CN102993302A - 新的抗il-13抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异地以高亲和力与糖基化和非糖基化的人IL13都能结合的抗IL13抗体，所述抗体不与小鼠IL13结合，并在1:2的近似摩尔比(MAb:IL13)中和人IL13活性。本发明也涉及这些抗体在治疗IL13介导的疾病中的应用，所述疾病例如过敏性疾病，包括哮喘、过敏性哮喘、非过敏性(内源性)哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、RSV感染、眼色素层炎、硬皮病、或骨质疏松。

Description

新的抗IL-13抗体及其应用

本申请为申请日为2004年12月23日、申请号为200480038657.1、发明名称为“新的抗IL-13抗体及其应用”的发明专利申请的分案申请。 

背景技术

白介素(IL)-13是一种多效的T辅助细胞亚型2(Th2)细胞因子。与IL-4一样，IL-13属于I型细胞因子家族，它们都具有由4α螺旋的疏水束核心所确定的四级结构。IL13与IL4具有大约30%的氨基酸序列同源性，并具有IL4的多种性质(Wynn,Ann.Rev.Immunol.,21:425(2003))。IL4和IL13的功能相似性造成了IL13可以在其与IL13受体α链-1(IL13Rα1)结合之后与IL4受体α链(IL4R-α)结合(Hershey，J.Allergy Clin.Immunol.,111:677(2003))。IL4和IL13激活IL4Rα，造成了Jak1依赖性STAT6磷酸化。IL4和IL13都促进B细胞增殖，并联合CD40/CD40L共刺激诱导抗体类型转变为IgG4和IgE(Punnonen etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3730(1993),Oettgen et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,107:429(2001))。 

但是，与IL4不同的是，IL13并不参与幼稚T细胞( 

T cell)向Th2细胞的分化(Zurawski et al.,Immunol.Today，15:19(1994))。IL13上调FcεRI，并因此帮助IgE激发(priming)肥大细胞(de Vries,Allergy Clin.Immunol.102:165(1998))。在单核细胞/巨噬细胞中，IL13上调CD23及I型和II型MHC抗原的表达，下调Fcγ和CD14的表达，并抑制抗体依赖性细胞毒性(de Waal Malefyt etal.,J.Immunol.,151:6370(1993),Chomarat etal.,Int.Rev.Immunol.,17:1(1998))。是IL13促进嗜酸性粒细胞的存活、激活和补充，而IL4不促进(Horie et al.,Intern.Med.,36:179(1997),Luttmann et al.,J.immunol.157:1678 (1996),Pope et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,108:594(2001))。IL13也表现出了对非造血细胞例如平滑肌细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维母细胞的重要功能。IL13增强了平滑肌的增殖以及胆碱能诱导性收缩(Wills-Karp,J.Allergy Clin.Immunol.,107:9(2001))。在上皮细胞中，IL13是一种趋化因子产生的强诱导物(Li et al.,J.Immunol.,162:2477(1999))，改变粘液纤毛的分化(Laoukili et al.,J.Clin.Invest.,108:1817(2001))，减少纤毛上皮细胞的纤毛摆动频率(Laoukili et al.,J.Clin.Invest.,108:1817(2001))，并造成了杯状细胞的化生(Zhu et al.,J.Clin.Invest.,103:779(1999),Grunig et al.,Science,282:2261(1998))。在内皮细胞中，IL13是一种血管细胞粘附分子1(VCAM-1)的强诱导物，VCAM-1对于嗜酸性粒细胞的补充(recruitment)是重要的(Bochner et al.,J.Immunol.,154:799(1995))。在人真皮的成纤维母细胞中，IL13诱导了人真皮成母纤维细胞内的1型胶原的合成(Roux et al.,J.Invest.Dermatol.,103:444(1994))。 

尽管IL13和IL4具有某些功能相似性，对疾病的动物模型以及基因敲除小鼠的研究证实IL13具有不同于IL4的独特的效应物功能，并提供了令人瞩目的关于不依赖于其它的Th2细胞因子，IL13对诱导过敏性哮喘的所有特征都是充分必要的的证据(Wills-Karp et al.Science,282:2258(1998),Walter et al.J.Immunol.167:4668(2001))。在与哮喘症状相关的效应物功能上，IL13可能起到了比其它Th2细胞因子更为显著的作用(Corry，Curr.Opin.Immunol.,11:610(1999))。在人类疾病中，通过IL13水平和IL13基因的遗传多态性与疾病相关性之间的强关联支持了这种观点(Wills-Karp.et al.Respir.Res.1:19(2000)；Vercelli et al.,Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.,2:389(2002)；He et al.,Genes Immunol.,4:385(2003)；Arima et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,109:980(2003)；Liu et al.,J.Clin.Allergy Immunol.,112:382(2003))。新出现的数据提示IL13通过其对粘膜上皮和平滑肌细胞的作用而不是通过涉及嗜酸性粒细胞和IgE介导事件的传统途径诱导过敏性反应的特征。 

哮喘被描述为一种慢性肺部疾病，它包括气道(airway)炎症、超反应性(hyperresponsiveness)和阻塞。在生理学上，气道超反应性被定义为在用乙酰甲胆碱或组胺进行气管激发之后支气管内气流的减少。其它激发气道阻塞的触发物包括冷空气、运动、病毒性上呼吸道感染、吸烟、和呼吸道过敏原。利用过敏原的支气管激发诱导了即刻的早期的免疫球蛋白E(IgE)介导的支气管内气流的减少，在许多患者中，紧接着的就是晚期的IgE介导的反应，使得支气管内气流减少4到8个小时。急性释放的炎性物质例如组胺、PGD₂、白三烯、纤溶酶和血小板活化因子(PAF)引起早期应答，而从头合成的前炎性细胞因子(例如，TNFα、IL4、IL13)和趋化因子(例如，MCP-1和MIP-1α)诱导了晚期应答(Busse et al.In:Allergy:Principles and Practice,Ed.Middleston,1173(1998))。在慢性哮喘患者中，持续的肺部症状是由Th2细胞的增强的应答所介导的(Larche et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,111:450(2003))。据信Th2细胞因子在所述疾病中具有至关重要的作用(Larche et al.,H.Allergy Clin.Immunol.,111:450(2003))，特别是具有NK表型的Th2细胞(NKT)在气道内产生的IL13和IL4，如在啮齿类动物的哮喘模型中显示的那样(Akbari et al.,Nature Med.,9:582(2003))。哮喘气道的总的病理显示出肺充气过度、平滑肌细胞肥大、网状板增厚、粘膜水肿、上皮细胞脱落、纤毛细胞破坏、以及粘液腺过度分泌。在显微镜下，哮喘的特征是支气管组织、支气管分泌物和粘液中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞数目的增加。最初，通过活化的CD4+T淋巴细胞从血流中向气道内补充白细胞。活化的T淋巴细胞也使得嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞释放出炎性介质。另外，Th2细胞产生IL4、IL5、IL9和IL13。IL4结合IL13给出从IgM向IgE抗体进行类别转换的信号。 

过敏原与膜结合的IgE分子的交联引起肥大细胞去颗粒，释放组胺、白三烯和其它维持气道炎症的介质。IL5激活嗜酸性粒细胞的补 充及活化。活化的肥大细胞和嗜酸性粒细胞也产生其有助于维持炎症的细胞因子。肺部的这些损害肺组织并随后修复的反复的炎症循环可以造成气道的长期的结构改变(“重构”)。 

目前用一种每日用的吸入性的抗炎糖皮质激素或肥大细胞抑制物例如色甘酸钠或奈多罗米(nedocromil)或根据需要加上一种吸入性β2激动剂(每日3-4次)治疗中度哮喘，以缓解突发性症状或过敏原或运动诱发的哮喘。色甘酸钠和奈多罗米阻断支气管痉挛和炎症，但是它们通常仅仅对与过敏原或运动相关的哮喘有效，并常常只对青少年哮喘有效。吸入性糖皮质激素改善炎症、气道超反应性和阻塞，并减少了急性发作的次数。但是，在其疗效明显之前至少需要1个月，而直到1年才会出现显著的改善。最常见的副作用是声音嘶哑和口腔真菌感染即念珠菌病。已经报道了更为严重的副作用，例如部分肾上腺抑制、生长抑制、和骨形成减少，但都仅仅是对于使用更大剂量的患者。倍氯米松(Beclomethasone)、曲安西龙(triamcinolone)、和氟尼缩松(flunisolide)可能具有相似的疗效；而布地奈德(budesonide)和氟替卡松(Fluticasone)的疗效更强，并报道其具有更少的全身性副作用。 

甚至轻微病变的患者都能表现出气道炎症，包括活化T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞在粘膜和上皮内的浸润。T细胞和肥大细胞释放出能促进嗜酸性粒细胞生长和成熟以及IgE抗体产生的细胞因子，而这些接下来增加了微血管的通透性、破坏上皮以及刺激神经反射和粘液分泌腺。结果是气道超反应性、支气管收缩、和高分泌，表现为哮鸣、咳嗽、和呼吸困难。 

传统上，用口服或吸入性支气管扩张剂治疗哮喘。这些药物有助于控制哮喘的症状，但对于内在的炎症却没有任何作用。在过去10年内，对炎症在哮喘病因中的重要性的认识已经造成了糖皮质激素使用的增加，但是许多患者仍持续地患有未受控制的哮喘。 

因为治疗人类的炎性疾病(特别是哮喘)的重要性，人们正在持续 不断地寻找着具有更少副作用的新的生物活性的化合物。对IL13的强特异的抑制物(当给哮喘气道长期施用时，其仍是有活性的)的开发提供了一种治疗哮喘以及其它的IL13和IgE介导的疾病的新的方法。发明概述 

本发明至少部分涉及特异地并且以高亲和力与糖基化的和非糖基化的人IL13都可以结合的抗体，所述抗体不与小鼠IL13结合，并以近似1:2(MAb:IL13)的摩尔比中和人IL13活性。本发明也包含包括来源于所述抗体的轻链和/或重链可变区的抗原结合区的抗体。本发明的抗体可以是单克隆的，单克隆抗体可以是人抗体、嵌合抗体、或人源化抗体。 

这些抗体的实例是228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43。在2003年11月20日产生这些抗体的杂交瘤保藏于10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，分别编号为PTA-5657、PTA-5656、PTA-5654、和PTA-5655。 

本发明包括具有与SEQ ID NO:3所示序列至少95%同源的VL序列和与SEQ ID NO:4所示序列至少95%同源的VH序列的抗体；具有与SEQ ID NO:5所示序列至少95%同源的VL序列和与SEQ ID NO:6所示序列至少95%同源的VH序列的抗体；以及具有与SEQ ID NO:7所示序列至少95%同源的VL序列和与SEQ ID NO:8所示序列至少95%同源的VH序列的抗体。本发明也包括一种重组抗体分子或其一种IL13结合片段，其包括至少一条抗体重链或其IL13结合片段，至少一条抗体轻链或其IL13结合片段，和来自人单克隆抗体的构架区，所述抗体重链或其IL13结合片段在位点31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)(Kabat编码)包括来自小鼠抗IL13抗体的非人CDR，其中位点27-30为氨基酸Gly26、Phe27、Ser28、Leu29、Asn30，(SEQ ID NO:8)，所述抗体轻链或其IL13结合片段在位点 24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)包括来自小鼠抗IL13抗体的非人CDR。 

本发明包括本发明抗体的人抗原结合抗体片段，但不限于Fab、Fab’和F(ab’)₂、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)。本发明也包括包括VL区或VH区的单域抗体(single-domain antibody)。在图21中描述了scFv的一个实例，其具有序列SEQ ID NO:152。 

本发明包括单克隆抗体228B/C-1的人源化序列。这些人源化的重组抗体分子包括一个轻链可变区以及一个重链可变区，所述轻链可变区包括具有结构式(FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4)的氨基酸序列，其中FRL1由SEQ ID NO:20-25中的任一序列构成；CDRL1由SEQ ID NO:99-103中的任一序列构成；FRL2由SEQ ID NO:29构成；CDRL2由SEQ ID NO:104-114中的任一序列构成；FRL3由SEQ ID NO:30-56中的任一序列构成；CDRL3由SEQ ID NO:115-116中的任一序列构成；FRL4是由SEQ ID NO:57-59构成；所述重链可变区包括具有结构式(FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4)的氨基酸序列，其中FRH1由SEQ ID NO:60-66中的任一序列构成；CDRH1由SEQ ID NO:117-122中的任一序列构成；FRH2由SEQ ID NO:67-75中的任一序列构成；CDRH2由SEQ ID NO:123-134中的任一序列构成；FRH3由SEQ ID NO:76-90中的任一序列构成；CDRH3由SEQ ID NO:135-141中的任一序列构成；FRH4由SEQ ID NO:91-92构成。所述重链可变区还可以包括至少恒定区的CH1区或恒定区的CH1、CH2和CH3区。所述重链恒定区可以包括IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、或IgG4抗体。 

本发明也包括重组抗体分子，其中轻链可变区选自SEQ ID NO:3、5、7、93、95、97、142、144、和150中的任一序列，以及 重链可变区选自SEQ ID NO:4、6、8、94、96、98、143、145、146、147、148、和149中的任一序列。一种特定抗体包括具有SEQ ID NO:142所示的序列的轻链可变区，以及具有SEQ ID NO:143所示的序列的重链可变区。 

本发明包括产生单克隆抗体228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43的杂交瘤细胞株。本发明包括编码单克隆抗体228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43的核酸、包括编码这些抗体或其链的核酸的细胞系、以及包括编码这些抗体或其链的核酸的载体。 

本发明也包括与228B/C-1结合相同表位的抗体。示例的多肽包括SEQ ID NO.1的全部或一部分或其变体、或SEQ ID NO.2，其中第13位氨基酸从谷氨酸变成了赖氨酸。本发明也涉及本发明的抗体所识别的表位。表位肽包括基本上包括ESLINVSG(SEQ ID NO:18)或YCAALESLINVS(SEQ ID NO:19)或由ESLINVSG(SEQ ID NO:18)或YCAALESLINVS(SEQ ID NO:19)组成的肽。 

本发明包括一种组合物，其包括与药物学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、或稳定剂组合的本发明的抗体。 

本发明包括一种治疗患有哮喘症状的对象的方法，包括给对象(例如需要治疗的对象)施用足以减轻哮喘症状的量的本发明的抗体，其中所述抗体可以下调患者体内的IL13的活性，减轻患者体内的支气管超反应性，和/或减少对象肺内的嗜酸性粒细胞。本发明也包括一种抑制呼吸道合胞病毒(RSV)感染的方法，包括给对象(例如需要治疗的对象)施用抑制量的本发明的抗体。 

可以通过一种或多种途径(包括静脉内、腹腔内、吸入、肌肉内、皮下和口服途径)施用本发明的抗体。本发明包括一种吸入设备，它送递给患者治疗有效量的本发明的抗体。 

本发明包括一种检测对象(例如患有过敏性疾病的患者)体内的白介素-13蛋白质的方法，包括例如使得本发明的抗体与样品接触；以 及通过免疫反应的发生检测白介素-13的步骤。本发明还描述了用于诊断对象体内的IL13的过量表达的方法，包括步骤(a)从所述对象中获得样品；(b)在使得与IL13发生免疫反应的条件下，将所述样品与本发明的抗体混和；和(c)确定相对于IL13表达的正常水平，IL13是否是过度表达的。 

本发明包括一种用于产生本发明的抗体的方法，包括步骤：a)产生包括糖基化的IL13成分和免疫原性成分的免疫原性化合物；b)制备包括处于磷酸盐缓冲液(PBS)中的所述免疫原性化合物和佐剂的可注射溶液；c)通过静脉内和腹腔内注射的组合，用所述可注射溶液免疫小鼠；d)通过将来自所述免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤；e)选择产生具有本发明抗体的特征的抗体的杂交瘤；以及f)分离所述抗体。 

本发明包括一种抑制患者体内IgE抗体产生的方法，其包括给患者施用有效量的抑制IgE抗体产生的本发明的抗体。对IgE抗体产生的抑制可以预防支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、和过敏症，也可以治疗支气管哮喘、过敏性皮炎、荨麻疹、和异位性皮炎。 

本发明包括一种治疗患者体内的IL13介导的疾病的方法，包括给患者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制IL13与其受体的结合，并抑制与白介素和所述受体结合相关的一种或多种功能。 

本发明包括一种治疗患者体内IgE介导的疾病的方法，包括给患者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制IL13与其受体的结合，并抑制与白介素和所述受体结合相关的一种或多种功能。 

本发明包括一种用于减轻哺乳动物体内的哮喘的严重度的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的具有至少一种以下特征的抗IL13单克隆抗体：以约1x10¹⁰到约1x10¹²M之间的K_D与人IL13结合的能 力；抑制与白介素IL13和IL13受体结合相关的一种或多种功能；以及所述抗体不能与小鼠IL13结合。 

本发明所涵盖的由IL13介导的疾病和/或病变包括，但不限于过敏性哮喘、非过敏性(内源性)哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏症、，慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、RSV感染、眼色素层炎、硬皮病、和骨质疏松。 

附图说明

图1描述了抗IL13单克隆抗体与人IL13的结合。 

图2描述了抗IL13单克隆抗体与突变体IL13-Fc的结合。 

图3说明了MAb JES10-5A2(Pharmingen)对MAb228B/C-1与人IL13的结合没有抑制作用。 

图4说明了抗IL13单克隆抗体对霍奇金淋巴瘤L-1236细胞的增殖的作用。 

图5说明了抗IL13单克隆抗体对人单核细胞中的由IL13诱导的CD14表达抑制的作用。 

图6说明了抗IL13单克隆抗体对人单核细胞中的由IL13诱导的CD23表达上调的作用。 

图7说明了抗IL13单克隆抗体对THP-1细胞内的由IL13诱导的STAT6磷酸化的作用。 

图8描述了单克隆抗体228B/C-1的VH和VL区的氨基酸序列。 

图9描述了单克隆抗体228A-4的VH和VL区的氨基酸序列。 

图10描述了单克隆抗体227-26的VH和VL区的氨基酸序列。 

图11描述了用于单克隆抗体228B/C-1的人源化的轻链可变区的序列。克隆B到R代表用人模板2检测VK和小鼠VH的克隆。HT2-NEW和HT2-DP27克隆的VK和VH都是用人的构架构建出的。 

图12描述了图11的克隆的相应的重链序列。 

图13A-D描述了组合的人源化候选物的ELISA模式。 

图14A描述了89Vk/276G的ELISA模式。图14B描述了构建体115Vk/73Vh FL的ELISA结果。 

图15描述了组合文库候选物的序列。 

图16描述了所检测的两种候选物(CL5和CL-13)的竞争模式，用针对与IL13的结合与嵌合候选物(228 B/C#3)进行比较表示。无关Fab是5I，其表现为没有竞争能力。 

图17描述了三种亲和力成熟的候选物的序列。 

图18显示了IL13蛋白质序列的对比排列。 

图19描述了Mab 228B/C-1的结合表位。 

图20描述了CDR变体以及它们各自的SEQ ID NO。 

图21描述了用于选择候选重组抗体的轻链可变区和重链可变区的序列。 

发明详述 

本发明并不限于本文所描述的特定方法学、方案、细胞系、载体、或试剂，因为它们可以有所变化。另外，本文所用的术语只用于描述特定实施方式的目的，而不是用于限定本发明的范围。如在此所用的以及在后附的权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括其复数形式，除非上下文中有清楚的不同的说明，例如“一个宿主细胞”包括多个这样的宿主细胞。 

除非有不同的定义，所有的技术和科学术语以及任何的缩写在此都具有与本发明领域普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践中可以使用与那些在本文所描述的方法和材料相似或等价的方法和材料，在此描述了例证性的方法、设备、和材料。 

为了描述和公开在本发明中可能使用的在此提及的蛋白质、酶、载体、宿主细胞、和方法学，本文所提到的所有专利和出版物在此以 法律所允许的程度并入本文。但是，这不应理解为基于现有技术，本发明不能被授权。 

免疫原 

用重组IL13免疫小鼠以产生生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤。从多个来源(见例如，R&D Systems,Minneapolis,MN.,PeproTech,Inc.,NJ,and Sanofi Bio-Industries,Inc.,Tervose,PA.)都可商购重组IL13。或者，利用本领域技术人员所熟知的方法可以将编码IL13的基因或cDNA克隆到质粒或其它的表达载体中，并在任一种表达系统中表达。克隆并表达IL13的方法以及IL13的核酸序列都是熟知的(见例如，美国专利No.5,652,123)。因为遗传密码子的简并性，可以产生多种编码IL13多肽的核苷酸序列。通过依据可能的密码子选择而选择组合可以改变核苷酸序列。根据标准的三联体遗传密码子，产生这些组合并将其应用于编码天然发生的IL13多肽的核苷酸序列中，所有的这些变异都被考虑到。可以用这些多肽中的任一种免疫动物以产生与IL13结合的抗体。 

当有益时，免疫原IL13多肽可以被表达为具有与融合片段连接的IL13多肽的融合蛋白。融合片段常常有助于蛋白质纯化，例如通过亲和层析使得分离并纯化融合蛋白。通过培养用编码包括连接到蛋白质的羧基和/或氨基末端的融合片段的蛋白的融合核酸序列所转化的重组细胞可以产生融合蛋白。融合片段可以包括，但不限于免疫球蛋白Fc区域、谷胱苷肽-S-转移酶、β-半乳糖苷酶、能与二价金属离子结合的多组氨酸片段、和麦芽糖结合蛋白。 

示例多肽包括SEQ ID NO.1或其变体的全部或一部分、或SEQ ID NO.2(其中第13位氨基酸是Xaa，它可以从野生型变化而来，例如从谷氨酸到赖氨酸)。 

用包括人IL13的突变形式的融合蛋白产生本发明的抗体。这种 含有单个突变的IL13的突变形式造成了蛋白质的无活性形式(Thompson et al.,J.Biol.Chem.274:2994(1999))。为了产生具有高亲和力的中和抗体，所述融合蛋白包括与免疫球蛋白Fc，特别是IgG1融合的突变的IL13蛋白，并在哺乳动物细胞系内表达，使得重组蛋白质被天然糖基化。融合蛋白的Fc部分可以提供一种暴露出关键表位的构象结构。糖基化可以增加表位的免疫原性，使得产生针对该特定表位的抗体。 

在大肠杆菌中表达的IL13多肽缺少糖基化，而所测试的可商购抗体是用这种蛋白质产生的。我们测试了这些抗体例如R&DSystems和Pharmingen，发现用在大肠杆菌中所产的免疫原所产生的抗体与本发明的抗体所结合的表位没有交叉反应。 

抗体产生 

用本领域任何适用的方法可以产生本发明的抗体。本发明的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法对于本领域技术人员是已知的(Harlow，et al.,Antibodies:a Laboratory Manual,(Cold spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988)，以其全文并入本文作参考全文并入本文作参考)。 

例如，可以给各种宿主动物施用上述的免疫原以诱导产生含有特异于该抗原的多克隆抗体的血清，所述动物包括但不限于兔、小鼠、和大鼠等等。免疫原的施用可以包括一次或多次注射免疫剂以及佐剂(如果需要)。根据宿主物种，可以用各种佐剂增加免疫应答，所述佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全弗氏佐剂)、矿物胶体例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、多聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚、以及可能有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。可以采用的其它佐剂的实例包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成的 trehalose dicorynomycolate)。免疫方案在本领域是熟知的，并可以用任一能引发所选择的动物宿主中的免疫应答的方法实施该方案。佐剂在本领域也是熟知的。 

通常地，通过多次皮下或腹腔内注射、或肌肉内或经IV可以将免疫原(有或没有佐剂)注射到哺乳动物体内。所述免疫原可以包括IL13多肽、融合蛋白或其变体。依赖于多肽的性质(即疏水性百分比、亲水性百分比、稳定性、净电荷、等电点等)，将免疫原与已知在所免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白质缀合可能是有用的。这些缀合包括通过衍生(derivatizing)所缀合的免疫原和免疫原性蛋白的化学功能基团使得形成共价键的化学缀合、或包括通过基于融合蛋白的方法学、或其它本领域人员熟知的方法进行。这些免疫原性蛋白的实例包括，但不限于钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、和泛宿主的T辅助细胞肽。可以用各种佐剂增强上述的免疫应答。 

本发明的抗体包括单克隆抗体。可以用杂交瘤技术和其它的本领域人员已知的技术制备单克隆抗体，例如在Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)和Harlow等的美国专利No.4,376,110，Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold spring Harbor Laboratory Press,2.sup.nd ed.(1988),by Hammerling,et al.,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(Elsevier,N.Y.,(1981))中所述杂交瘤技术。可以被采用的用于生产单克隆抗体的方法的其它实例包括但不限于人B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.,1983,Immunology Today4:72；Cole et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030)、和EBV杂交瘤技术(Cole et al.,1985,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。这些抗体可以是任何一种类型的免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD以及其任一亚型。可以在体外或在体内培养生产本发明的MAb的杂交瘤。 

利用经典的杂交瘤技术，通常用一种免疫原免疫宿主(例如小鼠、人源化小鼠、具有人免疫系统的小鼠、仓鼠、兔、骆驼、或任何其它的合适的宿主动物)以引发生产或能生产与IL13特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可以用抗原在体外免疫淋巴细胞。 

一般而言，在制备产生抗体的杂交瘤中，如果需要人来源的细胞，可以使用外周血淋巴细胞(“PBLs”)，或者如果需要非人的哺乳动物来源的细胞，则可以使用脾细胞或淋巴结细胞。然后利用合适的融合试剂(例如聚乙二醇)用无限增殖细胞系融合淋巴细胞以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986),pp.59-103)。无限增殖细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛或人来源的骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。可以将杂交瘤细胞培养在合适的培养基中，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的无限增殖细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)，这些物质将阻止HGPRT缺陷细胞的生长。 

优选的无限增殖细胞系是那些能有效地融合、支持所选择的产生抗体的细胞稳定地、高水平地表达抗体、并且是对培养基例如HAT培养基敏感的细胞系。更优选的无限增殖细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，例如可以从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.和the American Type Culture Collection,Manassas,Va得到细胞系。也可以用人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker，Inc.,New York,(1987)pp.51-63)。 

然后可以检测其中培养了杂交瘤细胞的培养基中的针对IL13的 单克隆抗体的存在。用例如免疫沉淀或用体外结合检测例如放射免疫检测(RIA)或酶联免疫吸附检测(ELISA)确定杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。这些技术在本领域是已知的，并且是在本领域人员的技术范围之内的。例如可以用Scatchard分析确定出单克隆抗体对IL13的结合亲和力(Munson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980))。 

在鉴定出所希望的杂交瘤细胞之后，利用有限稀释可以将克隆亚克隆化，并用标准方法使其生长(Goding，见上)。用于该目的的合适的培养基包括例如达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)和RPMI-1640。用传统的免疫球蛋白纯化方法例如蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析可以从培养基中分离或纯化出亚克隆所分泌的单克隆抗体。 

在本领域存在各种用于生产单克隆抗体的方法，因此本发明并不限于唯一的在杂交瘤中的生产。例如，可以用重组DNA方法制备单克隆抗体，例如在美国专利No.4,816,567中所述那些方法。在这个上下文中，术语“单克隆抗体”指的是一种来源于单个真核细胞的、噬菌体的、或原核细胞克隆的抗体。利用传统方法(例如利用能与编码鼠抗体的重链和轻链，或编码那些来自人、人源化的或其它来源的链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)可以容易地分离并测序编码本发明的单克隆抗体的DNA。本发明的杂交瘤细胞作为这些DNA的一种优选的来源。一旦被分离，可以将DNA放入到表达载体中，然后将所述表达载体转化到宿主细胞内以实现在重组宿主细胞内合成单克隆抗体，所述宿主细胞例如NS0细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不能产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。也可以修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源的鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，同上)进行修饰或通过将免疫球蛋 白编码序列与非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价连接进行修饰。可以用这些非免疫球蛋白多肽取代本发明的抗体的恒定区，或取代本发明的抗体的一个抗原组合位点的可变区，以产生嵌合的双价抗体。 

抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法在本领域是熟知的。例如，一种方法包括免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达。通常在Fc区域内的任一点截短重链，以阻止重链交联。或者，用另一种氨基酸残基取代相关的半胱氨酸残基或将之删除以阻止交联。 

利用已知的技术可以产生识别特异表位的抗体片段。例如，通过利用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)₂片段)对免疫球蛋白分子进行蛋白质裂解切割可以产生本发明的Fab或F(ab’)₂片段。F(ab’)₂片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1区。 

对于一些应用，包括在人体内应用抗体及在体外的检测测试中的应用，优选施用嵌合的、人源化的、或人抗体。嵌合抗体是一种分子，其中抗体的不同部分来源于不同的动物物种，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生产嵌合抗体的方法在本领域是已知的。见例如Morrison,Science229:1202(1985)；Oi et al.,Bio Techniques4:214(1986)；Gillies et al.,(1989)J.Immunol.Methods125:191-202；美国专利NO.5,807,715、4,816,567、和4,816397，在此其全文并入本文作参考。 

人源化抗体是在非人物种中产生的与所希望的抗原结合的抗体分子，它们具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)以及来自人免疫球蛋白分子的构架(framework，FR)区。通常用来自CDR供体抗体的相应残基取代人构架区内的构架残基以改变、优选地提高抗原结合力。用本领域熟知的方法可以鉴定出这些构架取代，例如通过建立CDR和构架残基的相互作用的模型以鉴定出对于抗原结合是重要的构架残基，以及通过序列比较以鉴定出特定位点上的非同寻常的 构架残基(见，例如Queen et al.,美国专利No.5,585,089；Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)，在此以其全文并入本文作参考)。利用本领域已知的各种技术可以将抗体人源化，所述技术包括例如CDR移植技术(EP 239,400、PCT文献WO 91/09967、美国专利NO.5,225,539、5,530,101、和5,585,089)、镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP592,106、EP519,596、Padlan,Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska.et al.,PNAS91:969-973(1994))、以及链替换(美国专利No.5,565,332)。 

一般而言，人源化抗体具有一个或多个被引入到其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人的氨基酸残基常常被称作“引入的(import)”残基，它们经常取自于“引入的”可变区。基于Winter及其同事的方法基本上可以通过用啮齿动物的CDR序列取代人抗体的相应序列进行人源化(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Reichmann et al.,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中完整的人可变区序列的很少部分用来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中用来自啮齿类动物的抗体中的类似位点上的残基取代了一些CDR残基和可能的一些FR残基。 

完整的人抗体对于人患者的治疗是特别希望的。用本领域已知的各种方法可以制备人抗体，包括上面所述利用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示。也参见美国专利NO.4,444,887和4,716,111、和PCT文献WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735、和WO91/10741，在此这些文献以其全文并入本文作参考。也可以用Cole等和Boerder等的技术制备人单克隆抗体(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer  Therapy，Alan R.Riss,(1985)；和Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95,(1991))。 

利用不能表达功能性的内源性免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠也可以生产人抗体。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机地导入或通过同源重组导入到小鼠胚胎干细胞内。或者，除了人重链和轻链基因以外，还可以将人可变区、恒定区、和多变区导入到小鼠胚胎干细胞内。通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座可以使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因分别或同时变成无功能。特别地，JH区的纯合缺失阻止了内源性抗体产生。扩增经修饰的胚胎干细胞，并将其显微注射到胚泡内以产生嵌合小鼠。然后对所述嵌合小鼠进行育种以产生表达人抗体的纯合后代。用所选择的抗原例如本发明的多肽的全部或一部分以正常的方式免疫转基因小鼠。通过传统杂交瘤技术可以从经免疫的转基因小鼠中得到针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠内所含有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间进行重排，并在此之后进行类别转换和体细胞突变(somatic mutation)。因此，利用这个技术生产治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体是有可能的。对于该生产人抗体的技术的综述，参见Lonberg和Huszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。对于该生产人抗体和人单克隆抗体的技术以及生产这些抗体的方案的详细讨论参见例如PCT文献WO98/24893、WO92/01047、WO96/34096、WO96/33735、欧洲专利No.0598877、美国专利NO.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771、和5,939,598，在此以其全文并入本文作参考。另外，利用与上述相似的技术，公司例如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)、Genpharm(San Jose,Calif.)、和Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)可以提供针对所选择的抗原的人抗体。 

也可以通过对移植了人外周血白细胞、脾细胞或骨髓(例如XTL 的三元杂交瘤技术(Trioma techniques))的小鼠进行免疫而制备人MAbs。可以利用被称作为“引导选择(guided selection)”的技术产生识别选定表位的完整的人抗体。在这个方法中，用所选择的非人的单克隆抗体例如小鼠抗体引导对识别相同表位的完整的人抗体的选择(Jespers et al.,Bio/technology 12:899-903(1988))。 

另外，接下来利用本领域人员熟知的技术可以用本发明的多肽的抗体产生“模拟”本发明的多肽的抗独特型抗体(见，例如，Greenspan &Bona,FASEB J.7(5):437-444；(1989)and Nissinoff，J.Immunol.147(8):2429-2438(1991))。例如，可以用结合并竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明的多肽与配体结合的抗体产生“模拟”多肽多聚化和/或结合区并因此结合及中和多肽和/或其配体的抗独特型抗体。在治疗方案中，可以用这些中和抗独特型抗体或这些抗独特型抗体的Fab片段中和多肽配体。例如，可以用这些抗独特型抗体结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，并因此阻断其生物学活性。 

本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是单克隆抗体，优选地是人或人源化的单克隆抗体，它们具有针对至少两种不同抗原的结合特异性。在本发明中，其中一种结合特异性可以针对IL13，另一种可以针对任何其它抗原，优选地针对细胞表面蛋白质、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源的蛋白质、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源的蛋白质、或细菌表面蛋白质等等。 

用于制备双特异性抗体的方法是熟知的。传统上，对双特异性抗体的重组生产是基于两种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达进行的，其中两种重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，这些杂交瘤(四元杂交瘤(quadromas))产生十种不同抗体分子的可能的混和物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。常常用亲和层析步骤完成对所述正确分子的纯化。在1993年5月13日发表的WO93/08829以及 在Traunecker et al.,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中公开了相似的方法。 

具有所希望的结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)可以与免疫球蛋白恒定区序列融合。所述融合优选与免疫球蛋白重链恒定区，包括至少绞链区、CH2和CH3区的一部分进行。它可以具有第一重链恒定区(CH1)，所述第一重链恒定区含有在至少一种融合蛋白中存在的轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物以及免疫球蛋白轻链(如果希望)的DNA插入到独立的表达载体内，并将其共转化到合适的宿主生物体内。对于产生双特异性抗体的更详细的描述参见例如Suresh et al.,Meth.In Enzym.,121:210(1986)。 

本发明还包括异源缀合抗体(heteroconjugate antibody)。异源缀合抗体由两种共价连接的抗体构成。这些抗体已经例如被计划将免疫系统细胞靶向于不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)。利用在合成蛋白质化学领域中的已知方法可以在体外制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，利用二硫键交换反应或通过形成硫酯键都可以构建出免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇(iminothiolate)和甲基-4-mercaptobutyrimidate，和那些在例如美国专利No.4,676,980中所公开的试剂。 

另外，可以产生IL13的单域抗体。WO9425591中已经描述了关于来源于骆驼科(camelidae)重链Ig的抗体这个技术的实例，以及US20030130496中已经描述了从噬菌体文库中分离出单区完全人抗体的。 

抗IL13抗体的鉴定 

本发明提供了抑制并中和IL13作用的拮抗单克隆抗体。特别地，本发明的抗体与IL13结合并抑制IL13受体阿尔法链-1(IL13Rα1)的激活。本发明的抗体包括被命名为228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43 的抗体，并公开了228B/C-1的人源化克隆。本发明也包括与这些抗体中的一种结合相同表位，例如单克隆抗体228B/C-1的表位的抗体。 

用酶联免疫吸附测定(EILISA)、Western印迹、或其它免疫化学技术测试候选的抗IL13抗体。用于研究单个抗体的特征的检测包括：(1)抑制霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)细胞系HDLM-2和L-1236的IL13-自分泌增殖；(2)抑制IL13诱导的THP-1细胞内的STAT6磷酸化；(3)抑制IL13诱导的对原代人单核细胞中的CD14表达的抑制；和(4)抑制IL13诱导的对原代人单核细胞上的CD23表达的上调。在实施例中描述了试验的细节。 

本发明的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、Fab表达文库所产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明的抗体的抗Id抗体)、和上述任一抗体的表位结合片段。 

如本文所用，术语“抗体”指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有免疫特异地结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任一类型(type)(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、和IgY)、任一类别(class)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)、或免疫球蛋白分子的亚类别(subclass)。因此，术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(MAb)的意思是包括能与蛋白质特异性结合的完整分子以及抗体片段(例如Fab和F(ab’)₂片段)。Fab和F(ab’)₂片段缺少完整抗体的Fc片段，可以从动物或植物的循环中被更快速地清除，以及可以比完整抗体具有更少的非特异的组织结合(Wahl et al.,J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。 

抗体可以是本发明的结合人抗原的抗体片段，以及包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)₂、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包括VL或VH结构域的单域抗体。结合抗原的抗体片段 包括单链抗体，其可以包括单独的可变区或与以下的全部或一部分组合的可变区：绞链区、CH1、CH2和CH3区。本发明也包括抗原结合片段，其包括可变区与绞链区、CH1、CH2和CH3区的任一组合。本发明的抗体可以来自任何动物来源包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体来自于人、非人灵长类、啮齿类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。 

如本文所用，“人”“抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体以及包括从人免疫球蛋白文库或从表达一种或多种人免疫球蛋白而不表达内源性免疫球蛋白的转基因动物中分离到的抗体，如在下文和例如在Kucherpalati等的美国专利5,939,598中所述那样。 

本发明的抗体可以是单特异的、双特异的、三特异的或具有更高的多特异性。多特异性抗体可以是特异于IL13的不同表位，或者可以是特异于IL13以及一种异源表位的，所述异源表位例如异源多肽或固相支持材料。参见例如PCT文献WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793、Tutt,et al.,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利NO.4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819；Kostelny et al.,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。 

可以根据抗体所识别的或特异结合的IL13的表位或一部分描述或说明本发明的抗体。可以如本文所述说明表位或多肽部分，例如通过N末端和C末端位置，通过连续氨基酸残基的大小，或表和图中所列出的进行说明。 

也可以根据抗体的交叉反应性描述或说明本发明的抗体。本发明也包括与IL13多肽结合的抗体，所述IL13多肽与IL13具有至少95%、至少90％、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、和至少50%的同一性(如利用本领域已知的和本文所述方法所计算的)。抗IL13抗体也可以以小于约10^-7M、小于约10^-6M、或小于约10^-5M的K_D与其它蛋白质结合，例如来自于不 同于得到所述抗IL-13抗体的物种的物种的IL13抗体。 

在特定实施方式中，本发明的抗体与人IL13的猴同源物以及其相应表位交叉反应。在一个特定实施方式中，上述交叉反应性相关于任何单一特异抗原的或免疫原性的多肽，或相关于本文所述特异抗原的和/或免疫原性的多肽的组合。 

本发明还包括与在严格杂交条件下与编码IL13的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽结合的抗体。也可以根据抗体与本发明的多肽的结合亲和力描述或说明本发明的抗体。优选的结合亲和力包括那些具有从10^-8到10^-15M、10^-8到10^-12M、10^-8到10^-10M、或10^-10到10^-12M的平衡解离常数或K_D的抗体。本发明也提供了根据本领域已知的任何用于确定竞争性结合的方法例如本文所述的免疫测试所确定的竞争性抑制抗体与本发明的表位结合的抗体，。在优选的实施方式中，抗体竞争性地抑制至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、或至少50%与表位的结合。 

载体和宿主细胞 

在另一个方面，本发明提供了包括编码本发明的抗体的核苷酸序列的载体构建体以及包括这样一种载体的宿主细胞。可以用进行克隆和转化的标准技术制备表达本发明的抗体的细胞系。 

利用熟知的技术可以制备含有编码本发明的抗体的核苷酸序列的重组表达载体。所述表达载体包括与合适的转录或翻译调节核苷酸序列可操纵地连接的核苷酸序列，所述转录或翻译调节核苷酸序列例如那些起源于哺乳动物、微生物、病毒、或昆虫基因序列。调节序列的实例包括转录启动子、操纵子、增强子、mRNA核糖体结合位点、和/或其它控制转录和翻译起始和终止的合适序列。当所述调节序列与合适的多肽的核苷酸序列功能性相关时，核苷酸序列是“可操纵地连接的”。因此，如果一个启动子核苷酸序列控制合适的核苷酸序列 的转录，那么所述启动子核苷酸序列就是可操纵地连接于例如抗体重链序列的。 

另外，可以将编码不与抗体重链和/或轻链序列天然相关的合适的信号肽的序列结合到表达载体内。例如，可以符合读码框地(in-frame)将信号肽(分泌导肽)的核苷酸序列与多肽序列融合，使得抗体可以被分泌到胞质外周空间或分泌到培养基中。在所希望的宿主细胞内具有功能的信号肽增强合适的抗体的胞外分泌。在抗体从细胞中分泌之后，信号肽可以从多肽中被切割。这些分泌信号的实例是熟知的并包括例如在US5698435、US5698417、和US6204023中所描述的那些分泌信号。 

可用于本发明的宿主细胞包括但不限于微生物，例如经含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母菌例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)感染的或经含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。 

载体可以是质粒载体、单链或双链噬菌体载体、或单链或双链RNA或DNA病毒载体。用熟知的将DNA和RNA导入到细胞内的技术可以将这些载体作为多核苷酸导入到细胞内。在噬菌体和病毒载体的情况下，也可以用熟知的感染和转导的技术将载体作为包装病毒 或包囊病毒导入到细胞内。病毒载体可以是可复制的或有复制缺陷的。在后一情况中，通常只有在互补的宿主细胞内才会发生病毒繁殖。利用来源于本DNA构建体的RNA，也可以采用无细胞的翻译系统产生蛋白质。这些载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(见，例如PCT文献WO86/05807、PCT文献WO89/01036、美国专利No.5,122,464)，并且可以将抗体的可变区克隆到这样的载体内，用于表达整个重链或轻链。 

在本发明中可用作宿主细胞的原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。在原核宿主细胞内所用的表达载体通常包括一个或多个表型选择标记基因。例如，表型选择标记基因是编码赋予抗生素抗性或提供自养需求的蛋白质的基因。用于原核宿主细胞的有用的表达载体的实例包括那些来源于可商购的质粒的表达载体，例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)、pGEM1(Promega Biotec,Madison,Wisconsin.,USA)、和pET(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)以及pRSET(Invitrogen Corporation,Carlsbad,California,USA)载体系列(Studier,F.W.,J.Mol.Biol.219:37(1991);Schoepfer,R.Gene 124:83(1993))。通常用于重组的原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括T7(Rosenberg,et al.Gene56,125-135(1987))、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang et al.,Nature 275:615,(1978)；和Goeddel et al.,Nature 281:544,(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.,Nucl.Acids Res.8:4057,(1980))、和tac启动子(Sambrook et al.,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2dEd.,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor,N.Y.)。 

在本发明中有用的酵母包括那些来自酵母属、毕赤酵母属、放线菌(Actinomycetes)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母。酵母载体常常含有一个来自2μ酵母质粒的复制序列起点、一个自主复制序列 (ARS)、启动子区、聚腺苷酸化序列、转录终止序列和选择标记基因。酵母载体的合适启动子序列包括但不限于金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.255:2073,(1980))或其它的糖酵解酶(Holland et al.,Biochem.17:4900,(1978))例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。在Fleer et al.,Gene,107:285-195(1991)中还描述了用于酵母表达的其它合适的载体和启动子。用于酵母和酵母转化方案的其它合适的启动子和载体在本领域是熟知的。酵母转化方案是熟知的。在Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,75:1929(1978)中描述了一种这样的方案。Hinnen方案在选择培养基中选择出Trp⁺转化体。 

也可以采用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统表达重组抗体，例如用于生产异源蛋白质的杆状病毒系统。在一个昆虫系统中，可以将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcNPV)用作表达外源基因的载体。所述病毒生长在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞内。可以将抗体编码序列单个地克隆到病毒的非必要区内(例如多角体蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制之下。 

可以将NS0或中华仓鼠卵巢细胞(CHO)用于在哺乳动物中表达本发明的抗体。可以从病毒基因组中切割下用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译的控制序列。常用的启动子序列和增强子序列来源于多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)、和人巨细胞病毒(CMV)。可以用来源于SV40病毒基因组的DNA序列提供用于在哺乳动物宿主细胞内表达结构基因序列的其它遗传元件，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪切和聚腺苷酸化位点。病毒的早期和晚期启动子是特别有用的，因为容易从病毒基因组中作为片段得到这两种 启动子，所述片段也可以含有病毒的复制起点。用于哺乳动物宿主细胞的所例举的表达载体是可商购的。 

编码抗体的多核苷酸 

本发明还提供了包括编码本发明的抗体和其片段的核苷酸序列的多核苷酸或核酸，例如DNA。示例的多核苷酸包括那些编码包括本文所述的一种或多种氨基酸序列的抗体链的多核苷酸。本发明也包括在严格的或较低严格的条件下能与编码本发明的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。 

可以利用本领域任一已知的方法得到多核苷酸，并确定出多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果已知了抗体的核苷酸序列，就可以从化学合成的寡核苷酸装配出编码所述抗体的多核苷酸(例如如在Kutmeier et al.,BioTechniques 17:242(1994)中所述那样)。简要地，所述装配包括含有编码所述抗体的序列的一部分的重叠寡核苷酸的合成、这些寡核苷酸的退火和连接、以及接下来用PCR对所连接的寡核苷酸的扩增。 

或者，可以从来自合适来源的核酸中产生编码抗体的多核苷酸。如果无法得到含有编码特定抗体的核酸的克隆，但已知所述抗体分子的序列，那么可以通过化学合成得到编码所述免疫球蛋白的核酸，或利用与所述序列的3’和5’末端可杂交的合成引物从合适的来源(例如抗体cDNA文库、或从表达所述抗体的任一组织或细胞例如所选择的用于表达本发明的抗体的杂交瘤细胞中所产生的cDNA文库，或从中所分离到的核酸，优选聚A⁺RNA)通过PCR扩增得到编码所述免疫球蛋白的核酸，或通过利用特异于所述特定基因序列的寡核苷酸探针从合适的来源(例如抗体cDNA文库、或从表达所述抗体的任一组织或细胞例如所选择的用于表达本发明的抗体的杂交瘤细胞中所产生的cDNA文库，或从中所分离到的核酸，优选聚A⁺RNA)通过克隆得 到编码所述免疫球蛋白的核酸，以例如从cDNA文库中鉴定出编码所述抗体的cDNA克隆。然后可以利用本领域任一熟知的方法将PCR所产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体内。 

一旦确定了抗体的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列，就可以利用本领域熟知的处理核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、定位诱变、PCR等处理抗体的核苷酸序列(参见例如在Sambrook et al.,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel et al.,eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons,NY，以其全文并入本文作参考)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失、和/或插入。 

在一个特定的实施方式中，可以用熟知的方法检查重链和/或轻链可变区的氨基酸序列以鉴定出CDR的序列，所述方法例如通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较以确定出序列的高变异性区域。利用常规重组DNA技术，可以将一个或多个CDR插入到构架区内，例如插入到人构架区内以人源化非人抗体，如上面所述。构架区可以是天然发生的或共有的构架区，以及优选地是人构架区(见例如，Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)中的人构架区的列表)。优选地，通过构架区和CDR的组合所产生的多核苷酸编码与本发明的多肽特异结合的抗体。优选地，如上面所讨论的，在构架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，以及优选地所述氨基酸取代提高了抗体与其抗原的结合。另外，可以用这些方法对参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基进行取代或删除，以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。本发明包括对多核苷酸的其它改变，这也在本领域人员的技术范围之内。 

另外，可以使用为通过将具有合适抗原特异性的来自小鼠抗体分子的基因与具有合适生物学活性的人抗体分子的基因剪切在一起而 产生“嵌合抗体”所开发的技术(Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855(1984);Neuberger et al.,Nature 312:604-608(1984);Takeda et al.,Nature 314:452-454(1985))。如上面所述，嵌合抗体是一种不同的部分来源于不同的动物物种的分子，例如具有来源于小鼠MAb的可变区以及人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体，例如人源化抗体。 

或者，可以调整所描述的用于生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778;Bird,Science 242:423-42(1988);Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988);和Ward et al.,Nature334:544-54(1989))以适于生产单链抗体。单链抗体通过经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段以得到一条单链多肽而形成。也可以使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science242:1038-1041(1988))。 

生产抗IL13抗体的方法 

用本领域已知的用于合成抗体的任一方法，特别是通过化学合成或优选地通过重组表达技术可以产生本发明的抗体。 

本发明的抗体或其片段、衍生物或类似物(例如本发明的抗体的重链或轻链或本发明的单链抗体)的重组表达要求构建含有编码所述抗体或抗体片段的多核苷酸的表达载体。一旦已经得到了编码抗体分子的多核苷酸，就可以用重组DNA技术产生用于产生抗体的载体。构建含有抗体编码序列以及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。 

利用传统技术将表达载体转移到宿主细胞内，然后用传统技术培养所转染的细胞以产生本发明的抗体。如下面所详细描述的，在本发明的一个方面，可以在宿主细胞内共表达编码重链和轻链的载体，以便表达整个免疫球蛋白分子。 

如上所述，可以利用各种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分 子。这样的宿主表达系统不仅代表通过其可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体(vehicles)，也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染后可以原位表达本发明的抗体分子的细胞。通常用细菌细胞例如大肠杆菌和真核细胞表达重组抗体分子，特别是表达完整重组抗体分子。例如，与载体例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件相结合的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是抗体的有效的表达系统(Foecking et al.,Gene 45:101(1986)；Cockett et al.,Bio/Technology 8:2(1990))。 

另外，可以选择宿主细胞株，其调控所插入序列的表达，或以所希望的特定方式修饰和加工基因产物。这些对蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性的和特定的机制。可以选择出合适的细胞系或宿主系统以保证对所表达的外源蛋白质的正确的修饰和加工。为此，可以使用具有对基因产物的初级转录、糖基化、和磷酸化的正确加工的细胞机制的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤细胞。 

为了长期、高产量地产生重组蛋白质，稳定的表达是优选的。例如，可以对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程化。可以用受合适的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标记转化宿主细胞，而不是用含有病毒的复制起点的表达载体。在导入外源DNA之后，可以使工程化的细胞在富集培养基中生长1到2天，然后将其转换到选择培养基中。重组质粒中的选择标记赋予了对选择的抗性，使得细胞稳定地将质粒整合到其染色体内并生长形成灶(focus)，接下来这可以被克隆并扩增成为细胞系。这种方法可以有利地用于对表达抗体分子的细胞系进行工程化。这些工程化的细胞系可以被特别用于筛选和评价与所述抗体分 子直接或间接相互作用的化合物。 

可以使用多种选择系统，其包括但不限于可以在tk、hgprt或aprt-细胞内分别采用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigier et al.,Cell 11:223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska & Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))、和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.,Cell 22:817(1980))基因。也可以基于抗代谢物抗性对下列基因进行选择：产生对甲氨蝶呤的抗性的dhfr(Wigler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci..USA 77:357(1980);O'Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981))；产生对霉酚酸的抗性的gpt(Mulligan & Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981))；产生对氨基糖甙G-418的抗性neo(Wu and Wu,Biotherapy3:87-95(1991))；和产生对潮霉素的抗性的hygro(Santerre et al.,Gene 30:147(1984))。可以常规地采用在重组DNA技术领域通常已知的方法选择所希望的重组克隆，例如在Ausubel et al.(eds),Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);和in chapter 12 and 13,Dracopoli et al.(eds),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley& Sons,NY(1994);Colberre-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981)中描述了这些技术，以其全文并入本文作参考。 

通过载体扩增可以增加抗体分子的表达水平(综述参见Bebbington and Hentschel,“The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells”(DNA cloning,Vol.3.Academic Press,New York,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的标记时，宿主细胞培养物中所存在的抑制物水平的增加将增加标记基因的拷贝的数目。因为扩增区与抗体基因相关，因此抗体的产生也会增加(Crouse et al.,Mol.Cell Biol.3:257(1983))。 

可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一种载体编码重链来源的多肽，而第二种载体编码轻链来源的多肽。两种载体都可以含有相同的能使得重链和轻链多肽等量表达的选择标记。或者，可以使用编码并能表达重链以及轻链多肽的单个载体。在这种情况中，轻链应当置于重链的前面，以避免有毒的游离重链的过量产生(Proudfoot,Nature 322:52(1986);Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197(1980))。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。 

一旦已经用动物、化学合成或重组表达产生了本发明的抗体分子，可以用本领域已知的任一用于纯化免疫球蛋白分子的方法进行纯化，例如通过层析(例如，离子交换层析、亲和层析特别是通过在蛋白A之后的与特异抗原的亲和力进行的层析，以及体积排阻层析)、离心、差异溶解、或任何其它的用于纯化蛋白质的标准技术。另外，还可以将本发明的抗体或其片段与本文所述或本领域已知的其它的异源多肽序列融合，以促进纯化。 

本发明包括与多肽重组融合的或化学缀合的(包括共价和非共价缀合的)抗体。可以用本发明的融合或缀合抗体使得纯化更为简便。参见例如Harbor等(见上)和PCT文献WO 93/21232、EP 439,095、Naramura et al.,Immunol.Lett.39:91-99(1994)；美国专利No.5,474,981；Gillies et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.89:1428-1432(1992)；Fell et al.,J.Immunol.146:2446-2452(1991)，以其全文并入本文作参考。 

此外，本发明的抗体或其片段可以与标记物序列例如肽融合以促进纯化。在优选的实施方式中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如在pQE载体中所提供的标签(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)等等，其中许多都是可商购的。例如在Gentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所述，六组氨酸提供了对融合蛋白的便利纯化。其它对纯化有用的肽标签包括但不限于“HA”标签，它对应于来源于流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson et  al.,Cell 37:767(1984))以及“flag”标签。 

抗IL13抗体的诊断应用 

本发明的抗体包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与所述抗体的共价连接而进行的修饰，所述共价连接并不干扰抗体与IL13的结合。例如，抗体衍生物包括那些已经被例如生物素、HRP、或任何其它的可检测组分修饰的衍生物，但这并非是限定。 

本发明的抗体可以被用于例如但不限于纯化或检测IL13，包括在体外和在体内的诊断方法中。例如所述抗体可应用于定性或定量测定生物样品中的IL13水平的免疫测试中。参见例如Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)(以其全文并入本文作参考)。 

如在下面更为详细讨论的，可以单独地或联合其它的组合物一起使用本发明的抗体。所述抗体还可以在N或C末端与异源多肽重组融合，或与多肽或其它组合物化学缀合(包括共价的或非共价的缀合)。例如，本发明的抗体可以与在检测测试中用作标记的分子重组融合或缀合。 

本发明还包括与诊断剂缀合的抗体或其片段。所述抗体可以作为临床测试方法的一部分被诊断性地用于例如监测过敏性应答的发生或进展，以例如确定给定治疗方案的效力。通过将抗体偶联到可检测物质可以促进检测。可检测物的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、利用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属、以及非放射性的顺磁性金属离子。利用本领域已知的技术，可检测物可以直接地与抗体(或其片段)偶联或缀合，或经中间物(例如本领域已知的接头)间接地偶联或缀合。参见例如关于金属离子的美国专利No.4,741,900，其中所述金属离子可以与抗体缀合，用作本发明的诊断剂。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、dichlorotriazinylamine荧光素、氯化丹酰或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白；合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或⁹⁹Tc。 

抗体也可以被粘附到固相支持物，这对于靶抗原的免疫测试或纯化是特别有用的。这些固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙稀或聚丙烯。 

与IL13特异性结合的标记抗体及其衍生物和类似物都被用于诊断目的，以检测、诊断、或监测与IL13的异常表达和/或活性相关的疾病、病症、和/或病态。本发明提供了对IL13异常表达的检测，其包括(a)用一种或多种特异于IL13的本发明的抗体检测个体的细胞或体液中的IL13的表达，和(b)比较基因表达水平与标准的基因表达水平，与标准的表达水平比较所检测到的IL13表达水平的增高或降低是异常表达的提示。 

抗体可被用于检测样品例如体液或组织样品中的IL13的存在和/或水平。检测方法可以包括将所述样品与IL13抗体接触，并确定与所述样品结合的抗体的量。 

本发明提供了一种用于诊断病症的诊断检测，包括(a)用一种或多种特异于IL13的本发明的抗体检测个体的细胞或体液中的IL13的表达；和(b)比较基因表达水平与标准的基因表达水平，与标准的表达水平比较，所检测到的IL13表达水平的增高或降低是特定疾病的提示。 

可以利用本领域技术人员已知的经典的免疫组织学方法用本发明的抗体检测生物样品中的蛋白质水平(参见例如Jalkanen,et al.,J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen,et al.,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987))。其它用于检测蛋白质基因表达的基于抗体的方法 包括免疫测试例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记在本领域是已知的，并包括酶标记例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素例如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹²In)、和锝(⁹⁹Tc)；发光标记例如鲁米诺；荧光标记例如荧光素和罗丹明；以及生物素。 

本发明的一个方面是对与动物(优选地是哺乳动物，以及最优选地是人)中的IL13的异常表达相关的疾病或病症的检测和诊断。在一个实施方式中，诊断包括：a)给对象施用(例如肠胃外、皮下、或腹腔内)有效量的与IL13特异结合的被标记的分子；b)在给药后要等待一段时间间隔，以使得被标记的分子优先地积聚在对象体内的表达多肽的位置上(并使得未结合的分子被清除到背景水平)；c)确定背景水平；和d)检测对象体内的被标记的分子，这样检测到超过背景水平的被标记的分子提示对象患有与IL13的异常表达相关的特定疾病或病症。可以用各种方法确定出背景水平，包括将所检测到的被标记的分子的量与预先确定好的某一特定系统的标准值进行比较。 

本领域人员知道对象的大小和所用的成像系统将决定产生诊断性图像所希望的成像组分的量。就放射性同位素组分而言，对于人体对象，所注射的放射性的量的范围通常从约5毫居里到20毫居里的99Tc。然后被标记的抗体或抗体片段将优先地积聚在含有特定蛋白质的细胞的部位。在S.W.Burchiel et al.,“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.”Chapter13 in Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes,eds.,Masson Publishing Inc.(1982)中描述了体内成像。 

依据一些变量包括所用标记物的类型以及给药模式，在给药后使得被标记的分子优先地在对象体内的位置上积聚和使得未结合的被标记的分子被清除到背景水平的时间间隔是6到48小时或6到24个小时或6到12小时。在另一实施方式中，给药后的时间间隔是5到 20天或5到10天。 

在一个实施方式中，通过重复用于诊断疾病或病症的方法进行对疾病或病症的监视，例如在初次诊断后1个月重复，在初次诊断后6个月重复，在初次诊断后1年重复等。 

利用本领域已知的用于体内扫描的方法可以检测患者体内的被标记的分子的存在。这些方法依赖于所用的标记的类型。本领域技术人员能确定出用于检测特定标记的合适方法。在本发明的诊断方法中可以使用的方法和设备包括但不限于计算机断层扫描(CT)、全身扫描例如正电子发射断层扫描(PET)、核磁共振显像(MRI)、和超声波。 

在一个特定的实施方式中，用放射性同位素标记分子，并用放射应答外科装置检测患者体内的被标记的分子(Thurston等的美国专利No.5,441,050)。在另一个实施方式中，用荧光化合物标记分子并用荧光应答扫描装置检测患者体内的被标记的分子。在另一个实施方式中，用正电子发射金属标记分子并用正电子发射断层扫描检测患者体内的被标记的分子。在另一个实施方式中，用顺磁标记物标记分子并用核磁共振显像(MRI)检测患者体内的被标记的分子。 

在另一个方面，本发明提供了一种用于诊断患者发生由未受调节的细胞因子的表达所引起的疾病的易感性的方法。在某些患者细胞、组织或体液中的IL13的量的增加可能提示该患者对某些免疫疾病易感。在一个实施方式中，所述方法包括收集已知具有低或正常水平的IL13的对象的细胞、组织、或体液样品；针对组织或体液分析组织中是否存在IL13；并根据组织或体液中的IL13的表达水平预测患者对某些免疫疾病的易感性。在另一个实施方式中，所述方法包括从患者中收集已知含有确定水平的IL13的细胞、组织、或体液样品；分析组织或样品的IL13的量；并根据与正常细胞、组织或体液中已建立的确定的或测定的水平比较后的IL13量的变化预测患者对某些免疫疾病的易感性。IL13的确定水平可以是依据文献数值的已知量或 可以通过测定正常细胞、组织或体液中的量而提前确定出的已知量。特别地，对某些组织或体液中的IL13水平的确定使得特异地和早期地检测到患者体内的免疫疾病，优选地是在疾病发生之前。利用本方法可以诊断的免疫疾病包括但不限于本文所述的免疫疾病。在优选的实施方式中，所述组织或体液是外周血、外周血白细胞、生物活检组织例如肺或皮肤活检、和组织。 

抗IL13抗体的治疗应用 

单独施用或联合细胞毒性因子一起施用的抗体(有或没有与之缀合的治疗组分)可以被用作为一种治疗剂。本发明针对于基于抗体的治疗，其包括给动物、哺乳动物、或人施用本发明的抗体，以治疗IL13介导的疾病、病症或病变。所述动物或对象可以是需要特定治疗的动物，例如已经被诊断为特定病症(例如，与IL13相关的病症)的动物。针对IL13的抗体对于抑制动物体内的过敏反应是有用的，所述动物包括但不限于牛、猪、马、鸡、猫、狗、非人灵长类等以及人。例如，通过施用治疗可接受量的本发明的抗体、或本发明抗体的鸡尾酒、或联合施用各种来源的其它抗体，可以减轻或消除所治疗动物体内的对抗原的过敏反应。 

本发明的治疗化合物包括但不限于本发明的抗体(包括如本文所述其片段、类似物和衍生物)和编码下面所述本发明的抗体(包括如本文所述其片段、类似物和衍生物以及抗独特型抗体)的核酸。可以用本发明的抗体治疗、抑制或预防与IL13的异常表达和/或活性相关的疾病、病症、或病变，所述疾病、病症或病变包括但不限于本文所述任何一种或多种疾病、病症、或病变。对与IL13的异常表达和/或活性相关的疾病、病症、或病变的治疗或预防包括但不限于缓解与这些疾病、病症、或病变相关的症状。可以以如本领域已知的或本文所述药物学可接受的组合物提供本发明的抗体。 

可以在多种疾病中治疗性地应用本发明的抗IL13抗体。本发明提供了一种预防或治疗哺乳动物中IL13介导的疾病的方法。所述方法包括给所述哺乳动物施用疾病预防或治疗量的抗IL13抗体。抗IL13抗体与IL13结合，并调节细胞因子和细胞受体的表达，造成了表现为非疾病状态的细胞因子水平。因此，所治疗的疾病包括过敏、哮喘、自身免疫性疾病、或其它炎性疾病。其它的过敏性疾病包括过敏性鼻炎、异位性皮炎、食物过敏和荨麻疹；免疫介导的皮肤病包括大庖性皮肤病、多形红斑、和接触性皮炎；自身免疫性疾病包括牛皮癣、类风湿关节炎、幼年型慢性关节炎；炎性肠病(即溃疡性结肠炎、克隆氏病)；其它与IL13相关的疾病包括特发性间质肺炎、杯状细胞化生、炎性和纤维化性肺病例如囊性纤维化、谷蛋白敏感性肠病、和Whipple病；肺部的免疫病例如嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎；慢性阻塞性肺病、RSV感染、眼色素层炎、硬皮病、骨质疏松、和霍奇金淋巴瘤。 

可以用标准的临床技术确定出能有效地治疗、抑制和预防与IL13的异常表达和/或活性相关的疾病或病症的抗体的量。可以按与疾病相一致的治疗方案施用抗体，例如在一天到数天内施用单次或数次剂量以缓解疾病状态，或在一段延长的时间内施用周期性的剂量以预防过敏或哮喘。另外，可以任选地采用体外测定以帮助鉴别出最佳的剂量范围。在配制品中所采用的精确剂量将依赖于给药途径以及疾病或病症的严重度，并应当根据医生的判断以及每个患者的情况做出决定。从来源于体外的或动物模型测试系统的剂量效应曲线可以外推出有效的剂量。 

对于抗体，施用给患者的剂量通常是从每kg患者体重0.1mg到100mg。优选地，施用给患者的剂量是从每kg患者体重0.1mg和20mg之间，更优选地是从每kg患者体重1mg到10mg之间。一般而言，人抗体在人体内具有比其它物种的抗体更长的半衰期，这是由于人体 对外源多肽的免疫应答。因此，更低剂量的人抗体以及更少频率的给药常常是可能的。另外，通过经修饰例如脂质化增强抗体的摄取和组织通透性(例如进入到脑部)可以减少本发明的抗体的给药剂量和频率。 

可以联合其它的单克隆或嵌合抗体、或淋巴因子或造血生长因子(例如IL-2、IL-3、IL-7、IFN)有利地利用本发明的抗体，所述淋巴因子或造血生长因子例如可以增加与抗体相互作用的效应细胞的数目或活性。 

可以单独地或联合其它类型的治疗例如免疫治疗、支气管扩张剂、抗IgE分子、抗组胺药、或抗白三烯药物施用本发明的抗体。 

在一个优选的方面，抗体是被充分纯化的(例如，基本上没有限制其作用或产生非所希望的副作用的物质)。 

各种送递系统是已知的，并可被用于施用本发明的抗体，包括注射，例如包装在脂质体、微粒体、微胶囊内、能表达所述化合物的重组细胞、受体介导的细胞内吞(见，例如Wu et al.,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))、构建核酸作为逆转录病毒或其它载体的一部分等等。 

可以按任何可接受的形式给哺乳动物施用抗IL13抗体。导入的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、吸入和口服途径。可以用任何便利的途径施用抗体或组合物，例如通过输注或推注，或通过经上皮或皮肤粘膜内层的吸收(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)，以及可以与其它的生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，可能希望通过任何合适的途径(包括脑室内和鞘内注射)将本发明的治疗抗体或组合物导入到中枢神经系统内；通过脑室内导管例如连接到储存池的导管如Ommaya囊可以有助于脑室内注射。 

也可以采用肺部给药，例如通过使用吸入器或雾化器以及雾化剂 的剂型。也可以给患者的肺部施用干粉组合物形式的抗体(参见例如美国专利No.6,514,496)。 

在一个特定的实施方式中，希望将本发明的治疗性抗体或组合物局部地施用到所希望治疗的部位；例如通过(并不限于此)局部输注、局部应用、通过注射、通过导管的方式、通过栓剂的方式、或通过植入物的方式可以实现这一点，所述植入物是多孔的、非多孔的、或胶状的材料，包括膜，例如sialatic膜，或纤维。优选地，当施用本发明的抗体时，必须小心地使用蛋白质所不吸附的材料。 

在另一个实施方式中，可以在载体中送递抗体，特别是在脂质体中(见，Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez Berestein,ibid.,pp.317-327;see generally ibid.)。 

仍在另一个实施方式中，可以用控释系统送递抗体。在一个实施方式中，可以施用泵(见，Langer，如上;Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980)；Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施方式中，可以施用聚合材料(见，Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)；也见Levy et al.,Science228:190(1985)；During et al.,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard et al.,J.Neurosurg.71:105(1989))。仍在另一个实施方式中，可以将控释系统置于治疗靶点的近端。 

本发明也提供了药物组合物。这些组合物包括治疗有效量的抗体，以及生理学可接受的载体。在一个特定的实施方式中，术语“生 理学可接受的”意思是经联邦或州政府的调控机构所认证的或在美国药典或其它普遍公认的用于动物(以及更特别地用于人)的药典中所罗列的。术语“载体”指的是稀释剂、佐剂、赋形剂、或与治疗药物一起施用的载体。这些生理载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用所述药物组合物时，水是一种优选的载体。也可以采用盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液作为液体载体，特别是作为可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙稀、乙二醇、水、乙醇等等。如果希望，所述组合物也可以含有少量的湿化剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放配制品等形式。用传统的粘和剂和载体例如甘油三脂可以将所述组合物配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体例如药物纯级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述了合适载体的实例。这些组合物将含有有效量的抗体(优选地是纯化形式的抗体)以及合适量的载体，以便提供能适当地施用给患者的形式。剂型应当适应于给药的模式。 

在一个实施方式中，根据常规方法将组合物配制成为适用于静脉内施用给人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是无菌等张的水性缓冲溶液。如果需要，组合物也可以含有增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。一般地，组分可以分别地或一起混和在单位剂量形式中提供，例如作为在标明活性剂的量的熔封容器例如安瓿或密封袋(sachette)内的冻干粉末或无水浓缩物提供。如果要通过输注施用所述组合物，可以用含有无菌的药物纯级水或盐水的输液瓶配药。如果要通过注射施用所述组合物，可以提供一安瓿的 注射用无菌水或盐水，使得可以在给药之前混和组分。 

本发明也提供了包括一个或多个装满本发明的药物组合物的一种或多种组分的容器的药物包装或药盒。与这些容器任选地伴随的可以是以管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的说明，这些说明反映了管理人体施用的药物的生产、使用或销售的机构的认证。 

此外，本发明的抗体可以与各种效应分子例如异源多肽、药物、放射性核素、或毒素缀合。参见例如PCT文献WO92/08495、WO91/14438、WO89/12624、美国专利No.5,314,995、和EP396,387。抗体或其片段可以与治疗组分缀合，所述治疗组分例如细胞毒素如细胞生长抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子例如α粒子辐射剂例如213Bi。细胞毒素或细胞毒剂包括任何对细胞有害的物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、dihydroxy anthracin dione、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、更生霉素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，氨甲蝶呤、6-硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、马法兰(melphalan)、卡氯芥(carmustine,BSNU)和环己亚硝脲(lomustine,CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、顺二氯化二氨亚铂(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(daunorubicin,以前称为daunomycin)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前叫放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和蒽霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。 

用于将这些治疗组分与抗体缀合的技术是熟知的，见例如Arnon et al.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss Inc.1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”,in Controlled Drug Delivery(2^nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",in Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press1985)，和Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.62:119-58(1982)。或者，抗体可以与第二种抗体缀合以形成抗体异源缀合物。(见例如Segal的美国专利No.4,676,980)。 

本发明的缀合物可以被用于修饰给定的生物应答，治疗剂或药物组分并非被解释成限定为经典的化学治疗剂。例如，药物组分可以是具有所希望的生物活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可以包括例如毒素如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白纤溶酶激活剂；凋亡剂例如TNFα、TNFβ、AIM I(见国际文献No.WO97/33899)、AIM II(见，国际文献No.WO97/34911)、Fas配体(Takahashi et al.,Int.immunol.,6:1567-1574(1994))、VEGI(见，国际文献No.WO99/23105)；血栓形成剂或抗血管生成剂例如血管抑素(angiostatin)或血管内皮抑素(endostatin)；或生物应答修饰剂例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白 介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其它的生长因子。基于抗体的基因治疗 

在本发明的另一个方面，以基因治疗的方式，施用包括编码抗体或其功能衍生物的序列的核酸治疗、抑制或预防与IL13的异常表达和/或活性相关的疾病或病症。基因治疗指的是通过给对象施用被表达的或可表达的核酸所进行的治疗。在本发明的这个具体实施方式中，所述核酸产生其所编码的介导治疗作用的蛋白质。根据本发明，可以使用任一种可获得的基因治疗的方法。下面描述了示例性的方法。 

对于基因治疗方法的一般性综述，见Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 12:488-505(1993)；Wu and Wu,Biotherapy3:87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan,Science 260:926-932(1993)；和Morgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993)；May，TIBTECH11(5):155-215(1993)。 

在一个方面，化合物包括编码抗体的核酸序列，所述核酸序列是在合适的宿主中表达所述抗体或其片段或嵌合蛋白或其重链或轻链的表达载体的一部分。特别地，这些核酸序列具有与所述抗体编码区可操纵地连接的启动子，所述启动子是诱导型的或组成型的启动子，并且任选地是组织特异性的启动子。 

在另一个特定实施方式中，使用核酸分子，所述核酸分子中抗体编码序列和任何其它所希望序列的侧翼是促进在基因组内所希望的位点上的进行同源重组的区域，并因此提供抗体编码核酸的染色体内表达(Koller and Smithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)；Zijistra et al.,Nature 342:435-438(1989))。在特定的实施方式中，所表达的抗体分子是单链抗体；或者，所述核酸序列包括编码抗 体的重链以及轻链、或其片段的序列。 

将核酸送递到患者体内可以是直接送递，其中患者直接暴露于所述核酸或携带核酸的载体，或者可以是间接的送递，其中首先在体外用所述核酸转化细胞，然后将细胞移植到患者体内。这两种方法分别被称为体内或回体(ex vivo)基因治疗。 

在一个特定实施方式中，直接在体内施用核酸序列，其中表达所述核酸以产生所编码的产物。通过本领域许多已知方法的任一种都可以实现这一点，例如通过将它们构建成为合适的核酸表达载体的一部分并施用，使得它们成为细胞内的核酸序列；例如通过有缺陷的或减活的逆转录病毒或其它病毒载体进行的感染(见美国专利No.4,980,286)；或通过直接注射裸DNA；或通过应用微粒轰击(例如，基因枪;Biolistic、Dupont)；或经脂质或细胞表面受体或转染剂包被，在脂质体、微粒体或微胶囊中包封；或通过与已知能进入细胞核的肽相连接而施用；或通过与配体相连接而施用以进行受体介导的胞吞作用的(参见例如Wu and Wu,J.Biol.Chem..262:4429-4432(1987))(这能被用于靶向于特异地表达所述受体的靶细胞类型)，等等。在另一实施方式中，可以形成核酸-配体复合物，其中所述配体包括破坏内含体的融合病毒肽，使得所述核酸避免溶酶体降解。仍在另一个实施方式中，通过靶向特异受体，所述核酸可以在体内被靶向于细胞特异的摄取及表达(见，例如PCT文献WO92/06180、WO92/22635、WO92/20316、WO93/14188、WO93/20221)。或者，可以将所述核酸导入到细胞内，并通过同源重组将其整合到用于表达的宿主细胞DNA内(Koller and Smithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)；Zijistra et al.,Nature 342:435-438(1989))。 

在一个特定实施方式中，使用含有编码本发明的抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可以施用逆转录病毒载体(参见Miller et al.,Meth.Enzymol.217:581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有正确包装病 毒基因组并将其整合到宿主细胞DNA内所必需的组分。将在基因治疗中所用的编码抗体的核酸序列克隆到一个或多个载体内，这有助于向患者体内的送递基因。在Boesen et al.,Biotherapy 6:291-302(1994)中可找到更多的关于逆转录病毒载体的细节，它描述了使用逆转录病毒载体将mdr1基因送递到造血干细胞内以便使得干细胞对化疗更为耐受。举例说明在基因治疗中使用逆转录病毒的其它参考文献是：Clowes et al.,J.Clin.Invest.93:644-651(1994)；Kiem et al.,Blood 83:1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg,Human Gene Therapy 4:129-141(1993)；和Grossman and Wilson,Curr.Opin.Gen.and Dev.3:110-114(1993)。 

在本发明中也可以使用腺病毒。在本发明中，腺病毒是特别引人注目的用于向呼吸道上皮送递抗体的载体。腺病毒天然地感染呼吸道上皮。基于腺病毒的送递系统的其它靶点是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞、和肌肉。腺病毒具有能感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson的Curr.Opin.Gen.Dev.3:499-503(1993)是一篇关于基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout et al.,Human Gene Therapy5:3-10(1994)显示了用腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮中。在Rosenfeld et al.,Science 252:431-434(1991)；Rosenfeld et al.,Cell 68:143-155(1992)；Mastrangeli et al.,J.Clin.Invest.91:225-234(1993)；PCT文献WO94/12649；和Wang,et al.,Gene Therapy 2:775-783(1995)中可以找到关于在基因治疗中使用腺病毒的其它实例。腺相关病毒(AAV)也已经被提出用于基因治疗(Walsh et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300(1993)；美国专利NO.5,436,146、6,632,670、6,642,051)。 

基因治疗的另一种方法包括通过例如电穿孔、脂染、磷酸钙介导转染、或病毒感染的方法将基因转移到在组织培养物中的细胞内。转移的方法通常包括将可选择标记转移到细胞。然后将所述细胞置于选 择条件下，以分离那些已经摄取并表达所转移的基因的细胞。然后将这些细胞送递到患者体内。 

在这个实施方式中，在体内施用所形成的重组细胞之前，将所述核酸导入到细胞内。可以用本领域已知的任一方法实现这种导入，所述方法包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、使用含有所述核酸序列的病毒或噬菌体载体的感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞(microcell)介导的基因转移、质体融合等等。用于将外源基因导入到细胞内的多种方法在本领域都是已知的(参见例如Loeffler and Behr,Meth.Enzymol.217:599-618(1993)；Cohen et al.,Meth.Enzymol.217:618-644(1993)；Cline,Pharmac.Ther.29:69-92m(1985))，根据本发明都可以使用这些方法，只要不破坏受体细胞的必要的发育功能及生理功能。所述技术应当向细胞内稳定地转移核酸，从而所述核酸可被细胞表达，并优选地是可遗传的和可被其细胞后代表达的。 

可以用本领域已知的各种方法将所形成的重组细胞送递到患者体内。优选地静脉内施用重组血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)。所用的细胞的量依赖于所希望的作用、患者的状态等等，并可由本领域技术人员所确定。 

其内可以导入用于基因治疗目的的核酸的细胞包括任何所希望的、可获得的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的造血干细胞或祖细胞。 

在一个实施方式中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。将编码本发明的抗体的核酸序列导入到细胞内，使得它们可被所述细胞或其后代表达；然后在体内施用所述重组细胞实现治疗作用。在一个特定实施方式中，使用干细胞或祖细胞。可以在体外分离并维持的任何干 细胞和/或祖细胞都有可能根据本发明的这个实施方式进行应用(参见例如PCT文献WO94/08598；Stemple and Anderson,Cell 71:973-985(1992)；Rheinwald,Meth.Cell Bio.21A:229(1980)；和Pittelkow and Scott,Mayo Clinic Proc.61:771(1986))。 

实施例

实施例1 

IL13免疫原(一种突变的、失活的人IL13/Fc(MT-IL13/Fc))的制备 

A.MT-IL13/Fc的表达质粒的克隆和构建 

据报道在第13位氨基酸残基上具有突变(谷氨酸突变成赖氨酸)的人IL13能以相同的或更高的亲和力与IL13Rα1结合，但其已经丧失了激活具有IL13Rα1的细胞的能力(Thompson et al.,J.Biol.Chem.,274:29944(1999))。在人胚胎肾细胞293-T内表达该突变的、失活的IL13(称为MT-IL13)。用纯化的重组蛋白作为本发明的免疫原，以产生抗IL13单克隆抗体。合成了2种对应于MT-IL13的寡核苷酸序列的寡核苷酸引物5'AAGCTTTCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCAT3'(SEQ ID NO 9)和5'CTCGAGGTTGAACCGTCCCTCGCGAAAAAG3'(SEQ ID NO10)，并将其用作聚合酶链反应(PCR)中的模板，以从人睾丸cDNA文库(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)中克隆IL13基因。将缺少预期的IL13的信号肽序列的PCR片段(342个碱基对)连接到pSecTag/FRT载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，所述pSecTag/FRT载体在其5’末端含有分泌信号肽序列以及在3’末端含有人Fcγ1(绞链区和恒定区CH2及CH3)序列。通过测序确认该构建体的组成。 

B.从所转染的293T细胞中产生MT-IL13/Fc 

为了短暂表达MT-IL13/Fc，根据生产商说明书，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将纯化的质粒DNA转染到293T细胞内。在转染后72个小时，收集转染细胞的培养物上清液用于纯化。为了稳定地表达MT-IL13/Fc，用Flp-In293T细胞系(Invitrogen)建立细胞系。为了确认表达，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析培养物上清液。将所分离的蛋白转移到硝基纤维素膜上，并通过与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的小鼠抗人IgG(Fc)单克隆抗体(Sigma,St.Louis,MO)或多克隆的山羊抗IL13抗体(R & D Systems,Minneapolis,MN)的反应进行检测，然后用HRP-驴抗山羊IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)对上述单克隆或多克隆抗体进行检测。利用增强的化学发光检测(Supersignal West PicoChemiluminescent Substrate,Pierce,Rockford,IL)在膜上鉴别出免疫反应性蛋白。 

C.MT-IL13/Fc的纯化 

用经磷酸盐缓冲液(PBS)平衡的hyper-D蛋白A亲和柱(Invitrogen)纯化MT-IL13/Fc。在往柱中加入细胞培养物上清液后，用超过20倍柱体积的PBS洗涤树脂。然后，用SCC缓冲液(0.05M柠檬酸钠、0.5M氯化钠，pH6.0)洗涤树脂，以去除未结合的蛋白质。然后洗脱出IL13融合蛋白(0.05M柠檬酸钠、0.15M氯化钠，pH3.0)，并在PBS中进行透析。 

用SDS-PAGE分析含有MT-IL13/Fc的得自亲和柱的级分。用考马斯蓝染色分析蛋白的纯度，以及如上所述用利用山羊抗人IgG(Fc)抗体(Sigma)和山羊抗人IL13抗体(R & D Systems)的Western免疫印迹法进行蛋白的鉴定。 

实施例2 

抗IL13单克隆抗体的产生 

给8-12周龄的雄性A/J小鼠(Harlan，Indianpolis，IN)皮下注射 200μl含20μg MT-IL13/Fc和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,MI)的PBS(pH7.4)。在两周的间隔内，给小鼠皮下注射两次处于弗氏不完全佐剂中的20μg MT-IL13/Fc。然后，在两周后以及在处死前3天，再次给小鼠腹腔内注射含有20μg同种免疫原的PBS。将从经一种或多种抗原免疫的小鼠中所分离到的脾细胞用于融合。对于大肠杆菌表达的人IL13(R & D Systems)作为免疫原时，也使用相似的免疫接种和融合的方法。 

在导致产生抗IL13 MAb 228B/C-1的融合中，组合来自两种免疫小鼠的26.4x10⁶个脾细胞和58.8x10⁶个脾细胞。对于每种融合，从免疫小鼠的脾中制备出单细胞悬液，并将其用于与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。在含有50%聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak,Rochester,NY)和5%二甲基亚砜(Sigma)的培养基中，按1:1的比例融合Sp2/0和脾细胞。然后在加有10%胎牛血清、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、和16μM胸腺嘧啶的DMEM培养基(Invitrogen,CA)中将细胞调整至浓度为每250μL悬浮液中1.5x10⁵个脾细胞。往约50个96孔微量培养板的每个孔内加入250微升细胞悬浮液。在约10天以后，取出培养物上清，用于在ELISA中筛选与MT-IL13/Fc的反应性。 

通过加入纯化的MT-IL13/Fc(0.1μg/mL)将Immulon 2(Dynatech Laboratories,Chantilly，VA)微量测定板的孔在室温下过夜包被。通过轻弹平板去除包被液之后，往每孔内加入200μL封闭/稀释缓冲液(含有2%小牛血清白蛋白和0.05% 

的PBS)1个小时以封闭非特异性位点。在1小时之后，用PBST缓冲液(含有0.05% 

的PBS)洗涤孔。从每个融合孔内收集50微升培养物上清液，并将其与50μL封闭/稀释缓冲液混和，然后将其加入到微量测定板的单个孔内。在温育1个小时之后，用PBST洗涤孔。然后通过与HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc特异的)(Jackson ImmunoResearch  Lab，West Grove，PA)的反应检测所结合的鼠抗体，并用封闭/稀释缓冲液按1:2,000将其稀释。往孔内加入含有0.1%3,3,5,5四甲基联苯胺(Sigma，St.Louis,MO)和0.003%过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶底物溶液进行显色30分钟。通过每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止反应。用BioTek ELISA读数器(BioTek Instruments,Winooski,VM)测定反应混和物的OD₄₅₀值。 

然后测定得自MT-IL13/Fc筛选阳性孔的培养物上清液与无关的Fγ1融合蛋白的阴性结合。然后通过有限稀释选择出单细胞克隆的最终阳性孔。用ELISA重新测定得自单克隆抗体的培养物上清液以确认其活性。将所选择的杂交瘤生长在锥形瓶内，并收集用过的培养物上清液用于通过蛋白A亲和层析进行抗体纯化。 

用四种测试测试纯化的抗体：i)与293T细胞表达的MT-IL13/Fc以及大肠杆菌表达的小鼠IL13的交叉反应性；ii)抑制HDLM-2和L-1236细胞的IL13自分泌性增殖；iii)抑制IL13诱导的THP-1细胞中的STAT6磷酸化；和iv)抑制IL13调节的人单核细胞的CD14及CD23的表达。 

从在MT-IL13/Fc和IL13免疫的小鼠中进行的融合中得到了73种抗IL13MAb。纯化了39种Mab用于通过ELISA和基于细胞的测试描述它们的特征。这39种MAb中有13种MAb抑制自分泌性IL13诱导的HDLM-2和L-1236细胞的增殖(见实施例5中的测试描述和结果)。ELISA中发现了4种MAb与人IL13有着强反应，并且它们在基于功能性细胞的测试中中和人IL13。这些抗体被称作228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43。所有的这些抗体都是利用糖基化MT-IL13/Fc作为免疫原产生的。 

实施例3 

ELISA测定的抗IL13单克隆抗体与人及小鼠IL13的反应性 

用ELISA测试各种抗IL13单克隆抗体的反应性。通过添加100μL含有0.1μg/mL IL13蛋白的PBS溶液，96孔微量测定板的不同孔用大肠杆菌表达的非糖基化的人IL13(R&D Systems)、293T细胞表达的糖基化MT-IL13/Fc、或大肠杆菌表达的小鼠IL13(R&D Systems)包被。在室温下过夜温育之后，用PBSTB(含有2%BSA的PBST)处理孔以饱和剩余的结合位点。然后用PBST洗涤孔。 

在室温下往孔内加入100微升2倍系列稀释的抗IL13MAb(从0.5μg/mL(3.33nM)到0.05ng/mL(0.00033nM))1个小时。同时测定来自(BD Biosciences-Pharmingen,San Diego,CA)的抗IL13MAb JES-5A2，并将其作为阳性对照。这种抗体是通过利用大肠杆菌表达的人IL13作为免疫原产生的。将同种型匹配的小鼠抗HIV-1gp120MAb作为无关的阴性对照。然后用PBST洗涤孔。通过与稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch)在室温下温育1个小时检测所结合的抗体。然后如上述的加入过氧化物酶底物溶液显色。用ELISA读数器测定OD₄₅₀。 

图1显示了ELISA测定的抗IL13MAb228B/C-1、228A-4、227-26、227-43和阴性对照的剂量依赖性结合。在这些MAb中，228B/C-1表现出最强的反应性。图2显示了ELISA测定的抗IL13MAb与MT-IL13/Fc的剂量依赖性的结合。228B/C-1和228A-4表现出与MT-IL13/Fc最强的反应性，而227-26和227-43表现出中等的反应性。 

图1和2显示228B/C-1在所有被测试的抗IL13MAb中具有与糖基化及非糖基化的人IL13最高的亲和力。在ELISA测定中，所有这些抗IL13MAb与小鼠IL13都没有交叉反应(数据未显示)。 

实施例4 

JES10-5A2缺乏对228B/C-1-Hrp与人IL13结合的竞争 

为了研究JES10-5A2和228B/C-1是否与人IL13上的相同的表位结合，用竞争性ELISA检查JES10-5A2对228B/C-1-HRP与大肠杆菌表达的人IL13结合的作用。96孔微量测定板中的每个孔都与100μL含有0.1μg/mL IL13蛋白的PBS溶液温育。在室温下过夜温育之后，用PBSTB(含有2%BSA的PBS)处理孔以饱和剩余的结合位点。然后用PBST洗涤孔。将50微升2倍系列稀释的228B/C-1和JES10-5A2(终浓度从20μg/mL到9.76ng/mL)与50μL预先滴定的228B/C-1-HRP(1:6,400稀释)混和。然后将混和物加入到孔中，并在室温下温育1个小时。然后如上所述加入过氧化氢酶底物溶液显色。用ELISA读数器测定OD₄₅₀。 

图3证实了JES10-5A2不竞争228B/C-1-HRP与人IL13的结合，说明228B/C-1和JES10-5A2与人IL13上的不同位点相结合。 

实施例5 

通过利用L-1236和HDLM-2细胞的IL-13自分泌依赖性增殖测试筛 

选抗IL13的中和单克隆抗体 

L-1236和HDLM-2是从德国Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ,Braunschweig,Germany)得到的霍奇金淋巴瘤细胞系。这些细胞系产生IL13，而IL13接下来以自分泌的方式激活它们的细胞增殖(Kapp U et al.,J.Exp.Med.189:1939(1999))。 

在有或没有不同的抗IL13MAb(0.2、0.02和0.002μg/mL)时，将细胞在5%CO₂、37℃下培养(25,000个细胞/孔)3到5天。然后通过利用四唑盐化合物MTS(Promega,Madison,WI)的测试(在OD₄₉₀读取)或通过掺入³H-胸腺嘧啶(Amersham Biosciences,Piscataway，NJ)测定细胞增殖。 

预计往这些细胞系的培养物中添加抗IL13中和MAb将通过结合并使这些细胞所产生的IL13失活而抑制细胞的增殖。图4所示的结 果显示了本发明的抗IL13MAb对L-1235细胞增殖的作用。在所测试的中和抗体中，MAb228B/C-1显示出最高效力地以剂量依赖性方式抑制L-1236细胞增殖。而TA1-37(用大肠杆菌表达的人IL13作为免疫原所产生的抗IL13MAb)甚至在剂量高到0.2μg/mL也没有任何的抑制活性。用HDLM-2细胞得到了相似的结果。 

实施例6 

对原代人单核细胞上的IL13调节的CD14和CD23表达的测试 

IL13诱导对人单核细胞上的CD14表达的抑制以及对CD23表达的上调(de Waal Malefyt et al.,J.Immunol.,151:6370(1993)；Chomarat et al.,Int.Rev.Immunol.,17:1(1998))。通过在Histopaque-1077(Sigma)中的密度梯度离心从新鲜收集的、肝素化的健康人供体的全血中分离出外周血白细胞(PBLs)。向含有重组IL13(终浓度10ng/mL=0.813nM)和抗IL13单克隆抗体或无关抗体(三倍系列稀释，始自终浓度12μg/mL=80nM)的96孔组织培养板的每个孔内都加入悬浮在加有5%小牛血清的RPMI-1640(Invitrogen)中的PBLs(1.5x10⁶)。通过向温育培养基中加入0.813nM人IL13分别抑制或上调了单核细胞上的CD14表达或CD23表达。对照培养基含有RPMI-1640/FBS培养基，但不含有重组IL13。 

将细胞在5%CO₂、37℃下温育2天。收集细胞，用抗CD14-FITC或抗CD23-PE(BD Biosciences-Pharmingen)染色。用流式细胞术测定单核细胞群上的CD14和CD23的表达水平，并用中位荧光强度(Median Fluorescence Intensity，MFI)表示。 

图5描述了抗IL13MAb对受IL13抑制的人单核细胞上的CD14表达的作用。在所有测试的抗IL13MAb中，228B/C-1在抑制IL13对CD14表达的作用上具有最高的效力。在0.33nM浓度上，达到对IL13作用的完全抑制。MAb227-26和228A-4的抑制活性是中等的， 而JES10-5A2具有弱活性。甚至在80nM浓度上，JES10-5A2仍不能完全地抑制IL13的作用。 

图6描述了抗IL13Mab对IL13诱导的人单核细胞上的CD23表达上调的作用。与CD14表达中的结果相似(图5)，在所有测试的抗IL13MAb中，228B/C-1最有力地抑制IL13对CD23表达的作用。0.33nM浓度的228B/C-1达到完全抑制。JES10-5A2具有弱抑制效力。 

根据图5和6所示的结果，在摩尔化学计量比为1:2(MAb:IL13)时，228B/C-1可以实现对IL13的完全抑制，因此，228B/C-1是一种具有非常高亲和力的抗人IL13的中和MAb。 

实施例7 

IL13诱导的THP-1细胞中的STAT6磷酸化的测试 

IL13能激活髓细胞系THP-1(ATCC，Manassas，VA)以诱导STAT6的磷酸化，这是IL13的信号传导途径中的关键步骤(Murata T et al.,Int.Immunol.10:1103-1110(1998))。在这个测试中，测试了抗IL13MAb对IL13的抑制作用。 

将THP-1细胞维持在加有5%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Invitrogen)中。在试验当天，洗涤细胞并将其在无血清的DMEM中、37℃和5%CO₂下温育2个小时。然后向96孔圆底平板的每个孔内都加入80μL含有0.3x10⁶个细胞的无血清培养基，和120μL含有人IL13(终浓度为10ng/mL=0.813nM)和抗IL13Mab(5倍系列稀释液，始自终浓度0.5μg/mL=3.333nM)。阴性对照孔不含有IL13或含有IL13以及同种型匹配的无关MAb。 

将混和物在5%CO₂、37℃下温育10分钟。然后将平板在4℃、300xg下离心3分钟。在倒掉上清液之后，将细胞沉淀物重悬在100μLLaemmli非还原样品缓冲液(SDS-PAGE上样缓冲液，BioRad，CA)中，然后将其转移到微量离心管内。将所述离心管在95℃下加热5 分钟，然后在室温下10,000xg离心10分钟。收集上清液，并用4-20%梯度SDS-PAGE分析。将所分离的蛋白质转移到PVDF膜上，然后将膜与稀释的小鼠抗人Stat6(Y641，磷酸特异的)MAb(BD Bioscienses Pharmingen)一起温育。 

用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc)抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)检测结合的抗体。利用增强的化学发光测试(Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate,Pierce)鉴定膜上的免疫反应性蛋白。图7描述了抗IL13MAb对IL13诱导的THP-1细胞中的Stat6磷酸化的作用的结果。在经0.813nM人IL13处理的THP-1细胞中，Stat6被磷酸化。当用MAb228B/C-1、228A-4、227-26、227-43和JES10-5A2处理细胞时，发现了对Stat6磷酸化的剂量依赖性的抑制作用。在所测试的抗IL13Mab中，MAb228B/C-1是作用最强的中和抗体。浓度为0.667nM和0.133nM之间的228B/C-1可以达到完全抑制。完全抑制时的228B/C-1和IL13之间的近似摩尔化学计量比是1:2。这与图5和6中所示的数据一致。 

实施例8 

对编码抗IL13单克隆抗体的重链和轻链基因的分子克隆 

用QIAGEN试剂盒(Valencia，CA)从杂交瘤细胞中分离出总RNA。如下进行逆转录(第一链cDNA)反应：将1-1.5mg总RNA与1ml 10mM dNTPs、50ng随机六聚物、以及无RNase的水混和，终体积为12mL。 

将反应混和物在65℃下温育5分钟，并立即将其放置于冰上1分钟。在短暂离心之后，加入以下试剂：4mL5X第一链缓冲液(250mM Tris-HCl、pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl₂)、2mL 0.1mM DTT、和1mL RNaseOUT RNase抑制物(40U/mL)。在混和之后，将反应物在室温下温育2分钟。然后向混和物中加入1mL Superscript II  RT(50U/mL)，在25℃温育10分钟，随后在42℃温育50分钟。在短暂离心之后，将反应物在70℃温育15分钟以灭活逆转录酶。然后加入1μL RNaseH(2U/mL)，并将反应物在37℃温育20分钟以破坏RNA。 

为了扩增重链和轻链的可变区，使用了O’Brien和Jones(O'Brien S.and Jones T.,"Humanizing antibodies by CDR grafting",Antibody Engineering,Springer Lab manual,Eds.Kontermann and Duble,S(2001))描述的方法。简要而言，从信号肽区选择5’引物(轻链有11组，重链有12组简并引物)，从轻链或重链的恒定区内选择3’引物。将5’和3’引物(1.5mL10mM)与5mL 10X PCR缓冲液(250mM Tris-HCI、pH8.8，20mM MgSO₄，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，1%Triton X-100，1mg/mL无核酸酶的BSA)、先前制备的1mL cDNA、1mL Turbo pfu(Stratagene)混和，并用水将其终体积调整为50mL。如下进行PCR：1个循环的94℃下4分钟；25个循环的94℃下30秒、53℃下30秒、和72℃下45秒；1个循环的72℃下7分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析反应混和物。 

纯化所扩增的DNA片段，并将其克隆到pcDNA3.1载体内。根据厂家所推荐的方案，利用Invitrogen TOPO克隆试剂盒进行克隆。15到20个转化大肠杆菌的克隆被用于质粒纯化。用T7引物对质粒进行测序。通过杂交诱变技术(Glaser S.et al.Antibody Engineering(Oxford University Press,New York(1995)),Near RI,BioTechniques 12:88(1992))将重链和轻链的优势序列(predominant sequences)克隆到M13Fab表达载体内。用ELISA确认所表达的Fab的结合性质。图8-10分别描述了228B/C、228A-4和227-26的VH和VL链的氨基酸序列。 

实施例9 

对克隆228B/C的人源化 

A.通用方案 

如在实施例8中所述，克隆并测序鼠抗体228B/C的可变区。构建在噬菌体载体中的嵌合Fab作为对照，该嵌合Fab组合了鼠228B/C的可变区和人kappa链的恒定区以及人IgG的CH1部分。 

为了开始人源化过程，根据在WO04/070010(其全文并入本文作参考)所述标准，从已知的人生殖系基因序列中选择合适的v基因序列以提供构架区1到3(FM1-FM3)，选择合适的J基因序列以提供构架区4(FM4)。这个模板可以根据例如它的相对总长度、CDR的大小、位于构架和CDR之间的连接处的氨基酸残基、整体同源性等等选出。所选出的模板可以是多个序列的混和物或者可以是共有模板。 

构建一个表达载体，其包括重链和/或轻链变体，所产生的重链和/或轻链变体包括结构式： 

FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4(i)和 

FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4(ii) 

其中FRH1、FRH2、FRH3、FRH4、FRL1、FRL2、FRL3和FRL4代表从生殖系模板中选出的重链和轻链序列的构架模板的变体，CDR代表亲代抗体的CDR。确定鼠亲代抗体和所选择的人模板序列之间的差异，以此作用为产生抗体Fab文库的基础。可以单独地产生轻链的文库，然后产生重链的文库，或者可以同时产生两个文库。也可以对构架进行人源化的同时或依次分析CDR区的亲和力成熟。 

产生变体Fab的文库，其在每个被发现与鼠构架序列不同的所选择的位点上含有：(1)鼠氨基酸残基；(2)来自所选出的人生殖系基因的氨基酸残基，或任选地；(3)随机选择的氨基酸。通过对重叠的寡核苷酸进行退火以及随后在感兴趣的构架位点上整合进所选出的氨基酸残基可以产生所希望的变体。利用两种引物可以进行对退火产物的扩增，其中一种引物是被生物素标记的。生物素标签被用于纯化单链 引物，该引物在利用以U模板形式存在的感兴趣的载体的基于Kunkel的诱变反应中被用作诱变寡核苷酸(Rosok,M.J.,et al.,(1996)Journal of Biological Chemistry 271:22611-22618)。在退火和延伸质粒之后，用独特的限制性酶Xbal对反应物进行消化，该酶切割原始模板但不切割新合成的突变链。将质粒电穿孔到感受态细胞内进行扩增，并将其与噬菌体感受态大肠杆菌细胞类型混和以产生噬菌体颗粒。所述质粒构建体能合成Fab，其被分泌到上清液内。选择单个噬菌斑和洗脱的抗体用于分析。 

分析文库的质量和完整性。在对文库的随机样品进行测序之后，确定具有正确的Vk(或Vh)插入的区域的候选物的数目。用这个数目确定文库的总效率。一旦建立了文库，用基于功能性ELISA的测试筛选候选物以确定哪些候选物产生特异于IL13的功能性的Fab。还进一步测试了那些显示与嵌合克隆相当的针对IL13的活性的候选物以检验可重复性。对一些候选物测序，以确定所靶向的构架位点对于人源化的耐受程度。 

在发现文库是代表性文库之后，分析变体的结合亲和力，对那些发现具有与嵌合对照抗体相当的或更大的结合亲和力的变体进行测序。如果所分析的分离物在构架中所选择的位点上未含有来自人生殖系基因的残基，则推定在该位点上人的氨基酸残基是不被耐受的。在这个位点上，如果仅仅测试鼠和人的氨基酸，那么可以构建另一个Fab文库，使得在未发现人模板残基的位点上的氨基酸随机化。然后可以选择出具有合适的取代残基(非鼠的)的Fab，并将其转化成完整MAb。另外，共有模板也可以被用作起始构架。 

B.IL13单克隆抗体Vk人源化 

首先进行对轻链可变区(Vk)的人源化。但是，人们可以从任一条链开始人源化或同时对两条链进行人源化。所选的人模板是人模板2， 并包括研究接近于轻链内的CDR的9个残基的作用，以确定它们是否可被人源化且不丧失功能活性。在轻链中所研究的用于第二轮筛选的位点是4、9、12、73、81、82、83、84、和109。 

通过用鼠的或人模板的残基对这些位点中的每个位点进行改变产生了一个文库。用功能性ELISA测试筛选了大约860个变体。仅仅18个候选物显示与嵌合克隆相当的功能。进一步测试了这些候选物。与嵌合克隆比较，18个中的6个候选物显示与抗原更高的亲和力，对这6个变体测序。在图11A和B中显示了测序结果，从这些结果中发现，4、12和81位点偏爱鼠残基。 

C.Vh人源化 

为了评价重链构架残基对候选抗体的总体功能的贡献，建立了一个文库，其中对不同于鼠亲代但保留了鼠轻链的人DP27模板构架中的10个位点进行改变。利用Vh的合成的重叠寡核苷酸产生这个文库，并用PCR产生鼠Vk。然后利用诱变将所述Vk和Vh插入到Fab表达载体内，然后筛选文库中的功能性Fab。所述文库的复杂性是(210/70%)x3=3840。 

用96孔形式的ELISA测试筛选了总共1056个候选物。从该文库中选择出用于测序的候选物是那些在筛选结果中获得最高值的候选物。对这些高活性候选物中的5个测序，以确定人源化的水平，在图12A和B中显示了它们的序列。从这些结果中看到，重链上的三个构架残基偏爱小鼠残基(#24、68和94)。 

第二个被研究的构架是人模板NEW。产生了组合文库，其中同时人源化Vk和Vh。在鼠和人残基之间，Vk中的9个残基有所不同，Vh中也选出了9个残基。筛选了来自该文库的近5200个候选物(55个96孔板)。从筛选中看到，大约300个候选物产生了与嵌合克隆相当的结果。在这个组中，对30个候选物测序以确定出这些功能性克 隆的人源化的水平。 

在图11A和B中显示了轻链的测序结果。在图12A和B中显示了重链序列。Vk上的位点83具有保留鼠残基的高发生率，Vh模板上的一些位点偏爱鼠残基。具体地，在所筛选的30个候选物中，29个的位点94都保留了鼠残基。尽管没有候选物表现出完全人源化的构架，Vk或Vh中的一些其中被高度人源化的可变区将被用于进一步的人源化。将最高人源化的Vk与最高人源化的Vh组合，以测定其功能活性(见图13)。 

利用DP27作为重链模板以及HT2作为轻链模板，产生第二个组合感兴趣的Vk和Vh的构架残基的文库。如上所述，合成了重叠寡核苷酸，它们包含在每个所研究的位点上具有人或鼠残基的人构架。混和这些寡核苷酸，然后退火以产生完整的可变区。用PRC扩增这些可变区，然后将其制成单链片段。将所述片段磷酸化，然后将其用于诱变反应，以便将可变区整合到基于M13的载体内。然后在基于ELISA的测试中筛选文库中的特异于IL-13的功能性的Fab。在图11C&D和图12C&D中分别显示了轻链和重链的序列。 

从测序结果中看到，Vk链能完全耐受人的残基，因此该链是完全人源化的。对于重链，两个位点不能耐受人残基：位点24和94。因此，重链可变区是～98%人源化的。 

D.组合的人源化候选物的产生 

因为从对完全人源化的文库的筛选中都不能挑选出候选物，因此对人源化进行了工程化。产生了一系列候选物，其中获得了所希望的人源化水平。将来自HT2文库的最高人源化的Vk与来自NEW或DP27文库的最高人源化的Vh组合。然后测试这些组合的候选物，以确定出在保持特定功能的同时具有最高人源化水平的候选物。从HT2-NEW中选出的候选物是重链为HT2-NEW#73和轻链为 HT2-NEW#115。从HT2-DP27轻链中选出的候选物是HT2-DP27#89和HT2-DP27#144；重链的候选物是HT2-DP27#123和HT2-DP27#276。对于HT2-DP27，如下制备构建体：#89Vk与#276Vh、和#89Vk与#123Vh；#144Vk与#276Vh和#144Vk与#123Vh。另外用#144Vk DP27与#73Vh NEW制备一个构建体，以确定NEW和DP27与HT2轻链之间的相互作用是否有所不同。 

用EILISA测试这些组合以确定在进一步人源化之后是否有任何的功能的进一步丧失。对于这些测试，将有限的量的抗原IL13置于平板上。然后向平板内以已知浓度加入抗IL13Fab，并在板上按1:3稀释滴定。用特异于Fab的二级抗体检测结合。图13描述了功能性测试的结果。图13A：115Vk/73Vh；图13B：89Vk/276Vh；图13C：144Vk/276Vh；图13D-144Vk/73Vh。从这些数据中看到，所观察到的结果说明人源化的可变区的工程化组合并没有反向影响Fab与抗原的结合。 

因为图11和12中的结果说明HT2轻链可以被完全人源化以及DP27中的除两个位点(24和94)以外的所有位点都可以被人源化，所以对理想的(ideal)人源化候选物进行工程化，其中只保留了2个鼠残基。在产生这个特定的候选物之后，测试该克隆，将其与其亲代以及其它候选物进行比较以确定是否有任何功能丧失。从图14A所示数据看到，该高度人源化(89Vk/276G)的候选物并没有显示出显著的功能丧失。也对HT2-NEW构架候选物进行了人源化。该候选物的最终的人源化水平是98%，因为在重链中仍保留有两个鼠残基。图14B显示了该构建体(115Vk/73Vh FL)的ELISA结果。 

通过取代两个剩余的鼠残基进行了进一步人源化89Vk/276G的尝试。在将位点突变成人的残基之后，用ELISA测试候选克隆并将其与亲代进行比较。但是，在用那些所选择的模板取代鼠残基之后，观察到了显著的功能丧失。因此，产生了另一个文库，其中Vh上的 两个位点被随机化，以使得产生在这两个位点上具有所有可能氨基酸的变体。利用功能性ELISA测试筛选候选物，将产生与亲代克隆(89Vk/276G)相当的结果的30个候选物测序，以确定在靶位点上出现的是哪个氨基酸。下面显示了候选物以及在两个位点上的氨基酸的列表。 

候选物	24	94	候选物	24	94
						228B/C	V	G	RL49	A	T
DP27	F	R	RL59	I	M
						89/276G	V	G	RL61	S	T
RL7	A	S	RL62	T	T
						RL8	L	S	RL70	S	L
RL11	T	V	RL72	V	T
						RL12	I	I	RL78	I	M
RL15	L	L	RL79	V	T

候选物	24	94	候选物	24	94
						RL19	S	L	RL84	L	T
RL27	G	V	RL88	L	S
						RL32	G	G	RL89	L	S
RL35	S	L	RL91	G	L
						RL36	G	V	RL95	I	L
RL40	L	S	RL97	T	T
						RL45	T	T	RL18	S	R

因此，从这个筛选中看到，一些氨基酸在所制定的位点上明显是可耐受的，并不会造成功能的显著丧失。因此，通过将构架残基变为在鼠序列以及在人构架中都不能找到的氨基酸，产生了完整功能性的 Fab，且对与靶抗原的结合没有有害的作用。进一步被测试的来自该随机文库的候选物是RL-19和RL-36。 

实施例10 

CDR的最优化 

在确定出候选抗IL13抗体的最优化构架序列之后，进行对CDR的最优化。对于这个过程，将CDR氨基酸序列随机化，然后筛选文库以鉴定出那些具有与亲代克隆相等的或更好的功能活性的候选物。对于这个文库，亲代候选物是RL-36(见上)。将6个CDR随机排列，一次一个位点，并用功能性ELISA筛选所述文库。对强反应性的候选物进行测序，以与亲代CDR进行比较。注意在下面表中所列的所有独特的序列也以合适的SEQ ID NO标识的形式出现在图20中。 

A.CDR-L1的最优化 

CDR-L1包括15个氨基酸。利用合成的寡核苷酸将这些位点中每个位点随机化，所述寡核苷酸以等摩尔量混和以用于诱变反应。诱变性寡核苷酸的整合效率被确定为40%。利用这个百分比，需要被筛选的候选物的数目是3600个。用功能性ELISA测定克隆，得到相当功能活性的那些克隆被测序。从所筛选的大量候选物中，鉴定出166个阳性候选物。从这个组中，对10个候选序列测序以确定CDR内的变化。从下面显示的测序结果中看到，导致亲和力提高的位点11和14的变化是从N到Q以及从M到L。 

B.CDR2-L2的最优化 

CDR-L2包括7个氨基酸。如上所述制备文库。该文库的效率为80%，测试了840个克隆。从测试中所鉴别到的阳性克隆的数目是75个，对11个克隆测序。从下面所示的结果中看到，该CDR内的一些位点提高了活性，尽管位点和取代氨基酸看上去是随机的。这个结果支持了CDR-L2离抗原结合位点最远的观察结果，因此其对抗原结合应该表现最小的影响。 

C.CDR-L3的最优化 

CDR-L3由9个氨基酸构成。所产生的这个文库产生了50%的效率，需要筛选～1700个克隆。从这个筛选中，鉴别到257个阳性候选物，对其中10个进行测序。从这些结果中看到，仅仅一个位点产生了与亲代序列不同的变化。一些候选物显示了相同的序列，说明这个位点的变化是被高度偏爱的(从N到A)。 

D.CDR-H1的最优化 

CDR-H1包含5个氨基酸。该文库的效率为80%，仅需要筛选约600个候选物。从该筛选中得到了138个阳性克隆，对其中11个克隆测序。从下面所列的结果中看到，该CDR中的第二个位点似乎提供了最大的提高抗原结合的机会。但是，一些氨基酸有利地影响结合。 

E.CDR-H2的最优化 

CDR-H2包括16个氨基酸。该文库的效率为70%，这意味着需要筛选超过2100个候选物。从这个筛选中鉴别出192个阳性候选物，对13个进行测序，以确定在CDR内所发生的变化。从下面所列的测序结果中看到，一些位点提高了结合亲和力，但是没有一个氨基酸改变显示与亲代的显著不同。 

F.CDR-H3的最优化 

CDR-H3包括10个氨基酸。一般相信这个CDR是对抗原结合施加了最大影响的CDR部分，因为该环通常位于结合位点的中间。该文库具有40%的效率，因此需要筛选2400个候选物。其中，鉴别出174个阳性候选物，并对10个测序以确定出CDR内的变化。下面所列的结果提示在第三个位点从Y到R的变化可能是用于提高结合的一个重要变化。 

G.组合文库 

一旦确定了造成抗原结合的最大程度的总体提高的CDR内的变化，就对最佳候选物进行组合以观察这些变化是否能提高了结合力。因此，对候选物进行工程化以组合所有有利的氨基酸取代。 

为了产生组合文库，最初克隆是一个整合了CDR-L1-59内的改变(N到Q)的克隆。对于该克隆，进行了其它改变：CDR-L3是N到A(位点4)；CDR-H1是Y到R、H、K、或S(位点2)；CDR-H3是Y到R(位点3)和D到K或S(位点9)。对CDR-L2或CDR-H2没有进行改变。用功能性ELISA测试筛选了超过1100个来自该文库的候选物。总共鉴别出120个候选物具有比亲代克隆更高的活性。在图15中显示了这些克隆的序列。 

为了确认这些组合候选物保留了功能，进行了竞争测试。对于该测试，将IL-13捕获到ELISA平板上。将不同浓度的候选物(即纯化的Fab)与恒定浓度的标记的嵌合抗IL-13Fab预先混和。向ELISA平板中加入该混和物。检测能与结合在平板上的IL13结合的标记的嵌合的抗IL13。 

从这个竞争测试的结果中看到，两种测试的候选物都显示相等的与嵌合候选物(228B/C#3)竞争与IL-13结合的能力(图16)。无关Fab是5I，其显示没有竞争的能力。图17描述了三种亲和力成熟的候选物的序列。 

实施例11 

表位定位 

抗IL-13MAb 228B/C-1与一个构象表位结合，并以与人IL13结合相同的高亲和力与cynomologous猴的IL13结合。但是，228B/C不与鼠IL13结合。因此，设计用于表位定位的策略是将猴IL13的一小部分与相应的小鼠IL13序列互换。如在图18中所示的合成重叠寡核苷酸。进行两轮PCR以装配出IL13杂交构建体，使得用来自小鼠 IL13的相应序列取代猴IL13的一部分序列(图18)。利用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将最终的PCR扩增的IL13编码区符合读框地克隆到具有V5标签的pcDNA3.1载体内。通过测序确认所有的PCR扩增的区域都只含有所希望的结构域交换突变(domain swapping mutation)，并且在表达载体中没有其它的非所希望的突变。 

抗IL13MAb结合表位被鉴定为从氨基酸#49到56的8肽ESLINVSG(SEQ ID NO18)。这个表位位于人IL13的B螺旋和BC环中。当来源于cyno-IL13的表位肽被用于交换鼠IL13中的相应序列时，所形成的杂交IL13分子能与228B/C结合，其结合亲和力与原始的cynoIL13的结合亲和力相似，进一步确认了228B/C MAb在残基#49-56之间的肽上与cyno或人IL13结合。人、cyno、和鼠IL13的序列比较显示只有人IL13中的三个残基Ile52、Val54、Gly56不是保守的，提示这三个残基中的一个或多个的组合决定了IL13和抗IL13MAb通过该8肽相互作用的关键残基。 

用肽点分析(peptide spot analysis)进一步确认该表位。用一系列经SPOT合成的在纤维素膜上的重叠的12肽扫描整个人IL13肽。唯一的抗IL13MAb反应性肽被鉴定为氨基酸#44-56的12肽，YCAALESLINVS(SEQ ID NO 19)，该序列与通过结构域交换试验中所鉴别的区域重叠。 

保藏 

下面的培养物已经被保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas Va.20110-2209 USA(ATCC))： 

杂交瘤	ATCC编号	保藏日期
			抗IL13 228B/C-1	PTA-5657	2003年11月20日
抗IL13 228A-4	PTA-5656	2003年11月20日

[0298] 

抗IL13 227-26	PTA-5654	2003年11月20日
			抗IL13 227-43	PTA-5655	2003年11月20日

本保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约及其细则(布达佩斯条约)的相关规定进行的。这保证了从保藏之日起保持该活培养物30年。在布达佩斯协议的范围下，通过ATCC可以获得该生物体，这保证了在相关的美国专利授权之后，公众可以永久地、不受限制地获得该培养物的后代。 

本申请的受让人已经同意如果当在合适条件下培养的被保藏培养物死亡或丢失或被损害时，在被通知后将迅速地用相同培养物的活体样品代替。保藏菌株的获得并不作为在违反任何政府主管部门根据其专利法所赋予的权利下实施本发明的许可。 

上面所写的说明书据信足以使得本领域技术人员能够实施本发明。本发明并不受所保藏的培养物的范围的限定，因为所保藏的实施方式只是用作举例说明本发明的一个方面，任何功能上等价的培养物都在本发明的范围之内。本文的保藏材料不构成对本文所含的所写的描述不足以能实践本发明的任何方面(包括本发明的最佳模式)的承认，它也不被用于将本权利要求书的范围限定到本文所呈现的特定的举例说明。事实上，通过上面的描述，对本发明的各种除了本文所示的和所述以外的修饰对于本领域人员将是显而易见的，并且都在附录的权利要求书的范围之内。 

本领域人员将认识到，或者能确信应用不超出常规试验范围的、与本文所述特异的实施方式等价的多个等价物。下面的权利要求书包括这些等价物。 

Claims (61)

1.一种特异地并且高亲和性地与糖基化和非糖基化的人IL13都可以结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段不与小鼠IL13结合，并在1:2(MAb:IL13)的近似摩尔比中和人IL13活性。

2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是228B/C，其由被命名为PTA-5657的杂交瘤产生。

3.一种与权利要求2的抗体结合相同表位的抗体。

4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是228A-4，其由被命名为PTA-5656的杂交瘤产生。

5.权利要求1的抗体，其中所述抗体是227-26，其由被命名为PTA-5654的杂交瘤产生。

6.权利要求1的抗体，其中所述抗体是227-43，其由被命名为PTA-5655的杂交瘤产生。

7.一种抗体，其中所述抗体包括来源于权利要求1的抗体的轻链和重链可变区的抗原结合区。

8.权利要求7的抗体，其中所述抗体具有与SEQ ID NO:3所示序列至少95%同源的VL序列，以及与SEQ ID NO:4所示序列至少95%同源的VH序列。

9.权利要求7的抗体，其中所述抗体具有与SEQ ID NO:5所示序列至少95%同源的VL序列，以及与SEQ ID NO:6所示序列至少95%同源的VH序列。

10.权利要求7的抗体，其中所述抗体具有与SEQ ID NO:7所示序列至少95%同源的VL序列，以及与SEQ ID NO:8所示序列至少95%同源的VH序列。

11.一种产生选自由228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43组成的一组的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，分别用ATCC保藏号PTA-5657、PTA-5656、PTA-5654、和PTA-5655命名。

12.一种包括编码权利要求1的抗体的核酸的细胞系。

13.一种包括编码权利要求1的抗体的核酸的载体。

14.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

15.权利要求14的抗体，其中所述单克隆抗体是人抗体、嵌合抗体、或人源化抗体。

16.一种包括权利要求1的抗体和生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂的组合物。

17.一种轻链可变区，其包括具有以下结构式的氨基酸序列：FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4，其中FRL1由SEQ ID NO:20-25中的任一序列组成；CDRL1由SEQ IDNO:99-103中的任一序列组成；FRL2由SEQ ID NO:29组成；CDRL2由SEQ ID NO:104-114中的任一序列组成；FRL3由SEQID NO:30-56中的任一序列组成；CDRL3由SEQ ID NO:115-116中的任一序列组成；以及FRL4由SEQ ID NO:57-59组成。

18.一种轻链可变区，其包括SEQ ID NO:3、5、7、93、95、97、142、144、和150中的任一序列。

19.权利要求17的轻链可变区，其进一步包括一个恒定区。

20.权利要求18的轻链可变区，其进一步包括一个恒定区。

21.一种重链可变区，其包括具有以下结构式的氨基酸序列：FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4，其中FRH1由SEQ ID NO:60-66中的任一序列组成；CDRH1由SEQ IDNO:117-122中的任一序列组成；FRH2由SEQ ID NO:67-75中的任一序列组成；CDRH2由SEQ ID NO:123-134中的任一序列组成；FRH3由SEQ ID NO:76-90中的任一序列组成；CDRH3由SEQ IDNO:135-141中的任一序列组成；以及FRH4由SEQ ID NO:91-92组成。

22.一种重链可变区，其包括SEQ ID NO:4、6、8、94、96、98、143、145、146、147、148、和149中的任一序列。

23.权利要求21的重链可变区，其进一步至少包括恒定区的CH1区。

24.权利要求23的重链可变区，其包括恒定区的CH1、CH2和CH3区。

25.权利要求24的重链可变区，其中所述恒定区来自IgG抗体。

26.权利要求25的重链可变区，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、或IgG4抗体。

27.权利要求22的重链可变区，其进一步至少包括恒定区的CH1区。

28.一种包括权利要求17的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与IL13特异结合。

29.一种包括权利要求21的重链可变区的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与IL13特异结合。

30.权利要求28的抗体，其包括权利要求21的一个重链区。

31.权利要求30的抗体，其包括具有SEQ ID NO:142所示氨基酸序列的轻链可变区以及具有SEQ ID NO:143所示氨基酸序列的重链可变区。

32.权利要求30的抗体，其包括具有SEQ ID NO:150所示氨基酸序列的轻链可变区以及具有SEQ ID NO:151所示氨基酸序列的重链可变区。

33.权利要求1的抗体，其中所述抗体是具有SEQ ID NO:152所示序列的单链抗体。

34.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单域抗体。

35.权利要求1的抗体，其中所述抗体是抗原结合片段。

36.权利要求35的抗体，其中所述抗原结合片段是Fab。

37.一种治疗患有哮喘症状的对象的方法，包括施用有效地减轻所述哮喘症状的量的权利要求1的抗体。

38.权利要求37的方法，其中所述抗体下调患者体内的IL13活性。

39.权利要求38的方法，其中所述抗体减轻患者体内的支气管超反应性。

40.权利要求37的方法，其中所述抗体减少对象肺内的嗜酸性粒细胞。

41.权利要求37的方法，其中所述抗体通过一种或多种选自由静脉内、腹腔内、吸入、肌肉内、皮下和口服组成的一组的途径施用。

42.权利要求41的方法，其中所述抗体通过吸入施用。

43.一种给患者送递治疗有效量的权利要求1的抗体的吸入设备。

44.一种用于检测样品中的白介素13蛋白质的方法，其包括步骤：使得权利要求30的抗体与样品接触；以及通过免疫反应的发生而检测白介素13。

45.权利要求44的方法，其中所述样品是从患者中收集的。

46.一种诊断对象体内IL13过表达的方法，其包括步骤：(a)从所述对象中获得样品；(b)在使得与IL13发生免疫反应的条件下，将所述样品与权利要求1的抗体混和；和(c)确定相对于IL13的正常表达水平，IL13是否是过表达的。

47.一种产生权利要求1的抗体的方法，其包括步骤：a)产生包括糖基化IL13组分和免疫原性组分的免疫原性化合物；b)制备一种可注射溶液，其包括处于磷酸盐缓冲液(PBS)中的所述免疫原性化合物和佐剂；c)通过静脉内和腹腔内注射的组合，用所述可注射溶液免疫小鼠；d)通过将来自所述免疫小鼠的脾细胞与一种骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤；e)选择产生具有权利要求1的抗体的特征的抗体的杂交瘤；和f)分离所述抗体。

48.一种重组抗体分子或其IL13结合片段，其包括：至少一条抗体重链或其IL13结合片段，至少一条抗体轻链或其IL13结合片段，以及来自单克隆抗体的构架区，其中所述抗体重链或其IL13结合片段在位点31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)(Kabat编码)包括来自小鼠抗IL13抗体的非人CDR，其中位点27-30具有氨基酸Gly26、Phe27、Ser28、Leu29、Asn30，所述抗体轻链或其IL13结合片段在位点24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)包括来自小鼠抗IL13抗体的非人CDR。

49.一种编码权利要求30的抗体的DNA序列。

50.一种包括权利要求49的DNA序列的载体。

51.一种包括权利要求50的载体的宿主细胞。

52.一种用于抑制患者体内的IgE抗体产生的方法，其包括给所述患者施用有效量的抑制IgE抗体产生的有效量的权利要求1的抗体。

53.权利要求52的方法，其中所述对IgE抗体产生的抑制被用于预防支气管哮喘、预防过敏性鼻炎、预防过敏性皮炎、治疗支气管哮喘、治疗过敏性皮炎、治疗荨麻疹、预防过敏症、或治疗异位性皮炎。

54.一种治疗患者体内的IL13介导的疾病的方法，其包括给所述患者施用有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制IL13与其受体的结合，并抑制与白介素和所述受体结合所相关的一种或多种功能。

55.权利要求54的方法，其中所述疾病是过敏性哮喘、非过敏性(内源性)哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、RSV感染、眼色素层炎、硬皮病、或骨质疏松。

56.一种治疗患者体内的IgE介导的疾病的方法，其包括给所述患者施用有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制IL13与其受体的结合，并抑制与白介素和所述受体结合所相关的一种或多种功能。

57.一种用于减轻哺乳动物的哮喘严重度的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的具有至少一种以下特征的抗IL13单克隆抗体：以约1x10⁹到约1x10¹²M的K_D与人IL13结合的能力；抑制与白介素IL13和IL13受体结合相关的一种或多种功能的能力；以及所述抗体不能与小鼠IL13结合。

58.权利要求52的方法，其中所述抗IL13抗体通过吸入、全身性、推注、或连续输注施用。

59.权利要求54的方法，其中所述抗IL13抗体通过吸入、全身性、推注、或连续输注施用。

60.一种基本上由氨基酸序列ESLINVSG(SEQ ID NO:18)组成的肽。

61.一种基本上由氨基酸序列YCAALESLINVS(SEQ ID NO:19)组成的肽。

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