KR20030096450A

KR20030096450A - 고사 유도 분자 ⅱ

Info

Publication number: KR20030096450A
Application number: KR1020017013938A
Authority: KR
Inventors: 에브너라인하르트; 루벤스티븐엠; 유구오리앙
Original assignee: 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1996-10-31
Publication date: 2003-12-31
Also published as: CN1216994A; CN1107072C; CN1428426A; EP0904278A4; WO1997034911A1; CA2248868A1; JP2000508522A; KR20000064745A; KR100497017B1; EP0904278A1

Abstract

본원 발명은 TNF-리간드 상과(上科)의 신규 분자인 고사 유도 분자 II(AIM-II)에 관한 것이다. 구체적으로, 인간의 AIM II 단백질을 암호하는 핵산 분자 분리물에 관한 것이다. 본 발명은 AIM II 폴리펩티드와 관련된 벡터, 숙주 세포 및 이를 제조하는 재조합 방법도 포함한다. 또한, 본 발명은 AIM II 활성의 작동물질 및 길항물질을 동정하는 선별 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 림프절증, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환을 치료하고, 종양 세포 성장과 같은 종양형성을 억제하는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

고사 유도 분자 Ⅱ{APOPTOSIS INDUCING MOLECULE II}

본 발명은 TNF-리간드 상과(上科)의 신규 분자에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 고사 유도 분자 II(Apoptosis Inducing Molecule: AIM II)를 암호하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, AIM II 폴리펩티드는 벡터, 숙주 세포 및 이를 생산하는 재조합 방법으로도 제공된다. 본 발명은 AIM II 활성의 작동물질 및 길항물질을 동정하는 선별 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 림프절증, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환을 치료하고, 종양 세포 성장과 같은 증식이상을 억제하는 치료 방법에 관한 것이다.

인간 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 및 β(TNF-β 또는 림프독소)는 총괄적으로 시토킨이라 불리는 인터페론, 인터루킨 및 성장 인자를 비롯한 다양한 부류의 폴리펩티드 매개인자와 관련있는 구성원이다[Beutler, B. and Cerami, A., Annu. Ret,. Immunol., 7:625-655 (1989)].

종양 괴사 인자(TNF-α 및 TNF-β)는 항종양 활성의 결과로서 최초로 발견되었으나, 현재는 일부 형질전환된 세포주의 고사, 세포 활성화 및 세포 증식의 매개를 비롯한 많은 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 다형질발현성 시토킨으로 알려져 있으며, 면역 조절과 염증에 중요한 역할을 하는 것으로도 알려져 있다.

지금까지 알려진 TNF-리간드 상과의 구성원으로는 TNF-α, TNF-β(림프독소-α), LT-β, OX40L, Fas 리간드, CD30L, CD27L, CD40L 및 4-IBBL을 포함한다. TNF리간드 상과에 속하는 리간드들은 세포외 도메인의 서열 상동성이 약 20%(12% 내지 36% 범위)인 산성의 TNF-유사 분자로서, 생물학적 활성 형태가 3량체/다량 복합체 형태인 막 결합 형태로 주로 존재한다. TNF 리간드 상과의 가용성 형태로서 지금까지 동정된 것은 TNF, LTα 및 Fas 리간드뿐이다[일반적인 개론에 대해서는 본원에 참고인용되는 문헌, Gruss, H. and Dower, S.K., Blood, 85(12): 3378-3404 (1995)].

이 단백질들은 세포 증식, 활성화 및 분화 뿐만 아니라, 고사 또는 세포독성에 의한 세포 사멸 또는 세포 생존의 조절에도 관여한다[Armitage, R.J., Curr.Opin.Immunol. 6:407(1994) and Smith, C.A., Cell 75:959(1994)].

포유동물의 발생은 세포 증식 및 분화 뿐만 아니라 고사를 통해 일어나는 프로그램된 세포 사멸에 따라 달라진다[Walker et al., Methods Achiev. Exp. Pathol. 13: 18 (1988)]. 고사는 자가 항원을 인식하는 면역 흉선세포의 파괴에 큰 역할을 한다. 이러한 정상적인 제거 과정이 손상되면 자가면역 질환이 생길 수 있다[Gammon et al., Immunology Today 12: 193 (1991)].

이토(Itoh) 등[Cell 66:233(1991)]은 고사를 매개하고 T-세포의 클론 결손에 관련있는 세포 표면 항원인 Fas/CD95에 대하여 기재하였다. Fas는 활성 T-세포, B-세포, 호중구, 및 흉선, 간, 심장과 폐, 및 성숙 마우스의 난소에서도 발현된다[Watanabe-Fukunaga et al., J. Immunolo. 148: 1274 (1992)]. Fas에 대한 모노클로날 Ab를 Fas에 가교시킨 실험에서도 고사가 유도됨이 확인되었다[Yonehara et al., J. Exp. Med. 169: 1747(1989); Trauth et al., Science 245: 301 (1989)]. 또한, Fas에 모노클로날 Ab가 결합하면 특정 조건하에서 T-세포를 자극할 수 있다는 일예도 제시되었다[Alderson et al., J. Exp. Med. 178: 2231 (1993)].

Fas 항원은 상대적 분자량이 45 Kd인 세포 표면 단백질이다. 인간과 쥐 모두의 Fas 유전자는 와타나베-후쿠나가 등[J. Immunol. 148: 1274 (1992)] 및 이토 등[Cell 66: 233 (1991)]에 의해 클로닝된 바 있다. 이 유전자들에 의해 암호된 단백질은 신경 증식 인자/종양 괴사 인자 수용체 상과와 구조적 상동성을 갖는 경막 단백질로서 모두 2가지 TNF 수용체인, 저친화도의 신경 증식 인자 수용체 및 LT_β수용체 CD40, CD27, CD30 및 OX40을 포함한다.

최근, Fas 리간드에 대하여 개시되었다[Suda et al., Cell 75:II69(1993)]. 이것의 아미노산 서열은 Fas 리간드가 TNF 과에 속하는 제II형의 경막 단백질이라는 것을 나타낸다. Fas 리간드는 비장세포와 흉선세포에서 발현된다. 정제된 Fas 리간드의 분자량은 40 kd이었다.

Fas/Fas 리간드 상호작용은 T-세포 활성화 후 고사에 필요한 작용임이 증명되었다[Ju et al., Nature 373: 444 (1995); Brunner et al., Nature 373: 441 (1995)]. T-세포가 활성화되면 세포 표면상에 상기 2가지 단백질을 모두 유도한다. 그 다음 리간드와 수용체의 상호작용은 세포를 고사시킨다. 이것은 고사의 조절 역할이 정상 면역 반응동안 Fas/Fas 리간드 상호작용에 의해 유도된다는 것을 지지한다.

본 발명의 폴리펩티드는 구조적, 생물학적 유사성을 기초로 할 때 TNF 리간드 상과의 신규 구성원으로 동정되었다.

분명한 것은, 정상 세포와 이상 세포의 활성화 및 분화를 조절하는 인자가 필요하다는 것이다. 따라서, 정상 상태 및 질병 상태에서 세포의 활성화 및 분화를조절하는 상기 인자를 동정하여 특성규명할 필요가 있다. 구체적으로, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환 및 림프절증의 치료시 고사를 조절하는 다른 Fas 리간드를 분리하여 특성규명할 필요가 있다.

도 1A 내지 도 1C는 AIM II의 뉴클레오티드 서열(서열번호 1) 및 이로부터 추론된 아미노산 서열(서열번호 2)을 도시한 것이다. 그 단백질의 추론된 분자량은 약 26.4 kDa이었다. 그 AIM II 단백질중 추정되는 경막 도메인에는 밑줄을 그었다.

도 2A 내지 도 2F는 본 발명의 AIM II 단백질의 아미노산 서열과, 인간 TNF-α(서열번호 3), 인간 TNF-β(서열번호 4), 인간 림프독소(서열번호 5) 및 인간 Fas 리간드(서열번호 6)의 아미노산 서열 간의 유사성 영역을 도시한 것이다.

도 3A 내지 도 3F는 AIM II 아미노산 서열의 분석 결과로서, 알파 영역, 베타 영역, 턴(turn) 영역 및 나선 영역; 친수성 및 소수성 영역; 양친매성 영역; 가요성 영역; 항원성 지수 및 표면 확률을 표시하였다. "항원성 지수 - 제임슨-울프" 그래프에서는, 도 1A 내지 도 1C에 기재된 아미노산 잔기 약 13 내지 20, 23 내지 36, 69 내지 79, 85 내지 94, 167 내지 178, 184 내지 196, 221 내지 233은 AIM II 단백질중에 표시된 고도 항원성 영역에 상응하였다.

발명의 요약

본 발명은 도 1A 내지 도 1C(서열번호 2)에 기재된 아미노산 서열 또는 1996년 8월 22일자에 ATCC 기탁번호 97689로서 박테리아 숙주중에 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가진 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자 분리물을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 핵산 분자 분리물을 함유하는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포 및 이러한 벡터와 숙주 세포를 제조하는 방법 및 이들을 재조합 기법을 통해 AIM II 폴리펩티드 또는 펩티드 생산에 사용하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 아미노산 서열을 가진 AIM II 폴리펩티드 분리물을 제공한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "AIM II" 폴리펩티드에는 막-결합 단백질(세포질 도메인, 경막 도메인 및 세포외 도메인 포함) 뿐만 아니라 AIM II 폴리펩티드 활성을 보유하는 절두(truncated) 단백질을 포함한다. 제1 양태로서, 가용성 AIM II 폴리펩티드는 AIM II 단백질의 세포외 도메인을 전체 또는 일부 포함하지만, 세포 막에 상기 폴리펩티드를 보유시킬 수 있는 경막 영역은 결실되어 있다.또한, 가용성 AIM II는 가용성 AIM II 단백질을 분비할 수만 있다면 경막 영역의 일부나 세포질 도메인의 일부 또는 다른 서열도 포함할 수 있다. 이종 시그널 펩티드를 가용성 AIM II 폴리펩티드의 N-말단에 융합시켜 가용성 AIM II 폴리펩티드가 발현시 분비될 수 있다.

또한, 본 발명은 AIM II 폴리펩티드, 구체적으로 인간 AIM-II 폴리펩티드를 제공하며, 이는 림프절증, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환을 치료하는 데 이용할 수 있고, 말초 내성을 자극하고, 일부 형질전환된 세포주를 파괴하며 세포 활성화 및 세포 증식을 매개하는데 이용할 수 있으며, 면역 조절과 염증 응답의 1차 매개인자로서 기능적으로 관련되어 있다.

또, 본 발명은 시험관내 세포, 생체외 세포 및 생체내 세포 또는 다세포 유기체에 투여하기 위한 AIM II 폴리뉴클레오티드 또는 AIM II 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 제공한다. 이러한 양태에 속하는 본 발명의 특히 바람직한 구체예로서, 본 발명의 조성물은 질환을 치료하기 위하여 숙주 개체중에서 AIM II 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 AIM II 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 것은 AIM II의 이상 내인성 활성과 관련있는 기능부전을 치료할 수 있도록 인체 환자 중에서 발현시키는 것이다.

또한, 본 발명은 AIM II에 의해 유도되는 세포 응답 반응을 증강 또는 억제할 수 있는 화합물을 동정하는 선별 방법을 제공하는데, 이는 AIM II를 발현하는 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계, 세포 응답 반응을 분석하는 단계 및 이 세포 응답 반응과 표준 세포 응답 반응을 비교하는 단계를 포함한다. 상기와 같은 방법에 의하여 상기 표준 세포 응답 반응은 시험 화합물을 첨가하지 않고 접촉반응시켜 분석하며, 표준 세포 응답 반응 보다 증가된 세포 응답 반응은 그 화합물이 작동물질임을 나타내고, 표준 세포 응답 반응보다 감소된 세포 응답 반응은 그 화합물이 길항물질이라는 것을 나타낸다.

제2 양태로서, 본 발명은 AIM II 작동물질 및 길항물질의 선별법을 제공한다. 길항물질은 패혈성 쇼크, 염증, 중추 말라리아, HIV 바이러스 활성화, 이식편-숙주 거부, 골흡수, 류마티스성 관절염 및 악액질(쇠약 또는 영양실조)을 예방하는데 이용할 수 있다.

본 발명의 제3 양태는 체내에 AIM II 활성 증가량을 필요로 하는 개체에게 본 발명의 AIM II 폴리펩티드 분리물이나 그 작동물질의 치료적 유효량을 함유하는 조성물을 투여하여 상기 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제4 양태는 체내에 AIM II 활성 감소량을 필요로 하는 개체에게 AIM II 길항물질의 치료적 유효량을 함유하는 조성물을 투여하여 상기 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

상세한 설명

본 발명은 클로닝된 cDNA를 서열 분석하여 결정된 도 1A 내지 도 1C에 도시한 아미노산 서열(서열번호 2)을 가진 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자 분리물을 제공한다. 본 발명의 AIM II 단백질은 인간 TNF-α(서열번호 3), 인간 TNF-β(서열번호 4), 인간 림프독소(서열번호 5) 및 인간 Fas 리간드(서열번호 6)와 서열 상동성을 갖고 있다(도 2A 내지 도 2F). 도 1A내지 도 1C(서열번호 1)에 기재된 뉴클레오티드 서열은 미국 매릴랜드주 20852, 록빌, 파크 론 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소에 1996년 8월 22일자로 기탁된 기탁 번호 97689의 cDNA 클론을 서열분석하여 얻었다. 기탁된 클론은 pBluescript SK(-) 플라스미드(캐나다 라 졸라에 소재하는 Stratagene으로부터 입수) 중에 함유되어 있다.

핵산 분자

다른 기재가 없는 한, 본 명세서에서 DNA 분자를 서열 분석하여 결정한 모든 뉴클레오티드 서열은 자동 DNA 서열분석기(예컨대, 모델 373 어플라이드 바이오시스템스, 인코포레이티드에서 입수)를 사용하여 결정하였고, 본 명세서에서 서열 결정된 DNA분자에 의해 암호되는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 전술한 바와 같이 결정된 DNA 서열의 해독에 의하여 예측하였다. 따라서, 이러한 자동 서열 분석법으로 결정된 모든 DNA 서열에 대하여 당업계에 공지된 바와 같이, 본 명세서에서 결정된 모든 뉴클레오티드 서열은 약간의 오류를 포함할 수 있다. 자동화로 측정된 뉴클레오티드 서열은 서열 분석된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 일반적으로 약 90% 이상, 보다 일반적으로 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 실제 서열은 당업계에 공지된 수동의 DNA 서열 결정법을 비롯한 기타 다른 접근법을 통해 보다 정확하게 결정될 수 있다. 또한, 당업계에 알려진 바와 같이, 실제 서열과 비교하여 소정의 뉴클레오티드 서열중 1개의 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 해독시 골격을 이동시키는 바, 이러한 삽입이나 결실 지점에서 시작하여 서열결정된 DNA 분자에 의해 실제 암호된 아미노산 서열은 소정의 뉴클레오티드 서열에의해 암호되는 추정적 아미노산 서열과 완전히 상이할 것이다.

AIM II 폴리펩티드를 암호하는 본 발명의 핵산 분자는 도 1A 내지 도 1C에 기재된 뉴클레오티드 서열과 같이 본 명세서에 제공된 정보를 사용하고, 출발 물질로서 mRNA를 사용하는 cDNA의 클로닝과 같이 표준 클로닝 및 선별 절차를 이용하여 얻을 수 있다. 본 발명의 일 예로서, 도 1A 내지 도 1C에 기재된 핵산 분자(서열번호 1)는 인간 대식세포 ox LDL(HMCCB64) 유래의 cDNA 라이브러리에서 발견되었다. 이 유전자는 활성화된 T-세포(HT4CC72) 유래의 cDNA 라이브러리에서도 동정되었다. 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II cDNA(서열번호 1)중 소정의 뉴클레오티드 서열은 도 1A 내지 도 1C에 기재된 뉴클레오티드 서열의 위치 49 내지 51에 개시 코돈을 가진 240개 아미노산 잔기의 단백질을 암호하는 오픈 리딩 프레임(서열번호 1), 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 60 내지 약 240의 아미노산 잔기를 함유하는 세포외 도메인(서열번호 2), 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 37 내지 약 59의 아미노산 잔기를 함유하는 경막 도메인(서열번호 2), 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 1 내지 약 36의 아미노산 잔기를 함유하는 세포내 도메인(서열번호 2)을 함유하며, 추정되는 분자량은 약 26.4 kDa이다. 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II 단백질(서열번호 2)은 인간 Fas 리간드의 아미노산 서열(도 2A 내지 도 2F)과 약 27% 동일하고 약 51% 유사하며, 인간TNF-α의 아미노산 서열(도 2A 내지 도 2F)과 약 26% 동일하고 약 47% 유사하다.

당업자라면 충분히 이해할 수 있는 바와 같이, 전술한 서열분석시의 오류 가능성으로 인하여, 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 추정상의 AIM II 폴리펩티드는약 240개의 아미노산을 함유하지만, 230개 내지 250개 범위에 속하는 임의의 아미노산 일 수 있다. 또한 AIM II 폴리펩티드중 세포외, 세포내 및 경막 도메인의 정확한 "주소"는 사용된 기준에 따라 약간씩 다르다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 자명한 것이다. 예컨대, 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II 세포외 도메인(서열번호 2)의 정확한 위치는 도메인을 정의하는데 사용된 기준에 따라 약간씩 다를 수 있다(예컨대, 주소는 약 1 내지 5 잔기 "이동"될 수 있음).

표시된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 mRNA 같은 RNA 형태이거나, 또는 클로닝이나 합성에 의해 얻어지는 cDNA와 게놈 DNA를 비롯한 DNA 형태일 수 있다. DNA는 2본쇄이거나 1본쇄일 수 있다. 1본쇄 DNA 또는 RNA는 센스 가닥으로도 알려진 암호 가닥이거나, 안티센스 가닥이라고도 하는 비암호 가닥일 수 있다.

핵산 분자 "분리물"이란 천연 환경에서 분리된 핵산 분자인 DNA 또는 RNA를 포함한다. 예컨대, 벡터 중에 함유된 재조합 DNA 분자는 본 발명에 있어서는 분리물로 간주한다. DNA 분자 분리물의 다른 예로는 이종 숙주 세포에서 유지되는 재조합 DNA 분자 또는 용액 상태의 (부분 또는 거의) 정제된 DNA 분자를 포함한다. RNA 분자 분리물은 본 발명에 속하는 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물을 포함한다. 본 발명에 따른 핵산 분자 분리물에는 합성적으로 생성된 분자도 추가로 포함한다.

본 발명에 따른 핵산 분자 분리물로는 도 1A 내지 도 1C에 도시된 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하는 DNA 분자(서열번호 1); 도 1A 내지 도 1C에 도시된 AIM II 단백질의 암호 서열을 함유하는 DNA 분자(서열번호 2); 및 전술한 서열과는 상당히다른 서열을 함유하지만 유전자 암호의 축퇴로 인하여 AIM II 단백질은 여전히 암호하는 DNA 분자를 포함한다. 물론, 유전자 암호는 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 이러한 축퇴 변형체를 만드는 것은 당업자에게 통상적인 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 1996년 8월 22일자로 기탁된 ATCC 기탁번호 97689의 플라스미드내에 함유된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 핵산 분자 분리물을 제공한다. 이 핵산 분자는 전술한 바와 같이 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호된 폴리펩티드를 암호하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 도 1A 내지 도 1C에 기재된 뉴클레오티드 서열(서열 1) 또는 전술한 바와 같이 기탁된 클론 중에 함유된 AIM II cDNA의 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자 분리물 또는 전술한 서열 중 어느 하나의 서열에 상보적인 서열을 가진 핵산 분자를 제공한다. 이와 같은 분자, 특히 DNA 분자 분리물은 염색체를 이용한 동일계 하이브리드화에 의한 유전자 지도 작성의 프로브, 및 인간 조직에서 노던 블롯 분석 등에 의한 AIM II 유전자 발현 검출의 프로브로서 유용하다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 핵산 분자 분리물의 단편에 관한 것이다. 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열이나 도 1A 내지 도 1C(서열 1)에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자 분리물의 단편이란, 본 명세서에 기재되는 바와 같은 진단 프로브와 프라이머로서 유용한, 길이가 약 15 nt 이상, 보다 바람직하게는 약 20 nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30 nt 이상, 가장 바람직하게는 약 40 nt 이상인 단편을 의미한다. 물론, 길이가 50 내지 1500 nt인 보다 큰 단편들도 기탁된 cDNA 또는 도 1A 내지 도 1C(서열번호 1)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드서열중 전체는 아니지만 대부분에 상응하는 단편처럼 본 발명에 유용하게 사용된다. 예컨대, 길이가 20 nt 이상인 단편이란 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열이나 도 1A 내지 도 1C에 기재된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)로부터 20개 이상인 인접 염기를 함유하는 단편을 의미한다.

본 발명의 바람직한 핵산 단편은 AIM II 단백질의 에피토프 함유 부분을 암호하는 핵산 분자를 포함한다. 구체적으로, 이와 같은 본 발명의 핵산 단편은 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 13 내지 약 20의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 23 내지 약 36의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 69 내지 약 79의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 85 내지 약 94의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 167 내지 약 178의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 184 내지 약 196의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 221 내지 약 233의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2)를 암호하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명자들은 전술한 폴리펩티드 단편들이 AIM II 단백질의 항원성 영역임을 결정하였다. 이러한 AIM II 단백질의 에피토프 함유 부분을 측정하는 방법에 대해서는 이하에 상세하게 설명하겠다.

AIM II 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따라 각종 용도, 구체적으로 AIM-II의 화학적 성질 및 생물학적 성질을 이용하는 용도들에 사용될 수 있다. 이러한 용도중에는 자가면역 질환 및 이상 세포 증식이 있다. 또 다른 용도로는 세포, 조직 및 유기체의 질환을 진단 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 예컨대 진단 시약으로서 상보성 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 AIM II 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 기능부전과 관련있는 AIM-II의 돌연변이 형태에 대한 검측은 예컨대 자가면역 질환과 같이 AIM-II의 발현 저하, 발현 과잉 또는 발현 이상에서 유래되는 질환에 대한 감수성이나 질환에 대한 진단을 부가하거나 규명하는 진단 기구로서 이용될 수 있다. 또한, AIM-II를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 이 유전자가 췌장 종양, 정소 종양, 자궁내막 종양 및 T-세포 림프종을 비롯한 많은 종양 세포주에서 발견되는 바, 본 발명의 폴리펩티드 발현에 진단 마커로서 이용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건하에서 전술한 본 발명의 핵산 분자, 예컨대 ATCC 기탁번호 97689호 중에 함유된 cDNA 클론에 존재하는 일부 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자 분리물에 관한 것이다. "엄격한 하이브리드화 조건"이란 50% 포름아미드, 5×SSC (150 mM NaCl, 15 mM 구연산 3나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH 7.6), 5×덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 g/㎖ 변성, 절단된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 중 42℃하에 하룻밤동안 항온처리한 뒤, 약 65 ℃에서 0.1×SSC로 필터를 세척하는 것을 의미한다.

폴리뉴클레오티드의 "일부"에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드란 대조 폴리뉴클레오티드에 대하여 약 15개 이상의 뉴클레오티드(nt), 보다 바람직하게는 약20개 nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30개 nt 이상, 가장 바람직하게는 약 30개 내지 70개 nt에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같은 진단 프로브 및 프라이머로서 유용하며, 이하에 보다 상세하게 설명된다.

예컨대, "길이가 20개 nt 이상"인 일부 폴리뉴클레오티드란 대조 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에서 유래한 20개의 이상 인접 뉴클레오티드를 의미한다[예컨대, 기탁된 cDNA 또는 도 1A 내지 1C에 기재된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)].

물론, 폴리 A 서열(예컨대, 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II cDNA의 3' 말단 폴리(A) 트랙) 또는 T(또는 U) 잔기의 상보적 스트레치에만 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산 일부와 하이브리드하는데 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않는데, 그 이유는 상기와 같은 폴리뉴클레오티드가 폴리(A) 스트레치 또는 그 보체(예컨대, 실제 모든 2본쇄 cDNA 클론)를 함유하는 모든 핵산 분자에 하이브리드하기 때문이다.

전술한 바와 같이, AIM II 폴리펩티드를 암호하는 본 발명의 핵산 분자는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호하는 서열 그 자체; 폴리펩티드의 암호 서열과 예컨대 리더 또는 분비 서열을 암호하는 서열 같은 추가 서열(예를들면, 프리단백질(preprotein), 또는 프로단백질(proprotein)이나 프리프로단백질(preproprotein) 서열); 전술한 추가 암호 서열의 존부와 상관없이 폴리펩티드의 암호서열과 또다른 비암호 서열, 예컨대 인트론 및 비암호 5' 및 3'서열, 예컨대 전사, 스플라이싱과 폴리아데닐화 시그널을 비롯한 mRNA 프로세싱에서 중요한 역할(즉, mRNA의 리보솜 결합과 안정성)을 하는 전사된 비해독 서열 추가 기능을 제공하는 서열과 같은 또다른 아미노산을 암호하는 추가 암호 서열을 포함할 수 있지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 따라서, 폴리펩티드를 암호하는 서열은 마커 서열, 예컨대 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 암호하는 서열에 융합될 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에 속하는 바람직한 특정 구체예에 있어서, 마커 아미노산 서열은 다양한 시판품중에서도 pQE 벡터(퀴아겐, 인코포레이티드)에서 제공되는 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩티드이다. 문헌[Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989)]에 기재된 바와 같이, 예컨대 핵사-히스티딘은 융합 단백질의 정제를 용이하게 한다. "HA" 태그는 정제에 유용한 또다른 펩티드로서, 문헌[Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)]에 개시된 바와 같이 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 유래의 에피토프에 상응한다. 하기 기술되는 바와 같이, 기타 다른 융합 단백질로는 N-말단이나 C-말단에 Fc가 융합되어 있는 AIM II를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 N-말단 메티오닌이 결실된 전장(full-length) AIM-II 폴리펩티드를 암호하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명은 추가로 AIM II 단백질의 일부, 유사체 또는 유도체를 암호하는 본 발명의 핵산 분자의 변이체에 관한 것이다. 변이체는 천연 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생할 수 있다. "대립유전자 변이체"란 유기체의 염색체 위에서 소정의 위치를 차지하는 유전자의 여러 형태 중의 1가지 형태를 의미한다[Genes II,Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)]. 비천연발생의 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이 기법을 사용하여 제조할 수 있다.

이러한 변이체로는 1개 이상의 뉴클레오티드가 관여할 수 있는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 첨가를 통해 생성되는 것을 포함한다. 이 변이체는 암호 영역, 비암호 영역, 또는 두 영역 모두에서 변형될 수 있다. 암호 영역의 변형은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 만들 수 있다. 이 중에서 특히 바람직한 것은 AIM II 단백질이나 그 일부의 활성과 성질을 변형시키지 않는 침묵 치환, 첨가 및 결실이다. 이러한 관점에서, 보존적 치환이 특히 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태는 (a) 도 1A 내지 도 1C의 완전 아미노산 서열을 가진 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2); (b) ATCC 기탁 번호 97689호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호되는 완전 아미노산 서열을 가진 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; (c) AIM II 폴리펩티드 세포외 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열; (d) AIM II 폴리펩티드 경막 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열; (e) AIM II 폴리펩티드 세포내 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열; (f) 경막 도메인은 결실되어 있으나, 세포외 도메인과 세포내 도메인을 가진 가용성 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 및 (g) 상기 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에 속하는 뉴클레오티드 서열 중 임의의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성되는 군 중에서 선택되는 서열과 90% 이상, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자 분리물에 관한 것이다.

AIM II 폴리펩티드를 암호하는 대조 뉴클레오티드 서열과 예컨대 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드란 이 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 대조 서열과 동일하지만 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 대조 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 각 100개당 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 즉, 대조 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는 대조 서열의 뉴클레오티드 중 최대 5%를 다른 뉴클레오티드로 치환 또는 결실시키거나, 또는 대조 서열의 총 뉴클레오티드 중 최대 5%에 해당하는 뉴클레오티드의 수를 대조 서열에 삽입할 수도 있다. 이와 같은 대조 서열의 돌연변이는 대조 뉴클레오티드 서열의 5' 말단이나 3' 말단 위치에서 일어나거나, 또는 그 말단 사이에서 대조 서열의 뉴클레오티드 중에 각각 개재하거나, 대조 서열에 존재하는 1개 이상의 인접 기들중에 개재할 수 있다.

실질적인 문제로서, 임의의 특정 핵산 분자가 예컨대 도 1A 내지 도 1C에 기재된 뉴클레오티드 서열이나 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열에 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한지 여부는 Bestfit 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적 방식에 의하여 결정할 수 있다. Bestfit는 두 서열간에 최대의 상동성 단편을 찾기 위하여 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)]의 국소적 상동성 알고리듬을 사용한다.특정 서열이 예컨대 본 발명의 대조 서열과 95% 동일한지를 측정하기 위하여 Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 전장 대조 뉴클레오티드 서열에 대하여 동일성 %를 계산하고 대조 서열의 뉴클레오티드 총 수에 대해 최대 5%까지만 상동성 갭이 허용되도록 매개변수를 설정해야 한다.

본 발명은 AIM II 활성을 가진 폴리펩티드를 암호하는지에 관계없이 도 1A 내지 도 1C에 기재된 핵산 서열(서열 1) 또는 기탁된 cDNA의 핵산 서열과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자에 관한 것이다. 이것은 특정 핵산 분자가 AIM II 활성을 가진 폴리펩티드를 암호하지 않는 경우라도 당업자라면 예컨대 하이브리드화 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 상기 핵산 분자를 사용하는 방법을 알기 때문이다. AIM II 활성을 가진 폴리펩티드를 암호하지 않는 본 발명의 핵산 분자의 용도로는, 특히 (1) cDNA 라이브러리에서 AIM II 유전자 또는 이의 대립유전자 변이체의 분리; (2) 문헌[Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]에 기재된 바와 같이 AIM II 유전자의 정확한 염색체 위치를 제공하기 위한, 중기 염색체 분포(spread)에 대한 동일계내 하이브리드화(예, "FISH"); 및 특정 조직에서 AIM II mRNA 발현을 검측하기 위한 노던 블롯 분석시의 용도를 포함한다.

하지만, 도 1A 내지 도 1C(서열 1)에 기재된 핵산 서열 또는 사실상 AIM II 단백질 활성을 가진 폴리펩티드를 암호하는 기탁된 cDNA의 핵산 서열과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 가진 핵산 분자가 바람직하다. "AIM II 활성을 가진 폴리펩티드"란 특정 생물검정법으로 측정했을 때 본 발명의 AIM II단백질 활성과 반드시 동일하지는 않지만 유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 예컨대, 문헌[Zarres et al., Cell 70: 31-46 (1992)]에 기재된 바와 같이 고사를 입증하기 위한 요오드화 프로피듐 염색법을 사용하여 AIM II 단백질 세포독성 활성을 측정할 수 있다. 대안적으로, AIM II 유도성 고사는 문헌[Gavierli et al., J. Cell. Biol. 119: 493-501 (1992)]에 기재된 바와 같이 TUNEL 염색을 사용하여 측정할 수 있다.

요오드화 프로피듐 염색에 대하여 간략히 설명하면 다음과 같다. 조직이나 배양물의 세포를 포름알데히드로 고정시키고, 동결 단편으로 절단한 뒤, 요오드화 프로피듐으로 염색하는 것이다. 동촛점 형광 현미경을 사용하면 세포 핵을 요오드화 프로피듐에 의해 관찰할 수 있다. 세포 사멸은 핵농축(염색체 군집, 수축 및/또는 핵 단편화)을 통해 관찰된다.

물론, 유전자 암호의 축퇴로 인하여 도 1A 내지 도 1C에 기재된 핵산 서열(서열번호 1) 또는 기탁된 cDNA 핵산 서열과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 가진 다수의 핵산 분자가 "AIM II 단백질 활성을 가진" 폴리펩티드를 암호할 것이라는 것은 당업자에게는 자명한 것이다. 실제로, 이러한 뉴클레오티드 서열의 축퇴 변이체가 모두 동일한 폴리펩티드를 암호하는 바, 전술한 비교 분석을 실시하지 않아도 당업자는 분명히 알 수 있을 것이다. 또한, 축퇴 변이체가 아닌 전술한 핵산 분자들도 적당한 수가 AIM II 단백질 활성을 가진 폴리펩티드를 암호한다는 것은 당업자라면 충분히 이해하는 것이다. 이는 당업자라면 단백질 기능에 거의 영향이 없거나 상당한 영향을 미치지 않는 아미노산 치환(예컨대, 제1지방족 아미노산을 제2 지방족 아미노산으로 치환)을 충분히 인식하고 있기 때문이다.

예컨대, 표현형적 침묵 아미노산 치환을 제조하는 방법에 대해서는 문헌[Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247: 1306-1310 (1990)]에 제시되어 있으며, 여기서 단백질들이 아미노산 치환에 대하여 매우 내성적임을 나타내고 있다.

벡터 및 숙주 세포

본 발명은 본 발명의 DNA 분자 분리물을 함유하는 벡터, 이 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법을 통한 AIM II 폴리펩티드 또는 그 단편의 제조에 관한 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 숙주 내 전파에 대한 선별용 마커를 함유하는 벡터에 연결시킬 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산 칼슘 침전물과 같은 침전물이나, 하전된 지질과의 복합체 형태로 도입시킨다. 벡터가 바이러스인 경우에는 적당한 패키징 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키지한 다음 숙주 세포로 형질도입시킬 수 있다.

DNA 삽입체는 적당한 프로모터, 예컨대 파지 람다 PL 프로모터,E.coli lac, trp및tac프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터 등에 작동적으로 결합되어야 한다. 당업자라면 기타 다른 적합한 프로모터도 알고 있을 것이다. 또한, 발현 작제물은 전사 개시 부위, 종지 부위 및 전사 영역내에 해독시의 리보솜 결합 부위를 추가로 포함할 것이다. 이러한 작제물에 의해 발현되는 성숙한 전사체의 암호 부위는 해독되는 폴리펩티드의 말단에 적당하게 위치된 개시 및 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)에서 개시하는 해독 부위를 포함하는 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이, 발현 벡터는 1가지 이상의 선별용 마커를 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 마커로는 진핵 세포 배양에 대한 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성 유전자, 및E.coli와 기타 박테리아 배양에 대한 테트라사이클린이나 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 적당한 숙주의 대표적인 예로는E.coli, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella typhimurium) 세포 같은 박테리아 세포; 효모 세포와 같은 진균 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS 및 보웨스(Bowes) 흑색종 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포를 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 전술한 숙주 세포에 적당한 배양 배지와 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있다.

박테리아에 사용하기에 바람직한 벡터중에는 퀴아겐에서 입수가능한 pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트라타진에서 입수가능한 pBS 벡터, 파지스크립트 벡터, 블루스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 파마시아에서 입수가능한 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함한다. 바람직한 진핵 벡터중에는 스트라타진에서 입수가능한 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 및 파마시아에서 입수가능한 pSVK3, pBPN, pMSG 및 pSVL을 포함한다. 당업자라면 기타 다른 적합한 벡터들을 충분히 알고 있을 것이다.

숙주 세포내로 작제물을 도입하는 데에는 인산 칼슘 형질감염법, DEAE-덱스트란 매개의 형질감염법, 양이온 지질 매개의 형질감염법, 전기천공법, 형질도입법, 감염법이나 기타 다른 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 많은 표준 실험서, 예컨대 Davies et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)에 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 융합 단백질과 같이 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 분비 시그널 뿐만 아니라 또 다른 이종 작용성 영역을 포함할 수도 있다. 예컨대, 다른 아미노산, 구체적으로 하전된 아미노산들의 일정 영역을 폴리펩티드의 N-말단에 첨가하면, 정제 또는 후속 취급과 저장 동안 숙주 세포 중에서의 안정성과 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하기 위하여 폴리펩티드에 펩티드 부를 첨가할 수도 있다. 이러한 영역은 폴리펩티드의 최종 정제 이전에 제거할 수 있다. 분비 또는 배출을 유발하고, 안정성을 증가시키며 정제를 용이하게 하기 위하여 폴리펩티드에 펩티드 부를 첨가하는 방법은 당해 기술 분야에 통상적인 기법이다. 바람직한 융합 단백질은 단백질을 가용화하는 데 유용한 면역글로불린 유래의 이종 영역을 함유한다. 예컨대, EP-A-0 464 533(캐나다 대응 특허 2045869)호는 또 다른 인간 단백질이나 그 일부와 함께 면역글로불린 분자의 불변부중 각종 부분을 함유하는 융합 단백질에 대하여 개시하고 있다. 대부분의 경우, 융합 단백질 중의 Fc 부분은 치료법과 진단법에 사용하기가 매우 좋고, 따라서 향상된 약물역학적 성질을 제공한다(EP-A 0232 262). 한편, 일부 경우에는 융합 단백질을 전술한 바와 같이 유리한 방법으로 발현, 검출 및 정제한 후에 Fc 부를 결실시키는 것이 바람직하다. 이러한 경우는 Fc 부분이 치료 및 진단시 방해가 되는 것으로 입증된 경우로서, 예컨대 융합 단백질을 면역화의 항원으로서 사용해야만 하는 경우이다. 약물 발견에 있어서, 예컨대 hIL5와 같은 인간 단백질은 hIL-5의 길항물질을 동정하는 높은 처리량의 선별법을 목적으로 Fc 부와 융합시켜 사용한 바 있다[D.Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, Vol. 8:52-58(1995) 및 K.Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol.270, No. 16:9459-9471(1995)].

AIM II 단백질은 재조합 세포 배양물로부터 황산 암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 공지의 방법들로 회수·정제할 수 있다. 보다 바람직하게는, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")를 정제에 사용한다. 본 발명의 폴리펩티드는 천연 정제 생성물, 화학 합성 방법의 생성물 및 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포 등을 비롯한 원핵 숙주 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기법으로 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생성 방법에 이용된 숙주에 따라 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나 비글리코실화된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 초기에 변형된 메티오닌 잔기를 함유하는데, 이것은 몇몇 경우에 숙주 매개의 과정을 통한 것이다.

AIM II 폴리펩티드 및 단편

본 발명은 기탁된 cDNA에 의해 암호된 아미노산 서열 또는 도 1A 내지 도 1C에 기재된 아미노산 서열(서열번호 2)을 가진 분리된 AIM II 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드중 일부를 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다.

AIM II 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 큰 영향을 미치지 않고 변화될 수 있다. 이러한 서열의 차이를 살펴보면 활성을 결정하는 중요 영역이 단백질 상에 존재한다는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명은 실질적인 AIM II 폴리펩티드 활성을 나타내거나 또는 하기 기술되는 단백질 부위와 같은 AIM II 단백질 영역을 포함하는 AIM II 폴리펩티드의 변이를 포함한다. 이러한 돌연변이로는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 타입 치환을 포함한다. 전술한 바와 같이, 표현적으로 침묵일 가능성이 있는 아미노산 변화에 관한 안내는 문헌[Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino acid Substitutions," Science 247: 1306-1310 (1990)]에 설명되어 있다.

따라서, 도 1A 내지 도 1C(서열번호 2)에 기재되거나, 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 아미노산 잔기중의 1개 이상이 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기로 치환되고(보존적 아미노산 잔기로의 치환이 바람직함), 이와 같이 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호되거나 암호되지 않는 것; (ii) 아미노산 잔기중 1개 이상이 치환기를 포함하는 것; (iii) 성숙한 폴리펩티드가 이 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 기타 다른 화합물과 융합된 것; 또는 (iv) 성숙 폴리펩티드에 부가 아미노산, 예컨대 IgG Fc 융합 영역 펩티드 또는 리더 서열이나 분비 서열 또는 성숙한 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제에 이용되는 서열 융합시킨 것이다. 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 본 명세서에 기재된 내용으로부터 당업자라면 충분히 이해할 수 있는 범위 이내이다.

특히 바람직한 것은 하전된 아미노산을 다른 하전된 아미노산과 중성 또는 음하전된 아미노산으로 치환시키는 경우이다. 중성 또는 음하전된 아미노산으로 치환시키는 경우에는 양전하가 감소된 단백질을 만들어 AIM II 단백질의 특성이 향상된다. 응집 예방도 매우 필요하다. 단백질의 응집은 활성을 손실시킬 뿐만 아니라 면역원성을 나타내어 약학 조성물 제조시 문제가 되기도 한다. [Pinckard et al., Clin Exp. Immunol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377 (1993)].

또한, 아미노산을 치환시키면 세포 표면 수용체에 대한 결합 선택성이 변화할 수도 있다. 오스타드 등(Ostade et al.)은 문헌[Nature 361: 266-268 (1993)]에서 2가지 공지 형태의 TNF 수용체 중 단지 1가지 형태에만 TNF-α를 선택적으로 결합시키는 특정 돌연변이에 대하여 기술하고 있다. 따라서, 본 발명의 AIM II 수용체는 천연 돌연변이나 인간의 조작을 통한 1종 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함한다.

하기 제시되는 바와 같이, 변화는 단백질의 폴딩이나 활성에 큰 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환과 같은 미세한 성질 변화인 것이 바람직하다(표 1).

보존적 아미노산 치환
방향족 아미노산	페닐알라닌, 트립토판, 티로신
소수성 아미노산	류신, 이소류신, 발린
극성 아미노산	글루타민, 아스파라긴
염기성 아미노산	아르기닌, 라이신, 히스티딘
산성 아미노산	아스파르트산, 글루탐산
소형 아미노산	알라닌, 세린, 쓰레오닌, 메티오닌, 글리신

기능에 필수적인 본 발명의 AIM II 단백질에 존재하는 아미노산은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 부위 지시성 돌연변이법 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이법[Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)]으로 확인할 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이법은 분자 중의 매 잔기마다 하나의 알라닌 돌연변이를 도입한다. 생성된 돌연변이 분자는 수용체 결합이나 시험관내 또는 생체내 증식 활성과 같은 생물학적 활성에 대하여 시험한다. 또한, 리간드 수용체 결합에 중요한 부위는 결정법, 핵자기 공명법 또는 광친화성 표지화와 같은 구조 분석을 통해 측정할 수 있다[Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) 및 de Vos et al., Science 255: 306-312 (1992)].

본 발명의 폴리펩티드는 분리형으로 제공되는 것이 바람직하다. "폴리펩티드 분리물"이란 천연 환경에서 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 재조합 숙주 세포 중에서 생성되어 함유되어 있는 폴리펩티드는 본 발명을 위하여 "분리된" 것으로 간주한다. 또한, "폴리펩티드 분리물"은 재조합 숙주로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩티드일 수 있다. 예컨대, 재조합 적으로 생성된 AIM II 폴리펩티드 형태는 문헌[Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (1988)]에 기재된 1단계 방법에 의하여 실질적으로 정제할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 기탁된 cDNA에 의해 암호된 폴리펩티드, 도 1A 내지 도 1C에 기재된 폴리펩티드(서열번호 2), N-말단 메티오닌이 결실된 도 1A 내지 도 1C에 기재된 폴리펩티드(서열번호 2), 세포외 도메인, 경막 도메인, 세포내 도메인, 경막 도메인은 결실되어 있으나 세포외 도메인과 세포내 도메인중 일부 또는 전부를 함유하는 가용성 폴리펩티드, 뿐만 아니라 기탁된 cDNA에 의해 암호된 폴리펩티드, 도 1A 내지 도 1C에 기재된 폴리펩티드(서열번호 2)와 80% 이상 동일하고, 보다 바람직하게는 90% 이상 또는 95% 이상 동일하며, 보다 더 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩티드와, 이 폴리펩티드중 30개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 함유하는 부분을 포함하는 폴리펩티드도 포함된다.

AIM II 폴리펩티드의 대조 아미노산 서열과 예컨대 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드란 이 폴리펩티드의 아미노산 서열이 AIM II 폴리펩티드의 대조 아미노산 각 100개 마다 최대 5개 아미노산에 변형을 포함하는 것을 제외하고는 대조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 즉, 대조 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 얻기 위해서는 대조 서열 중의 최대 5%의 아미노산 잔기가 결실 또는 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 대조 서열 중의 총 아미노산 잔기 중 최대 5%의 아미노산 수가 대조 서열 중에 삽입된다는 것을 의미한다. 이러한 대조 서열의 변형은 대조 아미노산 서열 중 아미노 말단 위치나 카르복시 말단 위치에서 일어나거나, 또는 대조 서열 중에 존재하는 잔기들사이에 각각 개재된 이 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어나게, 또는 대조 서열 중에 1개 이상의 인접 기들에서 일어날 수 있다.

실제로, 임의의 특정 폴리펩티드가 예컨대 도 1A 내지 도 1C에 기재된 아미노산 서열(서열번호 2) 또는 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호된 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한지 여부에 대해서는 Bestfit 프로그램(미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹의 Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적인 방식으로 측정할 수 있다. 특정 서열이 본 발명의 대조 서열과 예컨대 95% 동일한 지를 측정하기 위해 Bestfit 프로그램이나 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우에는 동일성의 비율을 대조 아미노산 서열 전 길이를 통해 계산하여 상동성 갭이 대조 서열 중에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수 중 최대 5% 정도가 되도록 매개변수를 설정해야 한다.

본 명세서에 사용된 "AIM II" 폴리펩티드란 AIM II 폴리펩티드 활성을 보유하는 절두 단백질 뿐만 아니라 막결합 단백질(세포질 도메인, 경막 도메인 및 세포외 도메인 함유)을 포함한다. 1가지 구체예로서, 가용성 AIM II 폴리펩티드는 AIM II 단백질의 세포외 도메인중 일부 또는 전부를 포함하지만, 그 폴리펩티드를 세포 막 상에 존재하게 하는 경막 영역은 결실되어 있다. 또한, 가용성 AIM II는 이 단백질이 분비될 수만 있다면 경막 영역의 일부 또는 세포질 도메인의 일부나 다른 서열도 함유할 수 있다. 이종의 시그널 펩티드가 가용성 AIM II 폴리펩티드의 N 말단에 융합되어 가용성 AIM II 폴리펩티드가 발현시 분비시킬 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하는 SDS-PAGE 겔이나 분자체 겔 여과 컬럼 중에서 분자량 마커로서 이용할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드중 에피토프 보유 부분을 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드 부분의 에피토프는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"란 단백질 전체가 면역원인 경우 항체 반응을 유도하는 단백질의 일부를 의미한다. 한편, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역은 "항원성 에피토프"라고 정의한다. 단백질중에 존재하는 면역원성 에피토프의 수는 항원성 에피토프의 수보다 적다. 예컨대, 문헌[Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983)]을 참조하라.

항원성 에피토프를 가진(즉, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 함유하는) 펩티드 또는 폴리펩티드의 분비와 관련하여, 단백질 서열 중 일부와 유사한 비교적 짧은 합성 펩티드는 통상적으로 부분적으로 유사한 단백질과 반응성인 항혈청을 유도할 수 있다는 것은 당해 기술분야에 공지되어 있다[Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N. and Learner, R.A.(1983) Antibodies that react with predetermined sites on proteins. Science 219: 660-666]. 단백질 반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩티드는 주로 단백질의 1차 서열에서 제시되며, 단순한 일군의 화학적 규칙에 의하여 특정될 수 있으며, 본래 단백질의 면역우성 영역(즉, 면역원성 에피토프) 또는 아미노 말단이나 카르복시 말단에만 제한되지 않는다.

따라서, 본 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 비롯한 항체를 유발시키는데 유용하다[Wilson et al. Cell 37:767-778(1984)중 777면 참조].

본 발명의 항원성 에피토프 함유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중에 함유된 아미노산 중, 바람직하게는 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 가장 바람직하게는 약 15개 내지 30개 이상의 아미노산을 함유하는 서열을 포함한다.

AIM II 특이적인 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 비제한적인 예로는 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 13 내지 약 20의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 23 내지 약 36의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 69 내지 약 79의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 85 내지 약 94의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 167 내지 약 178의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 184 내지 약 196의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2); 및 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 221 내지 약 233의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열번호 2)를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 상기 폴리펩티드 단편이 AIM II 단백질의 항원성 영역임을 밝혔다.

본 발명의 에피토프 함유 펩티드 및 폴리펩티드는 통상적인 모든 방법으로생성할 수 있다. 예컨대, 문헌[Houghten, R.A. (1985) General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135]을 참조하라. 이러한 "동시 다중 펩티드 합성법(Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)"은 휴튼 등(1986)에 의한 미국 특허 제4,631,211호에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 AIM II 폴리펩티드는 림프절증을 유발시키는 림프증식 질환을 치료하는 데 이용할 수 있으며, AIM II는 T 세포 클론의 결실을 자극하여 고사를 매개하는 바, 자가면역 질환을 치료하고 말초 내성 및 세포독성 T 세포 매개의 고사를 자극하는 데 이용할 수 있다. 또한, AIM II는 전신홍반성루푸스(SLE), 면역증식 질환 림프절증(IPL), 혈관면역증식 림프절증(AIL), 면역아세포 림프절증(IBL), 류마티스성 관절염, 당뇨병과 다발성 경화증, 알러지를 비롯한 자가면역 질환의 생물학을 해명하는 연구 도구로서 이용하고 이식편대숙주 질환을 치료하는 데 이용할 수 있다.

본 발명의 AIM II 폴리펩티드는 종양 세포 증식과 같은 증식이상을 억제하는데 이용할 수 있다. AIM II 폴리펩티드는 특정 세포에 대한 세포독성과 고사를 통한 종양 파괴에 주요 역할을 한다. 또한, AIM II는 표피세포 기원의 세포에 대해 증식 효과를 나타내는 바, 증식 촉진 활성을 요구하는 질환, 예컨대 재발협착증을 치료하는 데 이용할 수 있다. 따라서, AIM II는 표피 세포 발생에 있어서 혈액생성을 조절하는 데 이용할 수 있다.

본 발명은 수용체 분자와 같이 AIM II에 결합하는 분자를 동정하는 방법을 제공한다. 수용체 단백질과 같이 AIM II에 결합하는 단백질을 암호하는 유전자는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 확인할 수 있는 데, 그 예로는 리간드 패닝 및 FACS 분류법이 있다. 이러한 방법은 예컨대 문헌[Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1(2):Chapter 5(1991)]과 같은 많은 실험서에 개시되어 있다.

예컨대, 이러한 목적을 위해 발현 클로닝을 이용할 수도 있다. 이 방법을 위해, AIM II에 응답성인 세포로부터 폴리아데닐화된 RNA를 제조하고, 이 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 만든 뒤, 이 라이브러리를 푸울로 나누고, 이 푸울을 이용하여 AIM II에 응답성이 아닌 세포를 각각 형질감염시킨다. 그 다음 형질감염된 세포를 표지된 AIM II에 노출시킨다(AIM II는 방사능 요오드화 또는 부위 특이적 단백질 키나제의 인식 부위를 내포시키는 표준 방법을 비롯한 공지의 다양한 방법으로 표지화시킬 수 있다). 노출 후, 세포를 고정시킨 뒤 AIM II의 결합성을 측정한다. 이 절차는 유리 슬라이드 상에서 실시하는 것이 편리하다.

AIM II 결합성 세포를 생성하는 cDNA에 대하여 푸울을 조사한다. 양성군을 이용하여 하위 푸울을 만든 뒤, 숙주 세포를 형질감염시킨 다음 전술한 바와 같이 선별한다. 하위 푸울화 및 재선별 과정을 반복적으로 실시하면, 추정상의 결합 분자, 예컨대 수용체 분자를 암호하는 1개 이상의 단일 클론을 분리할 수 있다.

대안적으로, 표지된 리간드를 이 리간드가 결합하는 분자, 예컨대 수용체 분자를 발현하는 세포로부터 제조한 세포 추출물, 예컨대 막이나 막의 추출물에 광친화적으로 결합시킬 수 있다. 가교 결합된 물질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동("PAGE")을 통해 분리하여 X선 필름에 노출시킨다. 리간드-수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절단해내어 펩티드 단편으로 분리한 뒤, 단백질 미세서열분석(microsequencing)한다. 미세서열분석으로부터 얻은 아미노산 서열은 cDNA 라이브러리를 선별하기 위해 고유의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인하는 데 사용함으로써 추정상의 수용체 분자를 암호하는 유전자를 동정할 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 세포 또는 무세포 제조물 중에서 수용체 분자와 같은 AIM II 결합 분자의 AIM II 결합능을 평가하는 데 이용할 수 있다.

당업자라면, 전술한 본 발명의 AIM II 폴리펩티드 및 이의 에피토프 함유 단편을 면역글로불린(IgG)의 불변부중 일부분과 결합하여 키메라 폴리펩티드를 생성할 수 있다는 것을 충분히 이해할 것이다. 이 융합 단백질은 정제를 용이하게 하고 생체 내에서 증가된 반감기를 나타낸다. 이러한 사실은 예컨대 인간의 CD4 폴리펩티드의 처음 2개의 도메인과 포유동물의 면역글로불린중 중쇄 또는 경쇄 불변부에 존재하는 다양한 도메인으로 구성된 키메라 단백질에 대하여 밝혀진 바 있다[EPA 394,827; Traunecker et al., Nature 331: 84-86(1988)]. 또한, IgG 부분에 의한 이황화물 결합된 이량체 구조를 가진 융합 단백질도 단량체 AIM II 단백질이나 단백질 단편 단독물에 비하여 다른 분자에 결합하여 중화시키는 데 더욱 효과적이었다[Fountoulakis et al., J Biochem 270:3958-3964(1995)].

본 발명자들은 AIM II가 비장, 흉선 및 골수 조직에서 발현된다는 것을 발견하였다. 또한, 패혈증 쇼크, 염증, 뇌말라리아, HIV 바이러스 활성화, 이식편 숙주 거부반응, 골흡수, 류마티스성 관절염 및 악액질과 같은 각종 질환의 경우에 이러한 질환이 있는 개체에서 채취한 특정 조직(예, 비장, 흉선 및 골수 조직)이나 체액(예, 혈청, 혈장, 뇨, 활액 또는 척수액)에서, 전술한 질환이 없는 개체로부터 채취한 조직이나 체액 중에 존재하는 AIM II 발현 농도인 "표준" AIM II 유전자 발현 농도에 비하여 현저히 높거나 낮은 AIM II 유전자 발현 농도가 검출될 것이라고 생각하였다. 따라서, 본 발명은 (a) 개체의 세포나 체액 중에 존재하는 AIM II 유전자 발현 농도를 분석하는 단계; (b) 이 AIM II 유전자 발현 농도를 표준 AIM II 유전자 발현 농도와 비교하여, 표준 발현 농도에 비하여 분석된 AIM II 유전자 발현 농도의 증가 또는 감소를 통해 질환을 판정하는 단계를 포함하여, 질환 진단에 유용한 진단 방법을 제공한다.

AIM II 작동물질 및 길항물질

본 발명은 수용체 분자와 같은 AIM II 결합 분자와 AIM II의 상호작용 등을 비롯하여 세포에 대한 AIM II의 작용을 증강 또는 차단하는 화합물을 동정하기 위하여 화합물을 선별하는 방법을 제공한다. 작동물질은 AIM II의 천연 생물학적 작용을 증가시키거나 AIM II와 유사한 방식으로 작용하는 화합물이고, 길항물질은 이러한 작용을 감소 또는 제거하는 화합물이다.

예컨대, AIM II에 결합하는 분자, 예컨대 AIM II에 의해 조절되는 시그널 경로 또는 조절 경로의 분자를 발현하는 세포로부터 세포 구획물, 예컨대 막 제조물을 제조한다. 이 제조물을 AIM II 작동물질이거나 길항물질인 후보 분자의 존재 또는 부재하에 표지된 AIM II와 항온처리한다. 표지된 리간드의 결합 감소를 통해 후보 분자가 결합 분자 또는 AIM II 자체에 결합하는 능력을 관찰한다. 자유롭게 결합하는 분자, 즉 AIM II 결합 분자에 결합했을 때 AIM II의 효과를 유도하지 않는 분자를 가장 우수한 길항물질로서 간주한다. 결합성이 우수하고 AIM II와 동일하거나 매우 유사한 효과를 유도하는 분자는 우수한 작동물질로 간주한다.

잠재적인 작동물질과 길항물질의 AIM II 유사 효과의 측정은, 예컨대 제 2 메신저계(messenger system)의 활성을 측정한 후, 이 후보 분자를 세포 또는 적당한 세포 제조물과 상호작용시킨 뒤, 그 효과를 AIM II와 동일한 효과를 유도하는 분자나 AIM II의 효과와 비교한다. 이와 관련하여 유용하게 사용되는 제 2 메신저계로는 AMP 구아닐레이트 시클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시티드 가수분해 제 2 메신저계를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.

AIM II 길항물질 분석법의 또 다른 예는 경쟁적 억제 분석의 적합한 조건하에서 AIM II와 잠재적 길항물질을 막 결합성 AIM II 수용체 분자 또는 재조합 AIM II 수용체 분자와 결합 반응시키는 경쟁 분석법이다. 이 경우, AIM II는 방사능 등으로 표지하면, 수용체 분자에 결합된 AIM II 분자의 수를 정확하게 측정하여 잠재적 길항물질의 효과를 평가할 수 있다.

잠재적 길항물질로는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하여 그 활성을 억제하거나 소멸시키는 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드 및 항체를 포함한다. 또한, 잠재적 길항물질은 AIM II 유도 활성을 유도하지 않아서 AIM II가 결합되지 못하게 하여 AIM II의 작용을 차단함으로써 수용체 분자와 같은 결합 분자 상의 동일 부위에 결합하는 근연성이 있는 단백질이나 항체와 같은 작은 유기 분자, 펩티드 또는 폴리펩티드이다.

다른 잠재적 길항물질로는 안티센스 분자를 포함한다. 안티센스 기법은 안티센스 DNA 또는 RNA를 통하거나 3중 헬릭스 형성을 통해 유전자 발현을 조절하는 데 이용할 수 있다. 안티센스 기법은, 예컨대 문헌[Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)]에 기재되어 있다. 3중 헬릭스 형성은 예컨대 문헌[Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al, Science 241: 456 (1988); 및 Dervan et al., Science 251: 1360 (1991)]에 개시되어 있다. 이 방법들은 상보적 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합에 근거한 것이다. 예컨대, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드의 5' 암호부를 이용하면 길이가 약 10 내지 40개 염기쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자 영역에 상보적이게 만들어서 AIM II의 전사와 생성을 차단한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 하이브리드하여 mRNA 분자가 AIM II 폴리펩티드로 해독되지 못하도록 한다. 또한, 전술한 올리고뉴클레오티드는 세포로 전달되어 안티센스 RNA 또는 DNA를 생체내에 발현하므로써 AIM II의 생성을 억제할 수 있다.

길항물질은 하기 기술되는 바와 같은 약학적 허용 담체와 함께 조성물에 사용될 수 있다.

길항물질은 예컨대 AIM II에 의해 억제되는 것으로 생각되는 지단백질 리파제의 전신 결핍으로부터 일어나는 지질 제거 결손인 악액질을 치료하는 데 이용할 수 있다. 또한, AIM II 길항물질은 AIM II가 병원성 역할을 하는 뇌말라리아를 치료하고, 활액 세포 중의 IL1과 같은 염증성 시토킨의 AIM II 유도 생성을 억제하여 류마티스성 관절염을 치료하는 데 이용할 수 있다. 관절염을 치료하는 경우에, AIM II 길항물질은 관절내 주입하는 것이 바람직하다.

또한, AIM II 길항물질은 이식시 면역계의 자극을 차단하여 이식편 숙주 거부반응을 예방하는 데 이용할 수 있다.

AIM II 길항물질은 골흡수를 억제하는 데 이용할 수 있고, 따라서 골다공증을 치료 및/또는 예방할 수 있다.

길항물질은 소염제로 이용할 수 있고, 내독성 쇼크 치료에 이용할 수 있다. 이러한 위험한 질환은 박테리아 및 다른 유형의 감염에 대한 과대 반응에서 생기는 것이다.

암 예후(cancer prognosis)

암에 걸린 포유동물 중의 특정 조직은 대응하는 "표준" 포유동물, 즉 암에 걸리지 않은 동종의 포유동물에 비하여 AIM II 단백질을 암호하는 mRNA와 AIM II 단백질의 발현 농도가 상당히 적다고 한다. 또한, 암에 걸린 포유동물에서 채취한 특정 체액(예, 혈청, 혈장, 뇨 및 척수액) 중에 존재하는 AIM II 단백질의 농도도 암에 걸리지 않은 동종의 포유동물에서 채취한 혈청 중의 농도와 비교해 볼 때 감소되었다고 한다. 따라서, 본 발명은 종양 진단에 유용한 진단 방법을 제공하며, 이 방법은 포유 동물 세포 또는 체액 중에 존재하는 AIM II 단백질 암호 유전자의발현 농도를 분석하는 단계 및 이 유전자의 발현 농도와 표준 AIM II 유전자 발현 농도를 비교하여 표준 농도에 비하여 유전자 발현 농도가 감소된 것을 통해 특정 종양을 확인하는 단계를 포함한다.

종양 진단이 이미 종래의 방법을 통해 이루어진 경우에는, 본 발명은 예후적지시인자로서 유용한 데, 즉 AIM II 유전자 발현 농도의 증가를 나타내는 환자가 유전자 발현 농도가 더 적은 환자에 비하여 우수한 임상적 결과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

"AIM II 단백질을 암호하는 유전자의 발현 농도를 분석"한다는 것은 제1 생물 시료 중에 존재하는 AIM II 단백질을 암호하는 mRNA의 농도 또는 AIM II 단백질의 농도를 직접적이거나(예컨대, 단백질이나 mRNA의 절대 농도를 측정 또는 추정함) 또는 상대적으로(예컨대, 제2 생물 시료 중에 존재하는 AIM II 단백질 농도 또는 mRNA 농도와 비교함) 정량 또는 정성적으로 측정 또는 추정한다는 것을 의미한다.

바람직하게는, 제1 생물 시료 중에 존재하는 AIM II 단백질 농도 또는 mRNA 농도를 측정 또는 추정한 뒤, 표준 AIM II 단백질 농도 또는 mRNA 농도와 비교하는 것인 데, 여기서 표준 농도는 암에 걸리지 않은 개체에서 얻은 제2 생물 시료를 이용하여 측정한 값이다. 당업자라면 잘 알 수 있는 바와 같이, 일단 알려진 표준 AIM II 단백질 농도 또는 mRNA 농도는 비교용의 표준물질로서 반복적으로 이용할 수 있다.

"생물 시료"란 개체, 세포주, 조직 배양물 또는 AIM II 단백질이나 mRNA를함유하는 기타 다른 공급원에서 얻은 임의의 생물 시료를 의미한다. 생물 시료에는 분비형의 성숙 AIM II 단백질을 함유하는 포유류 체액(예컨대, 혈청, 혈장, 뇨, 활액 및 척수액) 및 난소, 전립선, 심장, 태반, 췌장 간, 비장, 폐, 유방 및 배꼽 조직을 포함한다.

본 발명은 포유동물 중에서 암을 검측하는 데 유용하다. 특히, 본 발명은 포유동물의 유방, 난소, 전립선, 골, 간, 폐, 췌장 및 비장과 같은 종류의 암을 진단하는데 유용하다. 포유동물로는 꼬리 있는 원숭이, 꼬리 없는 원숭이, 고양이, 개, 소, 돼지, 말, 토끼 및 인간이 바람직하다. 특히 바람직한 것은 인간이다.

총 세포 RNA는 문헌[Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)에 기재된 1단계 구아니디늄-티오시아네이트-페놀-클로로포름법을 사용하여 생물 시료로부터 분리한다. 그 다음, 적당한 방법을 사용하여 AIM II 단백질을 암호하는 mRNA의 농도를 분석한다. 이 분석 방법에는 노던 블롯 분석[Harada et al., Cell 63: 303-312 (1990)], S1 뉴클레아제 맵핑[Fujita et al., Cell 49: 357-367 (1987)], 폴리머라제 사슬 반응(PCR), 폴리머라제 사슬 반응과 조합한 역전사법(RT-PCR)[Makino et al., Technique 2: 295-301 (1990)] 및 리가제 사슬 반응과 조합한 역전사법(RT-LCR)을 포함한다.

생물 시료 중에 존재하는 AIM II 단백질 농도 분석은 항체를 기본으로 한 기법을 사용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 조직 중에 있어서의 AIM II 단백질 발현은 고전적 면역조직학 방법을 사용하여 연구한다[Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)].

AIM II 단백질 유전자의 발현을 검측하는데 유용한, 기타 다른 항체를 기본으로 한 방법으로는 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA) 및 방사능면역분석법(RIA)과 같은 면역분석법을 포함한다.

적합한 표지는 당해 기술분야에 공지되어 있는데, 예컨대 글루코스 옥시다제와 같은 효소 표지; 요오드(¹²⁵I,¹²¹I), 탄소(¹⁴C), 황(³⁵S), 3중수소(³H), 인듐(¹¹²In) 및 테크네튬(^99mTc)과 같은 방사능동위원소; 및 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광성 표지 및 비오틴을 포함한다.

치료법

AIM II 폴리펩티드, 구체적으로 인간의 AIM II 폴리펩티드는 증식이상, 림프절증, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환을 치료하는데 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 AIM II 폴리펩티드는 종양 세포 증식과 같은 증식이상을 억제하는데 이용할 수 있다. AIM II 폴리펩티드는 고사 및 특정 세포에 대한 세포독성을 통하여 종양을 파괴하는데 중요한 역할을 한다. 또한, AIM II는 표피세포 기원의 세포에 대하여 증식 효과를 나타내기 때문에 증식 촉진 활성을 요구하는 질환, 예컨대 재발협착증을 치료하는데 이용할 수 있다. 따라서, AIM II는 표피 세포 발생에 있어서 혈액생성을 조절하는 데 이용할 수 있다.

투여 방식

전술한 바와 같은 질환들은 AIM II 단백질을 투여함으로써 치료할 수 있다.따라서, 본 발명은 AIM II 활성수준의 증가를 요구하는 개체에게 본 발명의 AIM II 폴리펩티드 분리물, 구체적으로 상기 개체 중에서 AIM II 활성 농도를 증가시키기에 효과적인 성숙한 형태의 AIM II를 유효량으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하여 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

일반적인 예로서, 매투여량마다 비경구적으로 투여되는 AIM II 폴리펩티드의 약학적 총 유효량은 환자의 체중 당 약 1 ㎍/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일 범위이지만, 전술한 바와 같이 치료적 판단에 따라 달라진다. 보다 바람직하게는, 0.01 ㎎/㎏/일 이상이며, 가장 바람직하게는 인간에 대해 호르몬으로 약 0.01 내지 1 ㎎/㎏/일이다. 지속적으로 투여하는 경우에, AIM II 폴리펩티드는 일반적으로 약 1 ㎍/㎏/hr 내지 약 50 ㎍/㎏/hr의 투여량으로 투여하되, 1일당 1 내지 4회의 주사액으로 투여하거나 예컨대 미니펌프를 사용하여 연속 피하 주입한다. 또한, 정맥내 백(bag) 용액도 이용할 수 있다.

본 발명의 AIM II를 함유하는 약학 조성물은 경구, 직장, 비경구, 조내, 질내, 복강내, 국소적(분말, 연고, 점적제 또는 경피 패치), 협측 또는 경구나 비측 분무제로서 투여할 수 있다. "약학적 허용 담체"란 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캅셀화 물질 또는 임의 형태의 조제 보조제를 의미한다. 본 명세서에 사용된 "비경구"란 용어는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사액 및 주입액을 포함하는 투여 방식을 의미한다.

가용성 AIM II 폴리펩티드 외에도, 경막 영역을 함유하는 AIM II 폴리펩티드는 트리톤 X-100과 같은 세정제를 비롯하여 완충액으로 적당하게 용해시킨 경우에는 사용할 수 있다.

염색체 분석

본 발명의 핵산 분자는 염색체 동정에 매우 중요하다. 그 서열은 개개의 인체 염색체 중에서 특정 위치를 특이적으로 표적하여 하이브리드한다. 본 발명에 따른 염색체로의 DNA 맵핑은 질병과 관련있는 유전자를 가진 서열의 상관 관계를 찾는데 중요한 첫 단계이다.

이러한 점에서 바람직한 특정 구체예에서는 본 명세서에 개시된 cDNA를 이용하여 AIM II 단백질 유전자의 게놈 DNA를 클로닝한다. 이것은 다양한 공지의 기법과 일반적으로 시판용인 라이브러리를 통해 실시할 수 있다. 이어서 게놈 DNA를 이러한 목적의 공지 기법을 이용한 동일계내 염색체 맵핑에 사용한다.

또한, 일부 경우에는 cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25 bp)를 제조하여 서열을 염색체에 맵핑할 수 있다. 그 유전자 중 3' 비해독 영역을 컴퓨터 분석을 사용하여 게놈 DNA 중에 존재하는 1개 이상의 엑손에 걸쳐 있지 않아서 증폭 과정을 복잡하게 하는 프라이머를 신속하게 선별할 수 있다. 그 다음 이 프라이머들을 개개의 인간 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 선별에 사용한다.

중기 염색체 분포에 대한 cDNA 클론의 형광 동일계내 하이브리드화("FISH")를 사용하여 한단계로 정확한 염색체 위치를 제공한다. 상기 기법은 50 bp 또는 60 bp 정도의 짧은 cDNA 유래의 프로브를 사용하여 실시할 수 있다. 이 기법에 대해서는 문헌[Verma et al., Human Chromosomes: A Manual Of Basic Techniques,Pergamon Press, New York (1988)]을 참조하기 바란다.

일단 서열이 정확한 염색체 위치에 맵핑되면, 염색체 상에서 그 서열의 물리적 위치를 유전자 지도 데이터와 상호관련시킬 수 있다. 이러한 데이터는 예컨대 존스 홉킨스 유니버시티 웰치 메디칼 라이브러리를 통해 온라인으로 이용가능한 문헌[V. McKusick, Mendelian Inheritance In Man]에 기재되어 있다. 이어서, 동일한 염색체 영역으로 지도화된 유전자와 질병 사이의 관계를 연계(linkage) 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동상속)을 통해 확인한다.

그 다음, 질병이 있는 개체와 질병이 없는 개체 간에 cDNA 또는 게놈 서열의 차이를 측정할 필요가 있다. 정상 개체에서는 전혀 관찰되지 않지만, 질병이 있는 개체 중 일부 또는 전체에서 돌연변이가 관찰된다면, 그 돌연변이가 그 질병의 원인 인자일 가능성이 있다.

지금까지 본 발명을 개괄적으로 설명하였지만, 다음 실시예를 참조로 하면 보다 쉽게 본 발명을 이해할 수 있을 것이며, 하기 실시예는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니라 단지 예시하기 위한 것이다.

실시예 1: 이. 콜리 중에서의 AIM II 발현 및 정제

A. N-말단 HA 태그를 가진 AIM II의 발현

기탁된 cDNA 클론 중에 존재하는 AIM II 단백질을 암호하는 DNA 서열은 AIM II 단백질의 아미노 말단 서열과 그 유전자의 3'쪽 벡터 서열에 대해 특이적인 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 클로닝을 용이하게 하는 제한 부위를 함유하는 부가 뉴클레오티드를 5' 및 3' 서열 각각에 첨가하였다.

22 kDa의 AIM II 단백질 단편(N-말단과 경막 영역이 결실됨)을 다음과 같은 프라이머를 사용하여 발현시켰다.

5' 올리고뉴클레오티드 프라이머: 5' GCGGGATCCGGAGAGATGGTCACC 3' (서열번호 7) 도 1A 내지 도 1C(서열번호 1)에 기재된 AIM II 단백질 암호 서열의 244 내지 258 뉴클레오티드를 암호하는 서열 [밑줄친 부위는 BamHI 제한 부위임].

3' 프라이머: 5' CGCAAGCTTCCTTCACACCATGAAAGC 3' (서열번호 8). 밑줄친 HindIII 제한 부위와 그 다음 도 1A 내지 도 1C에 기재된 756 내지 783 뉴클레오티드를 함유하는 서열

전체 AIM II 단백질은 다음과 같은 프라이머를 사용하여 발현시킬 수 있다.

5' 올리고뉴클레오티드 프라이머: 5' GACCGGATCCATGGAGGAGAGTGTCGTACGGC 3' (서열번호 9). 도 1A 내지 도 1C(서열번호 1)에 기재된 AIM II 단백질 암호 서열의 22개 뉴클레오티드를 암호하며, 밑줄친 BamHI 제한 부위를 함유하는 서열

3' 프라이머: 5'CGCAAGCTTCCTTCACACCATGAAAGC 3'(서열번호 10). 밑줄친 HindIII 제한 부위 다음에 도 1A 내지 도 1C에 기재된 756 내지 783 뉴클레오티드를 함유하는 서열

제한 부위는 본 실시예에서 박테리아 발현에 유용하게 이용되는 박테리아 발현 벡터 pQE9에 존재하는 제한 효소 부위가 편리하게 이용된다(미국 캘리포니아주 91311 채스워스 이튼 애비뉴 9259에 소재하는 퀴아겐, 인코포레이티드 제품). pQE9는 암피실린 항생제 내성 유전자("Amp^r")를 암호하며, 박테리아 복제 기원("ori"),IPTG 유도성 프로모터, 리보솜 결합 부위("RBS"), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 포함한다.

증폭된 AIM II DNA 및 벡터 pQE9 양자는 BamHI 및 HindIII로 분해하고, 그 다음 분해된 DNA를 함께 결찰시킨다. 제한 분해된 pQE9 벡터 중으로 AIM II 단백질 DNA의 삽입은 상기 벡터의 IPTG 유도성 프로모터 하류에 AIM II 단백질 암호 영역을 배치한 뒤 작동가능하게 결합시키고, AIM II 단백질을 해독할 수 있도록 적당하게 위치한 개시 AUG와 인프레임(in-frame)되게 배치한다.

B. C-말단 HA 태그를 가진 AIM II의 발현

본 실시예에서는 박테리아 발현을 위하여 박테리아 발현 벡터 pQE60을 사용하였다(미국 캘리포니아주 91311 채스워스 이튼 애비뉴 9259에 소재하는 퀴아겐, 인코포레이티드 제품). pQE60은 암피실린 항생제 내성 유전자("Amp^r")를 암호하며, 박테리아의 복제 기원("ori"), IPTG 유도성 프로모터, 리보솜 결합 부위("RBS"), 니켈-니트릴로-트리-아세트산("Ni-NTA") 친화성 수지(퀴아겐, 인코포레이티드, 전술함)의 시판품을 사용한 친화성 정제를 가능하게 하는 히스티딘 잔기를 암호하는 6개의 코돈, 및 적합한 단일 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 이 인자들은 폴리펩티드를 암호하는 삽입된 DNA 단편이 그 폴리펩티드의 카르복실 말단에 6개의 His 잔기(즉, "6 X His 태그")가 공유 결합된 폴리펩티드를 발현하도록 배열된다.

AIM II 단백질의 목적 부위를 암호하는 DNA 서열을 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 기탁된 cDNA 클론으로부터 증폭시킨다. 상기 프라이머는 AIMII 단백질의 목적 부위의 아미노 말단 서열과 기탁된 작제물중에서 cDNA 암호 서열의 3'쪽 서열에 어닐링한다. 5' 서열과 3' 서열 각각에 pQE60 벡터로의 클로닝을 용이하게 하는 제한 부위를 함유하는 부가 뉴클레오티드를 첨가한다.

단백질 클로닝에 있어서, 5' 프라이머는 밑줄친 NcoI 제한 부위와 그 다음에 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II 서열의 아미노 말단 암호 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 서열 5' GACGCCCATGGAG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C 3'(서열 번호 17)를 갖는 것을 사용한다. 단백질 암호 서열 중에서 5' 프라이머가 시작하는 지점이 전체 단백질 중의 임의의 목적 부위를 암호하는 DNA 단편을 증폭시키기 위하여 변형(더 길거나 더 짧음)될 수 있다는 것은 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 3' 프라이머는 밑줄친 BamHI 제한 부위와 그 뒤에 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II DNA 서열 중의 종결 코돈 바로 앞에 암호 서열의 3' 말단에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 서열 5' GACCGGATCCCAC CAT GAA AGC CCC GAA GTA AG 3'(서열 번호 18)을 가지며, 이 서열 중 암호 서열은 제한 부위와 정렬시켜 pQE60 벡터 중에 존재하는 6개의 His 코돈의 서열과 리딩 프레임을 유지하도록 한다.

증폭된 AIM II DNA 단편과 벡터 pQE60은 BamHI 및 NcoI으로 분해하고, 이어서, 분해된 DNA는 함께 결찰시킨다. 제한 분해된 pQE60 벡터내로 AIM II DNA를 삽입하여, AIM II 단백질 암호 영역을 IPTG 유도성 프로모터의 하류에 배치하고 개시 AUG 및 6개의 히스티딘 코돈과 인프레임되게 배치한다.

전술한 A 또는 B에서 만든 HA 태그를 가진 발현 작제물 유래의 결찰 혼합물은 표준 방법을 사용하여 수용능있는 이.콜리 세포를 형질전환시킨다. 이러한 방법은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed.,: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]에 기재되어 있다. lac 억제인자를 발현하고 카나마이신 내성("Kan^r")을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다중 복사체를 함유한 이.콜리 균주 M15/rep4를 사용하여, 본 명세서에 예시된 실시예를 수행한다. AIM II 단백질을 발현하기에 적합한 다수의 균주중의 1가지인 상기 균주는 퀴아겐에서 입수할 수 있다.

암피실린과 카나마이신을 함유하는 LB 평판에서 성장하는 성질을 통해 형질전환체를 선별한다. 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 클로닝된 DNA의 존재를 제한 분석으로 확인한다.

목적하는 작제물을 함유하는 클론을 암피실린(100 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)을 보강한 LB 배지중 액체 배양액에서 하룻밤동안("O/N") 증식시킨다.

O/N 배양물을 사용하여 약 1:100 내지 1:250의 희석율에 해당하는 대량 배양물에 접종한다. 세포는 600 nm에서의 광학 밀도("OD600")가 0.4 내지 0.6이 되게 증식시킨다. 그 다음, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드("IPTG")를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여lacI억제인자를 불활성화시켜lac억제인자 감수성 프로모터로부터 전사를 유도한다. 세포를 3 내지 4 시간동안 더 연속 배양한다. 그 다음 세포를 원심분리로 수거한 뒤, 표준 방법을 이용하여 파괴시킨다. 파괴된 세포로부터 통상적인 수거 기법으로 봉입체를 정제하고, 이 봉입체로부터 8M 우레아내로 단백질을 가용화시킨다. 가용화된 단백질을 함유하는 8M 우레아 용액을 2X 인산염 완충 식염수("PBS")중 PD-10 컬럼을 통해 통과시켜 우레아를 제거하고 완충액을 교환하여 단백질을 리폴딩(refolding)시킨다. 그 다음 내독소를 제거하기 위해 크로마토그래피 단계로 단백질을 추가 정제한다. 그 다음, 멸균 여과한다. 멸균 여과된 단백질 제조물을 95 μ/㎖의 농도로 2X PBS에 저장한다.

C. HA 태그가 없는 AIM II의 발현 및 정제

본 실시예에서는 박테리아의 발현을 위해 박테리아 발현 벡터 pQE60를 이용하였다(미국 캘리포니아주 91311 채스워스 이튼 애비뉴 9259에 소재하는 퀴아겐, 인코포레이티드 제품). pQE60은 암피실린 항생제 내성 유전자("Amp^r")를 암호하며, 박테리아의 복제 기원("ori"), IPTG 유도성 프로모터, 리보솜 결합 부위("RBS"), 니켈-니트릴로-트리-아세트산("Ni-NTA") 친화성 수지(퀴아겐, 인코포레이티드, 전술함)를 사용한 친화성 정제를 가능하게 하는 히스티딘 잔기를 암호하는 6개의 코돈, 및 적합한 단일 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 이 인자들은 폴리펩티드를 암호하는 삽입된 DNA 단편이 그 폴리펩티드의 카르복실 말단에 6개의 His 잔기(즉, "6X His 태그")가 공유 결합된 폴리펩티드를 발현하도록 배열된다. 하지만, 본 실시예에서는 폴리펩티드 암호 서열은 6개의 His 코돈의 해독이 차단되도록 삽입되어, 결과적으로 6X His 태그를 함유하지 않는 폴리펩티드가 생성된다.

소수성 리더 서열이 결실된 AIM II 단백질의 목적 부위를 암호하는 DNA 서열을, AIM II 단백질의 목적 부위의 아미노 말단 서열과 기탁된 작제물중에서 cDNA 암호 서열의 3'쪽 서열에 어닐링하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여증폭시킨다. pQE60 벡터로의 클로닝을 용이하게 하는 제한 부위를 함유하는 부가 뉴클레오티드를 5' 서열과 3' 서열 각각에 첨가한다.

단백질을 클로닝하기 위하여, 5' 프라이머는 밑줄친 NcoI 제한 부위와 그 다음에 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II 서열의 아미노 말단 암호 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 서열 5' GACGCCCATGGAG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C 3'(서열 번호 17)를 갖는 것을 사용한다. 단백질 암호 서열 중에서 5' 프라이머가 시작하는 지점이 전체 단백질 중의 임의의 목적 부위를 증폭시키기 위하여 변형(더 길거나 더 짧음)될 수 있다는 것은 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 3' 프라이머는 밑줄친 HindIII 제한 부위와 그 뒤에 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II DNA 서열 중의 비암호 서열의 3' 말단에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 서열 5' CGCAAGCTTCCTT CAC ACC ATG AAA GC 3'(서열 번호 19)이다.

증폭된 AIM II DNA 단편과 벡터 pQE60은 NcoI 및 HindIII으로 분해하고, 이어서, 분해된 DNA는 함께 결찰시킨다. 제한 분해된 pQE60 벡터내로 AIM II DNA를 삽입하여 종결 코돈이 결합되어 있는 AIM II 단백질 암호 영역을 IPTG 유도성 프로모터의 하류에 배치하고 개시 AUG와 인프레임되게 배치한다. 결합된 종결 코돈은 삽입 지점의 하류에 있는 6개 히스티딘 코돈의 해독을 차단한다.

결찰 혼합물은 표준 방법을 사용하여 수용능있는 이.콜리 세포를 형질전환시킨다. 이러한 방법은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed.,: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)]에 기재되어 있다. lac 억제인자를 발현하고 카나마이신 내성("Kan^r")을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다중 복사체를 함유한 이.콜리 균주 M15/rep4를 사용하여, 본 명세서에 예시된 실시예를 수행한다. AIM II 단백질을 발현하기에 적합한 다수의 균주중의 1가지인 상기 균주는 퀴아겐, 인코포레이티드(전술함)에서 입수할 수 있다. 암피실린과 카나마이신을 함유하는 LB 평판에서 성장하는 성질을 통해 형질전환체를 선별한다. 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 클로닝된 DNA의 존재를 제한 분석, PCR 및 DNA 서열분석으로 확인한다.

목적하는 작제물을 함유하는 클론을 암피실린(100 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)을 보강한 LB 배지중 액체 배양액에서 하룻밤동안("O/N") 증식시킨다. O/N 배양물을 사용하여 약 1:25 내지 1:250의 희석율에 해당하는 대량 배양물에 접종한다. 세포는 600 nm에서의 광학 밀도("OD600")가 0.4 내지 0.6이 되게 증식시킨다. 그 다음, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드("IPTG")를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 lacI 억제인자를 불활성화시켜 lac 억제인자 감수성 프로모터로부터 전사를 유도한다. 세포를 3 내지 4 시간동안 더 연속 배양한다. 그 다음 세포를 원심분리로 수거한다.

그 다음, 6M 구아니딘-HCl(pH 8)에서 4 ℃하에 3 내지 4 시간 동안 교반한다. 세포 파편을 원심분리로 제거하고, AIM II를 함유하는 상청액을 200 mM NaCl이 보강된 50 mM Na-아세테이트 완충액(pH 6)에 대하여 투석한다. 또는, 단백질을 프로테아제 억제제를 함유하며 500 mM NaCl, 20% 글리세롤, 25 mM 트리스/HCl(pH7.4)를 함유하는 용액에 대해 투석하면 단백질이 성공적으로 리폴딩된다. 복원된 단백질은 이온교환, 소수성 상호작용 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제한다. 또는, 항체 칼럼과 같은 친화성 크로마토그래피 단계를 사용하여 순수 AIM II 단백질을 얻는다. 정제된 단백질은 4℃에서 보관하거나 -80℃로 동결시킨다.

실시예 2: 바큘로바이러스 발현계에서 AIM II 단백질의 클로닝 및 발현

기탁된 클론 중에 존재하는 전장 AIM II 단백질을 암호하는 cDNA 서열은 그 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.

5' 프라이머는 밑줄친 BamHI 제한 효소 부위와 그 뒤에 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II 단백질의 22개 염기 서열을 함유하는 서열 5' GCT CCAGGA TCCGCC ATC ATG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C 3'(서열 번호 11)을 갖고 있다. 이것을 아래와 같이 발현 벡터에 삽입하면 AIM II를 암호하는 증폭 단편의 5' 말단은 효과적인 시그널 펩티드를 제공한다. 문헌[Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987)]에 기재된 바와 같이 진핵 세포에서 해독을 개시하기에 효과적인 시그널을 작제물 중의 벡터 부위에 적당하게 위치시킨다.

3' 프라이머는 밑줄친 Asp 718 제한 부위와 그 다음에 도 1A 내지 도 1C에 기재된 AIM II의 뉴클레오티드 769 내지 795에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 서열 5'GA CGCGGT ACCGTC CAA TGC ACC ACG CTC CTT CCT TC 3'(서열 번호 12)이다.

증폭된 단편은 시판용 키트("Geneclean", 미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 BIO 101 인코포레이티드 제품)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다. 그 다음 단편을 BamHI과 Asp718로 분해하고 다시 1% 아가로스 겔로 정제한다. 이 단편은 본 명세서에서는 F2라 칭한다.

벡터 pA2-GP는 바큘로바이러스 발현계에서 문헌[Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Precedures, Texas Agriculture Experimental Station Bulletin No.1555(1987)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 AIM II 단백질을 발현시키는데 사용하였다. 이 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 다면성 바이러스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터와 그 다음에 편리한 제한 부위를 포함한다. N-말단의 메티오닌을 함유하는 AcMNPV gp67의 시그날 펩티드를 BamHI 부위의 바로 상류에 위치시킨다. 효과적인 폴리아데닐화를 위하여 시미안 바이러스 40("SV40")의 폴리아데닐화 부위를 이용한다. 재조합 바이러스를 용이하게 선별하기 위하여 폴리헤드린 프로모터와 동일한 배향으로 이.콜리 유래의 베타-갈락토시다제 유전자를 삽입하고, 그 다음 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그날을 삽입한다. 이 폴리헤드린 서열의 양측에는 야생형 바이러스 DNA와의 세포 매개된 상동성 재조합을 위한 바이러스 서열이 인접하여 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 발현하는 생바이러스를 생성한다.

당업자라면 충분히 이해할 수 있는 바와 같이, 작제물이 전사, 해독, 이동(traffinking) 등에 이용되는 적당하게 위치된 시그날, 예컨대 인프레임 AUG 및 시그날 펩티드를 필요에 따라 제공한다면, pA2-GP 대신에 pAc373, pVL941 및pAcIM1과 같은 기타 다른 바큘로바이러스 벡터를 사용할 수도 있다. 이러한 벡터들에 대해서는 문헌[Luckow et al., Virology 170: 31-39]에 기재되어 있다.

이 플라스미드를 제한 효소 BamHI 및 Asp718로 분해하고, 그 다음 소의 장 포스파타제를 사용하여 당해 기술분야에 공지된 절차에 따라 탈인산화반응시킨다. 그 다음, DNA를 시판용 키트("Geneclean", 미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 BIO 101 인코포레이티드 제품)를 사용하여 1% 아가로스 겔로 분리한다. 이 벡터 DNA를 본 명세서에서는 "V"라 한다.

단편 F2와 탈인산화된 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가아제로 함께 결찰시킨다. 결찰 혼합물로 이.콜리 HB101 세포를 형질전환시킨 뒤, 배양판에 도말한다. 박테리아 개개의 콜로니에서 유래한 DNA를 XbaI으로 분해한 뒤, 그 분해 생성물을 겔 전기영동으로 분석함으로써 인간 AIM II 유전자를 가진 플라스미드를 함유하는 박테리아를 동정하였다. 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 이 플라스미드를 본 명세서에서는 pBac AIM II라 한다.

플라스미드 pBac AIM II 5 ㎍을 문헌[Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:7413-7417(1987)]에 기재된 리포펙션법(lipofection)에 따라 시판용의 선형화된 바큘로바이러스 DNA("BaculoGold^TMbaculovirus DNA", 미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 파밍겐 제품) 1.0㎍으로 동시 형질감염시켰다. BaculoGold^TM바이러스 DNA 1㎍과 플라스미드 pBac AIM II 5㎍을, 무혈청 그레이스 배지(미국 매릴랜드주 게터스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드 제품) 50 ㎕를함유하는 미량역가 평판의 살균 웰 중에서 혼합하였다. 그 다음, 리포펙틴 10 ㎕와 그레이스 배지 90 ㎕를 첨가하여 혼합한 뒤, 실온에서 15분동안 항온처리하였다. 그 후, 형질감염 혼합물을, 무혈청 그레이스 배지 1 ㎖를 보유한 35 ㎜ 조직 배양판에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가하였다. 이 평판을 전후로 진탕시켜 새로 첨가된 용액을 혼합하였다. 그 다음 27 ℃에서 5 시간동안 배양하였다. 5 시간 후, 평판에서 형질감염 용액을 제거하고 10% 소 태내 혈청을 보강한 그레이스 곤충 배지 1 ㎖를 첨가하였다. 이 평판을 항온배양기에 다시 넣고 27 ℃에서 4일 동안 배양하였다.

4일 후, 상청액을 수거하여, 전술한 문헌[Summers and Smith]에 기재된 바와 같이 플라크 분석을 실시하였다. "Blue Gal"(라이프 테크놀로지스 인코포레이티드 제품)을 함유하는 아가로스 겔을 사용하여 청색 플라크를 생성하는 gal 발현 클론을 용이하게 동정하고 분리할 수 있다(이러한 유형의 "플라크 분석법"에 대한 상세한 설명은 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드에서 배포된 곤충 세포 배양과 바큘로바이러스학의 사용자 지침서, 9 내지 10면에 개시되어 있다).

바이러스를 연속 희석하여 4일간 배양한 후, 세포에 첨가하였다. 적당한 항온배양 후, 청색 플라크를 에펜도르프 피펫 끝으로 채취했다. 그 다음 재조합 바이러스를 함유하는 아가를 그레이스 배지 200 ㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브에 재현탁시켰다. 순간 원심분리로 아가를 제거하고, 재조합 바큘로바이러스를 함유하는 상청액을 사용하여, 35 ㎜ 접시에 접종된 곤충 Sf9 세포를 감염시켰다. 4일 후, 이 배양 접시의 상청액을 수거하여, 4℃에 보관하였다. 제한 지도 및 서열 분석을 비롯한 DNA 분석법에 의하여 적당하게 삽입된 hESSB I, II 및 III을 함유하는 클론을 확인한다. 이것을 본 명세서에서는 V-AIM II라 한다.

Sf9 세포를 10% 열불활성화된 FBS 보강된 그레이스 배지에서 성장시켰다. 이 세포를 재조합 바큘로바이러스 V-AIM II로 약 2(약 1 내지 약 3)의 감염 다중도("MOI")가 되게 감염시켰다. 6 시간 후, 배지를 제거하고, 메티오닌과 시스테인을 제거한 SF900 II 배지(라이프 테크놀로지스 인코포레이티드 제품)로 대체하였다. 42 시간 후,³⁵S-메티오닌 5 μCi 및³⁵S-시스테인(아머샴 제품) 5 μCi를 첨가하였다. 세포를 16 시간동안 추가 항온배양한 다음, 원심분리하여 수거한 뒤, 용해시켜, 얻어지는 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자동방사능사진술로 가시화하였다.

실시예 3: 포유동물 세포 중에서의 클로닝 및 발현

포유 동물 세포에서 AIM II 단백질 유전자 서열의 순간적인 발현에 사용된 대부분의 벡터는 SV40 복제 기원을 함유한다. 따라서, 바이러스 DNA 합성 개시에 요구되는 T 항원을 발현하는 세포(예, COS 세포) 중에서 상기 벡터를 높은 복제수로 복제할 수 있다. 이러한 목적을 위해 기타 다른 포유동물 세포주도 사용할 수 있다.

일반적인 포유동물 발현 벡터는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 프로모터 인자, 단백질 암호 서열 및 전사 종결과 전사체의 폴리아데닐화에 요구되는 시그날을 포함한다. 부가 인자로서, 인헨서, 코작(Kozak) 서열 및 RNA 스플라이싱의 공여체 부위와 수용체 부위에 인접해 있는 개재 서열을 포함한다. 고효율의 전사는 SV40의초기 프로모터 및 후기 프로모터, 레트로바이러스, 예컨대 RSV, HTLVI, HIVI 유래의 장말단 반복서열(LTR), 및 시토메가로바이러스(CMV)의 초기 프로모터를 사용하여 실시할 수 있다. 하지만, 세포 시그날도 사용할 수 있다(예, 인간 액틴 프로모터). 본 발명을 실시하기에 적합한 발현 벡터로는, 예컨대 pSVL 및 pMSG(스웨덴 웁살라에 소재하는 파마시아 제품), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2dhfr(ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109)와 같은 벡터를 포함한다. 사용할 수 있는 포유류 숙주 세포로는 인간 Hela, 283, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos1, Cos7 및 CV1, 아프리카 녹색 원숭이 세포, 메추라기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소 세포를 포함한다.

이와는 달리, 유전자는 염색체내로 통합된 유전자를 함유한 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 히그로마이신과 같은 선별용 마커로 동시형질감염시키면 형질감염된 세포를 동정 및 분리할 수 있다.

이와 같이 형질감염된 유전자를 증폭시키면 암호 단백질을 다량 발현시킬 수 있다. DHFR(디히드로폴레이트 환원효소)는 목적 유전자의 수백 또는 수천 복제수를 운반하는 세포주를 개발하기에 유용한 마커이다. 또 다른 유용한 마커로는 효소 글루타민 신타제(GS)가 있다[Murphy et al., Biochem J. 227: 277-279 (1991); Bebbington et al, Bio/Technology 10: 169-175 (1992)]. 이러한 마커를 사용하여, 선별용 배지중에서 포유동물의 세포를 성장시키고 최고 내성을 가진 세포를 선별한다. 선별된 세포주들은 염색체 중에 통합된 증폭 유전자를 함유한다. 또한, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포도 단백질 생산에 사용된다.

발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma virus)의 강한 프로모터(LTR)[Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447(1985.3)]와 CMV-인헨서의 단편[Boshart et al., Cell 41:521-530(1985)]을 포함한다. 다중 클로닝 부위, 예컨대 BamHI, XbaI 및 Asp718와 같은 제한 효소 절단 부위를 가진 다중 클로닝 부위는 목적 유전자의 클로닝에 유용하게 이용된다. 또한, 상기 벡터는 래트의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론, 폴리아데닐화 및 종결 시그날을 포함한다.

실시예 3(a): COS 세포의 클로닝 및 발현

발현 플라스미드, pAIM II HA는 발현 벡터 pcDNAI/Amp(인비트로겐, 인코포레이티드에서 입수용이함)에 AIM II를 암호하는 cDNA를 클로닝하여 제조한다.

발현 벡터 pcDNAI/amp는 (1) 이.콜리 및 기타 원핵 세포 중에서 전파하기에 효과적인 이.콜리의 복제 기원; (2) 플라스미드 함유 원핵 세포를 선별하기 위한 암피실린 내성 유전자; (3) 진핵 세포 중에서의 전파에 이용되는 SV40 복제 기원; (4) cDNA가 CMV 프로모터의 발현 조절하에 배치되고 폴리링커 내에 존재하는 제한 부위에 의하여 SV40 인트론과 폴리아데닐화 시그날에 작동가능하게 결합될 수 있도록 배열된 CMV 프로모터, 폴리링커, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다.

이 벡터의 폴리링커 영역에 AIM II 단백질을 암호하는 DNA 단편과 이것의 3' 말단에 인프레임식으로 융합된 HA 태그를 클로닝시켜 CMV 프로모터에 의하여 재조합 단백질이 발현되도록 한다. HA 태그는 문헌[Wilson et al., Cell 37: 767(1984)]에 기재된 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 유래의 에피토프에 상응한다. 표적 단백질에 HA 태그를 융합시키면 HA 에피토프를 인식하는 항체로 재조합 단백질을 용이하게 검출할 수 있다.

플라스미드 작제 방법은 다음과 같다. 대부분 상기 이.콜리 중에서의 AIM II 발현을 위한 발현 벡터의 작제에 관하여 상술한 바와 같이 편리한 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 기탁된 클론의 AIM II cDNA를 증폭시킨다. 발현된 AIM II의 검출, 정제 및 특성규명을 용이하게 하기 위하여 프라이머중의 하나에 전술한 헤마글루티닌 태그("HA 태그")를 포함시킨다.

적합한 프라이머로는 본 실시예에 사용된 다음과 같은 것을 포함한다.

밑줄친 BamHI 부위 및 AUG 개시 코돈을 함유하는 5' 프라이머는 다음과 같은 서열을 갖는다.

5'G CTCGGA TCCGCC ATC ATG 3'(서열 번호 13)

밑줄친 XbaI 부위, 종결 코돈, 헤마글루티닌 HA 태그를 형성하는 9개의 코돈 및 31 bp의 3' 암호 서열(3'말단)을 함유하는 3' 프라이머는 다음과 같은 서열을 갖는다.

5'GAT GTT CTA GAA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CAC CAT GAA AGC CCC GAA GTA AGA CCG GGT AC 3'(서열 번호 14)

PCR 증폭된 DNA 단편과 벡터 pcDNAI/Amp는 HindIII 및 XhoI으로 절단한 뒤, 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 이.콜리 균주 SURE(미국 캘리포니아주 92037라 졸라 노스 토레이 파인스 로드 11099에 소재하는 스트라타진 클로닝 시스템스에서 입수)를 형질전환시키고, 이와 같이 형질전환된 배양물을 암피실린 배지 평판에 도말하여 암피실린 내성 콜로니만을 배양 증식시켰다. 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 AIM II 암호 단편의 존재에 대해 제한 분석과 겔 사이징(sizing)으로 조사하였다.

재조합 AIM II를 발현시키기 위하여, COS 세포를 전술한 바와 같은 발현 벡터로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)]에 기재된 바와 같은 DEAE-DEXTRAN법을 통해 형질감염시켰다. 벡터에 의한 AIM II를 발현하기에 적당한 조건하에서 세포를 항온배양하였다.

AIM II HA 융합 단백질의 발현은 예컨대 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1988)]에 기재된 방법을 사용하여 방사능표지법과 면역침전법으로 검출하였다. 이러한 목적을 위하여, 형질감염 시킨지 2일 후에 세포를³⁵S-시스테인을 함유하는 배지에서 8시간동안 항온배양하여 표지화하였다. 세포와 배지를 수거하고, 세포는 세척한 뒤 세정제 함유 RIPA 완충액(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM TRIS, pH 7.5, 상기 인용된 윌슨 등의 문헌에 기재된 바와 같음)으로 용해시켰다. HA-특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 세포 용해물과 배양액으로부터 단백질을 침전시켰다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE 겔 및 자동방사능사진술로 분석하였다. 예상된 크기의 발현 생성물이 음성 대조군에서는 관찰되지 않았지만 세포 용해물에서 관찰되었다.

실시예 3(b): CHO 세포에서의 클로닝 및 발현

AIM II 단백질을 발현시키기 위하여 벡터 pC4를 사용하였다. 플라스미드 pC1은 플라스미드 pSV2-dhfr(ATCC 기탁번호 37146)의 유도체이다. 이 플라스미드들은 모두 SV40 초기 프로모터의 조절하에 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 이러한 플라스미드로 형질감염된 디히드로폴레이트 활성이 결실된 중국 햄스터 난소 세포 또는 기타 다른 세포는, 화학처치제 메토트렉세이트를 보강한 선별용 배지(알파 - MEM, 라이프 테크놀로지스 제품)에서 세포를 증식시켜 선별할 수 있다. 메토트렉세이트(MTX)에 내성적인 세포에서 DHFR 유전자를 증폭시키는 방법에 대해서는 공지되어 있다[예컨대, Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R. and Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253: 1357-1370, Hamlin, J.L. and Ma, C. 1990, Biochem et Biophys. Acta., 1097: 107-143, Page, M.J. and Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology Vol. 9: 64-68]. MTX의 상승 농도에서 증식하는 세포는 DHFR 유전자의 증폭 결과로서 표적 효소 DHFR를 과잉생성하여 약물에 대한 내성을 개발한다. 이 DHFR 유전자에 제2 유전자를 결합시키면 이것 또한 일반적으로 동시 증폭되고 과잉발현된다. 당해 기술분야의 수준으로는 상기 유전자를 1000 복제수 이상 운반하는 세포주를 형성시킬 수 있다. 그 다음, 메토트렉세이트를 제거하면 세포주는 염색체(들)에 통합된 증폭 유전자를 함유하게 된다.

플라스미드 pC4는 목적 유전자를 발현하기 위하여 라우스 육종 바이러스의 장말단 반복서열(LTR)의 강한 프로모터(Cullen et al., Molecular and CellularBiology, March 1985:438-447)와 인간 시토메가로바이러스(CMV)의 직접 초기 유전자의 인헨서로부터 분리된 단편[Boshart et al., Cell 41:521-530(1985)]을 포함한다. 프로모터의 하류에는 유전자를 통합시키는 BamHI, XbaI 및 Asp718 제한 효소 절단 부위가 있다. 이러한 클로닝 부위 뒤에는 래트의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론과 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 발현용으로서 기타 고효율의 프로모터, 예컨대 인간 β-액틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 또는 기타 다른 레트로바이러스, 예컨대 HIV 및 HTLVI 유래의 장말단 반복서열을 사용할 수 있다. 포유동물 세포에서 AIM II를 조절 방식으로 발현하는 데에는 클론테크의 Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현계와 이의 유사계를 사용할 수 있다(Gossen, M., & Bujard, H. 1992, Proc.Natl.Sci.USA 89:5547-5551). mRNA를 폴리아데닐화하는 데에는, 인간 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자 유래의 기타 다른 시그날도 사용할 수 있다. 또한, 염색체내로 통합된 목적 유전자를 보유한 안정한 세포주는 gpt, G418 또는 히그로마이신과 같은 선별용 마커로 동시형질감염시켜 선별할 수 있다. 예컨대, G418 + 메토트렉세이트와 같이 1종 이상의 선별용 마커를 초기에 사용하는 것이 바람직하다.

플라스미드 pC4는 제한 효소 BamHI 및 Asp718로 분해하고, 그 다음 당해 기술분야에 공지된 절차에 따라 소의 장 포스파타제를 사용하여 탈인산화처리한다. 그 다음 1% 아가로스 겔로부터 벡터를 분리한다.

리더 서열을 포함하는 완전한 AIM II 단백질을 암호하는 DNA 서열은 이 유전자의 5' 서열 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여증폭시킨다. 5' 프라이머는 밑줄친 BamHI 제한 효소 부위와 그 뒤에 문헌[Kozak, M., J.Mol.Biol. 196:947-950(1987)]에 기재된 바와 같은 진핵 세포내에서 해독을 개시하기에 효과적인 시그날, 및 도 1A 내지 도 1C(서열 번호1)에 기재된 AIM II 암호 서열 중 22개 염기를 포함하는 서열 5'GCT CCAGGA TCCGCC ATC ATG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C3'(서열 번호 15)을 갖는다. 3' 프라이머는 밑줄친 Asp 718 제한 부위와 그 다음에 도 1A 내지 도 1C(서열 번호 1)에 기재된 AIM II 유전자의 뉴클레오티드 769 내지 795에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 서열 5'GA CGCGGT ACCGTC CAA TGC ACC ACG CTC CTT CCT TC 3'(서열 번호 16)을 갖는다.

이와 같은 증폭 단편은 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp 718로 분해하고, 그 다음 1% 아가로스 겔로 다시 정제한다. 그 다음 분리된 단편과 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 결찰시킨다. 이.콜리 HB101 또는 XL-1 청색 세포를 형질전환시키고, 그 후 예컨대 제한 효소 분석을 통해 플라스미드 pC4에 삽입된 단편을 함유하는 박테리아를 동정한다.

활성 DHFR 유전자가 결실된 중국 햄스터 난소 세포를 형질감염을 위하여 사용한다. 발현 플라스미드 pC4 5 ㎍을 리포펙틴을 사용하여 플라스미드 pSV2-neo 0.5 ㎍과 함께 동시형질감염시킨다(Felgner et al., 전술한 문헌 참조). 상기 플라스미드 pSV2neo는 우성의 선별용 마커인, G418을 비롯한 일군의 항생제에 내성을 부여하는 효소를 암호하는 Tn5 유래의 neo 유전자를 포함한다. 얻어지는 세포를 G418 1 ㎎/㎖이 보강된 알파 - MEM 배지에 접종한다. 2 일 후, 세포를 트립신으로 처리하고, 메토트렉세이트 10, 25 또는 50 ng/㎖과 G418 1 ㎎/㎖이 보강된 알파 -MEM이 첨가된 하이브리도마 클로닝 평판(Greiner, 독일)에 접종한다. 약 10 내지 14일 후, 단일 클론을 트립신처리한 다음, 상이한 농도의 메토트렉세이트(50 nM, 100nM, 200nM, 400nM, 800nM)를 사용하는 6-웰의 페트리접시 또는 10㎖용 플라스크에 접종한다. 최고 농도의 메토트렉세이트에서 증식하는 클론을, 더 높은 농도의 메토트렉세이트(1 μM, 2μM, 5μM, 10 mM, 20 mM)를 함유하는 새로운 6-웰의 평판으로 이동시켰다. 농도 100 내지 200 μM에서 증식하는 클론이 얻어질 때까지 동일한 절차를 반복하였다. 목적 유전자 생성물의 발현은, 예컨대 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯이나 역상 HPLC 분석을 통해 분석한다.

실시예 4: AIM II 단백질 발현의 조직 분포

인간 조직 중에서의 AIM II 유전자 발현을 조사하기 위하여 상기 인용된 바 있는 문헌[Sambrook et al.]에 기재된 방법을 사용하여 노던 블롯 분석을 실시하였다. AIM II 단백질의 전체 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 함유하는 cDNA 프로브를rediprime^TMDNA 표지 시스템(아머샴 라이프 사이언스)을 제조자의 지시에 따라 사용하여³²P로 표지화하였다. 표지화 후, 프로브는 제조자의 프로토콜 PT1200-1에 따라 CHROMA SPIN-100^TM컬럼(클론테크 레보레이토리즈, 인코포레이티드)을 사용하여 정제한다. 그 다음, 정제된 표지화된 프로브를 사용하여 각종 인간 조직을 AIM II mRNA에 대해 조사한다.

각종 인간 조직(H) 또는 인간 면역계 조직(IM)을 함유하는 다중 조직 노던(MTN) 블롯을 클론테크에서 얻어, 제조자의 프로토콜 PT1190-1에 따라ExpressHyb^TM하이브리드화 용액(클론테크)을 사용하여 표지된 프로브로 조사하였다. 하이브리드화 및 세척 후, 블롯을 하룻밤동안 -70℃에서 필름에 올려놓고 노출시킨 후, 표준 방법에 따라 필름을 발색시켰다.

본 발명은 전술한 상세한 설명과 실시예에 구체적으로 기재된 예와는 다르게 실시될 수 있다는 것은 자명하다.

또한, 상기 교시된 내용을 통해 본 발명의 다양한 변형과 수정이 가능하며, 이것 또한 하기 청구의 범위 영역에 속하는 것이다.

본 명세서에 인용된 모든 문헌(특허, 특허 출원, 잡지, 실험서, 서적 또는 기타 다른 서류 등)들은 그 전체 내용이 본 발명에 참고로 인용되었다.

본 발명은 림프절증, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환을 치료하고, 종양 세포 성장과 같은 종양형성을 억제하는 치료에 효과가 있다.

Claims

(a) 도 1A 내지 도 1C에 기재된 완전한 아미노산 서열(서열 번호 2)을 가진 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열;

(b) ATCC 기탁번호 97689호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 가진 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열;

(c) AIM II 폴리펩티드 세포외 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

(d) AIM II 폴리펩티드 경막 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

(e) AIM II 폴리펩티드 세포내 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

(f) 세포외 도메인과 세포내 도메인은 갖고 있으나 경막 도메인은 결실되어 있는 가용성 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열;

(g) 상기 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군중에서 선택되는 서열에 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자 분리물.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 도 1A 내지 도 1C에 기재된 완전한 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 분자 분리물.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 도 1A 내지 도 1C에 기재된 완전한 아미노산 서열(서열 번호 2)을 갖는 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 도 1A 내지 도 1C에 기재된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 갖는 있는 것을 특징으로 하는 핵산 분자 분리물.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 ATCC 기탁번호 제97689호에 함유된 cDNA 클론의 완전한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 분자 분리물.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 ATCC 기탁번호 제97689호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호된 완전한 아미노산 서열을 가진 AIM II 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 분자 분리물.
제1항의 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)에 기재된 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드하지만, 단지 A 잔기나 또는 단지 T 잔기만으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해서는 엄격한 하이브리드 조건하에서 하이브리드하지 않는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것이 특징인, 핵산 분자 분리물.
제1항의 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에 기재된 아미노산 서열을 갖는AIM II 폴리펩티드의 에피토프 함유 부위의 아미노산 서열을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것이 특징인, 핵산 분자 분리물.
제7항에 있어서, AIM II 폴리펩티드의 에피토프 함유 부위가, 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 13 내지 약 20의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 23 내지 약 36의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 69 내지 약 79 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 85 내지 약 94 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 167 내지 약 178 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 184 내지 약 196 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 및 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 221 내지 약 233 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2)로 구성된 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자 분리물.
제1항에 기재된 핵산 분자 분리물을 벡터에 삽입하는 것을 포함하는, 재조합 벡터의 제조 방법.
제9항에 기재된 방법을 통해 생성된 재조합 벡터.
제10항에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포 중으로 도입시키는 것을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법.
제11항에 기재된 방법을 통해 생성된 재조합 숙주 세포.
제12항에 기재된 재조합 숙주 세포를 AIM II 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 배양하고, 생성된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 AIM II 폴리펩티드를 생성하는 재조합 방법.
(a) 도 1A 내지 도 1C에 기재된 완전한 아미노산 서열(서열 번호 2)을 가진 AIM II 폴리펩티드의 아미노산 서열;

(b) ATCC 기탁번호 97689호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호된 완전한 아미노산 서열을 가진 AIM II 폴리펩티드의 아미노산 서열;

(c) AIM II 폴리펩티드 세포외 도메인의 아미노산 서열;

(d) AIM II 폴리펩티드 경막 도메인의 아미노산 서열;

(e) AIM II 폴리펩티드 세포내 도메인의 아미노산 서열;

(f) 세포외 도메인과 세포내 도메인의 일부 또는 전체는 갖고 있으나 경막 도메인은 결실되어 있는 가용성 AIM II 폴리펩티드의 아미노산 서열;

(g) 상기 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에 기재된 폴리펩티드 중 어느 하나의 폴리펩티드의 에피토프 함유 부위에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 군중에서 선택되는 서열에 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 AIM II 폴리펩티드 분리물.
도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 13 내지 약 20의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 23 내지 약 36의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 69 내지 약 79 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 85 내지 약 94 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 167 내지 약 178 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 184 내지 약 196 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2); 및 도 1A 내지 도 1C에 기재된 약 221 내지 약 233 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드(서열 번호 2)로 구성된 군중에서 선택되는 AIM II 단백질의 에피토프 함유 부위를 포함하는 폴리펩티드 분리물.
제14항에 기재된 AIM II 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 분리물.
림프절증, 자가면역 질환 및 이식편대숙주 질환으로 구성된 군 중에서 선택되는 질환이나 증상의 치료가 요구되는 환자에게 제14항의 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에 기재된 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 질환이나 증상을 치료하는 방법.
종양 형성의 치료가 요구되는 환자에게 제14항의 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에 기재된 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 종양 형성을 억제하는 방법.
패혈증쇼크, 염증, 뇌말라리아, HIV 바이러스의 활성화, 골흡수, 류마티스성 관절염 및 악액질로 구성된 군 중에서 선택되는 질환이나 증상의 치료가 요구되는 환자에게 제14항에 기재된 폴리펩티드의 길항물질을 유효량 투여하는 것을 포함하여, 상기 질환이나 증상을 예방하는 방법.