KR101280338B1 - 신규 항-ｉｌ１３ 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당화 및 비당화 인간 IL13에 특이적으로 결합하지만 마우스 IL13에 결합하지 않으며, 약 1:2(MAb:IL13) 몰비로 인간 IL13의 활성을 중화시키는 항-IL13 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 천식, 알레르기성 천식, 비알레르기성(내인성) 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 알레르기성 결막염, 습진, 두드러기, 식품 알레르기, 만성 폐색성 폐 질환, 궤양성 대장염, RSV 감염, 포도막염, 경피증 또는 골다공증을 포함한 알레르기성 질환과 같은 IL-13 매개 질환의 치료에 있어서의, 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
항-IL13 항체, 알레르기성 질환

Description

신규 항-ＩＬ１３ 항체 및 그 용도{NOVEL ANTI-IL 13 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 항-IL13 항체 및 그 용도에 관한 것이다.
인터루킨(IL)-13은 다면발현성(pleiotropic) T 헬퍼 세포 서브클래스2(Th2)의 사이토카인이다. IL3는 IL4와 유사하게, 4α-나선형의 소수성 다발 코어(4α-helical hydrophobic bundle core)를 특징으로 하는 3차 구조를 공유하고 있는, 타입I 사이토카인 패밀리에 속한다. IL13은 IL4와 약 30%의 아미노산 서열 상동성을 가지며, IL4의 수많은 특징들을 공유하고 있다(Wynn, Ann. Rev. Immunol., 21: 425(2003)). IL4와 IL13의 기능 유사성은, IL13이 IL13 수용체의 알파 체인-1(IL13Rα1)과이 결합에 이어서, IL4 수용체의 알파 체인(IL4R-α)에 결합할 수 있는다는 점으로부터 파생된다(Hershey, J. Allergy Clin. Immunol., 111: 677(2003)). IL4Rα는 IL4와 IL13에 의해 활성화되며, Jak1-의존적 STAT6 인산화를 발생시킨다. IL4와 IL13은 B-세포 증식을 촉진시키고, CD40/CD40L 동시 자극과 함께 IgG4 및 IgE에 클래스 스위칭(switching)을 유발한다(Punnonen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3730 (1993), Oettgen et al., J. Allergy Clin. Immunol., 107: 429 (2001)).
그러나, IL4와는 다르게, IL13은 원시(naive) T 세포의 Th2로의 분화에 관여하지 않는다(Zurawski et al., Immunol. Today, 15: 19 (1994)). IL13은 FcεRI을 상향 조절하며, 따라서 비만세포(mast cell)의 IgE 프라이밍(priming)을 보조한다(de Vries, Allergy Clin. Immunol. 102: 165 (1998)). 단핵구/대식세포에서, IL13은 CD23과 MHC 클래스 I 및 II 항원의 발현을 상향 조절하고, Fcγ 및 CD14의 발현을 하향 조절하며, 항체 의존적 세포독성을 저해한다(de Waal Malefyt et al., J. Immunol., 151: 6370 (1993), Chomarat et al., Rev. Immunol., 17: 1 (1998)). IL4가 아닌 IL13은 호산구의 생존, 활성화 및 보충을 촉진한다(Horie et al., Interm. Med., 36: 179(1997), Luttmann et al., J. Immunol. 157: 1678 (1996), Pope et al., J. Allergy Clin. Immunol., 108: 594 (2001)). 또한, IL13은 평활근 세포, 상피 세포, 내피 세포 및 섬유아세포와 같은 비조혈성 세포에서 중요한 기능을 가진다. IL13은 평활근의 증식과 콜린 유발성 수축을 증강시킨다(Wills-Karp, J. Allergy Clin. Immunol., 107: 9 (2001)). 상피 세포에서, IL13은 중요한 케모카인 생산 유발체로(Li et al., J. Immunol., 162: 2477 (1999)), 점액섬모의 분화를 변이시키고(Laoukili et al., J. Clin. Invest., 108: 1817 (2001)), 섬모 상피세포의 섬모 운동 빈도를 감소시키고(Laoukili et al., J. Clin. Invest., 108: 1817 (2001)), 술잔세포(goblet cell)를 전이시킨다(Zhu et al., J. Clin. Invest., 103: 779 (1999), Grunig et al., Science, 282: 2261 (1998)). 내피세포에서, IL13은 호산구 보충에 중요한 맥관 세포 부착 분자1(vascular cell adhesion molecule 1; VCAM-1)의 강력한 유발체이다(Bochner et al., J. Immunol., 154: 799(1995)). 인간 진피의 섬유아세포에서, IL13은 인간 진피 섬유아세포에서의 1형 콜라겐 합성을 유도한다(Roux et al., J. Invest. Dermatol., 103: 444 (1994)).
IL13과 IL4는 일부 기능 유사성을 공유하고 있지만, 동물 질병 모델 및 유전자 넛 아웃(knockout) 마우스 연구를 통해, IL13은 IL4와는 다른 고유 작동자(effector) 기능을 가지고 있으며, 다른 Th2 사이토카인과 독립적으로 IL13이 알레르기성 천식의 모든 특징들을 유도하는데 필수충분하다는 설득력있는 증거를 제시하는 것으로 확인되었다(Wills-Karp et al., Science, 282: 2258 (1998), Walter et al. J. Immunol. 167: 4668 (2001)). IL13은 천식 증상과 관련된 작동자 기능에 있어서 다른 Th2 사이토카인 보다 더 유의적인 역할을 수행할 수도 있다(Corry, Curr. Opin. Immunol., 11: 610(1990)). 이러한 논의는, 인간의 질병에서의 IL13 수준 및 IL13 유전자의 유전자 다형성과 질병 연관성 사이의 강력한 관련성에 의해 뒷받침된다(Wills-Karp. et al. Respir. Res. 1: 19 (2000); Vercelli et al., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 2: 389 (2002); He et al., Genes Immunol., 4: 385 (2003); Arima et al., J. Allergy Clin. Immunol., 109: 980 (2003), Liu et al., J. Clin. Allergy Immunol., 112: 382(2003)). 최근 결과는, 호산구 및 IgE 매개 사건이 관여된 기존 경로를 통해서라기 보다는, 점막 상피 및 평활근 세포에서의 역할을 통하여, IL13이 알레르기 반응의 특징들을 유도하는 것으로 제시하고 있다(Wills-Karp et al., Sci., 282: 2258(1998)).
천식은 기도 염증, 과민 반응 및 폐색을 수반하는 만성 폐 질환으로 설명된 다. 생리학적으로, 기도 과민 반응은 메타콜린 또는 히스타민을 이용한 기관지 자극(bronchoprovocation) 이후에 기관지의 공기 흐름 감소로 나타난다. 기도 폐색을 야기하는 그외 촉발체로는, 차가운 공기, 운동, 바이러스 상기도 감염, 담배 연기 및 호흡기 알레르겐이 있다. 알레르겐에 의한 기관지 자극은, 다수 환자들에서 신속한 초기 단계 면역글로불린 E(IgE)-매개성 기관지의 공기 흐름 감소와, 이후 후기 단계 IgE 매개성 반응을 유발하며, 4-8시간 동안 기관지 공기 흐름이 감소된다. 초기 반응은 히스타민, PGD2, 루코트리엔, 트립타제 및 혈소판 활성 인자(PAF)와 같은 염증성 물질의 신속한 분비에 의해 초래되지만, 후기 반응은 새로이 합성된 전-염증성 사이토카인(예, TNFα, IL4, IL13) 및 케모카인(예, MCP-1 및 MIP-1α)에 의해 초래된다(Busse et al. In: Allergy : Principles and Practice, Ed. Middleston, 1173 (1998)). 만성 천식 환자들의 계속적인 폐 증상은, 강화된 Th2 세포 반응에 의해 매개된다. Th2 사이토카인, 특히 설취류의 천식 모델에서 나타난 바와 같이(Akbari et al., Nature Med., 9:582(2003)), NK 표현형의 Th2 세포로부터 생산된 IL13 및 IL4는, 질환에서 중요한 기능을 수행하는 것으로 여겨진다(Larche et al., J. Allergy Clin. Immunol., 111: 450(2003)). 천식 환자 기도는 폐 과다팽창, 평활근 비대증, 라미나 망상층 비후증(lamina reticularis thickening), 점막 부종, 상피 세포 슬러핑(epithelial cell sloughing), 섬모 세포 파괴 및 점액선 과다분비의 전반적인 병리 상태를 나타낸다. 미시적으로, 천식은 기관지 조직, 기관지의 분비 및 점막에서의 호산구, 중성구, 림프구 및 혈장 세 포의 수적 증가를 특징으로 한다. 우선, 활성화된 CD4+ T-림프구에 의해, 혈류에서 기도로 백혈구를 보충한다. 또한, 활성화된 T-림프구는 호산구, 비만세포 및 림프구에서의 염증 매개체가 방출되도록 한다. 또한, Th2 세포는 IL4, IL5, IL9 및 IL13을 생산한다. IL4는 IL13과 함께 IgM의 IgE 항체로의 스위치를 신호화한다.
알러겐에 의한 막 결합된 IgE 분자의 교차 결합은 비만 세포의 탈과립을 초래하여, 히스타민, 루코트리엔 및 그외 기도 염증을 지속시키는 매개체를 방출시킨다. IL5는 호산구의 보충과 활성화를 활성화한다. 활성화된 비만 세포와 호산구는 또한 염증을 지속시키는 것을 보조하는 사이토카인을 생산한다. 폐 조직 손상과 이후 회복이 후속되는 이러한 반복적인 폐의 염증 주기는, 기도의 장기간의 구조적 변화("리모델링")를 초래할 수 있다.
현재, 보통 수준의 천식은 파괴성 증상(breakthrough symptom), 알러겐 유발성 천식 또는 운동 유발성 천식을 완화시키기 위해, 흡입성 항-염증성-코르티코스테로이드, 또는 크로몰린 소듐(cromolyn sodium) 또는 네도크로밀(nedocromil)과 같은 비만 세포 저해제와, 흡입성 베타2-작용제로 필요에 따라 (1일 3-4회) 치료하고 있다. 크로몰린 소듐과 네도크로밀은 기관지천식(bronchospasm)과 염증을 차단하지만, 알레르겐이나 운동과 관련된 천식, 연소성 기관지염(juvenile asthmatics)에만 효과가 있다. 흡입성 코르티코스테로이드는 염증, 기도의 과다반응성 및 폐색을 향상시키며, 급격하게 악화된 다수의 증상들을 경감시킨다. 그러나, 효과가 나타나기까지 적어도 한달이 소요되며, 현저하게 개선되기까지는 적어도 일년 소요 된다. 가장 빈번하게 발생되는 부작용은 쉰 목소리와 구강 진균 감염증, 즉 칸디다증이다. 보다 심각한 부작용으로, 예컨대 부분적인 아드레날 억제, 생장 저해 및 골 형성 감소가 보고되고 있으며, 이는 보다 다량의 용량을 사용한 경우에 한정되어 있다. 베클로메타손(beclomethasone), 트리암시놀론(triamcinolone) 및 플루니솔리드(flunisolide)가 유사한 효과를 가질 수 있으나, 부데소니드(budesonide)와 플루티카손(fluticasone)이 보다 강력하며 일부 전신 부작용이 있는 것으로 보고된바 있다.
경미한 병증의 환자들에서도 점막 및 상피의 활성화된 T 세포, 비만 세포 및 호산구 침윤을 포함한, 기도 염증이 나타난다. T 세포와 비만 세포는 호산구 증식 및 성숙과 IgE 항체의 생산을 촉진시키는 사이토카인을 분비하여, 이후 미세혈관 투과성을 증가시키고, 상피를 파괴하고, 신경의 반사작용과 점액 분비선을 자극한다. 그 결과 쌕쌕거림(wheezing), 기침 및 호흡 곤란을 발생시키는 기도 과민반응, 기관수축 및 과다분비가 나타난다.
전통적으로, 천식은 경구용 및 흡입성 기관지 확장제로 치료하고 있다. 이러한 약제들은 천식 증상들을 완화시키지만, 근원적인 염증에는 효과가 없다. 최근 10년간, 천식 병인에 있어서 염증의 중요성을 인식하게 됨으로써, 코르티코스테로이의 사용이 증가되었지만, 많은 환자들은 무통제성 천식으로 계속 고통받고 있다.
환자에서의 염증성 질환, 특히 천식의 치료에 대한 중요성 인식으로 인해, 부작용이 거의 없는 새로운 생활성 화합물을 계속적으로 모색하고 있다. 천식 환 자의 기도에 장기간 투여하였을때 활성인 상태로 잔류하는, 강력하고 특이적인 IL13 저해제 개발은, 천식 및 그외 IL13- 및 IgE-매개 질환의 치료에 새로운 접근법을 제공한다.
발명의 개시
본 발명은 당화 및 비당화 인간 IL13 모두에 높은 친화력으로 특이적으로 결합하며, 마우스 IL13에는 결합하지 않으며, 약 1:2(MAb:IL13) 몰비에서 인간 IL13의 활성을 중화시키는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변부(variable region)로부터 유래된 항원 결합부를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 단일클론일 수 있으며, 단일클론 항체는 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
이러한 항체의 예로는, 228B/C-1, 228A-4, 227-26, 및 227-43이 있다. 이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 각각 등록번호(Accession Number) PTA-5657, PTA-5656, PTA-5654, 및 PTA-5655로 2003년 11월 20일자로 VA 20112-2209 마나사스 대학로 10801의 미국 세포주 은행(ATCC)에 기탁하였다.
본 발명은 서열번호 3의 서열과 적어도 95% 이상 상동인 VL 서열 및 서열번호 4의 서열과 적어도 95% 이상 상동인 VH 서열을 가지는 항체, 서열번호 5의 서열과 적어도 95% 이상 상동인 VL 서열 및 서열번호 6의 서열과 적어도 95% 이상 상동인 VH 서열을 가지는 항체, 및 서열번호 7의 서열과 적어도 95% 이상 상동인 VL 서열 및 서열번호 8의 서열과 적어도 95% 이상 상동인 VH 서열을 가지는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합 항체 분자 또는 이의 IL13 결합 절편에 관한 것으로, 이는 27-30 위치가 아미노산 Gly 26, Phe 27, Ser 28, Leu 29, Asn 30 (서열번호 18)인 마우스 항-IL13 항체로부터 유래된 31-35(CDR1), 50-65(CDR2) 및 95-102(CDR3)(Kabat 넘버링) 위치에 비인간성 CDR을 포함하는 적어도 하나 이상의 항체 중쇄 또는 그것의 IL13 결합 절편, 및 마우스 항-IL13 항체로부터 유래된 24-34(CDR1), 50-56(CDR2) 및 89-97(CDR3) 위치에서의 비인간성 CDR와 인간 단일클론 항체로부터의 프래임워크 부위(framework region)를 포함하는 적어도 하나 이상의 항체 경쇄 또는 그것의 IL13 결합 절편을 포함한다.
본 발명은 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, 이황화 결합된 Fvs(sdFv)을 비제한것으로 포함하는, 본 발명의 항체들의 인간 항원 결합성 항체 절편들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단쇄 항체에 관한 것이다. scFv의 일예는 서열번호 152의 서열을 가지는 것으로 도 21에 기재되어 있다.
본 발명은 단일클론 항체 228B/C-1의 인간화 서열에 관한 것이다. 이들 인간화 재조합 항체 분자는, FRL1이 서열번호 20-25 중 어느 하나로 이루어지며, CDRL1이 서열번호 99-103 중 어느 하나로 이루어지며, FRL2가 서열번호 29로 이루어지며, CDRL2가 서열번호 104-114 중 어느 하나로 이루어지며, FRL3가 서열번호 30-56 중 어느 하나로 이루어지며, CDRL3가 서열번호 115-116 중 어느 하나로 이루어지며, FRL4가 서열번호 57-59 중 어느 하나로 이루어진, 식: FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 가변성 경쇄를 포함하며, FRH1이 서열번호 60-66 중 어느 하나로 이루어지며, CDRH1이 서열번호 117-122 중 어느 하나로 이루어지며, FRH2가 서열번호 67-75중 어느 하나로 이루어지며, CDRH2가 서열번호 123-134 중 어느 하나로 이루어지며, FRH3가 서열번호 76-90 중 어느 하나로 이루어지며, CDRH3가 서열번호 135-141 중 어느 하나로 이루어지며, FRH4가 서열번호 91-92 중 어느 하나로 이루어진, 식: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 가변성 중쇄를 포함한다. 가변성 중쇄부는 불변부의 적어도 CH1 도메인 또는 불변부의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 추가적으로 포함한다. 중쇄 불변부는 IgG 항체를 포함하며, IgG 항체는 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체이다.
또한, 본 발명은 가변성 경쇄는 서열번호 3, 5, 7, 93, 95, 97, 142, 144 및 150 중 어느 하나로부터 선택되며, 가변성 중쇄는 서열번호 4, 6, 8, 94, 96, 98, 143, 145, 146, 147, 148 및 149 중 어느 하나로부터 선택되는, 재조합 항체 분자를 포함한다. 특정 항체는 서열번호 142의 서열을 가지는 가변성 경쇄와 서열번호 143의 서열을 가지는 가변성 중쇄를 포함한다.
본 발명은 단일클론 항체 228B/C-1, 228A-4, 227-26 및 227-43를 생산하는 하이브리도마 세포주를 포함한다. 본 발명은 단일클론 항체 228B/C-1, 228A-4, 227-26 및 227-43을 코딩하는 핵산, 이들 항체 또는 그것의 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포주 및 이들 항체 또는 그것의 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
또한, 본 발명은 228B/C-1과 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 1의 전체 또는 일부나 그것의 변이체, 서열번호 2를 포함하며, 아미노산 13의 글루탐산은 라이신으로 대체된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체에 의해 인지된 에피토프에 관한 것이다. 에피토프 펩티드는 ESLINVSG(서열번호 18) 또는 YCAALESLINVS(서열번호 19)를 필수적으로 포함하는/포함하거나 이루어진 펩티드를 포함한다.
본 발명은 본 발명에 기재된 바에 따른 항체를 포함하는 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 안정화제를 조합하여 포함한다.
본 발명은 개체, 예컨대 필요한 개체에게 본 발명에 따른 항체를 천식 증상의 경감에 유효한 함량으로 투여하는 단계를 포함하는 천식 증상을 가지는 개체의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 항체는 환자에게서 IL13의 활성을 하향 조절할 수 있으며, 기관지 과민반응을 완화시킬 수 있으며/있거나 개체의 폐내 호산구를 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 개체, 예컨대 필요한 개체에게 본 발명에 따른 항체를 저해 함량으로 투여하는 단계를 포함하는 RSV(respiratory syncytial virus) 감염 저해 방법을 포함한다.
본 발명의 항체는 정맥내, 복막내, 흡입, 근육내, 피하 및 경구 경로를 포함하는 한가지 이상의 경로로 투여할 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 치료학적으로 유효한 함량으로 환자에게 전달하는 흡입기를 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체와 샘플을 접촉시키는 단계, 및 면역반응 발생을 통해 IL13을 검사하는 단계를 포함하는, 개체, 예컨대 알레르기 질환을 가지는 환자에서 IL13 단백질을 검사하기 위한 방법을 포함한다. 또한, (a) 개체로부터 샘플을 수득하는 단계, (b) IL13을 이용한 면역반응을 허용하는 조건하에서 본 발명에 따른 항체와 샘플을 조합하는 단계, 및 (c) IL13의 정상 발현 수준에 비해 과다 발현되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 개체에서 IL13의 과다 발현을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, (a) 당화 IL13 모이어티와 면역성 모이어티를 포함하는 면역성 화합물을 제조하는 단계, (b) 인산 완충화 식염 및 보강제중에 상기 면역성 화합물을 포함하는 주사용 용액을 제조하는 단계, (c) 정맥내 및 복막내 주사의 병용에 의해 상기 주사용 용액으로 마우스를 면역화시키는 단계, (d) 상기 면역화된 마우스로부터 유래된 비장 세포와 골수 세포를 융합하여 하이브리도마를 제조하는 단계, (e) 본 발명에 따른 항체 특징들을 가지는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하는 단계, 및 (f) 상기 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항세 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체를 IgE 항체 생산 저해에 유효한 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 IgE 항체 생산을 저해하는 방법에 관한 것이다. IgE 항체 생산의 저해는, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염 및 과민증(anaphylaxis)을 방지할 수 있으며, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 두드러기 및 아토피 피부염을 치료할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그것의 항원 결합부를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에게서 IL13 매개 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 항체 또는 그것의 항원 결합부는 IL13의 그 수용체 결합을 저해하며, 인터루킨의 상기 수용체와 결합과 관련된 하나 이상의 기능을 저해한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그것의 항원 결합부를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에게서 IgE 매개 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 항체 또는 그것의 항원 결합부는 IL13의 그 수용체 결합을 저해하며, 인터루킨의 상기 수용체와 결합과 관련된 하나 이상의 기능을 저해한다.
본 발명은 다음의 특징들중 적어도 하나 이상의 특징을 가지는 항-IL13 단일클론 항체를 치료학적 유효량으로 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서의 천식의 중증을 경감시키는 방법에 관한 것이다: 인간 IL13에 KD 1 x 1010 내지 1 x 1012 M로 결합하는 능력, IL13의 IL13 수용체 결합과 관련있는 한가지 이상의 기능들을 저해하는 능력, 및 마우스 IL13에 결합하는 않는 항체의 특성.
본 발명에 포함되는 IL13에 의해 매개된 질환 및/또는 증상으로는, 알레르기성 천식, 비알레르기(고유)성 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 알레르기성 결막염, 습진, 두드러기, 식품 알레르기, 만성 폐색성 폐 질환, 궤양성 대장염, RSV 감염, 포도막염(uveitis) 및 골다공증이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
발명의 상세한 설명
본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 벡터 또는 반응시약은 변경될 수 있으며, 본 발명은 상기로 한정되지 않는다. 또한, 본원의 용어는 단지 특정 예를 표현하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 범위를 한정하기 위한 의도는 아니다. 본원 및 첨부된 청구항에서, 단수형인 "하나(a)", "하나(an)" 및 "하나(the)"는 문장이 명확하지 않는 한 복수의 것을 포함하며, 예컨대 "하나의 숙주 세포"는 이러한 숙주 세포 복수개를 포함한다.
언급되지 않는 한, 모든 기술적 및 과학적 용어 및 모든 두문자어(acronyms)는 본 발명의 기술분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본 발명에 기재된 바와 동일하거나 동급의 모든 방법 및 물질을 본 발명의 실시에서 사용할 수 있지만, 예시적인 방법, 기기 및 물질이 본 발명에 기재되어 있다.
본 발명에 기재된 모든 특허 및 공개물은 본 발명으로 사용될 수 있는 상기 문헌들에 기재된 단백질, 효소, 벡터, 숙주세포 및 방법을 기재 및 개시할 목적으로, 법으로 허용되는 범주로, 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 그러나, 본 발명은 본 발명이 종래 발명에 의한 개시물을 선행하는 것으로 칭하지 않은 것을 용인한 것으로서 해석되지 않는다.
면역원( IMMUNOGEN )
재조합 IL13을 사용하여 마우스를 면역화함으로써, 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하였다. 재조합 IL13은 여러 곳(예, R&D System, Minneapolis, MN., PeproTech, Inc., NJ 및 Sanofi Bio-Industries, Inc., Tervose, PA.)에서 상업적으로 구입가능하다. 또한, IL13을 코딩하는 유전자 또는 cDNA를 플라스미드 또는 다른 발현 벡터에 클론닝할 수 있으며, 당해분야의 당업자에게 공지된 방법에 따라 다수의 발현 시스템으로 발현할 수 있다. IL13의 클로닝 및 발현 방법과 IL13의 핵산 서열이 잘 알려져 있다(예, 미국 특허 5,652,123 참조). 유전자 코드의 축중(degeneracy)으로 인해, 폴리펩티드를 코딩하는 다수개의 뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있다. 가능한 코돈 선택을 토대로한 조합 선별에 의해 뉴클레오티드 서열이 달라질 수 있다. 이러한 조합은 천연 IL13 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적용된 바와 같이 3개로 이루어진 유전자 코드에 따라 이루어지며, 이러한 모든 변형이 고려된다. 이러한 폴리펩티드들중 임의의 하나를 동물의 면역화에 사용하여, IL13에 결합하는 항체를 제조할 수 있다.
면역원 IL13 폴리펩티드는, 이로운 경우, 융합 단편에 부착된 IL13 폴리펩티드를 가지는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 상기 융합 단편은 종종 단백질 정제를, 예컨대 융합 단백질이 친화성 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제되도록 함으로써 보조한다. 융합 단백질은 단백질의 카르복시 및/또는 아미노 말단중 어느 하나에 부착된 융합 단편을 포함하는 단백질을 코딩하는 융합 핵산 서열로 형질변환된 재조합 세포를 배양함으로써 생산할 수 있다. 융합 단편으로는, 면역글로불린 Fc 부분, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 베타-갈락토시다제, 이가 금속 이온에 결합할 수 있는 폴리-히스티딘 단편 및 말토스 결합 단백질을 포함할 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
예시적인 폴리펩티드는 서열번호 1의 전체 또는 일부분이나 그것의 변이체, 또는 서열번호 2를 포함하며, 이때, 아미노산 13은 Xaa이고 천연형에서 변화될 수 있으며, 예컨대 글루탐산이 라이신으로 바뀔 수 있다.
인간 IL13의 돌연변이형을 포함하는 융합 단백질을 사용하여, 본 발명의 항체를 생산하였다. 이 IL13의 돌연변이형은 단백질의 불활성형을 형성하는 하나의 돌연변이를 포함하였다(Thompson et al., J. Biol. Chem. 274: 2994 (1999)). 고친화성의 중화 항체를 생산하기 위해, 융합 단백질에 면역글로불린 Fc, 특히 IgG1에 융합된 돌연변이 IL13 단백질을 포함시켰으며, 재조합 단백질이 자연적으로 당화되도록 포유류의 세포주에서 발현시켰다. 융합 단백질의 Fc 부분은 주된 에피토프를 노출시킨 배위 구조를 제공할 수 있다. 당화는 에피토프의 면역원성(immunogenicity)을 증가시키므로, 이 특정 에피토프에 대한 항체를 제조할 수 있다.
IL13 폴리펩티드는 당화 결핍성 E. coli에서 발현시켰고, 발현된 단백질을 이용하여 상업적으로 이용가능한 항체를 테스트하였다. 본 발명자들은 이들 항체, 예컨대 R&D System 및 Pharmingen을 테스트하여, E. coli에서 생산된 면역원을 이용하여 제조한 항체는, 본 발명의 항체에 결합된 에피토프와 교차 반응하지 않는다는 것을 확인하였다.
항체 제조
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 모든 적절한 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 항체는 다클론 항체를 포함할 수 있다. 다클론 항체의 제조 방법은 당업자들에게 공지되어 있다(Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), 원용에 의해 본 발명에 포함됨).
예컨대, 전술한 바와 같이, 면역원은 토끼, 마우스 랫 등을 비제한적으로 포함하는 다양한 숙주 동물에 투여하여 항원에 특이적인 다클론 항체를 포함하는 혈청 생산을 유도할 수 있다. 면역원의 투여는 면역화제 및 필요에 따라 보강제의 1회 이상의 주사를 의미할 수 있다. 다양한 보강제를 사용하여 숙주 세포에 다라 면역학적 반응을 증가시킬 수 있으며, 프레운드스(Freund's)(완전 및 불완전), 알루미늄 하이드록사이드와 같은 미네랄 겔, 라이소렉시틴과 같은 계면활성물질, 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 폴리론, 폴리양이온(polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 임페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 및 BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보강제를 비제한적으로 포함한다. 사용될 수 있는 보강제의 다른 예로는 MPL-TDM 보강제(monophosphoryl lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate)가 있다. 면역화 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있으며, 선택한 동물 숙주에서 면역 반응을 일으키는 모든 방법으로 수행될 수 있다. 또한 보강제 역시 당업계에 알려져 있다.
전형적으로, (보강체 첨가 또는 무첨가) 면역원을 피하 또는 복막내 주사 또는 근육내 또는 정맥을 통한 다수의 방법으로 포유류에 주사할 수 있다. 면역원은 IL13 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 그것의 변형체를 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 특성에 따라(즉, 소수성%, 친수성 %, 안정성, 총 전하, 등전위점), 면역화되는 포유류에 면역을 유발하는 것으로 공지된 단백질에 면역원을 접합하는데 유용할 수 있다. 이러한 접합 방법은 공유 결합이 형성되도록 접합되는 면역성 단백질과 면역원 모두에 활성 화합물 관능기를 유도체화함에 의해 화학적 접합시키는 방법, 또는 융합 단백질을 근간으로 하는 방법 또는 그외 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 이러한 면역성 단백질의 예로는, 키홀 임페트 헤모시아닌, 오발부민, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 소이빈 트립신 저해제 및 다양한 T 헬퍼 펩티드(promiscuous T helper peptide)를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다양한 보강제를 사용하여 전술한 바와 같이 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체를 포함한다. 단일클론 항체는 Kohler 및 Milstein, Nature, 256: 495 (1975)와 Harlow et al.,의 미국 특허 4,376,110, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), Hammerling, et al., Monoclonal antibodies and T-cell Hybridomas(Elsevier, N. Y., (1981)) 또는 그외 당업자들에게 공지된 방법과 같이, 하이브리도마 기법으로 제조할 수 있다. 그외 단일클론 항체 생산에 사용할 수 있는 방법의 예로는, 인간 B-세포 하이브리도마 기법(Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030), 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 항체들은 IgG, IgE, IgD 및 이들의 임의의 서브클래스를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스일 수 있다. 본 발명의 MAb를 생산하는 하이브리도마는 생체내 및 시험관내에서 배양할 수 있다.
전형적인 하이브리도마 기법을 이용하여, 마우스, 인간화 마우스, 인간 면역 시스템을 가진 마우스, 햄스터, 토끼, 낙타 또는 그외 모든 적합한 숙주 동물과 같은 숙주를 면역원으로 면역화시켜 IL13에 특이적으로 결합할 항체를 생산 또는 생산하는 능력을 지닌 림프구를 유도한다. 또한, 림프구는 항원으로 시험관내에서 면역화될 수 있다.
일반적으로 항체를 생산하는 하이브리도마 제조에서, 인간 기원의 세포가 바람직한 경우에 말초 혈액 림프구("PBL")를, 또는 인간을 제외한 포유류 기원이 바람직한 경우에는 비장세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이후 림프구는 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 불멸화된 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 제조한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), pp. 59-103). 불멸화된 세포주는 일반적으로 형질변환된 포유류 세포, 특히 설취류, 소 또는 인간 기원의 골수 세포이다. 전형적으로, 랫 또는 마우스 골수 세포주가 채택된다. 하이브리도마 세포는 비융합성 불멸화 세포의 증식 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 바람직하게 포함하는 적정 배양배지내에서 배양할 수 있다. 예컨대, 모세포에 효소 하이폭산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마 배양 배지에 하이폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지"), HGPRT-결핍 세포의 증식을 방지하는 물질을 함유시킬 수 있다.
바람직한 불멸화 세포주는, 유효하게 융합되고 선별된 항체 생산세포에서의 안정적으로 높은 수준의 항체 생산을 지속시키며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포이다. 더욱 바람직한 불멸화 세포주는 뮤라인 골수세포주로서, 이는 예컨대 산디에고의 살크 세포 배급 센터와 버지니아주 마나사스의 미국 세포주 은행으로부터 공급받을 수 있다. 인간 골수 및 마우스-인간 헤테로골수 세포주 역시 인간 단일클론 항체 생산에 사용할 수 있다(Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).
하이브리도마 세포를 배양시킨 배양 배지로부터, 이후 IL13에 대한 단일클론 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 하이브리도마 세포에서 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은, 예컨대 면역침강 또는 시험관내 결합 분석, 예컨대 방사능면역분석(RIA) 또는 효소-연계 면역흡광 분석(ELISA)로 결정할 수 있다. 이러한 기법들은 당업계에 알려져 있으며, 당업자의 능력내에 속한다. IL13에 대한 단일클론 항체의 결합 친화성은, 예컨대, 스카차드 분석(Scatchard analysis)으로 결정할 수 있다(Munson et al., Anal. Biochem., 107:220(1980)).
적합한 하이브리도마 세포를 동정한 후, 제한 희석 과정으로 클론들을 서브클론하여 표준 방법(Goding, supra)에 따라 생육시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양배지로는, 예컨대 둘베코의 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640가 있다. 상기 서브클론에서 분비된 단일클론 항체를 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파티트 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography), 겔 배제 크로마토그래피(gel exclusion chromatography), 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 기존의 면역글로불린 정제 방법으로 배양배지로부터 분리 및 정제할 수 있다.
단일클론 항체 생산 분야에서는 다양한 방법들이 있으므로, 본 발명은 하나의 하이브리도마 생산방법으로 한정하지 않는다. 예컨대, 단일클론 항체는 미국 특허 4,816,567에 개시된 바와 같이 재조합 DNA 방법으로 제조할 수도 있다. 상기 문장에서, 용어 "단일클론 항체"는 하나의 진핵, 파지 또는 원핵 클론으로부터 유래된 항체를 의미한다. 본 발명의 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 기존 방법으로 (예, 뮤라인 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 인간, 인간화된 또는 그외 기원의 상기 쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써) 용이하게 분리 및 서열분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 분리한 후, DNA를 발현 벡터에 위치시킨 다음 NS0 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수 세포와 같은 숙주에 이를 형질전환시켜, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성한다. 또한 DNA를, 예컨대 상동성 뮤라인 서열 위치에서 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써(미국 특허 4,816,567; Morrison et al., supra) 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전체 또는 일부를 코딩하는 면역글로불린에 공유 결합으로 연결시킴으로써 변형시킬 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드를 본 발명에 다른 항체의 불변 도메인 대신 사용할 수 있으며, 또는 키메라 이가 항체(bivalent antibody)를 제조하기 위하여 본 발명에 따른 항원의 하나의 항원-조합부의 가변성 도메인 대신 사용할 수 있다.
항체는 1가(monovalent) 항체일 수 있다. 1가 항체의 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 그중 한가지 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현이다. 중쇄는 중쇄의 교차 결합을 방지하기 위하여 Fc 부위내 임의의 한 지점에서 일반적으로 절단된다. 대안적으로, 적절한 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하거나 또는 교차 결합을 방지하기 위해 제거된다.
특이적인 에피토프를 인지하는 항체 절편은 공지 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, Fab 및 F(ab')2 절편은 (Fab 절편을 제조하기 위해) 파파인 또는 (F(ab')2 절편을 제조하기 위해) 펩신과 같은 효소를 이용하여 면역글로불린 분자의 단백질 절단에 의해 제조할 수 있다. F(ab')2 절편은 가변부, 경쇄 불변부 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함한다.
인간에서의 생체내 항체 이용 및 시험관내 검출 분석에서의 항체 이용을 포함한 이용에 있어서, 바람직하기로는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 사용할 수 있다. 키메라 항체는 항원의 다른 부분은 상이한 동물종으로부터 유래되며, 예컨대 뮤라인 단일클론 항체에서 유래된 가변부 및 인간 면역글로불린 불변부를 가진다. 키메라 항체 생산 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, Morrison, Science 229: 1202(1985); Oi et al., Bio Techniques 4: 214(1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125: 191-202; 미국 특허 5,807,715; 4,816,567 및 4,816397를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
인간화 항체는, 인간을 제외한 종들로부터 유래된 하나 이상의 상보성 결정 부위 및 인간 면역글로불린 분자로부터 유래된 프래임워크(FR) 부위를 가지는 원하는 항원과 결합하는, 인간을 제외한 종에서 제조된 항체 분자이다. 종종, 인간 프래임워크 부위내 프래임워크 잔기는, 항원 결합성을 변이, 바람직하기로는 향상시키기 위해 CDR 수여체(donor) 항체 유래의 해당 잔기로 치환할 수 있을 것이다. 이러한 프래임워크 치환은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 항원 결합성에 중요한 프래임워크 잔기들을 동정하기 위한 CDR과 프래임워크 잔기의 상호작용 모델링 및 특정 위치에서 특이한 프래임워크 잔기를 동정하기 위한 서열 비교에 의해, 확인할 수 있다(예, Queen et el., 미국 특허 5,585,089; Riechmann et el., Nature 332: 323 (1988), 이는 원용에 의해 본 발명에 포함됨). 항체는, 예컨대, CDR-이식(EP 239,400 ; PCT 공개공보 WO 91/09967; 미국 특허 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 리설페이싱(resurfacing)(EP 592,106 ; EP 519,596 ; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska, et al., PNAS 91:969-973(1994)) 및 쇄 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 5,565, 332)를 포함한, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 인간화할 수 있다.
일반적으로, 인간화 항체는 인간을 제외한 기원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이러한 비-인간의 아미노산 잔기는 흔히 "유입(import)" 잔기라고 하며, 전형적으로 "유입" 가변성 도메인으로부터 취한다. 인간화는 본질적으로 윈터 및 공동 연구자들이 사용한 방법(Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라, 설취류 CDR 또는 CDR 서열 대신 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 키메라 항체(미국 특허 4,816,567)이며, 원형의 인간 가변성 도메인보다 실질적으로 적게 인간을 제외한 종으로부터 유래된 해당 서열로 치환된 것이다. 실제, 인간화 항체는, 설취류 항체에서 일부 CDR 잔기와 가능성 있는 일부 FR 잔기가 유사 부위로 치환된 인간 항체이다.
완전한 인간 항체는 특히 인간 환자의 치료학적 처리에 바람직하다. 인간 항체는 전술한 파지 디스플레이 방법을 포함한 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해, 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 미국 특허 4,444,887 및 4,716,111과, PCT 공개공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 또한, Cole 등 및 Boerder 등의 기법을 인간 단일클론 항체 제조에 이용가능하다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95, 1991).
또한, 인간 항체는 내인성 기능적 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 마우스를 이용하여 생산할 수 있다. 예컨대, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 임의로 또는 상동 재조합으로 마우스 배아 줄기 세포에 도입할 수 있다. 대안적으로는, 인간 가변성 부위, 불변 부위 및 다양성 부위(diversity region)를 인간 중쇄 및 경쇄 유전자와 더불어 마우스 배아 줄기세포에 도입할 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 좌(loci)의 도입과 따로 또는 동시에 무기능성화될 수도 있다. 특히, JH 부위의 동종접합 결손(homozygous deletion)은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포가 확장되며, 배반포에 미세주입되어 키메라 마우스로 생장된다. 키메라 마우스는 이후 교배하여 인간 항체를 발현하는 동종접합 자손(homozygous offspring)을 제조한다. 형질전환 마우스는 선별 항원, 예컨대, 본 발명에 다른 폴리펩티드 전체 또는 일부를 이용하여 정상적인 양상으로 면역화시킨다. 항원에 대한 단일클론 항체는 기존의 하이브리도마 기법을 이용하여 면역화된 형질전환 마우스로부터 수득할 수 있다. 형질전환 마우스로부터 수득한 인간 면역글로불린 트랜스진은 B 세포 분화 과정중에 재배열되며, 이후 클래스 스위칭 및 체세포 변이(somatic mutation)를 겪는다. 따라서, 이러한 기법을 이용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산 가능하다. 인간 항체 생산 기법의 개요는 Lonberg 및 Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)를 참조한다. 인간 항체 및 인간 단일클론 항체 생산 기술 및 이러한 항체 생산 프로토콜에 대한 구체적인 사항은, 예컨대, PCT 공개공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 0 598 877; 미국 특허 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 및 5,939,598를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 또한, 전술한 바와 비슷한 기법으로 선택한 항원에 대한 인간 항체를 제공하기 위해, Abgenix, Inc.(Freemont Clif), Genpharm(San Jose, Calif) 및 Medarex, Inc.(Princeton, N.J.)과 같은 회사를 이용할 수 있다.
또한, 형질이식된 마우스를 인간 말초 혈액 백혈구, 비장세포 또는 골수(예, Trioma techniques of XTL)로 면역화함으로써, 인간 MAb를 제조할 수 있다. 선택한 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체는 "유도 선별(guided selection)"로 언급되는 기법으로 제조할 수 있다. 이러한 접근 방식에서, 선택한 비-인간 단일클론 항체, 예컨대 마우스 항체를 사용하여, 동일한 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체를 선별하도록 인도한다(Jespers et al., Bio/technology 12: 899-903 (1988)).
또한, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는, 당업자에게 널리 공지된 기법으로 본 발명의 폴리펩티드를 "모방하는(mimic)" 항-이디오타입 항체(anti-idiotype antibody) 제조에 활용할 수 있다(예, Greenspan & Bone, FASEB J. 7(5): 437-444, 1989; Nissinoff, J. Immunol. 147(8): 2429-2438, 1991). 예컨대, 결합하여 폴리펩티드 다중체화(multimerization)를 경쟁적으로 저해하는 항체 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 리간드 결합성을 이용하여, 폴리펩티드 다중체화를 "모방하며" 며, 그 결과 폴리펩티드 및/또는 리간드에 결합하여 중화시키는, 항-이디오타입 및/또는 결합성 도메인을 제조할 수 있다. 이러한 중화성 항-이디오타입 또는 상기 항-이디오타입의 Fab 절편은 치료 요법에 사용하여 폴리펩티드 리간드를 중화시킬 수 있다. 예컨대, 이러한 항-이디오타입을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 그것의 리간드/수용체에 결합시킬 수 있으며, 따라서 그것의 생물학적 활성이 차단된다.
본 발명의 항체는 이중 특이적인(bispecific) 항체이다. 이중 특이적인 항체는 적어도 2 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 단일클론, 바람직하기로는 인간 또는 인간화 항체이다. 본 발명에서, 한가지 결합 특이성은 IL13에 대한 것이며, 나머지는 다른 임의의 항원, 바람직하기로는 세포 표면 단백질, 수용체, 수용체 서브유닛, 조직-특이 항원, 바이러스 유래 단백질, 바이러스 코딩 막 단백질, 세균 유래 단백질 또는 세포의 표면 단백질들일 수 있다.
이중 특이적인 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중 특이적인 항체의 재조합 생산은 두개의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다(Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 무작위 조합으로 인해, 하이브리도마(quadromas)는 가능성 있는 상이한 항체 분자 혼합을 생산하며, 단지 하나만 올바른 이중 특이적인 구조를 가진다. 올바른 분자는 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 일반적으로 정제한다. 유사한 방법들이 19993년 5월 13일에 공개된 WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659(1991)에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성을 가지는 항체의 가변 도메인(항체-항원 결합부)을 면역글로불린의 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 융합은 바람직하기로는 적어도 힌지(hinge), CH2 및 CH3 부위를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필수적인 부위를 포함하고 있는 제1 중쇄 불변부(CH1)가, 융합체들중 적어도 하나에 존재한다. 바람직하다면, 면역글로불린 경쇄를 각각의 발현 벡터에 삽입하여, 적합한 숙주 세포에 공동 형질전환한다. 이중 특이적인 항원 제조의 구체적인 사항은, 예컨대, Meth. In Enzym., 121:210(1986)을 참조한다.
이종접합 항체(Heteroconjugate antibody) 역시 본 발명에 포함된다. 이종접합 항체는 공유결합으로 연결된 2개의 항체로 구성되어 있다. 이러한 항체는 예컨대, 원하지 않는 세포로 면역계 세포를 표적화시키기 위해 제안되었다(미국 특허 4,676,980). 상기 항체는 교차-결합제가 사용되는 단계를 포함하는 단백질 합성 화학에서 공지된 방법으로 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 이해된다. 예컨대, 이황화 교환 반응 또는 티오에스테르 결합 형성에 의해 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약으로는 이미노티올레이트, 메틸-4-머캅토부티리미데이트 및 예컨대 미국 특허 4,676,980에 개시된 것들이 있다.
또한, IL13에 대한 단일 도메인 항체를 제조할 수 있다. 이 기법의 예가 낙타과의 중쇄 Ig 유래 항체에 대한 WO9425591과 파지 라이브러리로부터의 단일 도메인의 완전한 인간 항체의 분리를 언급하고 있는 US20030130496에 개시되어 있다.
항- IL13 항체의 동정
본 발명은 IL13의 역할을 저해 및 중화시키는 단일클론 항체 길항제를 제공한다. 특히, 본 발명의 항체는 IL13에 결합하여 IL13 수용체 알파 쇄-1(IL13Rα1)의 활성화를 저해한다. 본 발명의 항체로는, 228B/C-1, 228A-4, 227-26, 및 227-43으로 명명된 항체들이 있으며, 228B/C-1의 인간화 클론이 있다. 또한, 본 발명은 이들 항체들 중 하나, 예컨대 단일클론 항체 228B/C-1와 같이 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
항-IL13 항체 후보물질을 효소 연계성 면역흡광 분석법(ELISA), 웨스턴 면역블롯팅 또는 그외 면역화학적 기법으로 테스트하였다. 각각의 항체를 특정화하기 위한 분석 방법으로는, (1) 호지킨의 림프종 세포주 HDLM-2 및 L-1236의 IL13 자가분지 증식 저해, (2) THP-1 세포에서 IL13 유발성 STAT6 인산화 저해, (3) 원시 인간 단핵구에서 CD13 발현의 IL13 유발성 억제 저해, 및 (4) 원시 인간 단핵구상에서의 CD23 발현의 IL13-유발성 상향 조절 저해가 있다. 실험적인 구체 사항은 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 다클론, 단일클론, 1가, 이중 특이적인, 이종접합, 다중 특이적인, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체, Fab 절편, F(ab') 절편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 절편, 항-이디오타입(항-id) 항체(본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함) 및 전술한 모든 것의 에피토프 결합성 절편을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "항체"는 본원에서 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분과, 면역글로불린 분자, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합부를 포함하는 분자를 의미한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 모든 타입(IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY), 클래스(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 또한, 용어 "항체"(Ab) 또는 "단일클론 항체"(MAb)"는 순수한 분자(intact molecule) 및 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 절편(예, Fab 및 F(ab')2 절편을 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 절편은 순수 항체의 Fc 절편이 결핍되어 있으며 동물 또는 식물의 순환계에서 보다 신속하게 사라지며, 순수 항체보다 비특이적 조직 결합성이 낮을 수 있다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).
항체는 본 발명의 인간 항원-결합성 항체일 수 있으며, VL 또는 VH 중 어느 하나를 포함하는, Fab, Fab' 및 F (ab')2, Fd, 단일쇄 Fvs(scFv), 단일쇄 항체, 이황화 결합된 Fvs 및 단일 도메인 항체를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 항원 결합성 항체 절편은 단일쇄 항체를 포함하여, 가변부를 단독으로 또는 힌지 부위, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 전체 또는 일부분을 함께 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 힌지 부위, CH1, CH2 및 CH3 도메인과 가변부의 모든 조합을 포함하는 항원-결합성 절편을 포함한다. 본 발명의 항체는 조류 및 포유류를 포함하는 모든 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하기로는, 항체는 인간, 인간 이외의 영장류, 설취류(예, 마우스, 및 랫), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아피그, 낙타, 말 또는 닭으로부터 유래된다.
본원에서 "인간 항체"는 Kucherlapati 등의 미국 특허 5,939,598에 개시된 바와 같이, 인간의 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 항체, 인간 면역글로불린 라이브러리나 또는 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 하나 이상의 인간 면역글로불린으로 형질전환된 동물로부터 분리한 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 단일 특이적, 이중 특이적, 삼중 특이적 또는 다중 특이적일 수 있다. 다중 특이적 항체는 IL13의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나, 또는 IL13과 이종 폴리펩티드 또는 고형 지지 물질과 같은 이종 에피토프 둘다에 특이적일 수 있다. 예컨대, PCT 공개공보 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147: 60-69 (1991); 미국 특허 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)를 참조한다.
본 발명의 항체는, 이들이 인지 또는 특이적으로 결합하는 IL13의 에피토프, 또는 일부분이라는 측면에서 설명 또는 구체화될 수 있다. 에피토프 또는 폴리펩티드 일부분은 본원에서와 같이, 예컨대 N-말단 및 C-말단 위치에 의해, 연속 아미노산의 크기 또는 표와 도면에 기술된 바에 의해 구체화될 수 있다.
본 발명의 항체는 또는 이들의 교차-반응성의 측면에서 설명 또는 구체화될 수 있다. IL13 폴리펩티드에 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 및 적어도 50% 이상의 상동성을 가지는(당업계에 공지된 방법 및 본원에 기술된 방법으로 이용하여 계측됨) IL13 폴리펩티드에 결합하는 항체, 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 항-IL13 항체는 KD 약 10-7 M 미만으로, 약 10-6 M 미만으로, 약 10-5 M 미만으로, 항-IL13 항체가 설정되어진 것 이외의 종들로부터 유래된 IL13 항체와 같이, 다른 단백질에 결합할 수 있다.
구체적인 예로, 본 발명의 항체는 인간 IL13의 원숭이 유래 상동체 또는 그것에 해당되는 에피토프와 교차 반응한다. 구체적인 예로, 전술한 교차 반응성은 임의의 단일 특이 항원성 또는 면역성 폴리펩티드이거나, 또는 특이 항원성 및/또는 면역성 폴리펩티드의 조합에 대해서이다.
본 발명은, 엄격한 혼성화 조건하에서 IL13을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 폴리펩티드에 결합하는 항체를 더 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 그것의 결합 친화성에 대해 설명 또는 구체화될 수 있다. 바람직한 결합 친화력은 10-8 내지 10-15 M, 10-8 내지 10-12 M, 10-8 내지 10-10 M, 또는 10-10 내지 10-11 M의 KD 또는 평형 해리 상수를 가지는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 경쟁 결합 분야에서 공지된 방법, 예컨대 본원에 기재된 면역분석법으로 결정된 바와 같이, 본 발명의 에피토프에 항체 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체를 제공한다. 바람직한 예로, 항체는 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60% 또는 적어도 50%로 에피토프에 대한 결합력을 경쟁적으로 저해한다.
벡터 및 숙주 세포
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 구조체와, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 클로닝 및 형질전환의 표준 기법을 본 발명의 항체를 발현하는 세포주의 제조에 사용할 수 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 널리 공지된 기법으로 제조할 수 있다. 발현 벡터는 포유류, 미생물, 바이러스, 또는 곤충 유전자로부터 유래된 것과 같은, 적정 전사 또는 번역 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하도록 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 조절 서열의 예로는 전사 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, mRNA 리보솜 결합부 및/또는 그외 전사 및 번역 개시 및 종결을 조절하는 그외 적절한 서열이 있다. 뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 적절한 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열과 기능적으로 관련있는 경우에 "작동가능하도록 연결된다". 따라서, 프로모터 뉴클레오티드 서열이 적절한 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절한다면, 프로모터 뉴클레오티드 서열은 항체 중쇄 서열에 작동가능하도록 연결된 것이다.
또한, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 서열과 천연적으로 연관된 적절한 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 발현 벡터로 삽입할 수 있다. 예컨대, 항체가 세포 막간 공간(periplasmic space)나 배지로 분비되도록, 신호 펩티드(분비 리더)의 뉴클레오티드 서열을 폴리펩티드 서열에 인-플래임 융합시킬 수 있다. 계획된 숙주 세포에서 기능하는 신호 펩티드는, 원하는 항체의 방출을 증강시킨다. 신호 펩티드는 세포에서 항체가 분비될때 폴리펩티드로부터 절단될 수 있다. 이러한 분비 신호의 예는 널리 공지되어 있으며, 예컨대, US5698435, US5698417, 및 US6204023에 개시된 것을 포함한다.
본 발명에 이용가능한 숙주 세포로는, 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균(예, E. coli , B. subtilis), 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예, 사카로마이세스 피키아), 과 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 베큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템, 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 콜리플라워 모자익 바이러스, CaMV; 담배 모자익 바이러스, TMV)로 감염된 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템, 또는 포유류 세포의 게놈 유래의 프로모터(예, 메탈로티오인 프로모터) 또는 포유류 바이러스 유래의 프로모터(ㅇ), 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하고 있는 재조합 발현 구조체를 가지는 포유류 세포 시스템(예, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
벡터는 플라스미드 벡터, 단일 또는 이중 가닥의 파지 벡터 또는 단일 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 이러한 벡터들을 세포내로 DNA 및 RNA를 도입하기 위한 공지된 기법에 의해, 폴리뉴클레오티드로서 세포에 도입할 수 있다. 파지 및 바이러스 벡터의 경우에서, 또한 벡터를 공지의 감염 및 전달 기법에 의해 패킹된 바이러스(packaged virus)나 캡슐화된 바이러스(encapsulated virus)로서 세포에 도입시킬 수 있다. 바이러스 벡터는 복제가능하거나 또는 복제가 결여된 것일 수 있다. 후자의 경우에, 바이러스 증식은 일반적으로 보완적인 숙주 세포에서만 이루어질 수 있다. 또한, 무세포성 번역 시스템을 사용하여, DNA 구조체로부터 유래된 RNA를 이용하여 단백질을 생산할 수 있다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변부(예, PCT 공개공보 WO 86/05807, PCT 공개공보 WO 89/01036 및 미국 특허 5,122,464)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 항체의 가변성 도메인를 전체 중쇄 또는 경쇄 발현용 벡터에 클로닝할 수 있다.
본 발명에서 숙주 세포로서 유용한 원핵색물로는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예컨대 E. coli , B. subtilis를 포함한다. 표현형 선별 마커 유전자의 예로는, 항생제 내성을 부여하거나 또는 독립영양 요구성을 충족시키는 단백질의 코딩 유전자이다. 원핵 숙주 세포에 이용가능한 발현 벡터의 예로는, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pGEM1(Promega Biotec, Madison, Wisconsin., USA), 벡터(Studier, F.W., J. Mol. Biol. 219: 37(1991); Schoepfer, R. Gene 124: 83(1993))의 pET(Novagen, Madison, Wisconsin, USA) 및 pRSET(Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA) 시리즈와 같이 상업적으로 이용가능한 플라스미드로부터 유래된 것이 있다. 재조합 원핵생물의 숙주 세포 발현 벡터에 공통적으로 이용된 프로모터 서열로는, T7(Rosenberg, et al. Gene 56, 125-135 (1987)), β-락타마제(페니실린아제), 락토스 프로모터 시스템(Chang et al., Nature 275: 615, (1978); Goeddel et al., Nature 281: 544, (1979)), 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel et al., Nuci. Acids Res. 8: 4057, 1980) 및 tac 프로모터(Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)가 있다.
본 발명에 이용가능한 효모로는 사카로마이세스속, 피키아속, 액티노마이세테스 속 및 클루비메로마이세스 속의 것이 있다. 효모 벡터는 종종 2μ 효모 플라스미드 유래의 복제 오리진 서열, 자동 복제 서열(ARS), 프로모터 부위, 폴리아데닐레이션 서열, 전사 종결 서열 및 선별 마커 유전자를 포함할 것이다. 효모용 벡터에 적합한 프로모터 서열은, 그외의 것들 중에서 메탈로티오닌 프로모터, 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) 또는 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제와 같은 그외 당분해 효소의 프로모터(Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978)를 포함한다. 효소 발현을 이용하기 위한, 그외 적합한 벡터 및 프로모터는 또한 Fleer et al., Gene, 107: 285-195 (1991)에 개시되어 있다. 그외 효모용 적정 프로모터 및 벡터와, 효모 형질전환 프로토콜이 당업계에 널리 공지되어 있다. 효모 형질전환 프로토콜이 공지되어 있다. 이러한 프로토콜이 Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 75:1929(1978)에 기재되어 있다. 히넨 프로토콜은 선별 배지내에서 Trp* 형질전환체를 선별한다.
또한, 재조합 항체를 제조하기 위하여, 포유류 또는 곤충 숙주 세포 배양 시스템, 예컨대 이종 단백질 생산용 베큘로바이러스 시스템을 채택할 수 있다. 곤충 시스템에서, AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)를 벡터로 사용하여 외부 유전자를 발현시킬 수 있다. 상기 바이러스는 스포도프테라 프루기페라다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 증식한다. 항체 코딩 서열은 개별적으로 바이러스의 비필수 부위(예, 폴리헤드린 유전자에 클로닝하여, AcNPV 프로모터(예, 폴리헤드린 프로모터)의 통제하에 위치시킬 수 있다.
NSO 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 본 발명에 따른 항체의 포유류 발현용 세포로 사용할 수 있다. 포유류 숙주 세포 발현 벡터용 전사 및 번역 조절 서열은 바이러스 게놈으로부터 적출할 수 있다. 통상적으로 이용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 유인원 바이러스 40(SV40) 및 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래된다. SV40 바이러스 게놈 유래의 DNA 서열을 사용하여, 포유류 숙주 세포에서 구조 유전자 서열의 발현용 다른 유전자 요소, 예컨대, SV40 오리진, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐레이션 부위를 제공할 수 있다. 바이러스 초기 및 후기 프로모터 둘다 바이러스 복제 오리진을 또한 포함할 수 있는 절편으로서 바이러스 게놈으로부터 용이하게 수득할 수 있기 때문에, 특히 이들을 이용할 수 있다. 포유류 숙주 세포에 이용되는 예시적인 발현 벡터는 상업적으로 구입가능하다.
항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그것의 절편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산, 예컨대 DNA를 또한 제공한다. 폴리뉴클레오티드의 예로 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 항체 체인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 본 발명은 엄격한 혼성화 조건 또는 보다 낮은 엄격한 혼성화 조건하에서 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
당업계에 공지된 임의의 방법으로, 폴리뉴클레노티드를 수득할 수 있으며, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 예컨대, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지된 경우 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 화학 합성 올리고뉴클레오티드로부터 만들 수 있으며(예, Kutmeler et al., Bio Techniques 17: 242(1994))), 즉 항체를 코딩하는 서열의 일부를 포함하는 중첩 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 상기 올리고뉴클레오티드를 어닐링 및 라이게이션한 다음 라이게이션한 올리고뉴클레오티드를 PCR로 증폭시킨다.
대안적으로, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적정 기원의 핵산으로부터 제조할 수 있다. 항체 분자의 서열이 공지되어 있지만 특정 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 이용가능하지 않다면, 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 화학적으로 합성하거나 또는 적정 기원(예, 항체 cDNA 라이브러리 또는 본 발명의 항체를 발현하기 위해 선별된 하이브리도마 세포와 같이 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 분리한 핵산, 바람직하기로는 폴리 A+ RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리)으로부터 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해, 또는 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 동정하기 위한 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 클로닝에 의해, 수득할 수 있다. PCR에 의해 제조된 증폭시킨 핵산은 이후 당업계에 널리 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터에 클로닝할 수 있다.
항체의 뉴클레오티드 서열 및 해당 아미노산 서열이 결정되면, 항체의 뉴클레오티드 서열을 뉴클레오티드 서열 조작 기술분야에서 널리 공지된 방법, 예컨대 재조합 DNA 기법, 부위 직접 돌연변이화, PCR 등(예, Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Sons, NY, 원용에 의해 본 발명에 포함됨.)으로 조작하여, 상이한 아미노산 서열을 가지는 항체를 제조, 예컨대 아미노산 서열 치환, 결손 및/또는 삽입시킬 수 있다.
특정 예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변성 도메인의 아미노산 서열을 검사하여, 널리 공지된 방법에 의해, 예컨대 다른 중쇄 및 경쇄 가변성 부위의 공지 아미노산 서열을 비교하고 CDR의 서열을 동정함으로써, 과다변이 가능한 서열 부위를 결정할 수 있다. 일반적인 재조합 DNA 기법을 이용하여, 하나 이상의 CDR을 프래임워크 부위내에, 예컨대 인간 프래임워크 부위에 삽입하여, 비-인간 항체를 전술한 바와 같이 인간화할 수 있다. 프래임워크 부위는 천연 또는 보존적 프래임워크 부위일 수 있으며, 바람직하기로는 인간 프래임워크 부위(예, 인간 프래임워크 부위 리스트로서 Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) 참조)이다. 바람직하기로는 프래임워크 부위와 CDR의 조합에 의해 제조한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 바람직하기로는, 전술한 바와 같이, 하나 이상의 아미노산 치환을 프래임워크 부위에서 형성시킬 수 있으며, 바람직하기로는 상기 아미노산 치환은 항체의 항원 결합을 향상시킨다. 또한, 이러한 방법을 이용하여 체인 내부 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변부의 시스테인 잔기를 아미노산 치환하거나 또는 삭제하여, 하나 이상의 체인 내부의 이황화 결합이 결핍된 항체 분자로 제조할 수 있다. 그외 폴리뉴클레오티드 변이도 본 발명에 포함되며, 당업계의 기술 범위에 속한다.
또한, 적정 항원에 특이적인 마우스 항체 분자 유래 유전자와, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자 유래의 유전자의 스플라이싱에 의한, "키메라 항체" 생산을 위해 개발된 기법(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314: 452-454(1985))들을 사용할 수 있다. 전술한 바와 같이, 키메라 항체는 뮤라인 MAb로부터 유래된 가변부와 인간 면역글로불린 불변부, 예컨대 인간화 항체의 부위와 같이, 다른 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자이다.
대안적으로, 개시된 단일쇄 항체 생산 기법(미국 특허 4,946,778; Bird, Science 242: 423-42 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883(1988))을 적용하여, 단일쇄 항체를 생산할 수 있다. 단일쇄 항체는 아미노산 브릿지를 통해 Fv 부위의 중쇄 및 경쇄 절편을 연결함으로서 제조된다. 또한, E. coli에서 기능적 Fv 절편의 어셈블리 기법을 사용할 수 있다(Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).
항- IL13 항체 생산 방법
본 발명의 항체는 항체 합성 분야에 공지된 임의 방법으로 제조할 수 있으며, 특히 화학 합성 또는 재조합 발현 기법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 항체, 또는 그것의 절편, 유도체 또는 유사체(예, 본 발명에 따른 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 본 발명의 단일쇄 항체)의 재조합 발현에는 항체 또는 항체의 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터의 구축이 필요하다. 항체 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 생산용 벡터를 재조합 DNA 기법으로 제조할 수 있다. 발현 벡터는 항체 코딩 서열과 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 포함하는 구조체이다. 이를 위한 방법으로는, 예컨대 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합이 있다.
발현 벡터를 기존 기법에 의해 숙주 세포로 이동시키고, 이후 종래 방법에 따라 형질감염된 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 생산한다. 본 발명의 측면에서, 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는 벡터는 하기한 바와 같이, 전체 면역글로불린 분자 발현용 숙주 세포에서 공동 발현된다.
전술한 바와 같이, 다양한 숙주 발현 벡터 시스템을 활용하여 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은 원하는 코딩 서열을 생산 및 정제할 수 있는 비히클이며, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염되었을때 본 발명의 항체 분자를 인 시츄(in situ)로 발현시킬 수 있는 세포이다. E. coli 및 진핵세포와 같은 세균 세포를 재조합 항체 분자의 발현을 위해, 특히 전체 재조합 합체 분자의 발현을 위해 일반적으로 이용한다. 예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유류 세포와 인간 사이토메갈로바이러스의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터가, 효과적인 항체 발현 시스템이다(Foecking et al., Gene 45: 101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8: 2 (1990)).
또한, 삽입 서열의 발현을 조절하고 원하는 특이 양상으로 유전자 산물을 변형 및 처리하는 숙주 세포를 선택할 수 있다. 이러한 단백질 산물의 변형(예, 당화) 및 처리(예, 절단)가 단백질 기능에 중요할 수 있다. 다른 숙주 세포가 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 처리 및 변형에 있어 특징적이며 특이적인 기작을 가진다. 발현된 외부 단백질의 올바른 변형 및 처리를 위해, 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이로 인해, 유전자 산물의 초기 전사체, 당화 및 인산화의 적절한 처리를 위한 세포 장치를 가지고 있는 원핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유류 숙주 세포로는 CHO, COS, 293, 3T3 또는 골수 세포가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
장기간, 재조합 단백질의 고수율 생산, 안정적인 발현이 바람직하다. 예컨대, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주를 만들 수 있다. 바이러스 복제 오리진을 포함하는 발현 벡터를 이용하기보다는, 숙주 세포를 적합한 발현 조절 요소(예, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐레이션 부위 등) 및 선별 마커에 의해 조절된 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 재조합 플라스미드내 선별 마커는 선별에 대한 내성을 부여하며, 플라스미드가 그것의 염색체내로 안정적으로 삽입되도록 하며, 클론화되어 세포주로 발전될 수 있는 형태로 증식한다. 이러한 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주 제조에 유용하게 사용할 수 있다. 이러게 제조된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 화합물을 검색하고 평가하는데 특히 유용할 수 있다.
다수의 선별 시스템을 이용할 수 있으며, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미드 키나제(Wigler et al., Cell 11:223(1977)), 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202(1992)) 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라제(Lowy et al., Cell 22:817(1980)) 유전자를 각각 tk, hgpt 또는 aprt-세포에 각각 사용할 수 있다. 또한, 항대사산물 내성을 다음 유전자 선별을 위한 근거로서 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357(1980)); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527(1981)), 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981), 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95, 1991), 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., Gene 30:147, 1984). 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 공지된 방법을 일반적으로 적용하여 원하는 재조합 클론을 선별할 수 있으며, 이러한 방법의 예들이 Ausubel et al.(eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 12 및 13장, Dracopoli et al.(eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre- Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1(1981)에 기재되어 있으며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다(참조, Bebbington and Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" (DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press, New York, 1987). 항체를 발현하는 벡터 시스템내 마커가 증폭가능한 것인 경우에, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 저해제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 수 있을 것이다. 증폭된 부위는 항체 유전자와 관련되어있으므로, 항체 생산 역시 증가할 것이다(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983)).
중쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터와 경쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터인, 본 발명의 2종의 발현 벡터를 숙주 세포에 공동 형질감염시킬 수 있다. 이 2종의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 동일한 수준으로 발현할 수 있는 동일한 선별 마커를 포함할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두를 코딩하며 발현시킬 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 조건에서, 무독성 중쇄의 과다 발현을 방지하기 위해 경쇄는 중쇄 앞에 위치되어야 한다(Proudfoot, Nature 322:52(1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197(1980)). 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 동물을 이용하여 생산되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합 방법으로 발현되면, 임의의 면역글로불린 분자의 정제 분야에서 공지된 방법, 예컨대 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성 특히 단백질 A 이후의 특이 항원에 대한 친화성에 의한, 크기 배제 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이 또는 그외 단백질 정제에 대한 표준 기법으로 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그것의 절편은 본원에 기재되거나 당해분야에 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 융합하여, 정제를 용이하게 할 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드에 재조합 방법으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합된(공유 결합 및 비공유 결합 접합을 포함) 항체를 포함한다. 융합 또는 접합된 본 발명의 항체는 정제를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 예로, Harbor et al., supra, 및 PCT 공개공보 WO 93/21232; EP 439,095 ; Naramura et al., Immunol. Lett. 39: 91-99 (1994); 미국 특허 5,474,981; Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146: 2446-2452 (1991)를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
더욱이, 본 발명의 항체 또는 그것의 절편를 정제를 용이하게 하기 위한 펩티드와 같은 마커 서열과 융합시킬 수 있다. 바람직한 예로, 마커 아미노산 서열은 상업적으로 이용가능한 다수의 것들 중에서 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)에 있는 tag와 같은 히스티딘 6개로 이루어진 펩티드이다. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989)에 개시된 바와 같이, 6개의 히스티틴은 융합 단백질을 용이하게 정제되도록 한다. 그외 정제시 이용가능한 펩티드 텍으로는, 인플루엔자 헴어글루티닌 단백질 유래의 에피토프인 "HA" 텍(Wilson et al., Cell 37:767(1984)와 "flag" 텍이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
항 IL -13 항체의 진단 용도
본 발명의 항체는 공유 결합이 IL13의 결합을 간섭하지 않도록 항체에 모든 타입의 분자를 공유 결합에 의해 변형시킨 유도체를 포함한다. 예컨대, 한정하기 위한 것은 아니지만, 항체 유도체로는 예컨대, 바이오티닐레이션, HRP 또는 그외 검출가능한 모이어티에 의해 변형된 항체를 포함한다.
본 발명의 항체를 사용하여, 예컨대 IL13을 정제하거나 또는 검출할 수 있으며, 비제한적으로 시험관내 및 생체내 진단 방법을 비제한적으로 포함한다. 예컨대, 항체는 생물학적 샘플내 IL13 수준을 정량성 및 정성적으로 측정하기 위한 면역분석에 사용한다. 예를 들어, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)(원용에 의해 본 발명에 포함됨)를 참조한다.
하기에서 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체를 단독으로 또는 그외 조성물과 함께 사용할 수 있다. 항체의 N- 또는 C-말단에 이종 폴리펩티드를 재조합 방법에 의해, 또는 폴리펩티드 또는 그외 조성물을 (공유 및 비공유 접합을 포함한) 화학적으로 접합시킬 수 있다. 예컨대, 본 발명의 항체에 검출 분석법에서 표지물로서 유용한 분자를 재조합 방법으로 융합 또는 접합시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 진단제에 접합된 항체 또는 그것의 절편을 포함한다. 항체를 진단학적으로 이용하여, 예컨대 일정한 치료 요법의 효과를 결정하기 위한 임상적인 테스트 과정의 일부로서 예컨대 알레르기 반응의 발병 또는 진행을 모니터링할 수 있다. 검출은 검출가능한 물질과 항체를 커플링함으로써 촉진시킬 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는, 다양한 효소, 프로스테틱기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질, 방사능 활성 물질, 다양한 양전자 방사 촬영술을 이용한 양전자 방사 금속 및 비방사능 활성 상자성 금속 이온들이 있다. 검출가능한 물질은 당업계에 공지된 기법들을 이용하여 항체(또는 그것의 절편)과 직접적으로 또는 매개물(예, 당업계에 공지된 링커)을 통하여 간접적으로 커플링 또는 접합시킬 수 있다. 본 발명에 있어서 진단제로서 이용되는 항체에 접합시킬 수 있는 금속 이온의 예로는, 미국 특허 4,741,900를 참조한다. 적합한 효소의 예로는, 호르세라디시 페록시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며, 적합한 프로스테틱기 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있으며, 적합한 형광 물질의 예로 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있으며, 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며, 생발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에퀴오린이 있으며, 적합한 방사활성 물질로는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc가 있다.
또한, 항체는 표적 항원의 면역분석 또는 정제에 특히 유용한 고형 지지체에 부착시킬 수 있다. 고형 지지체로는, 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
IL13에 특이적으로 결합하는 표지된 항체, 및 그것의 유도체 및 유사체를 IL13의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련있는 질병, 장애 및/또는 증상을 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 진단 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명은 개체의 세포나 체액내의 IL13의 발현을 IL13에 특이적인 1종 이상의 본 발명에 따른 항체를 이용하여 분석하는 단계, 및 표준 유전자 발현 수준과 상기 유전자의 발현 수준을 비교하여, 분석한 IL13 발현 수준이 표준 발현 수준에 비해 증가 또는 감소된 경우 비정상적인 발현인 것으로 표시하는 단계를 포함하는, IL13의 비정상적인 발현 검출 방법을 제공한다.
항체를 샘플, 예컨대 체액 또는 조직 샘플내 IL13의 존재 및/또는 농도를 검출하는데 이용할 수 있다. 검출 방법은 상기 샘플을 IL13과 접촉시키는 단계 및 샘플에 결합된 항체의 함량을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 1종 이상의 항체를 이용하여 개체의 세포 또는 체액내의 IL13의 발현을 분석하는 단계, 및 유전자의 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교하여, 분석한 유전자 발현 수준이 표준 발현 수준에 비해 증가 또는 감소된 경우 특정 장애를 나타내는 것으로 보는 단계를 포함하는, 장애 진단용 진단 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 항체를 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법으로 생물학적 샘플내의 단백질 수준을 분석하기 위해 사용할 수 있다(예, Jalkanen et al., J. cell. Biol. 101:976-985, 1985; Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987 참조). 그외 단백질 유전자 발현 검출에 이용가능한 항체를 이용한 방법으로는, 효소 연계된 면역흡광 분석(ELISA) 및 방사면역분석(RIA)와 같은 면역분석법을 포함한다. 적합한 항체 분석 표지물은 당업계에 공지되어있으며, 포도당 옥시다제, 요오드(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(112In) 및 테크네튬(99Tc)와 같은 방사능 동위원소, 루미놀과 같은 발광 표지물, 및 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 표지물 및 비오틴과 같은 효소 표지물이 있다.
본 발명의 일 측면은 동물, 바람직하기로는 포유류 및 가장 바람직하기로는 인간에서 비정상적인 IL13의 발현과 관련있는 질병 또는 장애의 검출 및 진단 방법이다. 일 예에서, 진단 방법은 a) IL13에 특이적으로 결합하는 표지된 분자를 유효량으로 개체에게 (예, 비경구로, 피하로 또는 복막내로) 투여하는 단계, b) 폴리펩티드가 발현된 개체의 부위에서 표지 분자가 (백그라운드 수준으로 처리되어진 결합되어지 않은 표지 분자에 대해) 우선적으로 집중되도록, 투여 이후의 시간 간격동안 대기하는 단계, c) 백그라운드 수준을 측정하는 단계, 및 d) 개체에서 표지된 분자를 검출하는 단계로, 백그라운드 수준 이상의 표지 분자 검출은 개체가 비정상적인 IL13 발현과 관련있는 특정 질병 및 장애를 가짐을 의미하는 것을 포함한다. 백그라운드 수준은 특정 시스템에서 검출된 표지 분사의 함량을 사전에 측정한 표준치와 비교하는 단계를 포함한 여러가지 방법으로 결정할 수 있다.
개체의 사이즈와 사용한 이미징 시스템으로, 진단학적 이미지를 만드는데 필요한 이미징 모이어티의 함량을 결정할 수 있을 것으로 당업계에서 이해될 것이다. 방사능 동위원소 모이어티의 경우에서, 인간 개체에 대해 주입된 방사능의 함량은 정상적으로 99Tc 약 5 내지 20 밀리퀴리 범위일 것이다. 표지 항체 또는 항체 절편은 이후 특이적인 단백질을 포함하는 세포 위치에서 우선적으로 축적될 것이다. 생체내 이미징은 S. W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Chapter 13 in Tumor Imaging : The Radiochemical Detection of Cancer, S. W. Burchiel and B. A. Rhodes. eds., Masson Publishing Inc.(1982))에 개시되어 있다.
사용되는 표지물의 유형 및 투여 방식을 포함한 여러가지 변수에 따라, 투여 이후의 표지 분자가 개체의 부위에 우선적으로 집중되도록 하고 백그라운드 수준으로 처리되어지는 비결합 표지 분자에 대한 시간 간격은, 6 내지 48시간, 또는 6 내지 24시간 또는 6 내지 12시간이다. 다른 예에서, 투여후 시간 간격은 5 내지 20일 내지 5 내지 10일이다.
일 예로, 질병 또는 장애의 모니터링은 질병 또는 질환 진단 방법을 첫 진단 후 한달 경과시, 6개월 경과시 1년 경과시 등에 반복하여 수행할 수 있다.
표지 분자의 존재는 생체내 스캐닝 분야에서 공지된 방법으로 환자에서 검출할 수 있다. 이러한 방법은 사용하는 표지물의 종류에 따라 결정된다. 당업자는 특정 표지물을 검출하는 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에서 사용될 수 있는 방법 및 기기로는 CT(computed tomography), PET(position emission tomography)와 같은 전신 스캔, MRI(magnetic resonance imaging ) 및 소노그래피(sonography)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
특정 예에서, 분자는 방사능 동위원소로 표지되며 방사 반응성 수술 장치를 이용하여 환자에게서 검출한다(Thurston et al., 미국 특허 5,441,050). 다른 예에서, 분자를 형광 화합물로 표지하고, 형광 반응성 스캐닝 장치로 환자에게서 검출한다. 다른 예에서, 분자를 양전자 방사 금속으로 표지하고 양전자 방사 촬영술로 환자에게서 검출한다. 또 다른 예에서, 분자를 상자성 표지물로 표지하고 가지 공명 이미징(MRI)으로 환자에게서 검출한다.
다른 측면으로, 본 발명은 환자의 조절되지 않은 사이토카인 발현에 의해 야기된 질환이 발병되기 쉬운 경향을 진단하는 방법을 제공한다. 특정 환자의 세포, 조직 또는 체액내의 IL13 함량 증가는 환자가 특정 면역 질환에 걸리기 쉽다는 것을 나타낸다. 일 예에서, 상기 방법은 저수준 또는 정상 수준으로 IL13을 가지는 것으로 알려진 개체로부터 세포, 조직 또는 체액을 채취하는 단계, 조직내 IL13의 존재에 대해 조직 또는 체액을 분석하는 단계, 및 IL13 발현 수준을 토대로 환자의 특정 면역 질환에 걸릴 경향을 예측하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 상기 방법은 특정화된 IL13 수준을 가지는 것으로 알려진 세포, 조직 또는 체액을 환자로부터 수집하는 단계, 조직 또는 체액으로부터 IL13의 함량을 분석하는 단계 및 정상 세포, 조직 또는 체액으로부터 특정화되거나 테스트한 확정된 수준과 비교하여 IL13의 함량 변화를 토대로 특정 면역 질환에 걸릴 환자 경향을 예측하는 단계를 포함한다. 특정화된 IL13 수준은 문헌에 기재된 공지 함량일 수 있거나, 또는 정상적인 세포, 조직 또는 체액에서의 함량을 측정함으로써 미리 결정할 수 있다. 특히, 측정 조직이나 체액의 IL13 수준 결정으로 특이적으로 초기에, 바람직하기로는 질병 발병전에 환자의 면역 질환을 검출할 수 있다. 본 방법을 이용하여 진단할 수 있는 면역 질환은 본원에 기재되어 있지만, 그로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 예로, 조직 또는 체액은 말초 혈액, 말초 혈액 백혈구, 폐 또는 피부 바이옵시(biopsy)와 같은 바이옵시 조직 및 조직이다.
항- IL13 항체의 치료학적 용도
단독으로 또는 세포독성 인자와 조합하여 투여한 치료학적 모이어티가 접합 또는 접합되지 않은 항체를 치료제로서 사용할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체를 IL13 매개 질환, 장애 또는 증상을 치료하기 위해 동물, 포유류 또는 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 항체를 이용한 치료제에 관한 것이다. 상기 동물 또는 개체는 특정 장애, 예컨대 IL13과 관련된 장애를 가진 것으로 진단된 동물과 같이 특별한 치료가 필요한 동물일 수 있다. IL13에 대한 항체는 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개, 인간이외의 영장류 및 인간을 포함한 동물에서 알레르기성 반응을 저해하는데 유용하다. 예컨대, 본 발명의 항체 또는 항체들, 또는 본 발명에 따른 항체들의 혼합물(cockatil)을 단독으로 또는 다양한 기원의 그외 항체와 함께, 치료학적으로 허용가능한 함량으로 투여함으로써, 처리한 포유류에서 항원에 대한 알레르기 반응을 감소 또는 없앨 수 있다.
본 발명의 치료 화합물로는, 본 발명의 항체(본원에 기재된 바와 같이 절편, 유사체 및 유도체를 포함함) 및 하기에 기재된 바와 같이 본 발명의 항체(본원에 기재된 바와 같이, 그것의 절편, 유사체 및 유도체 및 항-이디오타입 항체를 포함함) 를 코딩하는 핵산이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체는 비정상적인 IL13 발현 및/또는 활성과 관련된 본원에 기재된 질병, 장애 또는 증상 중 임의의 하나 이상을 비제한적으로 포함하는 질병, 장애 또는 증상을 치료, 저해 또는 예방하기 위해 사용할 수 있다. 비정상적인 IL13 발현 및/또는 활성과 관련된 본원에 기재된 질병, 장애 또는 증상의 치료 및/또는 예방은, 상기 질병, 장애 또는 증상과 관련된 적어도 한가지 이상의 증상을 완화시키는 것을 비제한적으로 포함한다. 본 발명의 항체는, 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 바와 같이, 약학적으로 허용가능한 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 항-IL13 항체는 다양한 질병에 치료학적으로 사용할 수 있다. 본 발명은 포유류에 IL13 매개 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유류에 항-IL13 항체를 질병 예방 또는 치료 함량으로 투여하는 단계를 포함한다. 항-IL13 항체는 IL13에 결합하여 사이토카인과 세포 수용체 발현을 조절하고, 정상적인 상태의 사이토카인 수준을 형성시킨다. 따라서, 치료하기 위한 질병으로는 알레르기, 천식, 자가면역 질환 또는 그외 염증성 질환들이 있다. 그외 알레르기성 질환으로는 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 식품 과민증 및 두드러기가 있으며, 면역 매개 피부 질환으로는 수포성 피부 질환, 다형 홍반 및 접촉성 피부염이 있으며, 자가면역 질환으로는 건선, 류마티스 관절염, 청소년 만성 관절염이 있으며, 염증성 대장 질환(즉, 궤양성 대장염 및 크론병), 그외 IL13과 관련있는 질환으로는 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonia), 배상세포 이형성(goblet cell metaplasia), 낭포성 섬유증, 글루텐 민감성 장 질환, 및 위플씨 질환과 같은 염증성 진폐증이 있으며, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴과 같은 폐질환, 만성 폐색 폐질환, RSV 감염, 구개수염, 경피증, 골다공증 및 호지킨스 림프종이 있다.
비정상적인 IL13 발현 및/또는 활성과 관련있는 질병 또는 장애의 치료, 저해 및 예방에 효과적인 항체 함량은, 표준 임상 방법으로 결정할 수 있다. 항체는 질병에 맞는 치료 요법으로 질병 상태를 완화시키기 위해, 하루 또는 수일간 일회 또는 수회 투여하거나, 또는 알레르기 또는 천식을 예방하기 위해 장 시간동안 주기적으로 투여할 수 있다. 또한, 시험관내 분석을 선택적으로 채택하여 최적 투여량 범위 결정을 보조할 수 있다. 제형의 정확한 사용 용량은 역시 투여 경로, 질환 또는 장애의 심각도에 따라 결정될 것이며, 개업의나 각 환자의 상태에 따라 결정하여야 한다. 유효 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로 얻은 투여량-반응 곡선으로부터 추정할 수 있다.
항체의 경우, 환자에게 투여되는 투여량은 일반적으로 환자 체중 1 kg당 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 바람직하기로는, 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중의 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg이며, 더 바람직하기로는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외부 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종의 항체보다 인체내에서 더욱 긴 반감기를 가진다. 따라서, 인간 항체의 적은 투여량 및 투여 횟수 감소가 가능하다. 나아가, 본 발명에 따른 항체의 투여량 및 투여 횟수는, 예컨대 지질화(lipidation)와 같은 변형에 의해 항체의 흡수력 및 조직 투과성을 증강시킴으로써 낮출 수 있다.
본 발명의 항체는 다른 단일 클론항체, 키메라 항체, 예컨대 항체와 접촉한 작동자 세포의 수 또는 활성 증가에 기여하는 림포카인 또는 조혈 성장 인자(예, IL-2, IL-3, IL-7, IFN)와 조합 형태로 이롭게 사용할 수 있다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 면역치료, 기관지 확장제, 항-IgE 분자, 항-히스타민 또는 항-루코트리엔과 같은 그외 타입의 치료제와 조합하여 투여할 수 있다.
바람직한 측면에 있어서, 항체는 실질적으로 정제된 (예, 그것의 효과를 제한하거나 원하지 않는 부작용을 형성하는 물질이 실질적으로 없는) 것이다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 본 발명의 항체 투여에 사용할 수 있으며, 주입, 예컨대 리포좀, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 내포작용(endocytosis)(Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432(1987)), 레트로바이러스 또는 그외 벡터의 일부로서 핵산 구조체 등으로의 캡슐화를 포함한다.
항-IL13 항체는 모든 허용가능한 방식으로 포유류에 투여할 수 있다. 도입 방법으로는, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 흡입 및 경구 통로를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 항체 또는 조성물은 임의의 용이한 경로로, 예컨대 주입 또는 볼루스 주사(bolus injection), 상피 또는 점막피부 라이닝(mucocutaneous lining)(예, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)에 의해 투여할 수 있으며, 그외 생물학적으로 활성인 물질과 함께 투여할 수도 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 또한, 본 발명의 치료 항체 또는 조성물을 심실내 및 척추내 주입을 포함한 적절한 경로로 중추 신경계에 도입하는 것이 바람직할 수 있으며, 심실내 주사는 몸마야 저장체(Ommaya reservoir)와 같은 저장체가 부착된 심실내 카테터에 의해 용이하게 할 수 있다.
또한, 흡입기 또는 분사기를 사용하여 에어로졸화제가 포함된 제형을 폐 투여 할 수 있다. 또한, 항체를 건조 분말 조성물 형태로 환자의 폐에 투여할 수 있다(예, 미국 특허 6,514,496).
특정 예에서, 본 발명의 치료 항체 또는 조성물을 치료가 필요한 부분에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 이는 예컨대 국소 주입, 국소 적용, 주사, 카테터 방식으로, 좌약 형태로 또는 임플란트 방식으로 수행될 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니며, 상기 임플란트는 실라스틱 막(sialastic membrane) 또는 섬유과 같은 막을 포함하는 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 임플란트이다. 바람직하기로는, 본 발명의 항체를 투여하였을때 단백질이 흡수하지 않는 물질을 이용하도록 관리되어야 한다.
다른 예에서, 항체는 소낭(vesicle), 특히 리포솜 형태로 전달된 수 있다(Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp. 353-365(1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327).
다른 예에서, 항체는 조절성 방출 시스템의 형태로 전달할 수 있다. 일예로, 펌프를 사용할 수 있다(Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). 다른 예로, 폴리머 물질을 사용할 수 있다(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.) CRC Pres., Boca Raton, Fla.(1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performances, Smolen anc Ball(eds.), Wiley, New York(1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)). 또 다른 예로, 조절성 방출 시스템을 치료 표적지에 근접하여 위치시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 치료학적 유효량의 항체와 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특정 예에서, 용어 "생리학적으로 허용가능한"은 연방 또는 주정부의 규제 기구로부터 승인을 받았거나 또는 미국 약전에서 또는 그외 동물 특히 인간 사용에 대한 일반적으로 인정된 약전에 기재된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보강제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 생리학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 페트롤리움유, 동물유, 식물유 또는 합성유를 포함한 오일, 예컨대 땅콩 오일, 소이빈 오일, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 약학적 조성물을 정맥내로 투여할때 물이 바람직한 담체이다. 또한 식염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 액체 담체로서, 특히 주사용 용액으로서 사용할 수 있다. 적합한 약학 부형제로는 전분, 포도당, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 말트, 벼, 밀가루, 호분, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 건식 스킴 밀크, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 있다. 상기 조성물은 또한 바람직한 경우에 미량의 습윤제, 유화제 또는 pH 완충화제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액제, 현탁제, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 통상적인 결합제 및 트리글리세라이드와 같은 담체와 함께 좌제로서 제형화할 수 있다. 경구 제형은 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이트 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체의 예가 "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin에 개시되어 있다. 이러한 조성물은, 환자에게 투여하기에 적절한 형태를 제공하기 위해, 유효량의 항체, 바람직하기로는 정제형의 항체를 적정 함량의 담체와 함께 함유할 것이다.
일 예로, 조성물은 인간의 정맥내 투여용으로 제조한 약학적 조성물로서, 일반적인 공정에 따라 제형화한다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수계 완충액내의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주입한 위치의 통증을 약화시키는 리그노카인(lignocaine)과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로 성분은 예컨대 동결건조한 건조 분말 또는 무수 농축물과 같은 단위 투여 형태로, 앰플 또는 사케트와 같이 활성 물질의 함량이 표시된 밀폐 용기내에 별도로 또는 혼합하여 넣는다. 조성물이 주입에 의해 투여하는 경우, 약학 등급의 멸균 수 또는 염수를 포함하는 주입 병을 이용하여 투여할 수 있다. 조성물을 주사로 투여하는 경우, 투여전에 성분을 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수 앰플을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물의 하나 이상의 성분이 충진된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 용기에 약제 또는 생물학적 산물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기구에서 지정한 형태의 주의사항이 조합될 수 있으며, 주의사항은 인간 투여를 위한 기구의 제조, 이용 또는 판매 승인을 명시한다.
또한, 본 발명의 항체는 이종 폴리펩티드, 약물, 방사능뉴클레오티드 도는 독소와 같은 여러가지 작동자 분자에 접합될 수 있다. 예컨대, PCT 공개 공보 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 5,314,995; 및 EP 396,387을 참조한다. 항체 또는 그의 절편을 세포독소와 같은 치료학적 모이어티, 예컨대 세포 증식 억제 또는 세포치사 물질, 치료제 또는 방사능 금속 이온, 예컨대 213Bi와 같은 알파-방사체와 접합시킬 수 있다. 세포독소 또는 세포독성 물질은 세포에 해로운 임의 물질을 포함한다. 그 예로는 파클리탁솔, 사이토칼라신B, 그라미시딘d, 에티듐 브로마이드, 이메틴, 미토마이신, 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈클라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토산트론, 미트라마이신, 액티노마이신D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 그것의 유사체 또는 동질체를 포함한다. 치료제는 항대사산물(예, 메톡트레세이트, 6-머갑토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 디카르바진), 알킬화제(예, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 cis-디클로로디아민 플라티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예, 다우노루비신(다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예, 닥티노마이신(액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 항-체세포 분열체(예, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
치료 모이어티를 항체에 접합하는 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Theraphy, Reisfeld et al.(eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al.(eds.), pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Fo Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.(eds.), pp. 475-506(1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.(eds.) pp. 303-16(Academic Press 1985), 및 Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982)를 참조한다. 대안적으로, 항체를 이차 항체에 접합시켜 항체 이종접합체를 형성할 수 있다(Segal, 미국 특허 4,676,980).
본 발명의 접합체는 일정한 생물학적 반응을 변형하는데 사용할 수 있으며, 치료제 또는 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제에 한하여 추론되는 것은 아니다. 예컨대, 약물 모이어티는 바람직한 생물학적 활성을 지닌 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예컨대 아브린, 리신A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소와 같은 독소, 종양 괴사 인자, 알파-이터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성자, 세포자살제, 예컨대 TNF-α, TNF-β, AIM I(국제 공개공보 WO 97/33899), AIM II(국제 공개공보 WO 97/34911), Fas 리간드(Takahashi et al., Int. Immunol., 6: 1567-1574 (1994)), VEGI (국제 공개공보 WO 99/23105), 혈전제 또는 항-혈관신생제, 예컨대 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 예컨대 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) 또는 그외 성장 인자를 포함할 수 있다.
항체를 이용한 유전자 요법
본 발명의 다른 측면에서, 항체 또는 그것의 기능적 유도체를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 투여하여, 유전자 요법으로 IL13의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료, 저해 또는 예방한다. 유전자 요법은 발현된 또는 발현가능한 핵산을 개체에게 투여함으로써 수행된 요법이다. 본 발명의 예에서, 핵산은 치료 효과를 매개하는 그것의 코딩 단백질을 만든다. 이용가능한 유전자 요법에 사용되는 임의의 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 방법의 예는 하기와 같다.
유전자 요법의 전체적인 개요로서, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH 11 (5): 155-215 (1993)을 참조한다.
일 측면에 있어서, 화합물은 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 항체 또는 절편 또는 키메라 단백질 또는 그것의 중쇄 또는 경쇄를 적합한 숙주내에서 발현시키는 발현 벡터의 일부이다. 특히, 이러한 핵산 서열은 항체 코딩 부위에 작동가능하도록 연결된 프로모터를 가지며, 상기 프로모터는 유발성 또는 구성적(constitutive)이며, 선택적으로 조직-특이적이다.
다른 예에 있어서, 핵산 분자는 항체 코딩 서열 및 그외 바람직한 서열이 게놈내 원하는 부위에서 상동 재조합을 조장하는 부위의 측면에 위치하여, 항체 코딩 핵산을 염색체 내부(intrachromosomal)에서 발현하는데 사용된다(Koller and Smithies, Proc. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijistra et al., Nature 342: 435-438 (1989). 특정 예에서, 발현된 항체 분자는 단일 체인 항체이며, 대안적으로 핵산 서열은 항체의 중쇄 및 경쇄 둘다, 또는 그것의 절편을 코딩하는 서열을 포함한다.
핵산의 환자내 전달은 핵산 또는 핵산 운반 벡터에 환자를 직접적으로 노출시키는 경우에서의 직접적, 또는 세포에 핵산을 먼저 시험관내에서 형질전환시킨 다음 환자에게 이식하는 경우에서의 간접적일 수 있다. 이러한 생체내 또는 생체외 요법으로서 두가지 방식이 각각 공지되어 있다.
특정 예에서, 핵산 서열은 발현되어 코딩된 산물을 제조하는 생체내로 직접적으로 투여된다. 이는 예컨대 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 그것을 구축하고, 결함이 있는 레트로 바이러스 또는 약독화된 레트로 바이러스 또는 그외 바이러스 벡터(미국 특허 4,980,286)를 이용한 감염에 의해, 또는 네이키드 DNA(naked DNA)의 직접 주입에 의해, 또는 미세입자 충격(microparticle bombardment)(예, 유전자 총; Biolistic, Dupont), 지질을 이용한 코팅, 리포좀, 미세입자 또는 미세캡슐내 세포 표면 수용체 또는 형질감염제 캡슐화에 의해, 또는 핵으로 들어가는 것으로 알려진 펩티드에 연결시킨 형태로 그것을 투여함으로써, (수용체를 특이적으로 발현하는 표적 세포 유형에 사용될 수 있는) 수용체 매개 내포작용을 수행하는 리간드에 연결된 형태로 이것을 투여함으로써(예, Wu and Wu, J. Bio. Chem., 262:4429-4432(1987)), 당업계에 공지된 다수의 방법들로 완수할 수 있다. 다른 예에 있어서, 핵산-리간드 복합체는 리간드가 용해성 바이러스 펩티드(fusogenic viral peptide)를 포함하여 엔도좀을 파괴하는 형태로 제조될 수 있으며, 이로써 핵산은 라이소좀에 의한 분해를 피할 수 있다. 또 다른 예에서, 핵산은 세포 특이적인 흡수 및 발현에 있어서, 특이적인 수용체를 표적화함으로써 생체내에서 표적화될 수 있다(예, PCT 공개공보 WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; W0 93/14188, WO 93/20221). 대안적으로, 핵산을 세포내부로 도입하여 상동 재조합에 의해 발현을 위해 숙주 세포 DNA내로 병합될 수 있다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989)).
특정 예에서, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용한다. 예컨대, 레트로 바이러스를 사용할 수 있다(Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599(1993)). 이러한 레트로 벡터는 바이러스 게놈의 정확한 패키지와 숙주 세포 DNA로의 병합에 필요한 구성성분을 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 항체 코딩 핵산 서열을 환자에서 유전자 전달을 용이하게 하는 1종 이상의 벡터에 클로닝한다. 레트로 바이러스 벡터에 대한 보단 구체적인 사항은 Boesen et el., Biotherapy 6: 291-302 (1994)에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌은 줄기 세포를 화학요법에 더욱 내성적으로 만들기 위해 조혈 줄기 세포내로 mdrl 유전자를 전달시키기 위한 레트로 바이러스 벡터의 용도를 개시하고 있다. 유전자 요법에서의 레트로 바이러스 벡터의 용도를 개시하고 있는 그외 문헌으로는, Clowes et dl., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); 및 Grossman and Wilson, Curr. Opin. Gen. and Dev. 3: 110-114 (1993)가 있다.
또한, 본 발명에 아데노바이러스를 사용할 수 있다. 아데노바이러스는 특히 본 발명에서 호흡 상피에 항체를 전달하는데 있어 매우 매력적인 비히클이다. 그외 아데노바이러스계 전달 시스템의 타겟은 간, 중추 신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 무분열성 세포를 감염시킬 수 있는 능력을 가졌다는 점이 이점이다. Kozarsky 및 Wilson, Curr. Opin. Gen. Dev. 3: 499-503 (1993)에 아데노바이러스계 유전자 요법의 개략적인 내용이 기재되어 있다. Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994)에서는 아데노바이러스 벡터의 유전자를 붉은 털 원숭이의 호흡 상피에 전달하는 용도가 기재되어 있다. 그외 유전자 요법에서의 아데노바이러스의 용도는 Rosenfeld et al, Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993); PCT 공개공보 W094/12649; 및 Wang, et al., Gene Therapy 2: 775-783 (1995)에서 확인할 수 있다. 또한, AAV(Adeno-associated virus)의 유전자 요법에서의 용도가 제시되고 있다(Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 204: 289-300 (1993); 미국 특허 5,436,146; 6,632,670; 6,642,051).
다른 유전자 치료법은 유전자를 전기충격, 리포펙션, 칼슘 포스페이트 매개 형질감염 또는 바이러스 감염과 같은 방법으로 조직 배양물의 세포에 전이시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 전이 방법은 세포에 선별 마커의 전이를 포함한다. 이후 세포를 이것을 받아들이고 전이시킨 유전자를 발현하는 세포를 분리하기 위하여 선별 조건하에 둔다. 이러한 세포를 이후 환자에게 전달한다.
이러한 예에서, 핵산은 제조되는 재조합 세포의 생체내 투여 이전에 세포에 도입된다. 상기 도입은 형질감염, 전기충격, 미세주입, 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터를 이용한 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 전이, 미세세포-매개 유전자 전이, 스페로플라스트 융합 등을 비제한적으로 포함하는, 당업계에 공지된 임의 방법으로 수행할 수 있다. 외부 유전자를 세포내로 동입시키는 수많은 기법들이 당업계(Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29: 69-92m (1985))에 알려져 있으며, 수여체 세포의 필수 발생 및 생리학적 기능을 교란시키지 않는 경우에 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 이러한 기법은 핵산이 세포에 의해 발현가능하며 바람직하기로는 유전가능하며 그것의 세포 후손에서 발현가능하도록, 핵산의 세포로의 안정적인 전이를 제공하여야 한다.
제조되는 재조합 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 환자에게 전달할 수 있다. 재조합 혈액 세포(예, 조혈 줄기 또는 전구 세포)는 바람직하기로는 정맥내 투여된다. 이용되는 세포의 함량은 원하는 효과, 환자 상태 등에 따라 결정되며, 당업자가 결정할 수 있다.
유전자 치료 목적으로 핵산이 도입될 수 있는 세포는, 임의의 적절하며 이용가능한 세포 유형을 포함하며, 비제한적으로 상피 세포, 내피 세포, 각질 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간 세포, T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식 세포, 중성구, 호산구, 거대핵세포, 과립구와 같은 혈액 세포, 다양한 줄기 또는 전구 세포, 특히 예컨대 골수, 제대혈, 말초 혈액, 태아 간 등에서 수득되는 조혈 줄기 또는 전구 세포가 있다.
일 예에서, 유전자 요법에 사용되는 세포는 환자의 자가 조직이다. 본 발명에 다른 항체를 코딩하는 핵산 서열을 세포 또는 그것의 자손에서 발현가능하도록 세포내로 도입한 다음, 재조합 세포를 치료학적 작용을 위해 생체내로 투여한다. 특정 예에서, 줄기 세포 또는 전구 세포를 사용한다. 시험관내에서 분리 및 유지시킬 수 있는 임의의 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 본 발명의 구현예에 따라 사용가능할 수 있다(PCT 공개공보 WO 94/08598; Stemple and Anderson, Cell 71: 973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); Pittelkow and Scott, Mayo Clinic Proc. 61: 771 (1986)).
도 1은 항-IL13 단일클론 항체의 인간 IL13과의 결합성을 나타낸 것이다.
도 2는 항-IL13 단일클론 항체 돌연변이 IL13-Fc의 결합성을 나타낸 것이다.
도 3은 MAb 228B/C-1의 MAb JES10-5A2 (Pharmingen)에 의한 인간 IL13 결합 저해기 있음을 예시한 것이다.
도 4는 호지킨 림프종 L-1236 세포의 증식에 대한 항-IL13 단일클론 항체의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 인간 단핵구에서의 IL13-유발성 CD14 발현 억제에 대한 항-IL13 단일클론 항체의 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 인간 단핵구에서의 IL13-유발성 CD23 발현 상향 조절에 대한 항-IL13 단일클론 항체의 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 THP-1 세포에서의 IL13-유발성 STAT6 인산화에 대한 항-IL13 단일클론 항체 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 단일클론 항체 228B/C-1의 VH 및 VL 부위의 아미노산 서열이다.
도 9는 단일클론 항체 228A-4의 VH 및 VL 부위의 아미노산 서열이다.
도 10은 단일클론 항체 227-26의 VH 및 VL 부위의 아미노산 서열이다.
도 11은 단일클론 항체 228B/C-1의 인간화를 위한 경쇄 가변부의 서열이다. 클론 B 내지 R은 VK 및 뮤라인 VH에 대한 인간 주형2로 테스트한 클론이다. HT2-NEW 및 HT2-DP27 클론은 VK 및 VH 둘다에 대해 인간 프래임워크를 이용하여 구죽되었다.
도 12는 도 11의 클론에 해당되는 중쇄 서열이다.
도 13A 내지 E는 조합 인간화된 후보물질에 대한 ELISA 프로파일을 나타낸다.
도 14A는 89 Vk/276G에 대한 ELISA 프로파일을 나타낸다.
도 14B는 구조체 115Vk/73Vh FL의 ELISA 결과이다.
도 15는 조합 라이브러리 후보물질의 서열이다.
도 16은 IL13의 결합성에 대해 키메라 후보체((228 B/C #3)와 비교하여 분석한 2가지 후보물(CL5 및 CL-13)의 경쟁적 프로파일이다. 무관한 Fab은 5I로, 경쟁 능력이 없다.
도 17은 3가지의 친화성 돌연변이된 후보물질의 서열이다.
도 18은 IL13 단백질 서열의 배열을 나타낸 것이다.
도 19는 Mab 228B/C-1의 결합 에피토프이다.
도 20은 CDR 변이체 및 그것의 서열 번호를 나타낸 것이다.
도 21은 재조합 항체 후보물질 선별을 위한 가변성 경쇄 및 가변성 중쇄 서열을 나타낸 것이다.
실시예 1:
IL13 면역원의 제조: 변이된 불활성 인간 IL13 /Fc( MT - IL13 / FC )
A. MT-IL13/Fc 발현 플라스미드의 클로닝 및 구축
아미노산 잔기 13번이 (글루탐산이 라이신으로) 변이된 인간 IL13이 동급으로 또는 보다 증가된 친화력으로 IL13Rα1에 결합하지만, IL13Rα1을 가진 세포를 활성화시키는 능력은 없어지는 것으로 보고되었다(Thompson et al., J. Biol. Chem., 274:29944(1999)). 이러한 변이된 불활성의 IL13은 MT-IL13이라 하며, 인간 배아 신장 세포 293-T에서 발현시켰다. 정제한 재조합 단백질을 본 발명에서 면역원으로 사용하여 항-IL13 단일클론 항체를 제조하였다. 2종의 올리고뉴클레오 티드 프라이머는 다음과 같다:
(서열번호 9)
aagctttccc caggccctgt gcctccctct acagccctca ggaagctcat
(서열번호 10)
ctcgaggttg aaccgtccct cgcgaaaaag
MT-IL13 유전자의 올리고뉴클레오티드 서열에 대응되는 부분을 합성하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 주형으로 사용함으로써, 인간 정소 cDNA 라이브러리(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)로부터 IL13 유전자를 클로닝하였다. IL13의 예정된 신호 펩티드 서열이 없는 PCR 절편(342 bp)를, 5' 말단에 분비 신포 펩티드 서열과 3' 말단에 인간 Fcγ1(힌지 및 불변부 CH2 및 CH3) 서열을 포함하는 pSecTag/FRT 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)와 연결하였다. 구조체의 구성은 서열분석으로 검증하였다.
B. 형질감염된 293T 세포로부터 MT-IL13 제조
MT-IL13/Fc의 일시적 발현을 위해, 정제한 플라스미드 DNA를 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)으로 293T 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 경과 시점에, 형질감염된 세포의 배양 상등액을 정제하기 위해 수집하였다. MT-IL13/Fc의 안정적인 발현을 위해, 배양 상등액을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 이동시켜, 마우스 항-인간 IgG(Fc) 단일클론 항체(Sigma, St. Louis, MO) 또는 다클론성 염소 항-IL13 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)에 접합시킨 호르세라디시 페록시다제(HRP)를 이용한 반응으로 검출시키고, 이후 HRP-당나귀 항-염소 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)로 측정하였다. 면역반응성 단백질은 강화 화학-발광 검정(Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 필름상에서 확인하였다.
C. MT-IL13/Fc의 정제
MT-IL13/Fc를 PBS(phosphate-buffered saline)로 평형화한 하이퍼-D 단백질 A 친화성 컬럼으로 정제하였다. 세포 배양물의 상등액을 컬럼에 주입한 다음, 컬럼 부피의 20배 이상의 PBS로 수지를 세정하였다. 이후 수지를 SCC 완충액(0.05 M 소듐 시트레이트, 0.5 M 소듐 클로라이드, pH 6.0)로 세정하여 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 이후 IL13 융합 단백질을 용출시키고(0.05 M 소듐 시트레이트, 0.15 M 소듐 클로라이드, pH 3.0), PBS로 투석하였다.
MT-IL13/Fc를 포함하는 친화성 컬럼으로부터 수득한 분획은 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질의 순도는 코마시 블루 염색으로 분석하였고, 염소 항-인간 IgG(Fc) 항체(Sigma) 및 염소 항-인간 IL13 항체(R&D Systems)를 사용하여 전술한 바와 같이 웨스턴 블롯팅으로 단백질을 확인하였다.
실시예 2:
항- IL13 단일클론 항체의 제조
8-12주령의 웅성 A/J 마우스(Harlan, Indianapolis, IN)에 pH 7.4의 PBS 200 ㎕중의 완전 플레운드 보강제(Difco Laboratories, Detroit, MI)와 20 ㎍의 MT- IL13/Fc을 피하 주사하였다. 2주 간격으로 마우스에 완전 플레운드 보강제내 20 ㎍의 MT-IL13/Fc을 2회 피하 주사하였다. 2주후, 마우스를 죽이기 3일 전에, 마우스에게 다시 PBS 중의 동일 면역원 20 ㎍을 복막내 주사하였다. 비장 세포를 항원으로 면역화된 하나 이상의 마우스로부터 분리하여, 용합에 사용하였다. 또한 면역원으로서 E. coli에서 발현시킨 인간 IL13(R&D Systems)을 이용하여 동일한 면역화 및 융합 과정을 수행하였다.
항-IL13 MAb 228B/C-1을 제조하는 융합에서, 2 마리의 면역된 마우스로부터 분리한 26.4 x 106 비장 세포 및 58.8 x 106 비장 세포를 조합하였다. 각 융합에서, 면역 마우스의 비장으로부터 단일 세포 현탁물을 준비하였고, Sp2/0 골수 세포와 함께 융합에 사용하였다. Sp2/0와 비장 세포는 50% 폴리에틸렌 글리콜(M.W. 1450)(Kodak, Rochester, NY)과 5% 디메틸설폭사이드(Sigma)를 포함하는 매질내에서 1:1의 비율로 융합하였다. 이후 세포는 10% 소배아 혈청 10 unit/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖, 0.1 mM 하이폭산틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 10 μM 티미딘이 보충된 DMEM 배지(Invitrogen, CA)중에서, 250 ㎕ 현탁액 당 1.5 x 105 비장세포의 농도로 조절하였다. 250 ㎕를 50개의 96웰 미세배양판의 각 웰에 두었다. 약 하루후, 배양 상등액을 회수하여 ELISA로 MT-IL13/Fc를 이용한 반응성을 스크리닝하였다.
정제한 MT-IL13/Fc(0.1 ㎍/㎖)을 첨가하여 Immulon 2(Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) 마이크로테스트 플레이트의 웰을 실온에서 하룻밤동 안 코팅하였다. 코팅액은 플레이트를 가볍게 쳐서 제거하고, 비특이적 부위를 차단하기 위해 1시간동안 각 웰에 200 ㎕의 블록팅/희석 완충액(2% 소 혈청 알부민 및 0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS)을 첨가하였다. 1시간 후, 웰을 PBST 완충액(0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS)로 세척하였다. 50 ㎕의 배양 상등액을 각 융합 세포에서 수집하고, 50 ㎕의 블록킹/희석 완충액과 혼합한 다음 마이크로테스트 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 1시간 배양한 후, 웰을 PBST로 세척하였다. 결합한 뮤라인 항체는 이후 블록킹/희석 완충액으로 1:2,000으로 희석시킨 HRP-접합 염소 항-마우스 IgG(Fc 특이적)(Jackson immunoResearch Lab, West Grove, PA)과 반응시켜 검출하였다. 0.1 % 3,3,5,5 테트라메틸 벤지딘(Sigma, St. Louis, MO)과 0.003% 하이드로겐 페록사이드(Sigma)를 포함하는 페록시다제 기질 용액을 30분간 발색을 위해 웰에 첨가하였다. 반응은 각 웰에 50 ㎕의 2M H2SO4를 첨가하여 종결지었다. 반응 혼합물의 OD450을 BioTek ELISA 리더(BioTek Instruments, Winooski, VM)로 측정하였다.
MT-IL13/Fc 스크리닝의 양성 웰로부터 수득한 배양 상등액으로 관련성 없는 Fγ1 융합 단백질과의 음성적인 결합에 대해 테스트하였다. 제한 희석에 의한 단일 세포 클로닝을 수행하기 위해 최종 양성 웰을 선별하였다. 단일클론 항체의 배양 상등액을 재테스트하여, ELISA로 그것의 반응성을 검증하였다. 선별한 하이브리도마를 교반 플라스크(spinner flask)에서 배양하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 항체를 정제하기 위해 배양 상등액을 수집하였다.
정제한 항체는 4가지 분석으로 테스트하였다: i) MT-IL13/Fc를 발현하는 293T 세포와 마우스 IL13을 발현하는 E. coli를 이용한 교차 반응성, ii) HDLM-2 및 L-1236 세포에서 IL13-자가 분비 증식 저해, iii) THP-1 세포에서의 IL13 유발성 STAT6 인산화 저해, 및 iv) IL13-조절성 CD14 및 CD23의 인간 단핵구에서의 발현 저해.
MT-IL13/Fc와 IL13 면역화된 마우스로 수행한 융합으로부터 73개의 항-IL13 MAb를 수득하였다. 이들 MAb 39개는 ELISA로 특징화 및 세포성 분석을 위해 정제하였다. 이들 MAb 39개중 13개는 HDLM-2 및 L-1236세포의 자가분비 IL13-유발성 증식을 저해하였다(분석 설명 및 결과는 실시예 5에서 참조). 4개의 MAb는 ELISA에서 인간 IL13과 매우 강하게 반응하며, 기능적 세포 분석에서 인간 IL13을 중화시키는 것으로 확인되었다. 이들 MAbs는 228B/C-1,228A-4, 227-26, 및 227-43으로 기재한다. 이들 항체는 모두 면역원으로서 당화된 MT-IL13/Fc를 이용하여 제조하였다.
실시예 3:
ELISA 에서의 인간 및 마우스 IL13 과 항- IL13 단일클론 항체의 반응성.
ELISA로 다양한 항-IL13 단일클론 항체의 반응성을 테스트하였다. 96웰 마이크로테스트 플레이트의 각각의 웰에 E. coli에서 발현시킨 비당화 인간 IL13(R&D Systems), 293T세포에서 발현된 당화 MT-IL13/Fc 또는 E. coli에서 발현된 마우스 IL13(R&D Systems)을, PBS 중의 0.1 ㎍/㎖ 농도의 IL13을 100 ㎕ 첨가하여, 코딩하였다. 실온에서 하룻밤동안 배양한 다음, 웰에 PBSTB(2% BSA를 포함하는 PBST)를 처리하여 남아있는 결합 부분을 포화시켰다. 이후 웰을 PBST로 세척하였다.
2배속으로 연속 희석시킨 100 ㎕의 항-IL13 MAb(0.5 ㎍/㎖(3.33 nM)) 내지 0.05 ng/㎖(0.00033 nM))을 실온에서 1시간동안 웰에 첨가하였다. JES-5A2(BD Biosciences-Pharmingen, San Diego, CA)으로부터 수득한 항-IL13 MAb를 양성 대조군으로 테스트하였다. 상기 항체는 면역원으로서 인간 IL13을 발현하는 E. coli를 이용하여 제조된 것이다. 이소타입 일치되는 마우스 항-HIV-1 gp120 MAb를 무관한 음성 대조군으로 사용하였다. 이후, 웰을 PBST로 세척하였다. 결합한 항체는 희석한 HRP-염소 항-마우스 IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch)와 함께 실온에서 1시간 반응시켜, 검출하였다. 이후 전술한 바와 같이 발색을 위해 페록시다제 기질 용액을 첨가하였다. ELISA 리더로 OD450을 측정하였다.
도 1은 항-IL13 MAb 228B/C-1, 228A-4, 227-26, 227- 43 및 음성 대조군의 ELISA에서의 용량 의존적 결합성을 나타낸 것이다. 이들 Mac들 중에서, 228B/C-1가 가장 강력한 반응성을 보였다. 도 2는 항-IL13 MAb 내지 MT-IL13/Fc의 ELISA에서의 용량 의존적 결합성을 나타낸 것이다. 228B/C-1와 228A-4가 MT-IL13/Fc와 가장 강력한 반응성을 보였으며, 227-26과 227-43은 중간정도의 반응성을 보였다.
도 1 및 2는 테스트한 항-IL13 MAb 모두들 중에서 228B/C-1이 당화 및 비당화 인간 IL13 모두에 대하여 최고의 친화성을 가짐을 나타낸 것이다. 이들 항-IL13 MAb 모두 ELISA 에서 마우스 IL13과 교차 반응하지 않았다(데이타 미첨부).
실시예 4:
JES10 -5A2에 의한 228B/C-1- Hrp 의 인간 IL13 에 대한 결합에 있어서 경쟁 결핍
JES10-5A2와 228B/C-1가 인간 IL13상의 동일한 에피토프에 결합하는지를 확인하기 위해, 경쟁적 ELISA로 E. coli에서 발현된 인간 IL13에 결합하는 228B/C-1-HRP에 대한 JES10-5A2 효과를 시험하였다. 96웰 마이크로테스트 플레이트 각 웰에 PBS 중의 0.1 ㎍/㎖의 농도로 IL13 단백질 100 ㎕을 넣어 두었다. 실온에서 하룻밤동안 둔 후, 웰에 PBSTB(2% BSA를 포함하는 PBST)를 처리하여 남아있는 결합 부위를 포화시켰다. 이후 웰을 PBST로 세척하였다. 2배속으로 연속 희석한 228B/C-1 및 JES10-5A2 50 ㎕(최종 농도 20 ㎍/㎖ 내지 9.76 ng/㎖)을 미리 적정한 228B/C-1-HRP(1: 6,400 희석) 50 ㎕과 혼합하였다. 이후 혼합물을 웰에 넣고, 실온에서 1시간 두었다. 페록시다제 기질 용액을 전술한 바와 같이 발색을 위해 첨가하였다. ELISA 리더로 OD450을 측정하였다.
도 3은 JES10-5A2가 228B/C-1-HRP의 인간 IL13에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않음을 나타낸 것으로, 인간 IL13상의 다른 부위에 228B/C-1과 JES10-5A2가 결합함을 시사한다.
실시예 5:
L-1236 및 HDLM -2 세포를 이용한 IL -13 자가분비 의존적 증식 분석에 의한 항- IL13 중화성 단일클론 항체 스크리닝
L-1236과 HDLM-2 세포는 독일 미생물 콜렉션 및 세포 배양물(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; DSMZ, Braunschweig, Germany) 로부터 수득하였다. 이들 세포주는 자가분비 양상으로 그것의 세포 증식을 활성화시키는 IL13을 생산한다(Kapp U et. al., J. Exp. Med. 189: 1939 (1999)).
세포를 여러가지 항-IL13 MAb(0.2, 0.02, 0.002 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재하에 3-5일간 5% 이산화탄소, 37 ℃에서 배양하였다(25,000 세포/웰). 이후 테트라졸륨 화합물 MTS(Promega, Madison, WI)(OD490에서 판독)을 이용함으로써, 또는 3H-티미딘(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)의 병합에 의해, 세포 증식을 측정하였다.
항-IL13 중화 MAb를 이러한 세포주 배양물에 첨가하면, 상기 세포에서 생산된 IL13의 결합 및 불활성화에 의해 그것의 증식을 저해하는 것으로 예상되었다. 도 4에 나타낸 결과는 본 발명의 항-IL13 MAb의 L01235 세포 증식에 대한 효과를 나타낸다. MAb 228B/C-1은 테스트한 중화 항체들 중에서 용량 의존적 방식으로 L-1236 세포의 증식을 저해하는 최대 효능을 나타낸다. TA1-37(면역원으로서 E. coli에서 발현시킨 인간 IL13 을 이용하여 제조된 항-IL13 MAb)은 0.2 ㎍/㎖의 고농도에서도 어떠한 저해 활성을 나타내지 않는다. HDLM-2 세포에서 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 6:
원시 인간 단핵구에서 IL13 - 조절성 CD14 및 CD23 의 발현 분석
IL13은 인간 단핵구에서의 CD13 발현 억제와 CD23 발현의 상향 조절을 유발한다(de Waal Malefyt et al., J. Immunol., 151: 6370 (1993), Chomarat et al., Int. Rev. Immunol., 17:1(1998)). Histopaque- 1077 (Sigma)에서 밀도 구배 원심 분리로 건강한 인간 공여체의 금방 채혈한 헤파린 처리한 전 혈액으로부터 말초 혈액 백혈구(PBL)를 분리하였다. 5% 소태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지(Invitrogen)에 현탁한 PBL(1.5 x 106)을 재조합 IL13(최종 10 ng/㎖ = 0.813 nM) 및 항-IL13 단일클론 항체 또는 무관한 항체(3배수 연속 희석물 최종 12 ㎍/㎖ = 80 nM로부터)를 포함하는 96웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 인간 IL13 0.813 nM을 배양중인 배지에 첨가함으로써, 단핵구에서의 CD14 발현 또는 CD23 발현이 각각 억제 또는 상향 조절되었다. 배지 대조군은 재조합 IL13 무첨가 RPMI-1640/FBS 배지이다.
세포를 2일간 5% 이산화탄소, 37 ℃에서 배양하였다. 세포를 회수하여 항-CD14-FITC 또는 항-CD23-PE(BD Biosciences-Pharmingen)으로 염색하였다. 단핵구 집락에서 CD14와 CD23의 발현 수준을 유세포 측정기로 측정하였고, 평균 형광 밀도(MFI)로 나타내었다.
인간 단핵구의 IL13-억제성 CD14 발현에 대한 항-IL13 MAb 효과는 도 5에 나타낸다. 테스트한 모든 항-IL13 MAb중에서, 228B/C-1가 IL13의 CD14 발현 억제 효과면에서 가장 우수하였다. IL13 효과의 완전한 저해는 0.33 nM에서 이루어졌다. MAb 227-26 및 228A-4의 저해 활성은 중간 정도였으며, JES10-5A2은 약하였다. IL13 효과는 80 nM에서도 JES10-5A2에 의해 완전하게 저해할 수 없었다.
인간 단핵구의 IL13-유발성 CD23 상향-조절에 대한 항-IL13 MAb 효과는 도 6 에 나타낸다. CD14 발현 결과(도 5)와 유사하게, 테스트한 항-IL13 Mab들 중에서 228B/C-1가 IL13의 CD23 발현 억제 효과면에서 가장 우수하였다. 228B/C-1에 의한 완전한 저해는 0.33 nM에서 이루어졌다. JES10-5A2의 저해 효과는 약하였다.
도 5 및 6의 결과를 토대로, 228B/C-1에 의한 IL13의 완전한 저해는 1:2(MAb: IL13)의 몰 화학량 비율에서 이루어질 수 있으며, 따라서 228B/C-1는 인간 IL13에 대한 매우 높은 친화성 중화 MAb이다.
실시예 7:
THP -1 세포에서의 IL13 유발성 STAT6 인산화 분석
IL13은 골수 세포주 THP-1(ATCC, MANASSAS, VA)를 활성화시켜 IL13의 신호 전달 경로에 중요한 단계인 STAT6의 인산화를 유도할 수 있다(Murata T et al., Int. Immunol. 10: 1103-1110(1998)). 본 분석에서는 IL13 저해에 대해 항-IL13을 테스트하였다.
THP-1 세포를 5% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Invitrogen)에서 유지시켰다. 실험일에, 세포를 세척하여 혈청 무첨가 DMEM에서 2시간동안 37 ℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 혈청 무첨가 배지 80 ㎕중의 0.3 x 106 세포를 96웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 인간 IL13(최종 농도 10 ng/㎖ = 0.813 nM)와 항-IL13 MAb(최종 농도 0.5 ㎍/㎖ = 3.333 nM에서 부터 5 배수 연속 희석물)을 포함하는 배지 120 ㎕. 음성 대조군 웰은 IL13 또는 IL13 및 이소타입이 같은 무관한 마우스 Mab를 포함한다.
혼합물을 10분간 37 ℃, 5% 이산화탄소 조건하에 두었다. 이후 플레이트는 4 ℃, 300 xg로 원심분리하였다. 상등액을 버린 후, 세포 펠렛은 라밀 비환원성 샘플 완충액(SDS-PAGE 로딩 완충액, BioRad, CA) 100 ㎕에 현탁하고 미세원심분리 튜브로 옮겼다. 이 튜브를 5분간 95 ℃에서 열처리한 다음 실온에서 10분간 10,000 xg로 원심분리하였다. 상층액을 모아 4-20% 구배의 SDS-PAGE로 분석하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이동시키고, 희석한 마우스 항-인간 STAT6(Y641, phospho-specific) MAb (BD Bioscienses Pharmingen)와 반응시켰다.
결합한 항체는 HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG(Fc) 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)로 검출하였다. 면역반응성 단백질은 강화된 화학발광 검출법(Supersignal West Pico Substrate, Pierce)으로 막에서 식별하였다. 도 7은 THP-1 세포에서의 항-IL13 MAb의 IL13 유발성 인산화 효과 결과를 나타낸 것이다. Stat6는 0.813 nM읜 인간 IL13으로 처리된 THP-1 세포에서 인산화된다. 세포를 MAbs 228B/C-1, 228A-4, 227-26, 227-43 및 JES10-5A2로 처리하였을때, Stat6 인산화의 농도 의존적인 저해가 확인되었다. 테스트한 항-IL13 MAb중에서 가장 강력한 중화 항체는 MAb 228B/C-1이다. 228B/C-1에 의한 완전한 저해는 0.667 nM 내지 0.133 nM 농도에서 이루어졌다. 완전하 저해를 위한 228B/C-1와 IL13의 화학적 몰 비는 약 1:2였다. 이는 도 5 및 6의 결과에 부합된다.
실시예 8:
항- IL13 단일클론 항체를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 유전자의 분자 클로닝
QIAGEN 키트(Valencia, CA)를 이용하여 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 이후 다음과 같이 역전사(제1 가닥 cDNA) 반응을 수행하였다: 1-1.5 mg의 총 RNA를 1 ㎖ 10 mM dNTP, 50 ng 랜덤 헥사머 및 최종 부피 12 ㎖의 RNA가 없는 물과 혼합하였다.
반응 혼합물은 5분간 65 ℃에 둔 다음 바로 1분간 얼음위에 두었다. 간단한 원심분리를 수행한 후, 4 ㎖의 5X 제1가닥 완충액(250 mM Tris-HCI, pH 8.3, 375 mM KCI, 15 mM MgCl2), 2 ㎖의 0.1 mM DTT, 및 1 ㎖의 RNaseOUT RNase 저해제(40 U/㎖)을 첨가하였다. 혼합 후, 반응물을 2분간 실온에서 두었다. 여기에 Superscript II RT(50 U/㎖) 1 ㎖를 첨가하여 10분간 25 ℃에서 반응 시킨 다음 42 ℃에서 50분간 두었다. 간단한 원심분리를 수행한 후, 반응물을 15분간 70 ℃에 두어 역전사효소를 불활화하였다. 이후 1 ㎕의 RNase H(2 U/㎖)을 첨가하였고 반응물은 20분간 37 ℃에 두어 RNA를 파괴하였다.
중쇄 및 경쇄의 가변부를 증폭시키기 위해, O'Brien 및 Jones(O'Brien S. and Jones T., "Humanizing antibodies by CDR grafting", Antibody Enginerring, Springer Lab manual, Eds. Kontermann and Duble, S(2001))에 개시된 방법을 이용하였다. 즉, 신호 펩티드 부위(경쇄의 경우 11세트, 중쇄의 경우 축중 프라이머 12 세트)로부터 5' 프라이머를 선별하였고, 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나의 불변부에서 3' 프라이머를 선택하였다. 5' 및 3' 프라이머(10 mM의 1.5 ㎖)를 5 ㎖의 PCR 완충액(250 mM Tris-HCI, pH 8.8, 20 mM MgSO4, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 1% Triton X-100, 1 mg/㎖ nuclease free BSA), 상기와 같이 준비한 1 ㎖의 cDNA, 1 ㎖의 Turbo pfu(Stratagene) 및 총 50 ㎖의 반응 부피의 잔량의 물을 혼합하였다. PCR은, 95 ℃에서 4분간 1회, 94 ℃에서 30초, 53 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 45초로 이루어진 반응 25회, 그리고 72 ℃에서 7분간 1회로 수행하였다. 반응 혼합물은 1 % 아가로스 젤에서 전기영동하여 분석하였다.
증폭된 DNA 절편을 정제하여 pcDNA3.1 벡터에 클로닝하였다. 클로닝은 제조사의 제안 프로토콜에 따라 인비트로젠사의 TOPO 클로닝 키트로 수행하였다. 15 내지 20개의 E. coli 형질전환 클론을 플라스미드 정제에 사용하였다. 플라스미드는 T7 프라이머로 서열분석하였다. 중쇄 및 경쇄에 있어서 선호적인 서열은 혼성화 돌연변이 유발에 의해 M13 Fab 발현 벡터에 클로닝하였다(Glaser S. et al. Antibody Engineering(Oxford University Press, New York(1995); Near RI, BioTechniques 12: 88(1992)). 발현된 Fab의 결합 특성은 ELISA로 검증하였다. 도 8-10은 228B/C, 228A-4, 및 227-26 각각에 대한 VH 및 VL 체인의 아미노산 서열이다.
실시예 9:
클론 228B/C의 인간화
A. 일반적인 프로토콜
도 8에 나타낸 바와 같이, 뮤라인 항체 228B/C의 여러 부위를 클로닝 및 서열 분석하였다. 파지 벡터내 키메라 Fab를 뮤라인 228B/C의 가변부 및 인간 카파 체인과 인간 IgG의 CH1 부분의 불변부를 포함하는 대조군으로서 구축하였다.
인간화 프로토콜을 개시하기 위해, 공지된 인간 생식 세포주의 유전자 서열 에서 적합한 v 유전자 서열을 선별하여, 프래임워크 부위 1 내지 3(FM1-FM3)로 제공하였고, W004/070010에 개시된 기준에 따라 적합한 J 유전자 서열을 선별하여 프래임워크4(FM4)로 제공하였다. 주형은 그것의 상대적인 총 길이, CDR 크기, 프래임워크와 CDR 사이의 정션(junction)에 위치된 아미노산 잔기, 전반적인 상동성 등을 토대로 선택하였다. 주형은 하나의 서열이 아닌 혼합일 수 있거나, 보존 주형일 수 있다.
중쇄 및/또는 경쇄 변이체를 포함하는 발현 벡터 구축은 하기 식을 포함한다:
FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4(i) 및
FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRHL3-CDRL3-FRHL4(ii),
상기 식에서, FRH1, FRH2, FRH3, FRH4, FRL1, FRL2, FRL3 및 FRL4는 생식세포 주형으로부터 선택된 프래임워크 주형 중쇄 및 경쇄 서열의 변이체이며, CDR은 모 항체의 것을 나타낸다. 뮤라인 모 항체와 선별한 인간 주형 서열간의 차이를 확인하여 항체 Fab의 라이브러리 제조에 토대로서 제공되었다. 상기 라이브러리는 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 또는 동시에 제조할 수 있다. CDR 부위의 친화력 성숙(Affinity maturation) 역시 프래임워크의 인간화와 동시에 또는 순차적으로 분석될 수 있다.
변이체 Fab 라이브러리는 뮤라인 프래임워크 서열과 상이한 것으로 확인된 각 선택 위치에서. (1) 뮤라인 아미노산 잔기, (2) 선택한 인간 생식세포 유전자로부터 유래된 아미노산 잔기, 또는 선택적으로 (3) 무작위로 선택된 아미노산을 포 함하도록 제조하였다. 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 다음 원하는 프래임워크 위치에 선택한 잔기를 넣어, 원하는 변이체를 제조하였다. 어닐링된 산물은 하나가 비오틴으로 표지된 두개의 프라이머로 증폭시켰다. 비오틴 텍은 단일 가닥 프라이머의 정제에 사용하였고, U-주형 포맷에서 원하는 벡터를 이용한 쿤켈계 돌연변이유발 반응에서 돌연변이유발 올리고로서 사용하였다(Rosok, M. J., et al., (1996) Journal of Biological Chemistry 271: 22611-22618). 어닐링 및 플라스미드 연장 이후에, 고유 제한 효소 Xbal로 절단 반응을 수행하였으며, Xbal은 신규 합성된 변이 가닥이 아닌 최초 주형을 절단한다. 플라스미드는 증폭시키기 위해 컴피턴트 세포로 전기충격으로 도입시키고, 파지 입자 형성을 위해 파지-컴피턴트 E. coli 타입과 혼합하였다. 플라스미드 구조체는 상등액으로 분리되는 Fab를 합성할 수 있다. 각 플라그를 선택하였고, 분석하기 위해 항체를 분리하였다.
라이브러리의 특성 및 충실성(completeness)을 분석하였다.
라이브러리의 무작위 샘플링 서열분석으로, Vk(또는 Vh)가 바르게 삽입된 선별 후보물의 갯수를 측정하였다. 이 수치를 이용하여 라이브러리의 전체 유효성을 판단하였다. 일단 ㄹ하이브러리를 확립하고, 후보물질을 기능적 ELISA를 기본으로한 분석으로 스크리닝을 수행하여, 후보물이 IL-13에 특이적인 기능적 Fab를 생산하는 지를 결정하였다. 키메라 클론에 상응하게 IL-13에 대한 활성을 나타내는 후보물은 이후 재생산성을 분석하였다. 수개의 후보물을 서열 분석하여 표적화된 프래임워크 위치가 인간화에 얼마나 허용적인지를 측정하였다.
대표적인 라이브러리를 확인한 후, 변이체의 결합 친화성을 분석하였고, 키 메라 조절 항체에 상응하는 또는 보다 높은 친화력을 가지는 것으로 확인된 변이체의 서열을 분석하였다. 분석한 분리물에 프래임워크내 선택한 위치에서 인간 생식 세포 유전자 유래 잔기가 포함되어 있지 않다면, 이는 인간 아미노산 잔기가 상기 위치에서 허용적이지 않는 것으로 결론지었다. 이때, 뮤라인 및 인간 아미노산만을 테스트한 경우, 다른 Fab 라이브로리에서는 인간 주형 잔기가 발견되지 않는 위치에서 아미노산을 무작위화할 수 있다. 적정 치환 잔기(뮤라인 제외)를 가지는 Fab를 이후 선별하여 총 Mab로 변환시켰다. 또한, 보존 주형을 출발 프래임원크로서 사용할 수 있다.
B. IL-13 단일클론 항체 Vk 인간화
경쇄의 가변부(Vk)의 인간화를 먼저 수행하였다. 그러나, 어느 한 쇄만으로 시작할 수 있거나 두개의 쇄를 동시에 인간화할 수 있다. 선택한 인긴 주형은 인간 주형2이며, 기능적인 활성이 소실되지 않은 상태로 인간화될 수 있는지를 결정하기 위해 경쇄내 CDR에 근접한 9개의 잔기에 대한 영향을 연구하였다. 2차 스크리닝에서 경쇄에 대한 연구를 수행한 위치는 4, 9, 12, 73, 81, 82, 83, 84 및 109이다.
뮤라인 또는 인간 주형 잔기 중 어느 하나를 가지는 이들 각 위치를 달리하면서, 라이브러리를 제조하였다. 약 860개의 변이체를 기능적 ELISA 분석으로 스크리닝하였다. 18개의 후보물질에서만 키메라 클론과 유사한 기능이 확인되었다. 이들 후보물을 더욱 분석하였다. 상기 18개 중에서 6개의 후보물이 키메라 클론과 비슷한 항원에 대한 증가된 친화력을 나타내었으며, 이들 6개의 서열을 분석하였 다. 서열분석 결과는 도 11A 및 B에 나타나 있으며, 이들 결과로부터 위치 4, 12 및 81은 뮤라인 잔기에 호의적이다.
C. Vh 인간화
중쇄 프래임워크 잔기의 후보 항체의 전체 기능에 대한 기여도를 평가하기 위해, 뮤라인 모체와는 상이한 인간 DP27 주형 프래임내의 10곳의 위치를 달라지지만 뮤라인 경쇄는 유지되는 라이브러리를 확립하였다. 라이브러리는 Vh에 대한 합성한 중첩성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제조하였고, PCR로 뮤라인 Vk를 제조하였다. 이후 Vk와 Vh를 돌연변이유발 방법으로 Fab 발현 벡터에 삽입하였고, 이후 기능적 Fab에 대해 라이브러리를 스크리닝하였다. 라이브러리의 복잡성(complexity)은 (210/70%) x 3 = 3840이었다.
96웰 포맷의 ELISA 분석으로 총 1056개의 후보물질을 스크리닝하였다. 서열 분석을 위해 선택된 라이브러리로부터 수득한 후보물질은 스크리닝 결과에서 최대 값을 산출하는 것이었다. 5개의 고활성 후보물질의 서열을 분석하여 그것의 인간화 정도를 결정하였고, 그것의 서열을 도 12A 및 B에 나타내었다. 이러한 결과들로부터, 중쇄상의 3개의 프래임워크 잔기가 뮤라인 잔기(#24, 68 및 94)에 호의적이었다.
인간 주형 NEW로 제2 프래임워크 연구를 수행하였다. Vk 및 Vh 둘다 동시에 인간화된 조합 라이브러리를 제조하였다. Vk상의 9개의 잔기는 뮤라인 잔기 내지 인간 잔기로 다양하였으며, 또한 Vh에 대해 9개의 잔기를 선택하였다. 약 5200개 의 후보물질(55개의 96웰 플레이트)를 라이브러리로부터 스크리닝하였다. 스크리닝으로, 약 300개의 후보물질은 키메라 클론과 유사한 결과를 나타내었다. 이러한 군으로부터 30개의 후보물질의 서열을 분석하여, 이들 기능적 클론의 인간화 정도를 결정하였다.
도 11A과 B에 경쇄의 서열분석 결과를 나타낸다. 중쇄의 서열은 도 12A과 B에 나타나있다. Vk상의 83 위치는 뮤라인 잔기를 높은 빈도로 유지하였지만, Vh 주형내 몇몇 위치는 뮤라인 잔기에 호의적이었다. 특히, 스캐닝한 30개의 후보물질들중 29개에서, 위치 94에서 뮤라인 잔기가 유지되었다. 후보물질이 완전하게 인간화된 프래임워크를 가지는 것이 나타나진 않았지만, Vk 또는 Vh중 어느 하나에서 고도로 인간화된 수개의 가변부는 추가적인 인간화에 사용될 것이다. 가장 인간화된 Vk를 가장 인간화된 Vh와 조합하여 기능적 활성을 분석하였다(도 13).
원하는 Vk 및 Vh의 프래임워크 잔기를 조합한 제2 라이브러리를, 중쇄 주형으로서 DP27을, 경쇄 주형으로서 HT2를 이용하여 제조하였다. 전술한 바와 같이, 문제의 각 위치에 인간 또는 뮤라인 잔기 중 어느 하나와 인간 프래임워크를 함유한 중첩성 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이들 올리고들을 혼합한 다음 어닐링하여 완전한 가변부를 제조하였다. 상기 부분은 PCR로 증폭시켜 단일 가닥 절편으로 만들었다. 절편을 인산화한 다음 돌연변이 유발 반응에 사용하여 가변부를 M13성 벡터에 병합하였다. 이후 ELISA를 기초로한 분석에서 IL13에 특이적인 기능적 Fab에 대해 라이브러리를 스크리닝하였다. 경쇄 및 중쇄의 서열은 각각 도 11 C&D 및 12C&D에 기재되어 있다.
서열분석 결과로부터, Vk 쇄는 인간 잔기를 완전히 허용할 수 있었으며, 따라서 상기 쇄는 완전하게 인간화되었다. 중쇄의 경우, 2곳이 인간 잔기에 비허용적이었다: 24 및 94 위치. 따라서, 중쇄 가변부는 98% 인간화되었다.
D. 인간화된 조합 후보물질의 제조
양 라이브러리의 스크리닝으로 포착한 후보물질은 충분히 인간화되어 있지 않았으므로, 인간화를 수행하였다. 적합한 인간화 정도로 수득되는 후보물질 시리즈를 제조하였다. HT2 라이브러리 유래의 가장 인간화된 Vk를 NEW 또는 DP27 라이브러리중 어느 하나로부터 수득한 가장 인간화된 Vh와 조합하였다. 이러한 조합 후보물질들은, 최상의 인간화 정도를 가지면서 특이적인 기능을 유지하는지를 측정하기 위해 분석하였다. HT-2-NEW에서 선별한 후보물질은 중쇄의 경우 HT2-NEW #73이고, 경쇄의 경우 HT2-NEW # 115이다. HT2-DP27 경쇄로부터 선별한 후보물질은 HT2-DP27 #89 및 HT2-DP27 #144이고, 중쇄에 대한 후보 물질은 HT2-DP27 #123 및 HT2-DP27 #276이다. HT2-DP27의 경우 다음과 같이 구조체를 제조하였다: #89 Vk와 #276 Vh 및 #89 Vk와 #123Vh; #144 Vk와 #276 Vh 및 #144 Vk와 #123 Vh. 또한, NEW와 DP27의 HT2 경쇄와의 상호작용 상이성 여부를 확인하기 위해, #144 Vk DP27와 #73 Vh NEW로 하나의 구조체를 제조하였다.
이러한 조합을 ELISA로 테스트하여, 추가적인 인간화에서 어떠한 기능 소실이 있는지를 판단하였다. 이러한 분석을 위해, 항원 IL-13을 제한된 함량으로 플레이트상에 포획하였다. 항-IL13 Fab를 공지 농도로 플레이트에 첨가하여 1:3의 희석 비율로 조절하였다. 결합은 Fab에 특이적인 2차 항체로 검출하였다. 도 13 은 기능적 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 13A는 115Vk/73Vh; 도 13B는 89Vk/276Vh; 도 13C는 144Vk/276Vh; 도 13D는 144Vk/123Vh; 및 도 13E는 144Vk/73Vh이다. 이러한 데이타로부터 관찰된 결과들은, 제조한 인간화된 가변부의 조합이 Fab의 항원 결합력에 해로운 영향을 미치지 않음을 나타내었다.
도 11 및 12의 결과들은 HT2 경쇄가 충분히 인간화될 수 있으며 DP27의 2곳(24 및 94)을 제외한 모든 위치가 인간화될 수 있음을 나타내므로, 단지 2개의 뮤라인 잔기가 잔존하는 이상적인 인간화된 후보물질을 제조하였다. 이러한 특정 후보물질 제조에 있어서, 클론은 그것의 모체 뿐만 아니라 다른 후보물질과 비교하여 어떠한 기능의 소실이 있는지를 측정하였다. 도 14A의 데이타로부터, 이러한 인간화된 후보물질에 현저한 기능 소실이 없으며, 인간화 정도가 높은 것으로 보인다(89 Vk/276G). 또한, HT2-NEW 프래임워크 후보물질에 대하여 인간화를 수행하였다. 중쇄에 2개의 뮤라인 잔기가 남아 있어, 상기 후보물질의 최종 인간화 정도는 98%이다. 도 14B는 상기 구조체(115Vk/73Vh FL)에 대한 ELISA 결과를 나타내고 있다.
2개의 뮤라인 잔기를 치환함으로써 89Vk/276G를 더욱 인간화하기 위한 시도를 수행하였다. 상기 위치를 인간 잔기로 변이시켜, 후보 클론을 ELISA로 분석하고 모체와 비교하였다. 그러나, 뮤라인 잔기를 선택한 주형의 것으로 치환하였을때 현저한 기능 소실이 관찰되었다. 따라서, Vh내 2곳의 위치가 이들 2곳의 위치에 모든 가능한 아미노산을 허용하도록 무작위화된, 다른 라이브러리를 제조하였다. 후보물질은 기능적 ELISA 분석으로 스크리닝하였고, 모체 클론(89Vk276G)와 유사한 결과를 산출한 30개의 후보물질의 서열을 분석하여, 어느 아미노산이 표적화된 위치에 존재하는지를 결정하였다. 후보물질 리스트와 2곳의 아미노산은 하기와 같다.
Figure 112006052313532-pct00001
따라서, 스크리닝으로, 지정된 위치에서 명백하게 허용되는 수개의 아미노산이 있었으며, 기능이 현저하게 소실되지 않았다. 따라서, 프래임워크 잔기를 뮤라인 서열 또는 인간 프래임워크 중 어디에서도 발견되지 않는 아미노산으로 바꾸어, 표적 항원 결합에 해로지 않는 충분히 기능적인 Fab를 제조하였다. 이러한 무작위 라이브러리로부터 더욱 테스트한 후보물질은 RL-19와 RL-36이었다.
실시예 10
CDR 최적화
항-IL13 항체 후보물질에 대한 최적 프래임워크 서열을 결정하여, CDR의 최적화를 수행하였다. 본 공정에서, CDR 아미노산 서열을 무작위한 다음, 모체 클론과 동일하거나 또는 보다 낮은 기능적 활성을 가지는 후보물질을 동정하기 위해 라 이브러리를 스크리닝하였다. 상기 라이브러리에서, 모체 후보물질은 RL-36이었다. 하나의 위치에 6개의 CDR을 동시에 무작위화하였고, 기능적 ELISA를 이용하여 라이브러리를 스크리닝하였다. 강력한 반응성의 후보물질을 모체 CDR과 비교하기 위해 서열분석하였다. 하기 표에 나열된 모든 고유 서열은 도 20에 나타나 있으며 서열번호로 나타내었다.
A. CDR-L1 최적화
CDR-L1은 15개의 아미노산으로 이루어져 있다. 이들 각 위치는 돌연변이 유발 반응에서 사용되어지는 동일 몰 함량으로 혼합된 합성 올리고뉴클레오티드로 무작위화하였다. 돌연변이성 올리고뉴클레오티드의 병합 효율은 40%로 확인되었다. 상기 퍼센트에서, 스크리닝이 필요한 후보물질의 수는 3600이다. 기능적 ELISA로 클론을 분석하였고 비슷한 기능적 활성을 도출하는 클론의 서열을 분석하였다. 상기 군들에서, 10개의 후보물질의 서열을 분석하여 CDR내 변이를 확인하였다. 하기 서열분석 결과로부터, 향상된 친화성을 유도하는 11 및 14번 위치는 N 또는 Q 및 M 또는 L이다.
Figure 112006052313532-pct00002
B. CDR2-L2 최적화
CDR-L2는 7개의 아미노산으로 구성되어 있다. 전술한 바와 같이 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리의 효율은 80%이며, 840개의 클론을 분석하였다. 상기 분석에서 양성 클론의 수는 75개였으며, 11개의 서열을 분석하였다. 하기 결과로부터, 위치와 치환 아미노산은 무작위인 것으로 보였지만, CDR 내부의 몇몇 위치는 활성을 향상시켰다. 이러한 결과는 CDR-L2가 항원 결합부에서 가장 멀리 떨어져 있으며, 이는 항원 결합시 최소한의 영향을 발휘한다는 관찰을 뒷받침한다.
Figure 112006052313532-pct00003
C. CDR-L3 최적화
CDR-L3는 9개의 아미노산으로 구성되어 있다. 제조한 라이브러리의 효율은 50%이며, ~1700개의 클론의 스크리닝이 필요하다. 스크리닝에서, 257개의 양성 후보물질을 동정하였고, 10개는 서열을 분석하였다. 이러한 결과에서, 단지 하나의 위치에서만 모체 서열과 달랐다. 몇몇 후보물질은 상기 위치에서의 변화가 매우 호의적임을 제시하는 동일한 서열을 보인다(N에서 A).
Figure 112006052313532-pct00004
D. CDR-H1 최적화
CDR-H1은 5개의 아미노산으로 구성되어 있다. 제조한 라이브러리의 효율은 80%이며, 약 600개의 후보물질의 스크리닝이 필요하다. 스크리닝에서, 양성 클론은 138개였고, 11개의 클론은 서열을 분석하였다. 하기 결과에서, 상기 CDR내 2번째 위치는 항원의 결합력 향상에 보다 큰 기회를 제공하는 것으로 보인다. 그러나, 몇몇 아미노산은 결합에 호의적이다.
Figure 112006052313532-pct00005
E. CDR-H2 최적화
CDR-H2는 16개의 아미노산으로 구성되어 있다. 라이브러리의 효율은 70%이며, 이는 2100개 이상의 후보물질을 스크리닝하여야 한다는 것을 의미한다. 스크리닝에서, 양성 클론은 192개였고, 13개의 클론의 서열을 분석하여 CDR내에 발생된 변이를 확인하였다. 하기 결과에서, 몇몇 위치는 결합 친화성을 향상시켰지만, 아미노산 변이는 모체와 현저하게 다르지 않았다.
Figure 112006052313532-pct00006
F. CDR-H3 최적화
CDR-H3는 10개의 아미노산으로 구성되어 있다. 일반적으로 CDR은 결합 부위의 중간에 루프가 있기 때문에 항원 결합력에 매우 큰 영향력을 주는 것으로 여겨지고 있다. 라이브러리의 효율은 40%이며, 이는 2400개의 후보물질을 스크리닝하여야 한다. 이들 중, 양성 클론은 174개였고, 10개의 서열을 분석하여 CDR내에 변이를 확인하였다. 하기 결과는 3번째 위치에 Y의 R로의 변이가 결합력 향상에 중요한 점일 수 있음을 나타낸다.
Figure 112006052313532-pct00007
G. 조합 라이브러리
항원 결합력의 전반적인 최대 향상을 나타내는 CDR내 변이가 확인되면, 최상의 후보 물질을 이들이 향상된 결합력을 변이시키는지를 확인하기 위해, 조합하였다. 따라서, 후보물질을 사용하여 모든 유리한 아미노산 치환을 조합하였다.
조합 라이브러리를 제조하기 위해, 처음 클론은 CDR-L1-59(N에서 Q로)내 변이를 병합한 것이었다. 이 클론에, CDR-L#의 경우 N을 A로(위치4), CDR-H1의 경우 Y를 R, H, K 또는 S(위치 2), CDR-H3의 경우에 Y를 R로(위치 3) 그리고 D를 K 또는 S(위치 9)로, 다른 변이를 만들었다. CDR-L2 또는 CDR-H2에는 변이시키지 않았다. 라이브로리로부터 1100개 이상의 후보물질을 기능적 ELISA 분석으로 스크리닝하였다. 모체 클론보다 활성이 우수한 총 120개의 후보물질을 동정하였다. 클론의 서열은 도 15에 나타낸다.
이들 조합 후보물질이 기능을 유지하는지를 확인하기 위해, 경쟁적 분석을 수행하였다. 상기 분석에서, IL-13을 ELISA 플레이트상에 포획시켰다. 정제된 Fab인 후보물질을 일정한 농도의 표지된 키메라 항-IL13 Fab와 여러가지 농도로 미리 혼합하였다. 이 혼합물을 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 플레이트 결합된 IL-13에 결합할 수 있는 표지된 키메라 항-IL13가 검출되었다.
상기 경쟁적 분석 결과로부터, 분석한 2개의 후보물질이 IL-13에 대한 키메라 후보물질(228B/C #3)과 경쟁하는데 있어 동급의 능력을 나타내었다(도 16). 무관한 Fab는 5I로, 경쟁적인 능력을 나타내지 않았다. 도 17은 3종의 친화력 성숙된 후보물질의 서열이다.
실시예 11
에피토프 지도 작성( Epitope Mapping )
항-IL13 Mab 228B/C-1은 입체적 에피토프(conformational epitope)에 결합하며, 시노몰로거스(cynomologous) 원숭이 IL13에 결합하고, 인간 IL13과 동일한 고친화력을 가진다. 그러나, 228B/C는 뮤라인 IL13에 결합하지 않는다. 그래서, 에피토프 지도 작성을 위한 전략은 원숭이 IL13의 일 부분을 해당 마우스 IL13 서열로 교환하는 것이다. 중첩성 올리고뉴클레오티드를 도 18에 나타낸 바와 같이 합성하였다. 2회의 PCR을 실시하여, IL13 하이브리드 구조체를 조합함으로써 원숭이 IL13 부분을 마우스 IL13의 해당 서열로 치환하였다(도 18). 최종 PCR에서 증폭시킨 IL13 코딩 부위를 TOPO 클로닝 키트(Invitrogen)을 이용하여 pcDNA3.1 벡터의 V5 텍이 있는 구조내에 클로닝하였다. 모든 PCR 증폭시킨 부위는, 발현 벡터에서 서열분석으로 적합한 도메인 스와핑 변이만을 포함하고 원하지 않는 다른 변이를 포함하지 않는 것을 확인하였다.
항-IL13 Mab 결합성 에피토프는 아미노산 #49에서 56까지의 8 mer 펩티드, ESLINVSG(서열번호 18)로 확인되었다. 이 에피토프는 인간 IL13의 나선-B 및 루프-BC에 위치한다. 시노(cyno)-IL13 유래의 에피토프 펩티드를 이용하여 뮤라인 IL13에서 해당 서열을 스와핑하였을때, 제조되는 하이브리드 IL13 분자는 초기 시노IL13의 분자와 유사한 친화력으로 228B/C에 결합할 수 있으며, 잔기 #49-56의 펩티드에서 시노 또는 인간 IL13에 228B/C MAb 결합을 더욱 검증하였다. 인간, 시노 및 뮤라인 IL13 간의 서열 비교로 인긴 IL13에서의 단지 3개의 잔기 Ile52, Val54, Gly56이 보전적이지 않은 것으로 확인되어, IL13에 중요한 잔기인 것으로 시사되었으며, 상기 8 mer 펩티드를 통한 항-IL13 MAb 상호작용은 이들 3개의 잔기들중 하나 또는 조합에 의해 결정된다.
상기 에피토프는 펩티드 스팟 분석으로 더욱 검증하였다. 전체 인간 IL13 펩티드를 셀룰로스 막상에서 SPOT를 통해 합성한 중접성 12 mer 펩티드 시리즈로 스캐닝하였다. 항-IL13 Mab 반응성 펩티드는 아미노산 #44-56의 12 mer 펩티드, YCAALESLINVS(서열번호 19)로 확인되었으며, 이는 도메인 스와핑 실험에서 확인된 부위와 중첩된다.
기탁( DEPOSIT )
하기 배양물을 미국 20110-2209, Va 마나사스 대학가 10801 미국 세포주 컬렉션(ATCC)에 기탁하였다.
Figure 112006052313532-pct00008
특허 진행 및 그 규제를 위해 국제 미생물 기탁 승인에 대한 부다페스트 조약하에 기탁하였다. 이는 기탁일로부터 30년간 살아있는 배양 상태를 유지시키는 것을 보증한다. 유기체는 부다페스트 조약하에 ATCC로부터 이용가능하며, 영구성 및 관련 미국 특허의 발동시 배양물 자손의 공적인 무제한 이용성을 보장한다.
본 발명의 양수인은 적정 조건으로 배양하였을때 기탁 배양물이 죽거나 또는 없어지거나 또는 파괴된다면 동일한 살아있는 배양물로 신속하게 교체할 것임을 동의한다. 기탁 균주의 이용가능성은 특허법에 따라 정부 권한하에 허여된 권리를 위반하여 발명을 실시하기 위한 라이센스로서 이해되지 않는다.
전술한 내용은 당업자가 본 발명을 실시하기에 충분한 것으로 간주된다. 기탁한 구체적인 예는 본 발명의 일 측면을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 기탁된 배양물에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 기능적으로 동등한 모든 배양물이 본 발명의 범위에 포함된다. 본원의 물질 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 최상의 모드를 포함한 본 발명의 모든 측면을 수행하기에 부적절하거나, 또는 표시한 특정 예시로 청구 범위를 제한하는 것으로 이해되는 것으로 입장을 표명하는 것이 아니다. 또한, 본원에서 개시되고 기재된 바와 더불어, 본 발명의 여러가지 변형은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명확해질 수 있으며, 첨부된 청구범 위내에 포함된다.
당업자는 일반적인 실험으로 본원에 기재된 본 발명의 특정 예와 동급의 다수의 내용을 인지하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동급의 내용은 아래 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> TANOX, INC. FUNG, Sek Chung SINGH, Sanjaya HUANG, Dan Moyle, Matthew LU, Mason YAN, Changning <120> Anti-IL13 Antibodies and Uses Thereof <130> TNX-1050 <150> US60/532,130 <151> 2003-12-23 <160> 152 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu 1 5 10 15 Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly 20 25 30 Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala 35 40 45 Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr 50 55 60 Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln 65 70 75 80 Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe 85 90 95 Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg 100 105 110 Phe Asn <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Xaa Leu Ile Glu 1 5 10 15 Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly 20 25 30 Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala 35 40 45 Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr 50 55 60 Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln 65 70 75 80 Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe 85 90 95 Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg 100 105 110 Phe Asn <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <220> <221> CHAIN <222> (1)..(113) <223> VARIABLE REGION OF LIGHT CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 228B/C <400> 3 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Ala <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <220> <221> CHAIN <222> (1)..(118) <223> VARIABLE REGION OF HEAVY CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 228B/C <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly His Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 118 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <220> <221> CHAIN <222> (1)..(118) <223> VARIABLE REGION OF LIGHT CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 228A-4 <400> 5 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 118 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <220> <221> CHAIN <222> (1)..(118) <223> VARIABLE REGION OF HEAVY CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 228A-4 <400> 6 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 114 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <220> <221> CHAIN <222> (1)..(114) <223> VARIABLE REGION OF LIGHT CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 227-26 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(114) <223> VARIABLE REGION OF LIGHT CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 227-26-1 <400> 7 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <220> <221> CHAIN <222> (1)..(120) <223> VARIABLE REGION OF HEAVY CHAIN OF MONOCLONAL ANTIBODY 227-26-1 <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Leu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Ala Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Phe Asn Glu Met Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Ile Phe Leu Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Forward oligonucleotide primer for a mutant IL13 sequence <400> 9 aagctttccc caggccctgt gcctccctct acagccctca ggaagctcat 50 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Reverse Oligo nucleotide primer of a mutant IL13 sequence <400> 10 ctcgaggttg aaccgtccct cgcgaaaaag 30 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Forward degenerate oligonucleotide primer for monkey IL13 <400> 11 gyyctrggcy ycatggcgct yt 22 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Reverse degenerate oligonucleotide primer for monkey IL13 <400> 12 tttcagttga accgtccyty gcgaa 25 <210> 13 <211> 399 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 13 atggcgctct tgttgaccat ggtcattgct ctcacttgcc tcggcggctt tgcctcccca 60 agccctgtgc ctccctctac agccctcaag gagctcattg aggagctggt caacatcacc 120 cagaaccaga aggccccgct ctgcaatggc agcatggtgt ggagcatcaa cctgacagct 180 ggcgtgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 240 aagacccaga ggatgctgaa cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gcagttttcc 300 agcttgcgtg tccgagacac caaaatcgag gtggcccagt ttgtaaagga cctgctcgta 360 catttaaaga aactttttcg caatggacgg ttcaactga 399 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Forward oligonucleotide primer for cynomologus monkey IL13 <400> 14 aagcttcacc atggcgctct tgttgaccat ggtc 34 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Reverse oligonucleotide primer for cynomologus monkey IL13 <400> 15 tcacaagatc tgggctcctc gaggttgaac cgtccattgc 40 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Forward oligonucleotide primer for Fc gamma1 <400> 16 ctcgaggagc ccagatcttg tga 23 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Reverse oligonucleotide primer for Fc gamma 1 <400> 17 gctctagagc ctcatttacc cggagacagg gagag 35 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> EPITOPE BINDING SITE <400> 18 Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly 1 5 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> EPITOPE BINDING SITE <400> 19 Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL1 228B/C-1 <400> 20 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys 20 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL1 TEMPLATE HT2 <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL1 VARIANT B <400> 22 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL1 VARIANT J <400> 23 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL1 VARIANT L <400> 24 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL1 VARIANT HT-NEW #300 <400> 25 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL1 VARIANT HT2-DP27 #29 <400> 26 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL1 VARIANT HT2-DP27 #53 <400> 27 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL1 VARIANT HT2-DP27 #66 <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL2 228B/C <400> 29 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 30 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 288 B/C <400> 30 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 31 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 HT2 <400> 31 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 32 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT B <400> 32 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT J <400> 33 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT L <400> 34 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 35 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT N <400> 35 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 36 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT P <400> 36 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT R <400> 37 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 38 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-NEW #1 <400> 38 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 39 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-NEW #9 <400> 39 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 40 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-NEW #14 <400> 40 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 41 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 HT2-NEW #21 <400> 41 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 42 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-NEW # 67 <400> 42 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Pro Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 43 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-NEW #74 <400> 43 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 44 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-NEW #78 <400> 44 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 45 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-NEW #322 <400> 45 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Ser Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 46 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-NEW #162 <400> 46 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 47 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 # 7 <400> 47 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 #57 <400> 48 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 49 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 #73 <400> 49 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 50 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 #92 <400> 50 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Thr Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 51 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 #118 <400> 51 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 52 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 #123 <400> 52 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 53 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 #83 <400> 53 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asp Pro Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 54 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 #135 <400> 54 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 55 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 #273 <400> 55 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 56 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL3 VARIANT HT2-DP27 #301 <400> 56 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL4 228 B/C <400> 57 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL4 HT2 <400> 58 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRL4 VARIANT B <400> 59 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 60 <211> 30 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH1 228 B/C <400> 60 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn 20 25 30 <210> 61 <211> 30 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH1 DP27 <400> 61 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser 20 25 30 <210> 62 <211> 30 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH1 NEW <400> 62 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 63 <211> 30 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH1 VARIANT HT2-NEW #73 <400> 63 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 64 <211> 30 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH1 HT2-DP27 #7 <400> 64 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn 20 25 30 <210> 65 <211> 30 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH1 VARIANT HT2-DP27 #40 <400> 65 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser 20 25 30 <210> 66 <211> 30 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH1 VARIANT HT2-DP27 #268 <400> 66 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn 20 25 30 <210> 67 <211> 14 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH2 228 B/C <400> 67 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH2 DP27 <400> 68 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 69 <211> 14 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH2 NEW <400> 69 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH2 VARIANT 1 <400> 70 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 71 <211> 14 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH2 VARIANT 3 <400> 71 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 72 <211> 14 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH2 VARIANT HT2-DP27 #7 <400> 72 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH2 VARIANT HT2-DP27 # 43 <400> 73 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH2 VARIANT HT2-DP27 #50 <400> 74 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 75 <211> 14 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH2 VARIANT HT2-DP27 #100 <400> 75 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 76 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 228 B/C <400> 76 Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys 1 5 10 15 Met Ser Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 77 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 DP27 <400> 77 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 78 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 NEW <400> 78 Arg Val Thr Met Leu Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 79 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT 1 <400> 79 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 80 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT 3 <400> 80 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 81 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT 4 <400> 81 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 82 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 HT2-NEW #1 <400> 82 Arg Leu Asn Met Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Arg 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 83 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT HT2-NEW #9 <400> 83 Arg Leu Asn Met Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Arg 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 84 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT HT2-NEW #14 <400> 84 Arg Val Asn Met Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 85 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT HT2-DP27 #26 <400> 85 Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 86 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT HT2-DP27 #275 <400> 86 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ile Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 87 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT HT2-DP27 #301 <400> 87 Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 88 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT HT2-DP27 #580 <400> 88 Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 89 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT HT2-DP27 #345 <400> 89 Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 90 <211> 32 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH3 VARIANT HT2-DP27 #634 <400> 90 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> FRH4 228B/C <400> 91 Trp Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 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Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Lys Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 95 <211> 112 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN OF CL-13 <400> 95 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 96 <211> 118 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN OF CL-13 <400> 96 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Lys 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Ser Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 97 <211> 112 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN OF CL-50 <400> 97 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 98 <211> 118 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN OF CL-50 <400> 98 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Lys 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Lys Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 99 <211> 15 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-L1 228B/C <400> 99 Arg Ala Ser Lys Ser 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<223> CDR-H2 VARIANT 7 <400> 130 Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 131 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H2 VARIANT 8 <400> 131 Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Glu 1 5 10 15 <210> 132 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H2 VARIANT 9 <400> 132 Met Val Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 133 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H2 VARIANT 10 <400> 133 Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Ala Ser 1 5 10 15 <210> 134 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H2 VARIANT 11 <400> 134 Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Lys Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 135 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H3 228B/C <400> 135 Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn 1 5 10 <210> 136 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H3 VARIANT 1 <400> 136 Asp Gly Arg Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn 1 5 10 <210> 137 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H3 VARIANT 2 <400> 137 Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Lys Asn 1 5 10 <210> 138 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H3 VARIANT 3 <400> 138 Asp Gly Arg Tyr Pro Tyr Ala Met Lys Asn 1 5 10 <210> 139 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H3 VARIANT 4 <400> 139 Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Ser Asn 1 5 10 <210> 140 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H3 VARIANT 5 <400> 140 Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Ala Asn 1 5 10 <210> 141 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H3 VARIANT 6 <400> 141 Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Leu Asp Asn 1 5 10 <210> 142 <211> 112 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN OF CL-89 <400> 142 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 143 <211> 118 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN CL-276G <400> 143 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 144 <211> 112 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN OF RL-36 <400> 144 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 145 <211> 118 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN RL-36 <400> 145 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 146 <211> 118 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN RL-19 <400> 146 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ser Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Leu Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 147 <211> 118 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN RL-11 <400> 147 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Thr Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 148 <211> 118 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN RL-8 <400> 148 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 149 <211> 118 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN RL-45 <400> 149 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Thr Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 150 <211> 112 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE LIGHT CHAIN RL-36-L1,59 <400> 150 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 151 <211> 118 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> VARIABLE HEAVY CHAIN RL36-L1,59 <400> 151 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Gly Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Val Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 152 <211> 248 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINGLE CHAIN FV <400> 152 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr 165 170 175 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser 180 185 190 Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly 225 230 235 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 245

Claims (103)

  1. 인간 IL-13(interleukin-13)에 특이적으로 결합하는 항-IL-13 항체로서,
    상기 항-IL-13 항체는 ATCC 기탁번호 PTA-5657의 하이브리도마 228B/C-1에서 생산되는 항체의 가변 경쇄부의 상보성 결정 부위(CDRs) 및 가변 중쇄부의 상보성 결정 부위(CDRs)를 포함하는 항-IL-13 항체.
  2. 인간 IL-13(interleukin-13)에 특이적으로 결합하는 항-IL-13 항체로서,
    상기 항-IL-13 항체는 서열 ESLINVSG(서열번호 18) 또는 YCAALESLINVS(서열번호 19)로 구성된 에피토프에 결합하는 항-IL-13 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는
    (i) 서열번호 99의 아미노산 서열을 가진 CDR1, 서열번호 104의 아미노산 서열을 가진 CDR2, 및 서열번호 115의 아미노산 서열을 가진 CDR3를 포함하는 가변 경쇄부(VL); 및
    (ii) 서열번호 117의 아미노산 서열을 가진 CDR1, 서열번호 123의 아미노산 서열을 가진 CDR2, 및 서열번호 135의 아미노산 서열을 가진 CDR3를 포함하는 가변 중쇄부(VH)
    를 포함하는 것인 항-IL-13 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는
    (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL), 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH);
    (b) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL), 및 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH);,
    (c) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL), 및 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH);,
    (d) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL), 및 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH);,
    (e) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL), 및 서열번호 146의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH);,
    (f) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL), 및 서열번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH);,
    (g) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL), 및 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH); 또는
    (h) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL), 및 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH)
    를 포함하는 것인 항-IL-13 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체가 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL)와, 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH)를 포함하는 것인 항-IL-13 항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL)와, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH)를 포함하는 것인 항-IL-13 항체.
  7. 제2항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체가,
    (a) 서열 번호 100의 아미노산 서열을 가진 VL CDR1, 그리고 서열 번호 104의 아미노산 서열을 가진 VL CDR2, 그리고 서열 번호 116의 아미노산 서열을 가진 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변부(VL); 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 가진 VH CDR1, 서열 번호 123의 아미노산 서열을 가진 VH CDR2 그리고 서열 번호 137의 아미노산 서열을 가진 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변부(VH);
    (b) 서열 번호 100의 아미노산 서열을 가진 VL CDR1, 그리고 서열 번호 104의 아미노산 서열을 가진 VL CDR2, 그리고 서열 번호 115의 아미노산 서열을 가진 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변부(VL); 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 가진 VH CDR1, 서열 번호 123의 아미노산 서열을 가진 VH CDR2, 그리고 서열 번호 139의 아미노산 서열을 가진 VH CDR3를 포함하는 중쇄 가변부(VH); 또는
    (c) 서열 번호 100의 아미노산 서열을 가진 VL CDR1, 서열 번호 104의 아미노산 서열을 가진 VL CDR2, 그리고 서열 번호 116의 아미노산 서열을 가진 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변부(VL); 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 가진 VH CDR1, 서열 번호 123의 아미노산 서열을 가진 VH CDR2, 그리고 서열 번호 137의 아미노산 서열을 가진 VH CDR3를 포함하는 중쇄 가변부(VH),
    를 포함하는 것인 항-IL-13 항체.
  8. 제1항, 제3항, 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 단일클론 항체인 항-IL-13 항체.
  9. 제2항, 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 단일클론 항체인 항-IL-13 항체.
  10. 제5항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 단일클론 항체인 항-IL-13 항체.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체인 항-IL-13 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체인 항-IL-13 항체.
  13. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인 항-IL-13 항체.
  14. 제8항에 있어서, 상기항체는 인간화된 항체인 항-IL-13 항체.
  15. 제9항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인 항-IL-13 항체.
  16. 제1항, 제3항, 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 1가(monovalent) 항체, 다중특이적(multispecific) 항체, 인간 항체, 단쇄 항체, 키메라 항체 또는 Fab 단편인 항-IL-13 항체.
  17. 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 1가(monovalent) 항체, 다중특이적(multispecific) 항체, 인간 항체, 단쇄 항체, 키메라 항체 또는 Fab 단편인 항-IL-13 항체.
  18. 제8항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 1가(monovalent) 항체, 다중특이적(multispecific) 항체, 인간 항체, 단쇄 항체, 키메라 항체 또는 Fab 단편인 항-IL-13 항체.
  19. 제16항에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 이중특이적(bispecific) 항체인 항-IL-13 항체.
  20. 제17항에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 이중특이적(bispecific) 항체인 항-IL-13 항체.
  21. 제13항에 있어서, 이중특이적(bispecific) 항체인 항-IL-13 항체.
  22. 제10항에 있어서, 이중특이적(bispecific) 항체인 항-IL-13 항체.
  23. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합성 단편인 항-IL-13 항체.
  24. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-13 항체를 생산하는 세포.
  25. 제8항에 따른 항-IL-13 항체를 생산하는 세포.
  26. 제9항에 따른 항-IL-13 항체를 생산하는 세포.
  27. 제13항에 따른 항-IL-13 항체를 생산하는 세포.
  28. 제16항에 따른 항-IL-13 항체를 생산하는 세포.
  29. 제17항에 따른 항-IL-13 항체를 생산하는 세포.
  30. 항-IL-13 항체를 생산하는, ATCC 기탁번호 PTA-5657을 가지는 하이브리도마 세포주.
  31. 제1항, 제3항, 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-13 항체의 가변 경쇄부(VL), 가변 중쇄부(VH), 또는 이들 가변 경쇄부(VL)와 가변 중쇄부(VH)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  32. 제2항, 제4항, 제5항, 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-13 항체의 경쇄 가변부(VL), 중쇄 가변부(VH), 또는 경쇄 가변부(VL)와 중쇄 가변부(VH)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  33. 제14항에 따른 항-IL-13 항체의 경쇄 가변부(VL), 중쇄 가변부(VH), 또는 경쇄 가변부(VL)와 중쇄 가변부(VH)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  34. 제15항에 따른 항-IL-13 항체의 경쇄 가변부(VL), 중쇄 가변부(VH), 또는 경쇄 가변부(VL)와 중쇄 가변부(VH)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  35. 제19항에 따른 항-IL-13 항체의 경쇄 가변부(VL), 중쇄 가변부(VH), 또는 경쇄 가변부(VL)와 중쇄 가변부(VH)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  36. 제20항에 따른 항-IL-13 항체의 경쇄 가변부(VL), 중쇄 가변부(VH), 또는 경쇄 가변부(VL)와 중쇄 가변부(VH)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  37. 제31항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  38. 제32항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  39. 제33항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  40. 제34항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  41. 제35항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  42. 제36항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  43. 제31항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  44. 제32항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  45. 제33항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  46. 제34항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  47. 제35항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  48. 제36항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  49. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-13 항체 및 생리학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 천식 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 단일클론 항체인 약학 조성물.
  51. 제49항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체인 약학 조성물.
  52. 제49항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 인간화된 항체인 약학 조성물.
  53. 제49항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 1가(monovalent) 항체, 다중특이적(multispecific) 항체, 인간 항체, 단쇄 항체, 키메라 항체 또는 Fab 단편인 약학 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 이중특이적(bispecific) 항체인 다중특이적(multispecific) 항체인 약학 조성물.
  55. 제49항에 있어서, 천식 치료용인 약학 조성물.
  56. 제52항에 있어서, 천식 치료용인 약학 조성물.
  57. 제49항에 있어서, 염증성 질환 치료용인 약학 조성물.
  58. 제52항에 있어서, 염증성 질환 치료용인 약학 조성물.
  59. 제57항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증 및 폐 섬유증인 약학 조성물.
  60. 제49항에 있어서, 상기 염증성 질환은 특발성 폐 섬유화증인 약학 조성물.
  61. 제52항에 있어서, 상기 염증성 질환은 특발성 폐 섬유화증인 약학 조성물.
  62. 제49항에 있어서, 상기 천식 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방은 기관지 천식 예방, 알레르기성 비염의 예방, 알레르기성 피부염 예방, 과민증(anaphylaxis) 예방, 기관지 천식 치료, 알레르기성 비염 치료, 두드러기 치료, 또는 알레르기성 피부염의 치료 또는 예방을 포함하는 약학 조성물.
  63. 제49항에 있어서, 상기 천식 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방은 알레르기성 천식, 비알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 알레르기성 결막염, 습진, 두드러기, 식품 알레르기, 만성 폐색성 폐 질환, 궤양성 대장염, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV:Respiratory syncytial virus) 감염, 포도막염, 경피증, 또는 골다공증의 치료를 포함하는 약학 조성물.
  64. 제55항에 있어서, 상기 천식은 알레르기성 천식인 약학 조성물.
  65. 제55항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 흡입, 볼루스 주사, 또는 주입에 의해 투여하기에 적합한 약학 조성물.
  66. 제59항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 흡입, 볼루스 주사, 또는 주입에 의해 투여하기에 적합한 약학 조성물.
  67. 제31항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 항체를 발현하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  68. 제32항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 항체를 발현하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  69. 제33항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 항체를 발현하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  70. 제34항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 항체를 발현하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  71. 제35항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 항체를 발현하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  72. 제36항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 항체를 발현하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  73. 제43항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  74. 제44항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  75. 제45항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  76. 제46항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  77. 제47항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  78. 제48항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  79. 제30항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  80. 제67항에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 수득하는 단계를 더 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  81. 제73항에 있어서, 상기 세포가 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, NS0 세포, 또는 293 세포인, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  82. 삭제
  83. 제43항에 있어서, 상기 세포가 박테리아인 세포.
  84. 제43항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포, NS0 세포, 또는 293 세포인 세포.
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 제58항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증 및 폐 섬유증인 약학 조성물.
  88. 제56항에 있어서, 상기 천식은 알레르기성 천식인 약학 조성물.
  89. 제56항에 있어서, 상기 항-IL-13 항체는 흡입, 볼루스 주사, 또는 주입에 의해 투여하기에 적합한 약학 조성물.
  90. 제68항에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 수득하는 단계를 더 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  91. 제69항에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 수득하는 단계를 더 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  92. 제72항에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 수득하는 단계를 더 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  93. 제73항에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 수득하는 단계를 더 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  94. 제74항에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 수득하는 단계를 더 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  95. 제75항에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 수득하는 단계를 더 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  96. 제79항에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 수득하는 단계를 더 포함하는, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  97. 제74항에 있어서, 상기 세포가 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, NS0 세포, 또는 293 세포인, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  98. 제75항에 있어서, 상기 세포가 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, NS0 세포, 또는 293 세포인, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  99. 제79항에 있어서, 상기 세포가 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, NS0 세포, 또는 293 세포인, 인간 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법.
  100. 제44항에 있어서, 상기 세포가 박테리아인 세포.
  101. 제45항에 있어서, 상기 세포가 박테리아인 세포.
  102. 제44항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포, NS0 세포, 또는 293 세포인 세포.
  103. 제45항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포, NS0 세포, 또는 293 세포인 세포.
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Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7883704B2 (en) * 1999-03-25 2011-02-08 Abbott Gmbh & Co. Kg Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
GB0407315D0 (en) 2003-07-15 2004-05-05 Cambridge Antibody Tech Human antibody molecules
CA2550651C (en) * 2003-12-23 2018-01-23 Tanox, Inc. Novel anti-il 13 antibodies and uses thereof
US20050186146A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-25 Nektar Therapeutics Interleukin-13 antagonist powders, spray-dried particles, and methods
DK1716181T3 (da) 2004-02-19 2010-03-01 Genentech Inc CDR-reparerede antistoffer
AR049390A1 (es) 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
US20090098142A1 (en) * 2004-06-09 2009-04-16 Kasaian Marion T Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders
US7501121B2 (en) 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
DE602005025525D1 (de) 2004-11-17 2011-02-03 Amgen Inc Vollständige humane monoklonale antikörper gegen il-13
GB2430883B (en) * 2005-09-30 2008-03-19 Cambridge Antibody Tech Interleukin-13 antibody composition
US20070202106A1 (en) * 2005-10-06 2007-08-30 Baylor Research Institute Compositions and methods for the treatment of cancer
US20070237763A1 (en) * 2005-10-06 2007-10-11 Baylor Research Institute Compositions and methods for the treatment of cancer
WO2007045477A2 (en) 2005-10-21 2007-04-26 Novartis Ag Human antibodies against il-13 and therapeutic uses
RU2432362C2 (ru) 2005-11-30 2011-10-27 Эбботт Лэборетриз Моноклональные антитела и их применения
GB0600488D0 (en) * 2006-01-11 2006-02-22 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
AU2007209202A1 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Domantis Limited Ligands that bind IL-4 and/or IL-13
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
ES2817756T3 (es) * 2006-09-08 2021-04-08 Abbvie Bahamas Ltd Proteínas de unión a interleuquina-13
AU2008205512B2 (en) 2007-01-16 2014-06-12 Abbvie Inc. Methods for treating psoriasis
TW200848429A (en) * 2007-04-23 2008-12-16 Wyeth Corp Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders
WO2008140455A1 (en) * 2007-05-15 2008-11-20 Tanox, Inc. Treatment of radiation and chemo-therapy induced fibrosis using novel anti-il 13 monoclonal antibodies
US8183982B2 (en) 2007-08-14 2012-05-22 Infineon Technologies Ag System including reply signal that at least partially overlaps request
JP5641599B2 (ja) * 2007-08-24 2014-12-17 学校法人慶應義塾 腫瘍細胞による免疫抑制の解除剤とそれを用いた抗腫瘍剤
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
EP2274333A4 (en) 2008-03-18 2011-06-15 Abbott Lab PROCESS FOR TREATING PSORIASIS
NZ601815A (en) * 2008-03-31 2014-10-31 Genentech Inc Compositions and methods for treating and diagnosing asthma
MX2011001909A (es) 2008-08-20 2011-03-21 Centocor Ortho Biotech Inc Anticuerpos anti-interleucina-13 modificados, composiciones, metodos y usos.
CA2734905A1 (en) 2008-09-03 2010-03-11 Jenny M. Bostrom Multispecific antibodies
KR20110092328A (ko) * 2008-11-26 2011-08-17 글락소 그룹 리미티드 Ｉｌ-13에 결합하는 리간드
GB0904214D0 (en) 2009-03-11 2009-04-22 Ucb Pharma Sa Biological products
CN102946906B (zh) 2010-04-23 2015-07-15 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 生产异源多聚体蛋白质
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
EP2857499A1 (en) 2010-10-01 2015-04-08 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
MY188365A (en) 2010-12-16 2021-12-06 Genentech Inc Diagnosis and treatments relating to th2 inhibition
EP3604339B1 (en) 2011-01-14 2021-03-10 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
RU2013140685A (ru) 2011-02-04 2015-03-10 Дженентек, Инк. ВАРИАНТЫ Fc, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
JP2014510730A (ja) 2011-03-16 2014-05-01 サノフイ デュアルｖ領域抗体様タンパク質の使用
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9062106B2 (en) 2011-04-27 2015-06-23 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SG10201602654SA (en) 2011-10-03 2016-05-30 Moderna Therapeutics Inc Modified nucleosides,nucleotides,and nucleic acids,and uses thereof
RU2665810C2 (ru) * 2011-10-31 2018-09-04 Дженентек, Инк. Содержащие антитела составы
KR101483335B1 (ko) 2011-11-01 2015-01-15 울산대학교 산학협력단 골 손실 진단 마커로서의 피브리노겐의 용도
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
MX370486B (es) * 2012-03-27 2019-12-16 Genentech Inc Composiciones, métodos y usos para asistir en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática.
AU2013243950A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
IN2014DN10889A (ko) * 2012-07-13 2015-09-11 Univ Pennsylvania
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
AU2013381687A1 (en) 2013-03-12 2015-09-24 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2905223A1 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Genentech, Inc. Anti-il-4 antibodies and bispecific antibodies and uses thereof
BR112016004413A2 (pt) 2013-09-13 2017-10-17 Genentech Inc composições, preparação de anticorpo e método de purificação de um polipeptídeo recombinante e de tratamento de um distúrbio
BR112016004437A2 (pt) 2013-09-13 2017-10-17 Genentech Inc métodos de imunoteste e de seleção de linhagem de células, anticorpos e kit
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) * 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
WO2015127405A2 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Genentech, Inc. Anti-il-13/il-17 bispecific antibodies and uses thereof
BR112016023238A2 (pt) * 2014-04-11 2017-10-17 Novartis Ag processos de tratamento seletivo de asma usando antagonistas de il-13
WO2015195758A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Medimmune, Llc Cell culture methods and media comprising n-acetylcysteine
WO2016073794A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Genentech, Inc. Methods of producing two chain proteins in bacteria
MX2017005930A (es) 2014-11-05 2017-06-30 Genentech Inc Metodo de produccion de proteinas de cadena doble en bacterias.
JP6929771B2 (ja) 2014-11-10 2021-09-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗インターロイキン−３３抗体及びその使用
CN107109494B (zh) 2014-11-10 2023-10-27 豪夫迈·罗氏有限公司 Il-33介导型疾病的治疗方法和诊断方法
WO2016149276A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Genentech, Inc. Methods of detecting and quantifying il-13 and uses in diagnosing and treating th2-associated diseases
EP3286227A2 (en) 2015-04-24 2018-02-28 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antigen-binding proteins
EP3286315B1 (en) 2015-04-24 2021-05-26 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of identifying bacteria comprising binding polypeptides
SI3528838T1 (sl) 2016-09-23 2023-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Uporabe IL-13 antagonistov za zdravljenje atopijskega dermatitisa
EP3551034A1 (en) 2016-12-07 2019-10-16 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CA3051700A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Genentech, Inc. Anti-tryptase antibodies, compositions thereof, and uses thereof
WO2018183932A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a il-13 inhibitor
WO2018195388A1 (en) * 2017-04-21 2018-10-25 Kindred Biosciences, Inc. Il4/il13 receptor molecule for veterinary use
US11053309B2 (en) 2017-08-04 2021-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating active eosinophilic esophagitis
CN109776677B (zh) * 2017-11-15 2023-11-03 尚华科创投资管理（江苏）有限公司 一种人源化抗il-13抗体及其制备方法和应用
CN113101364B (zh) 2018-05-29 2023-12-01 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种自免疫抑制剂的开发和应用
EP3866924A4 (en) * 2018-06-29 2022-07-06 Krystal Biotech, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF ANTIBODY DELIVERY
US20210220471A1 (en) * 2018-07-13 2021-07-22 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of using pharmacologic inhibitors of type 2 cytokine signaling to treat or prevent pancreatic cancer
US20220249814A1 (en) 2018-11-19 2022-08-11 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
WO2020180727A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-4/il-13 pathway inhibitors for enhanced efficacy in treating cancer
CN113597328A (zh) 2019-03-21 2021-11-02 瑞泽恩制药公司 用于治疗过敏症的il-4/il-13途径抑制剂和浆细胞消融的组合
EP3966244A1 (en) * 2019-05-09 2022-03-16 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of making antibodies
US20200352958A1 (en) * 2019-05-10 2020-11-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods And Compositions For Targeting Retinoic Acid For Solid Tumor Immunotherapy
CA3154522A1 (en) 2019-10-15 2021-04-22 Christopher Carl Frye Recombinantly engineered, lipase/esterase-deficient mammalian cell lines
US11707610B2 (en) 2019-12-13 2023-07-25 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
CN115605507A (zh) 2020-03-13 2023-01-13 基因泰克公司（Us） 抗白介素-33抗体及其用途
TW202317191A (zh) 2021-07-16 2023-05-01 美商德米拉股份有限公司 用於治療異位性皮炎之il-13抗體
TW202323291A (zh) 2021-08-13 2023-06-16 美商德米拉股份有限公司 用於治療異位性皮膚炎之il-13抗體
IL311027A (en) 2021-09-15 2024-04-01 Dermira Inc IL-13 inhibitors for the treatment of PRURIGO NODULARIS
WO2023130010A1 (en) 2021-12-30 2023-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for attenuating atopic march by administering an il-4/il-13 antagonist
US20230357381A1 (en) * 2022-04-26 2023-11-09 Novartis Ag Multispecific antibodies targeting il-13 and il-18

Family Cites Families (152)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
DE3127674A1 (de) 1981-07-14 1983-02-24 Rheinmetall GmbH, 4000 Düsseldorf Verfahren und vorrichtung zum belegen einer zielflaeche mit munition
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
WO1989004838A1 (en) 1987-11-25 1989-06-01 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
DE68921982T4 (de) 1988-06-14 1996-04-25 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5359037A (en) * 1988-09-12 1994-10-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to TNF binding protein I
WO1990005183A1 (en) * 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5011778A (en) * 1989-05-23 1991-04-30 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Monoclonal antibodies directed to IL-1 activated endothelial cells and medicaments employing the monoclonal antibodies
AU641673B2 (en) 1989-06-29 1993-09-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
CZ283050B6 (cs) 1989-12-20 1997-12-17 Schering Corporation Polypeptid, jeho subsekvence a jejich použití
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
EP0521985B1 (en) 1990-03-20 1997-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
CA2092323A1 (en) 1990-10-01 1992-04-02 George Y. Wu Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
EP0553244B8 (en) 1990-10-05 2005-06-08 Celldex Therapeutics, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
AU8727291A (en) 1990-10-29 1992-06-11 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
ES2178635T3 (es) 1990-11-09 2003-01-01 Stephen D Gillies Inmunoconjugados de citoquinas.
ES2054601T3 (es) * 1991-03-29 1996-04-01 Sanofi Sa Proteina con actividad de tipo citoquina, adn recombinante codante para esta proteina, celulas y microorganismos transformados.
HUT66753A (en) 1991-04-26 1994-12-28 Surface Active Ltd Novel antibodies and methods for their use
CA2103064A1 (en) 1991-05-14 1992-11-15 George Y. Wu Targeted delivery of genes encoding immunogenic proteins
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
CA2103371C (en) 1991-06-05 2003-09-16 George Y. Wu Targeted delivery of genes encoding secretory proteins
US5994514A (en) * 1991-08-14 1999-11-30 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5965709A (en) * 1991-08-14 1999-10-12 Genentech, Inc. IgE antagonists
US6329509B1 (en) * 1991-08-14 2001-12-11 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
WO1993014188A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 The Regents Of The University Of Michigan Targeted virus
AU3658093A (en) 1992-02-10 1993-09-03 Seragen, Inc. Desensitization to specific allergens
AU3737893A (en) 1992-03-05 1993-10-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnostic and/or therapeutic agents, targeted to neovascular endothelial cells
WO1993020221A1 (en) 1992-04-03 1993-10-14 Young Alexander T Gene therapy using targeted viral vectors
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5318564A (en) 1992-05-01 1994-06-07 Hemostatic Surgery Corporation Bipolar surgical snare and methods of use
ES2136664T3 (es) 1992-06-09 1999-12-01 Hoppe Ag Sistema de cierre y conjunto de cerradura.
US5397703A (en) * 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5596072A (en) * 1992-08-21 1997-01-21 Schering Corporation Method of refolding human IL-13
CN1085953A (zh) * 1992-08-21 1994-04-27 先灵公司 人白细胞介素13
JPH07508179A (ja) 1992-08-21 1995-09-14 シェリング・コーポレーション ヒトインターロイキン−１３
EP0749475A4 (en) 1992-08-26 1997-05-07 Harvard College USE OF THE CYTOKIN IP-10 AS AN ANTI-TUMOR AGENCY
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1994008598A1 (en) 1992-10-09 1994-04-28 Advanced Tissue Sciences, Inc. Liver reserve cells
EP0911413A3 (en) 1992-12-03 2000-11-15 Genzyme Corporation Minimal adenovirus-based gene therapy vector
US5441050A (en) 1992-12-18 1995-08-15 Neoprobe Corporation Radiation responsive surgical instrument
EP0604693A1 (en) 1992-12-29 1994-07-06 Schering-Plough Monoclonal antibodies against the human interleukin-4 receptor and hybridomas producing the same
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
CN1127351C (zh) * 1993-09-02 2003-11-12 达特茅斯学院理事 诱导抗原特异性ｔ细胞耐受的方法
RU2162711C2 (ru) * 1993-09-07 2001-02-10 Смитклайн Бичам Корпорейшн Рекомбинантные il4-антитела, используемые для лечения нарушений, связанных с действием il4
EP0659766A1 (en) 1993-11-23 1995-06-28 Schering-Plough Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies
GB9415379D0 (en) * 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
IT1270662B (it) * 1994-10-13 1997-05-07 Applied Research Systems Antagonista della interleuchina-1
US5705154A (en) * 1995-03-08 1998-01-06 Schering Corporation Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
US6037453A (en) * 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US6518061B1 (en) * 1995-03-15 2003-02-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services IL-13 receptor specific chimeric proteins and uses thereof
US6165463A (en) 1997-10-16 2000-12-26 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
ATE390933T1 (de) 1995-04-27 2008-04-15 Amgen Fremont Inc Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
ES2317646T3 (es) 1995-09-08 2009-04-16 Genzyme Corporation Vectores aav mejorados para terapia genica.
CA2238080C (en) 1995-10-23 2012-03-13 Amrad Operations Pty. Ltd. A novel haemopoietin receptor and genetic sequences encoding same
US6911530B1 (en) * 1995-10-23 2005-06-28 Amrad Operations, Pty., Ltd. Haemopoietin receptor and genetic sequences encoding same
FR2742156A1 (fr) 1995-12-06 1997-06-13 Sanofi Sa Polypeptide recepteur de l'il-13
RO123028B1 (ro) 1996-02-09 2010-07-30 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Anticorpi umani, care leagă tnf alpha uman
US7078494B1 (en) * 1996-03-01 2006-07-18 Genetics Institute, Llc Antibodies to human IL-13bc and methods of their use in inhibiting IL-13 binding
US6664227B1 (en) * 1996-03-01 2003-12-16 Genetics Institute, Llc Treatment of fibrosis by antagonism of IL-13 and IL-13 receptor chains
US5710023A (en) 1996-03-01 1998-01-20 Genetics Institute, Inc. IL-13 cytokine receptor chain
WO1997033899A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
KR20030096450A (ko) 1996-03-22 2003-12-31 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 고사 유도 분자 ⅱ
WO1997047742A1 (en) 1996-06-12 1997-12-18 Smithkline Beecham Corporation Hr-1 receptor
WO1998010638A1 (en) 1996-09-10 1998-03-19 Amrad Operations Pty. Ltd. Therapeutic molecules
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
PT942968E (pt) 1996-12-03 2008-03-27 Amgen Fremont Inc Anticorpos totalmente humanos que se ligam ao egfr
US6743604B1 (en) * 1996-12-13 2004-06-01 Smithkline Beecham Corporation Substances and their uses
GB9625899D0 (en) * 1996-12-13 1997-01-29 Glaxo Group Ltd Substances and their uses
KR20000070034A (ko) 1997-01-10 2000-11-25 아스트루 마이클 제이 항 ｃｄ40ｌ 화합물로 신염성 루푸스를 치료하는 방법
WO1998031394A2 (en) * 1997-01-22 1998-07-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Tissue factor methods and compositions for coagulation and tumor treatment
AU742045B2 (en) 1997-04-14 2001-12-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Novel method for the production of anti-human antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6642051B1 (en) 1997-10-21 2003-11-04 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus(AAV) packaging cassettes for the production of recombinant AAV vectors
CA2309541C (en) 1997-11-03 2011-01-11 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
US6576232B1 (en) * 1998-04-03 2003-06-10 The Penn State Research Foundation IL13 mutants
US6482403B1 (en) 1998-05-29 2002-11-19 Heska Corporation Caniney IL-13 immunoregulatory proteins and uses thereof
US6299875B1 (en) * 1998-06-04 2001-10-09 Panacea Pharmaceuticals, Llc Methods to block IGE binding to cell surface receptors of mast cells
US6222971B1 (en) 1998-07-17 2001-04-24 David Slobodin Small inlet optical panel and a method of making a small inlet optical panel
GB9820014D0 (en) 1998-09-14 1998-11-04 Cancer Res Campaign Tech Receptor antagonists and uses thereof
DE19848026A1 (de) 1998-10-17 2000-04-20 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Bis(4-hydroxyaryl)alkanen
US7553487B2 (en) * 1998-12-14 2009-06-30 Genetics Institute, Llc Method and compositions for treating asthma
BR9916209A (pt) 1998-12-14 2001-12-26 Genetics Inst Cadeia de receptor de citocina
US6567436B1 (en) 1999-01-26 2003-05-20 California Institute Of Technology Opto-electronic oscillators having optical resonators
AU2750800A (en) 1999-02-01 2000-08-18 Amgen Canada Inc. Materials and methods to inhibit hodgkin and reed sternberg cell growth
JP2003511019A (ja) * 1999-10-06 2003-03-25 ザ ペン ステート リサーチ ファウンデーション Ｉｌ１３変異体
AU1599301A (en) 1999-11-11 2001-06-06 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Modulating IL-13 activity using mutated IL-13 molecules that are antagonists or agonists of IL-13
US7422376B2 (en) 1999-12-07 2008-09-09 Molex Incorporated Self-contained fiber optic connector module
EP1270595B1 (en) 2000-03-03 2008-07-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anti ccr4 antibody and its fragment
CN1323812A (zh) 2000-05-16 2001-11-28 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人白细胞介素－13(il－13)受体11和编码这种多肽的多核苷酸
WO2002033073A1 (fr) 2000-10-20 2002-04-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps agoniste degrade
EP2027867A1 (en) 2000-10-20 2009-02-25 Genetics Institute, LLC Method and composition for inhibition of tumor growth and enhancing an immune response
PT1449850E (pt) * 2001-08-31 2011-02-02 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anticorpos humanos enxertados em rdc¿s e fragmentos desses anticorpos
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
EP1578912A4 (en) 2001-10-26 2007-12-26 Centocor Inc IL-13 MUTEIN PROTEINS, ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
CA2466492A1 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays presenting il-5, il-13 or eotaxin for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7541040B2 (en) * 2001-12-04 2009-06-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces Chimeric molecule for the treatment of th2-like cytokine mediated disorders
US20030170724A1 (en) * 2002-03-08 2003-09-11 Anderson David C. Methods of identifying target polypeptides
WO2003075859A2 (en) * 2002-03-08 2003-09-18 Rigel Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS THAT MODULATE PROCESSES ASSOCIATED WITH IgE PRODUCTION AND METHODS AND KITS FOR IDENTIFYING AND USING THE SAME
AU2003223497A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-27 Centocor, Inc. Asthma-related anti-il-13 immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
ATE503233T1 (de) 2002-06-14 2011-04-15 Us Gov Health & Human Serv Verfahren zur behandlung und prävention von kolitis, an der il-13 und nk-t zellen beteiligt sind
US7374894B2 (en) * 2002-07-16 2008-05-20 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods of identifying compounds that modulate IL-4 receptor-mediated IgE synthesis utilizing a chloride intracellular channel 1 protein
US20060147417A1 (en) 2002-08-30 2006-07-06 Claire Ashman Immunogenic composition comprising an il-13 element and t cell epitopes, and its therapeutic use
CA2496948A1 (en) 2002-08-30 2004-03-11 Glaxo Group Limited Il-14 vaccine for the treatment of asthma and atopic disorders
EP1572946B1 (en) * 2002-09-06 2012-03-14 Amgen, Inc. Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody
EP1592776A4 (en) 2003-02-01 2008-06-04 Tanox Inc ANTI-HUMAN IGE ANTIBODIES WITH HIGH AFFINITY
DK1471057T3 (da) * 2003-04-25 2006-05-15 Actimis Pharmaceuticals Inc Pyrimidinyleddikesyrederivater, der er egnede til behandlingen af sygdomme medieret af CRTH2
GB0407315D0 (en) * 2003-07-15 2004-05-05 Cambridge Antibody Tech Human antibody molecules
CA2550651C (en) * 2003-12-23 2018-01-23 Tanox, Inc. Novel anti-il 13 antibodies and uses thereof
US7501121B2 (en) 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
AR049390A1 (es) 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
TWI307630B (en) 2004-07-01 2009-03-21 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
GB2430883B (en) 2005-09-30 2008-03-19 Cambridge Antibody Tech Interleukin-13 antibody composition
WO2007045477A2 (en) 2005-10-21 2007-04-26 Novartis Ag Human antibodies against il-13 and therapeutic uses
WO2008140455A1 (en) 2007-05-15 2008-11-20 Tanox, Inc. Treatment of radiation and chemo-therapy induced fibrosis using novel anti-il 13 monoclonal antibodies
NZ601815A (en) 2008-03-31 2014-10-31 Genentech Inc Compositions and methods for treating and diagnosing asthma
MY188365A (en) 2010-12-16 2021-12-06 Genentech Inc Diagnosis and treatments relating to th2 inhibition

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
British Journal of Pharamacology Vol. 135, Pages 1915-1926(2002.4.). *
British Journal of Pharamacology Vol. 135, Pages 1915-1926(2002.4.).*
NCBI Genebank Accession No. NP_002179(2003.4.7.). *
NCBI Genebank Accession No. NP_002179(2003.4.7.).*

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Publication number Publication date
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ATE552850T1 (de) 2012-04-15
US11434287B2 (en) 2022-09-06
US8734801B2 (en) 2014-05-27
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JP4851944B2 (ja) 2012-01-11
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US9605065B2 (en) 2017-03-28
CY1122817T1 (el) 2021-05-05
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US20110014199A1 (en) 2011-01-20
US20080008648A1 (en) 2008-01-10
HRP20231569T1 (hr) 2024-03-15

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