ES2967485T3 - Nuevos anticuerpos anti-IL 13 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos ant-IL-13 que se unen específicamente y con alta afinidad a la IL13 humana tanto glicosilada como no glicosilada, no se unen a la IL13 de ratón y neutralizan la actividad de la IL13 humana en una relación molar aproximada de 1:2 (MAb :IL13). La invención también se refiere al uso de estos anticuerpos en el tratamiento de enfermedades mediadas por IL13, tales como enfermedades alérgicas, incluyendo asma, asma alérgica, asma no alérgica (intrínseca), rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis alérgica, eczema, urticaria. , alergias alimentarias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, colitis ulcerosa, infección por VRS, uveítis, esclerodermia y osteoporosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos anticuerpos anti-IL 13 y usos de los mismos

Antecedentes de la invención

La interleucina (IL)-13 es una citocina pleiotrópica de la subclase 2 de células T helper (Th2). Al igual que la IL4, la IL13 pertenece a la familia de las citocinas de tipo I que comparten la estructura terciaria definida por un núcleo de haz hidrofóbico 4a-helicoidal. La IL13 tiene aproximadamente un 30% de homología en la secuencia de aminoácidos con la IL4 y comparte muchas de sus propiedades (Wynn, Ann. Rev. Immunol., 21: 425 (2003)). La similitud funcional de la IL4 y la IL13 se atribuye al hecho de que la ILl3 puede unirse a la cadena alfa del receptor de la IL4 (IL4R-a) tras su unión a la cadena alfa-1 del receptor de la IL13 (IL13Ra1) (Hershey, J. Allergy Clin. Immunol., 111: 677 (2003)). IL4Ra es activada por IL4 e IL13 dando lugar a la fosforilación de STAT6 dependiente de Jak1. Tanto la IL4 como la IL13 promueven la proliferación de células B e inducen el cambio de clase a IgG4 e IgE en combinación con la coestimulación CD40/CD40L (Punnonen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3730 (1993), Oettgen et al., J. Allergy Clin. Immunol., 107: 429 (2001)).

Sin embargo, a diferencia de la IL4, la IL13 no participa en la diferenciación de células T ingenuas en células Th2 (Zurawski et al., Immunol. Hoy, 15: 19 (1994)). La IL13 regula al alza el FceRI y, por tanto, contribuye a la cebado de IgE de los mastocitos (de Vries, Allergy Clin. Immunol. 102: 165 (1998). En monocitos/macrófagos, la IL13 regula al alza la expresión de CD23 y antígenos MHC de clase I y clase II, regula a la baja la expresión de Fcy y CD14, e inhibe la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (de Waal Malefyt et al., J. Immunol., 151: 6370 (1993), Chomarat et al. Rev. Immunol. 17: 1 (1998)). La IL13, pero no la IL4, promueve la supervivencia, activación y reclutamiento de eosinófilos (Horie et al., Intern. Med., 36: 179 (1997), Luttmann et al., J. Immunol. 157: 1678 (1996), Pope et al., J. Allergy Clin. Immunol, 108: 594 (2001). La IL13 también manifiesta importantes funciones en células no hematopoyéticas, como células del músculo liso, células epiteliales, células endoteliales y células de fibroblastos. La IL13 aumenta la proliferación y las contracciones de los músculos lisos inducidas por colinergia (Wills-Karp, J. Allergy Clin. Immunol., 107: 9 (2001). En las células epiteliales, la IL13 es un potente inductor de la producción de quimiocinas (Li et al., J. Immunol., 162: 2477 (1999), altera la diferenciación mucociliar (Laoukili et al., J. Clin. Invest., 108: 1817 (2001), disminuye la frecuencia de los latidos ciliares de las células epiteliales ciliadas (Laoukili et al., J. Clin. Invest., 108: 1817 (2001), y da lugar a metaplasia de células caliciformes (Zhu et al., J. Clin. Invest., 103: 779 (1999), Grunig y otros, Science, 282: 2261 (1998)). En las células endoteliales, la IL13 es un potente inductor de la molécula 1 de adhesión celular vascular (VCAM-1), que es importante para el reclutamiento de eosinófilos (Bochner et al., J. Immunol., 154: 799 (1995)). En los fibroblastos dérmicos humanos, la IL13 induce la síntesis de colágeno de tipo 1 en los fibroblastos dérmicos humanos (Roux et al., J. Invest. Dermatol, 103: 444 (1994)).

Aunque la IL13 y la IL4 comparten ciertas similitudes funcionales, los estudios en modelos animales de la enfermedad y en ratones desactivados genéticamente demostraron que la IL13 posee funciones efectoras únicas distintas de la IL4 y proporciona pruebas convincentes de que la IL13, independientemente de otras citocinas Th2, es necesaria y suficiente para inducir todas las características del asma alérgica (Wills-Karp et al. Ciencia, 282: 2258 (1998), Walter et al. J. Immunol. 167: 4668 (2001)). La IL13 puede desempeñar un papel más importante que otras citocinas Th2 en las funciones efectoras asociadas a los síntomas del asma (Corry, Curr. Opinen. Immunol., 11: 610 (1999)). Esta afirmación está respaldada en la enfermedad humana por una fuerte asociación entre los niveles de IL13 y los polimorfismos genéticos en el gen IL13 y los correlatos de la enfermedad (Wills-Karp. et al. Respir. Res. 1: 19 (2000); Vercelli et al., Curr. Opinen. Allergy Clin. Immunol., 2: 389 (2002); He et al., Genes Immunol. 4: 385 (2003), Arima et al., J. Allergy Clin. Immunol, 109: 980 (2003), Liu et al., J. Clin. Alergia Inmunología, 112: 382 (2003)). Los nuevos datos sugieren que la IL13 induce características de la respuesta alérgica a través de sus acciones sobre el epitelio de la mucosa y las células del músculo liso, en lugar de a través de las vías tradicionales que implican a los eosinófilos y los eventos mediados por IgE (Wills-Karp et al., Sci., 282: 2258 (1998)).

El asma se describe como una enfermedad pulmonar crónica que implica inflamación, hiperreactividad y obstrucción de las vías respiratorias. Fisiológicamente, la hiperreactividad de las vías respiratorias se documenta por la disminución del flujo bronquial tras la broncoprovocación con metacolina o histamina. Otros desencadenantes que provocan la obstrucción de las vías respiratorias son el aire frío, el ejercicio, las infecciones víricas de las vías respiratorias altas, el humo del tabaco y los alérgenos respiratorios. La provocación bronquial con alérgenos induce una rápida disminución del flujo de aire bronquial mediada por inmunoglobulina E (IgE) en la fase inicial, seguida en muchos pacientes por una reacción mediada por IgE en la fase tardía con una disminución del flujo de aire bronquial durante 4-8 horas. La respuesta temprana está causada por la liberación aguda de sustancias inflamatorias, como histamina, PGDz, leucotrieno, triptasa y factor activador de plaquetas (PAF), mientras que la respuesta tardía está causada por citocinas proinflamatorias sintetizadas denovo(por ejemplo, TNFa, IL4, IL13) y quimiocinas (por ejemplo, MCP-1 y MIP-1a) (Busse et al. En: Alergia: Principios y práctica, Ed. Middleston, 1173 (1998)). En los pacientes asmáticos crónicos, los síntomas pulmonares persistentes están mediados por la respuesta aumentada de las células Th2. Se cree que las citocinas Th2 desempeñan un papel vital en la enfermedad (Larche et al., J. Allergy Clin. Immunol., 111: 450 (2003)), en particular, Il 13 e IL4 producidas por células Th2 con fenotipo NK (NKT) en las vías respiratorias, como se indica en un modelo de asma en roedores (Akbari et al., Nature Med., 9: 582 (2003)). La patología macroscópica de las vías respiratorias asmáticas muestra hiperinsuflación pulmonar, hipertrofia del músculo liso, engrosamiento de la lámina reticular, edema de la mucosa, descamación de las células epiteliales, alteración de las células ciliadas e hipersecreción de las glándulas mucosas. Microscópicamente, el asma se caracteriza por la presencia de un mayor número de eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y células plasmáticas en los tejidos bronquiales, las secreciones bronquiales y el moco. Inicialmente, se produce un reclutamiento de leucocitos del torrente sanguíneo a las vías respiratorias por parte de linfocitos T CD4+ activados. Los linfocitos T activados también dirigen la liberación de mediadores inflamatorios procedentes de eosinófilos, mastocitos y linfocitos. Además, las células Th2 producen IL4, IL5, IL9 e IL13. La IL4, junto con la IL13, señala el cambio de anticuerpos IgM a IgE.

La reticulación de las moléculas de IgE unidas a la membrana por el alérgeno provoca la degranulación de los mastocitos, liberando histamina, leucotrienos y otros mediadores que perpetúan la inflamación de las vías respiratorias. La IL5 activa el reclutamiento y la activación de los eosinófilos. Los mastocitos y eosinófilos activados también generan sus citocinas que contribuyen a perpetuar la inflamación. Estos ciclos repetidos de inflamación en los pulmones con lesión de los tejidos pulmonares seguida de reparación pueden producir cambios estructurales a largo plazo ("remodelación") de las vías respiratorias.

El asma moderada se trata actualmente con un antiinflamatorio-corticosteroide inhalado diario o un inhibidor de mastocitos como cromoglicato sódico o nedocromilo más un agonista beta2 inhalado según sea necesario (3-4 veces al día) para aliviar los síntomas iniciales o el asma inducida por alérgenos o ejercicio. El cromoglicato sódico y el nedocromilo bloquean el broncoespasmo y la inflamación, pero suelen ser eficaces sólo para el asma asociada a alérgenos o al ejercicio y, por lo general, sólo para los asmáticos juveniles. Los corticosteroides inhalados mejoran la inflamación, la hiperreactividad de las vías respiratorias y la obstrucción, y reducen el número de exacerbaciones agudas. Sin embargo, los efectos tardan al menos un mes en manifestarse y hasta un año en producirse una mejora notable. Los efectos secundarios más frecuentes son la ronquera y la infección oral por hongos, es decir, la candidiasis. Se han notificado efectos secundarios más graves, por ejemplo, supresión suprarrenal parcial, inhibición del crecimiento y reducción de la formación ósea, pero sólo con el uso de dosis más altas. La beclometasona, la triamcinolona y la flunisolida tienen probablemente una potencia similar, mientras que la budesonida y la fluticasona son más potentes y, al parecer, tienen menos efectos secundarios sistémicos.

Incluso los pacientes con enfermedad leve muestran inflamación de las vías respiratorias, incluida la infiltración de la mucosa y el epitelio con células T activadas, mastocitos y eosinófilos. Los linfocitos T y los mastocitos liberan citocinas que promueven el crecimiento y la maduración de los eosinófilos y la producción de anticuerpos IgE, y éstos, a su vez, aumentan la permeabilidad microvascular, alteran el epitelio y estimulan los reflejos neurales y las glándulas secretoras de moco. El resultado es una hiperreactividad de las vías respiratorias, broncoconstricción e hipersecreción, que se manifiesta por sibilancias, tos y disnea.

Tradicionalmente, el asma se ha tratado con broncodilatadores orales e inhalados. Estos agentes alivian los síntomas del asma, pero no hacen nada contra la inflamación subyacente. El reconocimiento durante los últimos 10 años de la importancia de la inflamación en la etiología del asma ha llevado a un mayor uso de corticosteroides, pero muchos pacientes siguen padeciendo asma no controlada.

Debido a la importancia del tratamiento de enfermedades inflamatorias en humanos, particularmente el asma, se buscan continuamente nuevos compuestos bioactivos que tengan menos efectos secundarios. El desarrollo de inhibidores potentes y específicos de la IL13, que permanezcan activos cuando se administren a largo plazo a las vías respiratorias asmáticas, ofrece un enfoque novedoso para el tratamiento del asma, así como en otras enfermedades mediadas por la IL13 y la IgE.

Se mencionan los siguientes documentos:

• Blease et al (2001) Journal of Immunology, 166: 5219-5224 que trata del efecto terapéutico de la inmunoneutralización de la IL-13 durante el asma fúngica experimental crónica;

• WO 03/086451 que trata de proteínas derivadas de inmunoglobulinas relacionadas con el asma, composiciones, procedimientos y usos; y

• Campbell et al (2003) Faseb Journal, 18(2): 329-331 que se refiere a que los humanos alérgicos son hiporresponsivos a un bucle promotor de la inmunidad Th1 mediado por el ligando CXCR3.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar la proteína IL-13 humana en una muestra, que comprende la etapa de:

poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti IL-13 humano que comprenda una región variable de cadena pesada que comprenda las regiones CDRH1, CDRH2 y CDRH3 determinantes de la complementariedad que tengan las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 123, y SEQ ID NO: 135, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, y SEQ ID NO: 115; y

detectar la proteína IL-13 humana mediante la aparición de inmunorreacción entre el anticuerpo anti-Il-13 humana y la proteína IL-13 humana.

También se divulgan anticuerpos que se unen específicamente y con alta afinidad a IL13 humana glicosilada y no glicosilada; no se unen a IL13 de ratón, y neutralizan la actividad de IL13 humana en una proporción molar aproximada de 1:2 (MAb:IL13). También se divulgan anticuerpos que comprenden las regiones de unión a antígeno derivadas de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada de dichos anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, y un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

Ejemplos de estos anticuerpos son 228B/C-1, 228A-4, 227-26 y 227-43. Los hibridomas que producen estos anticuerpos se depositaron el 20 de noviembre de 2003 en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, con los números de acceso PTA-5657, PTA-5656, PTA-5654 y PTA-5655, respectivamente.

También se divulgan anticuerpos que tienen una secuencia VL homóloga en al menos un 95% a la establecida en SEQ ID NO: 3, y una secuencia Vh homóloga en al menos un 95% a la establecida en SEQ ID NO: 4; anticuerpos que tienen una secuencia VL homóloga en al menos un 95% a la establecida en SEQ ID NO: 5, y una secuencia VH homóloga en al menos un 95% a la establecida en SEQ ID NO: 6; y anticuerpos que tienen una secuencia VL homóloga en al menos un 95% a la establecida en SEQ ID NO: 7, y una secuencia VH homóloga en al menos un 95% a la establecida en SEQ ID NO: 8. También se divulga una molécula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a IL13 del mismo, que comprende al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a IL13 del mismo, que comprende CDR no humanas en las posiciones 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) y 95-102 (CDR3) (numeración de Kabat) de un anticuerpo anti-IL13 de ratón, en el que las posiciones 27-30 tienen el aminoácido Gly 26, Phe 27, Ser 28, Leu 29, Asn 30, (SEQ ID NO: 18); y al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a IL13 de la misma, que comprenda CDR no humanas en las posiciones 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) y 89-97 (CDR3) de un anticuerpo anti-IL13 de ratón, y regiones marco de un anticuerpo monoclonal humano.

La presente invención incluye el empleo de fragmentos de anticuerpos humanos de unión a antígeno de los anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única, Fvs ligados a disulfuro (sdFv). Un ejemplo de scFv se representa en la Figura 21, con la secuencia SEQ ID NO 152.

También se divulgan secuencias humanizadas del anticuerpo monoclonal 228B/C-1. Estas moléculas de anticuerpos recombinantes humanizados comprenden una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula: FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4, donde FRL1 consiste en uno cualquiera de los SEQ ID Nos: 20-25; CDRL1 consiste en uno cualquiera de los SEQ ID NOs: 99-103; FRL2 consiste en s Eq ID NO: 29; CDRL2 consiste en uno cualquiera de los SEQ iD NOs: 104-114; FRL3 consiste en uno cualquiera de los SEQ ID NOs: 30-56; CDRL3 consiste en cualquiera de los SEQ ID NOs: 115-116; y FRL4 consiste en s Eq ID NO: 57-59; y que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4, donde FRH1 consiste en uno cualquiera de los SEQ ID NOs: 60-66; CDRH1 consiste en uno cualquiera de los SEQ ID NOs: 117-122; FRH2 consiste en uno cualquiera de los SEQ ID NOs: 67-75 ; CDRH2 consiste en uno cualquiera de los SEQ ID NOs: 123-134; FRH3 consiste en uno cualquiera de los SEQ ID NOs: 76-90; CDRH3 consiste en cualquiera de los SEQ ID NOs: 135-141; y FRH4 consiste en SEQ ID NO: 91-92. La región variable de cadena pesada puede comprender además al menos el dominio CH1 de una región constante o los dominios CH1, CH2 y CH3 de una región constante. La región constante de la cadena pesada puede comprender un anticuerpo IgG. en el que el anticuerpo IgG es un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3 o un anticuerpo IgG4.

También se dan a conocer moléculas de anticuerpos recombinantes en las que la cadena ligera variable se elige entre cualquiera de los SEQ ID Nos: 3, 5, 7, 93, 95, 97, 142, 144 y 150, y una cadena pesada variable elegida entre cualquiera de los SEQ ID Nos: 4, 6, 8, 94, 96, 98, 143, 145, 146, 147, 148 y 149. Un anticuerpo particular comprende la cadena ligera variable que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO:142, y una cadena pesada variable que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO:143.

También se divulgan las líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales 228B/C-1, 228A-4, 227-26 y 227-43. También se divulgan ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos monoclonales 228B/C-1, 228A-4, 227-26 y 227-43, líneas celulares que comprenden un ácido nucleico que codifica estos anticuerpos o cadenas de los mismos, y vectores que comprenden el ácido nucleico que codifica estos anticuerpos o cadenas de los mismos.

También se divulgan anticuerpos que se unen al mismo epítopo que 228B/C-1. Los polipéptidos ejemplares comprenden la totalidad o una parte de SEQ ID NO. 1 o sus variantes, o SEQ ID NO. 2, en el que el aminoácido 13 cambia de ácido glutámico a lisina. También se divulga el epítopo reconocido por los anticuerpos divulgados. Los péptidos epítopo incluyen un péptido que comprende esencialmente o consiste en ESLINVSG (SEQ ID NO: 18) o YCAALESLINVS (SEQ ID NO:19).

También se divulga un procedimiento para producir los anticuerpos divulgados, que comprende las etapas de: a) producir un compuesto inmunogénico que comprende una fracción IL13 glicosilada y una fracción inmunogénica; b) preparar una solución inyectable que comprende dicho compuesto inmunogénico en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y un adyuvante; c) inmunizar un ratón con dicha solución inyectable mediante una combinación de inyecciones intravenosas e intraperitoneales, d) producir un hibridoma fusionando una célula de bazo de dicho ratón inmunizado con una célula de mieloma; e) seleccionar un hibridoma que produzca un anticuerpo que tenga las características del anticuerpo divulgado; y f) aislar dicho anticuerpo.

Las enfermedades y/o afecciones mediadas por la IL13 incluyen, entre otras, el asma alérgica, el asma no alérgica (intrínseca), la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la conjuntivitis alérgica, el eccema, la urticaria, las alergias alimentarias, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la colitis ulcerosa, la infección por VRS, la uveítis, la esclerodermia y la osteoporosis .

Breve descripción de los dibujos

La FIGURA 1 muestra la unión de los anticuerpos monoclonales anti-IL13 a la IL13 humana.

La FIGURA 2 representa la unión de anticuerpos monoclonales anti-IL13 mutantes IL13-Fc.

La FIGURA 3 ilustra que no hay inhibición de la unión de MAb 228B/C-1 a IL13 humana por MAb JES10-5A2 (Pharmingen).

La FIGURA 4 ilustra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-IL13 sobre la proliferación de las células L-1236 del linfoma de Hodgkin.

La FIGURA 5 ilustra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-IL13 sobre la supresión de la expresión de CD14 inducida por IL13 en monocitos humanos.

La FIGURA 6 ilustra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-IL13 sobre la regulación al alza de la expresión de CD23 inducida por IL13 en monocitos humanos.

La FIGURA 7 ilustra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-IL13 sobre la fosforilación de STAT6 inducida por IL13 en células THP-1.

La FIGURA 8 representa la secuencia de aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo monoclonal 228B/C-1.

La FIGURA 9 muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo monoclonal 228A-4. La FIGURA 10 muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo monoclonal 227-26. La FIGURA 11 muestra las secuencias de las regiones variables de la cadena ligera para la humanización del anticuerpo monoclonal 228B/C-1. Los clones B a R representan clones probados con una plantilla humana 2 para VK y una VH murina. Los clones HT2-NEW y HT2-DP27 se construyeron con marcos humanos tanto para VK como para VH.

La FIGURA 12 muestra las secuencias correspondientes de la cadena pesada de los clones de la Figura 11. Las FIGURAS 13 A-E muestran los perfiles ELISA de los candidatos humanizados combinatorios.

La FIGURA 14 A muestra los perfiles ELISA para 89 Vk/276G. La Fig. 14B muestra los resultados ELISA para el constructo 115Vk/73Vh FL.

La FIGURA 15 muestra las secuencias de las bibliotecas combinatorias candidatas.

La FIGURA 16 muestra un perfil de competencia para dos candidatos (CL5 y CL-13) ensayados demostrados en comparación con el candidato quimérico (228 B/C #3) para la unión a IL-13. El Fab irrelevante es el 5I, que demuestra no tener capacidad para competir.

La Figura 17 muestra las secuencias de tres candidatos madurados por afinidad.

La figura 18 muestra la alineación de las secuencias de la proteína IL13.

La Figura 19 muestra el epítopo de unión del Mab 228B/C-1.

La Figura 20 muestra las variantes CDR y sus respectivos SEQ ID Nos.

La Figura 21 muestra las secuencias variables de la cadena ligera y de la cadena pesada de determinados anticuerpos recombinantes candidatos.

Descripción detallada

Tal como se utilizan en el presente documento y en los anexos, las formas singulares "un", "una" “el” y "la" incluyen una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario, por ejemplo, la referencia a "una célula huésped" incluye una pluralidad de dichas células huésped.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos y cualquier acrónimo utilizado en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios de la técnica en el campo de la invención. Aunque en la práctica de la presente invención pueden utilizarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos, aquí se describen los procedimientos, dispositivos y materiales ejemplares.

Inmunógeno

Se utilizó IL13 recombinante para inmunizar ratones y generar los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales divulgados. La IL13 recombinante está disponible comercialmente en varias fuentes (véase, por ejemplo, R & D Systems, Minneapolis, MN., PeproTech, Inc., NJ, y Sanofi Bio-Industries, Inc., Tervose, PA.). Alternativamente, un gen o un ADNc que codifique la IL13 puede clonarse en un plásmido u otro vector de expresión y expresarse en cualquiera de una serie de sistemas de expresión según procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Los procedimientos de clonación y expresión de IL13 y la secuencia de ácido nucleico para IL13 son bien conocidos (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. n° 5.652.123). Debido a la degeneración del código genético, pueden producirse multitud de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos IL13. Se puede variar la secuencia de nucleótidos seleccionando combinaciones basadas en las posibles elecciones de codones. Estas combinaciones se realizan de acuerdo con el código genético estándar de tripletes aplicado a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido IL13 natural y deben considerarse todas las variaciones de este tipo. Cualquiera de estos polipéptidos puede utilizarse en la inmunización de un animal para generar anticuerpos que se unan a la IL13.

El polipéptido IL13 inmunógeno puede, cuando sea beneficioso, expresarse como una proteína de fusión que tiene el polipéptido IL13 unido a un segmento de fusión. El segmento de fusión a menudo ayuda en la purificación de proteínas, por ejemplo, permitiendo que la proteína de fusión sea aislada y purificada por cromatografía de afinidad. Las proteínas de fusión pueden producirse cultivando una célula recombinante transformada con una secuencia de ácido nucleico de fusión que codifica una proteína que incluye el segmento de fusión unido al extremo carboxilo y/o amino terminal de la proteína. Los segmentos de fusión pueden incluir, entre otros, regiones Fc de inmunoglobulina, glutatión-S-transferasa, p-galactosidasa, un segmento de poli-histidina capaz de unirse a un ion metálico divalente y proteína de unión a maltosa.

Los polipéptidos ejemplares comprenden la totalidad o una parte de SEQ ID NO.1 o sus variantes, o SEQ ID NO. 2 donde el aminoácido 13 es Xaa y puede cambiarse a partir del peso, por ejemplo, ácido glutámico a lisina.

Para generar los anticuerpos se utilizó una proteína de fusión que comprendía una forma mutante de IL13 humana. Esta forma mutante de IL13 contenía una única mutación que daba lugar a una forma inactiva de la proteína (Thompson et al., J. Biol. Química. 274: 2994 (1999)). Para generar anticuerpos neutralizantes con alta afinidad, la proteína de fusión comprendía la proteína IL13 mutante fusionada a una inmunoglobulina Fc, concretamente IgG1, y se expresó en una línea celular de mamífero de forma que la proteína recombinante estuviera glicosilada de forma natural. La porción Fc de la proteína de fusión puede haber proporcionado una estructura conformacional que expusiera un epítopo clave. La glicosilación puede haber aumentado la inmunogenicidad del epítopo, permitiendo la generación de anticuerpos contra este epítopo en particular.

Los polipéptidos de IL13 expresados en E.colicarecen de glicosilación y los anticuerpos comercialmente disponibles probados se generaron utilizando esta proteína. Probamos estos anticuerpos, porejemplo, R&D Systems y Pharmingen, y descubrimos que los anticuerpos generados con un inmunógeno producido enE. colino reaccionan de forma cruzada con el epítopo unido por los anticuerpos.

Generación de anticuerpos

Los anticuerpos a emplear pueden generarse por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por el experto (Harlow, et al., Antibodies: a Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988)).

Por ejemplo, un inmunógeno como el descrito anteriormente puede administrarse a diversos animales huéspedes, incluidos, entre otros, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales específicos para el antígeno. La administración del inmunógeno puede conllevar una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Se pueden utilizar varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, e incluyen, entre otros, los de Freund (completos e incompletos), geles minerales como el hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas como la lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Otros ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen el adyuvante MPL-TDM (lípido monofosforil A, trehalosa sintética dicor|nom¡colato). Los protocolos de inmunización son bien conocidos en la técnica y pueden realizarse mediante cualquier procedimiento que provoque una respuesta inmunitaria en el animal huésped elegido. Los adyuvantes también son bien conocidos en la técnica.

Típicamente, el inmunógeno (con o sin adyuvante) se inyecta en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales, o por vía intramuscular o intravenosa. El inmunógeno puede incluir un polipéptido IL13, una proteína de fusión o variantes de los mismos. Dependiendo de la naturaleza de los polipéptidos (es decir, porcentaje de hidrofobicidad, porcentaje de hidrofilicidad, estabilidad, carga neta, punto isoeléctrico, etc.), puede ser útil conjugar el inmunógeno con una proteína que se sabe que es inmunógena en el mamífero inmunizado. Dicha conjugación incluye la conjugación química mediante la derivatización de grupos funcionales químicos activos tanto en el inmunógeno como en la proteína inmunogénica que se va a conjugar, de forma que se forme un enlace covalente, o mediante la metodología basada en la proteína de fusión, u otros procedimientos conocidos por el experto. Ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, ovoalbúmina, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, inhibidor de tripsina de soja y péptidos T helper promiscuos. Pueden utilizarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, tal como se ha descrito anteriormente.

Los anticuerpos divulgados comprenden anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando tecnología de hibridoma, como la descrita por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975) y Pat. de EE.UU. No. 4,376,110, por Harlow, et al., Anticuerpos: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2.sup.nd ed. (1988), de Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y, (1981)), u otros procedimientos conocidos por el experto. Otros ejemplos de procedimientos que pueden emplearse para producir anticuerpos monoclonales incluyen, entre otros, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80:2026-2030), y la técnica EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluidas IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el MAb puede cultivarsein vitrooin vivo.

Utilizando técnicas típicas de hibridoma, un huésped como un ratón, un ratón humanizado, un ratón con un sistema inmunitario humano, un hámster, un conejo, un camello o cualquier otro animal huésped apropiado, se inmuniza típicamente con un inmunógeno para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente a la IL13. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarsein vitrocon el antígeno.

Generalmente, en la fabricación de hibridomas productores de anticuerpos, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o células de bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Anticuerpos monoclonales: Principles and Practice, Academic Press, (1986), pp. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas suelen ser células de mamífero transformadas, en particular células de mieloma de origen roedor, bovino o humano. Normalmente, se emplea una línea celular de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contenga preferentemente una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan una expresión estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-ratón también pueden utilizarse para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pp. 51-63).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma puede entonces analizarse para detectar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la IL13. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de uniónin vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas son conocidas en la técnica y están dentro de la habilidad del experto. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal a la IL13 puede determinarse, por ejemplo, mediante un análisis de Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)).

Una vez identificadas las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse por procedimientos estándar (Goding, supra). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco y RPMI-1640. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de exclusión en gel, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Existe una variedad de procedimientos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales y, por lo tanto, la producción de anticuerpos para su uso en la invención no se limita a su producción exclusiva en hidridomas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden fabricarse mediante procedimientos de ADN recombinante, como los descritos en la Pat. de EE.UU. N° 4.816.567. En este contexto, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un único clon eucariota, fago o procariota. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse fácilmente mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos, o dichas cadenas procedentes de fuentes humanas, humanizadas u otras). Las células de hidridoma sirven como fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transforman en células huésped como células NS0, células COS de Simia, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen proteínas inmunoglobulinas de otro modo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas (Pat. No. 4.816.567morrison et al, supra) o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico. Dicho polipéptido no inmunoglobulínico puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto de la región Fc para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen por otro residuo de aminoácido o se suprimen para evitar la reticulación.

Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas como la papaína (para producir fragmentos Fab) o la pepsina (para producir fragmentos F(ab')2 ). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.

Para algunos usos, incluyendo el usoin vivode anticuerpos en humanos y ensayos de detecciónin vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes especies animales, como los anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Morrison, Science 229:1202 (l985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Procedimientos 125:191-202; Pat. de EE.UU. Nos. 5.807.715; 4,816,567y 4,816397.

Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos generadas en una especie no humana que se unen al antígeno deseado teniendo una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones marco (FR) de una molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, los residuos marco en las regiones marco humanas se sustituirán por el residuo correspondiente del anticuerpo donante CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de la estructura se identifican por procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de los CDR y los residuos de la estructura para identificar los residuos de la estructura importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar residuos de la estructura inusuales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al, Pat. de EE.UU.N° 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, el injerto de CDR (EP 239.400; Publicación PCT WO 91/09967; Pat. de EE.UU. Nos. 5.225.539; 5,530,101y 5,585,089), el recubrimiento (PE 592.106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)), y el barajado de cadenas (Pat. de EE.UU. N° 5.565.332).

Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos suelen denominarse residuos "de importación", que suelen tomarse de un dominio variable "de importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo los procedimientos de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), sustituyendo secuencias CDR o CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Pat. N° 4.816.567), en el que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen a partir de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden fabricarse por diversos procedimientos conocidos en la técnica, incluidos los procedimientos de visualización de fagos descritos anteriormente, utilizando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véase también, Pat. de EE.UU.Nos.

4.444.887 y 4,716,111y Publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735y WO 91/10741. Las técnicas de Cole et al. y Boerder et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985); y Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, (1991)).

Los anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos génicos de inmunoglobulina humana de cadena pesada y ligera pueden introducirse al azar o por recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable, la región constante y la región de diversidad humanas pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón además de los genes humanos de las cadenas pesada y ligera. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden dejar de ser funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigota de la región JH impide la producción endógena de anticuerpos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocitos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se crían para producir descendencia homocigótica que exprese anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de forma normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, la totalidad o una parte de un polipéptido. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse a partir de los ratones transgénicos inmunizados utilizando la tecnología convencional del hibridoma. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reorganizan durante la diferenciación de los linfocitos B y posteriormente sufren cambios de clase y mutaciones somáticas. Así pues, utilizando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véase, por ejemplo, Las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente europea n° 0598 877; Pat. de EE.UU. Nos.

5.413.923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771y 5,939,598. Además, se puede contratar a empresas como Abgenix, Inc. (Freemont, California), Genpharm (San José, California) y Medarex, Inc. (Princeton, Nueva Jersey) para que proporcionen anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando una tecnología similar a la descrita anteriormente.

También podrían fabricarse MAbs humanos inmunizando ratones trasplantados con leucocitos humanos de sangre periférica, esplenocitos o médulas óseas (porejemplo, técnicas Trioma de XTL). Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse mediante una técnica denominada "selección guiada" En este enfoque se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconozca el mismo epítopo. (Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)).

Además, los anticuerpos contra los polipéptidos divulgados pueden, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos antiidiotipo que "imiten" los polipéptidos divulgados utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. (Véase, por ejemplo Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5):437-444; (1989) y Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438 (1991)). Por ejemplo, los anticuerpos que se unen e inhiben competitivamente la multimerización del polipéptido y/o la unión de un polipéptido revelado a un ligando pueden utilizarse para generar antiidiotipos que "imitan" el dominio de multimerización y/o unión del polipéptido y, como consecuencia, se unen y neutralizan el polipéptido y/o su ligando. Tales antiidiotipos neutralizantes o fragmentos Fab de tales antiidiotipos pueden utilizarse en regímenes terapéuticos para neutralizar el ligando polipeptídico. Por ejemplo, dichos anticuerpos antiidiotipos pueden utilizarse para unirse a un polipéptido divulgado en el presente documento y/o para unirse a sus ligandos/receptores, y bloquear así su actividad biológica.

Los anticuerpos empleados pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Una de las especificidades de unión puede dirigirse hacia la IL13, la otra puede ser para cualquier otro antígeno, y preferiblemente para una proteína de la superficie celular, receptor, subunidad del receptor, antígeno específico de tejido, proteína derivada de virus, proteína de envoltura codificada por virus, proteína derivada de bacterias, o proteína de superficie de bacterias, etc.

Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son bien conocidos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de inmunoglobulinas de cadena pesada/cadena ligera, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta suele realizarse mediante pasos de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpoantígeno) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Puede tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transforman en un organismo huésped adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo Suresh et al., Meth. En Enzym, 121:210 (1986).

También se contemplan los anticuerpos heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario contra células no deseadas (Pat. de EE.UU. N° 4.676.980). Se contempla que los anticuerpos puedan prepararsein vitroutilizando procedimientos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluidos los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéster. Ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los divulgados, por ejemplo, en la Pat. de EE.UU. N° 4.676.980.

Además, se pueden generar anticuerpos de dominio único contra la IL-13. Ejemplos de esta tecnología se han descrito en WO9425591 para anticuerpos derivados de Ig de cadena pesada de Camelidae, así como en US20030130496 en el que se describe el aislamiento de anticuerpos totalmente humanos de dominio único a partir de bibliotecas de fagos.

Identificación de anticuerpos anti-IL13

Se divulgan anticuerpos monoclonales antagonistas que inhiben y neutralizan la acción de IL13. En particular, los anticuerpos de la presente divulgación se unen a IL13 e inhiben la activación del receptor de IL13 de cadena alfa-1 (IL13Ra1). Los anticuerpos divulgados incluyen los anticuerpos designados 228B/C-1, 228A-4, 227-26 y 227-43, y se divulgan clones humanizados de 228B/C-1. También se divulgan anticuerpos que se unen al mismo epítopo que uno de estos anticuerpos, por ejemplo, el del anticuerpo monoclonal 228B/C-1.

Los anticuerpos candidatos anti-IL13 se probaron mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA), inmunotransferencia Western u otras técnicas inmunoquímicas. Ensayos realizados para caracterizar los anticuerpos individuales incluidos: (1) Inhibición de la proliferación autocrina por IL13 de las líneas celulares de linfoma de Hodgkin HDLM-2 y L-1236; (2) Inhibición de la fosforilación STAT6 inducida por IL13 en células THP-1; y (3) Inhibición de la supresión de la expresión de CD14 inducida por IL13 en monocitos humanos primarios; y (4) Inhibición de la regulación al alza de la expresión de CD23 inducida por IL13 en monocitos humanos primarios. Los detalles experimentales se describen en los Ejemplos.

Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos de dominio simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, anticuerpos antiidiotipos (anti-ld) (incluyendo, p. ej., anticuerpos anti-Id de los anticuerpos descritos en el presente documento), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores.

El término "anticuerpo", tal como se utiliza aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, lgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Además, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (MAb) incluye moléculas intactas, así como fragmentos de anticuerpos (como, por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 ) capaces de unirse específicamente a una proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación del animal o de la planta y pueden tener una unión tisular menos inespecífica que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos humanos de unión a antígeno de los anticuerpos divulgados incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única y Fvs ligados a disulfuro (sdFv) y anticuerpos de dominio único que comprenden un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, incluidos los anticuerpos de cadena simple, pueden comprender la(s) región(es) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una parte de lo siguiente: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se divulgan fragmentos de unión a antígeno que comprenden cualquier combinación de región(es) variable(s) con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal, incluidas aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son de humanos, primates no humanos, roedores (por ejemplo, ratón y rata), burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo.

Tal como se utilizan en el presente documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, tal como se describe infra y, por ejemplo, en, Pat. de EE.UU. N° 5.939.598 por Kucherlapati et al.

Los anticuerpos pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de IL13 o pueden ser específicos tanto para IL13 como para un epítopo heterólogo, como un polipéptido heterólogo o un material de soporte sólido. Véase, por ejemplo Publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol.

147:60-69 (1991); Pat. de EE.UU.Nos. 4.474.893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).

Los anticuerpos pueden describirse o especificarse en términos de epítopo(s) o porción(es) de IL13 que reconocen o a los que se unen específicamente. El epítopo o epítopos o la porción o porciones polipeptídicas pueden especificarse como se describe en el presente documento, por ejemplo, por posiciones N-terminal y C-terminal, por tamaño en residuos de aminoácidos contiguos, o enumerarse en las Tablas y Figuras.

Los anticuerpos también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. También se divulgan anticuerpos que se unen a polipéptidos de IL13, que tienen al menos un 95%, al menos un 90%, al menos un 85%, al menos un 80%, al menos un 75%, al menos un 70%, al menos un 65%, al menos un 60%, al menos un 55%, y al menos un 50% de identidad (calculada mediante procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) con IL-13. Los anticuerpos anti-IL-13 también pueden unirse con una K<d>de menos de aproximadamente 10'7 M, menos de aproximadamente 10'6 M, o menos de aproximadamente 10'5 M a otras proteínas, tales como anticuerpos IL-13 de especies distintas de aquella contra la que se dirige el anticuerpo anti-IL-13.

En casos específicos, los anticuerpos presentan reacción cruzada con homólogos de mono de la IL13 humana y sus epítopos correspondientes. En un caso específico, la reactividad cruzada descrita anteriormente es con respecto a cualquier polipéptido antigénico o inmunogénico específico único, o combinación(es) de los polipéptidos antigénicos y/o inmunogénicos específicos divulgados aquí.

Además, se divulgan anticuerpos que se unen a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridan con un polinucleótido que codifica IL13 en condiciones de hibridación estrictas. Los anticuerpos también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un polipéptido descrito en el presente documento. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación de equilibrio o K<d>de 10'8 a 10'15 M, 10'8 a 10' 12 M, 10‘8 a 10‘1° M, o 10‘1° a 10‘12 M. También se divulgan anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo a un epítopo divulgado en el presente documento según se determina por cualquier procedimiento conocido en la técnica para determinar la unión competitiva, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en el presente documento. En casos preferidos, el anticuerpo inhibe competitivamente la unión al epítopo en al menos un 95%, al menos un 90%, al menos un 85%, al menos un 80%, al menos un 75%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50%.

Vectores y células huésped

También se divulgan construcciones vectoriales que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica anticuerpos que se emplearán en la presente invención y una célula huésped que comprende dicho vector. En la preparación de líneas celulares que expresen los anticuerpos pueden utilizarse técnicas estándar de clonación y transformación.

Los vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica los anticuerpos pueden prepararse mediante técnicas bien conocidas. Los vectores de expresión incluyen una secuencia nucleotídica enlazada de forma operable a secuencias nucleotídicas reguladoras transcripcionales o traslacionales adecuadas, como las derivadas de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, potenciadores, sitios de unión ribosomal de ARNm y/u otras secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de la transcripción y traducción. Las secuencias de nucleótidos están "enlazadas operativamente" cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de nucleótidos para el polipéptido apropiado. Así, una secuencia nucleotídica promotora está operativamente unida, por ejemplo, a la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo si la secuencia nucleotídica promotora controla la transcripción de la secuencia nucleotídica apropiada.

Además, pueden incorporarse a los vectores de expresión secuencias que codifican péptidos señal apropiados que no están asociados naturalmente con secuencias de cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos para un péptido señal (líder secretor) puede fusionarse en el marco de la secuencia polipeptídica para que el anticuerpo sea secretado al espacio periplásmico o al medio. Un péptido señal que sea funcional en las células huésped previstas aumenta la secreción extracelular del anticuerpo apropiado. El péptido señal puede escindirse del polipéptido durante la secreción del anticuerpo de la célula. Los ejemplos de tales señales secretoras son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos US5698435, US5698417 y US6204023.

Las células huésped útiles en la presente invención incluyen, entre otras, microorganismos tales como bacterias (p. ej.,E. coli, B. subtilis)transformadas con ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o vectores de expresión de ADN cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (p. ej.,Saccharomyces, Pichia)transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (e.g., Baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas celulares de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas celulares de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, células 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia).

El vector puede ser un vector plasmídico, un vector fago de cadena simple o doble, o un vector viral de ARN o ADN de cadena simple o doble. Dichos vectores pueden introducirse en las células como polinucleótidos mediante técnicas bien conocidas para introducir ADN y ARN en las células. Los vectores, en el caso de los fagos y los vectores virales, también pueden introducirse en las células como virus empaquetados o encapsulados mediante técnicas bien conocidas de infección y transducción. Los vectores virales pueden ser competentes o defectuosos para la replicación. En este último caso, la propagación vírica se producirá generalmente sólo en células huésped complementarias. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir la proteína utilizando ARN derivados de las presentes construcciones de ADN. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, Publicación PCT WO 86/05807; Publicación PCT WO 89/01036 y Pat. de EE.UU. N° 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para la expresión de toda la cadena pesada o ligera.

Los procariotas útiles como células huésped en la presente invención incluyen organismos gramnegativos o grampositivos comoE. coliy B.subtilis.Los vectores de expresión para su uso en células huésped procariotas generalmente comprenden uno o más genes marcadores seleccionables fenotípicamente. Un gen marcador seleccionable fenotípicamente es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a los antibióticos o que suple un requisito autótrofo. Entre los ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procariotas se incluyen los derivados de plásmidos disponibles en el mercado, como las series de vectores pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), pGEMI (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, EE.u U.) y pET (Novagen, Madison, Wisconsin, E<e>.UU.) y pRSET (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, EE.UU.) (Studier, F.W., J. Mol. Biol. 219: 37 (1991); Schoepfer, R. Gene 124: 83 (1993)). Las secuencias promotoras utilizadas habitualmente para los vectores de expresión de células hospedadoras procariotas recombinantes incluyen T7, (Rosenberg, et al. Gene 56, 125-135 (1987)), p-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de la lactosa (Chang et al., Nature 275:615, (1978); y Goeddel et al., Nature 281:544, (1979)), sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, (1980)), y el promotor tac (Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y)

Las levaduras útiles en la presente invención incluyen las del géneroSaccharomyces, Pichia, ActinomycetesyKluyveromyces.Los vectores de levadura suelen contener una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura de 2|j, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores de metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Química. 255:2073, (1980)) u otras enzimas glucolíticas (Holland et al., Biochem. 17:4900, (1978)) como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexocinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructocinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato cinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levadura se describen con más detalle en Fleer et al., Gene, 107:285-195 (1991). Otros promotores y vectores adecuados para levaduras y protocolos de transformación de levaduras son bien conocidos en la técnica. Los protocolos de transformación de levaduras son bien conocidos. Uno de estos protocolos es el descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 75:1929 (1978). El protocolo Hinnen selecciona los transformantes Trp+ en un medio selectivo.

También pueden emplearse sistemas de cultivo de células huésped de mamíferos o insectos para expresar anticuerpos recombinantes, por ejemplo, sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas. En un sistema de insectos, - el virus de la poliedrosis nuclear deAutographa californica(AcNPV) puede utilizarse como vector para expresar genes extraños. El virus crece en las célulasde Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor del AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).

Pueden utilizarse células NS0 o de ovario de hámster chino (CHO) para la expresión mamífera de los anticuerpos. Las secuencias de control transcripcional y traslacional para los vectores de expresión de células huésped de mamíferos pueden extraerse de los genomas virales. Las secuencias promotoras y potenciadoras más utilizadas proceden del virus del polioma, el adenovirus 2, el virus simio 40 (SV40) y el citomegalovirus humano (CMV). Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40 pueden utilizarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia genética estructural en una célula huésped de mamífero, por ejemplo, el origen SV40, el promotor temprano y tardío, el potenciador, el empalme y los sitios de poliadenilación. Los promotores virales tempranos y tardíos son especialmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen viral de replicación. Existen en el mercado vectores de expresión ejemplares para su uso en células huésped de mamíferos.

Polinucleótidos que codifican anticuerpos

También se divulgan polinucleótidos o ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo que se empleará en la invención y fragmentos del mismo. Los polinucleótidos ejemplares incluyen los que codifican cadenas de anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento. También se divulgan polinucleótidos que hibridan en condiciones de hibridación estrictas o menos estrictas con polinucleótidos que codifican un anticuerpo divulgado en el presente documento.

Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, puede ensamblarse un polinucleótido que codifique el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos solapados que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, el recocido y ligado de esos oligonucleótidos, y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR.

Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo puede generarse a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada. Si no se dispone de un clon que contenga un ácido nucleico que codifique un anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, puede sintetizarse químicamente u obtenerse de una fuente adecuada un ácido nucleico que codifique la inmunoglobulina (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferiblemente ARN poli A , aislado de, cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo, como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación utilizando una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia génica particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifique el anticuerpo. A continuación, los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse en vectores de clonación replicables mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica.

Una vez determinada la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos del anticuerpo, la secuencia de nucleótidos del anticuerpo puede manipularse utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y yAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar anticuerpos que tengan una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.

En un caso específico, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera puede inspeccionarse para identificar las secuencias de las CDR mediante procedimientos bien conocidos, por ejemplo, por comparación con secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de secuencia. Utilizando técnicas rutinarias de ADN recombinante, una o más de las CDR pueden insertarse dentro de regiones marco, por ejemplo, en regiones marco humanas para humanizar un anticuerpo no humano, como se describe supra. Las regiones marco pueden ser regiones marco naturales o de consenso, y preferiblemente regiones marco humanas (véase, por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol.

278: 457-479 (1998) para una lista de las regiones marco humanas). Preferiblemente, el polinucleótido generado por la combinación de las regiones marco y las CDR codifica un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido divulgado en el presente documento. Preferiblemente, como se ha comentado anteriormente, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones marco y, preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuerpo a su antígeno. Además, dichos procedimientos pueden utilizarse para realizar sustituciones o deleciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de la región variable que participen en un enlace disulfuro intracadena para generar moléculas de anticuerpo que carezcan de uno o más enlaces disulfuro intracadena. La presente invención abarca otras alteraciones del polinucleótido que están dentro de los conocimientos de la técnica.

Además, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) empalmando genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica adecuada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica adecuada. Como se describe más arriba, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones derivan de diferentes especies animales, como las que tienen una región variable derivada de un MAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, los anticuerpos humanizados.

Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (Pat. de EE.UU. N° 4.946.778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); y Ward et al., Nature 334:544-54 (1989)) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena simple. Los anticuerpos de cadena simple se forman uniendo los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácidos, lo que da lugar a un polipéptido de cadena simple. También pueden utilizarse técnicas para el ensamblaje de fragmentos funcionales de Fv enE. coli(Skerra et al., Science242:1038-1041 (1988)).

Procedimientos de producción de anticuerpos anti-IL13

Los anticuerpos a emplear en la invención pueden producirse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química o, preferentemente, por técnicas de expresión recombinante.

La expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento, derivado o análogo del mismo,(por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo o un anticuerpo de cadena simple), requiere la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique el anticuerpo o un fragmento del anticuerpo. Una vez obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, el vector para la producción del anticuerpo puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Se construye un vector de expresión que contiene secuencias codificantes de anticuerpos y señales apropiadas de control transcripcional y traslacional. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantein vitro, técnicas sintéticas y recombinación genéticain vivo.

El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan a continuación mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo. En un caso, los vectores que codifican las cadenas pesada y ligera pueden coexpresarse en la célula huésped para la expresión de toda la molécula de inmunoglobulina, como se detalla a continuación.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión del huésped para expresar las moléculas de anticuerpos como se ha descrito anteriormente. Dichos sistemas de expresión huésped representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden ser producidas y posteriormente purificadas, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes nucleotídicas apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo in situ. Las células bacterianas, como E.coli,y las células eucariotas se utilizan habitualmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante, especialmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante completa. Por ejemplo, las células de mamíferos como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector como el elemento promotor del gen temprano intermedio mayor del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión eficaz para los anticuerpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).

Además, puede elegirse una cepa celular huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, la glicosilación) y el procesamiento(por ejemplo, la escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Las distintas células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccional de las proteínas y los productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped adecuados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para ello, pueden utilizarse células huésped eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células huésped de mamífero incluyen, entre otras, células CHO, COS, 293, 3T3 o de mieloma.

Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden crearse líneas celulares que expresen de forma estable la molécula de anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes virales de replicación, las células huésped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, las células manipuladas pueden crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y, a continuación, se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crecer hasta formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este procedimiento puede utilizarse ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresen la molécula de anticuerpo. Estas líneas celulares de ingeniería pueden ser particularmente útiles en el cribado y evaluación de compuestos que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Se pueden utilizar varios sistemas de selección, incluyendo pero sin limitarse a la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, la resistencia a los antimetabolitos puede utilizarse como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu y Wu, Bioterapia 3:87-95 (1991)); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Los procedimientos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología del ADN recombinante pueden aplicarse rutinariamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales procedimientos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981).

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificación vectorial (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" (Clonación de ADN, Vol.3. Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador del sistema vectorial que expresa anticuerpos es amplificable, el aumento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped incrementará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada al gen del anticuerpo, la producción de éste también aumentará (Crouse et al., Mol. Celda. Biol. 3:257 (1983)).

La célula huésped puede ser co-transfectada con dos vectores de expresión, el primer vector codificando un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codificando un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permitan la expresión por igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede utilizarse un único vector que codifique y sea capaz de expresar polipéptidos de cadena pesada y ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Una vez que una molécula de anticuerpo ha sido producida por un animal, sintetizada químicamente, o expresada recombinantemente, puede ser purificada por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la Proteína A, y cromatografía de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden fusionarse a secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica, para facilitar la purificación.

Los anticuerpos pueden fusionarse recombinantemente o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a un polipéptido. Pueden utilizarse anticuerpos fusionados o conjugados para facilitar la purificación. Véase, por ejemplo, Harbor et al., supra, y Publicación PCT WO 93/21232; EP 439.095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); Pat. de EE.UU. N° 5.474.981; Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452(1991).

Además, los anticuerpos o fragmentos pueden fusionarse a secuencias marcadoras, como un péptido para facilitar la purificación. En casos preferidos, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido hexa-histidina, como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina facilita la purificación de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, entre otras, la etiqueta "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) y la etiqueta "flag".

Usos diagnósticos de los anticuerpos anti-IL13

Los anticuerpos que pueden emplearse en la invención incluyen derivados modificados, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo, de tal forma que la unión covalente no interfiera con la unión a IL13. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por biotinilación, HRP, o cualquier otra fracción detectable.

Los anticuerpos pueden utilizarse, por ejemplo, aunque no exclusivamente, para purificar o detectar IL13, incluyendo procedimientos de diagnósticoin vitroein vivo. Por ejemplo, los anticuerpos se utilizan en inmunoensayos para medir cualitativa y cuantitativamente los niveles de IL13 en muestras biológicas. Véase, por ejemplo Harlow et al., Anticuerpos: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988).

Como se explica con más detalle a continuación, los anticuerpos pueden utilizarse solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos pueden además fusionarse recombinantemente a un polipéptido heterólogo en el extremo N o C o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos pueden fusionarse recombinantemente o conjugarse con moléculas útiles como etiquetas en ensayos de detección.

También se divulga el empleo de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un agente de diagnóstico. Los anticuerpos pueden utilizarse con fines de diagnóstico para, por ejemplo, controlar el desarrollo o la progresión de una respuesta alérgica como parte de un procedimiento de pruebas clínicas para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Entre los ejemplos de sustancias detectables se incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones mediante diversas tomografías por emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse directamente al anticuerpo (o fragmento del mismo) o indirectamente, a través de un intermediario (como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) utilizando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU. N° 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como diagnósticos. Entre los ejemplos de enzimas adecuadas se incluyen la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; entre los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados se incluyen la estreptavidina/biotina y la avidina/biotina; algunos ejemplos de materiales fluorescentes adecuados son la umbeliferona, la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la fluoresceína diclorotriazinilamina, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente es el luminol; algunos ejemplos de materiales bioluminiscentes son la luciferasa, la luciferina y la aequorina; y algunos ejemplos de material radiactivo adecuado son 125I, 131I, 111In o 99Tc.

Los anticuerpos también pueden unirse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, entre otros, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.

Los anticuerpos marcados, y sus derivados y análogos, que se unen específicamente a la IL13 pueden utilizarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o monitorizar enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas con la expresión y/o actividad aberrante de la IL13. La divulgación proporciona la detección de expresión aberrante de IL13, que comprende (a) ensayar la expresión de IL13 en células o fluido corporal de un individuo usando uno o más anticuerpos divulgados específicos para IL13 y (b) comparar el nivel de expresión génica con un nivel de expresión génica estándar, por lo que un aumento o disminución en el nivel de expresión de IL13 ensayado comparado con el nivel de expresión estándar es indicativo de expresión aberrante.

Los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia y/o los niveles de IL13 en una muestra, por ejemplo, una muestra de fluido corporal o de tejido. El procedimiento de detección puede comprender el contacto de la muestra con un anticuerpo IL13 y la determinación de la cantidad de anticuerpo que se une a la muestra.

También se divulga un ensayo de diagnóstico para diagnosticar un trastorno, que comprende (a) ensayar la expresión de IL13 en células o fluido corporal de un individuo usando uno o más anticuerpos divulgados y (b) comparar el nivel de expresión génica con un nivel de expresión génica estándar, por lo que un aumento o disminución en el nivel de expresión génica ensayado comparado con el nivel de expresión estándar es indicativo de un trastorno particular.

Los anticuerpos pueden utilizarse para analizar los niveles de proteínas en una muestra biológica utilizando procedimientos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la materia (p. ej., véase Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros procedimientos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de proteínas son los inmunoensayos, como el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Las etiquetas adecuadas para el ensayo de anticuerpos son conocidas en la técnica e incluyen etiquetas enzimáticas, como la glucosa oxidasa; radioisótopos, como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112In) y tecnecio 99Tc); etiquetas luminiscentes, como luminol; y etiquetas fluorescentes, como fluoresceína y rodamina, y biotina.

También se divulga la detección y diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión aberrante de IL13 en un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un humano. En un caso, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un sujeto una cantidad eficaz de una molécula marcada que se une específicamente a IL13; b) esperar un intervalo de tiempo tras la administración que permita que la molécula marcada se concentre preferentemente en los lugares del sujeto donde se expresa el polipéptido (y que la molécula marcada no unida se elimine hasta el nivel de fondo); c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar la molécula marcada en el sujeto, de forma que la detección de la molécula marcada por encima del nivel de fondo indique que el sujeto padece una enfermedad o trastorno particular asociado con la expresión aberrante de IL13. El nivel de fondo puede determinarse por varios procedimientos, entre ellos, comparando la cantidad de molécula marcada detectada con un valor estándar determinado previamente para un sistema concreto.

Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes utilizado determinarán la cantidad de fracción de imagen necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una fracción radioisotópica, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada oscilará normalmente entre unos 5 y 20 milicurios de 99Tc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se acumulará entonces preferentemente en la localización de las células que contienen la proteína específica. Las imágenesin vivose describen en S. W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (Capítulo 13 de Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S. W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).

Dependiendo de varias variables, incluyendo el tipo de etiqueta usada y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferentemente en sitios en el sujeto y para que la molécula marcada no unida se elimine al nivel de fondo es de 6 a 48 horas o de 6 a 24 horas o de 6 a 12 horas. En otro caso, el intervalo de tiempo tras la administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días.

En un caso, el seguimiento de la enfermedad o trastorno se lleva a cabo repitiendo el procedimiento para diagnosticar la enfermedad o trastorno, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc.

La presencia de la molécula marcada puede detectarse en el paciente utilizando procedimientos conocidos en la técnica para la exploraciónin vivo. Estos procedimientos dependen del tipo de etiqueta utilizada. Los expertos podrán determinar el procedimiento adecuado para detectar una etiqueta determinada. Los procedimientos y dispositivos que pueden utilizarse en los procedimientos de diagnóstico incluyen, entre otros, la tomografía computarizada (TC), el escáner de cuerpo entero como la tomografía por emisión de positrones (PET), la resonancia magnética (RM) y la ecografía.

En un caso específico, la molécula se marca con un radioisótopo y se detecta en el paciente utilizando un instrumento quirúrgico sensible a la radiación (Thurston et al., Pat. de EE.UU. N° 5.441.050). En otro caso, la molécula se marca con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente mediante un instrumento de exploración que responde a la fluorescencia. En otro caso, la molécula se marca con un metal emisor de positrones y se detecta en la patente mediante tomografía por emisión de positrones. En otro caso, la molécula se marca con una etiqueta paramagnética y se detecta en un paciente mediante resonancia magnética (RM).

También se divulga un procedimiento para diagnosticar la predisposición de un paciente a desarrollar enfermedades causadas por la expresión no regulada de citoquinas. El aumento de las cantidades de IL13 en determinadas células, tejidos o fluidos corporales del paciente puede indicar que el paciente está predispuesto a ciertas enfermedades inmunitarias. En un caso, el procedimiento comprende la recogida de una muestra de células, tejido o fluido corporal de un sujeto que se sabe que tiene niveles bajos o normales de IL13, el análisis del tejido o fluido corporal para detectar la presencia de IL13 en el tejido, y la predicción de la predisposición del paciente a ciertas enfermedades inmunitarias basándose en el nivel de expresión de IL13 en el tejido o fluido corporal. En otro caso, el procedimiento comprende la recogida de una muestra de células, tejido o fluido corporal de un paciente que se sabe que contiene un nivel definido de IL13, el análisis del tejido o fluido corporal para determinar la cantidad de IL13, y la predicción de la predisposición del paciente a ciertas enfermedades inmunitarias basándose en el cambio en la cantidad de IL13 en comparación con un nivel definido o probado establecido para una célula, tejido o fluido corporal normal. El nivel definido de IL13 puede ser una cantidad conocida basada en valores bibliográficos o puede determinarse de antemano midiendo la cantidad en células, tejidos o fluidos corporales normales. En concreto, la determinación de los niveles de IL13 en determinados tejidos o fluidos corporales permite la detección específica y precoz, preferiblemente antes de que se produzca la enfermedad, de enfermedades inmunitarias en el paciente. Las enfermedades inmunitarias que pueden diagnosticarse mediante el presente procedimiento incluyen, entre otras, las enfermedades inmunitarias descritas en el presente documento. En el caso preferido, el tejido o fluido corporal es sangre periférica, leucocitos de sangre periférica, tejidos de biopsia como biopsias de pulmón o piel, y tejido.

Usos terapéuticos de los anticuerpos anti-IL13

Un anticuerpo, con o sin una fracción terapéutica conjugada con él, administrado solo o en combinación con factor(es) citotóxico(s) puede utilizarse como terapéutico. También se divulgan terapias basadas en anticuerpos que implican administrar los anticuerpos divulgados a un animal, un mamífero o un ser humano, para tratar una enfermedad, trastorno o afección mediada por IL13. El animal o sujeto puede ser un animal que necesite un tratamiento particular, como un animal al que se le haya diagnosticado un trastorno particular, por ejemplo, uno relacionado con la IL13. Los anticuerpos dirigidos contra la IL13 son útiles para inhibir reacciones alérgicas en animales, incluyendo pero no limitándose a vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, primates no humanos, etc., así como en humanos. Por ejemplo, administrando una dosis terapéuticamente aceptable de un anticuerpo, o anticuerpos, o un cóctel de los presentes anticuerpos, o en combinación con otros anticuerpos de diversas fuentes, puede reducirse o eliminarse una respuesta alérgica a antígenos en el mamífero tratado.

Los compuestos terapéuticos incluyen, entre otros, los anticuerpos descritos en el presente documento (incluidos los fragmentos, análogos y derivados de los mismos descritos en el presente documento) y los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos descritos en el presente documento descritos en el presente documento (incluidos los fragmentos, análogos y derivados de los mismos y los anticuerpos antiidiotipos descritos en el presente documento). Los anticuerpos pueden usarse para tratar, inhibir o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la expresión y/o actividad aberrante de IL13, incluyendo, pero sin limitarse a, una o más de las enfermedades, trastornos o afecciones descritos en el presente documento. El tratamiento y/o la prevención de enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la expresión y/o actividad aberrante de IL13 incluye, pero no se limita a, aliviar al menos uno de los síntomas asociados con dichas enfermedades, trastornos o afecciones. Los anticuerpos pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticamente aceptables como se conoce en la técnica o como se describe en el presente documento.

Los anticuerpos anti-IL13 pueden utilizarse terapéuticamente en una variedad de enfermedades. También se divulga un procedimiento para prevenir o tratar enfermedades mediadas por IL13 en un mamífero. El procedimiento comprende la administración al mamífero de una cantidad de anticuerpo anti-IL13 que previene o trata la enfermedad. El anticuerpo anti-IL13 se une a la IL13 y regula la expresión de citoquinas y receptores celulares, dando lugar a niveles de citoquinas característicos de estados no patológicos. Por lo tanto, las enfermedades para el tratamiento incluyen alergia, asma, enfermedad autoinmune, u otras enfermedades inflamatorias. Otras enfermedades alérgicas incluyen la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad alimentaria y la urticaria; las enfermedades cutáneas inmunomediadas incluyen las enfermedades cutáneas bullosas, el eritema multiforme y la dermatitis de contacto; las enfermedades autoinmunes incluyen la psoriasis, la artritis reumatoide, la artritis crónica juvenil; las enfermedades inflamatorias intestinales (es decir, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn); otras enfermedades asociadas a la IL13 incluyen la neumonía intersticial idiopática, la metaplasia de células caliciformes, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas como la fibrosis quística, la enteropatía sensible al gluten y la enfermedad de Whipple; enfermedades inmunológicas del pulmón como neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad; enfermedad pulmonar obstructiva crónica, infección por VRS, uvelitis, esclerodermia, osteoporosis y linfoma de Hodgkin.

La cantidad del anticuerpo que será eficaz en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de IL13 puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. El anticuerpo puede administrarse en regímenes de tratamiento coherentes con la enfermedad, por ejemplo, una dosis única o unas pocas dosis durante uno o varios días para mejorar un estado de enfermedad o dosis periódicas durante un tiempo prolongado para prevenir la alergia o el asma. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayosin vitropara ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos. La dosis exacta que se emplee en la formulación dependerá también de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y deberá decidirse según el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayoin vitroo de modelos animales.

En el caso de los anticuerpos, la dosis administrada a un paciente suele ser de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis administrada a un paciente está comprendida entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente entre 1 mg/kg y 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Por lo general, los anticuerpos humanos tienen una vida media más larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies, debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos extraños. Así pues, a menudo es posible utilizar dosis más bajas de anticuerpos humanos y administrarlos con menos frecuencia. Además, la dosis y la frecuencia de administración de los anticuerpos pueden reducirse mejorando la captación y la penetración tisular (por ejemplo, en el cerebro) de los anticuerpos mediante modificaciones como, por ejemplo, la lipidación.

Los anticuerpos pueden utilizarse ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfoquinas o factores de crecimiento hematopoyético (como, por ejemplo, IL-2, IL-3 IL-7, IFN), por ejemplo, que sirven para aumentar el número o la actividad de las células efectoras que interactúan con los anticuerpos.

Los anticuerpos pueden administrarse solos o en combinación con otros tipos de tratamientos, como inmunoterapia, broncodilatadores, moléculas anti-IgE, antihistamínicos o antileucotrienos.

En un caso preferido, el anticuerpo está sustancialmente purificado (por ejemplo, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados).

Se conocen varios sistemas de administración que pueden utilizarse para administrar un anticuerpo , incluyendo la inyección, por ejemplo, la encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Química.

262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral o de otro tipo, etc.

El anticuerpo anti-IL13 puede administrarse al mamífero de cualquier manera aceptable. Los procedimientos de introducción incluyen, entre otros, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, inhalatoria y oral. Los anticuerpos o composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir los anticuerpos o composiciones terapéuticas en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo la inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un reservorio, como un reservorio Ommaya.

También puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente formador de aerosoles. El anticuerpo también puede administrarse en los pulmones de un paciente en forma de una composición de polvo seco (Véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU. N° 6.514.496).

En un caso específico, puede ser deseable administrar los anticuerpos terapéuticos o composiciones localmente al área que necesita tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local, aplicación tópica, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Preferiblemente, cuando se administra un anticuerpo, hay que tener cuidado de utilizar materiales a los que la proteína no se absorba.

En otro caso, el anticuerpo puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibídem, pp. 317-327; véase en general ibídem).

En otro caso, el anticuerpo puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En un caso, puede utilizarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otro caso, pueden utilizarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Química. 23:61 (1983); véase también Levy et al., Science 228:190 (1985); Durante et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). En otro caso, puede colocarse un sistema de liberación controlada cerca de la diana terapéutica.

También se divulga una composición farmacéutica. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, y un portador fisiológicamente aceptable. En una realización específica, el término "fisiológicamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o incluido en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la terapéutica. Dichos portadores fisiológicos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como soportes líquidos, especialmente para soluciones inyectables. Entre los excipientes farmacéuticos adecuados se encuentran el almidón, la glucosa, la lactosa, la sacarosa, la gelatina, la malta, el arroz, la harina, la creta, el gel de sílice, el estearato de sodio, el monoestearato de glicerol, el talco, el cloruro de sodio, la leche desnatada en polvo, el glicerol, el propilenglicol, el agua, el etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales como los triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándar tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin se describen ejemplos de soportes adecuados. Dichas composiciones contendrán una cantidad eficaz del anticuerpo, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

En un caso, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como la lignocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Por lo general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados entre sí en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como polvo seco liofilizado o concentrado sin agua en un envase herméticamente cerrado, como una ampolla o sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composición vaya a administrarse por infusión, puede dispensarse con un frasco de infusión que contenga agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

También se divulga un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más envases llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas. Opcionalmente, dicho(s) envase(s) puede(n) ir asociado(s) a un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana.

Además, los anticuerpos pueden conjugarse con diversas moléculas efectoras, como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos o toxinas. Véase, por ejemplo Publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Pat. de EE.UU. N° 5.314.995y EP 396.387. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con una fracción terapéutica como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocídico, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa como, por ejemplo, 213Bi. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Algunos ejemplos son paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, así como sus análogos u homólogos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Las técnicas para conjugar dicha fracción terapéutica con anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982). Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpos. (Véase, por ejemplo Segal en Pat. de EE.UU. N° 4.676.980.)

Los conjugados pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica determinada, el agente terapéutico o la fracción de fármaco no debe interpretarse como limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción del fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina como la abrina, la ricina A, la exotoxina de pseudomonas o la toxina diftérica; una proteína como el factor de necrosis tumoral, el a-interferón, el p-interferón, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-a, TNF-p, AIM I (Véase, Publicación Internacional No. WO 97/33899), AIM II (véase la publicación internacional núm. WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (Véase, Publicación Internacional No. WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o, modificadores de la respuesta biológica como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento.

Terapia génica basada en anticuerpos

En otro caso, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican anticuerpos o derivados funcionales de los mismos, se administran para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de IL13, mediante terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En este caso de la invención, los ácidos nucleicos producen su proteína codificada que media un efecto terapéutico. Puede utilizarse cualquiera de los procedimientos de terapia génica disponibles. A continuación se describen procedimientos ejemplares.

Para revisiones generales de los procedimientos de terapia génica, véase Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu y Wu, Bioterapia 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); Mayo, TIBTECH 11(5):155-215 (1993).

En un caso, el compuesto comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo, formando dichas secuencias de ácido nucleico parte de vectores de expresión que expresan el anticuerpo o fragmentos o proteínas quiméricas o cadenas pesadas o ligeras del mismo en un hospedador adecuado. En particular, dichas secuencias de ácido nucleico tienen promotores enlazados operativamente a la región codificante del anticuerpo, siendo dicho promotor inducible o constitutivo y, opcionalmente, específico de tejido.

En otra realización particular, se utilizan moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias codificantes de anticuerpos y cualesquiera otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio deseado del genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos codificantes de anticuerpos (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989). En realizaciones específicas, la molécula de anticuerpo expresada es un anticuerpo de cadena única; alternativamente, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican tanto las cadenas pesadas como las ligeras, o fragmentos de las mismas, del anticuerpo.

La administración de los ácidos nucleicos a un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o a los vectores portadores de ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso las células se transforman primero con los ácidos nucleicosin vitro yluego se trasplantan al paciente. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapia génicain vivooex vivo.

En un caso específico, las secuencias de ácido nucleico se administran directamentein vivo,donde se expresan para producir el producto codificado. Esto puede lograrse por cualquiera de los numerosos procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo para que se vuelvan intracelulares, por ejemplo, por infección usando retrovirales defectuosos o atenuados u otros vectores virales (véase la Pat. N° 4.980.286), o por inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un cañón de genes; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes transfectantes, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o administrándolos en enlace con un péptido que se sabe que entra en el núcleo, administrándolos en enlace con un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem ..

262:4429-4432 (1987)) (que pueden utilizarse para dirigirse a tipos de células que expresan específicamente los receptores), etc. En otro caso, pueden formarse complejos ácido nucleico-ligando en los que el ligando comprende un péptido viral fusogénico para alterar los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En otra realización, el ácido nucleico puede dirigirseinvivo para su captación y expresión específicas de la célula, dirigiéndose a un receptor específico (véase, por ejemplo, Publicaciones PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; WO93/14188, WO 93/20221). Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse al ADN de la célula huésped para su expresión, mediante recombinación homóloga (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

En una realización específica, se utilizan vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo divulgado en el presente documento. Por ejemplo, puede utilizarse un vector retroviral (véase Miller et al. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto empaquetamiento del genoma viral y su integración en el ADN de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo que se utilizará en la terapia génica se clonan en uno o más vectores, lo que facilita la administración del gen a un paciente. Se puede encontrar más información sobre los vectores retrovirales en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para administrar el gen mdrl a células madre hematopoyéticas con el fin de hacerlas más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., J. Clin. Invierte. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); yGrossman y Wilson, Curr. Opinen. Gen. y Dev. 3:110-114 (1993).

También pueden utilizarse adenovirus. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para administrar anticuerpos a los epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan de forma natural los epitelios respiratorios. Otras dianas de los sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de poder infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, Curr. Opinen. Gen. Dev. 3:499-503 (1993) presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos rhesus. Otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia génica pueden encontrarse en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invierte. 91:225-234 (1993); Publicación PCT WO94/12649; y Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). También se ha propuesto el uso del virus adenoasociado (AAV) en la terapia génica (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); Pat. de EE.UU. Nos. 5.436.146; 6,632,670; 6,642,051).

Otro enfoque de la terapia génica consiste en transferir un gen a células en cultivo de tejidos mediante procedimientos como la electroporación, la lipofección, la transfección mediada por fosfato cálcico o la infección vírica. Normalmente, el procedimiento de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. A continuación, las células se someten a selección para aislar las que han absorbido y expresan el gen transferido. A continuación, esas células se administran al paciente.

En esta realización, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administraciónin vivode la célula recombinante resultante. Dicha introducción puede llevarse a cabo por cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos, entre otros, la transfección, la electroporación, la microinyección, la infección con un vector vírico o bacteriófago que contenga las secuencias de ácido nucleico, la fusión celular, la transferencia génica mediada por cromosomas, la transferencia génica mediada por microcélulas, la fusión de esferoplastos, etc. Se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes extraños en las células (véase, por ejemplo, Loeffler y Behr, Meth. Enzymol.

217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92m (1985) y pueden utilizarse, siempre que no se alteren las funciones fisiológicas y de desarrollo necesarias de las células receptoras. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico sea expresable por la célula y preferiblemente heredable y expresable por su progenie celular.

Las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un paciente por diversos procedimientos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas) se administran preferentemente por vía intravenosa. La cantidad de células que se prevé utilizar depende del efecto deseado, del estado del paciente, etc., y puede ser determinada por un experto en la materia.

Las células en las que puede introducirse un ácido nucleico con fines de terapia génica abarcan cualquier tipo celular deseado y disponible, e incluyen, entre otras, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas, como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ej., obtenidas de médula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.

En un caso, la célula utilizada para la terapia génica es autóloga del paciente. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo se introducen en las células de modo que sean expresables por las células o su progenie, y las células recombinantes se administranin vivo paraobtener un efecto terapéutico. En un caso concreto, se utilizan células madre o progenitoras. Puede utilizarse potencialmente cualquier célula madre y/o progenitora que pueda aislarse y mantenersein vitro(véase, por ejemplo Publicación PCT WO 94/08598; Stemple y Anderson, Cell 71:973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Biología celular. 21A:229 (1980); y Pittelkow y Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986)).

Ejemplos

Ejemplo 1:

Preparación del inmunógeno IL13: una IL13/Fc humana mutada e inactiva (MT-IL13/Fc)

A. Clonación y construcción de un plásmido de expresión para MT-IL13/Fc

Se informó que la IL13 humana con una mutación (ácido glutámico a lisina) en el residuo de aminoácido #13 se unía a IL13Ra1 con igual o mayor afinidad pero había perdido la capacidad de activar células portadoras de IL13Ra1 (Thompson et al., J. Biol. Química, 274: 29944 (1999)). Esta IL13 mutada e inactiva, designada MT-IL13, se expresó en células de riñón embrionario humano 293-T. La proteína recombinante purificada se utilizó como inmunógeno en la presente invención para generar anticuerpos monoclonales anti-IL13. Dos cebadores oligonucleótidos:

5'AAGCTTTCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCAT3' (SEQ ID NO 9)

5' CTCGAGGTTGAACCGTCCCTCGCGAAAAAG 3' (SEQ ID NO 10)

correspondientes a la secuencia de oligonucleótidos del gen MT-IL13 se sintetizaron y utilizaron como plantillas en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para clonar el gen IL13 a partir de una biblioteca de ADNc de testículo humano (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). El fragmento de PCR (342 pares de bases) que carecía de la secuencia del péptido señal previsto de IL13 se ligó al vector pSecTag/FRT (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contenía una secuencia del péptido señal de secreción en el extremo 5' y una secuencia de Fcy1 humana (regiones bisagra y constante CH2 y CH3) en el extremo 3'. La composición del constructo se confirmó mediante secuenciación.

B. Producción de MT-IL13/Fc a partir de células 293T transfectadas

Para la expresión transitoria de MT-IL13/Fc, se transfectó ADN plasmídico purificado en células 293T mediante Lipofectamine 2000 (Invitrogen), según el protocolo del fabricante. A las 72 horas de la transfección, se recogieron los sobrenadantes de cultivo de las células transfectadas para su purificación. Para la expresión estable de MT-IL13/Fc, se establecieron líneas celulares utilizando una línea celular Flp-In 293T (Invitrogen). Para confirmar la expresión, se analizaron los sobrenadantes de los cultivos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE). Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se detectaron por reacción con peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con anticuerpos monoclonales IgG antihumana de ratón (Fc) (Sigma, St. Louis, MO) o anticuerpos policlonales anti-IL13 de cabra (R&D Systems, Minneapolis, MN), que luego se detectaron con IgG anti-cabra de mono HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Las proteínas inmunorreactivas se identificaron en película, utilizando detección de quimioluminiscencia mejorada (Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Rockford, IL).

C. Purificación de MTIL13/Fc

MT-IL13/Fc se purificó con una columna de afinidad de proteína A hiper-D (Invitrogen) equilibrada con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Tras aplicar el sobrenadante del cultivo celular a la columna, se lavó la resina con más de 20 volúmenes de columna de PBS. A continuación, se lavó la resina con tampón SCC (citrato sódico 0,05 M, cloruro sódico 0,5 M, pH 6,0) para eliminar las proteínas no unidas. A continuación, se eluyeron las proteínas de fusión IL13 (citrato sódico 0,05 M, cloruro sódico 0,15 M, pH 3,0) y se dializaron en PBS.

Las fracciones de la columna de afinidad que contenían MT-IL13/Fc se analizaron por SDS-PAGE. La pureza de las proteínas se analizó mediante tinción con azul de Coomassie y la identidad de las proteínas mediante inmunotransferencia Western utilizando anticuerpos IgG (Fc) antihumanos de cabra (Sigma) y anticuerpos IL13 antihumanos de cabra (R&D Systems), tal como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 2:

Generación de anticuerpos monoclonales anti-IL13

Ratones macho A/J (Harlan, Indianapolis, IN), de 8-12 semanas de edad, fueron inyectados subcutáneamente con 20 |jg de MT-IL13/Fc en adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI) en 200 j l de PBS pH 7,4. A intervalos de dos semanas, los ratones recibieron dos inyecciones subcutáneas de 20 jg de MT-IL13/Fc en adyuvante de Freund incompleto. A continuación, dos semanas más tarde y tres días antes del sacrificio, los ratones fueron inyectados de nuevo por vía intraperitoneal con 20 jg del mismo inmunógeno en PBS. Para la fusión se utilizaron células del bazo aisladas de uno o varios ratones inmunizados con antígenos. También se utilizaron procedimientos similares de inmunización y fusión con IL13 humana expresada en E.coli(R&D Systems) como inmunógeno.

En la fusión que condujo a la generación del MAb anti-IL13 228B/C-1, se combinaron 26,4*10® células de bazo y 58,8*10® células de bazo de dos ratones inmunizados. Para cada fusión, se prepararon suspensiones de células individuales a partir del bazo de ratones inmunizados y se utilizaron para la fusión con células de mieloma Sp2/0. Se fusionaron células Sp2/0 y de bazo en una proporción de 1:1 en un medio que contenía un 50% de polietilenglicol (M.W. 1450) (Kodak, Rochester, NY) y dimetilsulfóxido al 5% (Sigma). A continuación, las células se ajustaron a una concentración de 1,5 *105 células de bazo por 250 pl de suspensión en medio DMEM (Invitrogen, CA), complementado con un 10% de suero bovino fetal, 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 0,1 mM de hipoxantina, 0,4 pM de aminopterina y 1® pM de timidina. Se añadieron 250 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de unas cincuenta placas de microcultivo de 9® pocillos. Transcurridos unos diez días, se extrajeron los sobrenadantes de los cultivos para detectar la reactividad con MT-IL13/Fc en ELISA.

Se recubrieron pocillos de placas de microensayo Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) añadiendo MT-IL13/Fc purificado (0,1 pg/mL) durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de retirar la solución de recubrimiento agitando la placa, se añadieron 200 pl de un tampón de bloqueo/dilución (PBS con un 2% de albúmina de suero bovino y un 0,05% de TWEEN® 20) a cada pocillo durante una hora para bloquear los sitios no específicos. Una hora más tarde, se lavaron los pocillos con tampón PBST (PBS con 0,05% de TWEEN® 20). Se recogieron 50 microlitros de sobrenadante de cultivo de cada pocillo de fusión, se mezclaron con 50 pl del tampón de bloqueo/dilución y se añadieron a los pocillos individuales de las placas de micropruebas. Tras una hora de incubación, se lavaron los pocillos con PBST. A continuación, los anticuerpos murinos unidos se detectaron mediante reacción con IgG anti ratón de cabra conjugada con HRP (específica de Fc) (Jackson ImmunoResearch Lab, West Grove, PA) y diluida a 1:2.000 con el tampón de bloqueo/dilución. Se añadió a los pocillos una solución de sustrato de peroxidasa que contenía 0,1% de 3,3,5,5 tetrametilbencidina (Sigma, St. Louis, MO) y 0,003% de peróxido de hidrógeno (Sigma) para el desarrollo del color durante 30 minutos. La reacción se terminó añadiendo 50 pl de H2SO42 M por pocillo. La DO450 de la mezcla de reacción se midió con un BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, Winooski, VM).

A continuación, los sobrenadantes de cultivo de los pocillos positivos del cribado MT-IL13/Fc se sometieron a pruebas de unión negativa a una proteína de fusión Fy1 irrelevante. A continuación, se seleccionaron los pocillos positivos finales para la clonación unicelular mediante dilución limitadora. Los sobrenadantes de cultivos de anticuerpos monoclonales se volvieron a analizar para confirmar su reactividad mediante ELISA. Los hibridomas seleccionados se cultivaron en matraces de centrifugación y el sobrenadante del cultivo se recogió para la purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad con proteína A.

Los anticuerpos purificados se probaron mediante cuatro ensayos: i) reactividad cruzada con MT-IL13/Fc expresada en células 293T e IL13 de ratón expresada enE. coli; ii) inhibición de la proliferación autocrina por IL13 de células HDLM-2 y L-1236; iii) inhibición de la fosforilación STAT® inducida por IL13 en células THP-1; e iv) inhibición de la expresión CD14 y CD23 regulada por IL13 en monocitos humanos.

Se obtuvieron 73 MAbs anti-IL13 a partir de las fusiones realizadas en ratones inmunizados con MT-IL13/Fc e IL13. Treinta y nueve de estos MAbs se purificaron para su caracterización mediante ELISA y ensayos celulares. Trece de estos 39 MAbs inhibieron la proliferación inducida por IL13 autocrina de las células HDLM-2 y L-123® (véase la descripción del ensayo y los resultados en el Ejemplo 5). Cuatro de los MAbs resultaron ser muy fuertemente reactivos con la IL13 humana en ELISA y fueron neutralizantes contra la IL13 humana en ensayos funcionales basados en células. Estos MAbs fueron designados 228B/C-1, 228A-4, 227-2® y 227-43. Todos estos anticuerpos se generaron utilizando el MT-IL13/Fc glicosilado como inmunógeno.

Ejemplo 3:

Reactividad de anticuerpos monoclonales anti-IL13 con IL13 humana y de ratón en ELISA

La reactividad de varios anticuerpos monoclonales anti-IL13 se probó por ELISA. Se recubrieron diferentes pocillos de placas de micropruebas de 9® pocillos con IL13 humana no glicosilada expresada por E. coli (R&D Systems), MT-IL13/Fc glicosilada expresada por células 293T o IL13 de ratón expresada por E. coli (R&D Systems) mediante la adición de 100 pl de proteína iL13 a 0,1 pg/mL en PBS. Tras una incubación de una noche a temperatura ambiente, los pocillos se trataron con PBSTB (PBST con un 2% de BSA) para saturar los sitios de unión restantes. A continuación, se lavaron los pocillos con PBST.

Cien microlitros de MAbs anti-IL13 doblemente diluidos en serie (0,5 pg/mL (3,33 nM) a 0,05 ng/mL (0,00033 nM)) se añadieron a los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente. También se probó un MAb anti-IL13 JES-5A2 de (BD Biosciences-Pharmingen, San Diego, CA) como control positivo. Este anticuerpo se generó utilizando IL13 humana expresada en E. coli como inmunógeno. Como control negativo irrelevante se utilizó un MAb anti-VIH-1 gp120 de ratón con el mismo isotipo. A continuación, se lavaron los pocillos con PBST. El anticuerpo unido se detectó mediante incubación con IgG antirratón de cabra diluida con HRP (Fc) (Jackson ImmunoResearch) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadió solución de sustrato de peroxidasa para el revelado del color, tal como se ha descrito anteriormente. La DO450 se midió utilizando un lector ELISA.

La Fig. 1 muestra la unión dosis-dependiente de los MAbs anti-IL13 228B/C-1, 228A-4, 227-2®, 227-43, y el control negativo en ELISA. Entre estos MAbs, 228B/C-1 mostró la reactividad más fuerte. La Fig. 2 muestra la unión dosisdependiente de los MAbs anti-IL13 a MT-IL13/Fc en ELISA. 228B/C-1 y 228A-4 mostraron la mayor reactividad con MT-IL13/Fc, mientras que 227-26 y 227-43 mostraron una reactividad moderada.

Las Fig 1 y 2 muestran que 228B/C-1 tiene la afinidad más alta para IL13 humana glicosilada y no glicosilada entre todos los MAbs anti-IL13 probados. Todos estos MAbs anti-IL13 no presentaron reacción cruzada con la IL13 de ratón en ELISA (datos no mostrados).

Ejemplo 4

Falta de competencia de la unión 228B/C-1-Hrp a IL13 humana por JES10-5A2

Para determinar si JES10-5A2 y 228B/C-1 se unen al mismo epítopo de la IL13 humana, se utilizó un ELISA de competición para examinar el efecto de JES10-5A2 sobre la unión de 228B/C-1-HRP a la IL13 humana expresada en E. coli. Cada pocillo de placas de micropruebas de 96 pocillos se incubó con 100 pl de proteína IL13 a 0,1 pg/mL en PBS. Tras una incubación de una noche a temperatura ambiente, los pocillos se trataron con PBSTB (PBST con un 2% de BSA) para saturar los sitios de unión restantes. A continuación, se lavaron los pocillos con PBST. Cincuenta microlitros de 228B/C-1 y JES10-5A2 diluidos dos veces en serie (desde una concentración final de 20 pg/mL a 9,76 ng/mL) se mezclaron con 50 pL de 228B/C-1-HRP previamente titulada (a una dilución de 1:6.400). A continuación, se añadieron las mezclas a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadió solución de sustrato de peroxidasa para el revelado del color, tal como se ha descrito anteriormente. La DO450 se midió utilizando un lector ELISA.

La Fig. 3 demuestra que JES10-5A2 no compite con la unión de 228B/C-1-HRP a IL13 humana, indicando que 228B/C-1 y JES10-5A2 se unen a diferentes sitios en IL13 humana.

Ejemplo 5

Cribado de Anticuerpos Monoclonales Neutralizantes Anti-IL13 Mediante un Ensayo de Proliferación Dependiente de IL-13-Autocrina Utilizando Células L-1236 y HDLM-2

L-1236 y HDLM-2 son líneas celulares de linfoma de Hodgkin obtenidas de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Estas líneas celulares producen IL13, que a su vez activa su proliferación celular de forma autocrina (Kapp U et.al., J. Exp. Med. 189:1939 (1999)).

Se cultivaron células (25.000 células/pocillo) en presencia o ausencia de diferentes MAb anti-IL13 (0,2, 0,02 y 0,002 pg/mL) en 5% CO2 a 37°C durante 3-5 días. A continuación, se midió la proliferación celular mediante un ensayo con el compuesto de tetrazolio MTS (Promega, Madison, WI) (lecturas a DO490) o mediante la incorporación de 3H-timidina (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

Se esperaba que la adición de un MAb neutralizante anti-IL13 al cultivo de estas líneas celulares inhibiera su proliferación mediante la unión e inactivación de la IL13 producida por estas células. Los resultados ilustrados en la Figura 4 muestran el efecto del MAb anti-IL13 de la presente invención sobre la proliferación de las células L-1235. El MAb 228B/C-1 muestra la mayor potencia de inhibición de la proliferación de células L-1236 de forma dependiente de la dosis entre los anticuerpos neutralizantes ensayados. TA1-37 (un MAb anti-IL13 generado utilizando IL13 humana expresada por E. coli como inmunógeno) no tuvo ninguna actividad inhibidora incluso a una dosis tan alta como 0,2 pg/mL. Se obtuvieron resultados similares con células HDLM-2.

Ejemplo 6

Ensayo de expresión de CD14 y CD23 regulada por IL13 en monocitos humanos primarios

La IL13 induce la supresión de la expresión de CD14 y la regulación al alza de la expresión de CD23 en los monocitos humanos (de Waal Malefyt et al., J. Immunol., 151., 2001: 6370 (1993), Chomarat et al. Rev. Immunol. 17: 1 (1998)). Los leucocitos de sangre periférica (LPS) se aislaron de sangre total heparinizada recién extraída de donantes humanos sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad en Histopaque-1077 (Sigma). Se añadieron PBL (1,5*106) suspendidas en medio RPMI-1640 (Invitrogen) con un 5% de suero bovino fetal a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos que contenía IL13 recombinante (10 ng/mL finales = 0,813 nM) y un anticuerpo monoclonal anti-IL13 o un anticuerpo irrelevante (diluciones seriadas al triple, a partir de un final de 12 pg/mL = 80 nM). La expresión de CD14 o CD23 en los monocitos se suprimió o aumentó, respectivamente, mediante la adición de 0,813 nM de IL13 humana al medio de incubación. El medio de control contenía medio RPMI-1640/FBS sin IL13 recombinante.

Las células se incubaron en 5% de CO2 a 37°C durante 2 días. Se recogieron las células para teñirlas con anti-CD14-FITC o anti-CD23-PE (BD Biosciences-Pharmingen). Los niveles de expresión de CD14 y CD23 en la población de monocitos se midieron mediante citometría de flujo y se representaron mediante la intensidad de fluorescencia media (MFI).

Los efectos de los MAbs anti-IL13 sobre la expresión CD14 suprimida por IL13 en monocitos humanos se representan en la Fig. 5. Entre todos los MAbs anti-IL13 probados, 228B/C-1 tuvo la mayor potencia en la inhibición del efecto de IL13 sobre la expresión de CD14. La inhibición completa del efecto de la IL13 se alcanzó a 0,33 nM. Las actividades inhibitorias de los MAbs 227-26 y 228A-4 fueron moderadas, mientras que la de JES10-5A2 fue débil. El efecto de IL13 no pudo ser completamente inhibido por JES10-5A2 incluso a 80nM.

Los efectos de los MAbs anti-IL13 sobre la regulación al alza de CD23 inducida por IL13 en monocitos humanos se representan en la Fig. 6. De forma similar a los resultados sobre la expresión de CD14 (Fig. 5), 228B/C-1 fue el más potente a la hora de inhibir el efecto de IL13 sobre la expresión de CD23 entre los MAbs anti-IL13 probados. La inhibición completa por 228B/C-1 se alcanzó a 0,33 nM. La potencia inhibidora de JES10-5A2 fue débil.

Basándose en los resultados presentados en las Figs. 5 y 6, la inhibición completa de la IL13 por 228B/C-1 puede conseguirse a una relación estequiométrica molar de 1:2 (MAb:IL13), y, por lo tanto, 228B/C-1 es un MAb neutralizante de muy alta afinidad contra la IL13 humana.

Ejemplo 7

Ensayo de fosforilación de STAT6 inducida por IL13 en células THP-1

La IL13 puede activar la línea celular mieloide THP-1(ATCC, Manassas, VA) para inducir la fosforilación de STAT6, que es un paso crítico en la vía de transducción de señales de la IL13 (Murata T et al., Int. Immunol. 10: 1103-1110 (1998). Los MAbs anti-IL13 fueron probados para la inhibición de IL13 en este ensayo.

Las células THP-1 se mantuvieron en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen) suplementado con un 5 % de suero bovino fetal. El día de los experimentos, se lavaron las células y se incubaron en DMEM sin suero a 37 °C en un 5% de CO2 durante 2 horas. 0.a continuación, se añadieron 3*106 células en 80 pl del medio sin suero a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Ciento veinte microlitros de medio conteniendo IL13 humana (concentración final de 10 ng/mL = 0,813 nM) y MAbs anti-IL13 (diluciones seriadas 5 veces, a partir de una concentración final de 0,5 pg/mL = 3,333 nM). Pocillos de control negativo sin IL13 o con IL13 y un MAb de ratón irrelevante de isotipo similar.

Las mezclas se incubaron a 37°C bajo 5% de CO2 durante 10 min. A continuación, las placas se centrifugaron a 300 x g durante 3 minutos a 4°C. Tras desechar el sobrenadante, los gránulos celulares se resuspendieron en 100 pl de tampón de muestra no reductor Laemmli (tampón de carga SDS-PAGE, BioRad, CA) y se transfirieron a tubos de microcentrífuga. Los tubos se calentaron a 95 °C durante 5 minutos y después se centrifugaron a 10.000 * g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se recogieron los sobrenadantes y se analizaron mediante SDS-PAGE en gradiente de 4-20%. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de PVDF que luego se incubó con MAb anti-Stat6 humana de ratón diluida (Y641, fosfoespecífica) (BD Bioscienses Pharmingen).

El anticuerpo unido se detectó mediante anticuerpos IgG de cabra anti-ratón (Fc) conjugados con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Las proteínas inmunorreactivas se identificaron en película, utilizando detección de quimioluminiscencia mejorada (Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce) Fig. 7 representa los resultados del efecto de MAbs anti-IL13 sobre la fosforilación de Stat6 inducida por IL13 en células THP-1. Stat6 se fosforila en células THP-1 tratadas con 0,813 nM de IL13 humana. Se observó una inhibición dependiente de la dosis de la fosforilación de Stat6 cuando las células se trataron con MAbs 228B/C-1,228A-4, 227-26, 227-43 y JES10-5A2. El MAb 228B/C-1 es el anticuerpo neutralizante más potente entre los MAbs anti-IL13 probados. La inhibición completa por 228B/C-1 se alcanzó a una concentración entre 0,667 nM y 0,133 nM. La relación estequiométrica molar aproximada entre 228B/C-1 e IL13 para una inhibición completa fue de 1:2. Es coherente con los datos mostrados en las Figs. 5 y 6.

Ejemplo 8

Clonación molecular de los genes de las cadenas pesada y ligera que codifican los anticuerpos monoclonales anti-IL13

El ARN total se aisló de células de hibridoma utilizando un kit QIAGEN (Valencia, CA). La reacción de transcripción inversa (ADNc de primera cadena) se llevó a cabo del siguiente modo: se mezclaron 1-1,5 mg de ARN total con 1 ml de dNTPs 10 mM, 50 ng de hexámeros aleatorios y agua libre de RNasa en un volumen final de 12 mL.

La mezcla de reacción se incubó a 65°C durante 5 minutos y se colocó inmediatamente en hielo durante 1 minuto. Tras un breve centrifugado, se añadieron los siguientes reactivos: 4 mL de tampón de primera cadena 5X (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCI, 15 Mm MgCh), 2 mL de 0,1 mM DTT y 1 mL de inhibidor de RNasaOUT RNase (40 U/mL). Tras mezclar, la reacción se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos. A continuación, se añadió un mililitro de Superscript II RT (50 U/ml) a la mezcla para incubarla a 25°C durante 10 minutos, seguidos de 50 minutos a 42°C. Tras una breve centrifugación, la reacción se incubó durante 15 minutos a 70°C para inactivar la transcriptasa inversa. A continuación, se añadió un microlitro de RNasa H (2 U/ml) y se incubó la reacción durante 20 minutos a 37°C para destruir el ARN.

Para amplificar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, se utilizó un procedimiento descrito por O'Brien y Jones (O'Brien S. y Jones T, "Humanizing antibodies by CDR grafting", Antibody Engineering, Springer Lab manual, Eds. Kontermann y Duble, S (2001)). Brevemente, los cebadores 5' se seleccionaron a partir de la región del péptido señal (11 juegos para la cadena ligera y 12 juegos de cebadores degenerados para la cadena pesada) y los cebadores 3' se seleccionaron a partir de la región constante de la cadena ligera o pesada. los cebadores 5' y 3' (1,5 mL de 10 mM) se mezclaron con 5 mL de tampón de PCR 10X (250 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM MgSO4, 100 mM KCI, 100 mM (NH4)2 SO4, 1% Triton X-100, 1 mg/mL de BSA libre de nucleasas), 1 mL de ADNc preparado previamente, 1 mL de Turbo pfu (Stratagene) y agua para ajustar el volumen total de la reacción a 50 mL. La PCR se realizó de la siguiente manera: 1 ciclo a 94°C durante 4 minutos; 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, a 53°C durante 30 segundos y a 72°C durante 45 segundos; y 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos. Las mezclas de reacción se resolvieron por electroforesis en un gel de agarosa al 1%.

Se purificó el fragmento de ADN amplificado y se clonó en un vector pcDNA3.1. La clonación se llevó a cabo utilizando el kit de clonación TOPO de Invitrogen siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante (Invitrogen). Se utilizaron entre quince y veinte colonias de E. coli transformada para la purificación del plásmido. Los plásmidos se secuenciaron utilizando un cebador T7. Las secuencias predominantes para las cadenas pesada y ligera se clonaron en un vector de expresión M13 Fab mediante mutagénesis por hibridación (Glaser S. et al. Antibody Engineering (Oxford University Press, Nueva York(1995)), Near RI, BioTechniques 12: 88 (1992)). Las propiedades de unión del Fab expresado se confirmaron mediante ELISA. Las figuras 8-10 muestran las secuencias de aminoácidos de las cadenas VH y VL de 228B/C, 228A-4 y 227-26, respectivamente.

Ejemplo 9

Humanización del clon 228B/C

A. Protocolo general

Las regiones variables del anticuerpo murino 228B/C se clonaron y secuenciaron como se describe en el Ejemplo 8. Como control se construyó un Fab quimérico en un vector fago que combinaba las regiones variables de la 228B/C murina y la región constante de la cadena kappa humana y la parte CH1 de la IgG humana.

Para iniciar el proceso de humanización, se seleccionó una secuencia génica v adecuada de entre las secuencias génicas germinales humanas conocidas para proporcionar las regiones marco uno a tres (FM1-FM3), y se seleccionó una secuencia génica J adecuada para proporcionar la región marco 4 (FM4) según los criterios descritos en el documento WO04/070010. Esta plantilla puede elegirse basándose, por ejemplo, en su longitud total comparativa, el tamaño de las CDR, los residuos de aminoácidos situados en la unión entre la estructura y las CDR, la homología total, etc. La plantilla elegida puede ser una mezcla de más de una secuencia o puede ser una plantilla de consenso.

Construcción de un vector de expresión que comprenda las variantes de cadena pesada y/o ligera generadas comprendidas en las fórmulas:

FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 (i) y

FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 (ii),

donde FRH1, FRH2, FRH3, FRH4, FRL1, FRL2, FRL3 y FRL4 representan las variantes de las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de la plantilla marco elegidas de las plantillas de línea germinal y las CDR representan las del anticuerpo madre. Se determinaron las diferencias entre el anticuerpo parental murino y las secuencias plantilla humanas seleccionadas para servir de base a la generación de una biblioteca de Fabs de anticuerpos. Esta biblioteca puede generarse para la cadena ligera individualmente, y después para la cadena pesada o simultáneamente. La maduración de la afinidad de las regiones CDR también puede analizarse simultánea o secuencialmente con la humanización de la estructura.

La biblioteca de Fabs variantes se generó conteniendo (1) el residuo de aminoácido murino, (2) el residuo de aminoácido del gen de la línea germinal humana elegido, u opcionalmente, (3) un aminoácido seleccionado al azar, en cada una de las posiciones seleccionadas que se encontró que diferían de la secuencia marco murina. Las variantes deseadas se generaron mediante el recocido de oligonucleótidos solapados y la posterior incorporación del residuo elegido en las posiciones del armazón que eran de interés. Se realizó una amplificación del producto recocido utilizando dos cebadores, uno de ellos marcado con biotina. La etiqueta de biotina se utilizó para la purificación de una sola hebra del cebador y ésta se utilizó como oligo mutagénico en una reacción de mutagénesis basada en Kunkel utilizando el vector de interés en un formato de placa U (Rosok, M. J., et al., (1996) Journal of Biological Chemistry 271: 22611-22618). Tras el recocido y la elongación del plásmido, la reacción se sometió a digestión con una enzima de restricción única, Xbal, que escinde la plantilla original pero no la cadena mutada recién sintetizada. El plásmido se electroporó en células competentes para la amplificación y se mezcló con un tipo de célulaE. colicompetente en fagos para la generación de partículas de fagos. Las construcciones plasmídicas son capaces de sintetizar un Fab que se secreta en el sobrenadante. Se seleccionaron placas individuales y se eluyó el anticuerpo para su análisis.

Se analizó la calidad y la integridad de la biblioteca. Tras secuenciar una muestra aleatoria de la biblioteca, se determinó el número de candidatos seleccionados que tenían la inserción correcta de la región Vk (o Vh). Esta cifra se utilizó para determinar la eficiencia global de la biblioteca. Una vez establecida la biblioteca, los candidatos se examinaron mediante un ensayo funcional basado en ELISA para determinar qué candidatos producían Fabs funcionales específicos para la IL-13. Aquellos candidatos que demostraron una actividad para la IL-13 comparable a la del clon quimérico fueron sometidos a ensayos adicionales de reproducibilidad. Se secuenciaron varios de los candidatos para determinar el grado de tolerancia a la humanización de las posiciones marco seleccionadas.

Una vez que las bibliotecas resultaron ser representativas, se analizaron las variantes para determinar la afinidad de unión, y se secuenciaron las que resultaron tener una afinidad de unión comparable o mayor que el anticuerpo de control quimérico. Si los aislados analizados no contenían un residuo del gen de la línea germinal humana en una posición elegida del marco, se concluía que el residuo de aminoácido humano no se toleraba en esa posición. En este punto, si sólo se probaran los aminoácidos murinos y humanos, se podría hacer otra biblioteca Fab aleatorizando los aminoácidos en las posiciones en las que no se encontraran residuos de la plantilla humana. A continuación, se seleccionarían Fabs con residuos de sustitución adecuados (no murinos) y se convertirían en MAbs completos. Además, pueden utilizarse plantillas de consenso como marco de partida.

B. Anticuerpo monoclonal IL-13 Humanización Vk

Primero se realizó la humanización de la región variable de la cadena ligera (Vk). Sin embargo, se puede empezar por cualquiera de las dos cadenas o humanizar ambas simultáneamente. La plantilla humana elegida fue la Plantilla Humana 2 e implicó el estudio de los efectos sobre 9 residuos cercanos a las CDR dentro de la cadena ligera para determinar si podían humanizarse sin pérdida de actividad funcional. Las posiciones que se estudiaron en la cadena ligera para la segunda ronda de cribado fueron 4, 9, 12, 73, 81, 82, 83, 84 y 109.

Se generó una biblioteca variando cada una de estas posiciones con el residuo plantilla murino o humano. Se analizaron aproximadamente 860 variantes mediante un ensayo ELISA funcional. Sólo 18 candidatos demostraron una función comparable a la del clon quimérico. Estos candidatos fueron sometidos a ensayos adicionales. Seis candidatos de los 18 demostraron una mayor afinidad por el antígeno en comparación con el clon quimérico, y estos 6 fueron secuenciados. Los resultados de la secuenciación se presentan en la Fig. 11A y B, y de ellos se desprende que las posiciones 4, 12 y 81 favorecen al residuo murino.

C. Vh Humanización

Para evaluar la contribución de los residuos del armazón de la cadena pesada a la función general del anticuerpo candidato, se estableció una biblioteca variando 10 posiciones dentro del armazón de la plantilla DP27 humana que diferían del progenitor murino, mientras se mantenía la cadena ligera murina. La biblioteca se generó utilizando oligonucleótidos solapados sintetizados para el Vh, y la generación del Vk murino mediante PCR. A continuación, la Vk y la Vh se insertaron en el vector de expresión Fab mediante mutagénesis y la biblioteca se analizó en busca de Fabs funcionales. La complejidad de la biblioteca era de (210/70%) * 3 = 3840.

Se seleccionó un total de 1056 candidatos, utilizando un ensayo ELISA en formato de 96 pocillos. Los candidatos de esta biblioteca que se eligieron para la secuenciación fueron los que arrojaron los valores más altos de los resultados del cribado. Cinco de estos candidatos de alta actividad fueron secuenciados para determinar su nivel de humanización y sus secuencias se presentan en la Fig. 12A y B. A partir de estos resultados, tres de los residuos marco en la cadena pesada favorecieron el residuo murino (#24, 68 y 94).

El segundo marco estudiado fue la plantilla humana NEW. Se generó una biblioteca combinatoria en la que tanto el Vk como el Vh se humanizaron simultáneamente. Se variaron nueve residuos en el Vk entre los residuos murinos y los humanos y también se eligieron nueve residuos para el Vh. De esta biblioteca se seleccionaron aproximadamente 5200 candidatos (55 placas de 96 pocillos). De la criba, aproximadamente 300 candidatos dieron resultados comparables al clon quimérico. De este grupo, se secuenciaron treinta candidatos para determinar el nivel de humanización de estos clones funcionales.

Los resultados de la secuenciación para las cadenas ligeras se presentan en la Figura 11A y B. Las secuencias de la cadena pesada se presentan en la Fig. 12 A y B. La posición 83 en la Vk tuvo una alta incidencia para retener el residuo murino, mientras que varias posiciones en la plantilla Vh favorecieron el residuo murino. En particular, la posición 94 conservaba el residuo murino en 29 de los 30 candidatos examinados. Aunque no parece que ningún candidato tenga marcos completamente humanizados, varias regiones variables que estaban muy humanizadas en el Vk o en el Vh se utilizarán para una mayor humanización. El Vk más humanizado se combinó con el Vh más humanizado para ensayar la actividad funcional. (Véase la Fig. 13.)

Se generó una segunda biblioteca que combinaba los residuos marco de la Vk y Vh de interés utilizando DP27 como plantilla de cadena pesada y HT2 como plantilla de cadena ligera. Como se ha descrito anteriormente, se sintetizaron oligonucleótidos superpuestos que contenían el marco humano con residuos humanos o murinos en cada posición en cuestión. Estos oligos se mezclaron y luego se recocieron para generar las regiones variables completas. Las regiones se amplificaron mediante PCR y luego se convirtieron en fragmentos monocatenarios. Los fragmentos se fosforilaron y luego se utilizaron en una reacción de mutagénesis para incorporar las regiones variables al vector basado en M13. A continuación, se analizó la biblioteca en busca de Fabs funcionales que fueran específicos para la IL-13 en un ensayo basado en ELISA. Las secuencias de las cadenas ligera y pesada se muestran en las figuras 11 C&D y 12C&D, respectivamente.

A partir de los resultados de la secuenciación, la cadena Vk fue capaz de tolerar residuos humanos en su totalidad, y por lo tanto esta cadena fue completamente humanizada. Para la cadena pesada, dos posiciones eran intolerantes a los residuos humanos: la posición 24 y la 94. Así, la región variable de la cadena pesada estaba humanizada en un ~98 %.

D. Generación de candidatos humanizados combinatorios

Dado que ningún candidato seleccionado en el cribado de cualquiera de las bibliotecas estaba completamente humanizado, se diseñó la humanización. Se generaron una serie de candidatos en los que se obtuvieron los niveles de humanización deseados. El Vk más humanizado de la biblioteca HT2 se combinó con el Vh más humanizado de las bibliotecas NEW o DP27. A continuación, se ensayaron estos candidatos combinatorios para determinar cuál mantenía la función específica al tiempo que portaba el mayor nivel de humanización. Los candidatos elegidos de HT2-NEW fueron HT2-NEW #73 para la cadena pesada y HT2-NEW #115 para la cadena ligera. Los candidatos elegidos de la cadena ligera HT2-DP27 fueron HT2-DP27 #89 y HT2-DP27 #144, y los candidatos de la cadena pesada fueron HT2-DP27 #123 y HT2-DP27 #276. Para HT2-DP27, se realizaron las siguientes construcciones: #89 Vk con #276 Vh y #89 Vk con #123 Vh; #144 Vk con #276 Vh y #144 Vk con #123 Vh. Además, se realizó una construcción con #144 Vk DP27 con #73 Vh NEW para determinar si las interacciones de NEW y DP27 con la cadena ligera HT2 diferían.

Estas combinaciones se probaron por ELISA para determinar si había más pérdida de función tras una mayor humanización. Para estos ensayos, el antígeno IL-13 se capturó en la placa en una cantidad limitante. A continuación, se añadieron los Fabs anti-IL13 a la placa a una concentración conocida y se valoraron en la placa a una dilución 1:3. La unión se detectó con un anticuerpo secundario específico para Fab. La Fig. 13 muestra los resultados del ensayo funcional. Fig. 13A - 115Vk/73Vh; Fig. 13B- 89Vk/276Vh; Fig. 13C -144Vk/276Vh; Fig. 13D - 144Vk/123Vh; y Fig. 13E - 144Vk/73Vh. A partir de estos datos, los resultados observados sugirieron que las combinaciones de ingeniería de las regiones variables humanizadas no afectaban negativamente a la unión de los Fabs al antígeno.

Debido a que los resultados en las Figuras 11 y 12 sugirieron que la cadena ligera HT2 podría ser completamente humanizada y todas menos 2 posiciones en DP27 (24 y 94) podrían ser humanizadas, el candidato humanizado ideal fue diseñado en el cual los únicos 2 residuos murinos permanecieron. Tras la generación de este candidato en particular, se analizó el clon en comparación con su progenitor, así como con los otros candidatos, para determinar si había alguna pérdida de función. A partir de los datos presentados en la Fig. 14A, este candidato humanizado no muestra ninguna pérdida significativa de función con este alto grado de humanización (89 Vk/276G). La humanización también se realizó para el candidato a marco HT2-NEW. Este candidato tiene un nivel de humanización final del 98 %, ya que quedan dos residuos murinos en la cadena pesada. La Fig. 14B muestra los resultados ELISA para esta construcción (115Vk/73Vh FL).

Se intentó humanizar aún más 89Vk/276G sustituyendo los dos residuos murinos restantes. Tras mutar las posiciones a los residuos humanos, los clones candidatos se analizaron mediante ELISA y se compararon con los parentales. Sin embargo, se observó una pérdida significativa de función al sustituir los residuos murinos por los de la plantilla elegida. Por lo tanto, se generó otra biblioteca en la que las dos posiciones en el Vh se aleatorizaron para permitir todos los aminoácidos posibles en estas dos posiciones. Los candidatos se examinaron mediante un ensayo ELISA funcional y se secuenciaron treinta candidatos que arrojaron resultados comparables a los del clon parental (89Vk/276G) para determinar qué aminoácidos estaban presentes en las posiciones objetivo. A continuación se muestra una lista de los candidatos y los aminoácidos en las dos posiciones.

Por lo tanto, a partir de esta pantalla, hay varios aminoácidos que aparentemente son tolerados en las posiciones designadas y sin embargo no resultan en una pérdida significativa de la función. Así, cambiando los residuos de la estructura por aminoácidos que no se encuentran en la secuencia murina ni en la estructura humana, se generó un Fab totalmente funcional sin efecto perjudicial sobre la unión al antígeno diana. Los candidatos que se siguieron probando a partir de esta biblioteca aleatoria fueron RL-19 y RL-36.

Ejemplo 10

Optimización CDR

Una vez determinada la secuencia marco óptima para el anticuerpo candidato anti-IL-13, se llevó a cabo la optimización de las CDR. Para este proceso, se aleatorizó la secuencia de aminoácidos CDR y, a continuación, se examinaron las bibliotecas para identificar los candidatos que tenían una actividad funcional igual o mejor que el clon parental. Para esta biblioteca, el candidato principal fue RL-36 (véase más arriba). Se aleatorizaron las seis CDR, una posición cada vez, y las bibliotecas se analizaron mediante un ELISA funcional. Los candidatos fuertemente reactivos se secuenciaron para compararlos con el CDR original. Cabe señalar que todas las secuencias únicas enumeradas en las tablas siguientes también aparecen en la Figura 20 con los identificadores de SEQ ID NO adecuados.

A. Optimización CDR-L1

CDR-L1 comprendía 15 aminoácidos. Cada una de estas posiciones se aleatorizó utilizando oligonucleótidos sintetizados que se mezclaron en cantidades equimolares para utilizarlos en una reacción de mutagénesis. Se determinó que la eficacia de incorporación de los oligonucleótidos mutagénicos era del 40 %. Con este porcentaje, el número de candidatos que había que examinar era de 3.600. Los clones se analizaron mediante un ELISA funcional y se secuenciaron los clones que mostraron una actividad funcional comparable. Del número de candidatos examinados, se identificaron 166 candidatos positivos. De este grupo, se secuenciaron 10 candidatos para determinar los cambios dentro de la CDR. A partir de los resultados de secuenciación que se muestran a continuación, las posiciones 11 y 14 conducen a una afinidad mejorada son N a Q y M a L.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CDR-L1 R A S K S V D S Y G N S F M H

L1-21 R A S K S V D S Y G N S F L H

L1-39 R A S K S V D S Y GQS F M H

L1-47KA S K S V D S Y G N S F M H

L1-50 R A S K S V D S Y G N SYM H

L1-59 R A S K S V D S Y GQS F M H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

L1-61 R A S K S V D S Y G N S F M H

L1-62 R A S K S V D S Y G N S F L H

L1-63 R A S K S V D S Y G N S F L H

L1-117NA S K S V D S Y G N S F M H

L1-125 R A S K S V D S Y G N S F MH

B. Optimización CDR2-L2

CDR-L2 comprendía 7 aminoácidos. Esta biblioteca se preparó como se ha descrito anteriormente. La eficacia de esta biblioteca fue del 80% y se analizaron 840 clones. El número de clones positivos identificados a partir del ensayo fue de 75 y 11 fueron secuenciados. A partir de los resultados que se muestran a continuación, varias posiciones dentro de esta CDR produjeron una actividad mejorada, aunque las posiciones y los aminoácidos de sustitución parecían aleatorios. Este resultado apoya la observación de que la CDR-L2 está más alejada del sitio de unión al antígeno y, como tal, debería ejercer la menor influencia sobre la unión al antígeno.

1 2 3 4 5 6 7

CDR-L2 L A S N L E S

L2-10 L A S N L N S

L2-13 L A S N L E S

L2-25 L A S N LQS

L2-37 L ATN L E S

L2-41 L A S N LKS

L2-44 L A S N L EK

L2-45 L A SRL E S

L2-53 L A S N LHS

L2-58 L A S N LSS

L2-65 L A SFL E S

L2-70 L ANN L E S

C. Optimización CDR-L3

La CDR-L3 estaba compuesta por 9 aminoácidos. Al generar esta biblioteca se obtuvo una eficiencia del 50 %, lo que requirió el cribado de ~1700 clones. A partir de este cribado, se identificaron 257 candidatos positivos y se secuenciaron diez. De estos resultados, sólo en una posición se produjo un cambio con respecto a la secuencia original. Varios candidatos mostraron la misma secuencia, lo que sugería que este cambio posicional estaba muy favorecido (de N a A).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CDR-L3 Q Q N N E D P R T

L3-1 Q Q N N E D PRT

L3-32 Q Q NAE D P R T

1 2 3 4 5 6 7 8 9

L3-90 Q Q N N E D P RT

L3-100 Q Q N N E D P RT

L3-150 Q Q N N E D P RT

L3-170 Q Q NAE D P R T

L3-185 Q Q NAE D P R T

L3-207 Q Q NAE D P R T

L3-225 Q Q NNE D P R T

D. Optimización CDR-H1

CDR-H1 comprendía 5 aminoácidos. La eficacia de esta biblioteca fue del 80 %, y sólo fue necesario cribar unos 600 candidatos. Se obtuvieron 138 clones positivos y se secuenciaron once de ellos. De los resultados se enumeran a continuación, la segunda posición dentro de este CDR parecía ofrecer la mayor posibilidad de mejora de la unión al antígeno. Sin embargo, varios aminoácidos afectan favorablemente a la unión.

1 2 3 4 5

CDR-H1 A Y S V N

H1-2 AKS V N

H1-12GY S V N

H1-18 AKS V N

H1-24 AKS V N

H1-31 AHS V N

H1-89 A YSV N

H1-90GY S V N

H1-114 ASS V N

H1-115 AHS V N

H1-123 ARS V N

H1-126 ARS V N

E. Optimización CDR-H2

CDR-H2 comprendía 16 aminoácidos. La eficacia de esta biblioteca era del 70 %, lo que significaba que había que cribar más de 2100 candidatos. A partir del cribado, se identificaron 192 candidatos positivos y se secuenciaron trece para determinar los cambios que se producían dentro de la CDR. A partir de los resultados de la secuenciación que se enumeran a continuación, varias posiciones mejoraron la afinidad de unión, pero ninguno de los cambios de aminoácidos parecía significativamente diferente del progenitor.

CDR-H2 M I W G D G K I V Y N S A L K S

H2-38 M I W G D G K I S Y N S A L K S

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

H2-43 M I W G D G K I V Y N S A L E S

H2-51 M I W G D G K I V Y N S A L K S

H2-66 M I W G D G K I S Y N S A L K S

H2-79 M I W G D G K I V Y N SDL K S

H2-86 M I W G D G K V V Y N S A L K S

H2-101 M I W G D G K I V Y N S E L K S

H2-109 M I W G D G K IAY N S A L K S

H2-119 M I W G D G K I V Y N S A L KE

H2-121 MVW G D G K I V Y N S A L K S

H2-129 M I W G D G K I V Y N S A L K S

H2-169 M I W G D G K I V Y N S A LAS

H2-176 M I W G D G KKV Y N S A L K S

F. Optimización CDR-H3

CDR-H3 comprendía 10 aminoácidos. En general, se cree que este CDR es el que más influye en la unión al antígeno, ya que este bucle se encuentra generalmente en el centro del sitio de unión. Esta biblioteca tenía una eficacia del 40 %, por lo que era necesario cribar 2.400 candidatos. De ellos, se identificaron 174 candidatos positivos y se secuenciaron diez para determinar los cambios dentro de la CDR. Los resultados enumerados a continuación indican que el cambio de Y a R en la tercera posición puede ser importante para mejorar la unión.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

H3 D G Y Y P Y A M D N

H3-1 D GRY P Y A M D N

H3-30 D G Y Y P Y A MSN

H3-73 D G Y Y P Y A MAN

H3-89 D G Y Y P Y A MAN

H3-130 D GRY P Y A M D N

H3-131 D GRY P Y A M D N

H3-133 D G Y Y P Y A L D N

H3-135 D GRY P Y A M D N

H3-161 D G Y Y P Y A MDN

H3-162 D G Y Y P Y A MKN

G. Biblioteca combinatoria

Una vez que se determinaron los cambios dentro de las CDR que produjeron la mayor mejora general en la unión al antígeno, se combinaron los mejores candidatos para ver si estos cambios mejoraban la unión. Así, se diseñó un candidato que combinara todas las sustituciones de aminoácidos favorables.

Para generar la biblioteca combinatoria, el clon inicial fue el que incorporaba la alteración en CDR-L1-59 (N a Q). A este clon se le hicieron los otros cambios para CDR-L3, N a A (posición 4), para CDR-H1, Y a R, H, K o S (posición 2), para CDR-H3, Y a R (posición 3) y D a K o S (posición 9). No se han introducido cambios en CDR-L2 ni en CDR-H2. Se analizaron más de 1.100 candidatos de esta biblioteca mediante un ensayo ELISA funcional. En total, se identificaron 120 candidatos con una actividad superior a la del clon parental. Las secuencias de esos clones se muestran en la Fig. 15.

Para confirmar que estos candidatos combinatorios mantenían la función, se realizó un ensayo de competición. Para este ensayo, la IL-13 se capturó en una placa ELISA. Los candidatos, que son Fabs purificados, se mezclaron previamente en concentraciones variables con una concentración constante de Fab quimérico anti-IL-13 marcado. Esta mezcla se añadió a la placa ELISA. Se detectaron los anti-IL-13 quiméricos marcados capaces de unirse a la IL-13 unida a la placa.

De los resultados de esta competición, los dos candidatos ensayados demostraron una capacidad equivalente para competir con el candidato quimérico (228 B/C #3) para unirse a IL-13 (Fig. 16). El Fab irrelevante es el 5I, que demuestra no tener capacidad para competir. La Figura 17 muestra las secuencias de tres candidatos madurados por afinidad.

Ejemplo 11

Mapeo de epítopos

El MAb anti-IL13228B/C-1 se une a un epítopo conformacional y se une a la IL13 de mono cinomólogo con la misma alta afinidad que a la IL13 humana. Sin embargo, 228B/C no se une a la IL13 murina. Así pues, la estrategia ideada para el mapeo de epítopos consistió en intercambiar pequeñas porciones de la IL13 de mono con la correspondiente secuencia de IL13 de ratón. Se sintetizaron oligonucleótidos solapados como se muestra en la Figura 18. Se realizaron dos rondas de PCR para ensamblar las construcciones híbridas de IL13 de forma que parte de la IL13 de mono fuera sustituida por la secuencia correspondiente de la IL13 de ratón (Fig. 18). Las regiones codificantes de IL13 amplificadas por PCR se clonaron en el vector pcDNA3.1 con una etiqueta V5 utilizando el kit de clonación TOPO (Invitrogen). Se confirmó mediante secuenciación que todas las regiones amplificadas por PCR contenían únicamente las mutaciones de intercambio de dominios deseadas y ninguna mutación adicional no deseada en los vectores de expresión.

El epítopo de unión del MAb anti-IL13 se identificó como un péptido de 8-mer del aminoácido #49 a 56, ESLINVSG (SEQ ID NO 18). Este epítopo se localiza en la hélice-B y el bucle-BC de la IL13 humana. Cuando se utilizó el péptido epítopo derivado de la IL13 cino para intercambiar la secuencia correspondiente en la IL13 murina, la molécula de IL13 híbrida resultante puede unirse a 228B/C con afinidad similar a la de la IL13 cino original, lo que validó aún más que la MAb 228B/C se une a la IL13 cino o humana en este péptido entre los residuos #49-56. La comparación de secuencias entre la IL13 humana, cyno y murina revela que sólo tres residuos Ile52, Val54 y Gly56 de la<i>L13 humana no se conservan, lo que sugiere que los residuos críticos para la interacción entre la IL13 y el MAb anti-IL13 a través de este péptido de 8 polímeros está determinada por uno o la combinación de algunos de estos tres residuos.

Este epítopo se confirmó además mediante análisis de manchas peptídicas. El péptido IL13 humano completo se exploró con una serie de péptidos solapados de 12 polímeros sintetizados mediante SPOT sobre membrana de celulosa. El único péptido reactivo MAb anti-IL13 se identificó como un péptido 12-mer del aminoácido #44-56, YCAALESLINVS (SEQ ID NO 19), que se solapa con la región identificada mediante experimentos de intercambio de dominios.

Depósitos

Los siguientes cultivos han sido depositados en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas Va. 20110-2209 USA (ATCC):

Este depósito se efectuó en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes y Reglamentos correspondientes (Tratado de Budapest).

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro para detectar la proteína IL-13 humana en una muestra, que comprende la etapa de:

poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti IL-13 humano que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las regiones CDRH1, CDRH2 y CDRH3 determinantes de la complementariedad que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 123, y SEQ ID NO: 135, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, y SEQ ID NO: 115; y

detectar la proteína IL-13 humana mediante la aparición de inmunorreacción entre el anticuerpo anti-Il-13 humana y la proteína IL-13 humana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti IL-13 humano comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la muestra se recoge de un paciente.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra es un fluido corporal o una muestra de tejido.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la aparición de inmunorreacción se detecta mediante un ensayo seleccionado entre inmunohistoquímica, ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA).