ES2391087T3 - Anticuerpos de IL-9 recombinantes y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo de IL-9 que comprende: (a) una región de determinación de complementariedad (CDR) 1 del dominio variable pesado (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:26; y una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2; y una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3; y una VL CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:62; y una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:65; y una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:20; o (b) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:27; y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:28; donde el anticuerpo se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 humano con alta afinidad, donde la alta afinidad se caracteriza por: (i) una constante de velocidad de asociación (kon) de al menos 105 M-1s-1; y una constante de velocidad de disociación (koff) de menos de 2 x 10-4s-1; o (ii) una constante de disociación (Kd) de menos de 10-9 M donde la alta afinidad se mide por Biacore.

Description

Anticuerpos de IL-9 recombinantes y usos de los mismos
1. CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica A un polipéptido IL-9 y composiciones que comprenden dichos anticuerpos. La invención también proporciona protocolos terapéuticos y profilácticos para prevenir, tratar, controlar, y/o mejorar diversos trastornos o uno o más síntomas de los mismos, comprendiendo dichos protocolos la administración de anticuerpos que se unen de manera inmunoespecífica a un polipéptido IL-9 exclusivamente o en combinación con otras terapias. En particular, la presente invención proporciona métodos para prevenir, tratar, controlar, y/o mejorar síntomas asociados a un trastorno inflamatorio (p.ej., el asma) o una infección respiratoria, comprendiendo dichos métodos la administración a un sujeto humano de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos del mismo que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido IL-9. La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 para la prevención, tratamiento, control, y/o mejora de diversos trastornos. La invención proporciona además métodos para detectar o diagnosticar la expresión de IL-9 o trastornos asociados con una expresión de IL-9 aberrante utilizando composiciones que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen de manera inmunoespecífica a un polipéptido IL-9. La presente invención hacer referencia además a artículos de fabricación y kits que comprenden anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido IL-9 para su uso en la prevención, control, tratamiento, y/o mejora de diversos trastornos.
2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 2.1 TRASTORNOS AUTOINMUNES
[0002] Los trastornos autoinmunes se causan cuando el sistema inmunitario del cuerpo, que debe defender el cuerpo frente a bacterias, virus, y cualquier otro producto extraño, falla y produce anticuerpos contra tejido, células y órganos sanos. Los anticuerpos, las células T y los macrófagos proporcionan una protección beneficiosa, pero también pueden producir respuestas inmunológicas perjudiciales o mortales.
[0003] Los mecanismos principales por los que los autoanticuerpos pueden producir una enfermedad autoinmune son la destrucción lítica dependiente del complemento de la célula diana, opsonización, formación de inmunocomplejos, bloqueo de sitios receptores para ligandos fisiológicos, y estimulación de los receptores de la superficie celular. El autoanticuerpo puede unirse a los receptores de la superficie celular y bien inhibir o estimular la función especializada de la célula (Paul, W. E. Ed., 1989, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, Chapter31, p. 839).
[0004] Las enfermedades autoinmunes pueden ser específicas de un órgano o sistémicas y son provocadas por diferentes mecanismos patogénicos. La autoinmunización específica de un órgano se caracteriza por la tolerancia y supresión dentro del compartimento de células T, la expresión aberrante de antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), mimetismo antigénico y variaciones alélicas en genes del MHC. Las enfermedades autoinmunes sistémicas incluyen la activación policlonal de células B y anomalías de las células T inmunorreguladoras, receptores de células T y genes del MHC. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes específicas de un órgano son la diabetes, enfermedad de Hashimoto, insuficiencia suprarrenal autoinmune, aplasia eritrocitaria pura, esclerosis múltiple y carditis reumatoide. Las enfermedades autoinmunes sistémicas representativas son el lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, inflamación crónica, dermatomiositis, esclerodermia y polimiositis asociada al síndrome de Sjogren.
[0005] El tratamiento actual de las enfermedades autoinmunes implica la administración de agentes inmunosupresores como cortisona, derivados de la aspirina, hidroxicloroquina, metotrexato, azatioprina y ciclofosfamida y combinaciones de los mismos. Sin embargo, el dilema al que nos enfrentamos cuando se administran agentes inmunosupresores es que cuanto más eficazmente se trata la enfermedad autoinmune, más indefenso queda el paciente al ataque de infecciones. Por ello, existe la necesidad de un tratamiento eficaz contra las enfermedades autoinmunes que no ponga en peligro el sistema inmunitario del paciente.
2.2 TRASTORNOS INFLAMATORIOS
[0006] La inflamación juega un papel fundamental en las defensas del huésped y la progresión de las enfermedades inmunomediadas. La respuesta inflamatoria se inicia por una lesión del tejido (p.ej., traumatismo, isquemia, y partículas extrañas) e infección por una compleja cascada de eventos, incluyendo mediadores químicos (p.ej., citocinas y postaglandinas) y células inflamatorias (p.ej., leucocitos). La respuesta inflamatoria se caracteriza por un flujo sanguíneo aumentado, permeabilidad capilar aumentada, e influjo de células fagocíticas. Estos eventos provocan hinchazón, enrojecimiento, calor, y formación de pus en el lugar de la lesión o infección.
[0007] Una delicada interacción equilibrada entre los elementos inmunes celulares y humorales en la respuesta inflamatoria permite la eliminación de los agentes perjudiciales y el inicio de la reparación del tejido dañado. Cuando esta interacción delicadamente equilibrada se altera, la respuesta inflamatoria puede tener como resultado un daño considerable del tejido normal y puede ser más perjudicial que la lesión o infección original que provocó la reacción inflamatoria inicial. En estos casos de respuestas inflamatorias descontroladas es necesaria la intervención clínica para evitar el daño de los tejidos y la disfunción de órganos. Las enfermedades y trastornos como la artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad de Crohn, psoriasis, enfermedad intestinal inflamatoria, asma, y alergias se caracterizan por la inflamación.
[0008] Las terapias actuales para trastornos inflamatorios incluyen medicamentos sintomáticos y agentes inmunosupresores para controlar los síntomas. Por ejemplo, medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs
o NSAIDs, por sus siglas en inglés) como la aspirina, ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, tolmetina, sulindac, meclofenamato sódico, piroxicam, flurbiprofeno, diclofenaco, oxaprozina, nabumetona, etodolac, y ketoprofeno que tienen efectos analgésicos y antiinflamatorios se utilizan para tratar los trastornos inflamatorios. Sin embargo, se cree que los AINEs no son capaces de alterar la evolución de la enfermedad, (Tierney et al. (eds.), Current Medical Diagnosis & Treatment, 37 ed., Appleton & Lange (1998), p793). Además, los AINEs causan con frecuencia efectos secundarios gastrointestinales, afectan al tracto intestinal inferior provocando perforación o agravando la enfermedad inflamatoria intestinal, producen toxicidad renal y prolongan el tiempo de hemorragia. Los corticosteroides son otra clase de fármacos que se utilizan comúnmente para controlar los síntomas inflamatorios. Los corticosteroides, al igual que los AINEs, no alteran la evolución natural de la enfermedad, y de ese modo, las manifestaciones clínicas de la enfermedad activa reaparecen de forma común cuando se interrumpe la administración del medicamento. El grave problema de las reacciones negativas resultantes de la terapia de corticosteroides prolongada (p.ej., osteoporosis, aumento del riesgo de infección, aumento del apetito, hipertensión, edema, úlcera péptica, y psicosis) limita enormemente su uso prolongado.
[0009] También se utilizan comúnmente pequeñas dosis de agentes inmunosupresores, como los agentes citotóxicos, para el tratamiento de trastornos inflamatorios. Por ejemplo, el metotrexato, un antagonista del ácido fólico, se utiliza a menudo en el tratamiento de la psoriasis, artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias. El metotrexato, como otros agentes citotóxicos, provoca con frecuencia estomatitis, eritema, alopecia, náuseas, vómitos, diarrea, y daño a los órganos principales como el riñón y el hígado. El uso prolongado de agentes inmunosupresores normalmente deja al paciente sin defensas frente a las infecciones.
[0010] Se buscan constantemente nuevas terapias para los trastornos inflamatorios. En particular, se busca constantemente cualquier nuevo tratamiento que reduzca la dosis y/o frecuencia de administración de agentes que se utilizan actualmente, o que sea capaz de aumentar la eficacia de un tratamiento utilizado en la actualidad.
2.2.1 Asma
[0011] Alrededor de 12 millones de personas en Estados Unidos tienen asma y es la causa principal de hospitalización de niños. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17º ed., 1999).
[0012] El asma es una enfermedad inflamatoria del pulmón que se caracteriza por hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR, en inglés), broncoconstricción (es decir, sibilancia), inflamación eosinofílica, hipersecreción de mucosidad, fibrosis subepitelial, y niveles elevados de IgE. Los ataques asmáticos pueden provocarse por factores ambientales (p.ej., ácaros, insectos, animales (p.ej., gatos, perros, conejos, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, ratones, ratas, y aves), hongos, contaminantes atmosféricos (p.ej., humo de tabaco), gases irritantes, humos, vapores, aerosoles, o sustancias químicas, o polen), ejercicio, o aire frío. Se desconoce la causa o causas del asma. Sin embargo, se ha especulado que los antecedentes familiares del asma (London et al., 2001, Epidemiology 12(5):577-83), la exposición temprana a los alérgenos, como ácaros de polvo, humo de tabaco, y cucarachas (Melen et al., 2001, 56(7):646-52), e infecciones respiratorias (Wenzel et al., 2002, Am J Med, 112(8):672-33 y Lin et al., 2001, J Microbiol Immuno Infect, 34(4):259-64) pueden aumentar el riesgo de desarrollar asma.
[0013] El asma puede identificarse por la sibilancia recurrente y la limitación intermitente del flujo de aire. Puede cuantificarse una tendencia asmática mediante la medición de la hiperreactividad bronquial en la que se limita la curva dosis-respuesta del sujeto a un broncoconstrictor como histamina o metacolina. La curva se resume comúnmente por la dosis que resulta en una caída del 20% en el flujo de aire (PD20) o la inclinación de la curva entre la medición inicial del flujo de aire y la última dosis administrada (inclinación).
[0014] Las terapias actuales se dirigen principalmente a controlar el asma e incluyen la administración de fármacos β-adenérgicos (p.ej., epinefrina o isoproterenol), teofilina, fármacos anticolinérgicos (p.ej., atropina y bromuro de ipratropio), corticosteroides, e inhibidores de leucotrienos. Estas terapias tienen efectos secundarios asociados como interacción entre los fármacos, sequedad bucal, visión borrosa, supresión del crecimiento en niños, y osteoporosis en mujeres menopáusicas. Se administran cromolín y nedocromil de forma profiláctica para inhibir la liberación de mediadores desde las células inflamatorias, reducir la hiperreactividad de las vías respiratorias, y bloquear las reacciones a alérgenos. Sin embargo, actualmente no existen terapias disponibles para prevenir el desarrollo del asma en sujetos con un mayor riesgo de desarrollar asma. Por ello, son necesarias nuevas terapias para el asma con menos efectos secundarios y mayor eficacia profiláctica y/o terapéutica.
2.2.2 Alergias
[0015] Una causa común de inflamación son las alergias. Las reacciones alérgicas inmunomediadas (hipersensibilidad) se clasifican en cuatro tipos (I-IV) según los mecanismos subyacentes que llevan a la manifestación de síntomas alérgicos. Las reacciones alérgicas de tipo I son reacciones de hipersensibilidad inmediatas caracterizada por la liberación mediada por IgE de sustancias vasoactivas como la histamina desde mastocitos y basófilos. Con el paso de las horas, los mastocitos y basófilos liberan citocinas proinflamatorias que producen vasodilatación, aumento de la permeabilidad capilar, hipersecreción glandular, espasmo muscular leve, e infiltración del tejido con eosinófilos y otras células inflamatorias.
[0016] Las reacciones alérgicas de tipo II son reacciones de hipersensibilidad citotóxica e incluyen anticuerpos IgG o IgM unidos a los antígenos de la superficie celular con posterior fijación del complemento. Determinadas células citotóxicas, como las células T asesinas o macrófagos, se activan, se unen a células recubiertas con IgG y destruyen las células diana. Las reacciones de tipo II pueden causar citólisis o daño en el tejido.
[0017] Las reacciones de tipo III son reacciones por inmunocomplejos resultantes de los depósitos de la circulación de inmunocomplejos antígeno-anticuerpo en los vasos sanguíneos o tejidos. La inflamación aguda es el resultado de la iniciación por el inmunocomplejo de una secuencia de eventos que resultan en la migración de células polimorfonucleares y la liberación de enzimas proteolíticas lisosomales y factores de permeabilidad en los tejidos.
[0018] Las reacciones de tipo IV son reacciones de hipersensibilidad retardadas causadas por linfocitos T sensibilizados tras entrar en contacto con un antígeno específico. Los linfocitos T sensibilizados activados provocan una lesión inmunológica mediante un efecto tóxico directo o a través de la liberación de linfocinas y otras sustancias solubles. Los linfocitos T activados pueden liberar también citocinas que afectan a la actividad de los macrófagos, neutrófilos, y células linfoides asesinas.
[0019] Las reacciones alérgicas pueden ser inmediatas, de fase tardía, o crónicas. La exposición continua o crónica a un alérgeno puede resultar en una inflamación alérgica crónica. Los tejidos de lugares en los que se da inflamación crónica contienen eosinófilos y células T que liberan mediadores que pueden causar daño en el tejido, aumento de la inflamación, y aumento de la sensibilidad.
[0020] Actualmente, las reacciones alérgicas se tratan con fármacos como los antihistamínicos, corticosteroides, vasodilatadores, broncodilatadores, inhibidores de leucotrienos, e inmunomoduladores que tratan de aliviar los síntomas asociados con la reacción alérgica. Las terapias actuales para las reacciones alérgicas producen efectos secundarios negativos o tienen un uso limitado. Por ejemplo, las dosis altas de antihistamínicos y corticosteroides tienen efectos secundarios perjudiciales (p.ej., alteración del sistema nervioso central, estreñimiento, etc.). Los vasodilatadores plantean un aumento de riesgo en pacientes con determinadas afecciones como hipertensión, enfermedades cardiovasculares, hipertiroidismo y puede causar la muerte por hemorragia cerebrovascular o arritmia cardiaca. Por todo ello, son necesarios otros métodos para tratar las reacciones alérgicas.
2.3 INFECCIONES RESPIRATORIAS
[0021] Las infecciones respiratorias son infecciones comunes del tracto respiratorio superior (p.ej., nariz, oídos, senos nasales y garganta) y el tracto respiratorio inferior (p.ej., tráquea, bronquios, y pulmones). Los síntomas de infección en las vías respiratorias superiores incluyen goteo o congestión nasal, irritabilidad, agitación, falta de apetito, disminución del nivel de actividad, tos y fiebre. Las infecciones de las vías respiratorias superiores virales causan y/o se asocian a la irritación de garganta, constipados, crup y gripe. Los ejemplos de los virus que causan infecciones en el tracto respiratorio superior incluyen rinovirus y virus de influenza tipo A y B. Las infecciones bacterianas de las vías respiratorias superiores comunes causan y/o se asocian a, por ejemplo, la tos ferina y la amigdalitis estreptocócica. Un ejemplo de bacteria que causa una infección en el tracto respiratorio superior es el Streptococcus.
[0022] Las manifestaciones clínicas de una infección respiratoria inferior incluyen tos superficial que produce esputo en los pulmones, fiebre, y dificultad en la respiración. Los ejemplos de infecciones virales del tracto respiratorio inferior son infecciones del virus de la parainfluenza (PIV, en inglés), infecciones del virus sincicial respiratorio (VSR), y bronquiolitis (provocada por PIV, VSR, virus de la influenza, micoplasma y algunos adenovirus). Los ejemplos de bacterias que causan infecciones del tracto respiratorio inferior incluyen Streptococcus pneumoniae que causa neumonía neumocócica y Mycobacterium tuberculosis que causa tuberculosis. Las infecciones respiratorias causadas por hongos incluyen la candidiasis sistémica, blastomicosis, criptococosis, coccidioidomicosis, y aspergilosis. Las infecciones respiratorias pueden ser infecciones primarias o secundarias.
[0023] Las terapias actuales para las infecciones respiratorias implican la administración de agentes antivirales, antibacterianos, y agentes antifúngicos para el tratamiento, prevención, o mejora de las infecciones respiratorias virales, bacterianas y fúngicas, respectivamente. Desafortunadamente, con respecto a determinadas infecciones no existen terapias disponibles, las infecciones han demostrado no responder a las terapias, o la aparición de efectos secundarios tiene más peso que los beneficios de la administración de una terapia a un sujeto. El uso de agentes antibacterianos para el tratamiento de infecciones respiratorias bacterianas puede producir también efectos secundarios o resultar en cepas bacterianas resistentes. La administración de agentes antifúngicos puede causar fallo renal o disfunción de la médula ósea y puede no ser eficaz contra la infección fúngica en pacientes con sistemas inmunitarios deprimidos. Además, el microorganismo que provoca la infección (p.ej., virus, bacteria, u hongo) puede ser resistente o desarrollar resistencia al agente terapéutico administrado o la combinación de agentes terapéuticos. De hecho, los microorganismos que desarrollan una resistencia a los agentes terapéuticos administrados a menudo desarrollan resistencia a fármacos pleiotrópicos o a múltiples fármacos, es decir, resistencia a los agentes terapéuticos que actúan mediante mecanismos distintos a los mecanismos de los agentes administrados. Por ello, como resultado de la resistencia a los fármacos, muchas infecciones no responden a una amplia gama de protocolos de tratamiento estándares. Por lo tanto, son necesarias nuevas terapias para el tratamiento, prevención y mejora de las infecciones respiratorias y síntomas de las mismas.
2.3.1 Infecciones respiratorias virales 2.3.1.1 Infecciones por el virus de la parainfluenza
[0024] La infección viral de parainfluenza (PIV) resulta en enfermedades del tracto respiratorio graves en bebés y niños. (Tao et al., 1999, Vaccine 17: 1100-08). Las infecciones virales de parainfluenza infecciosa representan aproximadamente el 20% del total de hospitalizaciones de pacientes pediátricos que padecen infecciones del tracto respiratorio a nivel mundial. Id.
[0025] El PIV es un miembro del género paramixovirus de la familia paramixoviridae. El PIV está compuesto por dos módulos estructurales: (1) un núcleo de ribonucleoproteínas interno o nucleocápside, que contiene el genoma viral, y
(2) una envoltura externa aproximadamente esférica de lipoproteínas. Su genoma es una cadena sencilla de ARN en sentido negativo, de aproximadamente 15.456 nucleótidos de longitud, que codifica al menos ocho polipéptidos. Estas proteínas incluyen, sin carácter limitativo, la proteína de la estructura de nucleocápside (NP, NC, o N dependiendo del género), la fosfoproteína (P), la proteína de la matriz (M), la glicoproteína de fusión (F), la glicoproteína hemaglutina-neuraminidasa (HN), proteína larga polimerasa (L), y las proteínas C y D de función desconocida. Id.
[0026] La proteína de la nucleocápside de parainfluenza (NP, NC o N) consta de dos dominios dentro de cada unidad de proteína que incluye un dominio amino-terminal, que comprende aproximadamente dos tercios de la molécula, que interactúa directamente con el ARN, y un dominio carboxilo-terminal, que yace en la superficie de la nucleocápside ensamblada. Se cree que existe una articulación en la junta de estos dos dominios impartiendo así cierta flexibilidad a esta proteína (véase Fields et al. (ed.), 1991, Fundamental Virology, 2º ed., Raven Press, New York,). La proteína de la matriz (M) está implicada aparentemente en el ensamblaje viral e interactúa con la membrana viral así como con las proteínas de la nucleocápside. La fosfoproteína (P), que está sujeta a fosforilación, se cree que tiene un papel regulador en la trasncripción y puede estar involucrada también en la metilación, fosforilación y poliadenilación. La glicoproteína de fusión (F) interactúa con la membrana viral y se produce en primer lugar como precursor inactivo, después se escinde de forma postraduccional para producir dos polipéptidos unidos por disulfuro. La proteína F activa está implicada también en la penetración del virus de la parainfluenza en las células huéspedes mediante la facilitación de la fusión de la envoltura viral con la membrana de plasma de la célula huésped. Id. La glicoproteína, hemaglutinina-neuraminidasa (HN), sobresale de la envoltura permitiendo al virus contener tanto actividades de hemaglutinina como de neuraminidasa. La HN es altamente hidrofóbica en su terminal amino, lo que sirve para sujetar la proteína HN en la bicapa lipida. Id. Finalmente, la proteína larga polimerasa (L) juega un papel importante en la transcripción y replicación. Id.
[0027] En la actualidad, las terapias para el PIV comprenden el tratamiento de síntomas específicos. En la mayoría de los casos, el descanso, fluidos, y un ambiente confortable resulta una terapia suficiente para una infección por PIV. En aquellos casos en los que la fiebre es alta, se recomienda paracetamol en lugar de aspirina, especialmente en niños para evitar el riesgo de síndrome de Reye con influenza. Para el crup asociado a la infección por PIV, se recomiendan terapias como el aire humidificado, oxígeno, epinefrina racémica aerosolizada, y dexametasona por vía oral (un esteroide) para disminuir la hinchazón de las vías respiratorias superiores y se administran fluidos intravenosos para la deshidratación. La terapia para la bronquiolitis asociada a la infección por PIV incluye terapia de apoyo (p.ej., oxígeno, aire humidificado, percusión torácica (clapping), y drenaje postural para eliminar secreciones, descansar, y líquidos claros) y la administración de albuterol o esteroides. Se pueden administrar agentes antobióticos, antivirales, y/o antifúngicos para evitar infecciones respiratorias secundarias. Véase Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17 ed., 1999).
2.3.1.2 Infecciones por virus sincicial respiratorio
[0028] El virus sincicial respiratorio (“VSR”) es la causa principal de enfermedades graves del tracto respiratorio
inferior en bebés y niños (Feigen et al., eds., 1987, Textbook of Pediatric Infectious Diseases, WB Saunders, Philadelphia páginas 1653-1675; New Vaccine Development, Establishing Priorities, Vol.1, 1985, National Academy Press, Washington DC, páginas 397-409; y Ruuskanen et al., 1993, Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79). La naturaleza anual de la epidemia de la infección por VSR es evidente en todo el mundo, pero la incidencia y gravedad de la enfermedad del VSR en una estación dada varía según la región (Hall, C.B., 1993, Contemp. Pediatr. 10:92-110). En regiones templadas del hemisferio norte, normalmente comienza a finales de otoño y acaba a finales de primavera. La infección por RSV primaria se da más a menudo en niños de 6 semanas a 2 años de edad y excepcionalmente en las primeras 4 semanas de vida durante epidemias nosocomiales (Hall et al., 1979, New Engl. J. Med. 300:393396). Los niños con alto riesgo de sufrir infección por VSR incluyen, sin carácter limitativo, bebés prematuros (Hall et al., 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396) y niños con displasia broncopulmonar (Groothuis et al., 1988, Pediatrics 82:199-203), enfermedad cardiaca congénita (MacDonald et al., New Engl. J. Med. 307:397-400), inmunodeficiencia congénita o adquirida (Ogra et al., 1988, Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249; y Pohl et al., 1992, J. Infect. Dis. 165:166169), y fibrosis cística (Abman et al., 1988, J. Pediatr. 113:826-830). La tasa de mortalidad en bebés con enfermedades del corazón o pulmones que son hospitalizados con infección por VSR es del 3%-4% (Navas et al., J. Pediatr. 121:348-354).
[0029] El VSR infecta a los adultos así como a bebés y niños. En adultos sanos, el VSR causa predominantemente enfermedades del tracto respiratorio superior. Recientemente, se ha hecho evidente que determinados adultos, especialmente los ancianos, presentan infecciones por VSR sintomáticas con mayor frecuencia de los que se había informado anteriormente (Evans, A.S., eds., 1989, Viral Infections of Humans Epidemiology and Control, 3º ed., Plenum Medical Book, New York en páginas 525-544). También se ha informado de diversas epidemias entre los pacientes de residencias para ancianos y adultos jóvenes institucionalizados (Fasley, A.R., 1991, Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608; y Garvie et al., 1980. Br. Med. J. 281:1253-1254). Finalmente, el VSR puede causar enfermedades graves en personas inmunodeprimidas, especialmente pacientes de transplantes de médula ósea (Hertz et al., 1989, Medicine 68:269-281).
[0030] Las terapias disponibles para el tratamiento de una enfermedad por el VSR establecida son limitadas. La enfermedad por el VSR grave del tracto respiratorio inferior requiere a menudo unos cuidados de apoyo considerables, incluyendo la administración de oxígeno humidificado y asistencia respiratoria (Fields et al., eds, 1990. Fields Virology, 2º ed., Vol. 1, Raven Press, New York en páginas 1045-1072).
[0031] Aunque una vacuna podría evitar la infección por VSR, todavía no se ha autorizado ninguna vacuna para esta indicación. La seguridad es el principal obstáculo para el desarrollo de una vacuna. Una vacuna inactivada por formalina, aunque inmunogénica, causó inesperadamente una mayor incidencia, y más grave, de enfermedad del tracto respiratorio inferior debido a VSR en bebés inmunizados que en bebés inmunizados con una vacuna trivalente de parainfluenza preparada de forma similar (Kim et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:422-434; y Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-421). Se han abandonado diversas vacunas para el VSR candidatas y otras se encuentran en desarrollo (Murphy et al., 1994, Virus Res. 32:13-36), pero incluso resolviendo las cuestiones de seguridad, debe mejorarse también la eficacia de la vacuna. Todavía queda un gran número de problemas sin resolver. Sería necesaria una inmunización en el periodo neonatal inmediato puesto que la mayor incidencia de la enfermedad del tracto respiratorio inferior se da a los 2-5 meses de vida. La inmadurez de la respuesta inmune neonatal junto con los altos títulos de anticuerpos del VSR adquiridos de forma materna podría esperarse que redujera la inmunogenicidad de la vacuna en el periodo neonatal (Murphy et al., 1988, J. Virol. 62:3907-3910; y Murphy et al., 1991, Vaccine 9:185-189). Finalmente, la infección y enfermedad por el VSR primaria no es una buena protección frente a otra enfermedad por el VSR posterior (Henderson et al., 1979, new Engl. J. Med. 300:530-534).
[0032] Actualmente, el únic método autorizado de la profilaxis de la enfermedad por el VSR es la inmunización pasiva. Se han obtenido los primeros datos que sugieren un papel protector de la IgG a partir de observaciones que incluían anticuerpos maternos en hurones (Prince, G.A., Ph.D.diss., University of California, Los Angeles, 1975) y humanos (Lambrecht et al., 1976, J. Infect. Dis. 134:211-217; y Glezen et al., 1981, J. Pediatr. 98:708-715). Hemming et al. (Morell et al., 1986 Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins, Academic Press, London en páginas 285-294) reconocieron la posible utilidad de anticuerpos del VSR en el tratamiento o prevención de la infección por el VSR durante los estudios que incluían la farmacocinética de una inmunoglobulina intravenosa (IgIV) en recién nacidos que se sospeche que padecen sepsis neonatal. Se observó que un bebé, cuyas secreciones respiratorias contenían VSR se recuperó rápidamente tras la infusión de IgIV. Los análisis posteriores del lote de IgIV revelaron títulos inusualmente altos de anticuerpos neutralizantes del VSR. Este mismo grupo de investigadores examinó más tarde la capacidad del suero hiperinmune o la inmunoglobulina, enriquecidos en anticuerpos neutralizantes del VSR, de proteger a ratas algodoneras y primates frente a la infección por el VSR (Prince et al., 1985, Virus Res. 3:193-206; Prince et al., 1990, J. Virol. 64:3091-3092; Hemming et al., 1985, J. Infect. Dis. 152:1083-1087; Prince et al., 1983, Infect. Immun. 42:81-87; y Prince et al., 1985, J. Virol. 55:517-520. Los resultados de estos estudios sugirieron que el anticuerpo neutralizante del VSR administrado de forma profiláctica inhibió la replicación del VSR en el tracto respiratorio en ratas algodoneras. Cuando se administró de forma terapéutica, el anticuerpo del VSR redujo la replicación viral en los pulmones tanto en ratas algodoneras como en un modelo primate no humano. Además, la infusión pasiva de suero inmune o inmunoglobulina no produjo un aumento en la patología pulmonar en ratas algodoneras expuestas posteriormente al VSR.
[0033] Estudios clínicos recientes han demostrado la capacidad de la hiperinmunoglobulina del VSR administrada de forma pasiva (IgIV-VSR) para proteger a los niños en riesgo de sufrir infecciones de las vías respiratorias inferiores severas por el VSR (Groothius et al., 1993, New Engl. J. Med. 329:1524-1530; y THE PREVENT Study Group, 1997, Pediatrics 99:93-99). Aunque esto constituye un gran avance en la prevención de la infección por el VSR, esta terapia plantea determinadas limitaciones a su uso generalizado. En primer lugar, la IgIV-VSR debe infundirse por vía intravenosa durante varias horas para lograr una dosis eficaz. En segundo lugar, las concentraciones de material activo en las hiperinmunoglobulinas son insuficientes para tratar a adultos en riesgo o a la mayoría de niños con función cardiopulmonar comprometida. En tercer lugar, la infusión intravenosa necesita visitas mensuales al hospital durante la temporada del VSR. Por último, puede resultar difícil elegir donantes suficientes para producir una hiperinmunoglobulina del VSR para cubrir la demanda de este producto. En la actualidad, solo aproximadamente el 8% de los donantes normales tienen los títulos de anticuerpos neutralizantes del VSR lo suficientemente altos para permitir producir hiperinmunoglobulina.
[0034] Una forma de mejorar la actividad específica de la inmunoglobulina sería desarrollar uno o más anticuerpos monoclonales (AcM o MAbs, en inglés) neutralizantes del VSR altamente potentes. Tales AcM deberían ser humanos o humanizados para retener farmacocinética favorable y para evitar la generación de una respuesta de anticuerpo humano antiratón, ya que sería necesaria una dosis repetida a lo largo de la estación del VSR. Se ha demostrado que dos glicoproteínas, F y G, en la superficie del VSR son dianas de los anticuerpos neutralizantes (Fields et al., 1990, supra; y Murphy et al., 1994, supra). Estas dos proteínas también son fundamentalmente responsables del reconocimiento viral y entrada en las células diana; la proteína G se une a un receptor celular específico y la proteína F fomenta la fusión del virus con la célula. La proteína F se expresa también en la superficie de las células infectadas y es responsable de la fusión posterior con otras células que lleva a la formación de sincitios. De este modo, los anticuerpos de la proteína F pueden neutralizar directamente el virus o bloquear la entrada del virus en la célula o evitar la formación de sincitios. Aunque se han descrito diferencias estructurales y antigénicas entre los subtipos A y B de ambas proteínas G y F, las diferencias antigénicas más significativas residen en la glicoproteína G, en la que las secuencias de aminoácido son solo un 53% homólogas y la relación antigénica es del 5% (Walsh et al., 1987, J. Infect. Dis. 155:1198-1204; y Johnson et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5625-5629). A la inversa, los anticuerpos producidos contra la proteína F muestran un alto grado de reactividad cruzada entre virus del subtipo A y B. La comparación de las propiedades biológicas y bioquímicas de 18 AcM murinos diferentes dirigidos contra la proteína F del VSR tuvo como resultado la identificación de tres sitios antigénicos diferentes designados A, B y C. (Beeler and Coelingh, 1989, J, Virol. 7:2941-2950). Se llevaron a cabo estudios de la neutralización contra un panel de cepas del VSR aisladas de 1956 a 1985 que demostró que los epítopos de los sitios antigénicos A y C se encuentran altamente conservados, mientras que los epítopos del sitio antigénico B son variables.
[0035] Se aprueba un anticuerpo humanizado producido contra un epítopo en el sitio antigénico A de la proteína F del VSR, palivizumab (SYNAGIS®), para la administración intramuscular a pacientes pediátricos para la prevención de enfermedades del tracto respiratorio inferior provocadas por el VSR en dosis mensuales recomendadas de 15 mg/kg del peso corporal a lo largo de la temporada del VSR (de noviembre a abril en el hemisferio norte). El palivizumab (SYNAGIS®) es un compuesto de secuencias de anticuerpo humano (95%) y murino (5%). Véase, Johnson et al., 1997, J. Infect. Diseases 176:1215-1224 y la patente estadounidense nº 5.824.307, cuyo contenido completo queda aquí incorporado mediante referencia. La secuencia de cadena pesada humana se derivó de los dominios constantes de IgG1 humana y las regiones marco variables de los genes VH Cor (Press et al., 1970, Biochem. J. 117:641-660) y Cess (Takashi et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:194-198). La secuencia de la cadena ligera humana se derivó del dominio constante de Cκ y las regiones marco variables del gen VL K104 con Jκ-4 (Bentley et al., 1980, Nature 288:5194-5198). Las secuencias murinas se derivaron de un anticuerpo monoclonal murino, Mab 1129 (Beeler et al., 1989, J. Virology 63:2941-2950), en un proceso que implicaba el injerto de las regiones determinantes de la complementariedad murinas en los marcos de anticuerpos humanos.
2.3.1.3 Metapneumovirus humano y aviar
[0036] Recientemente, se ha aislado un nuevo miembro de la familia Paramyxoviridae a partir de 28 niños con síntomas clínicos similares a aquellos provocados por la infección del virus sincitial respiratorio humano (VSRh), que van desde la enfermedad leve del tracto respiratorio superior hasta la bronquiolitis y neumonía grave (Van Den Hoogen et al., 2001, Nature Medicine 7: 719-724). El nuevo virus se denominó metapneumovirus humano (MPVh) basándose en la homología de la secuencia y la constelación genética. El estudio mostró también que a la edad de cinco años casi todos los niños en los Países Bajos habían estado expuestos al MPVh y que el virus había estado circulando en humanos durante al menos medio siglo.
[0037] La organización genómica del metapneumovirus humano se describe en van den Hoogen et al., 2002, Virology 295:119-132. El metapneumovirus humano ha sido aislado recientemente a partir de pacientes de Norteamérica (Peret et al., 2002, J. Infect. Diseases 185:1660-1663).
[0038] El metapneumovirus humano guarda relación con el metapneumovirus aviar. Por ejemplo, la proteína F del MPVh es altamente homóloga a la proteína F del pneumovirus aviar (PVA). El alineamiento de la proteína F metapneumoviral humana con la proteína F de un pneumovirus aviar aislado a partir del ánade real muestra una identidad del 85,6% en el ectodominio. El alineamiento de la proteína F metapneumoviral humana con la proteína F de un pneumovirus aviar aislado a partir del pavo (subgrupo B) muestra una identidad del 75% en el ectodominio.
[0039] La enfermedad respiratoria causada por un PVA se describió por primera vez en Sudáfrica a finales de los 70’ (Buys et al., 1980, Turkey 28:36-46) donde tuvo un efecto devastador en la industria del pavo. La enfermedad en los pavos se caracterizó por la sinusitis y rinitis y se llamó rinotraqueítis del pavo (TRT, en inglés). Los aislados de PVA europeos también han estado fuertemente implicados como factores en el síndorme de la cabeza hinchada (SCH) en pollos (O’Brien, 1985, Vet. Rec. 117:619-620). Originalmente, la enfermedad aparecía en manadas de pollos de engorde infectados con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV, en inglés) y se asumió que era un problema secundario asociado a la enfermedad de Newcastle (ND, en inglés). Se detectó el anticuerpo contra el PVA europeo en pollos afectados tras la aparición de SCH (Cook et al., 1988, Avian Pathol. 17:403-410), lo que implicaba que el PVA era la causa.
[0040] El pneumovirus aviar es un virus de ARN no segmentado de cadena sencilla que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxoviridae, del género metapneumovirus (Cavanagh y Barrett, 1988, Virus Res. 11:241-256; Ling et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:1709-1715; Yu et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:1355-1363). La familia Paramyxoviridae se divide en dos subfamilias: la Paramyxovirinae y la Pneumovirinae. La subfamilia Paramyxovirinae incluye, sin carácter limitativo, los géneros: Paramyxovirus, Rubulavirus, y Morbilivirus. Recientemente, la subfamilia Pneumovirinae se dividió en dos géneros basados en el orden de los genes, a saber, pneumovirus y metapneumovirus (Naylor et al., 1998, J. Gen.Virol., 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159). El género pneumovirus incluye, sin carácter limitativo, el virus sincitial respiratorio humano (VSRh), el virus sincitial respiratorio bovino (VSRb), el virus sincitial respiratorio ovino y el pneumovirus del ratón. El género metapneumovirus incluye, sin carácter limitativo, el pneumovirus aviar europeo (subgrupos A y B), que se diferencia del VSRh, las especies tipo del género pneumovirus (Naylor et al., 1998, J. Gen. Virol., 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159). El aislado de PVA estadounidense representa un tercer subgrupo (subgrupo C) del género metapneumovirus, porque se ha descubierto que es antigénicamente y genéticamente diferente de los aislados europeos (Seal, 1998, Virus Res. 58:45-52; Senne et al., 1998, In: Proc. 47th WPDC, California, pp.67-68).
[0041] El examen por microscopía electrónica de PVA teñido negativamente revela viriones pleomórficos, a veces esféricos, que van desde los 80 a los 200 nm de diámetro con largos filamentos de 1000 a 2000 nm de longitud (Collins and Gough, 1988, J. Gen. Virol. 69:909-916). La envoltura está formada por una membrana salpicada de púas de 13 a 15 nm de longitud. El nucleocápside es helicoidal, de 14 nm de diámetro y un paso de hélice de 7 nm. El diámetro del nucleocápside es más pequeños que el de los géneros Paramyxovirus y Morbillivirus, que normalmente tienen diámetros de aproximadamente 18 nm.
[0042] La infección por el pneumovirus aviar es una enfermedad emergente en los Estados Unidos a pesar de su presencia en el resto del mundo en las aves de corral durante muchos años. En mayo de 1996, apareció una enfermedad respiratoria altamente contagiosa de los pavos en Colorado, y posteriormente se aisló un PVA en el Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (NVSL, en inglés) en Ames, Iowa (Senne et al., 1997, Proc. 134th Ann. Mtg., AVMA, pp. 190). Con anterioridad a esto, los Estados Unidos y Canadá se consideraban libres del pneumovirus aviar (Pearson et al., 1993, In: Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control, pp. 78-83; Hecker y Myers, 1993, Vet. Rec. 132:172). A principios de 1997, se detectó la presencia del PVA de forma serológica en pavos en Minnesota. Cuando se confirmó el primer diagnóstico, las infecciones de PVA ya se habían extendido por muchas granjas. Esta enfermedad se asocia a signos clínicos en el tracto respiratorio superior: espuma en los ojos, secreción nasal e hinchazón de los senos nasales. Esto se agrava por infecciones secundarias. La morbosidad en las aves infectadas puede llegar a ser del 100%. La mortalidad puede variar del 1 al 90% y alcanza su máximo en los polluelos de 6 a 12 semanas de edad.
[0043] El pneumovirus aviar se transmite por el contacto. La secreción nasal, el movimiento de las aves afectadas, el agua contaminada, el equipo contaminado, los camiones que transportan el alimento contaminados y las actividades de descarga pueden contribuir a la transmisión del virus. Se cree que los pavos recuperados son portadores. Puesto que el virus ha mostrado influir en el epitelio del oviducto de pavos ponedores y puesto que se ha detectado el PVA en aves jóvenes, la transmisión por el huevo se considera una posibilidad.
[0044] Basándonos en los trabajos recientes sobre el MPVh, el MPVh parece del mismo modo un factor significativo en las enfermedades respiratorias humanas, especialmente en las juveniles.
[0045] De este modo, estos tres virus, VSR, MPVh, y PIV, causan una parte significativa de las enfermedades respiratorias humanas. Por lo tanto, es necesaria una terapia de amplio espectro para reducir la incidencia de las enfermedades respiratorias virales causadas por estos virus.
2.3.2 Infecciones respiratorias bacterianas 2.3.2.1 Neumonía bacteriana
[0046] Se dan aproximadamente 2 millones de casos de neumonía al año, de los cuales de 40.000 a 70.000 ocasionan la muerte. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17º ed. 1999). Aunque determinados virus y hongos pueden causar neumonía, la mayoría de los casos de neumonía en adultos son provocados por bacterias como Streptococcus pneumonia, Staphylococcus, aureus, Haemophilus influenzae, Chlmayda pneumoniae, C. psittaci, C. trachomatis, Moraxella (Branhamella) catarrhalis, Legionella pneumophila, Klebsiella penumoniae, y otros bacilos gramnegativos. Id.
[0047] La neumonía se extiende normalmente mediante la inhalación de gotitas lo suficientemente pequeñas como para alcanzar los alveolos y aspirando secreciones de las vías respiratorias superiores. Id. Las personas alcohólicas, las personas institucionalizadas, los fumadores de tabaco, los pacientes con insuficiencia cardiaca, los pacientes con enfermedad obstructiva de las vías respiratorias crónicas, los ancianos, los niños, los bebés, los bebés nacidos de forma prematura, los pacientes con sistema inmune comprometido, y los pacientes con disfagia corren mayor riesgo de desarrollar neumonía. Id.
[0048] La neumonía se diagnostica basándose en los síntomas característicos y un infiltrado en una radiografía de tórax. Id. Los síntomas comunes de la neumonía incluyen tos, fiebre, producción de esputo, taquipnea, y crepitaciones con sonidos respiratorios bronquiales. Id. La determinación de un patógeno específico que cause la neumonía no puede realizarse en aproximadamente el 30-50% de los pacientes y los especímenes pueden inducir a error debido a que la flora normal puede contaminar las muestras a través de las vías respiratorias superiores. Id. Se pueden utilizar técnicas de cultivo especiales, tintes especiales, ensayos serológicos, o biopsias pulmonares para el diagnóstico. Id.
[0049] Las terapias para el tratamiento de la neumonía constan de apoyo respiratorio, como oxígeno, y antibióticos basados en la determinación de bacterias específicas y/o según la edad del paciente, epidemiología, factores de riesgo del huésped y gravedad de la enfermedad. Id. Por ejemplo, en casos de neumonía estafilocócica, la terapia antibacteriana comprende la administración de penicilina (p.ej., oxacilina y nafcilina) o cefalosporina (p.ej., cefalotina
o cefamandol, cefazolina, y cefuroxima). Id. En casos de neumonía estreptocócica, la terapia antibacteriana comprende la administración de penicilina, cefalosporinas, eritromicina o clindamicina. Id.
[0050] La administración de antibióticos puede provocar efectos secundarios, toxicidad, y desarrollo de cepas resistentes al antibiótico. Además, debido a que resulta difícil diagnósticar el patógeno que causa la neumonía, el uso de antibióticos puede ser ineficaz ya que tanto los virus como los hongos pueden causar también neumonía. Por ello, se desea lograr nuevas terapias para la neumonía.
2.3.2.2 Tuberculosis
[0051] La Mycobacterium tuberculosis infecta a 1,9 mil millones de personas y la enfermedad activa, la tuberculosis (“TB”) causa 1,9 millones de muertes en todo el mundo cada año. (Dye et al., 1999, JAMA 282:677-686). Tras un siglo de constante descenso de la tasa de casos de TB en los Estados Unidos, la tendencia a la baja invirtió el sentido a finales de los 80’ como resultado de la aparición de la cepa multirresistente de M. tuberculosis, la epidemia de VIH, y la afluencia de inmigrantes. (Navin et al., 2002, Emerg. Infect. Dis. 8:11).
[0052] La M. tuberculosis es una bacteria en forma de vara inmóvil, aeróbica y obligada. En los casos clásicos de tuberculosis, los complejos de M. tuberculosis se encuentran en los lóbulos superiores bien aireados de los pulmones. Las M. tuberculosis se clasifican como bacterias acidorresistentes debido a la impermeabilidad de la pared celular por determinados colorantes y tintes. La pared celular de la M. tuberculosis, compuesta por peptidoglicano y lípidos complejos, es la responsable de la resistencia de la bacteria a muchos antibióticos, compuestos ácidos y alcalinos, lisis osmótica, y oxidaciones letales y la supervivencia en el interior de macrófagos.
[0053] La TB avanza en cinco fases. En la primera fase, el sujeto inhala núcleos de gotitas que contienen menos de tres bacilos. Aunque los macrófagos alveolares absorben la M. tuberculosis, los macrófagos no están activados y no destruyen la bacteria. De siete a 21 días tras la infección inicial, la M. tuberculosis se multiplica dentro de los macrófagos hasta que los macrófagos se desintegran, lo que atrae a más macrófagos al lugar de la infección que fagocitan la M. tuberculosis, pero no se activan y, por ello, no destruyen la M. tuberculosis. En la fase 3, los linfocitos, especialmente las células T, están activadas y se producen citocinas, incluyendo macrófagos activados por interferones (IFN) capaces de destruir la M. tuberculosis. En esta fase, el paciente es tuberculino-positivo y se inicia una respuesta inmune celular, que incluye macrófagos activados que liberan enzimas líticas y células T que segregan citocinas. Aunque algunos macrófagos se activan frente a la M. tuberculosis, las bacterias continúan multiplicándose dentro de los macrófagos inactivados y comienzan a crecer tubérculos que se caracterizan por los centros semisólidos. En la fase 4, los tubérculos pueden invadir el bronquio, otras partes del pulmón y las vías de suministro de sangre y el paciente puede presentar lesiones secundarias en otras partes del cuerpo, incluyendo el sistema genitourinario, huesos, articulaciones, ganglios linfáticos y peritoneo. En la fase final, los tubérculos se licuan induciendo un aumento en el crecimiento de M. tuberculosis. La alta carga bacteriana hace que las paredes de los bronquios cercanos se rompan y formen cavidades que permiten que la infección se extienda rápidamente a otras partes del pulmón.
[0054] Las terapias actuales disponibles para la TB comprenden un régimen inicial de dos meses de múltiples antibióticos, como rifampicina, isoniazida, piranzinamida, etambutol o estreptomicina. En los cuatro meses siguientes, solo se administra rifampicina e isoniazida para destruir la M. tuberculosis persistente. Aunque una prescripción adecuada y el cumplimiento del paciente resultan en la cura en la mayoría de los casos, el número de muertes por TB ha aumentado como resultado de la aparición de nuevas cepas de M. tuberculosis resistentes a las terapias de antibióticos actuales. (Rattan et al., 1998, Emerging Infectious Diseases, 4(2):195-206). Además, se han asociado lesiones del hígado graves o mortales al tratamiento de TB latente con rifampicina y piranzinamida (CDC Morbidity and Mortality Weekly Report, 51 (44):998-999).
2.3.3 Infecciones respiratorias fúngicas
[0055] El número de infecciones fúngicas invasivas sistémicas aumentó bruscamente en la pasada década debido al aumento de población de pacientes de riesgo como resultado de trasplantes de órganos, oncología, el virus de la inmunodeficiencia humana, el uso de catéteres vasculares, y el mal uso de los antibióticos de amplio espectro. Dodds et al., 2000 Pharmacotherapy 20(11):1335-1355. El setenta por ciento de las muertes por infecciones fúngicas son causadas por la especie Candida, especie Aspergillus, y Cryptococcus neoformans. Yasuda, California Journal of Health-System Pharmacy, mayo/junio 2001, pp. 4-11.
2.3.3.1 Candidiasis sistémica
[0056] El 80% de todas las infecciones fúngicas sistémicas importantes se debe a la especie Candida. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17 ed., 1999. La candidiasis invasiva es causada muy a menudo por Candida albicans, Candida troicalis, y Candida glabrata en pacientes inmunodeprimidos. Id. La candidiasis es una infección oportunista propia del SIDA, que infecta el esófago, la tráquea, el bronquio, y los pulmones. Id. En los pacientes infectados con VIH, la candidiasis es normalmente mucocutánea e infecta la orofaringe, el esófago, y la vagina. Ampel, abril-junio 1996, Emerg. Infect. Dis. 2(2): 109-116.
[0057] Las especies de Candida son comensales que colonizan el tracto gastrointestinal normal y la piel. The Merk Manual of Diagnosis and Therapy, Berwok et al. (eds.), 17º ed., 1999. Por ello, los cultivos de Candidia del esputo, la boca, la orina, las heces, la vagina o la piel no indican necesariamente una infección progresiva e invasiva. Id. En la mayoría de los casos, el diagnóstico de la candidiasis exige la presentación de una lesión clínica característica, la documentación de evidencias histopatológicas de invasión del tejido, o de exclusión de otras causas. Id. Los síntomas de la infección de candidiasis sistémica del tracto respiratorio son normalmente no específicos, incluyendo disfagia, tos y fiebre. Id.
[0058] Todas las formas de candidiasis se consideran graves, progresivas y potencialmente fatales. Id. Las terapias para el tratamiento de la candidiasis incluyen normalmente la administración de los agentes antifúngicos anfotericina B y flucitosina. Id. Desafortunadamente, se ha asociado la insuficiencia renal aguda a la terapia de anfotericina B. Dodds., supra. El fluconazol no es tan eficaz como la anfotericina B en el tratamiento de determinadas especies de Candida, pero es útil como terapia inicial en altas dosis orales o intravenosas mientras está pendiente la identificación de la especie. The Merk Manual of Diagnoses and Therapy, 17 ed., 1999. Sin embargo, el fluconazol ha llevado a un aumento en el fracaso del tratamiento y en la resistencia antifúngica. Ampel, supra. Por ello, existe una necesidad de nuevas terapias para el tratamiento de la candidiasis sistémica.
2.3.3.2 Apergilosis
[0059] El Aspergillus incluye 132 especies y 18 variantes entre los que el Aspergillus fumigatus participa en el 80% de las enfermedades relacionadas con el Aspergillus. Krup et al., 1999, Medscape General Medicine 1 (3). El Aspergillus fumigatus es la causa más común de la aspergilosis pulmonar invasiva que se extiende rápidamente, provocando insuficiencia respiratoria progresiva, y fatal en última instancia. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17 ed., 1999. Los pacientes que se someten a una terapia de corticosteroides de altas dosis a largo plazo, pacientes de trasplantes de órganos, pacientes con trastornos hereditarios de la función de los neutrófilos, y pacientes infectados de SIDA corren riesgo de sufrir aspergilosis.
[0060] Las manifestaciones clínicas de infección pulmonar invasiva por Aspergillus incluyen la fiebre, tos, y dolor en el pecho. El Aspergillus coloniza las lesiones pulmonares de las cavidades preexistentes en forma de aspergiloma (bola fúngica) que está compuesto por hifas de masas enredadas, exudado de fibrina, y células inflamatorias encapsuladas por tejido fibroso. Id. Los aspergilomas normalmente se forman y aumentan en las cavidades pulmonares causadas originalmente por bronquiectasia, neoplasia, TB, y otras infecciones pulmonares crónicas. Id. La mayoría de aspergilomas no responden a o exigen una terapia antifúngica sistémica. Id. Sin embargo, las infecciones invasivas a menudo avanzan rápidamente y son fatales, de forma que se necesita una terapia agresiva que comprende anfotericina B (IV) o itraconazol oral. Desafortunadamente, una alta dosis de anfotericina B puede causar insuficiencia renal y el itraconazol es eficaz solo es casos moderadamente graves. Id. Por lo tanto, son necesarias nuevas terapias para el tratamiento de la aspergilosis.
2.3.3.3 Criptococosis
[0061] Los casos de criptococosis eran raros antes de la epidemia de VIH. Ampel, supra. Los pacientes de SIDA, pacientes con enfermedad de Hodgkin u otros linfomas o sarcoidosis, y los pacientes sometidos a una terapia de corticosteroides a largo plazo corren un riesgo más alto de sufrir criptococosis. The Merk Manual of Diagnosis and Therapy, 17 ed. 1999. En la mayoría de los casos, las infecciones criptocócicas son autolimitadas, pero la infección criptocócica asociada al SIDA puede presentarse en forma de una neumonía prograsiva y grave con disnea aguda y lesiones primarias en los pulmones. Id. En los casos de criptococosis diseminada progresiva que afecta a pacientes inmunocomprometidos, la meningitis crónica es la más común sin lesiones pulmonares clínicamente evidentes. Id.
[0062] Los pacientes inmunocompetentes no siempre necesitan la administración de una terapia para tratar la criptococosis pulmonar localizada. Sin embargo, cuando a tales pacientes se les administra una terapia para el tratamiento de criptococosis pulmonar localizada, normalmente consta de la administración de anfotericina B con o sin flucitosina. Id. A los pacientes de SIDA generalmente se les administra una terapia inicial que consta de anfotericina B y flucitosina y después fluconazol oral a partir de entonces para tratar la criptococosis. Id. La función renal y hematológica de todos los pacientes que reciben anfotericina B con o sin flucitosina debe ser evaluada antes y durante la terapia, ya que los niveles de flucitosina en sangre deben monitorizarse para limitar la toxicidad, y la administración de flucitosina puede no ser segura para pacientes con una insuficiencia renal preexistente o disfunción de la médula ósea. Id. Por tanto, se necesitan nuevas terapias para el tratamiento de la criptococosis.
2.4 INTERLEUCINA-9
[0063] La interleucina-9 (“IL-9”) juega un papel crítico en el número de respuestas inducidas por antígenos en ratones, como la hipersensibilidad bronquial, producción epitelial de mucinas, eosinofilia, aumento de células T, células B, mastocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, y otros recuentos de células inflamatorias en el lavado bronquial, cambios histológicos en el pulmón asociados a la inflamación, y aumento de IgE total en suero. Véase Levitt et al., patente estadounidense nº 6.261.559. La similitud estructural observada en los genes de la IL-9 humanos y murinos sugiere que la IL-9 humana tiene un papel significativo en la facilitación de la respuesta inmune asmática. La IL-9 es expresada por células T activadas y mastocitos y funciona como un factor de crecimiento de la célula T, media el crecimiento de los progenitores eritroides, células B, mastocitos, eosinófilos, y timocitos fetales, actúa de forma sinérgica con la interleucina-3 (“IL-3”) para inducir la activación y proliferación de mastocitos, y fomenta la producción de mucina por el epitelio pulmonar. La administración de anticuerpos murinos a sujetos humanos se asocia con numerosos inconvenientes. Por ello, los anticuerpos que tienen una baja inmunogenicidad y una alta afinidad con la IL-9 humana serían útiles para tratar a pacientes humanos que padezcan enfermedades asociadas a la expresión y/o actividad de la IL-9 como el asma. Gruss et al., Cancer Research, 15 Feb 1992, vol 52, nº 4, páginas 1026-1031 revela un anticuerpo monoclonal murino anti-IL-9 humana inhibitorio.
[0064] La mención o discusión de una referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admisión de que la misma es técnica precedente a la presente invención.
3. RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0065] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de interleucina-9 (“IL-9”) (preferiblemente un polipéptido de IL-9 humana).En particular, la invención proporciona un anticuerpo como se define en la reivindicación 1.
[0066] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos un dominio variable de la cadena pesada o dominio variable pesado (“VH”) que tiene una secuencia de aminoácidos del dominio VH de SEQ ID No:27. La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos un dominio variable de la cadena ligera o dominio variable ligero (“VL”) que tiene una secuencia de aminoácidos del dominio VL de SEQ ID No: 28. La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos un dominio VH y un dominio VL que tienen una secuencia de aminoácidos de los dominios VH y VL de SEQ ID No:27 y 28.
[0067] La presente invención proporciona mezclas de anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, en el que la mezcla comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más anticuerpos diferentes de la invención. La presente invención proporciona también paneles de anticuerpos que se unen de manera inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, en el que el panel tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más anticuerpos diferentes de la invención. En especial, la invención proporciona paneles de diferentes anticuerpos que se unen de forma inmuno específica a un polipéptido de IL-9 en el medio (a saber, no unidos al IL-9R o una subunidad del mismo), la forma unida al receptor de un polipéptido de IL-9, y/o ambos la forma unida al receptor de un polipéptido de IL-9 y un polipéptido de IL-9 en el medio. En modos de realización específicos, la invención proporciona paneles de anticuerpos que tienen distintas afinidades con un polipéptido de IL-9, distintas especificidades para un polipéptido de IL-9, o distinto índice de disociación. La invención proporciona paneles de al menos 10, preferiblemente al menos 25, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, al menos 500, al menos 550, al menos 600, al menos 650, al menos 700, al menos 750, al menos 800, al menos 850, al menos 900, al menos 950, o al menos 100 anticuerpos. Los paneles de anticuerpos pueden usarse, por ejemplo, en placas de 96 pocillos para ensayos como los ELISAs.
[0068] En un modo de realización preferido, los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanos o humanizados. En otro modo de realización, los anticuerpos de la invención están conjugados a un agente terapéutico o sustancia detectable. En un modo de realización alternativo, los anticuerpos de la invención no están conjugados a una sustancia detectable o un agente terapéutico.
[0069] La presente invención engloba usos que proporcionan un mejor perfil profiláctico o terapéutico que las terapias de un solo agente actuales o las combinaciones de terapias para enfermedades o trastornos asociados a o caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, enfermedades o trastornos asociados a o caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-9 (“IL-9R”) o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria o uno o más síntomas de la misma. En particular, la invención proporciona usos profilácticos y terapéuticos para la prevención, tratamiento, control, y/o mejora de las enfermedades o trastornos caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, enfermedades o trastornos caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria o uno o más síntomas de la misma, que comprende la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención. La invención también proporciona usos profilácticos y terapéuticos para la prevención, tratamiento, control, y/o mejora de las enfermedades o trastornos caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, enfermedades o trastornos caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, y una enfermedad inflamatoria o uno o más síntomas de la misma, que comprende la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención y una cantidad efectiva de al menos una terapia (p.ej., un agente profiláctico o terapéutico) distinta de los anticuerpos de la invención.
[0070] En un modo de realización, la invención proporciona usos para prevenir, tratar, controlar, y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de IL-9 de la invención solos o en combinación con una cantidad eficaz de una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos), distintos de los anticuerpos de la invención, utilizados o que se sepa que son eficaces en la prevención, tratamiento, control, y/o mejora de trastornos inflamatorios. En un modo de realización específico, el trastorno inflamatorio es asma, una alergia, artritis, o trastorno caracterizado por una inflamación mediada de tipo 2. Los ejemplos no limitativos de terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) para la prevención, tratamiento, control, y/o mejora de un trastorno inflamatorio incluyen los agentes antivirales, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, antagonistas del TNF-α, agentes inmunomoduladores, moduladores de mastocitos y agentes antiinflamatorios. En un modo de realización preferido, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la presente invención en combinación con una cantidad efectiva de VITAXIN , siplizumab, uno o más anticuerpos anti-EphA2, o cualquier combinación de los mismos para prevenir, controlar, tratar, y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas de los mismos. [0071] La presente invención proporciona un método in vitro de diagnóstico, pronóstico, o monitorización de una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria que comprende evaluar el nivel de IL-9 en las células o una muestra de tejido de un sujeto utilizando un anticuerpo de IL-9 de la invención y comparar el nivel evaluado de IL-9 con un nivel de control (p.ej., solución salina tamponada con fosfato (PBS)). Un aumento o disminución en el nivel evaluado de IL-9 en comparación con el nivel de control de IL-9 es indicativo de una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas, kits y artículos de fabricación que comprenden uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 con o sin una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos), distintos a los anticuerpos de la invención, para su uso en la prevención, tratamiento, control, y/o mejora de una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, un enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria), o uno o más síntomas de las mismas. Los kits o artículos de fabricación pueden comprender además instrucciones.
3.1 TERMINOLOGÍA
[0072] Según su uso aquí, el término “aberrante” hace referencia a una desviación de la normal, p.ej., el sujeto sano medio y/o una población de sujetos sanos medios. El término “expresión aberrante”, según su uso aquí, hace
referencia a la expresión anormal de un producto genético (p.ej., ARN, proteína, polipéptido o péptido) por una célula
o sujeto en comparación con una célula normal y sana o un sujeto y/o población de células o sujetos sanos y normales. Dicha expresión aberrante puede ser el resultado de la amplificación del gen. En un modo de realización específico, el término “expresión aberrante” se refiere a la expresión anormal de IL-9 y/o un IL-9R o subunidad del mismo por una célula o sujetos en comparación con la expresión del producto genético por una célula o un sujeto normal sano y/o una población de células o sujetos sanos y normales y engloba la expresión de un producto genético de IL-9 y/o de IL-9R o subunidad del mismo en una ubicación inusual en la célula o sujeto, la expresión de un producto genético de IL-9 y/o de IL-9R o subunidad del mismo a un nivel alterado en la célula o sujeto, la expresión de un producto genético mutado de IL-9 y/o de IL-9R o subunidad del mismo, o una combinación de los mismos. El término “actividad aberrante”, según su uso aquí, hace referencia a un nivel alterado de un producto genético, el aumento de una actividad por un producto genético, o la pérdida de una actividad de un producto genético en una célula o sujeto en comparación con una célula o sujeto sano y normal y/o una población de células
o sujetos sanos y normales. En modos de realización específicos, el término “actividad aberrante” hace referencia a una actividad de IL-9 y/o de IL-9R o subunidad del mismo que se desvía de lo encontrado normalmente en una célula o sujeto sano y/o un población de células o sujetos normales sanos (p.ej., un aumento en la capacidad de la IL-9 de unirse a su receptor). Los ejemplos de actividades de la IL-9 incluyen, sin carácter limitativo, la fosforilación del IL-9R, la activación de Jak-3, la activación de MEK, la activación de Stat-1, y la activación de Stat-3.
[0073] Según su uso aquí, el término “análogo” en el contexto de un agente proteínico (p.ej., proteínas, polipéptidos, péptidos y anticuerpos) hace referencia a un agente proteínico que posee funciones similares o idénticas a las funciones de un segundo agente proteínico, pero no comprende necesariamente una secuencia de aminoácidos similar o idéntica del segundo agente proteínico, o posee una estructura similar o idéntica a la del segundo agente proteínico. Un agente proteínico que tiene una secuencia de aminoácidos similar hace referencia a un segundo agente proteínico que satisface al menos una de las siguientes opciones: (a) un agente proteínico que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99% a la secuencia de aminoácidos del segundo agente proteínico; (b) un agente proteínico codificado por una secuencia de nucleótidos que hibridiza en condiciones rigurosas con una secuencia de nuecleótidos que codifica un segundo agente proteínico de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos; y (c) un agente proteínico codificado por una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99% a la secuencia de nucleótidos que codifica un segundo agente proteínico. Un agente proteínico con estructura similar a un segundo agente proteínico se refiere a un agente proteínico que tiene una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria similar al segundo agente proteínico. La estructura de un agente proteínico puede determinarse por métodos conocidos por aquellos con habilidad en la técnica, incluyendo, sin carácter limitativo, secuenciación de péptidos, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear, dicroísmo circular y microscopía electrónica cristalográfica.
[0074] Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucléicos, se alinean las secuencias para fines de comparación óptimos (p.ej., se pueden introducir espacios en la secuencia de un primer aminoácido o en la secuencia de ácido nucléico para un alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácido o ácido nucléico). Después, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. La identidad porcentual entre dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % identidad = número de posiciones coincidentes idénticas / número total de posiciones x 100%). En un modo de realización, las dos secuencias tienen la misma longitud.
[0075] La determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede lograrse también utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. La búsqueda de nucleótidos BLAST puede llevarse a cabo con los parámetros del programa de nucleótidos de NBLAST establecidos, p.ej., para puntuación=100, longitud de palabra=12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden llevarse a cabo con los parámetros del programa XBLAST fijados, p.ej., para puntuación=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de la presente invención. Para obtener alineamientos con espacios para fines comparativos, puede utilizarse el programa Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. De forma alternativa, puede usarse PSI-BLAST para llevar a cabo una búsqueda repetida que detecta relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (p.ej., de XBLAST y NBLAST) (véase, p.ej., la página web del NCBI (Centro Nacional para la Información Biotecnológica)). Otro ejemplo preferido no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de software para el alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12, y una penalización por hueco de 4.
[0076] La identidad porcentual entre dos secuencias puede determinarse utilizando técnicas similares a aquellas descritas arriba, permitiendo huecos o sin ellos. Al calcular las identidades porcentuales, normalmente se cuentan solo las coincidencias exactas.
[0077] Según su uso aquí, el término “análogo” en el contexto de un análogo no proteínico hace referencia a una segunda molécula orgánica o inorgánica que posee una función similar o idéntica a una primera molécula orgánica o inorgánica y es estructuralmente similar a la primera molécula orgánica o inorgánica.
[0078] Según su uso aquí, los términos “antagonista” y “antagonistas” hacen referencia a cualquier proteína,
polipéptido, péptido, peptidomimético, glicoproteína, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, carbohidrato, ácido nucleico, molécula orgánica, molécula inorgánica, molécula grande, o molécula pequeña que bloquea, inhibe, reduce
o neutraliza la función, actividad y/o expresión de otra molécula. En diversos modos de realización, un antagonista reduce la función, actividad y/o expresión de otra molécula en al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99% en comparación con un control como una solución salina tamponada con fosfato (PBS).
[0079] Según su uso aquí, los términos “anticuerpo” y “anticuerpos” hacen referencia a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camélidos, anticuerpos quiméricos, Fvs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), Fvs unidos por un puente disulfuro (sdFv), y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo, p.ej., anticuerpos anti-Id de anticuerpos de la invención), intracuerpos, y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen las moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un lugar de unión al antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (p.ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p.ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
[0080] Según su uso aquí, los términos “anticuerpos anti-IL 9”, “anticuerpos de IL-9”, “anticuerpos de la invención”, “anticuerpos de la presente invención” y términos análogos hacen referencia a los anticuerpos descritos en la sección 5.1.
[0081] Según su uso aquí, el término “anticuerpo IgG de control” se refiere a un anticuerpo de IgG u otro “anticuerpo de control” que no se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y preferiblemente no presenta reacción cruzada con un polipéptido de IL-9.
[0082] Según su uso aquí, el término “modulador de receptores de citocinas” hace referencia a un agente que
modula la fosforilación de un receptor de citocinas, la activación de una vía de transducción de señal asociada a un receptor de citocina, y/o la expresión de una proteína específica como una citocina o un receptor de citocina. Dicho agente puede modular directa o indirectamente la fosforilación de un receptor de citocina, la activación de una vía de transducción de señal asociada a un receptor de citocina, y/o la expresión de una proteína específica como una citocina. Por tanto, los ejemplos de moduladores de receptores de citocinas incluyen, sin carácter limitativo, citocinas, fragmentos de citocinas, proteínas de fusión, y anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un receptor de citocina o un fragmento del mismo. Además, los ejemplos de moduladores de receptores de citocinas incluyen, sin carácter limitativo, péptidos, polipéptidos (p.ej. receptores de citocina solubles), proteínas de fusión y anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a una citocina o un fragmento de la misma.
[0083] Según su uso aquí, el término “derivado” en el contexto del agente proteínico (p.ej., proteínas, polipéptidos, péptidos y anticuerpos) hace referencia a un agente proteínico que comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido alterada por la introducción de sustituciones, deleciones y/o adiciones de residuos de aminoácidos. El
término “derivado” según su uso aquí se refiere también a un agente proteínico que ha sido modificado, es decir,
por la unión covalente de cualquier tipo de molécula a un agente proteínico. Por ejemplo, sin carácter limitativo, un anticuerpo puede ser modificado, p.ej., mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos de bloqueo/protectores conocidos, segmentación proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Un derivado de un agente proteínico puede producirse mediante modificaciones químicas utilizando técnicas conocidas por aquellos con habilidad en la técnica, incluyendo, sin carácter limitativo, la segmentación química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un derivado de un agente proteínico puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Un derivado de un agente proteínico posee una función similar o idéntica al agente proteínico del que fue derivado.
[0084] Según su uso aquí, los términos “trastorno” y “enfermedad” se usan de forma intercambiable para hacer referencia a una afección en un sujeto. El término “enfermedad inflamatoria” se usa de forma intercambiable con el término “trastorno inflamatorio” para hacer referencia a una afección en un sujeto caracterizada por la inflamación, preferiblemente inflamación crónica. Los trastornos autoinmunes pueden estar asociados a la inflamación o pueden no estarlo. Además, la inflamación puede o no estar causada por un trastorno autoinmune. Determinadas afecciones puede caracterizarse como más de un trastorno. Por ejemplo, determinadas afecciones pueden caracterizarse como trastornos autoinmunes y también como trastornos inflamatorios.
[0085] Según su uso aquí, el término “cantidad efectiva” hace referencia a la cantidad de una terapia (p.ej., un agente profiláctico o terapéutico) que es suficiente para reducir y/o mejorar la gravedad y/o duración de una enfermedad o trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma), prevenir el avance de dicha enfermedad o trastorno, provocar la regresión de dicha enfermedad o trastorno, prevenir la repetición, desarrollo o aparición de uno o más síntomas asociados a dicha enfermedad o trastorno, o mejorar o aumentar el efecto o efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia (p.ej., agente profiláctico o terapéutico).
[0086] Según su uso aquí, el término “epítopos” se refiere a fragmentos de un polipéptido o proteína que tienen actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferiblemente en un mamífero, y más preferiblemente en un ser humano. Un epítopo que presenta actividad inmunogénica es un fragmento de un polipéptido o proteína que provoca una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es un fragmento de un polipéptido o proteína al que se une de forma inmunoespecífica un anticuerpo según determina cualquier método conocido por las personas con habilidad en la técnica, por ejemplo mediante inmunoensayos. Los epítopos antigénicos no tienen que ser necesariamente inmunogénicos.
[0087] Según su uso aquí, el término “fragmento” hace referencia a una proteína o polipéptido que conserva al
menos una función de la proteína o polipéptido. En otro modo de realización, un fragmento de un polipéptido o proteína conserva al menos dos, tres, cuatro, o cinco funciones del polipéptido o proteína. Preferiblemente, un fragmento de un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 conserva la capacidad de unirse de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9.
[0088] Según su uso aquí, el término “proteína de fusión” hace referencia a un polipéptido o proteína que comprende
una secuencia de aminoácidos de un primer polipéptido o proteína o fragmento, análogo o derivado del mismo, y una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o proteína heterólogo (es decir, un segundo polipéptido, o proteína
o fragmento, análogo o derivado del mismo, distinto del primer polipéptido o proteína o fragmento, análogo o derivado del mismo). En un modo de realización, una proteína de fusión comprende un agente profiláctico o terapéutico fusionado a una proteína, polipéptido o péptido heterólogo. Según este modo de realización, la proteína, polipéptido o péptido heterólogo puede ser un tipo diferente de agente profiláctico o terapéutico, o puede no serlo. Por ejemplo, se pueden fusionar dos proteínas, polipéptidos o péptidos diferentes con actividad inmunomoduladora para formar una proteína de fusión. En un modo de realización preferido, las proteínas de fusión conservan o han mejorado la actividad en relación con la actividad del polipéptido o proteína original antes de ser fusionado a una proteína, polipéptido, o péptido heterólogo.
[0089] Según su uso aquí, el término “célula huésped” incluye una célula de un sujeto concreto transfectada o transformada con una molécula de ácido nucleico y la progenie o progenie potencial de dicha célula. La progenie de dicha célula puede no ser idéntica a la célula madre transfectada con la molécula de ácido nucleico debido a mutaciones o influencias ambientales que puedan ocurrir en generaciones futuras o la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula huésped.
[0090] Según su uso aquí, el término “ser humano adulto” o “adulto” hace referencia a un ser humano de 18 años o más.
[0091] Según su uso aquí, los términos “ser humano niño” o “niño” o variaciones de los mismos hacen referencia a
un ser humano de entre 24 meses y 18 años de edad.
[0092] Según su uso aquí, los términos “ser humano anciano”, “ancianos”, o variaciones de los mismos hacen referencia a un ser humano de 65 años o más, preferiblemente de 70 años o más.
[0093] Según su uso aquí, los términos “ser humano bebé” o “bebé” o variaciones de los mismos hacen referencia a un ser humano de menos de 24 meses de edad, preferiblemente menos de 12 meses, menos de 6 meses, menos de 3 meses, menos de 2 meses, o menos de 1 mes de edad.
[0094] Según su uso aquí, los términos “ser humano bebé nacido de forma prematura”, “bebé pretérmino”, o “bebé prematuro”, o variaciones de los mismos hacen referencia a un ser humano nacido con menos de 40 semanas de edad gestacional, preferiblemente menos de 35 semanas de edad gestacional, que tiene menos de 6 meses de edad, preferiblemente menos de 3 meses, más preferiblemente menos de 2 meses, y más preferiblemente menos de 1 mes.
[0095] Según su uso aquí, el término “hibridiza en condiciones rigurosas” describe las condiciones de hibridación y
lavado en las que las secuencias de nucleótidos que son al menos un 30% (preferiblemente, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idénticas entre ellas normalmente permanecen hibridizadas las unas con las otras. Dichas condiciones rigurosas son conocidas por aquellos con experiencia en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1
6.3.6.
[0096] Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente de 5 a 10 ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definida. La Tm es la temperatura (en condiciones de fuerza iónica, pH y concentración nucleica definidos) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana hibridizan con la secuencia diana en equilibrio (puesto que se hay secuencias diana presentes en exceso, a la Tm, el 50% de las sondas son ocupadas en equilibrio). Las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es menor de aproximadamente 1,0 M de ión sodio, normalmente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de concentración de ión sodio (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos 60 ºC para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas pueden lograrse también con la adición de agentes desestabilizadores, por ejemplo, formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces la hibridación de base, preferiblemente 10 veces la hibridación de base.
[0097] En un ejemplo no limitativo, las condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en cloruro de sodio/citrato de socio (SSC) 6X a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,1X, SDS 0,2% a aproximadamente 68 ºC. En un ejemplo preferido no limitativo, las condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS 0,1% a 50-65 ºC (es decir, uno o más lavados a 50 ºC, 55ºC, 60ºC o 65ºC). Se entiende que los ácidos nucleicos de la invención no incluyen moléculas de ácido nucleico que hibridizan en estas condiciones exclusivamente con una secuencia de nucleótidos que consta solo de nucleótidos A o T.
[0098] Según su uso aquí, el término “polipéptido de IL-9” se refiere a IL-9, un análogo, derivado o un fragmento de la misma, incluyendo formas maduras e inmaduras de la IL-9 (véase, Van Snick et al., 1989, J Exp. Med. 169:363-68 y Yang et al., 1989, Blood 74:1880-84, o una proteína de fusión que comprende IL-9, un análogo, derivado o un fragmento de la misma. El polipéptido de IL-9 puede ser de cualquier especie. Las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de polipéptidos de IL-9 pueden encontrarse en la literatura o bases de datos públicas, o pueden determinarse las secuencias de nuecleótidos y/o aminoácidos utilizando técnicas de clonación y secuenciación conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de IL-9 humana puede encontrarse en la base de datos GenBank (véase, p.ej., Nº de registro NM_000590; FIG. 12). La secuencia de aminoácidos de la IL-9 humana puede encontrarse en la base de datos GenBank (véase, p.ej., nº de registro A60480, NP_000584 y AAC17735; FIG. 13). En un modo de realización preferido, el polipéptido de IL-9 es IL-9 humana, un análogo, derivado o un fragmento de la misma.
[0099] Según su uso aquí, los términos “receptor de IL-9” e “IL-9R” hacen referencia a un receptor de IL-9 o un análogo, derivado, o fragmento del mismo, o una proteína de fusión que comprende un receptor de IL-9, un análogo,
derivado, o un fragmento del mismo. Según su uso aquí, los términos “una o más subunidades” y “una subunidad” en el contexto de un IL-9R hacen referencia a la subunidad alfa ligando-específica del IL-9R (“IL-9Rα”) y/o la cadena γc común (también presente en complejos de IL-2R, IL-4R, IL-7R e IL-15R) del IL-9R funcional o un análogo, derivado o fragmento del mismo. En un modo de realización preferido, un IL-9R funcional actúa de mediador en una respuesta proliferativa en células T tratadas con IL-9 según se determina por cualquier ensayo de proliferación de células conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo de incorporación de [3H]-timidina o un ensayo de hexosaminidasa) (véase, p.ej., Renauld et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5690-94 y Bauer et al., 1998, J Biol. Chem. 273:9255-60). Preferiblemente, tratar una línea celular T que expresa un IL-9R funcional (p.ej., células TS 1 RA3 (R&D Systems) que expresan tanto IL-9Rα humano como murino) con IL-9, resulta en un aumento dependiente de la dosis en la proliferación de células T, medida mediante cualquier ensayo de proliferación celular conocido por aquellos con habilidad en la técnica (véase, Renauld et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5690-94 y Bauer et al., 1998, J Biol. Chem. 273:9255-60). En otro modo de realización preferido, un IL-9R funcional, que comprende las cadenas γc y IL-9Rα, inicia una cascada de señales a través de las cinasas de Jano JAK1 y JAK3, activando así los homodímeros y heterodímeros de los factores del transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) STAT-1, STAT-3 y STAT-5 (véase, Bauer et al., 1998, J Biol. Chem. 273:9255-60). En otro modo de realización preferido, un IL-9R funcional puede evitar la apoptosis en un mecanismo que incluye STAT3 y STAT-5, determinado mediante ensayos de apoptosis conocidos por aquellos con habilidad en la técnica (véase, Bauer et al., 1998, J Biol. Chem. 273:9255-60). El IL-9R o una o más subunidades del mismo puede ser de cualquier especie. Las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos del IL-9R y las subunidades del mismo pueden encontrarse en la literatura o en bases de datos públicas, o pueden determinarse las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos utilizando técnicas de clonación y secuenciación conocidas por las personas con experiencia en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de IL-9R humano puede encontrarse en la base de datos GenBank (véase, p.ej., nº de registro NM_002186, NM_176786 y NM_000206; FIG. 14). La secuencia de aminoácidos de IL-9R humana puede encontrarse en la base de datos GenBank (véase, p.ej., nº d registro NP_002177; NP_789743 y NP_000197; FIG. 15). En un modo de realización preferido, un IL-9R o una o más subunidades del mismo es un IL9R humano o una o más subunidades del mismo, un análogo, derivado o fragmento del mismo.
[0100] Según su uso aquí, el término “agente inmunomodulador” y las variaciones del mismo que incluyen, sin
carácter limitativo, agente inmunomoduladores, inmunomodulantes o fármacos inmunomoduladores, hacen referencia a un agente que modula el sistema inmunitario del huésped. En un modo de realización específico, un agente inmunomodulador es un agente que cambia un aspecto de una respuesta inmune de un sujeto. En determinados modos de realización, un agente inmunomodulador es un agente que inhibe o reduce el sistema inmunitario del sujeto (es decir, un agente inmunosupresor). En otros modos de realización determinados, un agente inmunomodulador es un agente que activa o aumento el sistema inmune del sujeto (es decir, un agente inmunoestimulante). Según la invención, un agente inmunomodulador utilizado en las terapias de combinación de la invención no incluye un anticuerpo de la invención. Los agentes inmunomoduladores incluyen, sin carácter limitativo, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos (p.ej., nucleótidos de ADN y ARN incluyendo, sin carácter limitativo, secuencias de nucleótidos antisentido, hélices triples, ARNi, y secuencias de nucleótidos que codifican proteínas, polipéptidos o péptidos biológicamente activos), anticuerpos, moléculas inorgánicas sintéticas o naturales, agentes miméticos, y moléculas orgánicas naturales o sintéticas.
[0101] Según su uso aquí, el término “se une de forma inmunoespecífica a un antígeno” y términos análogos se
refieren a péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión y anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a un antígeno o un fragmento y no se unen específicamente a otros antígenos. Un péptido, polipéptido, proteína, o anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un antígeno, puede unirse a otros péptidos, polipéptidos o proteínas con afinidad inferior tal y como se determinó por, p.ej., inmunoensayos, BIAcore, u otros ensayos conocidos en la técnica. Los anticuerpos o fragmentos que se unen de forma inmunoespecífica a un antígeno pueden presentar reacción cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos que se unen de forma inmunoespecífica a un antígeno no reaccionan de forma cruzada con otros antígenos. Un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando se une al antígeno con afinidad más alta que a cualquier antígeno de reacción cruzada como se determinó utilizando técnicas experimentales, como el radioinmunoanálisis (RIA) y pruebas de inmunoabsorción enzimática (ELISA, por sus siglas en inglés). Véase, p.ej., Paul, ed. 1989, Fundamental Immunology, 2º ed., Raven Press, New York en páginas 332-336 para un análisis relacionado con la especificidad de los anticuerpos.
[0102] Según su uso aquí, el término “se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9” y términos análogos hacen referencia a péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, y anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a un polipéptido de IL-9 y no se unen específicamente a otros polipéptidos. El término “se une de forma inmunoespecífica a un IL-9R” y términos análogos se refieren a péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, y anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo y no se unen específicamente a otros receptores. Un péptido, polipéptido, proteína, o anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de IL-9 o un IL-9R puede unirse a otros péptidos, polipéptidos, o proteínas con menor afinidad, determinado mediante, p.ej., inmunoensayos, BIAcore, u otros ensayos conocidos en la técnica. Los anticuerpos o fragmentos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 o un IL-9R pueden presentar reacción cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 o un IL-9R del mismo no reaccionan de forma cruzada con otros antígenos. Los anticuerpos o fragmentos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 o un IL-9R pueden identificarse, por ejemplo, mediante inmunoensayo, BIAcore, u otras técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Un anticuerpo o fragmento del mismo se une de forma específica a un polipéptido de IL-9 o un IL-9R cuando se une a un polipéptido de IL-9 o IL-9R con afinidad más alta que a cualquier antígeno con reacción cruzada como se determina utilizando técnicas experimentales, como radioinmunoanálisis (RIAs) y pruebas de inmunoabsorción enzimática (ELISA, por sus siglas en inglés). Véase, p.ej., Paul, ed., 1989. Fundamental Immunology, 2º ed., Raven Press, New York en las páginas 332-336 para un análisis en relación con la especificidad de los anticuerpos. En un modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 no se une o reacciona de forma cruzada con otros antígenos. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 que es una proteína de fusión se une específicamente a la parte de la proteína de fusión que es IL-9.
[0103] Según su uso aquí, el término “en combinación” se refiere al uso de más de una terapia (p.ej., más de un agente profiláctico y/o agente terapéutico). El uso del término “en combinación” no limita el orden en el que se administran las terapias (p.ej., agentes profilácticos y/o terapéuticos) a un sujeto con una enfermedad o trastorno. Una primera terapia (p.ej., un primer agente profiláctico y/o terapéutico) puede administrarse antes de (p.ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), simultáneamente con, o posterior a (p.ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) la administración de una segunda terapia (p.ej., un segundo agente profiláctico o terapéutico) a un sujeto con un trastorno.
[0104] Según su uso aquí, el término “aislado” en el contexto de una molécula orgánica o inorgánica (tanto en una
molécula pequeña como una grande), distinta del agente proteínico o molécula de ácido nucleico, hace referencia a una molécula orgánica o inorgánica sustancialmente libre de una molécula orgánica o inorgánica diferente. Preferiblemente, una molécula orgánica o inorgánica se encuentra libre en un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de una segunda molécula orgánica o inorgánica diferente. En un modo de realización preferido, se aísla una molécula orgánica y/o inorgánica.
[0105] Según su uso aquí, el término “aislado” en el contexto de un agente proteínico (p.ej., un péptido, polipéptido, proteína de fusión o anticuerpo) hace referencia a un agente proteínico que se encuentra sustancialmente libre de material celular o proteínas contaminantes de la fuente celular o del tejido del que se deriva, o se encuentra sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando son sintetizados químicamente. La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de agente proteínico en las que el agente proteínico se separa de los componentes celulares de las células de las que es aislado o producido de forma recombinante. Por tanto, un agente proteínico que se encuentra sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de un agente proteínico que tiene menos de aproximadamente un 30%, 20%, 10% o 5% (en peso
seco) de proteína, polipéptido, péptido, o anticuerpo heterólogo (también denominada “proteína contaminante”).
Cuando el agente proteínico se produce de forma recombinante, también se encuentra preferiblemente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de agente proteínico. Cuando el agente proteínico se produce mediante síntesis química, preferiblemente se encuentra sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas, es decir, se separa de los precursores químicos u otras sustancias químicas que intervienen en la síntesis del agente proteínico. Por consiguiente, dichas preparaciones de agente proteínico tienen menos de aproximadamente un 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos que no sean el agente proteínico de interés. En un modo de realización específico, los agentes proteínicos revelados aquí son aislados. En un modo de realización preferido, un anticuerpo de la invención es aislado. En un modo de realización específico, un anticuerpo “aislado” se purifica mediante un proceso de purificación de varias etapas que comprende tres etapas de cromatografía (intercambio catiónico, cromatografía de proteína A e intercambio aniónico), una etapa de nanofiltración y una etapa de tratamiento a pH bajo (para una descripción detallada, véase la Sección 6, infra).
[0106] Según su uso aquí, el término “aislado” en el contexto de moléculas de ácido nucleico hace referencia a una molécula de ácido nucleico que se separa de otras moléculas de ácido nucléico que se encuentran presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucléico. Además, una molécula de ácido nucléico “aislada”, como una molécula de ADNc, puede encontrarse libre sustancialmente de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o libre sustancialmente de precursores químicos u otras sustancias químicas
cuando son sintetizados químicamente; sin embargo, el término “aislado” excluye a los miembros de una librería de
clones, como una librería de ADNc. En un modo de realización preferido, se aísla una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la invención.
[0107] Según su uso aquí, los términos “controlar”, “controlando” y “control” hacen referencia a los efectos
beneficiosos que obtiene el sujeto de una terapia (p.ej., un agente profiláctico o terapéutico), que no resultan en la cura de la enfermedad. En determinados modos de realización, se administra a un sujeto una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) para “controlar” una enfermedad para prevenir el avance o empeoramiento de la enfermedad.
[0108] Según su uso aquí, el término “modulador de mastocitos” hace referencia a un agente que modula la
activación de un mastocito, degranulación de mastocitos y/o expresión de una proteína particular como una citocina. Dicho agente puede modular directa o indirectamente la activación de un mastocito, degranulación del mastocito, y/o la expresión de una proteína específica como una citocina. Los ejemplos no limitativos de moduladores de mastocitos incluyen, sin carácter limitativo, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos (p.ej., nucleótidos de ADN y ARN incluyendo, sin carácter limitativo, secuencias de nucleótidos antisentido, hélices triples, ARNi, y secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos, péptidos o proteínas biológicamente activos), proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas naturales o sintéticas, moléculas orgánicas naturales o sintéticas, o agentes miméticos que inhiben y/o reducen la expresión, función, y/o actividad de un factor de células madre, una proteasa de mastocito, una citocina (como IL-3, IL-4, e IL-9), un receptor de citocina (como IL-3R, IL-4R, e IL-9R) y una receptor de células madre. Otros ejemplos no limitativos de moduladores de mastocitos incluyen, sin carácter limitativo, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos (p.ej., nucleótidos del ADN y ARN incluyendo, sin carácter limitativo, secuencias de nucleótidos antisentido, hélices triples, ARNi, y secuencias de nucleótidos que codifican proteínas, polipéptidos o péptidos biológicamente activos), proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas sintéticas o naturales, molécula orgánica sintética o natural, o agentes miméticos que inhiben y/o reducen la expresión, función y/o actividad de IgE. En determinados modos de realización, un modulador de mastocitos es un agente que previene o reduce la activación de mastocitos adicionales tras la degranulación de mastocitos. En otros modos de realización, un modulador de mastocitos es un agente que inhibe o reduce la degranulación de mastocitos. Según la invención, un modulador de mastocitos usado en las terapias combinadas de la invención no incluye un anticuerpo de la invención.
[0109] Según su uso aquí, los términos “que no responde” y “resistente” describen pacientes tratados con una terapia disponible actualmente (p.ej., agente profiláctico o terapéutico) para un trastorno, (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) o uno o más síntomas de la misma) que no es clínicamente adecuada para mitigar uno o más síntomas asociados con el trastorno. Normalmente, dichos pacientes padecen enfermedades graves y persistentemente activas y necesitan una terapia adicional para mejorar los síntomas asociados con el trastorno.
[0110] Según su uso aquí, la frase “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno estatal o federal, o recogido en la Farmacopea de Estados Unidos, la Farmacopea Europea, o cualquier otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más concretamente, en seres humanos.
[0111] Según su uso aquí, los términos “prevenir”,” que previene” y “prevención” hacen referencia a la inhibición del desarrollo o aparición de una enfermedad o trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) o uno o más síntomas de la misma) o la prevención de la reaparición, aparición, o desarrollo de uno o más síntomas de dicha enfermedad o dicho trastorno en un sujeto como resultado de la administración de una terapia (p.ej., un agente terapéutico o profiláctico), o la administración de una combinación de terapias (p.ej., una combinación de agentes profilácticos y/o terapéuticos).
[0112] Según su uso aquí, los términos “agente profiláctico” y “agentes profilácticos” hacen referencia a cualquier
agente(s) que puede usarse en la prevención de una enfermedad o trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) o uno o más síntomas de la misma). En determinados modos de realización, el término “agente profiláctico” hace referencia a un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de IL-9. En otros modos de realización determinados, el término “agente profiláctico” se refiere a un agente distinto a un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de IL-9. Preferiblemente, un agente profiláctico es un agente que se sabe que es útil o ha sido utilizado o se utiliza actualmente para prevenir o impedir la aparición, desarrollo, progresión y/o severidad de dicha enfermedad o dicho trastorno. Los agentes profilácticos pueden caracterizarse como diferentes agentes basandonos en uno o más efectos que los agentes tienen in vitro y/o in vivo. Por ejemplo, un modulador de mastocitos puede caracterizarse también como un agente inmunomodulador.
[0113] Según su uso aquí, el término “cantidad profilácticamente efectiva” hace referencia a la cantidad de una
terapia (p.ej., agente profiláctico) que es suficiente para provocar la prevención del desarrollo, reaparición, o aparición de una enfermedad o trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) o uno o más síntomas de las mismas, o mejorar o aumentar el efecto o efectos profilácticos de otra terapia (p.ej., un agente profiláctico).
[0114] Según su uso aquí, un “protocolo profiláctico” hace referencia al régimen de dosificación y el momento de
administración de una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos) que tiene un efecto profiláctico.
[0115] Según su uso aquí, un “protocolo” incluye programas de dosificación y regímenes de dosificación. Los
protocolos aquí son métodos de uso e incluyen protocolos profilácticos y terapéuticos.
[0116] Según su uso aquí, la expresión “efectos secundarios” abarca efectos adversos y no deseados de un agente profiláctico o terapéutico. Los efectos secundarios siempre resultan no deseados, pero los efectos no deseados no son necesariamente adversos. Un efecto adverso de una terapia (p.ej., un agente profiláctico o terapéutico) puede ser perjudicial, molesto, o peligroso.
[0117] Según su uso aquí, el término “pequeñas moléculas” y términos análogos incluyen, sin carácter limitativo,
péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente
1.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ésteres, y otras formas farmacéuticamente aceptables de tales agentes.
[0118] Según su uso aquí, los términos “sujeto” y “paciente” se usan de forma intercambiable. Según su uso aquí, los términos “sujeto” y “sujetos” hacen referencia a un animal, preferiblemente un mamífero que incluye un no
primate (p.ej., una vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata y ratón) y un primate (p.ej., un mono, como un macaco cangrejero, chimpancé, y un ser humano), y más preferiblemente un ser humano. En un modo de realización determinado, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano, con una enfermedad o trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) o uno o más síntomas de los mismos). En otro modo de realización, el sujeto es un animal de granja (p.ej., un caballo, cerdo o vaca) o un animal doméstico (p.ej., un perro o gato) con un trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) o uno o más síntomas de las mismas. En otro modo de realización, el sujeto es un mamífero (p.ej., un mamífero inmunocomprometido o inmunodeprimido), preferiblemente un ser humano, con riesgo de desarrollar un trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) o uno o más síntomas de las mismas). En otro modo de realización, el sujeto no es un mamífero inmunocomprometido o inmunodeprimido, preferiblemente un ser humano. En otro modo de realización, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano, con un recuento de linfocitos que no se encuentra por debajo de las 500 células/mm3 aproximadamente. En otro modo de realización, el sujeto es un bebé humano o un bebé humano nacido de forma prematura. En otro modo de realización, el sujeto es un niño humano o un adulto humano. En otro modo de realización, el sujeto es un niño humano con displasia broncopulmonar, enfermedades cardiacas congénitas, o fibrosis cística. En otro modo de realización, el sujeto es un anciano humano. En otro modo de realización más, el sujeto es un ser humano en una institución u hogar de grupo, por ejemplo, a modo ilustrativo y no limitativo, una residencia de ancianos.
[0119] Según su uso aquí, el término “sinérgico” hace referencia a la combinación de terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) que es más efectiva que los efectos añadidos de cualquiera de las dos o más terapias sencillas (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos). Un efecto sinérgico de una combinación de terapias (p.ej., una combinación de agentes profilácticos o terapéuticos) permite el uso de dosis más bajas de una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) y/o una administración menos frecuente de dichas terapias al sujeto con una afección respiratoria. La capacidad de utilizar dosis más bajas de terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) y/o administrar dichas terapias de forma menos frecuente reduce la toxicidad asociada con la administración de dichas terapias a un sujeto sin reducir la eficacia de dichas terapias en la prevención o tratamiento de una afección respiratoria. Además, un efecto sinérgico puede provocar un aumento en la eficacia de las terapias (p.ej., agentes terapéuticos o profilácticos) en la prevención o tratamiento de una afección respiratoria. Finalmente, el efecto sinérgico de una combinación de terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) puede evitar o reducir los efectos secundarios adversos o no deseados asociados al uso de cualquier terapia sencilla.
[0120] Según su uso aquí, el término “modulador de receptor de células T” se refiere a un agente que modula la
fosforilación de un receptor de células T, la activación de la vía de transducción de señal asociada al receptor de células T y/o la expresión de una proteína específica asociada a la actividad del receptor de células T, como una citocina. Dicho agente puede modular directa o indirectamente la fosforilación de un receptor de células T, la activación de una vía de transducción de señal asociada a un receptor de células T, y/o la expresión de una proteína específica asociada a la actividad del receptor de células T, como una citocina. Los ejemplos de moduladores del receptor de células T incluyen, sin carácter limitativo, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión y anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un receptor de células T o un fragmento del mismo. Además, los ejemplos de moduladores de receptores de células T incluyen, sin carácter limitativo, proteínas, péptidos, polipéptidos (p.ej., receptores de células T solubles), proteínas de fusión y anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un ligando para una receptor de células T o fragmentos del mismo.
[0121] Según su uso aquí, los términos “agente terapéutico” y “agentes terapéuticos” hacen referencia a cualquier
agente o agentes que pueden usarse en la prevención, tratamiento, control, o mejora de una enfermedad o trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria o uno o más síntomas de la misma). El término “agente terapéutico” hace referencia a un anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-9. Preferiblemente, un agente terapéutico es un agente que se conoce que es útil para, o ha sido utilizado, o está siéndolo para la prevención, tratamiento, control, o mejora de dicha enfermedad o trastorno. Los agentes terapéuticos pueden caracterizarse como agentes diferentes basandonos en uno o más efectos que los agentes tienen in vivo y/o in vitro, por ejemplo, un agente antiinflamatorio puede caracterizarse también como un agente inmunomodulador.
[0122] Según su uso aquí, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” hace referencia a la cantidad de una
terapia (p.ej., un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9), que es suficiente para reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria o uno
o más síntomas de la misma), reducir la duración de una afección respiratoria, mejorar uno o más síntomas de dicha enfermedad o trastorno, prevenir el avance de dicha enfermedad o trastorno, provocar la regresión de dicha enfermedad o trastorno, o mejorar o aumentar el efecto o efectos terapéuticos de otra terapia.
[0123] Los términos “terapias” y “terapia” pueden hacer referencia a cualquier protocolo(s), método(s), y/o agente(s) que pueden utilizarse en la prevención, tratamiento, control, o mejora de una enfermedad o trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o de una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma).
[0124] Según su uso aquí, el término “protocolo terapéutico” hace referencia a un régimen de dosificación y momento de administración de una o más terapias (p.ej., agentes terapéuticos) que tienen un efecto terapéutico.
[0125] Según su uso aquí, los términos “tratar”, “tratamiento”, y “que tratan” hacen referencia a la reducción o mejora
de la evolución, gravedad y/o duración de dicha enfermedad o trastorno (p.ej., una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o la mejora de uno o más síntomas de la misma como resultado de la administración de una o más terapias (incluyendo, sin carácter limitativo, la administración de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos). En determinados modos de realización, dichos términos hacen referencia a una reducción en la inflamación de órganos o tejidos, o una reducción en el dolor asociado a una afección respiratoria. En otros modos de realización, dichos términos hacen referencia a una reducción en la inflamación o constricción de una vía o vías respiratorias asociada con el asma. En otros modos de realización, dichos términos hacen referencia a la reducción de la liberación de agentes inflamatorios por los mastocitos, o la reducción del efecto biológico de dichos agentes inflamatorios.
4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0126] Las FIGS. 1A-B muestran secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 7) de 4D4 con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 1), la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 61), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 3) subrayadas, empezando por orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de cadena ligera
(B) (SEQ ID NO.: 8) de 4D4, con la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 4, la VL CDR2 (SEQ ID NO.:5), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 6) subrayadas, empezando en orden por VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0127] Las FIGS. 2A-B muestran las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 9) de 4D4 H2-1 D11, con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 1), la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 10), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 3) subrayadas, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 8) de 4D4 H2-1 D11, la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 4), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 5), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 6) subrayadas, empezando en orden desde VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0128] Las FIGS. 3A-B muestran las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 15) de 4D4com-XF-9, con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 11), la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 10), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 12) subrayados, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 16) de 4D4com-XF-9, la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 13), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 14), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 63) subrayados, empezando en orden desde VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0129] Las FIGS. 4A-B muestran las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 17) de 4D4com-2F9, con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 1), la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 10), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 12) subrayadas, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 18) de 4D4com-2F9, con la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 4), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 14), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 64) subrayadas, empezando por orden desde VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0130] Las FIGS. 5A-B muestran las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 21) de 7F3, con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 19), la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 61), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 3) subrayadas, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 22) de 7F3, con la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 4), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 5), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 20) subrayadas, empezando en orden por VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0131] Las FIGS. 6A-B muestran las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 23) de 71A10, con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 19), la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 2), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 3) subrayadas, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 24) de 71A10, la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 4), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 5), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 20) subrayadas, empezando en orden desde VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0132] Las FIGS. 7A-B muestran las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 21) de 7F3 22D3, con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 19), la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 61), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 3) subrayadas, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 25) de 7F3 22D3, con la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 4), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 14), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 20) subrayadas, empezando en orden desde VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0133] Las FIGS. 8A-B muestran las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 27) de 7F3com-2H2, la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 26), con la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 2), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 3) están subrayadas, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 28) de 7F3com-2H2, la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 62), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 65), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 20) subrayadas, empezando en orden desde VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0134] Las FIGS. 9A-B muestran las secuencias de nucleótidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 43) de 7F3com-2H2, con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 44), con la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 45), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 46) subrayadas, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 47) de 7F3com-2H2, con la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 48), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 49), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 50) subrayadas, empezando en orden desde VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0135] Las FIGS. 10A-B muestran las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 29) de 7F3com-3H5, con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 19), la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 2), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 3) subrayadas, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo; y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 30) de 7F3com-3H5, con la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 4), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 14), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 20) subrayadas, empezando en orden desde VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0136] Las FIGS. 11A-B muestran las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (A) (SEQ ID NO.: 31) de 7F3com-3D4, con la VH CDR1 (SEQ ID NO.: 26), la VH CDR2 (SEQ ID NO.: 2), y la VH CDR3 (SEQ ID NO.: 3) subrayadas, empezando en orden desde VH CDR1 en el extremo izquierdo y el dominio variable de la cadena ligera (B) (SEQ ID NO.: 32) de 7F3com-3D4, con la VL CDR1 (SEQ ID NO.: 62), la VL CDR2 (SEQ ID NO.: 14), y la VL CDR3 (SEQ ID NO.: 20) subrayadas, empezando en orden desde VL CDR1 en el extremo izquierdo.
[0137] La FIG. 12 muestra las secuencia de nucleótidos de la IL-9 humana (SEQ ID NO.: 51) ubicada en la base de datos GenBank (nº de registro NM_000590).
[0138] La FIG. 13 muestra la secuencia de aminoácidos de la IL-9 humana ubicada en la base de datos GenBank (nº de registro A60480 (SEQ ID NO.: 52), NP_000584 (SEQ ID NO.: 53) y AAC17735 (SEQ ID NO.: 54)).
[0139] Las FIGS. 14A-C muestran la secuencia de nucleótidos de las subunidades de IL-9R encontradas en la base de datos GenBank (nº de registro NM_002186 (SEQ ID NO.: 55), NM_176786 (SEQ ID NO.: 56), y NM_000206 (SEQ ID NO.: 57)). El nº de registro (A) NM_002186 y el nº de registro (B) NM_176786 corresponden a las secuencias de nucleótidos de precursores de la isoforma de la subunidad alfa de IL-9R humana. El nº de registro (C) NM_000206 es la secuencia de nucleótidos de la cadena gamma de IL-9R humana.
[0140] La FIG. 15 muestra la secuencia de aminoácidos de IL-9R humano encontrado en la base de datos GenBank (nº de registro NP_002177 (SEQ ID NO.: 58); NP_789743 (SEQ ID NO.: 59), y NP_000197 (SEQ ID NO.: 60). Los registros nº NP_002177 y NP_789743 son las secuencias de aminoácidos de precursores de la isoforma de subunidades alfa de IL-9R humana. El registro NP_000197 es la secuencia de aminoácidos de la cadena gamma de IL-9R humana.
5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0141] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de interleucina-9 (“IL-9”) (preferiblemente, un polipéptido de IL-9 humana). La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (“VH”) y/o un dominio variable de la cadena ligera (“VL”) que tienen una secuencia de aminoácidos del dominio VH y/o el dominio VL, SEQ ID Nos.: 27 y 28, respectivamente. Dichos anticuerpos pueden comprender además cualquier región constante conocida en la técnica, preferiblemente cualquier región constante humana conocida en la técnica, incluyendo, sin carácter limitativo, la cadena ligera humana kappa (κ), la cadena ligera humana lambda (λ), la región constante de IgG1, la región constante de IgG2, la región constante de IgG3 y la región constante de IgG4.
[0142] La presente invención abarca los protocolos de tratamiento que proporcionan mejores perfiles profilácticos y terapéuticos que las terapias actuales de un solo agente o combinación de terapias para enfermedades o trastornos asociadas a o caracterizadas por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, enfermedades o trastornos asociados con o caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-9 (“IL-9R”) o una o más subunidades del mismo, enfermedades inflamatorias, o uno o más síntomas de las mismas. En especial, la invención proporciona protocolos profilácticos y terapéuticos para la prevención, tratamiento, control, y/o mejora de enfermedades o trastornos caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, enfermedades o trastornos caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante de un receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, enfermedades inflamatorias, o uno o más síntomas de las mismas, que comprenden la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de uno o más de los anticuerpos de la invención solo o en combinación con una cantidad efectiva de al menos una terapia (p.ej., un agente profiláctico o terapéutico) distinto de un anticuerpo de la invención.
[0143] La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas, kits, y artículos de fabricación que comprenden uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 para su uso en la prevención, tratamiento, control, y/o mejora de una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-9 o uno o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma. La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas, kits, y artículos de fabricación que comprenden uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de los anticuerpos de la invención para su uso en la prevención, tratamiento, control, o mejora de una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-9 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de los mismos.
5.1 ANTICUERPOS DE LA IL-9
[0144] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 (preferiblemente un polipéptido de IL-9 humana). En concreto, la invención proporciona los siguientes anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9: 4D4 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, 4D4 H2-1 D11 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, 4d4com-XF-9 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, 4d4com-2F9 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, 7F3 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, 71A10 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, 7F3 22D3 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, 7F3com-2H2 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, 7F3com-3H5 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y 7F3com-3D4 o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En un modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 es 7F3com-2H2 o un fragmento de unión al antígeno del mismo (p.ej., una o más CDRs de 7F3com-2H2). Las regiones constantes para 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, y 7F3com-3D4 son idénticas a las regiones constantes para palivizumab (MedImmune, Inc.) IgG1 (véase la patente estadounidense nº 5.824.307, emitida el 20 de octubre de 1998).
[0145] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos del dominio VH de 4D4 (FIG. 1A; SEQ ID NO.: 7), 4D4 H2-1 D11 (FIG.2A; SEQ ID NO.: 9), 4D4com-XF-9 (FIG. 3A; SEQ ID NO.: 15), 4D4com-2F9 (FIG. 4A; SEQ ID NO.: 17), 7F3 (FIG. 5A; SEQ ID NO.: 21), 71 A 10 (FIG. 6A; SEQ ID NO.: 23), 7F3 22D3 (FIG. 7A; SEQ ID NO.: 21), 7F3com-2H2 (FIG. 8A; SEQ ID NO.: 27), 7F3com-3H5 (FIG. 10A; SEQ ID NO.: 29), o 7F3com-3D4 (FIG. 11A; SEQ ID NO.: 31). En un modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, que comprende un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos del dominio VH de 7F3com-2H2 (FIG. 8A; SEQ ID NO.: 27).
[0146] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos una VH CDR que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VH CDRs enumeradas en la Tabla 1, infra. En especial, la invención comprende anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos (o alternativamente, constando de) una, dos, tres, cuatro, cinco o más VH CDRs que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VH CDRs enumeradas en la Tabla 1, infra. En un modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 19, o SEQ ID NO.:26. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 10 o SEQ ID NO.: 61. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 o SEQ ID NO.: 12. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 19 o SEQ ID NO.: 26 y una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 10 o SEQ ID NO.: 61. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 19, o SEQ ID NO.: 26 y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 o SEQ ID NO.: 12. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 10 o SEQ ID NO.: 61 y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 o SEQ ID NO.: 12. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 19, o SEQ ID NO.: 26, una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 10 o SEQ ID NO.: 61, y una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 o SEQ ID NO.: 12.
[0147] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos del dominio VL de 4D4 (FIG. 1B; SEQ ID NO.: 8), 4D4 H2-1 D11 (FIG. 2B; SEQ ID NO.: 8), 4D4com-XF-9 (FIG. 3B; SEQ ID NO.: 16), 4D4com-2F9 (FIG. 4B; SEQ ID NO.: 18), 7F3 (FIG. 5B; SEQ ID NO.: 22), 71A10 (FIG. 6B; SEQ ID NO.: 24), 7F3 22D3 (FIG. 7B; SEQ ID NO.: 25), 7F3com-2H2 (FIG. 8B; SEQ ID NO.: 28), 7F3com-3H5 (FIG. 10B; SEQ ID NO.: 30), o 7F3com-3D4 (FIG. 11B; SEQ ID NO.: 32). En un modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos del dominio VL para 7F3com-2H2 (FIG. 8B; SEQ ID NO.: 28).
[0148] La presente invención proporciona también anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos una VL CDR que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VL CDRs enumeradas en la Tabla 1, infra. En concreto, la invención proporciona anticuerpos que
se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos (o alternativamente, constando de) uno, dos, tres o más VL CDRs que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los VL CDRs enumerados en la Tabla 1, infra. En un modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ 5 ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 13 o SEQ ID NO.: 62. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 14 o SEQ ID NO.: 65. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 63 o SEQ ID NO.: 64. En otro modo de realización, un anticuerpo que se 10 une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comrpende una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 13 o SEQ ID NO.: 62 y una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 14 o SEQ ID NO.: 65. En otro modo de realización de un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 13 o SEQ ID NO.: 62 y una VL CDR3 que tiene la secuencia de 15 aminoácidos de SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 63 o SEQ ID NO.: 64. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 14 o SEQ ID NO.: 65 y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 63 o SEQ ID NO.: 64. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VL CDR1
20 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 13 o SEQ ID NO.: 62, una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 14 y SEQ ID NO.: 65, y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 63 o SEQ ID NO.: 64, siendo una parte del anticuerpo.
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Tabla 1
Los residuos que son diferentes entre cada secuencia de aminoácidos que codifica las diversas CDRs aparecen en fuente negrita y subrayado.
Nombre del anticuerpo
DominioVH VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 Dominio VL VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
4D4
SEQ. ID NO.: 7 GYTFTGYWI E (SEQ. ID NO. 1): EILPGSGTTN YNEKFKG (SEQ. ID NO.:61) ADYYGSDYV (SEQ. ID NO.:3) SEQ. IDNO.: 8 KFDY KASQHVGTH VT (SEQ. ID NO.: 4) STSYRYS (SEQ. ID NO.: 5) QHFYSYPLT(SEQ. ID NO.: 6)
404 H2-1 D11
SEQ. ID NO.: 9 GYTFTGYWI E (SEQ. ID NO.: 1) EWLPGSGTTNYNEKFKG (SEQ. ID NO.: 10) ADYYGSDYV (SEQ. ID NO.: 3) SEQ. IDNO.: 8 KFDY KASQHVGTH VT (SEQ. ID NO.: 4) STSYRYS (SEQ. ID NO.: 5) QHFYSYPLT(SEQ. ID NO.: 6)
4D4com-XF-9
SEQ. ID NO.: 15 E GYTFTYYWI (SEQ. ID NO.: 11) EWLPGSGTT NYNEKFKG (SEQ. ID NO.: 10) ADYYGSDHV KFDY (SEQ. ID NO.: 12) SEQ. ID NO.: 16 LASQHVGTH VT (SEQ. ID NO.: 13) GTSYRYS(SEQ. ID NO.: 14) QHFYDYPLT(SEQ. ID NO.:63)
4D4com-2F9
SEQ. ID NO.: 17 GYTFTGYWI E (SEQ. ID NO.: 1) EWLPGSGTT NYNEKFKG (SEQ. ID NO.: 10) ADYYGSDHV KFDY (SEQ. ID NO.: 12) SEQ. ID NO.: 18 KASQHVGTH VT (SEQ. ID NO.: 4) GTSYRYS(SEQ. ID NO.: 14) QHFYEYPLT(SEQ. ID NO.:64)
7F3
SEQ. ID NO.: GGTFSGYWI 21 E (SEQ. ID NO.: 19) EILPGSGTTN YNEKFKG (SEQ. ID NO.:61) ADYYGSDYV KFDY (SEQ. ID NO.: 3) SEQ. ID NO.: 22 KASQHVGTH VT (SEQ. ID NO.: 4) STSYRYS (SEQ. ID NO.: 5) QQFYEYPLT(SEQ. ID NO.: 20)
71A10
SEQ. ID NO.: 23 GGTFSGYWI E (SEQ. ID NO.: 19) EILPGSGTTN PNEKFKG (SEQ. ID NO.: 2) ADYYGSDYV KFDY (SEQ. ID NO.: 3) SEQ. ID NO.: 24 KASQHVGTH VT (SEQ. ID NO.: 4) STSYRYS (SEQ. ID NO.: 5) QQFYEYPLT(SEQ. ID NO.: 20)
7F3 22D3
SEQ. ID NO.: 21 GGTFSGYWI E (SEQ. ID NO.: 19) EILPGSGTTN YNEKFKG (SEQ. ID NO.:61) ADYYGSDYV KFDY (SEQ. ID NO.: 3) SEQ. ID NO.: 25 KASQHVGTH VT (SEQ. ID NO.: 4) GTSYRYS(SEQ. ID NO.: 14) QQFYEYPLT(SEQ. ID NO.: 20)
25 26
Los residuos que son diferentes entre cada secuencia de aminoácidos que codifica las diversas CDRs aparecen en fuente negrita y subrayado.
Nombre del anticuerpo
DominioVH VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 Dominio VL VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
7F3com-2H2
SEQ. ID NO.: 27 GGTFSYYWI E (SEQ. ID NO.: 26) EILPGSGTTN PNEKFKG (SEQ. ID NO.: 2) ADYYGSDYV KFDY (SEQ. ID NO.: 3) SEQ. ID NO.: 28 KASQHVITH VT (SEQ. ID NO.:62) GTSYSYS ID NO.:65) QQFYEYPLT(SEQ. ID NO.: 20)
7F3com-3H5
SEQ. ID NO.: 29 GGTFSGYWI E (SEQ. ID NO.: 19) EILPGSGTTN PNEKFKG (SEQ. ID NO.: 2) ADYYGSDYV KFDY (SEQ. ID NO.: 3) SEQ. ID NO.: 30 KASQHVGTH VT (SEQ. ID NO.: 4) GTSYRYS(SEQ. ID NO.: 14) QQFYEYPLT(SEQ. I D NO.: 20)
7F3com-3D4
SEQ. ID NO.: GGTFSYYWI 31 E (SEQ. ID NO.: 26) EILPGSGTTN PNEKFKG (SEQ. ID NO.: 2) ADYYGSDYV KFDY (SEQ. ID NO.: 3) SEQ. ID NO.: 32 KASQHVITH VT (SEQ. ID NO.:62) GTSYRYS(SEQ. ID NO.: 14) QQFYEYPLT(SEQ. ID NO.: 20)
[0149] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos un dominio VH aquí revelado combinado con un dominio VL aquí revelado, u otro dominio VL. La presente invención proporciona también anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos un dominio VL aquí revelado combinado con un dominio VH aquí revelado, u otro dominio VH.
[0150] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos (o alternativamente, constando de) una VH CDR enumerada en la Tabla 1, supra. La presente invención proporciona también anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos (o alternativamente, constando de) una VL CDR enumerada en la Tabla 1, supra. La invención proporciona además anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos combinaciones de VH CDRs y VL CDRs descritas aquí.
[0151] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos una o más VH CDRs y una o más VL CDRs enumeradas en la Tabla 1, supra. En concreto, la invención proporciona un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo (o alternativamente, constando de) una VH CDR1 y una VL CDR1; una VH CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2 y una VL CDR1; VH CDR2 y VL CDR2; una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR3 y una VH CDR1; una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH1 CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR1; una VH CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR1; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; o cualquier combinación de los mismos de las VH CDRs y VL CDRs enumerados en la Tabla 1, supra.
[0152] En un modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 19 o SEQ ID NO.: 26 y una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 13 o SEQ ID NO.: 62. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 19, o SEQ ID NO.: 26 y una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 14 o SEQ ID NO.: 65. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comrpende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 19, o SEQ ID NO.: 26 y una VL CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 63 o SEQ ID NO.: 64.
[0153] En un modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 10 o SEQ ID NO.: 61 y una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 13 o SEQ ID NO.: 62. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 10 o SEQ ID NO.: 61 y una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 14 o SEQ ID NO.: 65. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 10 o SEQ ID NO.: 61 y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 63 o SEQ ID NO.: 64.
[0154] En un modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 o SEQ ID NO.: 12 y una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 13 o SEQ ID NO.: 62. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende un VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 o SEQ ID NO.: 12 y una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 14 o SEQ ID NO.: 65. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 o SEQ ID NO.: 12 y una VL CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 63 o SEQ ID NO.: 64.
[0155] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, codificados dichos anticuerpos mediante una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de 7F3com-2H2 o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En un modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende un dominio VH codificado por una secuencia de ácido nucléico que tiene una secuencia de nucleótidos del dominio VH de 7F3com-2H2. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comrpende un dominio VL codificado por una secuencia de ácido nucléico que tiene una secuencia de nucleótidos del dominio VL de 7F3com-2H2. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende un dominio VH y un dominio VL codificados por una secuencia de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos del dominio VH y dominio VL de 7F3com-2H2.
[0156] En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR codificada por una secuencia de ácido nucléico que tiene una secuencia de nucleótidos de una VH CDR de 7F3com-2H2. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VL CDR codificada por una secuencia de ácido nucléico que tiene una secuencia de nucleótidos de una VL CDR de 7F3com-2H2. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una VH CDR y una VL CDR codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de una VH CDR y una VL CDR de 7F3com2H2.
[0157] La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico, generalmente aislada, que codifica un anticuerpo de la presente invención que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9. En particular, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, teniendo dicho anticuerpo la secuencia de aminoácidos de 4D4, 4D4 H21 D 11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5 o 7F3com-3D4, o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En un modo de realización preferido, una molécula de ácido nucleico aislada codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, teniendo dicho anticuerpo la secuencia de aminoácidos de 7F3com-2H2.
[0158] La invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo (alternativamente, constando de) un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio VH de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4. En un modo de realización preferido, una molécula de ácido nucleico aislada codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos del dominio VH de 7F3com-2H2.
[0159] La invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo (alternativamente, constando de) una VH CDR que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VH CDRs incluidas en la Tabla 1, supra. En particular, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipépitdo de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo tres VH CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VH CDRs incluidas en la Tabla 1, supra. En un modo de realización, una molécula de ácido nucleico aislada codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la VH CDR1 incluida en la Tabla 1, supra. En otro modo de realización, una molécula de ácido nucléico aislada codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la VH CDR2 incluida en la Tabla 1, supra. En otro modo de realización, una molécula de ácido nucleico aislada codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la VH CDR3 incluida en la Tabla 1, supra.
[0160] La invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho polipéptido (alternativamente, constando de) un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio VL de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4. En un modo de realización preferido, una molécula de ácido nucleico aislada codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos del dominio VL de 7F3com-2H2.
[0161] La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo (alternativamente, constando de) una VL CDR que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VL CDRs incluidas en la Tabla 1, supra. En concreto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo, tres VL CDRs que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VL CDRs incluidas en la Tabla 1, supra. En un modo de realización, una molécula de ácido nucleico aislada codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la VH CDR1 incluida en la Tabla 1, supra. En otro modo de realización, una molécula de ácido nucleico aislada codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la VL CDR2 incluida en la Tabla 1, supra. En otro modo de realización, una molécula de ácido nucleico aislada codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la VL CDR3 incluida en la Tabla 1, supra.
[0162] La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo una o más VH CDRs y una o más VL CDRs incluidas en la Tabla 1, supra. En especial, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo (o alternativamente, constando de) una VH CDR1 y una VL CDR1; una VH CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2 y una VL CDR1; VH CDR2 y VL CDR2; una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR3 y una VH CDR1; una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH1 CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR1; una VH CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR1; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; o cualquier combinación de las VH CDRs y VL CDRs incluidas en la Tabla, supra.
[0163] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos derivados de los dominios VH, VH CDRs, dominios VL o VL CDRs descritos aquí que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9. Se pueden usar técnicas estándares conocidas por aquellos con habilidad en la técnica para introducir mutaciones (p.ej., deleciones, adiciones, y/o sustituciones) en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la invención, incluyendo, por ejemplo, la mutagénesis dirigida y mutagénesis por PCR, que provoca sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, los derivados incluyen menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto a la molécula original. En un modo de realización preferido, los derivados tienen sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más residuos de aminoácido que se prevén no esenciales (es decir, residuos de aminoácidos que no son críticos para que el anticuerpo se una de forma inmunoespecífica al polipéptido de IL-9). Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es aquella en la que se sustituye un residuo de aminoácidos con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p.ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p.ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p.ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p.ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (p.ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p.ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Alternativamente, se pueden introducir mutaciones al azar a lo largo de toda la secuencia de codificación o parte de ella, como mediante mutagénesis de saturación, y se puede investigar la actividad biológica de los mutantes resultantes para identificar mutantes que retengan actividad. Tras la mutagénesis, el anticuerpo codificado puede expresarse y puede determinarse la actividad del anticuerpo.
[0164] La presente invención proporciona un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos la secuencia de aminoácidos de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4 con una o más sustituciones de residuos de aminoácidos en el dominio variable de la cadena ligera (VL) y/o en el dominio variable de la cadena pesada (VH). La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos la secuencia de aminoácidos de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4 con una o más sustituciones de residuos de aminoácidos en una o más VL CDRs y/o una o más VH CDRs. La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos la secuencia de aminoácidos de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4, o un dominio VH y/o VL de los mismos con una o más sustituciones de residuos de aminoácidos en una o más regiones marco de la VH y/o una o más regiones marco de la VL. El anticuerpo generado mediante la introducción de sustituciones en el dominio VH, VH CDRs, dominio VL, VL CDRs y/o regiones marco de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4 puede someterse a pruebas in vitro y/o in vivo, por ejemplo, para su capacidad de unirse a un polipéptido de IL-9, o su capacidad de inhibir o reducir la proliferación celular mediada por IL-9, o para su capacidad para prevenir, tratar y/o mejorar un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio, un trastorno proliferativo o una infección respiratoria, o un síntoma de los mismos.
[0165] En un modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos que codifica 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4, o un fragmento de unión al antígeno del mismo en condiciones rigurosas, p.ej., hibridación con ADN unido a un filtro en 6x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC seguido de uno o más lavados en 0,2xSSC/0,1 % SDS a aproximadamente 50-65ºC, en condiciones estrictamente rigurosas, p.ej., hibridación con ácido nucleico unido a un filtro en 6xSSC a aproximadamente 45ºC seguido de uno o más lavados en 0,1 xSSC/0,2% SDS a aproximadamente 68ºC, o en otras condiciones de hibridación rigurosas que sean conocidas para aquellos con experiencia en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., New York en páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3).
[0166] En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio VH o una secuencia de aminoácidos de un dominio VL codificado por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con la secuencia de nucleótidos que codifica los dominios VH o VL de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4 en las condiciones rigurosas aquí descritas o en otras condiciones rigurosas de hibridación que sean conocidas para aquellos con experiencia en la técnica. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio VH y una secuencia de aminoácidos de un dominio VL codificado por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios VH y VL de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4 en las condiciones rigurosas aquí descritas o en otras condiciones rigurosas de hibridación conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una secuencia de aminoácidos de una VH CDR o una secuencia de aminoácidos de una VL CDR codificada por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las VH CDRs o VL CDRs incluidas en la Tabla 1, supra en condiciones rigurosas aquí descritas o en otras condiciones rigurosas de hibridación que sean conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una secuencia de aminoácidos de una VH CDR y una secuencia de aminoácidos de una VL CDR codificadas por secuencias de nucleótidos que hibridizan con las secuencias de nucleótidos que codifican cualquiera de las VH CDRs incluidas en la Tabla 1, supra, y cualquiera de las VL CDRs incluidas en la Tabla 1, supra, en condiciones rigurosas aquí descritas o en otras condiciones rigurosas de hibridación que sean conocidas por aquellos con experiencia en la técnica.
[0167] En otro modo de realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo un dominio VH y/o dominio VL codificado por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con la secuencia de nucleótidos del dominio VH y/o dominio VL de 7F3com-2H2 (SEQ ID NO.: 43 y SEQ ID NO.: 47, respectivamente) en condiciones rigurosas. En otro modo de realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo una VH CDR y/o VL CDR codificada por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con la secuencia de nucleótidos de la VH CDR y/o VL CDR de 7F3com-2H2 (FIGS. 9A-B) en condiciones rigurosas.
[0168] En un modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 99% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nos.: 27 y 28, o a un fragmento de unión al antígeno del mismo.
[0169] La presente invención abarca polipéptidos o proteínas que comprenden (alternativamente, que constan de) VH CDRs que compiten con una VH CDR incluida en la Tabla 1, supra, para unirse a un polipéptido de IL-9. La presente invención también abarca polipéptidos o proteínas que comprenden (alternativamente, constan de) VL CDRs que compiten con una VL CDR incluida en la Tabla 1, supra para unirse a un polipéptido de IL-9.
[0170] Los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 incluyen derivados que están modificados, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo como la unión covalente. Por ejemplo, pero careciendo de carácter limitativo, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados, p.ej., mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos de bloqueo/protectores conocidos, segmentación proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de las numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, sin carácter limitativo, la segmentación química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
[0171] La presente invención proporciona también anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo una región marco conocida por aquellos expertos en la técnica (p.ej., un marco humano o no humano). Las regiones marco pueden ser regiones marco consenso o que suceden de forma natural. Preferiblemente, la región de fragmento de un anticuerpo de la invención es humana (véase, p.ej., Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479 para una lista de las regiones marco humanas, que se incorpora aquí mediante referencia en su totalidad).
[0172] La presente invención abarca anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dicho anticuerpo la secuencia de aminoácidos de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4 con mutaciones (p.ej., una o más sustituciones de aminoácidos) en las regiones marco. En determinados modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprenden la secuencia de aminoácidos de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4 con una o más sustituciones de residuos de aminoácidos en las regiones marco de los dominios VH y/o VL. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos en la región marco mejoran la unión del anticuerpo a un polipéptido de IL-9.
[0173] En un modo de realización específico, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprenden la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4, teniendo una región marco VH 1 la secuencia de aminoácidos de QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO.: 33) o QVQLVQSGAEV KKPGSSVKVSCKAS (SEQ ID NO.: 37), teniendo una región marco VH 2 la secuencia de aminoácidos de WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO.: 34), teniendo una región marco VH 3 la secuencia de aminoácidos de RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO.: 35) o RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO.: 38), y teniendo una región marco VH 4 la secuencia de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO.: 36). En otro modo de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprenden la secuencia de aminoácidos de una o más CDRs de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com3D4, teniendo una región marco VL 1 la secuencia de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO.: 39), teniendo una región marco VL 2 la secuencia de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO.: 40), teniendo una región marco VL 3 la secuencia de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYC (SEQ ID NO.: 41), y teniendo la región marco VL 4 la secuencia de aminoácidos de FGGGTKVEIK (SEQ ID NO.: 42). En otro modo de realización diferente, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 comprenden la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4, teniendo una región marco VH 1 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 33 o SEQ ID NO.: 37, teniendo una región marco VH 2 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 34, teniendo una región marco VH 3 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 35 o SEQ ID NO.: 38, teniendo una región marco VH 4 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 36, teniendo una región marco VL 1 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 39, teniendo una región marco VL 2 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 40, teniendo una región marco VL 3 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 41, y teniendo una región marco VL 4 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 42.
[0174] La presente invención también abarca anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, comprendiendo dichos anticuerpos la secuencia de aminoácidos de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5, o 7F3com-3D4 con mutaciones (p.ej., una o más sustituciones de residuos de aminoácidos) en las regiones variables y marco. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos en las regiones variables y marco mejoran la unión del anticuerpo a un polipéptido de IL-9.
[0175] La presente invención también proporciona anticuerpos de la invención que comprenden regiones constantes conocidas por aquellos expertos en la técnica. Preferiblemente, las regiones constantes de un anticuerpo de la invención o fragmento del mismo son humanas.
[0176] La invención abarca anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 expresado por una célula inmune como una célula T activada o un mastocito. La invención también abarca anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y modulan una actividad o función de células T, células B, mastocitos, neutrófilos, y/o eosinófilos. La invención abarca además anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 e inhiben o reducen la infiltración de células inflamatorias en un tejido, articulación, u órgano de un sujeto y/o inhiben o reducen la hiperplasia de las células epiteliales.
[0177] La invención abarca anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 encontrado en el medio, es decir, no unido a un IL-9R o a una subunidad del mismo. La invención también comprende anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 unido a una subunidad del IL-9Rα soluble. La invención también abarca anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 unido a un IL-9R unido a una membrana celular o una subunidad del mismo.
[0178] En un modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhibe y/o reduce la intercacción entre el polipéptido de IL-9 y el receptor de IL-9 (“IL-9R”) o una subunidad del mismo aproximadamente en un 25%, preferiblemente aproximadamente en un 30%, aproximadamente en un 35%, aproximadamente en un 45%, aproximadamente en un 50%, aproximadamente en un 55%, aproximadamente en un 60%, aproximadamente en un 65%, aproximadamente en un 70%, aproximadamente en un 75%, aproximadamente en un 80%, aproximadamente en un 85%, aproximadamente en un 90%, aproximadamente en un 95%, o aproximadamente en un 98% en relación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG de control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por una persona con habilidad en la técnica (p.ej., un inmunoensayo como un ELISA). En un modo de realización alternativo, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 no inhibe la interacción entre un polipéptido de IL-9 y el IL-9R o una subunidad del mismo en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG de control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por una persona con habilidad en la técnica (p.ej., un inmunoensayo como un ELISA). En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhibe la interacción entre el polipéptido de IL-9 y el IL-9R en menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, o menos de un 5% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control usando, por ejemplo, un inmunoensayo como un ELISA.
[0179] En un modo de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben o reducen la interacción entre el polipéptido de IL-9 y el receptor de IL-9 (“IL-9R”) o una o más subunidades del mismo en al menos un 25%, preferiblemente, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como una solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí
o conocido por una persona con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo de proliferación celular utilizando una línea celular dependiente de la IL-9 como una línea celular T de ratón dependiente de la IL-9 que expresa el IL-9R humano). En un modo de realización alternativo, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 no inhiben la interacción entre un polipéptido de IL-9 y el IL-9R o una o más subunidades del mismo en comparación con un control como una solución salina fosfatada o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo de proliferación celular utilizando una línea celular dependiente de la IL-9 como una línea celular T de ratón dependiente de la IL-9 que expresa el IL-9R humano). En otro modo de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben la interacción entre el polipéptido de IL-9 y el IL-9R o una o más subunidades del mismo en menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10% o menos de un 5% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica, (p.ej., un ensayo de proliferación celular usando una línea celular dependiente de la IL-9 como una línea celular T de ratón dependiente de la IL-9 que expresa el IL-9R humano).
[0180] La presente invención abarca anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y no inducen o reducen la expresión y/o liberación de citocinas en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En un modo de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y no inducen un aumento de la concentración de citocinas como, p.ej., INF-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 e IL-23 en el suero de un sujeto al que se ha administrado dicho anticuerpo en comparación con la concentración de tales citocinas en el suero de un sujeto al que se ha administrado un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control. En un modo de realización alternativo, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inducen la expresión y/o liberación de citocina en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con experiencia en la técnica. En un modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 induce un aumento en la concentración de citocinas como, p.ej., INF-γ, IL-2, IL-12, e IL-15 en el suero de un sujeto al que se ha administrado dicho anticuerpo en comparación con la concentración de tales citocinas en el suero de un sujeto al que se ha administrado un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control. En otro modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 induce un aumento en la concentración de citocinas producidas por las células Th1, como INF-γ e IL-12, en un sujeto al que se ha administrado dicho anticuerpo en comparación con la concentración de tales citocinas en el suero de un sujeto al que se ha administrado un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control. En otro modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 induce una disminución en la concentración de citocinas como, p.ej., IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e IL-23 en el suero de un sujeto al que se le ha administrado dicho anticuerpo en comparación con la concentración de dichas citocinas en el suero de un sujeto al que se ha administrado un control como solución salina fosfatada (PBS) o anticuerpo IgG control. En otro modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 induce una disminución en la concentración de citocinas producidas por mastocitos, como TNF-α, IL-4 e IL-13, en el
suero de un sujeto al que se ha administrado dicho anticuerpo en comparación con la concentración de dichas citocinas en el suero de un sujeto al que se ha administrado un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control. En otro modo de realización más, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 induce una disminución en la concentración de citocinas producidas por las células Th2, como IL4, IL-5, IL-13 e IL-10, en el suero de un sujeto al que se ha administrado dicho anticuerpo en comparación con la concentración de dichas citocinas en el suero de un sujeto al que se ha administrado un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control. Las concentraciones séricas de una citocina pueden medirse por cualquier técnica conocida por aquellos con experiencia en la técnica como, p.ej., ELISA o análisis de Western blot.
[0181] En un modo de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 reducen y/o inhiben la proliferación de células inflamatorias (p.ej., mastocitos, células T, células B, macrófagos, neutrófilos, basófilos y/o eosinófilos) en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un65%, al menos un70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán o ensayo con 3H-timidina). En otro modo de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 reducen y/o inhiben la infiltración de células inflamatorias en el tracto respiratorio superior y/o inferior en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En otro modo de realización más, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 reducen y/o inhiben la infiltración de células inflamatorias en el tracto respiratorio superior y/o inferior en al menos un 25%, preferiblemente en al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido en la técnica y reducen y/o inhiben la proliferación de células inflamatorias en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con solución salina fosfatada (PBS)
o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con experiencia en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán o ensayo con 3H-timidina).
[0182] En determinados modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 reducen la degranulación de los mastocitos en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (véase, p.ej., Windmiller y Backer, 2003, J. Biol. Chem. 278:11874-78 para ejemplos de ensayos de degranulación de los mastocitos). En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la activación de los mastocitos en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la expresión y/o liberación de productos de activación y/o degranulación de los mastocitos en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica.
[0183] En un modo de realización específico, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la expresión, actividad, concentración sérica y/o liberación de proteasas de mastocitos, como quimasa y triptasa, en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En un modo de realización preferido, la actividad de los mastocitos puede medirse mediante el cultivo de mastocitos primarios o una línea de mastocitos in vivo en presencia de 10 ng/ml de IL-9. Los niveles de referencia de proteasa (p.ej. quimasa y triptasa) y leucotrienos se determinan en el sobrenadante mediante kits de ELISA disponibles en el mercado. La capacidad de los anticuerpos de modular los niveles de proteasa o leucotrieno se evalúa añadiendo un anticuerpo reactivo a la IL-9 o
un anticuerpo control directamente a los cultivos celulares a una concentración de 1μg/ml. Los niveles de proteasas
y leucotrienos se evalúan a las 24 y a las 36 horas. En otro modo de realización específico, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la expresión, actividad, concentración sérica, y/o liberación de leucotrienos de los mastocitos, como C4, D4, y E4 en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En otro modo de realización específico, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la expresión, actividad, concentración sérica, y/o liberación de citocinas de los mastocitos, como TNF-α, IL-4, e IL-13 en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con experiencia en la técnica (p.ej. un ensayo ELISA o ensayo de Western blot).
[0184] En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de mastocitos en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido en la técnica. En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la proliferación de mastocitos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán, ensayo con 3H-timidina o FACS). En otros modos de realización más, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de mastocitos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vitro y/o in vivo descrito aquí o conocido en la técnica e inhibe y/o reduce la proliferación de mastocitos al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán, ensayo con 3H-timidina o FACS). En un modo de realización preferido, las reducciones en la infiltración de mastocitos puede medirse in vivo mediante la sensibilización de animales con ovoalbúmina. En síntesis, se administran 100 μg de ovoalbúmina ligada a adyuvante de aluminio por vía subcutánea en los días 1 y 21. A lo largo del procedimiento de sensibilización de tres semanas, se administró a los animales un anticuerpo reactivo a la IL-9 o un anticuerpo control a una dosis de 10mg/kg de cada 5 a 7 días. En los días, 29, 30 y 31, los animales fueron expuestos a ovoalbúmina sin adyuvante administrada mediante aerosol, o alternativamente, mediante instilación intranasal de 100 μl de una solución 1μg/ml preparada en solución salina fosfatada (PBS). El día 31, 6 horas después de la última exposición a ovoalbúmina, se sacrificó a los animales y se fijó tejido pulmonar mediante perfusión con formalina. La infiltración de mastocitos se evalúa histológicamente mediante el recuento de mastocitos por campo en las secciones del tejido epitelial pulmonar. Utilizando este diseño experimental, los precursores de mastocitos pueden diferenciarse de los mastocitos en el epitelio pulmonar mediante la evaluación (por ejemplo) de la presencia de gránulos metacromáticos, y/o mediante inmunohistoquímica utilizando marcadores de las superficies celulares dependientes de la diferenciación (p.ej., FcepsilonRI).
[0185] En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de precursores de mastocitos en los tractos respiratorios superior y/o inferior en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido en la técnica. En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la proliferación de precursores de mastocitos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán, ensayo con 3H-timidina o FACS). En otros modos de realización más, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un anticuerpo de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de precursores de mastocitos en los tractos respiratorios superior y/o inferior en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido en la técnica e inhiben y/o reducen la proliferación de precursores de mastocitos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán, ensayo con 3H-timidina o FACS). En un modo de realización preferido, la infiltración de precursores de mastocitos puede medirse in vivo mediante el ensayo de infiltración de mastocitos descrito arriba.
[0186]En determinados modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 actúan de mediadores en la disminución de células T de sangre periférica mediante la inducción de un aumento en la apoptosis de células T, especialmente de células Th2. En un modo de realización preferido, la disminución de linfocitos T Th2 puede medirse in vivo mediante la sensibilización de animales con ovoalbúmina. En
síntesis, se administran 100 μg de ovoalbúmina ligada a adyuvante de aluminio por vía subcutánea en los días 1 y
21. A lo largo del procedimiento de sensibilización de tres semanas, se administró a los animales un anticuerpo reactivo a la IL-9 o un anticuerpo control a una dosis de 10mg/kg de cada 5 a 7 días. El día 28, los animales recibieron un refuerzo de 100 μg de proteína de ovoalbúmina sin adyuvante por vía intravenosa. Dos días después del refuerzo intravenoso, se sacrificó a los animales. Se recuperaron las células del bazo y se analizaron mediante citometría de flujo. Los linfocitos T Th2 esplénicos, identificables mediante tinción citoplasmática para IL-4, deberían reducirse en los animales que reciben un anticuerpo neutralizante de IL-9 en comparación con los que reciben el anticuerpo control. En otro modo de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 median, inhiben y/o reducen la diferenciación de Th1 y Th2 en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., FACS). En determinados modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de células T, especialmente la infiltración de células Th2, en los tractos respiratorios superior y/o inferior en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la proliferación de células T en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán, ensayo con 3H-timidina o FACS). En otros modos de realización más, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de células T, especialmente la infiltración de células Th2, en los tractos respiratorios superior y/o inferior en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, inhiben y/o reducen la proliferación de células T, especialmente la proliferación de células Th2, en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, y/o aumentan la apoptosis de células T en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica.
[0187] En determinados modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 reducen la infiltración de macrófagos en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En un modo de realización preferido, las reducciones en la infiltración de macrófagos pueden medirse in vivo mediante la sensibilización de animales con ovoalbúmina. En síntesis, se administran 100 μg de ovoalbúmina ligada a adyuvante de aluminio por vía subcutánea en los días 1 y 21. A lo largo del procedimiento de sensibilización de tres semanas, se administró a los animales un anticuerpo reactivo a la IL-9 o un anticuerpo control a una dosis de 10mg/kg de cada 5 a 7 días. En los días 29, 30 y 31, se expuso a los animales a ovoalbúmina sin adyuvante administrado por aerosol, o alternativamente, mediante instilación intranasal de 100 μl de una solución 1μg/ml preparada en solución salina fosfatada (PBS). El día 31, 6 horas después de la última exposición a ovoalbúmina, se sacrificó a los animales y se fijó tejido pulmonar mediante perfusión con formalina. La infiltración de macrófagos se evalúa de forma inmunocitoquímica mediante recuento de células CD14 positivas por campo en las secciones de tejido pulmonar. En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la proliferación de macrófagos en al menos un 25%, preferiblemente, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán, ensayo con 3H-timidina o FACS). En otros modos de realización diferentes, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de macrófagos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica e inhiben y/o reducen la proliferación de macrófagos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica.
[0188] En determinados modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 reducen la infiltración de células B en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En un modo de realización preferido, las reducciones en la infiltración de linfocitos B puede medirse in vivo mediante la sensibilización de forma sistemática de animales con ovoalbúmina. En síntesis, se administran 100 μg de ovoalbúmina ligada a adyuvante de aluminio por vía subcutánea en los días 1 y 21. A lo largo del procedimiento de sensibilización de tres semanas, se administró a los animales un anticuerpo reactivo a la IL-9 o un anticuerpo control a una dosis de 10 mg/kg de cada 5 a 7 días. En los días 29, 30 y 31, se expuso a los animales a ovoalbúmina sin adyuvante administrado por aerosol, o alternativamente, mediante instilación intranasal de 100 μl de una solución 1μg/ml preparada en solución salina fosfatada (PBS). El día 31, 6 horas después de la última exposición a ovoalbúmina, se sacrificó a los animales y se fijó tejido pulmonar mediante perfusión con formalina. La infiltración de linfocitos B se evalúa de forma inmunocitoquímica mediante recuento de células CD19 positivas por campo en las secciones de tejido pulmonar. En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la proliferación de células B en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán, ensayo con 3H-timidina o FACS). En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de células B en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica e inhibe y/o reduce la proliferación de células B en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica.
[0189] En determinados modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 reducen la infiltración de eosinófilos en los tractos respiratorios superior y/o inferior en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (véase, p.ej., Li et al., 2000, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25:644-51). En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la proliferación de eosinófilos, en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí (véase Sección 5.6) o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán, ensayo con3H-timidina o FACS). En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de eosinófilos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica e inhibe y/o reduce la proliferación de eosinófilos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica.
[0190] En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 reducen la infiltración de neutrófilos en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En otros modos de realización, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la proliferación de nuetrófilos, en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., un ensayo con azul tripán, ensayo con 3H-timidina o FACS). En otros modos de realización más, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 inhiben y/o reducen la infiltración de nuetrófilos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica e inhibe y/o reduce la proliferación de nuetrófilos en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica.
[0191] En un modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 neutraliza o inhibe los efectos biológicos mediados por la IL-9 incluyendo, sin carácter limitativo, el reclutamiento de células inflamatorias, hiperplasia epitelial, producción de mucina de las células epiteliales, y activación, degranulación, proliferación y/o infiltración de mastocitos.
[0192] En un modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 actúa de manera sinérgica con un agente proteínico (p.ej., un péptido, polipéptido, o proteína (incluyendo un anticuerpo)) y/o un agente no proteínico que antagoniza la expresión, función y/o actividad de IgE para reducir o inhibir la activación, degranulación, proliferación y/o infiltración de mastocitos en al menos un 25%, preferiblemente, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica.
[0193] En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 actúa de manera sinérgica con un agente proteínico (p.ej., un péptido, polipéptido, o proteína (incluyendo un anticuerpo)) y/o un agente no proteínico que antagoniza la expresión, función y/o actividad de una proteasa de los mastocitos para reducir o inhibir la activación, degranulación, proliferación, y/o infiltración de mastocitos en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica.
[0194] En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 actúa de forma sinérgica con un agente proteínico (p.ej., un péptido, polipéptido, y proteína (incluyendo un anticuerpo)) o un agente no proteínico que antagoniza la expresión, función y/o actividad de un factor de células madre para reducir o inhibir la activación, degranulación, proliferación, y/o infiltración de mastocitos en al menos un 25%, preferiblemente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98%, en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) o un anticuerpo IgG control en un ensayo in vivo y/o in vitro descrito aquí o conocido por aquellos con habilidad en la técnica. En un modo de realización preferido, los mastocitos primarios o una línea de mastocitos se cultivan in vitro en presencia de 1 ng/ml de IL-9 más 1ng/ml de factor de células madre. Los niveles de referencia de proteasa (p.ej., quimasa y triptasa) y leucotrienos se determinan en el sobrenadante mediante kits de ELISA disponibles en el mercado. La capacidad de los anticuerpos de modular los niveles de proteasa o leucotrienos se evalúa añadiendo anticuerpo reactivo a la IL-9 o anticuerpo control directamente a los cultivos
celulares a una concentración de 1 μm/ml. Los niveles de proteasa y leucotrienos se evalúan a las 24 y 36 horas.
[0195] Los anticuerpos de la presente invención que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de una multiespecificidad mayor. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido de IL-9 o pueden ser específicos para un polipéptido de IL-9 así como para un epítopo heterólogo, como un polipéptido heterólogo o material de apoyo sólido. Véase, p.ej., las publicaciones internacionales WO 93/17715, WO 92/08802, WO91/00360, y WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); patentes estadounidenses nº 4.474.893, 4.714.681, 4.925.648, 5.573.920, y 5.601.819; y Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).
[0196] La presente invención proporciona anticuerpos que tienen una alta afinidad de enlace a un polipéptido de IL
9. En un modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de
IL-9 tiene una constante de velocidad de asociación o velocidad kon (anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag)
Ab-Ag) de al menos 105 M-1s-1, al menos 1,5 X 105 M-1s-1, al menos 2 X 105 M-1s-1, al menos 2,5 X 105 M-1s-1, al menos 5 X 105 M-1s-1, al menos 106 M-1s-1, al menos 5 X 106 M-1s-1, al menos 107 M-1s-1, al menos 5 X 107 M-1s-1, o al menos 108 M-1s-1, o 105 - 108 M-1s-1, 1,5 X 105 M-1s-1 - 1 X 107 M-1s-1, 2 X 105 - 1 X 106 M-1s-1, o 4,5 X 105 X 107M-1s-1.En un modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 tiene una kon de al menos 2 X 105 M-1s-1, al menos 2,5 X 105 M-1s-1, al menos 5 X 105 M-1s-1, al menos 106 M-1s-1, al menos 5 X 106 M-1s-1, al menos 107 M-1s-1, al menos 5 X 107 M-1s-1, o al menos 108 M-1s-1 determinado mediante un ensayo BIAcore y el anticuerpo neutraliza la IL-9 humana en el ensayo de microneutralización aquí descrito. En un modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 tiene una kon de
M-1M-1M-1-1
como máximo 108 s-1, como máximo 109 s-1, como máximo 1010 s-1, como máximo 10" M-1s,o como máximo 1012 M-1s-1, determinado mediante un ensayo BIAcore y el anticuerpo neutraliza la IL-9 humana en el ensayo de microneutralización descrito aquí. Según estos modos de realización, tales anticuerpos pueden comprender un dominio VH y/o un dominio VL de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5 o 7F3com-3D4 o una VH CDR y/o una VL CDR de 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5 o 7F3com-3D4.
[0197] En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9
tiene una velocidad koff (anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag)
Ab-Ag) de menos de 2 x 10-4 s-1, menos de 5 X 10-4 s-1, menos de 10-5 s-1, menos de 5 X 10-5 s-1, menos de 10-6 s-1, menos de 5 X 10-6 s-1, menos de 10-7 s-1 , menos de 5 X 10-7s-1, menos de 10-8 s-1, menos de 5 X 10-8 s-1, menos de 10-9 s-1, menos de 5 X 10-9 s-1, o menos de 10-10 s-1, o 10-5 -10-8 s-1. En un modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 tiene una koff de 10-5 s-1, menos de 5 X 10-5 s-1, menos de 10-6 s-1, menos de 5 X 10-6 s-1, menos de 10-7 s-1, menos de 5 X 10-7 s-1, menos de 10-8 s-1, menos de 5 X 10-8 s-1, menos de 10-9 s-1, menos de 5 X 10-9 s-1,
o menos de 10-10 s-1, determinado mediante un ensayo BIAcore y el anticuerpo neutraliza la IL-9 humana en el ensayo de microneutralización aquí descrito. En otro modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 tiene una koff de más de 10-13 s-1, más de 10-12 s-1, más de 10-11 s-1, más de 10-10s-1, más de 10-9 s-1, o más de 10-8 s-1.
[0198] En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 tiene una constante de afinidad o Ka (kon/koff) de al menos 102 M-1, al menos 5 X 102 M-1, al menos 103 M-1, al menos 5 X 103 M-1, al menos 104 M-1, al menos 5 X 104 M-1, al menos 105 M-1, al menos 5 X 105 M-1, al menos 106 M-1, al menos 5 X 106 M-1, al menos 107 M-1, al menos 5 X 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 X 108 M-1, al menos 109 M1, al menos 5 X 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 X 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 X 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 5 X 1012 M-1, al menos 1013 M-1, al menos 5 X 1013 M-1, al menos 1014 M-1, al menos 5 X 1014 M-1, al menos 1015 M-1, o al menos 5 X 1015 M-1, o 102 -5 X 105 M-1, 104 -1 X 1010 M-1, o 105 -1 X 108 M-1. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 tiene una Ka de como máximo 1011 M-1, como máximo 5 X 1011 M-1, como máximo 1012 M-1, como máximo 5 X 1012 M-1, como máximo 1013 M-1, como máximo 5 X 1013 M-1, como máximo 1014 M-1, o como máximo 5 X 1014 M-1. En otro modo de realización, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 tiene una constante de disociación o Kd (koff/kon) de menos de 10-9 M, menos de 5 X 10-9 M, menos de 10-10 M, menos de 5 X 10-10 M, menos de 10-11 M, menos de 5 X 10-11 M, menos de 10-12 M, menos de 5 X 10-12 M, menos de 10-13 M, menos de 5 X 10-13 M, menos de 10-14 M, menos de 5 X 10-14 M, menos de 10-15 M, o menos de 5 X 10-15 M o 10-2 M -5 X 10-5 M, 10-6 10-15 M, o 10-8 - 10-14 M. En un modo de realización preferido, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 tiene una Kd de menos de 10-9 M, menos de 5 X 10-9 M, menos de 10-10 M, menos de 5 X 1010 M, menos de 1 X 10-11 M, menos de 5 X 10-11 M, menos de 1 X 10-12 M, menos de 5 X 10-12 M, menos de 10-13 M, menos de 5 X 10-13 M o menos de 1 X 10-14 M, o 10-9 M- 10-14 M determinado mediante un ensayo BIAcore y el anticuerpo neutraliza la IL-9 humana en el ensayo de microneutralización aquí descrito.
[0199] En determinados modos de realización, los anticuerpos de la invención no incluyen anticuerpos conocidos en la técnica que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos conocidos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 incluyen 4D4, 4D4 H2-1 D11, 4D4com-XF-9, 4D4com-2F9, 7F3, 71A10, 7F3 22D3, 7F3com-2H2, 7F3com-3H5 o 7F3com-3D4.
[0200] En modos de realización específicos, los anticuerpos de la invención se unen a péptidos y polipéptidos de IL9 que contienen el epítopo antigénico, y dichos polipéptidos y péptidos que contienen el epítopo antigénico comprenden o constan de una secuencia de aminoácidos, de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferiblemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, y preferiblemente, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de IL-9 encontrados en cualquier especie. Los polipéptidos preferidos que comprenden los epítopos antigénicos o inmunogénicos tiene una longitud de al menos 8, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, o al menos 35 residuos de aminoácidos.
[0201] Los polipéptidos y péptidos que contienen el epítopo de IL-9, y fragmentos de los mismos, pueden producirse mediante cualquier técnica convencional. Véase, p.ej., Houghten, R. A. (1985) “General method for the rapid solidphase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5 13 1-5 135; este proceso de “Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)” (síntesis múltiple y simultánea de péptidos) se describe en mayor medida en U
5.1.1 Anticuerpos con vida media aumentada
[0202] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 que tiene una vida media in vivo ampliada. En particular, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 que tiene una vida media en un sujeto, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un ser humano, de más de 3 días, más de 7 días, más de 10 días, preferiblemente más de 15 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 4 meses, o más de 5 meses.
[0203] Para prolongar la circulación de anticuerpos en el suero (p.ej., anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos fab) in vivo, por ejemplo, se pueden unir moléculas de polímero inerte como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular a los anticuerpos con o sin enlazador multifuncional bien mediante conjugación de sitio específico del PEG al extremo N-terminal o C-terminal de los anticuerpos, o bien mediante grupos épsilon-amino presentes en los residuos de lisina. Se usará la derivatización de polímeros lineales o ramificados que resulta en una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación puede monitorizarse de forma rigurosa mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) y espectrometría de masas para asegurar la conjugación adecuada de las moléculas de PEG a los anticuerpos. El PEG que no ha reaccionado puede separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico. Los anticuerpos derivatizados con PEG pueden someterse a ensayos de actividad de enlace así como de eficacia in vivo utilizando los métodos conocidos por aquellos con habilidad en la técnica, por ejemplo, mediante los inmunoensayos aquí descritos.
[0204] Los anticuerpos que tienen una vida media in vivo aumentada pueden generarse también introduciendo una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o deleciones) en un dominio constante de la IgG, o fragmento de enlace al receptor de Fc neonatal (FcRn) del mismo (preferiblemente un Fc o fragmento del dominio bisagra Fc). Véase, p.ej., la publicación internacional nº WO 98/23289; la publicación internacional nº WO 97/34631; la publicación internacional WO 02/060919; y la patente estadounidense nº 6.277.375, quedando todas ellas incorporadas aquí mediante referencia.
[0205] Además, los anticuerpos pueden conjugarse a albúmina para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo o tenga una vida media in vivo más larga. Las técnicas son conocidas en la técnica, véase, p.ej., las publicaciones internacionales nº WO 93/15199, WO 93/15200, y WO 01/77137; y la patente europea nº EP 413.622, quedando todas ellas incorporadas aquí mediante referencia.
5.1.2 Conjugados de anticuerpos
[0206] La presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 fusionado de forma recombitante o conjugado químicamente (incluyendo tanto conjugaciones covalentes como no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento de los mismos, preferiblemente a un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión.
En particular, la invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo aquí descrito (p.ej., un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una VH CDR, un dominio VL o una VL CDR) y un péptido, polipéptido o proteína heterólogos. Preferiblemente, la proteína, polipéptido, o péptido heterólogos a los que se fusiona el anticuerpo o fragmento de anticuerpo son útiles para dirigir el anticuerpo a las células epiteliales de las vías respiratorias, mastocitos, neutrófilos, eosinófilos, células B, macrófagos o células T activadas. Por ejemplo, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un receptor de la superficie celular expresado por un tipo de células concreto (p.ej., una célula epitelial de las vías respiratorias, un mastocito, un neutrófilo, un eosinófilo, una célula B, un macrófago, o una célula activada T) puede fusionarse o conjugarse a un anticuerpo o fragmento de la invención. En un modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 se fusiona o conjuga a antifactor de las células madre o un anti-ligando kit. Los métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos o péptidos a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo son conocidos en la técnica. Véase, p.ej., las patentes estadounidenses nº 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 y 5.112.946; las patentes europeas nº EP 307.434 y EP 367.166; las publicaciones internacionales WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; y Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 (dichas referencias quedan aquí incorporadas mediante referencia en su totalidad).
[0207] Pueden generarse proteínas de fusión adicionales por medio de las técnicas de barajado de genes, barajado de motivos (motif-shuffling), barajado de exones y/o barajado de codones (denominados de forma colectiva como
“barajado de ADN”). El barajado de ADN puede utilizarse para alterar las actividades de los anticuerpos de la
invención o fragmentos de los mismos (p.ej., anticuerpos o fragmentos de los mismos con mayores afinidades y menores tasas de disociación). Véase, en general, las patentes estadounidenses nº 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Se pueden alterar anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, sometiéndolos a la mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a error, inserción de nucleótidos aleatoria u otros métodos previos a la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una o más moléculas heterólogas.
[0208] Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos puede fusionarse a secuencias de marcadores, como un péptido para facilitar la purificación. En los modos de realización preferidos, la secuencia de aminoácidos marcadores es un péptido de hexahistidina, como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales se encuentran disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por ejemplo, la hexahistidina asegura la purificación conveniente de las proteínas de fusión. Otras etiquetas de péptido útiles para la purificación incluyen, sin carácter limitativo, la etiqueta de hemaglutinina (“HA”), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de la influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), y la etiqueta “flag”.
[0209] En otros modos de realización, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos se conjugaron a un agente de diagnóstico o detectable. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para controlar o pronosticar la aparición, desarrollo, avance y/o gravedad de una enfermedad o trastorno (p.ej., un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio, un trastorno proliferativo o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) como parte de un procedimiento de ensayos clínicos, como puede ser determinando la eficacia de una terapia concreta. Dicho diagnóstico y detección puede lograrse combinando el anticuerpo a sustancias detectables incluyendo, sin carácter limitativo, diversas enzimas, como, sin carácter limitativo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, como por ejemplo, sin carácter limitativo, estreptavidina-biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, por ejemplo, sin carácter limitativo, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, por ejemplo, sin carácter limitativo, luminol; materiales bioluminiscentes, como por ejemplo, sin carácter limitativo, luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radioactivos, como por ejemplo, sin carácter limitativo, yodo (131I, 125I, 123I, y 121I,), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, y 111In,), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenon (133Xe) flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, y 117Sn; metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías por emisión de positrones, y iones metálicos paramagnéticos y no radiactivos.
[0210] La presente invención también abarca los usos de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados a una fracción terapéutica. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse a una fracción terapéutica como la citotoxina, p.ej., agentes citostáticos o citocidales, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, p.ej., emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que resulta perjudicial para las células. Las fracciones terapéuticas incluyen, sin carácter limitativo, antimetabolitos (p.ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo dacarbazina); agentes alquilantes (p.ej., mecloretamina, tiotepa clorambucil, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-dicloro-diamina-platino (II) (DDP), y cisplatino); antraciclinas (p.ej., daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina); antibióticos (p.ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)); moléculas de auristatina (p.ej., auristatina PHE, briostatina 1 y solastatina 10; véase Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735-40 (2001), Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:7680 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999), quedando todos ellos incorporados aquí mediante referencia); hormonas (p.ej., glucocorticoides, progestinas, andrógenos y estrógenos ), inhibidores de enzimas de reparación de ADN (p.ej., etopósido o topotecán), inhibidores de quinasas (p.ej., compuesto ST1571, mesilato de imatinib (Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002)); agentes citotóxicos (paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracin-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1dihidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y purimicina y análogos u homólogos de los mismos y aquellos compuestos revelados en las patentes estadounidenses nº 6.245.759, 6.399.633, 6.383.790, 6.335.156, 6.271.242, 6.242.196, 6.218.410, 6.218.372, 6.057.300, 6.034.053, 5.985.877, 5.958.769, 5.925.376, 5.922.844, 5.911.995, 5.872.223, 5.863.904, 5.840.745, 5.728.868, 5.648.239, 5.587.459); inhibidores de farnesil transferasa (p.ej., R115777, BMS-214662, y aquellos revelados por ejemplo en las patentes estadounidenses nº: 6.458.935, 6.451.812, 6.440.974, 6.436.960, 6.432.959, 6.420.387, 6.414.145, 6.410.541, 6.410.539, 6.403.581, 6.399.615, 6.387.905, 6.372.747, 6.369.034, 6.362.188, 6.342.765, 6.342.487, 6.300.501, 6.268.363, 6.265.422, 6.248.756, 6.239.140, 6.232.338, 6.228.865, 6.228.856, 6.225.322, 6.218.406, 6.211.193, 6.187.786, 6.169.096, 6.159.984, 6.143.766, 6.133.303, 6.127.366, 6.124.465, 6.124.295, 6.103.723, 6.093.737, 6.090.948, 6.080.870, 6.077.853, 6.071.935, 6.066.738, 6.063.930, 6.054.466, 6.051.582, 6.051.574 y 6.040.305); inhibidores de topoisomerasa (p.ej., camptotecina; irinotecán; SN-38; topotecán; 9-aminocamptotecina; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; IST-622; rubitecan; pirazoloacridina; XR-5000; saintopin; UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB-506; ED-110; NB-506; y rebecamicina); bulgarein; ligandos de unión al surco menor del ADN como tinte de Hoescht 33342 y tinte de Hoescht 33258; nitidina; fagaronina; epiberberina; coralina; beta-lapachona; BC-4-1; bifosfonatos (p.ej., alendronato, cimadronte, clodronato, tiludronato, etidronato, ibandronato, neridronato, olpandronato, risendronato, piridronato, pamidronato, zolendronato) inhibidores de la HMG-CoA reductasa (p.ej., lovastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, fluvastatina, estatina, cerivastatina, lescol, lipitor, rosuvastatina y atorvastatina); oligonucleótidos antisentido (p.ej., aquellos revelados en las patentes estadounidenses nº 6.277.832, 5.998.596, 5.885.834, 5.734.033 y 5.618.709); inhibidores de adenosina deaminasa (p.ej., fosfato de Fludarabina y 2-clorodeoxiadenosina); ibritumomab tiuxetan (Zevalin®); tositumomab (Bexxar®)) y solvatos, clatratos, profármacos y sales farmacéuticamens aceptables de los mismos.
[0211] Además, un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse a una fracción terapéutica o fracción de fármaco que modifica una respuesta biológica dada. Las fracciones terapéuticas o fracciones de fármacos no deben interpretarse como limitadas a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción del fármaco puede ser una proteína, péptido o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina, toxina del cólera, toxina de la difería; una proteína como un factor de necrosis tumoral, α-interferón, β-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno, agente apoptótico, p.ej., TNF-α, TNF-β, AIM I (véase, publicación internacional nº WO 97/33899), AIM II (véase, publicación internacional nº WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574), y VEGF (véase, publicación internacional nº WO 99/23105), un agente antiangiogénico, p.ej., angiostatina, endostatina o un componente de la vía de coagulación (p.ej., factor tisular); o, un modificador de la respuesta biológica como, por ejemplo, una linfocina (p.ej., interferón gamma (“IFN-y”), interleucina 1 (“IL-1”), interleucina 2 (“IL-2”), interleucina 5 (“IL-5”), interleucina 6 (“IL-6”), interleucina 7 (“IL-7”), interleucina 10 (“IL-10”), interleucina 12 (“IL-12”), interleucina 15 (“IL-15”), interleucina 23 (“IL23”), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (“GM-CSF”), y factor estimulador de colonias de granulocitos (“G-CFS”)), o un factor de crecimiento (p.ej., hormona del crecimiento (“GH”), o un agente de coagulación (p.ej., calcio, vitamina K, factores tisulares, por ejemplo, sin carácter limitativo, factor de Hageman (factor XII), cininógeno de alto peso molecular (HMWK, por sus siglas en inglés), precalicreína (PK), factores de proteínas de coagulación II (protrombina), factor V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa” IX, IXa, X, fosfolípido, fibrinopéptidos A y B de las cadenas α y β de fibrinógeno, monómero de fibrina). En un modo de realización específico, un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 se conjuga con un antagonista de leucotrienos (p.ej., montelukast, zafirlukast, pranlukast y zileutón).
[0212] Además, un anticuerpo puede conjugarse a fracciones terapéuticas como un ión metálico radiactivo, como emisores alfa como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles para la conjugación de iones radio metálicos, incluyendo, sin carácter limitativo, 131In, 131L, 131Y, 131Ho, 131Sm, a polipéptidos o cualquiera de aquellos incluido en la lista supra. En determinados modos de realización, el quelante macrocíclico es ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano-N, N’, N’’, N’’’-tetraacético (DOTA) que puede unirse al anticuerpo mediante una molécula de unión. Dichas moléculas de unión se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin. Cancer Res. 4(10):248390; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.
[0213] Las técnicas para conjugar fracciones terapéuticas a anticuerpos son conocidas, véase, p.ej., Arno et al.,
“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfield et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2º Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical
Applications, Pinchera et al. (eds), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.
[0214] Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado como describe Segal en la patente estadounidense nº 4.676.980, que queda incorporada aquí en su totalidad mediante referencia.
[0215] La fracción terapéutica o fármaco conjugado a un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 o fragmento del mismo debe elegirse de forma que logre el efecto o efectos terpaéuticos o profilácticos deseados para una enfermedad o trastorno concreto asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, enfermedades o trastornos asociados a o caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, o enfermedades inflamatorias. El clínico o el personal médico debe considerar lo siguiente a la hora de decidir qué fracción terapéutica o fármaco conjugar a un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 o fragmento del mismo: la naturaleza de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad y el estado de salud del sujeto.
[0216] Los anticuerpos pueden unirse también a soportes sólidos, los cuales resultan especialmente útiles en los inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, sin carácter limitativo, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
5.2 TERAPIAS ÚTILES EN COMBINACIÓN CON ANTICUERPOS DE IL-9
[0217] La presente invención proporciona también usos para prevenir, controlar, tartar y/o mejorar enfermedades y trastornos incluyendo, sin carácter limitativo, trastornos caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante de IL9, trastornos caracterizados por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria que comrpende la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y una o más terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) diferentes de los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9. La presente invención proporciona también composiciones que comprenden uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos diferentes de los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un péptido de IL-9 y usos para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar una enfermedad o trastorno utilizando dichas composiciones. Los agentes profilácticos o terapéuticos incluyen, sin carácter limitativo, pequeñas moléculas, fármacos sintéticos, péptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos (p.ej., nucleótidos del ADN y ARN incluyendo, sin carácter limitativo, secuencias de nucleótidos antisentido, hélices triples, ARNi y secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos, péptidos o proteínas biológicamente activos) anticuerpos, moléculas inorgánicas sintéticas o naturales, agentes miméticos y moléculas orgánicas sintéticas o naturales.
[0218] Cualquier terapia (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de la que se conozca su utilidad, o que haya sido usada o se esté usando actualmente para la prevención, control, tratamiento, o mejora de uno o más síntomas asociados a un trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno o enfermedad asociada a la expresión y/o actividad de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, o un trastorno inflamatorio, puede utilizarse en combinación con un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 según la invención descrita aquí. Véase, p.ej., Gilman et al., Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10º Ed. , McGraw-Hill, New York, 2001; The Merk Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M.D. et al. (eds.), 17º Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, NJ, 1999; y Cecil Textbook of Medicine, 20º Ed., Bennett and Plum (eds.), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996 para información sobre terapias, en especial agentes profilácticos y terapéuticos, que han sido o son actualmente utilizados para prevenir, tartar, controlar y/o mejorar trastornos asociados a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, trastornos asociados a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, o un trastorno inflamatorio. Los ejemplos de agentes profilácticos y terapéuticos incluyen, sin carácter limitativo, agentes inmunomoduladores, agentes antiinflamatorios (p.ej., adrenocorticoides, corticosteroides (p.ej., beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, triamcinolona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, hidrocortisona), glucocorticoides, esteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (p.ej., aspirina, ibuprofeno, diclofenaco e inhibidores de COX-2), antagonistas de los leucotrienos (p.ej., montelukast, metilxantinas, zafirlukast y zileutón), antagonistas beta 2 (p.ej., albuterol, biterol, fenoterol, isoetarina, metaproterenol, pirbuterol, salbutamol, terbutalina, formoterol, salmeterol, y terbutalina salbutamol), agentes anticolinérgicos (p.ej., bromuro de ipratropio y bromuro de oxitropio), sulfasalazina, penicilamina, dapsona, antihistamínicos, agentes contra la malaria (p.ej., hidroxicloroquina, agentes antivirales, y antibióticos (p.ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, eritromicina, penicilina, mitramicina, y antramicina (AMC)).
5.2.1 Terapias inmunomoduladoras
[0219] En los métodos y composiciones de la invención puede utilizarse cualquier agente inmunomodulador conocido por aquellos con habilidad en la técnica. Los agentes inmunomoduladores pueden afectar a uno o más o todos los aspectos de la respuesta inmune en un sujeto. Los aspectos de la respuesta inmune incluyen, sin carácter limitativo, la respuesta inflamatoria, la cascada del complemento, diferenciación de leucocitos y linfocitos, proliferación y/o función efectora, recuentos de monocitos y/o basófilos, y la comunicación celular entre células del sistema inmune. En determinados modos de realización, un agente inmunomodulador modula un aspecto de la respuesta inmune. En otros modos de realización, un agente inmunomodulador modula más de un aspecto de la respuesta inmune. En un modo de realización preferido de la invención, la administración de un agente inmunomodulador a un sujeto inhibe o reduce uno o más aspectos de la capacidad de respuesta inmune del sujeto. En un modo de realización específico de la invención, el agente inmunomodulador inhibe o reprime la respuesta inmune en un sujeto. Según la invención, el agente inmunomodulador no es un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9. En determinados modos de realización, el agente inmunomodulador no es un agente antiinflamatorio. En determinados modos de realización, el agente inmunomodulador no es un agente antiangiogénico. En otros modos de realización, el agente inmunomodulador no es un antagonista de la integrina αvβ3. En otros modos de realización, un agente inmunomodulador no es un antagonista del TNF α. En determinados modos de realización, un agente inmunomodulador es un agente quimioterapéutico. En determinados modos de realización, un agente inmunomodulador no es un agente quimioterapéutico.
[0220] Los ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen, sin carácter limitativo, agentes proteínicos como citocinas, péptidomiméticos y anticuerpos (p.ej., humanos, humanizados, quiméricos, monoclonales, policlonales, fragmentos F(ab) 2, Fvs, scFvs o Fab o fragmentos de unión al epítopo), moléculas de ácido nucleico (p.ej., moléculas de ácido nucleico antisentido y hélices triples), moléculas pequeñas, compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos. En particular, los agentes inmunomoduladores incluyen, sin carácter limitativo, metotrexato, leflunomida, ciclofosfamida, citoxan, Immuran, ciclosporina A, minociclina, azatioprina, antibióticos (p.ej., FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP), corticosteroides, esteroides, mofetil micofenolato, rapamicina (sirolimus), mizoribina, deoxispergualina, brequinar, malononitriloamidas (p.ej., leflunomida), moduladores de receptores de células T, moduladores de receptores de citocinas y moduladores de mastocitos.
[0221] Para una mayor aclaración con respecto a los moduladores de receptores de células T, moduladores de receptores de citocina y moduladores de mastocitos véase la Sección 3.1. Los ejemplos de moduladores de receptores de células T incluyen, sin carácter limitativo, anticuerpos anti-receptores de células T (p.ej., anticuerpos anti-CD4 (p.ej, cM-T412 (Boeringer), IDEC-CE9.1® (IDEC y SKB), mAB 4162W94, Orthoclone y OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), anticuerpos anti-CD3 (p.ej., Nuvion (Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson) o Rituxan (IDEC)), anticuerpos anti-CD5 (p.ej., inmunoconjugado anti-CD5 unido a ricina), anticuerpos anti-CD7 (p.ej., CHH380 (Novartis)), anticuerpos anti-CD8, anticuerpos monoclonales anti-ligando CD40 (p.ej., IDEC-131 (IDEC)), anticuerpos anti-CD52 (p.ej., CAMPATH 1H (IIex)), anticuerpos anti-CD2 (p.ej., siplizumab (MedImmune, Inc., publicaciones internacionales nº WO 02/098370 y WO 02/069904)), anticuerpos anti-CD11a (p.ej., Xanelim (Genentech)), y anticuerpos anti-B7 (p.ej., IDEC-114) (IDEC))), inmunoglobulina CTLA4 y LFA-3TIP (Biogen, publicación internacional nº WO 93/08656 y patente estadounidense nº 6.162.432).
[0222] Los ejemplos de moduladores de receptores de citocinas incluyen, sin carácter limitativo, receptores solubles de citocinas (p.ej., el dominio extracelular de un receptor del TNF-α o un fragmento del mismo, el dominio extracelular de un receptor de IL-1β o un fragmento del mismo, y el dominio extracelular de un receptor de IL-6 o un fragmento del mismo), citocinas o fragmentos de las mismas (p.ej., interleucina IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-23, TNF-α, TNF-β, interferón (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ y GM-CSF), anticuerpos anti-receptor de citocina (p.ej., anticuerpos anti-receptor de IFN, anticuerpos anti-receptor de IL-2 (p.ej., Zenapax (Protein Design Labs)), anticuerpos anti-receptor de IL-3, anticuerpos anti-receptor de IL-4, anticuerpos anti-receptor de IL-6, anticuerpos anti-receptor de IL-10, anticuerpos anti-receptor de IL-12, anticuerpos anti-receptor de IL-13, anticuerpos anti-receptor de IL-15 y anticuerpos anti-receptor de IL-23), anticuerpos anti-citocinas (p.ej., anticuerpos anti-IFN, anticuerpos anti-TFN-α, anticuerpos anti-IL-1β, anticuerpos anti-IL-3, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos antiIL-8 (p.ej., ABX-IL-8 (Abgenix)), anticuerpos anti-IL-12, anticuerpos anti-IL-13, anticuerpos anti-IL-15 y anticuerpos anti-IL-23).
[0223] En un modo de realización específico, un modulador de receptores de citocinas es IL-3, IL-4, IL-10 o un fragmento de las mismas. En otro modo de realización, un modulador de receptores de citocinas es un anticuerpo anti-IL-1β, anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo anti-receptor de IL-12 o anticuerpo anti-TNF-α. En otro modo de realización, un modulador de receptores de citocinas es el dominio extracelular de un receptor de TNF-α o un fragmento del mismo. En determinados modos de realización, un modulador de receptores de citocinas no es un antagonista de TNF-α.
[0224] En un modo de realización, un modulador de receptores de citocinas es un modulador de mastocitos. En un modo de realización alternativo, un modulador de receptores de citocinas no es un modulador de mastocitos. Los ejemplos de moduladores de mastocitos incluyen, pero sin carácter limitativo, inhibidores del factor de células madre (ligando del receptor c-kit) (p.ej., mAb 7H6, mAb 8H7a, pAb 1337, FK506, CsA, dexametasona y fluconcinonida), inhibidores de receptores c-kit (p.ej., STI571 (antes conocido como CGP 57148B)), inhibidores de proteasa de los mastocitos (p.ej., GW-45, GW-58, wortmanina, LY 294002, calfostina C, citocalasina D, genisteína, KT5926, estaurosporina y lactoferrina), relaxina (“RLX”), antagonistas de IgE (p.ej., anticuerpos rhuMAv-E25 omalizumab, HMK-12 y 6HD5, y mAB Hu-901), antagonistas de IL-3, antagonistas de IL-4, antagonistas de IL-10 y TGF-beta.
[0225] Un agente inmunomodulador puede seleccionarse de forma que interfiera en las interacciones entre subgrupos de células T colaboradoras (TH1 o TH2) y células B para inhibir la formación de anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos que interfieren en o bloquean las interacciones necesarias para la activación de células B por células TH (T colaboradoras), y bloquean así la producción de anticuerpos neutralizantes, resultan útiles como agentes inmunomoduladores en los métodos de la invención. Por ejemplo, la activación de células B por células T exige que ocurran determinadas interacciones (Durie et al., Immunol. Today, 15(9):406-410 (1994)), como la unión del ligando CD40 en la célula T colaboradora al antígeno CD40 en la célula B, y la unión del ligando CD28 y/o CTLA4 en la célula T al antígeno B7 en la célula B. Sin ambas interacciones, la célula B no puede activarse para inducir la producción del anticuerpo neutralizante.
[0226] La interacción del ligando CD40 (CD40L)-CD40 es un factor deseable para bloquear la respuesta inmune debido a su amplia actividad tanto en la activación y función de células T colaboradoras como en la ausencia de redundancia en la vía de señalización. Por tanto, en un modo de realización específico de la invención, la interacción de CD40L con CD40 queda bloqueada de manera transitoria en el momento de la administración de uno o más de los agentes inmunomoduladores. Esto puede lograrse mediante el tratamiento con un agente que bloquea el ligando CD40 en la célula TH e interfiere con el enlace normal del ligando CD40 en la célula T colaboradora con el antígeno CD40 en la célula B. Un anticuerpo para el ligando CD40 (anti-CD40L) (disponible en Bristol-Myers Squibb Co; véase, p.ej., la solicitud de patente europea 555.880, publicada el 18 de agosto de 1993) o una molécula de CD40 soluble pueden seleccionarse y utilizarse como un agente inmunomodulador según los métodos de la invención.
[0227] Un agente inmunomodulador puede seleccionarse de forma que inhiba la interacción entre las células TH 1 y los linfocitos T citotóxicos (“CTLs”) para reducir la incidencia de la destrucción celular mediada por CTL. El agente inmunomodulador puede seleccionarse de forma que altere (p.ej. inhiba o reprima) la proliferación, diferenciación, actividad y/o función de lás células T CD4+ y/o CD8+. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos específicos para células T como agentes inmunomoduladores para reducir, o alterar la proliferación, diferenciación, actividad y/o función de las células T CD4+ y/o CD8+.
[0228] En un modo de realización de la invención, el agente inmunomodulador que reduce o disminuye las células T, preferiblemente las células T de memoria, se administra a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad
o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) según los métodos de la invención. Véase, p.ej., la patente estadounidense nº 4.658.019. En otro modo de realización de la invención, el agente inmunomodulador que inactiva las células T CD8+ se administra a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a
o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, según los usos de la invención. En un modo de realización específico, los anticuerpos anti-CD8 se utilizan para reducir o disminuir las células T CD8+.
[0229] En otro modo de realización, el agente inmunomodulador que reduce o inhibe una o más actividades biológicas (p.ej., la diferenciación, proliferación, y/o funciones efectoras) de subgrupos TH0, TH1 y/o TH2 de células T colaboradoras CD4+ se administra a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria según los métodos de la invención. Un ejemplo de dicho agente inmunomodulador es la IL-4. La IL-4 mejora la actividad específica del antígeno de las células TH2 en detrimento de la función de las células TH1 (véase, p.ej. Yokota et al, 1986 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:5894-5898; y la patente estadounidense nº 5.017.691). Otros ejemplos de agentes inmunomoduladores que afectan a la actividad biológica (p.ej., proliferación, diferenciación y/o funciones efectoras) de las células T colaboradoras (en especial, células TH1 y/o TH2) incluyen, sin carácter limitativo, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-23, e interferón (IFN)-γ.
[0230] En otro modo de realización, el agente inmunomodulador administrado a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) según los métodos de la invención es una citocina que previene la presentación de antígenos. En un modo de realización específico, el agente inmunomodulador utilizado en los métodos de la invención es IL-10. La IL-10 también reduce o inhibe la acción de los macrófagos que implica la eliminación bacteriana.
[0231] El agente inmunomodulador puede seleccionarse de forma que reduzca o inhiba la activación, degranulación, proliferación y/o infiltración de mastocitos. En determinados modos de realización, el agente inmunomodulador interfiere en las interacciones entre mastocitos y agentes activadores de los mastocitos, incluyendo, sin carácter limitativo, factores de células madre (ligandos c-kit), IgE, IL-4, irritantes ambientales y agentes infecciosos. En un modo de realización específico, el agente inmunomodulador reduce o inhibe la respuesta de los mastocitos a los irritantes ambientales como, sin carácter limitativo, polen, ácaros del polvo, humo del tabaco y/o caspa de mascotas.
En otro modo de realización específico, el agente inmunomodulador reduce o inhibe la respuesta de mastocitos a agentes infecciosos, como virus, bacterias y hongos. Los ejemplos de moduladores de mastocitos que reducen o inhiben la activación, degranulación, proliferación y/o infiltración de mastocitos incluye, sin carácter limitativo, inhibidores del factor de células madre (ligando del receptor c-kit) (p.ej., mAb 7H6, mAb 8H7a y pAb 1337 (véase Mendiaz et al., 1996, Eur J Biochem 293(3):842-849), FK506 y CsA (Ito et al., 1999 Arch Dermatol Res 291 (5):275283), dexametasona y fluconcinonida (véase Finooto et al. J Clin Invest 1997 99(7):1721-1728)), inhibidores del receptor c-kit (p.ej., STI 571 (antes conocidos como CGP 57148B) (véase Heinrich et al., 2000 Blood 96(3):925932)), inhibidores de proteasas de los mastocitos (p.ej., GW-45 y GW-58 (véase Temkin et al., 2002 J Immunol 169(5):2662-2669), wortmanina, LY 294002, calfostina C y citocalasina D (véase Vosseller et al., 1997, Mol Biol Cell 1997:909-922), genisteína, KT5926 y estaurosporina (véase Nagai et al. 1995, Biochem Biophys Res Commun 208(2):576-581), y lactoferrina (véase He et al., 2003 Biochem Pharmacol 65(6):1007-1015)), relaxina (“RLX”) (véase Bani et al., 2002 Int Immunopharmacol 2(8):1195-1294),antagonistas de IgE (p.ej., anticuerpos rhuMAb-E25 omalizumab (véase Finn et al., 2003 J Allergy Clin Immuno 111(2):278-284; Corren et al., 2033 J Allergy Clin Immuno 111(1):87-90; Busse y Neaville, 2001 Curr Opin Allergy Clin Immuno 1(1):105-108; y Tang y Powell, 2001, Eur J Pediatr 160(12):696-704), HMK-12 y 6HD5 (véase Miyajima et al., 2202 Int Arch Allergy Immuno 128(1):24-32), y mAB Hu-901 (véase van Neerven et al., 2001 Int Arch Allegry Immuno 124(1-3):400), antagonistas de IL-3, antagonistas de IL-4, antagonistas de IL-10 y TGF-beta (véase Metcalfe et al., 1995, Exp Dermatol 4(4 Pt 2):227230).
[0232] En un modo de realización preferido, las proteínas, polipéptidos o péptidos (incluyendo anticuerpos) que se utilizan como agentes inmunomoduladores se derivan de las mismas especies que el receptor de las proteínas, polipéptidos o péptidos para reducir la probabilidad de una respuesta inmune a aquellas proteínas, polipéptidos o péptidos. En otro modo de realización preferido, cuando el sujeto es un ser humano, las proteínas, polipéptidos o péptidos que se utilizan como agentes inmunomoduladores son humanos o humanizados.
[0233] Según la invención, se administran uno o más agentes inmunomoduladores a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria antes de, después de o de forma concomitante con un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9. Preferiblemente, se administran uno o más agentes inmunomoduladores en combinación con un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, o una enfermedad inflamatoria, para reducir o inhibir uno o más aspectos de la respuesta inmune según se considere necesario por aquellos con habilidad en la técnica. Puede usarse cualquier técnica conocida por aquellos con habilidad en la técnica para medir uno o más aspectos de la respuesta inmune en un sujeto particular, y determinar así cuando es necesario administrar un agente inmunomodulador a dicho sujeto. En un modo de realización preferido, se mantiene un recuento absoluto de linfocitos promedio de aproximadamente 500 células/mm3, preferiblemente 600 células/mm3, 650 células/mm3, 700 células/mm3, 750 células/mm3, 800 células/mm3, 900 células/mm3, 1000 células/mm3, 1100 células/mm3, o 1200 células/mm3 en un sujeto. En otro modo de realización preferido, a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, o una enfermedad inflamatoria, no se le administra un agente inmunomodulador si su recuento absoluto de linfocitos es de 500 células/mm3 o inferior, 550 células/mm3 o inferior, 600 células/mm3 o inferior, 650 células/mm3 o inferior, 700 células/mm3 o inferior, 750 células/mm3 o inferior, o 800 células/mm3 o inferior.
[0234] En un modo de realización preferido, se administran uno o más agentes inmunomoduladores en combinación con un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, o una enfermedad inflamatoria, para reducir o inhibir de forma transitoria uno o más aspectos de la respuesta inmune. Dicha inhibición o reducción transitoria de uno o más aspectos del sistema inmunitario puede durar horas, días, semanas, o meses. Preferiblemente, la inhibición o reducción transitoria en uno
o más aspectos de la respuesta inmune dura unas horas (p.ej., 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o 48 horas), unos días (p.ej., 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, o 14 días), o unas semanas (p.ej., 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas). La reducción o inhibición transitoria de uno o más aspectos de la respuesta inmune mejora el efecto o efectos terapéuticos y/o profilácticos de un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9.
[0235] Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas, polipéptidos, o péptido con actividad inmunomoduladora o proteínas, polipéptidos, o péptidos con actividad inmunomoduladora pueden administrarse a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, o una enfermedad inflamatoria, según los métodos de la invención. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican derivados, análogos, o fragmentos de proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad inmunomoduladora, o derivados, análogos o fragmentos de proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad inmunomoduladora pueden administrarse a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión aberrante de un IL9R o una o más subunidades del mismo, o una enfermedad inflamatoria, según la invención. Preferiblemente, dichos derivados, análogos, y fragmentos conservan la actividad inmunomoduladora de la proteína, polipéptido o péptido natural completo.
[0236] Preferiblemente, en los métodos de la invención se utilizan agentes que se encuentran disponibles en el mercado y conocidos por su función como agentes inmunomoduladores. Las actividad inmunomoduladora de un agente puede determinarse in vitro y/o in vivo mediante cualquier técnica conocida por aquellos con experiencia en la técnica, incluyendo, p.ej., ensayo CTL, ensayos de proliferación e inmunoensayos (p.ej., ELISAs) para la expresión de proteínas específicas como citocinas y moléculas coestimulantes.
5.2.2 Terapias antiangiogénicas
[0237] Puede utilizarse cualquier agente antiangiogénico conocido por aquellos con habilidad en la técnica en las composiciones y métodos de la invención. Los ejemplos no limitativos de agentes antiangiogénicos incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, proteínas de fusión, anticuerpos (p.ej., humanos, humanizados, quiméricos, monoclonales, policlonales, fragmentos Fab, Fvs, ScFvs, fragmentos F(ab)2, y fragmentos de unión al antígeno de los mismos) como anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a TNF-α, moléculas de ácido nucleico (p.ej., moléculas antisentido o hélices triples), moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, y moléculas pequeñas que reducen o inhiben la angiogénesis. En especial, los ejemplos de agentes antiangiogénicos incluyen, sin carácter limitativo, endostatina, angiostatina, apomigren, antitrombina III antiangiogénica, los fragmentos proteolíticos Nterminal de 29 kDa y C-terminal de 40 kDa de fibronectina, antagonista del receptor de uPA, el fragmento proteolítico de 16 kDa de prolactina, el fragmento proteolítico de 7,8 kDa de factor 4 plaquetario, el fragmento de 24 aminoácidos de factor 4 plaquetario antiangiogénico, factor antiangiogénico designado 13.40, fragmento peptídico de 22 aminoácidos de trombospondina I antiangiogénico, el fragmento peptídico de 20 aminoácidos antiangiogénico de SPARC, RGD y NGR que contienen los péptidos, los péptidos antiangiogénicos pequeños de laminina, fibronectina, procolágeno y EGF, antagonistas de la integrina αvβ3, antagonistas del factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF), antagonistas del factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), antagonistas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (p.ej., anticuerpos anti-VEGF), y antagonistas del receptor de VEGF (VEGFR) (p.ej., anticuerpos anti-VEGFR).
[0238] Los ejemplos de antagonistas de la integrina αvβ3 incluyen, sin carácter limitativo, agentes porteínicos como fragmentos de metaliproteinasas no catalíticos, péptidos RGD, péptidomiméticos, proteínas de fusión, disintegrinas o derivados o análogos de los mismos, y anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a integrina αvβ3, moléculas de ácido nucleico, moléculas orgánicas y moléculas inorgánicas. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a integrina α vβ3 incluyen11D2 (Searle), LM609 (Scripps) y VITAXIN (MedImmune, Inc.). Los ejemplos no limitativos de moléculas pequeñas de antagonistas de la integrina αvβ3 peptidomiméticos incluyen S836 (Searle) y S448 (Searle). Los ejemplos de disintegrinas incluyen, sin carácter limitativo, Accutin. La invención también abarca el uso de cualquiera de los antagonistas de la integrina αvβ3
revelados en las siguientes patentes estadounidenses y publicaciones internacionales en las composiciones y métodos de la invención: patentes estadounidenses nº 5.149.780, 5.196.511, 5.204.445, 5.262.520, 5.306.620, 5.478.725, 5.498.694, 5.523.209, 5.578.704, 5.589.570, 5.652.109, 5.652.110, 5.693.612, 5.705.481, 5.753.230, 5.767.071, 5.770.565, 5.780.426, 5.817.457, 5.830.678, 5.849.692, 5.955.572, 5.985.278, 6.048.861, 6.090.944, 6.096.707, 6.130.231, 6.153.628, 6.160.099, y 6.171.588, y las publicaciones internacionales nº WO 95/22543, WO 98/33919, WO 00/78815, y WO 02/070007. En un modo de realización preferido, el agente antiangiogénico es VITAXIN (MedImmune, Inc.) o un fragmento de unión al antígeno del mismo. [0239] En un modo de realización específico de la invención, el agente antiangiogénico es endostatina. La endostatina de origen natural consta de 180 aminoácidos C-terminales de colágeno XVIII (los ADNcs que codifican dos formas de empalme de colágeno XVIII tienen nº de registo en Gen Bank AF18081 y AF18082). En otro modo de realización de la invención, el agente antiangiogénico es un fragmento de plasminógeno (la secuencia de codificación del plasminógeno puede encontrarse en Genbank con el número de registro NM_000301 y A33096). Los péptidos de angiostatina incluyen de forma natural los cuatro dominios kringle del plasminógeno, del kringle 1 hasta el krignle 4. Se ha demostrado que los dominios kringle 1, 2 y 3 recombinantes poseen las propiedades antiangiogénicas del péptido nativo, mientras que el dominio kringle 4 no presenta tal actividad (Cao et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:29461:29467). Por lo tanto, los péptidos de angiostatina comprenden al menos una y preferiblemente más de un dominio kringle elegido del grupo formado por los dominios kringle 1, kringle 2 y kringle 3. En un modo de realización específico, el páptido antiangiogénico es la isoforma de 40 kDa de la molécula de angiostatina humana, la isoforma de 42 kDa de la molécula de angiostatina humana, la isoforma de 45 kDa de la molécula de angiostatina humana, o una combinación de las mismas. En otro modo de realización, el agente antiangiogénico es el dominio kringle 5 del plasminógeno, que es un inhibidor más potente de la angiogénesis que la angiostatina (la angiostatina comprende los dominios kringle 1-4). En otro modo de realización, el agente antiangiogénico es antitrombina III. La antitrombina III, de aquí en adelante denominada antitrombina, comprende un dominio de unión a heparina que enlaza la proteína a las paredes vasculares, y un bucle de sitio activo que interactúa con la trombina. Cuando la antitrombina se enlaza a la heparina, la proteína provoca un cambio conformacional que permite que el bucle activo interactúe con la trombina, lo que provoca la escisión proteolítica de dicho bucle por la trombina. El evento de escisión proteolítica resulta en otro cambio de conformación de la antitrombina, que (i) altera la superficie de interacción entre la trombina y la antitrombina y (ii) libera el complejo de la heparina (Carrell, 1999, Science 285:1861-1862, y las referencias del mismo). O’Reilly et al. (1999, Science 285:1926-1928) han descubierto que la antitrombina escindida tiene una potente actividad antiangiogénica. Por consiguiente, en un modo de realización, el agente antiangiogénico es la forma antiangiogénica de antitrombina. En otro modo de realización de la invención, el agente antiangiogénico es el fragmento proteolítico de 40 kDa y/o 29 kDa de fibronectina.
[0240] En otro modo de realización de la invención, el agente antiangiogénico es un antagonista del receptor del activador de plasminógeno tipo urocinasa (uPA). En un modo del modo de realización, el antagonista es un mutante dominante negativo de uPA (véase, p.ej., Crowley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5021-5025). En otro modo de realización, el antagonista es un antagonista peptídico o una proteína de fusión del mismo (Goodson et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7129-7133). En otro modo diferente del modo de realización, el antagonista en un receptor de uPA soluble dominante negativo (Min et al., 1996, Cancer Res. 56:2428-2433). En otro modo de realización de la invención, una molécula terapéutica de la invención es el fragmento N-terminal de 16 kDa de prolactina, que comprende aproximadamente 120 aminoácidos, o un fragmento biológicamente activo del mismo (la secuencia de codificación de la prolactina puede encontrarse en GenBank nº de registro NM_000948). En otro modo de realización de la invención, el agente antiangiogénico es el fragmento de 7,8 kDA de factor 4 plaquetario. En otro modo de realización de la invención, una molécula terapéutica de la invención es un péptido pequeño que corresponde al fragmento de 13 aminoácidos antiangiogénico de factor 4 plaquetario, el factor antiangiogénico designado 13.40, fragmento peptídico de 22 aminoácidos de trombospondina I antiangiogénico, el fragmento peptídico de 20 aminoácidos antiangiogénico de SPARC antiangiogénico, los péptidos antiangiogénicos pequeños de laminina, fibronectina, procolágeno o EGF, o antagonistas peptídicos pequeños de la integrina αvβ3 o el receptor de VEGF. En otro modo de realización, el péptido pequeño comprende un motivo RGD o NGR. En determinados modos de realización, el agente antiangiogénico es un antagonista de TNF-α. En otros modos de realización, el agente antiangiogénico no es un antagonista de TNF-α.
[0241] Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad antiangiogénica, o las proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad antiangiogénica pueden administrarse a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, o una enfermedad inflamatoria, según la invención. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican derivados, análogos, fragmentos, o variantes de proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad antiangiogénica, o los derivados, análogos, fragmentos, o variantes de porteínas, polipéptidos o péptidos con actividad antiangiogénica pueden administrarse a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, o un trastorno inflamatorio, según la invención. Preferiblemente, dichos derivados, análogos, variantes, y fragmentos conservan la actividad antiangiogénica de la proteína, polipéptido o péptido natural completo.
[0242] Las proteínas, polipéptidos o péptidos que pueden usarse como agentes antiangiogénicos pueden producirse por cualquier técnica conocida en el sector o descrita aquí. Las proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad antiangiogénica pueden diseñarse de forma que se aumente la vida media in vivo de dichas proteínas, polipéptidos o péptidos utilizando técnicas conocidas en el sector o descritas aquí. Preferiblemente, se utilizan los agentes antiangiogénicos que se encuentran disponibles en el mercado en las composición y métodos de la invención. La actividad antiangiogénica de un agente puede determinarse in vitro y/o in vivo mediante cualquier técnica conocida por aquellos con experiencia en el sector.
5.2.3 Antagonistas del TNF-α
[0243] Cualquier antagonista del TNF-α conocido por aquellos con habilidad en la técnica puede usarse en las composiciones y métodos de la invención. Los ejemplos no limitativos de antagonistas del TNF-α incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, proteínas de fusión, anticuerpos (p.ej., humanos, humanizados, quiméricos, monoclonales, policlonales, fragmentos Fab, Fvs, ScFvs, fragmentos F(ab)2, y fragmentos de unión al antígeno de los mismos) como anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a TNF-α, moléculas de ácido nucleico (p.ej., moléculas antisentido o hélices triples), moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas y moléculas pequeñas que bloquean, reducen, inhiben o neutralizan una función, una actividad y/o expresión de TNF-α. En diversos modos de realización, el antagonista del TNF-α reduce la función, actividad y/o expresión del TNF-α en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS).
[0244] Los ejemplos de anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica al TNF-α incluyen, sin carácter limitativo, infliximab (REMICADE®; Centacor), D2E7 (Abbott Laboratories/Knoll Pharmaceuticals Co., Mt. Olive, N.J.), CDP571 que también se conoce como HUMICADE y CDP-870 (ambos de Celltech/Pharmacia, Slough, U.K.), y TN3-19.12 (Williams et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2762-2766; Thorbecke et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7375-7379). La presente invención también abarca el uso de anticuerpos que se unen de froma inmunoespecífica al TNF-α revelados en las siguientes patentes estadounidenses en las composiciones y métodos de la invención: 5.136.021, 5.147.638, 5.223.395, 5.231.024, 5.334.380, 5.360.716, 5.426.181, 5.436.154, 5.610.279, 5.644.034, 5.656.272, 5.658.746, 5.698.195, 5.736.138, 5.741.488, 5.808.029, 5.919.452, 5.958.412, 5.959.087, 5.968.741, 5.994.510, 6.036.978, 6.114.517, y 6.171.787. Los ejemplos de receptores del TNF-α soluble incluyen, sin character limitativo, sTNF-R1 (Amgen), etanercept (ENBREL™; Immunex) y su homólogo en ratas RENBREL™, inhibidores del TNF-α solubles derivados de TNFRI, TNFRII (Kohno et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8331-8335), e inhibidores del TNF-α (TNF-α Inh) (Seckinger et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:51885192).
[0245] En un modo de realización, un antagonista del TNF-α utilizado en las composiciones y métodos de la invención es un receptor del TNF-α soluble. En un modo de realización específico, un antagonista del TNF- α utilizado en las composiciones y métodos de la invención es etanercept (ENBREL ; Immunex) o un fragmento, derivado o análogo del mismo. En otro modo de realización, un antagonista del TNF-α utilizado en las composiciones y métodos de la invención es un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica al TNF-α. En un modo de realización específico, un antagonista del TNF-α utilizado en las composiciones y métodos de la invención es infliximab (REMICADE®; Centacor), un derivado, análogo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
[0246] Otros antagonistras del TNF-α abarcados por la invención incluyen, sin carácter limitativo, IL-10, la cual se sabe que bloquea la producción de TNF-α vía macrófagos activados por interferón γ (Oswald et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8676-8680), TNFR-IgG (Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539), el producto murino TBP-1 (Serono/Yeda), la vacuna CytoTAb (Protherics), molécula antisentido 104838 (ISIS), el péptido RDP-58 (SangStat), talidomida (Celgene), CDC-801 (Celgene), DPC-333 (Dupont), VX-745 (Vertex), AGIX4207 (AtheroGenics), ITF-2357 (Italfarmaco), NPI-13021-31 (Nereus), SCIO-469 (Scios), TACE targeter (Immunix/AHP), CLX-120500 (Calyx), Thiazolopyrim (Dynavax), auranofina (Ridaura) (SmithKline Beecham Pharmaceuticals), quinacrina (diclorhidrato de mepacrina), tenidap (Enablex), melanina (Large Scale Biological) y agentes anti-p38 MAPK de Uriach.
[0247] Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad antagonista frente al TNF-α, o proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad antagonista frente al TNF-α pueden administrarse a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad inflamatoria según la invención. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican derivados, análogos, fragmentos o variantes de proteínas, polipéptidos, o péptidos con actividad antagonista frente al TNF-α, o derivados, análogos, fragmentos o variantes de proteínas, polipéptidos, o péptidos con actividad antagonista frente al TNF-α se pueden administrar a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad inflamatoria según la invención. Preferiblemente, dichos derivados, análogos, variantes y fragmentos conservan la actividad antagonista frente al TNF-α de la proteína, polipéptido o péptido natural completo.
[0248] Las proteínas, polipéptidos o péptidos que pueden usarse como antagonistas del TNF-α pueden producirse por cualquier técnica concida en el sector o descrita aquí. Las proteínas, polipéptidos o péptidos con actividad antagonista frente al TNF-α pueden someterse a ingeniería de forma que aumenten la vida media in vivo de dichas proteínas, polipéptidos o péptidos utilizando técnicas conocidas en el sector o descritas aquí. Preferiblemente, en las composiciones y métodos de la invención se utilizan agentes que se encuentran disponibles en el mercado y cuya función como antagonistas del TNF-α es conocida. La actividad antagonista frente al TNF-α de un agente puede determinarse in vitro y/o in vivo mediante cualquier técnica conocida por aquellos con experiencia en la técnica.
5.2.4 Terapias antiinflamatorias
[0249] Cualquier agente antiinflamatorio, incluyendo los agentes útiles en las terapias de trastornos inflamatorios, concido por aquellos con habilidad en la técnica puede usarse en las composiciones y métodos de la invención. Los ejemplos no limitativos de agentes antiinflamatorios incluyen los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), medicamentos antiinflamatorios esteroideos, anticolinérgicos (p.ej., sulfato de atropina, metilnitrato de atropina y bromuro de ipratropio (ATROVENT )), agonistas beta-2 (p.ej., albuterol (VENTOLIN y PROVENTIL ), bitolterol (TORNALATE ), levalbuterol (XOPONEX), metaproterenol (ALUPENT ), pirbuterol (MAXAIR ), terbutalina (BREATHAIRE y BRETHINE ), albuterol (PROVENTIL , REPETABS , y VOLMAX ), formoterol (FORADIL AEROLIZER ), y salmeterol (SEREVENT y SEREVENT DISKUS )), y metilxantinas (p.ej., teofilina (UNIPHYL THEO-DUR , SLO-BID , y TEHO-42 )). Los ejemplos de AINEs incluyen, sin carácter limitativo, aspirina, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX), diclofenaco (VOLTAREN ), etodolaco (LODINE ), fenoprofeno (NALFON ), indometacina (INDOCIN ), ketorolaco (TORADOL ), oxaprozina (DAYPRO ), nabumetona (RELAFEN ), sulindac (CLINORIL ), tolmetina (TOLECTIN ), rofecoxib (VIOXX), naproxeno (ALEVE , NAPROSYN ), ketoprofeno (ACTRON ) y nabumetona (RELAFEN ). Dichos AINEs funcionan mediante la inhibición de una enzima ciclooxigenasa (p.ej., COX-1 y/o COX-2). Los ejemplos de medicamentos antiinflamatorios esteroideos incluyen, sin carácter limitativo, glucocorticoides, dexametasona (DECADRON ), corticosteroides (p.ej., metilprednisolona (MEDROL )), cortisona, hidrocortisona, prednisona (PREDNISONE Y DELTASONE ), prednisolona (PRELONE
y PEDIAPRED
triamcinolona, azulfidina e inhibidores de eicosanoides (p.ej., prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos (véase Tabla 5 2, infra, para ejemplos no limitativos de leucotrienos y típicas dosis de dichos agentes)).
[0250] En determinados modos de realización, el agente antiinflamatorio es un agente útil en la prevención, control, tratamiento y/o mejora del asma o uno o más síntomas del mismo. Los ejemplos no limitativos de dichos agentes incluyen estimulantes adrenérgicos (p.ej., catecolaminas (p.ej., epinefrina, isoproterenol e isoetarina), resorcinoles (p.ej., metaproterenol, terbutalina, fenoterol), y saligéninas (p.ej., salbutamol)), adrenocorticoides, glucocorticoides, 10 corticosteroides (p.ej., beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, triamcinolona, metilprednisolona, prednisolona y prednisona), otros esteroides, antagonistas beta-2 (p.ej., albuterol, bitolterol, fenoterol, isoetarina, metaproterenol, pirbuterol, salbutamol, terbutalina, formoterol, salmeterol y albutamol terbutalina), anticolinérgicos (p.ej., bromuro de ipratropio y bromuro de oxitropio), antagonistas de la IL-4 (incluyendo anticuerpos), antagonistas de IL-5 (incluyendo anticuerpos), antagonistas de IL-13 (incluyendo anticuerpos), inhibidor de PDE4, inhibidor de NF15 Kappa-β, inhibidor de VLA-4, CpG, anti-CD23, antagonistas de selectina (TBC 1269), inhibidores de proteasas de los mastocitos (p.ej., inhibidores de cinasas y triptasas (p.ej., GW-45, GW-58 y genisteína), inhibidores de fosfatidilinositol3’-cinasa (PI3) (p.ej., calfostina C), y otros inhibidores de cinasas (p.ej., estaurosporina) (véase Temkin et al., 2002 J Immunol 169(5):2662-2669; Vosseller et al., 1997 Mol. Biol. Cell 8(5):909-922; y Nagai et al., 1995 Biochem Biophys Res Commun 208(2):576-581)), un antagonista del receptor C3 (incluyendo anticuerpos), agentes inmunosupresores
20 (p.ej., metotrexato y sales de oro), moduladores de mastocitos (p.ej., cromolino sódico (INTAL ) y nedocromil sódico (TILADE )), y agentes mucolíticos (p.ej., acetilcisteína)). En un modo de realización específico, el agente antiinflamatorio es un inhibidor de leucotrienos (p.ej., montelukast (SINGULAIR ), zafirlukast (ACCOLATE ), pranlukast (ONON ), o zileutón (ZYFLO ) (véase Tabla 2)).
Tabla 2. Inhibidores de leucotrienos para terapia del asma
Modificador de leucotrienos
Dosis diaria habitual
Montelukast (SINGULAIR™)
4 mg para sujetos de 2-5 años
5 mg para sujetos de 6 a 15 años
10mg para sujetos de 15 años o más
Zafirlukast (ACCOLATE™)
10 mg b.i.d. para sujetos de 5 a 12 años dos veces al día
20 mg b.i.d. para sujetos de 12 años o más dos veces al día
Pranlukast (ONON™)
Solo disponible en Asia
Zyleuton (ZYFLO™)
600 mg cuatro veces al día para sujetos de 12 años o más
[0251] En determinados modos de realización, el agente antiinflamatorio es un agente útil en la prevención, tratamiento, control y/o mejora de alergias o uno o más síntomas de las mismas. Los ejemplos no limitativos de dichos agentes incluyen fármacos antimediadores (p.ej., antihistamínico, véase Tabla 3, infra para ejemplos no limitativos de antihistamínicos y dosis típicas de dichos agentes), corticosteroides, descongestionantes, fármacos 30 simpaticomiméticos (p.ej., fármacos adrenérgicos α y adrenérgicos β), TNX901 (Leung et al., 2003, N Engl J Med 348(11):986-993), antagonistas de IgE (p.ej., anticuerpos rhuMAb-E25 omalizumab (véase Finn et al., 2003 J Allergy Clin Immuno 111(2):278-284; Corren et al., 2003 J Allergy Clin Immuno 111(1):87-90; Busse y Neaville, 2001 Curr Opin Allergy Clin Immuno 1(1):105-108; y Tang y Powell, 2001, Eur J Pediatr 160(12):696-704), HMK12 y 6HD5 (véase Miyajima et al., 2202 Int Arch Allergy Immuno 128(1):24-32), y mAB Hu-901 (véase van
35 Neerven et al., 2001 Int Arch Allegry Immuno 124(1-3):400), teofilina y sus derivados, glucocorticoides, e inmunoterapias (p.ej., inyección de alérgeno repetido a largo plazo, desensibilización de corta duración e inmunoterapia con veneno).
Tabla 3. Antihistamínicos H1
Categoría química y fármacos representativos
Dosis diaria habitual
Etanolamina
Difenhidramina
25-50 mg cada 4-6 horas
Clemastina
0,34-2,68 mg cada 12 horas
Etilendiamina
Tripelenamina
25-50 mg cada 4-6 horas
Alquilamina
Bromfeniramina
4 mg cada 4-6 horas; o 8-12 mg de la forma de liberación prolongada cada 8-12 horas
Clorfeniramina
4 mg cada 4-6 horas; o 8-12 mg de la forma de liberación prolongada cada 8-12 horas
Triprolidina (1,25 mg/5ml)
2,5 mg cada 4-6 horas
Fenotiacina
Prometacina
25 mg antes de acostarse
Piperacina
Hidroxicina
25 mg cada 6-8 horas
Piperidinas
Astemizol (no sedante)
10 mg/día
Azatadina
1-2 mg cada 12 horas
Cetirzina
10 mg/día
Ciproheptadina
4 mg cada 6-8 horas
Fexofenadina (no sedante)
60 mg cada 12 horas
Loratidina (no sedante)
10 mg cada 24 horas
[0252] Las terapias antiinflamatorias y sus dosis, vías de administración, y uso recomendado son conocidos en la técnica y se han descrito en la literatura como el Physician’s Desk Reference (57º ed., 2003).
[0253] 5.3 USOS PROFILÁCTICOS Y TERAPÉUTICOS DE LOS ANTICUERPOS
[0254] La presente invención se dirige a terapias que implican el uso de uno o más anticuerpos de la invención y composiciones que comprenden la administración de dichos anticuerpos a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno o uno o más síntomas de los mismos. En un modo de realización, la invención proporciona usos para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno o uno o más síntomas de los mismos, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención. En determinados modos de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más polipéptidos, péptidos y proteínas que comprenden uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención a un sujeto que lo necesita para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno o uno o más síntomas de los mismos.
[0255] La invención también proporciona usos para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno o uno o más síntomas de los mismos, comprendiendo dicho uso la administración a un sujeto que lo necesita de uno o más de los anticuerpos de la invención y una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) diferentes de los anticuerpos de la invención que se están utilizando actualmente, han sido usados, o se sabe que son útiles en la prevención, tratamiento, control y/o mejora de dicha enfermedad o trastorno o uno o más de los síntomas de los mismos. Los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias combinadas de la invención pueden administrarse de forma sucesiva o concurrente. En un modo de realización específico, las terapias combinadas de la invención comprenden una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención y una cantidad efectiva de al menos otra terapia que tenga el mismo mecanismo de acción que dichos anticuerpos. En un modo de realización específico, las terapias combinadas de la invención comprenden una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención y una cantidad efectiva de al menos otra terapia (p.ej., agente profiláctico o terapéutico) que tiene un mecasnimo de acción diferente al de dichos anticuerpos. En determinados modos de realización, las terapias combinadas de la presente invención mejoran el efecto profiláctico
o terapéutico de uno o más anticuerpos de la invención mediante el funcionamiento conjunto con los anticuerpos para tener un efecto acumulativo o sinérgico. En determinados modos de realización, las terapias combinadas de la presente invención reducen los efectos secundarios asociados a los agentes profilácticos o terapéuticos.
[0256] Los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias combinadas pueden administrarse a un sujeto, preferiblemente a un sujeto humano, en la misma composición farmacéutica. Alternativamente, los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias combinadas pueden administrarse de forma concurrente a un sujeto en composiciones farmacéuticas separadas. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse a un suejto por la misma o diferente vía de administración.
[0257] En un modo de realización específico, se administra una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos de la invención descrita aquí a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno o uno o más síntomas de los mismos. Según la invención, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender también una o más terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos), diferentes de los anticuerpos de la invención, que se usen actualmente, o se hayan usado o se sepa que son útiles en la prevención, tratamiento o mejora de uno o más síntomas asociados a una enfermedad o trastorno.
5.3.1 Las enfermedades y trastornos que pueden prevenirse, tratarse, controlarse y/o mejorarse mediante la administración de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invenicón incluyen, sin carácter limitativo, enfermedades o trastornos asociados a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9 y enfermedades y trastornos asociados a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, enfermedades inflamatorias (p.ej., asma, trastornos alérgicos y artritis). En otro modo de realización, los anticuerpos de la invención y las composiciones que comprenden dichos anticuerpos se administran a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, según los métodos de la invención para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9 o una enfermedad o trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo. En otro modo de realización, los anticuerpos de la invención y las composiciones que comprenden los mismos se utilizan para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad inflamatoria o uno o más síntomas de la misma. En otro modo de realización, los anticuerpos de la invención y las composiciones que comprenden los mismos se utilizan para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar el asma o uno o más síntomas del mismo. En otro modo de realización específico, los anticuerpos de la invención y las composiciones que comprenden dichos anticuerpos se usan para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una afección alérgica incluyendo, sin carácter limitativo, rinitis, eccema, urticaria crónica, dermatitis atópica y asma alérgica. Trastornos inflamatorios
[0258] Uno o más anticuerpos de la invención y composiciones que comprenden dichos anticuerpos pueden usarse para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo. Los anticuerpos de la invención o composiciones que comprenden dichos anticuerpos pueden administrarse también en combinación con una o más terapias diferentes (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos diferentes de los anticuerpos de la invención) útiles para la prevención, tratamiento, control y/o mejora de un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo. Los ejemplos no limitativos de dichas terapias incluyen los agentes descritos en la sección 5.2, supra, y en especial, los agentes inmunomoduladores descritos en la sección 5.2.1, los agentes antiangiogénicos descritos en la sección 5.2.2, los antagonistas del TNF-α descritos en la sección 5.2.3, los agentes antiinflamatorios descritos en la sección 5.2.4, los agentes anticancerígenos descritos en la sección 5.2.5, los agentes antivirales descritos en la sección 5.2.6, los agentes antibacterianos descritos en la sección 5.2.7 y los agentes antifúngicos descritos en la sección 5.2.8.
[0259] En un modo de realización específico, la invención proporciona un método para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas de los mismos, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención. En otro modo de realización, la invención proporciona un método para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad efectiva de uno o más de los anticuerpos de la invención y una cantidad efectiva de una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) diferentes de los anticuerpos de la invención.
[0260] La invención proporciona métodos para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo en un sujeto resistente a terapias convencionales (p.ej., metotrexato y un antagonista del TNF-α (p.ej., REMICADE o ENBREL )) para dicho trastorno inflamatorio, comprendiendo dichos métodos la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención. La invención porporciona también métodos para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo en un sujeto resistente a las terapias de un solo agente existentes para dicho trastorno inflamatorio, comprendiendo dichos métodos administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención y una cantidad efectiva de una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos), diferentes de los anticuerpos de la invención. La invención también proporciona métodos para la prevención, tratamiento, control y/o mejora de un trastorno inflamatorio en pacientes que han mostrado ser resistentes a otras terapias pero ya no están sometidos a estas terapias. La invención porporciona también métodos alternativos para la prevención, tratamiento, control y/o mejora de un trastorno inflamatorio cuando otra terapia ha mostrado o puede mostrar resultar demasiado tóxica, es decir, resulta en efectos secundarios inaceptables o insoportables, para el sujeto que está siendo tratado. Además, la invención proporciona métodos para prevenir la recurrencia de un trastorno inflamatorio en pacientes que han sido tratados y no presentan actividad de la enfermedad.
[0261] Los ejemplos de trastornos inflamatorios que pueden prevenirse, controlarse, tratarse y/o mejorarse según los métodos de la invención, incluyen, sin carácter limitativo, asma, trastornos alérgicos, trastornos inflamatorios caracterizados por la inflamación tipo 2 mediada, fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), encefalitis, enfermedad inflamatoria intestinal, shock séptico, espondiloartropatía indiferenciada, artropatía indiferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones bacterianas o virales crónicas. En un modo de realización preferido, el trastorno inflamatorio que se previene, trata, controla y/o mejora según los métodos de la invención es un trastorno inflamatorio caracterizado como una inflamación tipo 2 mediada. La inflamación tipo 2 mediada se caracteriza por la infiltración eosinofílica y basofílica tisular y/o extensiva degranulación de los mastocitos, un proceso dependiente del enlace cruzado de la IgE unida a la superficie. En otro modo de realización preferido, el trastorno inflamatorio que se previene, trata, controla y/o mejora según los métodos de la invención es asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar o un trastorno alérgico.
[0262] En un modo de realización específico, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar el asma o uno o más síntomas del mismo en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) diferentes de los anticuerpos de la invención útiles en la prevención, tratamiento, control y/o mejora del asma o uno
o más síntomas del mismo. Los ejemplos no limitativos de dichas terapias incluyen agentes como estimulantes adrenérgicos (p.ej., catecolaminas (p.ej., epinefrina, isoproterenol e isoetarina), resorcinoles (p.ej., metaproterenol, terbutalina y fenoterol), saligeninas (p.ej., salbutamol)), anticolinérgicos (p.ej., sulfato de atropina, metilnitrato de atropina y bromuro de ipratropio (ATROVENT )), agonistas beta-2 (p.ej., abuterol (VENTOLIN y PROVENTIL ), bitolterol (TORNALATE ), levalbuterol (XOPONEX ), metaproterenol (ALUPENT ), pirbuterol (MAXAIR ), terbutalina (BREATHAIRE y BRETHINE ), albuterol (PROVENTIL , REPETABS , y VOLMAX ), formoterol (FORADIL AEROLIZER ), y salmeterol (SEREVENT y SEREVENT DISKUS )), corticosteroides (p.ej., metilprednisolona (MEDROL ), prednisona (PREDNISONE y DELTASONE ), y prednisolona (PRELONE PEDIAPRED )), glucocorticoides (p.ej., esteroides orales u otros esteroides orales o sistémicos, y glucocorticoides inhalados) otros esteroides, agentes inmunosupresores (p.ej., metotrexato y sales de oro), inhibidores de leucotrienos (p.ej., montelukast (SINGULAIR ), zafirlukast (ACCOLATE ), y zileutón (ZYFLO )), moduladores de mastocitos (p.ej., cromolino sódico (INTAL ) y nedocromil sódico (TILADE )), metilxantinas (p.ej., teofilina (UNIPHYL , THEO-DUR , SLO-BID , y TEHO-42 )) y agentes mucolíticos (p.ej., acetilcisteína)). En un modo de realización específico, se administran uno o más anticuerpos de la invención en combinación con siplizumab (MedImmune, Inc.) a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar el asma o uno o más síntomas del mismo.
[0263] La invención abarca métodos para prevenir el desarrollo del asma en un paciente que se espera que sufra, o con riesgo de desarrollar asma, p.ej., pacientes con disposición genética para el asma, pacientes que tienen o han tenido una o más infecciones respiratorias, bebés, bebés que nacen de forma prematura, niños, ancianos, o pacientes que trabajan con sustancias químicas tóxicas (es decir, con riesgo de desarrollar asma ocupacional). En 5 modos de realización específicos, los sujetos son niños con riesgo de desarrollar asma, p.ej., niños que tienen o han tenido una infección respiratoria, especialmente, PIV, VSR y MPVh, que tienen niveles elevados de IgE, antecedentes familiares de asma, que han estado expuestos a desencadenantes del asma y/o alérgenos (p.ej., animales, alérgenos de cucarachas y humo de tabaco), o han sufrido sibilancia o hiperreactividad bronquial. Para un análisis de los factores de riesgo para el asma véase, p.ej., Klinnert et al., 2001, Pediatrics 108(4):E69; London et
10 al.,2001, Epidemiology, 12(5):577-83; Melen et al., 2001, Allergy, 56(7):464-52; Mochizuki et al., 2001, J Asthma 38(1):1-21; Arruda et al., 2001, Curr Opin Pulm Med, 7(1):14-19; Castro-Rodriguez et al., 2000, Am J Respir Crit Care Med 162:1403-6; Gold, 2000, Environ Health Perspect 108:643-51; y Csonka et al., 2000, Pediatr Allergy Immuno, 11(4):225-9.
[0264] En un modo de realización específico, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la
15 invención a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una alergia o uno o más síntomas de la misma en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) útiles en la prevención, tratamiento, control y/o mejora de alergias o uno o más síntomas de las mismas. Los ejemplos no limitativos de dichas terapias incluyen agentes como fármacos antimediadores (p.ej., antihistamínicos, véase Tabla 5), corticosteroides, decongestionantes, fármacos simpaticomiméticos (p.ej., fármacos adrenérgicos α y
20 adrenérgicos β), teofilina y sus derivados, glucocorticoides e inmunoterapias (p.ej., inyección de alérgeno repetida a largo plazo, desensibilización de corta duración e inmunoterapia con veneno).
Tabla 5. Antihistamínicos H1
Categoría química y fármacos representativos
Dosis diaria habitual
Etanolamina
25-50 mg cada 4-6 horas
Difenhidramina
0,34-2,68 mg cada 12 horas
Clemastina
Etilendiamina
25-50 mg cada 4-6 horas
Tripelenamina
Alquilamina
4 mg cada 4-6 horas; o 8-12 mg de la forma de liberación prolongada cada 8-12 hour
Bromfeniramina
Clorfeniramina
4 mg cada 4-6 horas; o 8-12 mg de la forma de liberación prolongada cada 8-12 horas
Triprolidina (1,25 mg/5ml)
2,5 mg cada 4-6 horas
Fenotiacina
25 mg antes de acostarse
Prometazina
Piperacina
25 mg cada 6-8 horas
Hidroxicina
Piperidinas
10 mg/d
Categoría química y fármacos representativos
Dosis diaria habitual
Astemizol (no sedante)
1-2 mg cada 12 horas
Azatadina
10 mg/d
Cetirzina
4 mg cada 6-8 horas
Ciproheptadina
60 mg cada 12 horas
Fexofenadina (no sedante)
10 mg cada 24 horas
Loratidina (no sedante)
[0265] En un modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 en combinación con una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos anti-IgE a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una alergia o uno o más síntomas de la 5 misma. En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 con una cantidad efectiva de anticuerpo anti-IgE TNX901 a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar la alergia o uno o más síntomas de la misma. En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 con una cantidad efectiva de anticuerpo anti-IgE rhuMAb-E25 omalizumab a un sujeto para 10 prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una alergia o uno o más síntomas de la misma. En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos que se unen de forma imunoespecífica a un polipéptido de IL-9 en combinación con una cantidad efectiva de anticuerpo anti-IgE HMK-12 a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una alergia o uno o más síntomas. En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 en combinación
15 con una cantidad efectiva de anticuerpo anti-IgE 6HD5 a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una alergia o uno o más síntomas. En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 en combinación con una cantidad efectiva de anticuerpo anti-IgE MAb Hu-901 a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre alergias para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una alergia o uno o más síntomas de la misma.
20 [0266] En un modo de realización específico, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención a un sujeto en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) distintos de un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 útiles para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar EPOC o uno o más síntomas de la misma. Los ejemplos no limitativos de dichas terapias incluyen agentes como los broncodilatadores (p.ej., agonistas β2 adrenérgicos de acción corta (p.ej.,
25 albuterol, pirbuterol, terbutalina y metaproterenol), agonistas β2 adrenérgicos de acción prolongada (p.ej., albuterol oral de liberación prolongada o salmeterol inhalado), anticolinérgicos (p.ej., bromuro de ipratropio), y teofilina y sus derivados (el rango terapéutico de teofilina es preferiblemente de 10 – 20 μg/mL)), glucocorticoides, antitripsina α1 (AT α1) exógena (p.ej., AT α1 obtenida a partir de plasma humano combinado administrado por vía intravenosa en una dosis semanal de 60 mg/kg), oxígeno, transplante de pulmón, reducción quirúrgica del volumen pulmonar,
30 intubación endotraqueal, soporte ventilatorio, vacunación anual contra la influenza y vacunación antineumocócica polisacárida 23 valente, ejercicio, y dejar de fumar.
[0267] En un modo de realización específico, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención a un sujeto que lo necestia en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) distintos de los anticuerpos de la invencíon útiles en la prevención, tratamiento, 35 control y/o mejora de la fibrosis pulmonar o uno o más síntomas de la misma. Los ejemplos no limitativos de dichas terapias incluyen oxígeno, corticosteroides (p.ej., administración diaria de prednisona empezando con una dosis de 1-1,5 mg/kg/d (hasta 100 mg/d) durante seis semanas y reduciendo lentamente la dosis durante 3-6 meses hasta una dosis de mantenimiento mínima de 0,25 mg/kg/d), fármacos citotóxicos (p.ej., ciclofosfamida a 100-120 mg por vía oral una vez al día y azatioprina a 3 mg/kg hasta 200 mg por vía oral una vez al día), broncodilatadores (p.ej.,
40 anticolinérgicos, teofilina y sus derivados, y agonistas β2-adrenérgicos de corta duración y de duración prolongada), y antihistamínicos (p.ej., difenidramina y doxilamina).
[0268] En un modo de realización específico, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención en combinación con una cantidad efectiva de VITAXIN (MedImmune, Inc. Publicación internacional nº WO 00/78815, publicación internacional nº WO 02/070007 A1, con fecha del 12 de septiembre de 2002, titulada
“Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists”, publicación internacional nº WO 03/075957 A1, con fecha del 18 de septiembre de 2003, titulada “The Prevention or Treatment of Cancer Using IntegrinAlphaVBeta3 Antagonists in Combination With Other Agents”,
publicación de patente estadounidense nº US 2002/0168360 A1, con fecha de 14 de noviembre de 2002, titulada
“Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin αvβ3 Antagonists in Combination With Other Prophylactic or Therapeutic Agents”, y la publicación internacional nº WO
03/075741 A2, con fecha del 18 de septiembre de 2003, titulada “Methods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin αvβ3 Antagonists in Combination With an HMG-CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate”, cada una de las cuales queda incorporada aquí mediante referencia en su totalidad ) a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo. En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención en combinación con una cantidad efectiva de siplizumab (MedImmune, Inc., publicación internacional nº WO 02/069904) a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo. En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención en combinación con una cantidad efectiva de uno o más inhibidores de EphA2 (p.ej., uno o más anticuerpos anti-EphA2 (MedImmune, Inc.;
publicación internacional nº WO 02/102974 A4, con fecha del 27 de diciembre de 2002, titulada “Mutant Proteins, High Potency Inhibitory Antibodies and FIMCH Crystal Structure”, publicación internacional nº 03/094859 A2, con fecha del 20 de noviembre de 2003, titulada “EphA2 Monoclonal Antibodies and Methods of Use Thereof”, solicitud estadounidense nº 10/436.783; y solicitud estadounidense nº 60/379.368, cada una de las cuales queda incorporada aquí mediante referencia)) a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo. En otro modo de realización preferido más, se administra una cantidad efectiva de un o más anticuerpos de la invención en combinación con una cantidad efectiva de VITAXIN , siplizumab y/o inhibidor de EphA2 a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo.
[0269] En un modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención en combinación con una cantidad efectiva de un inhibidor del factor de células madre (ligando c-kit), como por ejemplo, sin carácter limitativo, MAb 7H6, MAb 8H7a, pAb 1337, FK506 y CsA a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo. Según este modo de realización, el inhibidor de factor de células madre se administra preferiblemente de manera local en el área afectada (es decir, el área inflamada). En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención en combinación con una cantidad efectiva de uno o más inhibidores de receptores c-kit, como por ejemplo, sin carácter limitativo STI 571 a un sujeto para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo. Según este modo de realización, el inhibidor del receptor c-kit se administra preferiblemente de forma local en el área afectada.
[0270] En un modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención en combinación con una inhibidor de proteasas de los mastocitos a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre un trastorno inflamatorio. En otro modo de realización, el inhibidor de proteasas de mastocitos es un inhibidor de triptasa cinasa, como por ejemplo, sin carácter limitativo GW-45, GW-58, y genisteína. En un modo de realización específico, el inhibidor de proteasas de los mastocitos son inhibidores de fosfatidilinositol-3’-cinasa (PI3), como por ejemplo, sin carácter limitativo, calfostina C. En otro modo de realización, el inhibidor de proteasa de los mastocitos es un inhibidor de proteínas cinasas como por ejemplo, sin carácter limitativo, estaurosporina. Según este modo de realización, el inhibidor de proteasas de los mastocitos se administra preferiblemente de manera local sobre el área afectada.
[0271] Los anticuerpos de la invención o terapias combinadas de la invención pueden usarse como la primera, segunda, tercera, cuarta o quinta terapia para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo. La invención incluye también usos para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo en un paciente sometido a terapias para otras enfermedades o trastornos. La invención abarca usos para la prevención, control, tratamiento y/o mejora de un trastorno inflamatorio
o uno o más síntomas del mismo en un paciente ante cualquier efecto adverso o intolerancia a terapias distintas de los anticuerpos que desarrolla la invención. La invención también abarca usos para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o un síntoma del mismo en pacientes resistentes. La invención abarca usos para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno proliferativo o un síntoma del mismo en un paciente que ha mostrado ser resistente a las terapias diferentes de los anticuerpos, composiciones, o terapias combinadas de la invención. La determinación de si un paciente es resistente puede llevarse a cabo in vivo o in vitro mediante cualquier método conocido en la técnica para ensayar la efectividad de un tratamiento de trastornos proliferativos,
utilizando significados de “resistente” aceptados en la técnica en dicho contexto. En determinados modos de
realización, un paciente con un trastorno inflamatorio es resistente a una terapia cuando no se previene, controla y/o alivia la inflamación. La invención abarca además usos de prevención, control, tratamiento y/o mejora de un trastorno inflamatorio o un síntoma del mismo en pacientes susceptibles de sufrir reacciones adversas a las terapias convencionales.
[0272] La invención abarca usos para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o un síntoma del mismo en un paceinte que ha mostrado ser resistente a las terapias distintas de los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 pero que ya no se encuentran sometidos a esas terapias. En determinados modos de realización, los pacientes que están siendo controlados o tratados según los métodos de esta invención son pacientes que ya están siendo tratados con agentes antiinflamatorios, antibióticos, terapia antiviral, antifúngicos, u otras inmunoterapias/terapias biológicas. Entre estos pacientes se encuentran pacientes resistentes, pacientes que son demasiado jóvenes para las terapias convencionales, y pacientes con trastornos inflamatorios que vuelven a aparecen a pesar del control o tratamiento con terapias existentes.
[0273] La presente invención abarca usos para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno inflamatorio o uno
o más síntomas del mismo como una alternativa a otras terapias convencionales. En determinados modos de realización, el paciente que está siendo controlado o tratado según los métodos de la invención es resistente a otras terapias o es susceptible de sufrir reacciones adversas a dichas terapias. El paciente puede ser una persona con el sistema inmunitario debilitado (p.ej., pacientes posoperatorios, pacientes de quimioterapia, y pacientes con enfermedades de inmunodeficiencia, pacientes con displasia broncopulmonar, pacientes con enfermedad cardiaca congénita, pacientes con fibrosis cística, pacientes con enfermedad cardiaca congénita o adquirida, y pacientes que sufren una infección), una persona con deterioro de la función renal o hepática, ancianos, niños, bebés, bebés nacidos de forma prematura, personas con trastornos neuropsiquiátricos o aquellos que toman fármacos psicotrópicos, personas con antecedentes de convulsiones, o personas que toman medicación que interactuaría de manera negativa con los agentes convencionales utilizados para prevenir, controlar, tratar o mejorar una infección respiratoria viral o uno o más síntomas de la misma.
[0274] Las terapias antiinflamatorias y sus dosis, vías de administración y uso recomendado son conocidos en la técnica y han sido descritos en la literatura como el Physician’s Desk Reference (57º ed., 2003).
5.4 COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN DE LOS ANTICUERPOS
[0275] La invención facilita la prevención, tratamiento, control y/o mejora de trastornos asociados a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, trastornos asociados a la expresión y/o actividad aberrante de un IL9R o una o más subunidades del mismo, trastornos inflamatorios o uno o más síntomas de los mismos. En un modo de realización específico, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención. En otro modo de realización, la composición comprende uno o más anticuerpos de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de los anticuerpos de la invención, sabiéndose que dichos agentes son útiles o han sido utilizados o se utilizan actualmente para la prevención, tratamiento, control y/o mejora de trastornos asociados a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, trastornos asociados a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, trastornos inflamatorios, o uno o más síntomas de los mismos.
[0276] En un modo de realización, la composición comprende un fragmento de un anticuerpo de la invención que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9. En otro modo de realización, comprende un fragmento de un anticuerpo de la invención que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 en combinación con una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos), distintos al fragmento de anticuerpo de la invención.
[0277] En un modo de realización específico, la composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, o uno o más fragmentos de anticuerpo de la invención, y uno o más agentes inmunomoduladores. En un modo de realización específico, la composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, o fragmentos de anticuerpo de la invención, y uno o más moduladores de mastocitos. En otro modo de realización, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención o uno o más fragmentos de anticuerpos de la invención, y uno o más agentes antiangiogénicos. En otro modo de realización, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, fragmentos de anticuerpos de la invención, y uno o más agentes antiinflamatorios. En otro modo de realización, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, o fragmentos de anticuerpos de la invención y uno o más agentes anticancerígenos. Según este modo de realización, el agente anticancerígeno puede
o no ser un agente inmunomodulador o agente antiangiogénico. En otro modo de realización, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, o fragmentos de anticuerpos de la invención y uno o más agentes antivirales. En otro modo de realización, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, o fragmentos de anticuerpos de la invención, o uno o más agentes antibacterianos. En otro modo de realización, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, o fragmentos de anticuerpos de la invención, o uno o más agentes antifúngicos. En otro modo de realización más, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, o fragmentos de anticuerpos de la invención, y cualquier combinación de uno, dos, tres o más de cada uno de los siguientes agentes profilácticos o terapéuticos: un agente inmunomodulador, un modulador de mastocitos, un agentes antiangiogénico, un agente anticancerígeno distinto a un agente inmunomodulador o agente antiangiogénico, un agente antiinflamatorio, un agente antiviral, un agente antibacteriano, un agente antifúngico.
[0278] En un modo de realización específico, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, o uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención y uno o más antagonistas del TNF-α (p.ej.,
ENBREL y/o REMICADE®). En otro modo de realización, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, fragmentos de anticuerpos de la invención, y uno o más antagonistas de la integrina αvβ. En otro modo de realización, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención, fragmentos de anticuerpos de la invención, y VITAXIN , siplizumab, palivizumab, un inhibidor de EphA2, o cualquier combinación de los mismos. Además de los agentes profilácticos o terapéuticos, las composiciones de la invención pueden comprender también un portador.
[0279] Las composiciones de la invención incluyen composiciones de fármaco a granel útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas (p.ej., composiciones que son adecuadas para su administración a un sujeto o paciente) que pueden usarse en la preparación de formas de unidad de dosis. En un modo de realización preferido, una composición de la invención es una composición farmacéutica. Dichas composiciones comprenden una cantidad efectiva de forma terapéutica o profiláctica de uno o más agentes terapéuticos o profilácticos (p.ej., un anticuerpo de la invención; polipéptido, péptido, o proteína que comprende un fragmento de anticuerpo de la invención, u otro agente terapéutico o profiláctico), y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se formulan de forma que sean adecuadas para la vía de administración a un sujeto. En un modo de realización preferido, una composición farmacéutica de la invención se formula en viales de dosis única como un líquido estéril que contiene 10 mM de tampón de histidina a pH 6,0 y 150 mM de cloruro sódico. Cada 1,0 mL de solución contiene 100 mg de proteína, 1,6 mg de histidina y 8,9 mg de cloruro sódico en agua para una estabilidad y solubilidad óptimas.
[0280] En un modo de realización específico, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una
agencia reguladora del gobierno federal o u gobierno estatal estadounidense o enlistado en la Farmacopea estadounidense u otra farmacopea reconocida de forma general para su uso en animales, y más específicamente en humanos. El término “portador” hace referencia a un diluyente, adyuvante (p.ej., adyuvante de Freund (completo e incompleto)), excipiente, o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones de glicerol y dextrosa acuosas también pueden usarse como portadores líquidos, especialmente para las soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener también pequeñas cantidades de agentes humectantes o agentes emulsionantes, o agentes amortiguadores de pH. Estas composiciones pueden presentar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares.
[0281] Generalmente, los ingredientes de las composiciones de la invención se suministran bien de forma separada
o bien mezclados en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado como una ampolla o sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composición se vaya a administrar mediante infusión, puede prepararse con una botella de infusión que contenga solución salina o agua de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se vaya a administrar mediante inyección, se puede facilitar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de forma que los ingredientes puedan mezclarse antes de su administración.
[0282] Las composiciones de la presente invención pueden formularse como formas de sales o neutras. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones como aquellas que se derivan de ácidos tartárico, oxálico, acético, fosfórico, clorhídrico, etc., y aquellas formadas con cationes como aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos de hierro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamina etanol, histidina, procaína, etc.
[0283] Se conocen diversos sistemas de administración en la técnica y pueden utilizarse para administrar un agente profiláctico o terapéutico o composiciones de la invención para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad
o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio, un trastorno autoinmune, un trastorno proliferativo, o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria) o uno o más síntomas de los mismos, p.ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptores (véase, p.ej., Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432(1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos de administración de una terapia (p.ej., agente profiláctico o terapéutico) de la invención incluyen, sin carácter limitativo, la administración parenteral (p.ej., intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral, y administración por la mucosa (p.ej., vía intranasal y oral). Además, también puede emplearse la administración pulmonar, p.ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de aerosolización. Véase, p.ej. las patentes estadounidenses nº 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, y 4.880.078; y publicaciones PCT nº WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903. En un modo de realización, un anticuerpo, terapia combinada, o una composición de la invención se administra utilizando tecnología de administración pulmonar de fármacos AIR de Alkermes (Alkermes, Inc., Cambridge, MA). En un modo de realización específico, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se administran por vía intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través del revestimiento epitelial o mucocutáneo (p.ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto a otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
[0284] En un modo de realización específico, puede ser deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención de forma local en el área que necesita el tratamiento: esto puede lograrse, por ejemplo, mediante, sin carácter limitativo, infusión local, mediante inyección, o por medio de un implante, siento dicho implante de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, como membranas de silastic, polímeros, matrices fibrosas (p.ej., Tissuel®), o matrices de colágeno. En un modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención de manera local al área afectada a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio. En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención de manera local al área afectada en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (p.ej., uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) distintos de un anticuerpo de la invención a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio. En otro modo de realización, se administra una cantidad efectiva de una terapia como un modulador de mastocitos (p.ej., inhibidor del factor de células madre (ligando del receptor c-kit) (p.ej., mAb 7H6, mAb 8H7a, pAb 1337, FK506, CsA, dexametasona y fluocinonida), un inhibidor del receptor c-kit (p.ej., STI 571 (antes conocido como CGP 57148B)), un inhibidor de proteasas de los mastocitos (p.ej., GW-45, GW-58, wortmanina, LY 294002, calfostina C, citocalasina D, genisteína, KT5926, estaurosporina y lactoferrina), y relaxina
(“RLX”)) de manera local al área afectada a un sujeto con riesgo de sufrir o que sufre una enfermedad o trastorno
asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio.
[0285] En otro modo de realización, una terapia de la invención puede administrarse en un sistema de liberación controlara o liberación sostenida. En un modo de realización, puede usarse una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otro modo de realización, se pueden utilizar materials poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (véase, p.ej., Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); patente estadounidense nº 5.679.377; patente estadounidense nº 5.916.597; patente estadounidense nº 5.912.015; patente estadounidense nº 5.989.463; patente estadounidense nº 5.128.326; publicación PCT nº WO 99/15154; y publicación PCT nº WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros utilizados en las formulaciones de liberación sostenida incluyen, sin carácter limitativo, poli(2-hidroxietil metacrilato), poli(metil metacrilato), ácido poliacrílico, poli(etileno-acetato de vinilo), ácido polimetacrílico, ácidos poliglicólicos (PLG), polianhidridos, poli(N-vinil pirrolidona), alcohol polivinílico, poliacrilamida, polietilenglicol, poliláctidos (PLA), poli(láctido-co-glicólicos) (PLGA), y poliortoesteres. En un modo de realización preferido, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable al almacenamiento, estéril y biodegradable. En ontro modo de realización más, un sistema de liberación controlada o sostenida puede situarse próximo al objetivo profiláctico o terapéutico, necesitando así únicamente una fracción de la dosis sistémica (véase, p.ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
[0286] Los sistemas de liberación controlada se analizan en la publicación de Langer (1990, Science 249:15271533). Se puede usar cualquier técnica conocida por aquellos con habilidad en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véase, p.ej., la patente estadounidense nº 4.526.938, la publicación PCT WO 91/05548, publicación PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, “Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel”, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions, “ PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, y Lam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery”, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
[0287] En un modo de realización específico, cuando la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para fomentar la expresión del agente profiláctico o terapéutico codificado, elaborándolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico adecuado y administrándolo de forma que llegue a ser intracelular, p.ej., mediante el uso de un vector retroviral (véase la patente estadounidense nº 4.980.286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de un bombardeo de micropartículas (p.ej., una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o revestimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección o mediante su administración unido a un péptido similar a la homeosecuencia conocido por entrar en el núcleo (véase, p.ej., Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Alternativamente, puede introducirse un ácido nucléico de forma intracelular e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para expresión mediante recombinación homóloga.
[0288] Se formula una composición farmacéutica de la invención para que sea compatible con su vía de administración deseada. Los ejemplos de vías de administración incluyen, sin carácter limitativo, la administración parenteral, p.ej., intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (p.ej., inhalación), transdérmica (p.ej., tópica), transmucosa, y rectal. En un modo de realización específico, se formula la composición según los procedimientos habituales como composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal o tópica a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico y estéril. Si fuera necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizante y un anestésico local como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.
[0289] Si las composiciones de la invención se van a administrar por vía tópica, las composiciones pueden formularse en forma de ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, spray, aerosol, solución, emulsión u otra forma conocida por aquellos con habilidad en la técnica. Véase, p.ej., Remington’s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19º ed., Mack Pub. Co., Easton, PA (1995). Para formas de dosificación tópica no pulverizables, se emplean normalmente formas de viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un portador o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin carácter limitativo, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, pomadas y similares, que son si se desea, esterilizados o mezclados con agentes auxiliares (p.ej., conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, soluciones amortiguadoras o sales) para influir en diversas propiedades como, por ejemplo, la presión osmótica. Otras formas farmacéuticas tópicas adecuadas incluyen preparaciones en aerosol pulverizables en las que el ingrediente activo, preferiblemente en combinación con un portador inerte sólido o líquido, se envasa en una mezcla con un volátil presurizado (p.ej., propulsor gaseoso, como freón) o en un frasco exprimible. También pueden añadirse humectantes o hidratantes a las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas si se desea. Los ejemplos de dichos ingredientes adiciones son concidos en la técnica.
[0290] Si el uso de la invención comprende la administración intranasal de una composición, la composición puede formularse en forma de aerosol, espray, vapor o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para su uso según la presente invención pueden administrarse convenientemente en forma de una presentación en aerosol o espray a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (p.ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otros gases adecuados). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se puede formular cápsulas o cartuchos (compuestos de, p.ej., gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador que contenga una mezcla de polvo del compuesto y una base en polvo adecuada como lactosa o almidón.
[0291] Si el uso de la invención comprende la administración oral, las composiciones pueden formularse por vía oral en forma de comprimidos, cápsulas, sellos, cápsulas de gel, soluciones, suspensiones, y similares. Los comprimidos
o cápsulas pueden prepararse por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables como agentes de enlace (p.ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); rellenos (p.ej., lactosa, celulosa microcristalina, o calcio hidrógeno fosfato); lubricantes (p.ej., estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (p.ej., almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (p.ej., laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por métodos conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma de, sin carácter limitativo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables como agentes de suspensión (p.ej., jarabe de sorbitol, derivados de la celulosa, o grasas hidrogenadas comestibles), agentes emulsionantes (p.ej., lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p.ej., aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p.ej., metil o propil p-hidroxibenzoato o ácido sórbico). Las preparaciones pueden contener también sales amortiguadoras, agentes saborizantes, colorantes, y edulcorantes según proceda. Las preparaciones para la administración oral pueden formularse adecuadamente para la liberación lenta, liberación controlada, o liberación sostenida de un agente(s) profiláctico o terapéutico.
[0292] El uso de la invención puede comprender la administración pulmonar, p.ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente de aerosolización. Véase, p.ej., las patentes estadounidenses nº 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y publicaciones PCT nº WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903. En un modo de realización específico, un anticuerpo de la invención, terapia combinada, y/o composición de la invención se administra utilizando tecnología de administración pulmonar de fármacos AIR de Alkermes (Alkermes, Inc., Cambridge, MA).
[0293] El uso de la invención puede comprender la administración de una composición formulada para la administración parenteral por inyección (p.ej., por inyección de bolo o infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis unitarias (p.ej., en ampollas o en recipientes multidosis) con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar las formas de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado (p.ej., agua estéril libre de pirógenos) antes de su uso.
[0294] Los usos de la invención pueden comprender además la administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Dichas formulación de acción prolongada pueden administrarse mediante la implantación (p.ej., de forma subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. De ese modo, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (p.ej., como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o derivados escasamente solubles (p.ej., como una sal poco soluble).
[0295] Los usos de la invención abarcan la administración de composiciones formuladas como formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones como aquellos derivados de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes como aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos de hierro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamina etanol, histidina, procaína, etc.
[0296] Generalmente, los ingredientes de las composiciones se suministran bien por separado o bien mezclados en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado como una ampolla o sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composición se vaya a administrar mediante infusión, la composición puede prepararse con una botella de infusión que contenga solución salina o agua de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se vaya a administrar mediante inyección, se puede facilitar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de forma que los ingredientes puedan mezclarse antes de su administración.
[0297] En particular, la invención también proporciona uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la invención se envasan en recipientes sellados de forma hermética como una ampolla o sobre indicando la cantidad de agente. En un modo de realización, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la invención se suministran como un polvo liofilizado y esterilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente sellado de forma hermética y pueden ser reconstituidos (p.ej., con solución salina o agua) a la concentración adecuada para su administración a un sujeto. Preferiblemente, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas de la invención se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente sellado en una dosis unitaria de al menos 5 mg, más preferiblemente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg, o al menos 100 mg. Las composiciones farmacéuticas o agentes terapéuticos o profilácticos liofilizados de la invención deben almacenarse a una temperatrua de entre 2ºC y 8ºC en su recipiente original y las composiciones farmacéuticas o agentes terapéuticos o profilácticos de la invención deben administrarse en el plazo de una semana, más preferiblemente en el plazo de 5 días, de 72 horas, de 48 horas, de 24 horas, de 12 horas, de 6 horas, de 5 horas, de 3 horas, o de una hora tras haber sido reconstituidos. En un modo de realización alternativo, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en forma líquida en un recipiente herméticamente sellado indicando la cantidad y concentración del agente. Preferiblemente, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un recipiente herméticamente sellado de al menos 0,25 mg/ml, más preferiblemente al menos 0,5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml. La forma líquida debe almacenarse a una temperatura de entre 2ºC y 8ºC en su recipiente original.
[0298] Generalmente, los ingredientes de las composiciones de la invención provienen de un sujeto que presente el mismo origen de especie o la misma reactividad de especie que el receptor de dichas composiciones. Por lo tanto, en un modo de realización preferido, se administran anticuerpos humanos o humanizados a un paciente humano para terapia o profilaxis.
5.4.1 Terapia génica
[0299] Las secuencias de nucleótidos que comprenden ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de la invención u otro agente terapéutico o profiláctico pueden administrarse para tratar, prevenir, controlar y/o mejorar una infección respiratoria o uno o más síntomas de la misma por medio de la terapia génica. La terapia génica hace referencia a la terapia llevada a cabo mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En este modo de realización, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado de la invención o agente profiláctico o terapéutico que actúa como mediador de un efecto profiláctico o terapéutico.
[0300] Cualquiera de los usos de la terapia génica disponibles en la técnica puede utilizarse según la presente invención. Para análisis generales de los métodos de la terapia génica, véase Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Mayo, 1993, TIBTECH 11 (5):155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante que puede utilizarse se describe en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
[0301] La invención puede comprender la administración de una composición que comprende ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico, siendo parte dichos ácidos nucleicos de un vector de expresión que expresa un anticuerpo de la invención, otro agente profiláctico o terapéutico, o fragmentos o proteínas quiméricas o cadenas ligeras o pesadas de los mismos en un huésped adecuado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, preferiblemente promotores heterólogos, unidos de forma operativa a la región de codificación de anticuerpo, siendo dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico de tejido. Pueden usarse moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias de codificación de un anticuerpo de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico y cualquier otra secuencia deseada están flanqueadas por regiones que fomentan la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (Koller y Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438). En modos de realización específicos, el anticuerpo expresado de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico es un anticuerpo de cadena simple; alternativamente, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican tanto las cadenas pesadas como las ligeras, o fragmentos de las mismas, del anticuerpo de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico.
[0302] La administración de los ácidos nucleicos en el sujeto puede ser directa, en cuyo caso el sujeto es expuesto directamente al ácido nucleico o vectores que portan ácidos nucleicos, o indirecta, en cuyo caso, las células se transforman primero con los ácidos nucleicos in vitro, y se transplantan después en el sujeto. Estos dos métodos son conocidos, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.
[0303] En un modo de realización específico, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, cuando se expresan para producir un producto codificado. Esto puede lograrse por cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica, p.ej., construyéndolos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de forma que lleguen a ser intracelulares, p.ej., mediante infección utilizando retrovirales atenuados o defectuosos u otros vectores virales (véase la patente estadounidense nº 4.980.286), o mediante inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (p.ej., una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas, o microcápsulas, o administrándolos unidos a un péptido que sea conocido por entrar en el núcleo, mediante su administración unidos a un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptores (véase, p.ej., Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (el cual puede utilizarse con tipos de célula diana que expresan específicamente los receptores). En otro modo de realización, pueden formarse complejos de ácido nucleico-ligandos en los que el ligando comprende un péptido viral fusogénico para alterar endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En otro modo de realización más, el ácido nucleico puede convertirse en objetivo in vivo de expresión y captación celular específica, mediante la identificación de un receptor específico (véase, p.ej., las publicaciones internacionales nº WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188; y WO 93/20221). Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse de forma intracelular e incorporarse en el ADN de la célula huésped para su expresión, mediante recombinación homóloga (Koller y Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435438).
[0304] En un modo de realización específico, se utilizan los vectores virales que contienen las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de la invención, otro agente terapéutico o profiláctico, o fragmentos del mismo. Por ejemplo, puede utilizarse un vector retroviral (véase, Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto envase del genoma viral e integración en el ADN de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico que se vaya a usar en terpaia génica son clonadas en uno o más vectores, lo que facilita la administración del gen en el sujeto. Se pueden encontrar más detalles acerca de los vectores retrovirales en Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, que describe el uso de un vector retroviral para administrar el gen mdr1 a células madre hematopoyéticas para hacer las células madre más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Klein et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons y Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; y Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3:110-114.
[0305] Los adenovirus son otros vectores virales que pueden utilizarse en la terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para administrar genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan de forma natural el epitelio respiratorio, donde causan una enfermedad leve. Otros objetivos para los sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales, y músculos. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 presentan un análisis de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de macacos rhesus. Se pueden encontrar otros ejemplos del uso de adenovirus en la terapia génica en Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234; Publicación PCT WO 94/12649; y Wang et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783. En un modo de realización preferido, se utilizan vectores de adenovirus.
[0306] También se ha propuesto el uso de virus adeno-asociados (AAV) en terapia génica (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300; y patente estadounidense nº 5.436.146).
[0307] Otro método de la terapia génica implica transferir un gen a células en un cultivo de tejido mediante métodos como la electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio, o infección viral. Normalmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Después, las células se sitúan bajo selección para asilar aquellas células que hayan acogido y estén expresando el gen transferido. Después, se administran esas células a un paciente.
[0308] En este modo de realización, se introduce el ácido nucleico en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Dicha introducción puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin carácter limitativo, la transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contenga las secuencias de ácido nucleico, fusión de células, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. Se conocen numerosos métodos en la técnica para la introducción de genes extraños en las células (véase, p.ej., Loeffler y Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Clin. Pharma. Ther. 29:69-92 (1985)) y pueden usarse según la presente invención, siempre que no se alteren las funciones fisiológicas y de desarrollo necesarias de las células receptoras. La técnica debe facilitar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de forma que el ácido nucleico sea expresable por la célula y preferiblemente hereditaria y expresable por su progenie celular.
[0309] Las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un sujeto por diversos métodos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinantes (p.ej., células madre o progenitoras hematopoyéticas) se administran preferiblemente por vía intravenosa. La cantidad de células previstas para su uso depende de diversos factores incluyendo, sin carácter limitativo, los efectos deseados y el estado del paciente, y puede determinarse por una persona con habilidad en la técnica.
[0310] Las células en las que se puede introducir un ácido nucleico para fines de la terpaia génica abarcan cualquier tipo celular deseado y disponible, e incluyen, sin carácter limitativo, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos, megacariocitos, granulocitos; diversas células progenitoras o madre, en especial células progenitoras o madre hemotopoyéticas (p.ej., como las obtenidas de la médula ósea, la sangre del cordón umbilical, la sangre periférica, el hígado del feto, etc.) En un modo de realización preferido, la célula utilizada en la terapia génica es autóloga del sujeto.
[0311] En un modo de realización en el que las células recombinantes se usan en terapia génica, se introducen secuencias de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo en las células de forma que sean expresables por las células o su pirogenie, y después se administran las células recombinantes in vivo para los efectos terapéuticos. En un modo de realización específico, se utilizan células madre o progenitoras. Cualquier célula madre y/o progenitora que pueda ser aislada y mantenida in vitro puede ser utilizada potencialmente según este modo de realización de la presente invención (véase, p.ej., la publicación PCT WO 94/08598; Stemple y Anderson, 1992, Cell 7 1:973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21 A:229; y Pittelkow y Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771).
[0312] En un modo de realización específico, el ácido nucleico que va a introducirse para fines de terapia génica comprende un promotor inducible enlazado de manera operativa a la región de codificación, de forma que la expresión del ácido nucleico sea controlable mediante el control de la presencia o ausencia del inductor de transcripción adecuado.
5.5 DOSIS Y FRECUENCIA DE LA ADMINISTRACIÓN
[0313] La cantidad de un agente profiláctico o terapéutico o una composición de la invención que será efectiva en la prevención, tratamiento, control y/o mejora de un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma puede determinarse mediante métodos clínicos estándares. La frecuencia y dosis variará también según los factores específicos de cada paciente dependiendo de las terapias específicas (p.ej., el agente o agentes profilácticos o terapéuticos específicos) administradas, la gravedad del trastorno, enfermedad o afección, la vía de administración, así como la edad, cuerpo, peso, respuesta y el historial médico previo del paciente. Por ejemplo, la dosis de un agente profiláctico o terapéutico o una composición de la invención que será efectiva en el tratamiento, prevención, control y/o mejora de un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio, un trastorno proliferativo o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria), o uno o más síntomas de las mismas puede determinarse mediante la administración de la composición a un modelo animal como, p.ej., los modelos animales revelados aquí o conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Además, los ensayos in vitro pueden usarse opcionalmente para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos. Los régimenes adecuados pueden ser seleccionados por aquellos con experiencia en la técnica teniendo en cuenta dichos factores y siguiendo, por ejemplo, dosis documentadas en la literatura y recomendadas en la obra Physician’s Desk Reference (57º ed., 2003).
[0314] Las dosis ejemplares de una molécula pequeña incluyen cantidades de miligramo o microgramo de la molécula pequeña por kilogramo de peso del sujeto o muestra (p.ej., aproximadamente de 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, aproximadamente de 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 5 miligramos por kilogramos, o aproximadamente de 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo).
[0315] Para los anticuerpos, proteínas, polipéptidos, péptidos y proteínas de fusión abarcados por la invención, la dosis administrada a un paciente es normalmente de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis administrada a un paciente es de entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 5mg/kg, 0,0001 y 2 mg/kg, 0,0001 y 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, de 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, de 0,0001 a 0,15 mg/kg, de 0,0001 a 0,10 mg/kg, de 0,001 a 0,5 mg/kg, de 0,01 a 0,25 mg/kg o de 0,01 a 0,10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una vida media más larga en el cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmune a los polipéptidos extraños. Por lo tanto, a menudo son posibles unas dosis más bajas de anticuerpos humanos y la administración menos frecuente. Además, la dosis y frecuencia de la administración de anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden reducirse mejorando la absorción y penetración del tejido de los anticuerpos mediante modificaciones como, por ejemplo, lipidación.
[0316] En un modo de realización específico, la dosis administrada a un paciente se calcula utilizando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis a administrar en mg/kg. El volumen necesario (en mL) que se va a dar se determina a continuación tomando la dosis necesaria en mg dividida por la concentración del anticuerpo
o fragmento del mismo en las formulaciones (100 mg/mL). El volumen final calculado necesario se obtendrá uniendo los contenidos de tantos viales como sea necesario en una jeringa o jeringas para administrar el fármaco. Se puede inyectar un volumen máximo de 2,0 mL de anticuerpo o fragmento del mismo en las formulaciones por lugar.
[0317] En un modo de realización específico, la dosis de anticuerpos, composiciones, o terapias combinadas de la invención administrada para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio, un trastorno proliferativo o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria), o uno o más síntomas de los mismos en un paciente es de 150 μg/kg o menos, preferiblemente 125 µg/kg o menos, 100 µg/kg o menos, 95 µg/kg o menos, 90 µg/kg o menos, 85 µg/kg o menos, 80 µg/kg o menos, 75 µg/kg o menos, 70 µg/kg o menos, 65 µg/kg o menos, 60 µg/kg o menos, 55 µg/kg o menos, 50 µg/kg o menos, 45 µg/kg o menos, 40 µg/kg o menos, 35 µg/kg o menos, 30 µg/kg o menos, 25 µg/kg o menos, 20 µg/kg o menos, 15 µg/kg o menos, 10 µg/kg o menos, 5 µg/kg o menos, 2,5 µg/kg o menos, 2 µg/kg o menos, 1,5 µg/kg o menos, 1 µg/kg o menos, 0,5 µg/kg o menos, o 0,5 µg/kg o menos del peso corporal de un paciente. En otro modo de realización, la dosis de los anticuerpos, composiciones, o terapias combinadas de la invención administrada para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio, un trastorno proliferativo o una infección (preferiblemente, una infección respiratoria), o uno o más síntomas de los mismos en un paciente es una dosis unitaria de 0,1 mg a 20 mg, 0,1 mg a 15 mg, 0,1 mg a 12 mg, 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 8 mg, 0,1 mg a 7 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 a 2,5 mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 a 15 mg, 0,25 a 12 mg, 0,25 a 10 mg, 0,25 a 8 mg, 0,25 mg a 7mg, 0,25mg a 5 mg, 0,5 mga 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10mg, 1 mg a 8 mg, 1 mg a 7 mg, 1 mg a 5 mg, o 1 mg a 2,5 mg.
[0318] En determinados modos de realización, se administra a un sujeto una o más dosis de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos, composiciones, o terapias combinadas de la invención, en las que la cantidad efectiva de dichos anticuerpos, composiciones, o terapias combinadas evita en al menos de un 20% a un 25%, preferiblemente al menos de un 25% a un 30%, al menos de un 30% a un 35%, al menos de un 35% a un 40%, al menos de un 40% a un 45%, al menos de un 45% a un 50%, al menos de un 50% a un 55%, al menos de un 55% a un 60%, al menos de un 60% a un 65%, al menos de un 65% a un 70%, al menos de un 70% a un 75%, al menos de un 75% a un 80%, o hasta al menos un 85% que la IL-9 endógena se una a su receptor. En determinados modos de realización, se administra a un sujeto una o más dosis de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos, composiciones o terapias combinadas de la invención, en las que la dosis de la cantidad efectiva de dichos anticuerpos, composiciones o terapias combinadas reduce y/o inhibe la degranulación de mastocitos en al menos de un 20% a un 25%, preferiblemente al menos de un 25% a un 30%, al menos de un 30% a un 35%, al menos de un 35% a un 40%, al menos de un 40% a un 45%, al menos de un 45% a un 50%, al menos de un 50% a un 55%, al menos de un 55% a un 60%, al menos de un 60% a un 65%, al menos de un 65% a un 70%, al menos de un 70% a un 75%, al menos de un 75% a un 80%, al menos de un 80% a un 85%, al menos de un 85% a un 90%, al menos de un 90% a un 95%, o al menos de un 95% a un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) en un ensayo in vitro y/o in vivo conocido en la técnica. En determinados modos de realización, se administra a un sujeto una o más dosis de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos, composiciones o terapias combinadas de la invención, en las que la dosis de la cantidad efectiva de dichos anticuerpos, composiciones o terapias combinadas reduce y/o inhibe la activación de mastocitos en al menos de un 20% a un 25%, preferiblemente al menos de un 25% a un 30%, al menos de un 30% a un 35%, al menos de un 35% a un 40%, al menos de un 40% a un 45%, al menos de un 45% a un 50%, al menos de un 50% a un 55%, al menos de un 55% a un 60%, al menos de un 60% a un 65%, al menos de un 65% a un 70%, al menos de un 70% a un 75%, al menos de un 75% a un 80%, al menos de un 80% a un 85%, al menos de un 85% a un 90%, al menos de un 90% a un 95%, o al menos de un 95% a un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) en un ensayo in vitro y/o in vivo conocido en la técnica. En determinados modos de realización, se administra a un sujeto una o más dosis de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos, composiciones o terapias combinadas de la invención, en las que la dosis de una cantidad efectiva de dichos anticuerpos, composiciones o terapias combinadas reduce y/o inhibe la proliferación de mastocitos en al menos de un 20% a un 25%, preferiblemente al menos de un 25% a un 30%, al menos de un 30% a un 35%, al menos de un 35% a un 40%, al menos de un 40% a un 45%, al menos de un 45% a un 50%, al menos de un 50% a un 55%, al menos de un 55% a un 60%, al menos de un 60% a un 65%, al menos de un 65% a un 70%, al menos de un 70% a un 75%, al menos de un 75% a un 80%, al menos de un 80% a un 85%, al menos de un 85% a un 90%, al menos de un 90% a un 95%, o al menos de un 95% a un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) en un ensayo in vitro y/o in vivo conocido en la técnica. En determinados modos de realización, se administra a un sujeto una o más dosis de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos, composiciones o terapias combinadas de la invención, en las que la dosis de una cantidad efectiva de dichos anticuerpos, composiciones o terapias combinadas reduce y/o inhibe la infiltración de mastocitos en al menos de un 20% a un 25%, preferiblemente al menos de un 25% a un 30%, al menos de un 30% a un 35%, al menos de un 35% a un 40%, al menos de un 40% a un 45%, al menos de un 45% a un 50%, al menos de un 50% a un 55%, al menos de un 55% a un 60%, al menos de un 60% a un 65%, al menos de un 65% a un 70%, al menos de un 70% a un 75%, al menos de un 75% a un 80%, al menos de un 80% a un 85%, al menos de un 85% a un 90%, al menos de un 90% a un 95%, o al menos de un 95% a un 98% en comparación con un control como solución salina fosfatada (PBS) en un ensayo in vitro y/o in vivo conocido en la técnica.
[0319] En otros modos de realización, se administra a un sujeto una o más dosis de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención, en las que la dosis de una cantidad efectiva logra un título sérico de al menos 0,1 µg/ml, al menos 0,5 µg/ml, al menos 1 µg/ml, al menos 2 µg/ml, al menos 5 µg/ml, al menos 6 µg/ml, al menos 10 µg/ml, al menos 15 µg/ml, al menos 20 µg/ml, al menos 25 µg/ml, al menos 50 µg/ml, al menos 100 µg/ml, al menos 125 µg/ml, al menos 150 µg/ml, al menos 175 µg/ml, al menos 200 µg/ml, al menos 225 µg/ml, al menos 250 µg/ml, al menos 275 µg/ml, al menos 300 µg/ml, al menos 325 µg/ml, al menos 350 µg/ml, al menos 375 µg/ml, o al menos 400 µg/ml de los anticuerpos de la invención. En otros modos de realización más, se administra a un sujeto una dosis de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención para lograr un título sérico de al menos 0,1 µg/ml, al menos 0,5 µg/ml, al menos 1 µg/ml, al menos 2 µg/ml, al menos 5 µg/ml, al menos 6 µg/ml, al menos 10 µg/ml, al menos 15 µg/ml, al menos 20 µg/ml, al menos 25 µg/ml, al menos 50 µg/ml, al menos 100 µg/ml, al menos 125 µg/ml, al menos 150 µg/ml, al menos 175 µg/ml, al menos 200 µg/ml, al menos 225 µg/ml, al menos 250 µg/ml, al menos 275 µg/ml, al menos 300 µg/ml, al menos 325 µg/ml, al menos 350 µg/ml, al menos 375 µg/ml, o al menos 400 µg/ml de los anticuerpos y se administra una dosis posterior de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención para mantener un título sérico de al menos 0,1 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1 µg/ml, al menos 2 µg/ml, al menos 5 µg/ml, al menos 6 µg/ml, al menos 10 µg/ml, al menos 15 µg/ml, al menos 20 µg/ml, al menos 25 µg/ml, al menos 50 µg/ml, al menos 100 µg/ml, al menos 125 µg/ml, al menos 150 µg/ml, al menos 175 µg/ml, al menos 200 µg/ml, al menos 225 µg/ml, al menos 250 µg/ml, al menos 275 µg/ml, al menos 300 µg/ml, al menos 325 µg/ml, al menos 350 µg/ml, al menos 375 µg/ml, o al menos 400 µg/ml. Según estos modos de realización, se puede administrar a un sujeto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más dosis posteriores.
[0320] En un modo de realización específico, la invención proporciona métodos para prevenir, tratar, controlar, o tratar una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que lo necesite de una dosis de al menos 10 µg, preferiblemente al menos 15 µg, al menos 20 µg, al menos 25 µg, al menos 30 µg, al menos 35 µg, al menos 40 µg, al menos 45 µg, al menos 50 µg, al menos 55 µg, al menos 60 µg, al menos 65 µg, al menos 70 µg, al menos 75 µg, al menos 80 µg, al menos 85 µg, al menos 90 µg, al menos 95 µg, al menos 100 µg, al menos 105 µg, al menos 110 µg, al menos 115 µg, o al menos 120 µg de uno o más anticuerpos, terapias combinadas o composiciones de la invención. En otro modo de realización, la invención proporciona un método para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo, comprendiendo dichos métodos la administración a un sujeto que lo necesite de una dosis de al menos 10 µg, preferiblemente al menos 15 µg, al menos 20 µg, al menos 25 µg, al menos 30 µg, al menos 35 µg, al menos 40 µg, al menos 45 µg, al menos 50 µg, al menos 55 µg, al menos 60 µg, al menos 65 µg, al menos 70 µg, al menos 75 µg, al menos 80 µg, al menos 85 µg, al menos 90 µg, al menos 95 µg, al menos 100 µg, al menos 105 µg, al menos 110 µg, al menos 115 µg, o al menos 120 µg de uno o más anticuerpos, terapias combinadas, o composiciones de la invención una vez cada 3 días, preferiblemente, una vez cada 4 días, una vez cada 5 días, una vez cada 6 días, una vez cada 7 días, una vez cada 8 días, una vez cada 10 días, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes.
[0321] La presente invención proporciona métodos para prevenir, tratar, controlar o prevenir una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de los mismos, comprendiendo dicho método: (a) administrar a un sujeto que lo necesite una o más dosis de una cantidad efectiva profilácticamente o terapéuticamente de uno o más anticuerpos, terapias combinadas o composiciones de la invención; y (b) monitorizar el nivel plasmático/concentración de dicho anticuerpo o anticuerpos administrados en dicho sujeto tras la administración de un determinado número de dosis de dicho anticuerpo o anticuerpos. Además, preferiblemente, dicho determinado número de dosis es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 dosis de una cantidad efectiva profilácticamente o terapéuticamente de uno o más anticuerpos, composiciones o terapias combinadas de la invención.
La invención proporciona un uso para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma, comprendiendo dicho uso: (a) administrar a un sujeto que lo necesite una dosis de al menos 10 µg (preferiblemente al menos 15 µg, al menos 20 µg, al menos 25 µg, al menos 30 µg, al menos 35 µg, al menos 40 µg, al menos 45 µg, al menos 50 µg, al menos 55 µg, al menos 60 µg, al menos 65 µg, al menos 70 µg, al menos 75 µg, al menos 80 µg, al menos 85 µg, al menos 90 µg, al menos 95 µg, o al menos 100 µg) de uno o más de los anticuerpos de la invención; y (b) administrar una o más dosis posteriores a dicho sujeto cuando el nivel plasmático del anticuerpo o anticuerpos administrados a dicho sujeto sea inferior a 0,1 µg/ml, preferiblemente inferior a 0,25 µg/ml, inferior a 0,5 µg/ml, inferior a 0,75 µg/ml, o inferior a 1 µg/ml. La invención proporciona un uso para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo, comprendiendo dicho método: (a) administrar a un sujeto que lo necesite una o más dosis de al menos 10 µg (preferiblemente al menos 15 µg, al menos 20 µg, al menos 25 µg, al menos 30 µg, al menos 35 µg, al menos 40 µg, al menos 45 µg, al menos 50 µg, al menos 55 µg, al menos 60 µg, al menos 65 µg, al menos 70 µg, al menos 75 µg, al menos 80 µg, al menos 85 µg, al menos 90 µg, al menos 95 µg, o al menos 100 µg) de uno o más de los anticuerpos de la invención; y (b) controlar el nivel plasmático del anticuerpo o anticuerpos de la invención administrados a dicho sujeto tras la administración de un determinado número de dosis; y (c) administrar una dosis posterior del anticuerpo o anticuerpos de la invención cuando el nivel plasmático del anticuerpo o anticuerpos administrados a dicho sujeto sea inferior a 0,1 µg/ml, preferiblemente inferior a 0,25 µg/ml, inferior a 0,5 µg/ml, inferior a 0,75 µg/ml, o inferior a 1 µg/ml. Preferiblemente, dicho número determinado de dosis es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 dosis de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención.
[0322] Las terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos), distintos de los anticuerpos de la invención, que han sido utilizados, o se utilizan actualmente para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma pueden administrarse en combinación con uno o más anticuerpos de la invención según los métodos de la invención para tratar, controlar, prevenir y/o mejorar una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma. Preferiblemente, las dosis de agentes profilácticos o terapéuticos utilizados en las terapias combinadas de la invención son más bajas que aquellas que se han utilizado o se están utilizando actualmente para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma. Las dosis recomendadas de agentes usadas actualmente para la prevención, tratamiento, control o mejora de una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R
o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma pueden obtenerse a partir de cualquier referencia en la técnica incluyendo, sin carácter limitativo, Hardman et al., eds., 2001, Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Basis of Therapeutics, 10º ed., McGraw-Hill, New York; Physician’s Desk Reference (PDR) 57º ed., 2003, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ.
[0323] En diversos modos de realización, las terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) se administran con menos de 5 minutos de diferencia, menos de 30 minutos de diferencia, 1 hora de diferencia, aproximadamente a 1 hora de diferencia, aproximadamente de 1 hora a aproximadamente 2 horas de diferencia, aproximadamente de 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, aproximadamente de 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, aproximadamente de 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, aproximadamente de 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, aproximadamente de 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, aproximadamente de 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, aproximadamente de 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, aproximadamente de 9 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, aproximadamente de 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, aproximadamente de 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, aproximadamente de 12 horas a 18 horas de diferencia, de 18 horas a 24 horas de diferencia, de 24 horas a 36 horas de diferencia, de 36 horas a 48 horas de diferencia, de 48 horas a 52 horas de diferencia, de 52 horas a 60 horas de diferencia, de 60 horas a 72 horas de diferencia, de 72 horas a 84 horas de diferencia, de 84 horas a 96 horas de diferencia, o de 96 horas a 120 horas de diferencia. En modos de realización preferidos, se administran dos o más terapias en la misma visita del paciente.
[0324] En determinados modos de realización, se administran cíclicamente uno o más anticuerpos de la invención y una o más terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos). La terapia de ciclos implica la administración de una primera terapia (p.ej., un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo, seguida de la administración de una segunda terapia (p.ej., un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo, opcionalmente seguido de la administración de una tercera terapia (p.ej., un agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo, etcétera, y repetir esta administración secuencial, es decir, el ciclo para reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias, para evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias, y/o para mejorar la eficacia de las terapias.
[0325] En determinados modos de realización, la administración de los mismos anticuerpos de la invención puede repetirse y las administraciones pueden separarse por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses, o al menos 6 meses. En otros modos de realización, la administración de la misma terapia (p.ej., agente profiláctico o terapéutico) distinta a un anticuerpo de la invención puede repetirse y la administración puede separarse por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses, o al menos 6 meses.
5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS 5.6.1 Inmunoespecificidad de los anticuerpos de la invención
[0326] Los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden caracterizarse de una variedad de formas conocidas por aquellos con habilidad en la técnica. En especial, los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden someterse a ensayos para la capacidad de unirse de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9. Dicho ensayo puede llevarse a cabo en una solución (p.ej., Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421), en perlas (Lam, 1991, Nature, 354:82-84), en virutas (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), en bacterias (patente estadounidense nº 5.223.409), en esporas (patentes estadounidenses nº 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), en plásmidos (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) o en fagos (Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; y Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310). Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se ha identificado que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 pueden someterse a ensayos después para su especificidad y afinidad para un polipéptido de IL-9.
[0327] Los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden someterse a ensayos para la unión inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y la reactividad cruzada con otros antígenos mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden utilizarse para analizar el enlace inmunoespecífico y la reactividad cruzada incluyen, sin carácter limitativo, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas como el análisis de Western blot, radioinmunoanálisis, ELISA (pruebas de inmunoabsorción enzimática), inmunoensayos tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar algunos. Dichos ensayos son comunes y conocidos en la técnica (véase, p.ej., Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York. A continuación, se describen brevemente inmunoensayos ejemplares (que no pretenden tener carácter limitativo).
[0328] Los protocolos de inmunoprecipitación comprenden generalmente lisar una población de células en una solución tampón de lisis como el tampón RIPA (NP-40 o Triton X-100 al 1%, deoxicolato de sodio al 1%, SDS al 0,1%, 0,15 M NaCl, 0,01 M de fosfato de sodio a pH 7,2, Trasylol al 1%) complementada con proteínas fosfatasas y/o inhibidores de proteasas (p.ej., EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio), anadir el anticuerpo de interés al lisado celular, incubar durante un periodo de tiempo (p.ej., de 1 a 4 horas) a 40 ºC, añadir perlas de proteína A y/o proteína G sefarosa al lisado celular, incubar durante aproximadamente una hora o más a 40 ºC, lavar las perlas en solución tampón de lisis y resuspender las perlas en SDS/solución tampón muestra. Se puede evaluar la capacidad del anticuerpo de interés de inmunoprecipitar un antígeno particular, p.ej., mediante análisis de Western blot.
Aquellos con habilidad en la técnica serán conocedores de los parámetros que pueden modificarse para aumentar el enlace del anticuerpo a un antígeno y disminuir el fondo (p.ej., preaclarar el lisado celular con perlas de sefarosa). Para un mayor análisis sobre los protocolos de inmunoprecipitación véase, p.ej., Ausubel et al., eds. 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York a 10.16.01.
[0329] El análisis de Western blot comprende generalmente preparar muestras de proteínas, la electroforesis de las muestras de proteínas en un gel de poliacrilamida (p.ej., SDS-PAGE 8%-20% dependiendo del peso molecular del antígeno), transferir la muestra de proteína del gel de poliacrilamida a una membrana como nitrocelulosa, PVDF o nylon, incubar la membrana en solución de bloqueo (p.ej., PBS con 3% albúmina de suero bovino (BSA, en inglés) o leche sin grasa), lavar la membrana en tampón de lavado (p.ej., PBS-Tween 20), incubar la membrana con el anticuerpo primario (anticuerpo de interés) diluído en el tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado, incubar la membrana con un anticuerpo secundario (que reconozca al anticuerpo primario, p.ej., anticuerpo anti-humano) conjugado a un sustrato enzimático (p.ej., peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) o molécula radiactiva (p.ej., 32P o 125I) diluidos en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado, y detectar la presencia del antígeno. Aquellos con habilidad en la técnica son conocedores de los parámetros que pueden modificarse para aumentar la señal detectada y reducir el ruido de fondo. Para un mayor análisis sobre los protocolos del análisis Western blot véase, p.ej., Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York a 10.8.1.
[0330] Los ensayos ELISA comprenden preparar el antígeno, recubrir el pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con el antígeno, añadir el anticuerpo de interés conjugado a un compuesto detectable como un sustrato enzimático (p.ej., peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) al pocillo e incubar durante un periodo de tiempo, y detectar la presencia del antígeno. En los ensayos ELISA el anticuerpo de interés no tiene que estar conjugado a un compuesto detectable; en su lugar, se puede añadir al pocillo un segundo anticuerpo (que reconoce al anticuerpo de interés) conjugado a un compuesto detectable. Además, en lugar de recubrir el pocillo con el antígeno, el anticuerpo puede aplicarse como recubrimiento en el pocillo.En este caso, se puede añadir un segundo anticuerpo conjugado a un compuesto detectable tras la adición del antígeno de interés al pocillo recubierto. Aquellos con habilidad en la técnica son conocedores de los parámetros que pueden modificarse para aumentar la señal detectada así como otras variaciones de ELISAs conocidas en la técnica. En un modo de realización preferido, un ensayo ELISA puede llevarse a cabo recubriendo una placa de microtítulación de 96 pocillos (Costar) altamente ligante con 2 μg/ml de IL9 humana recombinante (rhu-IL-9) en PBS durante la noche. Tras tres lavados con PBS, la placa se incuba con tres diluciones seriadas de Fab a 25 ºC durante 1 hora. Tras otros tres lavados de PBS, se añade 1 μg/ml de conjugado de fosfatasa alcalina-anti-kappa humana y se incuba la placa durante 1 hora a 25 ºC. Tras tres lavados con PBST, la actividad de la fosfatasa alcalina se determina en sustrato de 5μl/AMP/PPMP. Se paran las reacciones y se determina la absorbancia a 560 nm con un lector de microplacas VMAX. Para un mayor análisis sobre los ensayos ELISA véase, p.ej., Ausubel et al., eds. , 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York a 11.2.1.
[0331] La afinidad de enlace de un anticuerpo a un antígeno y la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno puede determinarse mediante ensayos de enlace competitivo. Un ejemplo de un ensayo de enlace competitivo es un radioinmunoanálisis que comprende la incubación de un antígeno marcado (p.ej., 3H o 125I) con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades en aumento de antígeno no marcado, y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad del anticuerpo de la presente invención o un fragmento del mismo para un polipéptido de IL-9 y las constantes de disociación pueden determinarse a partir de los datos del análisis del gráfico de Scatchard. La competición con un segundo anticuerpo puede determinarse también utilizando radioinmunoanálisis. En este caso, un polipéptido de IL-9 se incuba con un anticuerpo de la presente invención conjugado a un compuesto marcado (p.ej., 3H o 125I) en presencia de cantidades en aumento de un segundo anticuerpo no marcado.
[0332] En un modo de realización preferido, se utiliza el análisis cinético BIAcore para determinar las constantes de asociación y disociación de anticuerpos de la invención a un polipéptido de IL-9. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y disociación de un polipéptido de IL-9 a partir de chips con anticuerpos de la invención inmovilizados en la superficie. Un estudio cinético BIAcore típico implica la inyección de 250 μl de un reactivo de anticuerpos (mAb, Fab) a una concentración variable en tampón HBS que contiene Tween-20 al 0,005% sobre la superficie de un chip sensor, sobre el que se ha inmovilizado el antígeno. El flujo se mantiene contrante a 75 μL/min. Los datos de disociación se recogen durante 15 minutos o más, según sea necesario. Después de cada ciclo de inyección/disociación, el mAb enlazado se separa de la superficie del antígeno utilizando pulsos breves de 1 min., de ácido diluido, normalmente 10-100 mM HCl, aunque se emplean otros regeneradores si las circunstancias lo justifican. Más específicamente, para la medida de las constantes de asociación, kon, y disociación, koff, el antígeno se inmoviliza directamente sobre la superficie del chip sensor mediante el uso de sustancias químicas de enlace amino estándares, concretamente el método EDC/NHS (EDC= N-dietil-aminopropil)-carbodiimida). En resumen, se prepara una solución de 5-100 nM del antígeno en 10 mM NaOAc, pH 4 o pH 5 y se pasa por la superficie activada de EDC/NHS hasta que se inmovilizan aproximadamente 30-50 RU (Unidades de Resonancia) de antígeno. Tras esto, los ésteres activos no reaccionados son “tapados” con una inyección de 1M Et-NH2. Se prepara una superficie blanca, que no contenga antígeno, en condiciones de inmovilización idénticas para fines de referencia. Una vez que se ha preparado una superficie apropiada, se prepara una serie de diluciones adecuadas de cada uno de los reactivos de anticuerpo en HBS/Tween-20, se pasa sobre el antígeno y las superficies celulares de referencia, que están conectadas en serie. El intervalo de concentraciones de anticuerpo que se preparan varía, dependiendo de la estimación de la constante de asociación de equilibrio, KD. Como se ha descrito arriba, el anticuerpo unido se elimina tras cada ciclo de inyección/disociación utilizando un regenerador adecuado.
[0333] Los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden someterse también a ensayos para su capacidad de inhibir el enlace de la IL-9 a su receptor de la célula huésped utilizando técnicas conocidas por aquellos con habilidad en la técnica. Por ejemplo, las células que expresan el receptor de la IL-9 pueden entrar en contacto con IL-9 en presencia o ausencia de un anticuerpo o fragmento del mismo y la capacidad del anticuerpo o fragmento del mismo de inhibir el enlace a IL-9 puede medirse, por ejemplo, mediante citometría de flujo o un ensayo de centelleo. La IL-9 o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo pueden ser marcados con un compuesto detectable como un marcador radiactivo (p.ej., 32P, 35S, y 125I) o un marcador fluorescente (p.ej., isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehído y fluorescamina) para permitir la detección de una interacción entre IL-9 y su receptor de la célula huésped. Alternativamente, la capacidad de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de impedir que la IL-9 se una a su receptor puede determinarse en ensayos libres de células. Por ejemplo, un polipéptido de IL-9 puede entrar en contacto con un anticuerpo o fragmento del mismo y se puede determinar la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de impedir que el polipéptido de IL-9 se una a su receptor de la célula huésped. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se inmoviliza en un soporte sólido y se marca un polipéptido de IL-9 con un compuesto detectable. Alternativamente, se inmoviliza un polipéptido de IL-9 en un soporte sólido y se marca el anticuerpo o fragmento del mismo con un compuesto detectable. Una IL-9 puede estar purificada completa o parcialmente (p.ej., completa o parcialmente libre de otros polipéptidos) o ser parte de un lisado celular. Además, un polipéptido de IL-9 puede ser una proteína de fusión que comprende IL-9, un derivado, análogo o fragmento de los mismos y un dominio como glutatión Stransferasa. Alternativamente, puede añadirse biotina a un polipéptido de IL-9 usando técnicas conocidas por aquellos con experiencia en al técnica (p.ej., kit de biotinilación, Pierce Chemical; Rockford, IL).
[0334] La capacidad de los anticuerpos o fragmentos de la invención de impedir que la IL-9 se una a su receptor de la célula huésped puede medirse mediante ensayos de proliferación celular. Por ejemplo, la línea celular T de TS1-RA3 murina que expresa el IL-9Rα tanto humano como murino puede cultivarse de manera continua en medio de cultivo (DMEM) que contenga IL-9 humana recombinante (rhuIL-9) (25 ng/ml, R & D Systems). Al retirar la IL--9 humana recombinante (rhuIL-9), el TS1-RA3 sufre una muerte celular en 18-24 horas. Las células TS1-RA3 se cultivaron en medio RPMI 1640 (ATCC) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS, en inglés) y 25 ng/ml de IL9 humana recombinante (rhuIL-9). Antes del ensayo, se lavan las células con un medio que no contenga IL-9 y se resuspenden a 5 X 105 células/ml en un medio que contenga 2 ng/ml de IL-9 humana recombinante (rhuIL-9). Las células se distribuyen en una placa de microtitulación de 96 pocillos no enlazante con fondo negro (100 μl células/pocillo) y se añaden a continuación 100 ml de Fabs variables diluidas en serie a la placa. Se incuba la placa durante 72 horas a 37 ºC, 5% CO2. Se añaden 20 μl/pocillo de Alamar blue®, y se incuban las células durante 4-5 horas adicionales. El metabolismo celular se cuantifica utilizando un fluorímetro con excitación a 555 nm y emisión a 590 nm. La capacidad de los anticuerpos o fragmentos de la invención de impedir que la IL-9 se una a su receptor de la célula huésped puede medirse también mediante ensayo de enlace celular, como un ensayo ELISA de enlace de la IL-9. Por ejemplo, cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos se recubre con 100 μL de anticuerpos de IL-9
o fragmentos de anticuerpos de la invención durante la noche a una temperatura de 2 a 8ºC. La placa se lava tres veces con tampón PBS/Tween-20 al 0,5%, y se bloquea durante 1 hora a temperatura ambiente con tampón PBS/Tween-20 al 0,1%, albúmina de suero bovino al 1%(p/v). Tras lavar la placa, se cargan 100 p L de un estándar de referencia, las muestras y controles en la placa de ensayo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras el lavado, se añaden 100 μL de anti-IgG humana de cabra marcada con peroxidasa de rábano (HRP) en una dilución de 1:15.000 a la placa de ensayo. Tras una hora de incubación, la placa se lava y se añaden 100 μL/pocillo de sustrato de 3, 3’, 5, 5’-tetrametilbencidina (TMB) a la placa y se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos. La reacción enzimática se para por la adición de 50 μL/pocillo de 2N de ácido sulfúrico. La
absorbancia a 450 nm se mide utilizando un lector de microplacas. Las muestras se disponen como aprobadas/suspendidas basándose en el paralelismo de la curva de la muestra y la curva del estándar de referencia, y el valor ED50 de la muestra que recae en el intervalo de 3,91-31,91 ng/mL.
5.6.2 Estudios in vitro
[0335] Los anticuerpos, composiciones o terapias combinadas de la invención pueden someterse a ensayos in vitro y/o in vivo para su capacidad de modular la actividad biológica de las células inmunitarias (p.ej., células T, neutrófilos y mastocitos), células endoteliales y células epiteliales. La capacidad de un anticuerpo, composición o terapia combinada de la invención de modular la actividad biológica de las células inmunitarias (p.ej., células T, células B, mastocitos, macrófagos, neutrófilos y eosinófilos), células endoteliales y células epiteliales puede medirse: detectando la expresión de antígenos (p.ej., activación de genes por IL-9, como por ejemplo, sin carácter limitativo, genes de mucina (p.ej., MUC2, MUC5AC, MUC5B y MUC6) y genes que intervienen en la activación de linfocitos (p.ej., Lgamma-6A/E)); detectando la proliferación de células inmunitarias, células endoteliales y/o células epiteliales; detectando la activación de moléculas de señalización (p.ej., la fosforilación de Stat2, la fosforilación de JAK3, o la fosforilación del IL-9R); detectando la función efectora de las células inmunitarias (p.ej., células T, células B, mastocitos, macrófagos, neutrófilos y eosinófilos), células endoteliales y/o células epiteliales; o detectando la diferenciación de células inmunitarias, células endoteliales y/o células epiteliales. Se pueden utilizar técnicas conocidas por aquellos con experiencia en el sector para medir estas actividades. Por ejemplo, la proliferación celular puede medirse mediante ensayos de incorporación de 3H-timidina y recuentos celulares con azul tripán. La expresión de antígenos puede ensayarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos que incluyen, sin carácter limitativo, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos utilizando técnicas como el análisis de Western blot, radioinmunoanálisis inmunohistoquímica, ELISA (pruebas de inmunoabsorción enzimática), inmunoensayos tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y análisis FACS. La activación de las moléculas de señalización puede analizarse, por ejemplo, mediante ensayos de cinasas y ensayos de cambio en la corrida electroforética (EMSA). La degranulación de mastocitos puede analizarse, por ejemplo, midiendo la liberación de serotonina (5-HT) o liberación de histamina con cromatografía de líquidos de alto rendimiento (véase, p.ej., Taylor et al., 1995 Immunology 86(3):427-433 y Kurosawa et al., 1998 Clin Exp Allergy 28(8): 1007-1012).
[0336] Los anticuerpos, composiciones, o terapias combinadas de la invención se prueban preferiblemente in vitro y después in vivo para la actividad terapéutica o profiláctica deseada antes de su uso en humanos. Por ejemplo, los ensayos que pueden utilizarse para determinar si la administración de una composición farmacéutica específica es indicada incluyen los ensayos de cultivos celulares en los que se cultiva una muestra de tejido del paciente en un cultivo y se expone a, o entra en contracto con, una composición farmacéutica, y se observa el efecto de dicha composición en la muestra de tejido. La muestra de tejido puede obtenerse mediante biopsia del paciente. Esta prueba permite la identificación de la terapia más efectiva terapéuticamente (p.ej., agente profiláctico o terapéutico) para cada paciente individual. En diversos modos de realización específicos, pueden llevarse a cabo ensayos in vitro con células representativas de los tipos celulares que intervienen en una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio, para determinar si una composición farmacéutica de la invención tiene un efecto deseado en dichos tipos celulares.
[0337] El efecto de un anticuerpo, una composición o una terapia combinada de la invención en el recuento de linfocitos en la sangre periférica puede controlarse/evaluarse utilizando técnicas estándares conocidas por aquellos con experiencia en el sector. Los recuentos de linfocitos en la sangre periférica en un sujeto pueden determinarse, p.ej., obteniendo una muestra de sangre periférica de dicho sujeto, separando los linfocitos de otros componentes de la sangre periférica como el plasma utilizando, p.ej., centrifugación en gradiente Ficoll-Hypaque (Pharmacia), y contando los linfocitos usando azul tripán. Los recuentos de células T en la sangre periférica en un sujeto pueden determinarse, p.ej., separando los linfocitos de otros componentes de la sangre periférica como el plasma utilizando, p.ej., un uso de la centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia), marcando las células T con un anticuerpo dirigido a un antígeno de células T que está conjugado a FITC o ficoeritrina, y midiendo el número de células T mediante análisis FACS.
5.6.3 Ensayos in vivo
[0338] Los anticuerpos, composiciones o terapias combinadas de la invención pueden probarse en sistemas de modelos animales adecuados antes de su uso en humanos. Dichos sistemas de modelos animales incluyen, sin carácter limitativo, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, cerdos, perros, conejos, etc. Puede utilizarse cualquier sistema animal conocido en la técnica. Pueden variar diversos aspectos del procedimiento; dichos aspectos incluyen, sin carácter limitativo, el régimen temporal de administración de terapias (p.ej., agentes profilácticos y/o terapéuticos), tanto si estas terapias se administran por separado como si es como mezcla, y la frecuencia de administración de las terapias.
[0339] La actividad antiinflamatoria de un anticuerpo, una composición o una terapia combinada de la invención puede determinarse utilizando diversos modelos animales experimentales de artritis inflamatoria conocidos en la técnica y descritos en Crofford L. J. y Wilder R.L., “Arthritis and Autoimmunity in Animal”, en Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty (eds.), Chapter 30 (Lee y Febiger, 1993). Los modelos animales experimentales y espontáneos de artritis inflamatoria y enfermedades reumáticas autoinmunes pueden utilizarse también para evaluar la actividad antiinflamatoria de los anticuerpos, composiciones o terapias combinadas de la invención.
[0340] La actividad antiinflamatoria de un anticuerpo, una composición o una terapia combinada de la invención puede evaluarse también midiendo la inhibición de edema plantar inducida por carragenina en la rata, usando una modificación del método descrito en Winter C. A. et al., “Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs” Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547, (1962). Este ensayo ha sido usado en un examen in vivo primario de la actividad antiinflamatoria de la mayoría de AINEs, y se considera predictivo de la eficacia humana. La actividad antiinflamatoria de las terapias de la prueba (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) se expresa como el porcentaje de inhibición del aumento en el peso de la pata posterior del grupo de la prueba en comparación con un grupo de control al que se ha administrado vehículo.
[0341] En un modo de realización específico de la invención en el que el modelo animal experimental utilizado es un modelo de rata de artritis inducida por adyuvante, puede medirse el peso corporal en relación con un grupo de control para determinar la actividad antiinflamatoria de un anticuerpo, una composición o una terapia combinada de la invención.
[0342] Los modelos animales de alergias y asma son conocidos en la técnica, como la inflación con flujo constante con oclusión inspiratoria final descrita por Ewart et al., 1995 J Appl Physiol 79(2):560-566 y otros ensayos descritos en, p.ej., Komai et al., 2003 Br J Pharmacol 138(5):912-920; Kenyon et al., 2003 Toxicol Appl Pharmacol 186(2):90100; Path et al., 2002 Am J Resp & Critical Care Med 166(6):818-826; Martins et al., 1990 Crit Care Med 19:515-519; Nicolaides et al., 1997 Proc Natl Acad Sci USA 94:13175-13180; McLane et al., 1998 19:713-720; y Temann et al., 1998 J Exp Med 188(7): 1307-1320. Por ejemplo, el modelo de transferencia adoptiva murino es un modelo animal utilizado para evaluar la eficacia de un anticuerpo, una composición o una terapia combinada de la invención para la prevención, tratamiento, control y/o asma incluye. En el modelo de transferencia adoptiva murino, la provocación de aeroalérgenos de los ratones receptores de TH1 o TH2 resulta en la migración de las células efectoras TH a las vías respiratorias y se asocia a la respuesta inflamatoria de la mucosa pulmonar neutrofílica (TH 1) y eosinofílica (TH 2) (Cohn et al., 1997, J. Exp. Med. 1861737-1747). La hipersensibilidad de las vías respiratorias puede inducirse en ratones mediante ovoalbúmina (Tomkinson et al., 2001, J. Immunol. 166:5792-5800) o antígeno de huevo de Schistosoma mansoni (Tesciuba et al., 2001, J. Immunol. 167:1996-2003).
[0343] La eficacia en la prevención o tratamiento de un trastorno inflamatorio puede demostrarse, p.ej., detectando la capacidad de un anticuerpo, una composición o terapia combinada de la invención de reducir uno o más síntomas del trastorno inflamatorio, de disminuir la activación de células T, de disminuir la proliferación de células T, de modular uno o más perfiles de citocinas, de reducir la producción de citocinas, de reducir la inflamación de una articulación, órgano o tejido o de mejorar la cualidad de vida.
[0344] Los cambios en la actividad de la enfermedad inflamatoria pueden evaluarse a través de recuentos de articulaciones sensibles e hinchadas, puntuaciones globales hechas por el médico y el paciente para el dolor y la actividad de la enfermedad, y la ESR/CRP. La progresión del daño en las articulaciones estructural puede evaluarse mediante puntuación cuantitativa de rayos X de las manos, muñecas y pies (método de Sharp). Los cambios en el estado funcional en humanos con trastornos inflamatorios pueden evaluarse utilizando un Health Assessment Questionnaire (HAQ, cuestionario de evaluación de la salud), y los cambios en la calidad de vida de evalúan con el cuestionario SF (Short Form).
[0345] La eficacia de un anticuerpo, una composición o una terapia combinada de la invención para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una reacción alérgica de tipo I puede evaluarse por su capacidad de incudir anticuerpos anti-IgE que evitan que la IgE se una a su receptor en los mastocitos o basófilos in vitro. Los niveles de IgE pueden evaluarse mediante inmunoensayos, electroforesis en gel seguida de visualización, prueba de radioinmunosorbencia (RIST, en inglés), prueba de radioalergosorbencia (RAST, en inglés), o cualquier otro método conocido por aquellos con experiencia en la técnica.
[0346] Además, se puede utilizar cualquier ensayo conocido por aquellos con experiencia en la técnica para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de un anticuerpo, una composición, una terapia combinada aquí revelada para la prevención, tratamiento, control y/o mejora de un trastorno o enfermedad caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno o enfermedad caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo.
5.6.4 Ensayos de toxicidad
[0347] La toxicidad y/o eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos de la presente invención pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, p.ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis efectiva terapéuticamente en el 50% de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción DL50/DE50. Se prefieren las terapias que presentan altos índices terapéuticos. Aunque se pueden usar terapias que presenten efectos secundarios tóxicos, se debe prestar especial atención a diseñar un sistema de administración que dirija dichos agentes al lugar del tejido afectado para minimizar el daño potencial de células no infectadas y, así, reducir los efectos secundarios.
[0348] Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios animales pueden usarse en la formulación de una variedad de dosis de agentes profilácticos y/o terapéuticos para su uso en humanos. La dosis de dichos agentes recae preferiblemente dentro de un margen de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este margen según la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. En cualquier terapia utilizada en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un margen de concentración en plasma circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de la prueba que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) determinada en el cultivo celular. Dicha información puede utilizarse para determinar de una manera más precisa las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.
[0349] Además, puede utilizarse cualquier ensayo concido por aquellos con habilidad en la técnica para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de un anticuerpo, una composición, una terapia combinada aquí revelada para una enfermedad o un trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, una enfermedad o un trastorno asociado a o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo.
5.7 USOS DE DIAGNÓSTICO DE LOS ANTICUERPOS
[0350] Los anticuerpos de la invención (incluyendo las moléculas que comprenden, o alternativamente constan de, fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 pueden utilizarse para fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar un trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mimso, un trastorno inflamatorio, o uno o más síntomas del mismo. La invención proporciona un método para la detección de la expresión aberrante de IL-9 que comprende: (a) someter a ensayo la expresión de IL-9 en una muestra biológica de un individuo utilizando uno o más anticuerpos de la invención que se unen de forma inmunoespecífca a un polipéptido de IL-9; y (b) comparar el nivel de IL-9 con un nivel estándar de IL-9, p.ej., en muestras biológicas normales, según el cual un aumento o disminución en el nivel ensayado de IL-9 comparado con el nivel estándar de IL-9 es indicativo de un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo. En otro modo de realización específico, el nivel de expresión aberrante de IL-9 es indicativo de un trastorno inflamatorio o una enfermedad o afección asociada al mismo, como el asma
[0351] .
[0352] Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para ensayar los niveles de IL-9 en una muestra biológica utilizando métodos inmunohistológicos clásicos como los descritos aquí o los conocidos por aquellos con habilidad en la técnica (p.ej., véase Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; y Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para la detección de expresión génica de proteínas incluye los inmunoensayos, como la prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA, por sus siglas en inglés) y el radioinmunoanálisis (RIA, en inglés). Los marcadores de ensayos de anticuerpos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen marcadores enzimáticos, como por ejemplo, glucosa oxidasa; radioisótopos, como yodo (125I,121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (121In) y tecnecio (99Tc); marcadores luminiscentes, como luminol; y marcadores fluorescentes, como fluoresceína y rodamina, y biotina.
[0353] Los anticuerpos de la invención (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente que constan de, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden utilizarse para la inmunofenotipificación de las líneas celulares y muestras biológicas por su expresión de IL-9 o expresión del receptor de IL-9. Se pueden utilizar diversas técnicas que usen los anticuerpos, fragmentos o variantes de la invención para analizar las poblaciones celulares (que expresan IL-9 y/o receptor de IL-9, especialmente células inmunitarias, es decir, linfocitos T y B, mastocitos, eosinófilos, macrófagos, neutrófilos y células epiteliales o receptor de IL-9, e incluyen separación magnética utilizando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo, mediante “panning” con el anticuerpo unido a una matriz sólida (es decir, una placa), y citometría de flujo (véase, p.ej., patente estadounidense 5.985.660; y Morrison et al., Cell, 96:737-49 (1999)).
[0354] Estas técnicas permiten la exploración de poblaciones de células particulares, como puede encontrarse con neoplasias hematológicas (es decir, enfermedad mínima residual (EMR) en pacientes con leucemia aguda) y células
“ajenas” en transplantes para evitar la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Alternativamente, estas
técnicas permiten la exploración de células progenitoras o madre hematopoyéticas capaces de someterse a proliferación y/o diferenciación, como puede encontrarse en la sangre del cordón umbilical humano.
5.8 KITS
[0355] La presente invención proporciona kits que pueden utilizarse en los métodos arriba mencionados. En otro modo de realización, un kit comprende un anticuerpo de la invención, preferiblemente un anticuerpo purificado, en uno o más recipientes. En otro modo de realización, un kit comprende un fragmento de anticuerpo de la invención que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9. En un modo de realización específico, los kits de la presente invención contienen un polipéptido de IL-9 sustancialmente aislado como un control. Preferiblemente, los kits de la presente invención comprenden también un anticuerpo de control que no reacciona con un polipéptido de IL-9. En otro modo de realización específico, los kits de la presente invención contienen un medio para detectar la unión de un anticuerpo a un polipéptido de IL-9 (p.ej., el anticuerpo puede conjugarse a un sustrato detectable como un compuesto fluorescente, un sustrato enzimático, un compuesto radiactivo o un compuesto luminiscente, o puede conjugarse un segundo anticuerpo que reconozca al primer anticuerpo a un sustrato detectable). En modos de realización específicos, el kit puede incluir un polipéptido de IL-9 sintetizado químicamente o producido de forma recombinante. El polipéptido de IL-9 proporcionado en el kit puede también estar unido a un soporte sólido. En un modo de realización más específico, el medio de detección del kit arriba descrito incluye un soporte sólido al que se une un polipéptido de IL-9. Dicho kit puede incluir también un anticuerpo antihumano marcado con indicador no unido. En este modo de realización, el enlace del anticuerpo al polipéptido de IL-9 puede detectarse mediante el enlace de dicho anticuerpo marcado con indicador.
[0356] En un modo de realización adicional, la invención incluye un kit de diagnóstico para su uso en la exploración de suero que contenga un polipéptido de IL-9. El kit de diagnóstico incluye un anticuerpo sustancialmente aislado inmunoreactivo de forma específica con un polipéptido de IL-9, y medios para detectar la unión del polipéptido de IL9 al anticuerpo. En un modo de realización, el anticuerpo se une a un soporte sólido. En un modo de realización específico, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El medio de detección del kit puede incluir un segundo anticuerpo monoclonal marcado. Alternativamente, o además, el medio de detección puede incluir un antígeno competidor marcado.
5.9 ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN
[0357] La presente invención también abarca un producto farmacéutico final etiquetado y envasado. Este artículo de fabricación incluye la forma de dosis unitaria adecuada en un recipiente o envase adecuado como un vial de vidrio u otro recipiente que esté herméticamente sellado. El producto farmacéutico puede formularse en viales de dosis única como un líquido estéril que contiene 10 mM de tampón de histidina a pH 6,0 y 150 mM de cloruro sódico. Cada 1,0 mL de solución puede contener 100 mg de proteína, 1,6 mg de histidina y 8,9 mg de cloruro sódico en agua para su inyección. Durante el proceso de producción el pH del tampón de la formulación se ajusta a 6,0 utilizando ácido clorhídrico. En el caso de una forma farmacéutica adecuada para su administración por vía parenteral el ingrediente activo, p.ej., un anticuerpo de la invención que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, es estéril y adecuada para su administración como solución libre de partículas. En otras palabras, la invención abarca tanto soluciones pareterales como polvos liofilizados, siendo ambos estériles, y los últimos siendo adecuados para su reconstitución antes de la inyección. Alternativamente, la forma de dosis unitaria puede encontrarse en forma de sólido adecuado para su administración oral, transdérmica, intranasal o tópica.
[0358] En un modo de realización preferido, la forma de dosis unitaria es adecuada para su administración intravenosa, intramuscular, intranasal, oral, tópica o subcutánea. De ese modo, la invención abarca soluciones, preferiblemente estériles, adecuadas para cada una de las vías de administración.
[0359] Como con cada producto farmacéutico, el material y recipiente de envasado están diseñados para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y envío. Además, los productos de la invención incluyen instrucciones para el uso u otro material de información que aconseje al médico, técnico o paciente cómo evitar o tratar de forma adecuada la enfermedad o trastorno en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye medios de instrucciones que indican o sugieren un régimen de dosis incluyendo, sin carácter limitativo, dosis efectivas, procedimientos de control, linfocitos totales, recuentos de mastocitos, recuentos de células T, producción de IgE y otra información de control.
[0360] En concreto, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende material de envasado, como una caja, botella, tubo, vial, recipiente, pulverizador, insuflador, bolsa intravenosa (i.v.), sobre y similares; y al menos una forma de dosis unitaria de un agente farmacéutico contenido en dicho material de envasado, en el que dicho agente farmacéutico comprende un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a la IL-9 y en el que dicho material de envase incluye medios de instrucciones que indican que dicho anticuerpo puede usarse para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar uno o más síntomas asociados a un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, una enfermedad inflamatoria, o uno o más síntomas de la misma, administrando dosis específicas y utilizando régimenes de dosis específicos como se describe aquí.
[0361] La invención también proporciona un artículo de fabricación que comprende material de envasado, como una caja, botella, tubo, vial, recipiente, pulverizador, insuflador, bolsa intravenosa (i.v.), sobre y similares; y al menos una forma de dosis unitaria de cada agente farmacéutico contenido en dicho material de envasado, en el que un agente farmacéutico comprende un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y el otro agente farmacéutico comprende un segundo anticuerpo diferente que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, y en el que el material de envasado incluye medios de instrucciones que indican que dichos agentes pueden usarse para tratar, prevenir y/o mejorar un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio o uno o más síntomas del mismo administrando dosis específicas y usando régimenes de dosis específicas según se describe aquí.
[0362] La invención también proporciona un artículo de fabricación que comprende material de envasado, como una caja, botella, tubo, vial, recipiente, pulverizador, insuflador, bolsa intravenosa (i.v.), sobre y similares; y al menos una forma de dosis unitaria de cada agente farmacéutico contenido en dicho material de envasado, en el que un agente farmacéutico comprende un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 y el otro agente farmacéutico comprende un agente profiláctico o terapéutico distinto de un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9, y en el que dicho material de envasado incluye medios de instrucciones que indican que dichos agentes pueden utilizarse para tratar, prevenir y/o mejorar uno o más síntomas asociados a un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno asociado a la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio, o uno
o más síntomas del mismo mediante la administración de dosis específicas y utilizando régimenes de dosis específicos aquí descritos.
[0363] La presente invención dispone que los efectos perjudiciales que pueden reducirse o evitarse por los métodos de la invención se encuentran indicados en el material informativo que acompaña a un artículo de fabricación a usar en la prevención, tratamiento y/o mejora de uno o más síntomas asociados a una inflamatoria
[0364] Además, el material informativo que acompaña a un artículo de fabricación a usar en la prevención, tratamiento, control y/o mejora de un trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9, un trastorno caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R o una o más subunidades del mismo, un trastorno inflamatorio, un trastorno proliferativo o uno o más síntomas de los mismos puede indicar que las proteínas extrañas pueden provocar también reacciones alérgica, incluyendo anafilaxia, o síndrome de liberación de citocinas. El material informativo debe indicar que las reacciones alérgicas pueden presentarse solo como erupciones pruriginosas leves o pueden ser graves como la eritrodermia, síndrome de Stevens-Johnson, vasculitis o anafilaxia. El material informativo debe indicar también que las reacciones anafilácticas (anafilaxia) son reacciones de hipersensibilidad graves y ocasionalmente fatales. Pueden producirse reacciones alérgicas incluyendo la anafilaxia cuando se inyecta cualquier proteína extraña en el cuerpo. Pueden variar desde manifestaciones leves como la urticaria o erupciones hasta reacciones sistémicas letales. Las reacciones anafilácticas se producen poco después de la exposición, normalmente en el plazo de 10 minutos. Los pacientes pueden sufrir parestesia, hipotensión, edema laríngeo, cambios del estado mental, angioedema facial o faríngeo, obstrucción de las vías respiratorias, broncoespasmo, urticaria y prurito, enfermedad del suero, artritis, nefritis alérgica, glomerulonefritis, artritis temporal o eosinofilia.
5.10 MÉTODOS DE PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS
[0365] Los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un antígeno pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en especial, mediante síntesis química o preferiblemente, mediante técnicas de expresión recombinantes.
[0366] Los anticuerpos policlonales que se unen de forma inmunoespecífica a un antígeno pueden producirse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede administrarse un antígeno humano a diversos animales hospedadores incluyendo, sin carácter limitativo, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales específicos para el antígeno humano. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmune, dependiendo de la especie hospedadora, e incluyen, sin carácter limitativo, adyuvantes de Freund (completos e incompletos), geles de minerales como el hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de la lapa californiana (conocida como KLH: Keyhole Limpet Haemoyanin), dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles como el bacilo de Calmette-Guerin (BCG) y corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes también son conocidos en la técnica.
[0367] Los anticuerpos monoclonales puede prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en el sector, incluyendo el uso de las tecnologías del hibridoma, recombinante y de expresión en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando técnicas del hibridoma incluyendo aquellas conocidas en la técnica y explicadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2º ed., 1988); Hammering, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). El término “anticuerpo monoclonal” según el uso aquí realizado no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología del hibridoma. El término “anticuerpo monoclonal” hace referencia a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo un clon de fago, eucariótico o procariótico, y no el método por el que se produce.
[0368] Los métodos para producir y evaluar anticuerpos específicos utilizando la tecnología del hibridoma son habituales y conocidos en la técnica. Brevemente, puede inmunizarse a ratones con un polipéptido de IL-9 y una vez se detecta la respuesta inmune, p.ej., se detectan anticuerpo específicos para la IL-9 en el suero del ratón, se cultiva el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. Después, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo células de la línea celular SP20 disponible en el ATCC. Se seleccionan los hibridomas y se clonan mediante dilución limitada. Además, se puede usar una técnica RIMMS (inmunización repetitiva de múltiples sitios) para inmunizar a un animal (Kilptrack et al., 1997 Hybridoma 16:381-9. Los clones de hibridoma se ensayan después por métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido de la invención. El líquido de ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse mediante la inmunización de ratones con clones de hibridomas positivos.
[0369] Por tanto, la presente invención proporciona métodos para generar anticuerpos mediante el cultivo de un célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención en los que, preferiblemente, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un polipéptido de IL-9 con células de mieloma y después evaluando los hibridomas resultantes de la fusión para detectar clones de hibridoma que secreten un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de IL-9.
[0370] Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos de IL-9 específicos pueden generarse por cualquier técnica conocida por aquellos con habilidad en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab’)2 de la invención pueden producirse mediante segmentación proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas como
la papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab’)2). Los fragmentos F(ab’)2
contienen la región variable, la cadena ligera de la región constante y el dominio CH1 de la cadena pesada. Además, los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse utilizando diversos métodos de exposición en fagos conocidos en la técnica.
[0371] En los métodos de exposición en fagos, los dominios funcionales del anticuerpo se exponen en la superficie de las partículas de fago que portan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. En particular, las secuencias de ADN que codifican los dominios de VH y VL son amplificados a partir de bibliotecas de ADNc animal (p.ej., bibliotecas de ADNc humano o murino de tejidos afectados). El ADN que codifica los dominios VH y VL se recombina junto con un ligador de scFv mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se clona en un vector fagómido. El vector se somete a electroporación en E.coli yla E. coli se infecta con el fago auxiliar. El fago usado en estos métodos es típicamente un fago filamentoso incluyendo fd y M13 y los dominios VH y VL se fusionan normalmente de forma recombinante al gen III o gen VIII de los fagos. El fago que expresa un dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno particular puede elergise o identificarse con antígeno, p.ej., usando un antígeno marcado o antígeno unido a o retenido en una superficie o perla sólida. Los ejemplos de métodos de exposición en fagos que pueden usarse para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos revelados en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; solicitud PCT nº PCT/GB91/O1 134; publicaciones internacionales nº WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, y WO97/13844; y las patentes estadounidenses nº 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743 y 5.969.108;.
[0372] Como se describe en las referencias anteriores, tras la selección de fagos, las regiones del fago que codifican el anticuerpo pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado, y expresado en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levadura y bacterias, p.ej., como se describe a continuación. Las técnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab’ y F(ab’)2 puedenusarse también utilizando métodos conocidos en la técnica como aquellos revelados en la publicación PCT nº WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; y Better et al., 1988, Science 240:1041-1043.
[0373] Para generar anticuerpos completos, se pueden utilizar cebadores de la PCR incluyendo secuencias de nucleótidos de VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia de flanqueo para proteger el sitio de restricción, para amplificar las secuencias VH o VL en los clones de scFV. Mediante el uso de técnicas de clonación conocidas por aquellos con experiencia en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresan una región constante VH, p.ej., la región constante gamma 4 humana, y los dominios VL amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresan una región constante VL, p. ej., regiones constantes lamba o kappa humanas. Preferiblemente, los vectores para la expresión de los dominios VH y VL comprenden un promotor EF-1α (Factor de Elongación 1 α), una señal de secreción, un sitio de clonación para el dominio variable, dominios constantes, y un marcador de selección como neomicina. Los dominios VH y VL pueden clonarse también en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de la cadena pesada y los vectores de conversión de la cadena ligera se cotransfectan en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorios que expresen anticuerpos completos, p.ej., IgG, utilizando técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica.
[0374] En algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en humanos y los ensayos de detección in vitro, puede ser preferible utilizar anticuerpos humanos o quiméricos. Los anticuerpos completamente humanos resultan especialmente deseables en el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse por una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo los métodos de exposición en fagos descritos arriba que utilizan bibliotecas de anticuerpos derivados de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véase también las patentes estadounidenses nº 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones internacionales nº WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
[0375] Los anticuerpos humanos pueden producirse también utilizando ratones transgénicos que sean incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que puedan expresar genes de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de la inmunoglobulina de cadena ligera y cadena pesasa humana pueden introducirse al azar o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratones. Alternativamente, se puede introducir la región de diversidad, la región constante y la región variable humana en células madre embrionarias de ratones además de los genes de cadena pesada y cadena ligera humanas. Los genes de la inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden volverse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En especial, la deleción homocigótica de la región JH evita la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se amplían y microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. Después, se reproducen los ratones quiméricos para producir descendientes homocigóticos que expresan anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan según el procedimiento normal con un antígeno seleccionado, p.ej., todo o parte de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales que se dirigen contra el antígeno pueden obtenerse del ratón transgénico inmunizado utilizando la tecnología del hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana hospedados en los ratones transgénicos se reorginazan durante la diferenciación de células B, y posteriormente sufren un cambio de clase y mutación somática. Por ello, utilizando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE útiles terapéuticamente. Para una revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para un análisis detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véase, p.ej., las publicaciones PCT nº WO 98/24893, WO 96/34096, y WO 96/33735; y las patentes estadounidenses nº 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318, y 5.939.598, las cuales quedan incorporadas aquí en su totalidad mediante referencia. Además, puede solicitarse a compañías como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) que faciliten anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita arriba.
[0376] Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes del anticuerpo se derivan se diferentes moléculas de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véase, p.ej., Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; y las patentes estadounidenses nº 5.807.715, 4.816.567, 4.816.397, y 6.331.415.
[0377] Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo o su variante o fragmento del mismo que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región marco que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR (región determinante de la complementariedad) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todo de al menos una, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab’, F(ab’).sub.2, Fabc, Fv) en las que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado comprende también al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente aquella de la inmunoglobulina humana. Generalmente, el anticuerpo contendrá tanto la cadena ligera como al menos el dominio variable de la cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Normalmente, el dominio constante es un dominio constante de fijación del complemento donde se desea que el anticuerpo humanizado exhiba actividad citotóxica, y la clase es normalmente IgG.sub.1. Cuando dicha actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG.sub.2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y seleccionar dominios constantes específicos para optimizar las funciones efectoras deseadas se encuentra dentro de la habilidad ordinaria en la técnica. Las regiones marco o CDR de un anticuerpo humanizado no tienen que corresponder de manera precisa a las secuencias parentales, p.ej., la CDR del donante y el marco de consenso puede mutagenizarse mediante sustitución, inserción o deleción de al menos un residuo de forma que el residuo CDR o marco en ese sitio no corresponda ni al anticuerpo de consenso ni al de importación. Sin embargo, dichas mutaciones no serán extensas. Normalmente, al menos el 75% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a aquellos de las secuencias CDR y FR parentales, más a menudo un 90%, y más preferiblemente más de un 95%. El anticuerpo humanizado puede producirse utilizando una variedad de técnicas conocidas en el sector, incluyendo sin carácter limitativo, el CDR-grafting (sustitución de CDR) (patente europea nº EP 239.400; publicación internacional nº WO 91/09967; y patente estadounidense nº 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), veneering o resurfacing (técnicas de remodelación o reconstrucción de la superficie) (patentes europeas nº EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), chain shuffling (intercambio de cadenas) (patente estadounidense nº 5.565.332), y las técnicas reveladas en, p.ej., las patentes estadounidenses nº 6.407.213, 5.766.886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353 -60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s -5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), y Pedersen et al.,
J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994). A menudo, los residuos marco en las regiones marco se sustituirán por los residuos correspondientes del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferiblemente para mejorar, la unión del antígeno. Estas sustituciones de marco se identifican mediante métodos conocidos en la técnica, p.ej., modelado de las interacciones de los residuos marco y de CDR para identificar los residuos marco importantes para la unión del antígeno y comparación de la secuencia para identificar residuos marco inusuales en posiciones específicas. (Véase, p.ej., Queen et al., patente estadounidense nº 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature 332:323.
[0378] Los anticuerpos de dominio único, por ejemplo, los anticuerpos que carecen de las cadenas ligeras, pueden producirse por métodos conocidos en la técnica. Véase Riechmann et al., 1999, J. Immuno. 231:25-38; Nuttall et al.,
2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3):253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4):277302; patente estadounidense nº 6.005.079; y publicaciones internacionales nº WO 94/04678, WO 94/25591, y WO 01/44301.
[0379] Además, los anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a un antígeno (p.ej., polipéptido de IL-9) pueden, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipo que “imiten” un antígeno utilizando técnicas bien conocidas por aquellos con experiencia en el sector. (Véase, p.ej., Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7(5):437444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438.
5.10.1 Secuencias de polinucleótidos que codifican anticuerpos
[0380] La invención proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de forma inmunoespecífica a un antígeno (p.ej., polipéptido de IL-9). La invención abarca también polinucleótidos que hibridizan en condiciones de hibridación de rigor alto, intermedio o bajo, p.ej., como se define supra, con polinucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención.
[0381] Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos puede determinarse, mediante cualquier método conocido en la técnica. Dicho polinucleótido que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (p.ej., como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), lo que, en síntesis, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, fragmentos, o variantes de los mismos, anillamiento y ligadura de aquellos oligonucleótidos, y despúes la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
[0382] Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo puede generarse a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada. Si no hay disponible un clon que contenga un ácido nucleico que codifique un anticuerpo específico, pero la secuencia de la molécula del anticuerpo es conocida, se puede sintetizar u obtener químicamente un ácido nucleico que codifique una inmunoglobulina a partir de un fuente adecuada (p.ej., una biblioteca de ADNc de anticuerpos o una biblioteca de ADNc generada a paritr de, o ácido nucleico, preferiblemente ARN poli A+, aislado de, cualquier tejido o célula que exprese el anticuerpo, como células de hibridoma seleccionadas de forma que expresen un anticuerpo de la invención) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos
hibridizables a los extremos 3’ y 5’ de la secuencia o mediante clonación utilizando una sonda de oligonucleótidos
específica para la secuencia de genes particular a identificar, p.ej., un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse entonces en vectores de clonación replicables utilizando cualquier método bien conocido en la técnica.
[0383] Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, la secuencia de nucleótidos del anticuerpo puede manipularse usando métodos conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, p.ej., técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2º Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, para generar anticuerpos que tengan una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.
[0384] En un modo de realización específico, una o más de las CDRs se inserta en las regiones marco usando técnicas del ADN recombinante habituales. Las regiones marco pueden producirse de forma natural o ser regiones marco consenso, y preferiblemente regiones marco humanas (véase, p.ej., Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479 para un listado de regiones marco humanas). Preferiblemente, la secuencia de polinucleótidos generada mediante la combinación de las regiones marco y CDRs codifica un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un antígeno específico (p.ej., un polipéptido de IL-9). Preferiblemente, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos en las regiones marco y, preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuerpo a su antígeno. Además, dichos métodos pueden utilizarse para realizar sustituciones
o deleciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína en la región variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario para generar moléculas de anticuerpo que carezcan de uno o más enlaces disulfuro intracatenarios. Se abarcan otras alteraciones del polinucleótido por la presente invención y dentro de la habilidad de la técnica.
5.10.2 Expresión recombinante de anticuerpos
[0385] La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención (p.ej., una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo o un anticuerpo de cadena única de la invención) que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 requiere la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que se obtiene un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, la cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o un fragmento del mismo (preferiblemente, pero no necesariamente, que contenga el dominio variable de la cadena pesada o ligera) de la invención, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse mediante tecnología del ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en el sector. Por lo tanto, se describen aquí los métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo. Pueden utilizarse métodos que son conocidos por aquellos con habilidad en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican anticuerpos y señales de control de transcripción y de traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Por tanto, la invención proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, un cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo, o una CDR de la cadena pesada o ligera, unidos de forma operativa a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifican la región constante de una molécula de anticuerpo (véase, p.ej., la publicación internacional nº WO 86/05807, la publicación internacional nº WO 89/01036 y la patente estadounidense nº 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para la expresión de la cadena pesada completa, la cadena ligera completa o ambas la cadena pesada y ligera completas.
[0386] Los vectores de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan entonces mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención. Por ello, la invención incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención o fragmentos del mismo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o fragmento del mismo, o un anticuerpo de cadena única de la invención, unido de forma operativa a un promotor heterólogo. En modos de realización preferidos para la expresión de anticuerpos de cadena doble, los vectores que codifican la cadena pesada y la ligera pueden coexpresarse en la célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuación.
[0387] Se puede utilizar una variedad de de sistemas de vectores de expresión-huésped para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención (véase, p.ej., la patente estadounidense nº 5.807.715). Dichos sistemas de expresión-huésped representan vehículos mediante los cuales pueden producirse las secuencias de codificación de interés y pueden ser posteriormente purificadas, pero también respresentan a células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, expresan una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen, sin carácter limitativo, los microorganismos como bacterias (p.ej., E. coli y B. subtilis) transformados con vectores de expresión de ADN cósmido, ADN plásmido, o ADN de bacteriófago recombinante que contienen secuencias que codifican anticuerpos; levadura (p.ej., Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias que codifican anticuerpos; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (p.ej., baculovirus) que contienen secuencias que codifican anticuerpos; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (p.ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (p.ej., plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican anticuerpos; o sistemas celulares de los mamíferos (p.ej., células COS, CHO, BHK, 293, NS0 y 3T3) que hospedan diseños de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (p.ej., promotores de metalotioneína) o de virus de mamíferos (p.ej., promotor tardío del adenovirus, promotor 7,5K del virus de la vaccinia). Preferiblemente, las células bacterianas como Escherichia coli, y más preferiblemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa, se utilizan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero como las células del ovario del hámster chino (CHO, en inglés), junto con un vector como el elemento promotor del gen temprano, intermedio y principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; y Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). En un modo de realización específico, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos de la invención, derivados, análogos o fragmentos de los mismos que se unen de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 o fragmentos del mismo se regula mediante un promotor constitutivo, promotor inducible o específico de tejido.
[0388] En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse varios vectores de expresión de forma ventajosa dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que está siendo expresada. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicho anticuerpo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, sin carácter limitativo, el vector de expresión de E.coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), en el que la secuencia de codificación del anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en el marco de la región de codificación de lac Z de forma que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. También se pueden utilizar vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión-5-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a perlas de agarosa-glutatión en matriz, seguido de la elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de proteasa de factor Xa o trombina de forma que el producto del gen diana clonado puede liberarse de la fracción de GST.
[0389] En un sistema de insectos, se utiliza el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa califórnica (AcNPV, en inglés) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica el anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y situarse bajo el control de un promotor del AcNPV (por ejemplo el promotor de polihedrina).
[0390] En las células huésped de los mamíferos, puede utilizarse una variedad de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, p.ej., el promotor tardío y secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (p.ej., región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados (p.ej., véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359). Pueden ser también necesarias señales de iniciación específicas para la traducción eficiente de las secuencias de codificación de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio debe encontrarse en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de inicio pueden tener una diversidad de orígenes, tanto natural como sintético. La eficiencia de expresión puede fomentarse mediante de inclusión de un elemento potenciador de transcripción adecuado, terminadores de transcripción, etc. (véase, p.ej., Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
[0391] Además, un cepa de células huésped puede elegirse de forma que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto del gen en una forma específica deseada. Dichas modificaciones (p.ej., glicosilación) y procesamiento (p.ej., escisión) de productos de proteínas puede ser importante para la función de la proteína. Las diferentes células huéspedes tienen mecanismos específicos y característicos para el procesamiento postraduccional y modificación de proteínas y productos de genes. Las líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados pueden elegirse de forma que se asegure la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña expresada. Para este fin, se pueden usar células huésped eucariotas que poseen el mecanismo celular para el procesamiento adecuado de la transcripción, glicosilación y fosforilación primaria del producto génico. Dichas células huésped de mamíferos incluyen, sin carácter limitativo, células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce de forma endógena ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O y HsS78Bst.
[0392] Para la producción de alto rendimiento y a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden someterse a ingeniería las líneas celulares que expresan de forma estable la molécula del anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes virales de replicación, las células huésped pueden transformarse con ADN controlado mediante los elementos de control de expresión adecuados (p.ej., promotor, potenciador, seucencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introducción de ADN extraño, se puede permitir que las células sometidas a ingeniería crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se pasan a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse de forma ventajosa para someter a ingeniería líneas celulares que expresan la molécula del anticuerpo. Dichas líneas celulares sometidas a ingeniería pueden ser especialmente útiles en la exploración y evaluación de composiciones que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
[0393] Se puede usar una variedad de sistemas de selección, incluyendo sin carácter limitativo, los genes de timidicinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) pueden emplearse en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. También puede usarse la resistancia a antimetabolitos como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; mayo, 1993, TIB TECH 11(5):155-2 15); e hygro, que confiere Resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante pueden aplicarse de forma habitual para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1.
[0394] Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificación de vectores (para un análisis, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)).Cuando un marcador en el sistema de vectores que expresa un anticuerpo es amplificable, un aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada se asocia al gen de anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
[0395] La célula huésped puede ser cotransfectada con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codificando un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de los polipéptidos de la cadena pesada y la cadena ligera. Alternativamente, puede utilizarse un solo vector que codifique, y sea capaz de expresar, tanto los polipéptidos de la cadena pesada como los de la cadena ligera. En estas situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; y Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:2 197). Las secuencias de codificación de las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc y ADN genómico.
[0396] Una vez que se ha producido la molécula de anticuerpo de la invención mediante expresión recombinante, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de un molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (p.ej., de intercambio iónico, de afinidad, especialmente mediante afinidad por el antígeno específico despúes de la proteína A, y cromatografía en columna de exclusión), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden fusionarse a secuencias de polipéptidos heterólogos descritas aquí o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.
6. EJEMPLOS
[0397] Se ilustran determinados modos de realización de la invención mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
6.1 EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DE ANTICUERPO ANTI-IL-9 7F3COM-2H2
[0398] El anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-9 7F3com-2H2 se preparó usando el vector pMI347. El vector pMI347 que codifica la expresión de 7F3com-2H2 de los cuatro elementos genéticos independientes siguientes: un casete de expresión del marcador seleccionable glutamina sintetasa, el casete de expresión de ADNc de la cadena ligera kappa de 2H2, el casete de expresión de mini-gen de la cadena pesada de 2H2 γ1, y un gen de resistencia a antibiótico y origen de replicación bacteriano.
[0399] El primer elemento, el casete de expresión del marcador seleccionable glutamina sintetasa consta de un ADNc de glutamina sintetasa (GS) de hámster bajo el control de potenciador temprano del virus del simio 40 (SV40) y promotor y empalme (splicing) temprano de SV40 y región de poliadenilación para la escisión eficiente de ARN mensajero (ARNm) y adición de una cola de poliadenilato. Este elemento es necesario para la integración, amplificación y mantenimiento estable del plásmido en el genoma de la célula huésped.
[0400] Cada uno de los casetes de expresión de la cadena pesada y la cadena ligera de 2H2 consta del potenciador temprano inmediato principal del citomegalovirus humano (hCMVie, en inglés), promotor, y la región 5’ no traducida que dirige el alto nivel de transcripción del ADNc de la cadena ligera de 2H2, y la región de poliadenilación temprana de SV40 para una eficiente poliadenilación. Esta combinación de un potenciador/promotor fuerte y una región de poliadenilación eficiente asegura altos niveles de ARN mensajero de la cadena ligera de 2H2 en las células. Los casetes de expresión de las cadenas pesada y ligera se separan por una región de terminación de transcripción mu de inmunoglobulina murina para evitar la interferencia de transcripción de genes posteriores.
[0401] El elemento final del vector pMI347 es el origen de replicación bacteriano y el gen de resistencia a antibióticos (p.ej., gen de beta-lactamasa) permite la propagación y selección del vector E. coli.
[0402] El vector pMI347 que codifica el anticuerpo monoclonal anti-IL-9 7F3com-2H2 ha sido depositado en la forma de E. coli (DH5-α) en la Colección americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection, ATTC), ubicada en Manassas, Virginia según las disposiciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del
Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes (“Tratado de Budapest”), el 9 de
abril, 2004, y número de registro asignado PTA-5913.
Expresión transitoria en células de mamífero de 7F3com-2H2
[0403] Se introdujo el vector de expresión pMI347 en células 293-H mediante transfección mediada por lípidos para su expresión transitoria. Tras 72 horas, se recogió el sobrenadante del cultivo celular y se añadió medio de cultivo fresco a cada placa. Se repitió el proceso tras 96 horas. Tras la tercera recolección, los sobrenadantes de los cultivos celulares se agruparon y se analizó el contenido de IgG humana.
Expresión estable en células de mamífero de 7F3com-2H2
[0404] El vector de expresión pMI347 se linealizó con la enzima de restricción Sal I y se introdujo en células NS0 mediante electroporación. Las células se eligieron para la integración del plásmido en el genoma de la célula huésped en un medio libre de glutamina. Las colonias que sobrevivieron en el entorno libre de glutamina se examinaron para la expresión de inmunoglobulina y se expandieron las colonias con mayor expresión. Después, estos transfectantes primarios se clonaron mediante dilución limitante en un medio libre de glutamina para asilar las subpoblaciones de mayor producción. Estos clones se analizaron para características de crecimiento y productividad específicas. Se seleccionaron aquellos clones que exhibían las combinaciones más favorables de alta productividad y rápido crecimiento para su evaluación como líneas celulares de producción.
Cuantificación de 7F3com-2H2
5 [0405] Se analizó el sobrenadante del cultivo celular para la detección de anticuerpo de 7F3com-2H2 utilizando una prueba ELISA tipo sándwich. Se lavaron las placas de ensayo recubiertas con anti-IgG humana de cabra y se incubaron con el sobrenadante del cultivo celular y estándares de IgG humana. Tras la incubación, se lavaron las placas para eliminar la IgG no enlazada. Después, las placas se hicieron reaccionar con anticuerpo secundario de anti-IgG humana de cabra marcada con peroxidasa de rábano. Tras la incubación, se lavaron de nuevo las placas.
10 Se añadió el sustrato cromogénico de 3, 3’, 5, 5’-tetrametilbencidina a cada pocillo y tras cinco minutos, se añadieron 0,1 N de ácido sulfúrico para terminar el recambio de sustrato. A continuación, se midió el recambio de sustrato a 450 nm utilizando un lector de microplacas. La curva estándar se representó como una relación log-lineal y se compararon muestras desconocidas con la curva estándar para estimar su contenido de IgG humana.
6.2 PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS
15 [0406] La siguiente sección describe un método para la purificación de anticuerpos para su uso en los métodos de la invención.
Equipo y componentes de tampón [0407] Los tampones, soluciones de proceso y soluciones de limpieza se preparan con agua para inyección (WFI). Los tampones se someten a pruebas para la detección de carga bacteriana biológica y endotoxina. 20 Soluciones de proceso y tampones [0408]
0,1 M ácido cítrico 10 mM citrato sódico, 80 mM NaCl, pH4,6 25 mM fosfato sódico, pH 6,5
25 20 mM Tris-HCl, 40 mM NaCl, pH 7,5 0,5 M fosfato sódico, pH 6,5 5 mM fosfato sódico, 40 mM NaCl, pH 6,5 50 mM glicina-HCl, 30 mM NaCl, pH 2,5 50 mM glicina-HC, pH 2,35
30 1,0 M base Tris
Soluciones de limpieza y de almacenamiento [0409]
Agua para inyección (WFI) 1,0 N NaOH
35 0,1 N NaOH 20% (v/v) etanol 0,5 N NaOH, 400 ppm hipoclorito de sodio
Tampones de formulación [0410]
40 10 mM histidina, 150 mM NaCl, pH 6,0 4 M cloruro sódico
Equipo (son aceptables las sustituciones con materiales de funciones equivalentes) [0411]
Báscula de 300 kg Medidor de conductividad Placa de agitación
5 Medidor de pH Recipientes: bolsas Stedim , tanques de tampón, botellas PETG de tamaño adecuado Bomba peristáltica Watson Marlow 1700 Unidad de conducitivdad, pH, UV de Wedgewood Controlador de cromatografía de Amersham Pharmacia
10 Gel de intercambio de cationes POROS 50 envasado Gel de afinidad de proteína A recombinante Pharmacia envasado Gel de intercambio de aniones POROS HQ envasado Tubo de silicona esterilizado y despirogenizado Evaluador de integridad del filtro IntegriTest II
15 Filtro de eliminación de virus de membrana Asahi Planova 20 N esterilizado Filtro Durapore de 0,2 micrones de Millipore Filtro multimedia de Millipore Filtro 10/60 SP, CUNO 60LP Carcasa de filtro CUNO
20 Campana de clase 100
Purificación y formulación de los anticuerpos
[0412] El proceso de purificación comprende tres etapas de cromatografía, una etapa de nanofiltración, una etapa de tratamiento a bajo pH, y formulación. Estas fases están diseñadas para eliminar las proteínas de la célula huésped, ADN y componentes del cultivo celular como albúmina de suero bovino y transferrina. Además, el proceso
25 incluye etapas para controlar la carga bacteriana biológica y endotoxina y eliminar e inactivar virus.
Medio condicionado (etapas de la 1 a la 6)
[0413] El medio condicionado de un solo lote de cultivo celular o agrupado a partir de múltiples lotes de cultivo celular se purifica como un solo lote. La combinación de múltiples lotes de cultivo celular en un lote de purificación se lleva a cabo para utilizar pasos de procesamiento posteriores diseñados para un solo tamaño de lote y para 30 disminuir el número de lotes de purificación. Por ejemplo, puesto que los volúmenes de trabajo de los biorreactores de cultivos celulares de 130 L y 250 L son aproximadamente 100 L y 200 L, respectivamente, estos dos lotes de cultivo celular podrían agruparse y funcionar como un lote de purificación de 300 L. Las muestras de producto del proceso se someten a pruebas de ADN utilizando un ensayo con PicoGreen o un ensayo de PCR cuantitativo para detectar ADN. La concentración de proteínas se determina bien mediante ensayo HPLC enlazable de proteína A o
35 mediante absorbancia UV a 280 nm. Los flujos del proceso que contiene el producto se supervisa para detectar endotoxina y carga bacteriana biológica. Los efluentes de la columna se supervisan para detectar endotoxina. A continuación se resume una descripción de cada etapa.
Ajuste y filtración del medio condicionado (etapa 7)
[0414] El medio condicionado se ajusta a pH 4,6 ± 0,2 con 0,1 M de ácido cítrico. Después, se filtra el medio 40 condicionado ajustado utilizando un filtro CUNO alineado con un filtro Durapore de 0,2 micrones de Millipore.
Etapa de cromatografía de intercambio catiónico (estapa 8)
[0415] El medio condicionado ajustado y filtrado se carga en una columna de intercambio catiónico que ha sido equilibrada con 10 mM de fosfato de sodio, 80 mM de cloruro de sodio, pH 4,6. El anticuerpo enlazado se lava utilizando el mismo tampón. Después, se lava la columna con 25 mM de fosfato de sodio pH 6,5 para eliminar impurezas del proceso, especialmente albúmina de suero bovino. El producto se eluye usando 20 mM de tampón Tris-HCl, 40 mM NaCl, pH 7,5. Tras la elución del producto, se limpia la columna con 1,0 N NaOH y se almacena en 0,1 N NaOH a temperatura ambiente.
Cromatografía con proteína A recombinante (etapa 9)
5 [0416] El producto del intercambio catiónico se carga directamente en una columna de proteína A recombinante equilibrada con 20 mM de tampón Tris-HCl, 40 mM NaCl, pH 7,5. Tras la carga, se lava la columna con el tampón de equilibrado, y se eluye el producto con 50 mM de glicina, 30 mM NaCl, pH 3,2. El producto de la proteína A recombinante se neutraliza a pH 6,5 ± 0,2 con 1,0 M de base Tris. Esta etapa de cromatografía elimina impurezas adicionales relacionadas con el proceso. Al final de la etapa, se lava la columna con el tampón de equilibrado, se
10 limpia con 0,1 N NaOH, se lava con tampón de equilibrado y se almacena en 20% (v/v) etanol a temperatura ambiente.
Cromatografía de intercambio aniónico (etapa 10)
[0417] Esta etapa de cromatografía es la etapa final diseñada para eliminar cualquier nivel de rastros de impurezas relacionadas con el proceso. Se equilibra la columna con 0,5 M de fosfato de sodio, pH 6,5 seguido de equilibrado
15 con 5 mM de fosfato de sodio, 40 mM de cloruro de sodio, pH 6,5. En estas condiciones, el producto de la proteína A recombinante neutralizado se carga en la columna de intercambio aniónico equilibrada, y en estas condiciones, se recupera el producto en la fracción no enlazada y se retienen las impurezas relacionadas con el proceso en la columna. La columna se limpia con 1,0 N NaOH y se almacena en 0,1 N NaOH a temperatura ambiente.
Nanofiltración (paso 11)
20 [0418] El producto de intercambio aniónico se filtra a través de una membrana 20 N Planova esterilizada (tamaño del poro = 20 nm) que se prepara lavando primero con agua para inyección y después con 5 mM de fosfato de sodio, 40 mM de cloruro de sodio pH 6,5. Una vez que se ha filtrado el producto, se agrega al filtro un pequeño volumen de 5 mM de fosfato de sodio, 40 mM de cloruro de sodio, pH 6,5 para maximizar la recuperación de producto. Tras la filtración, se analiza la integridad del nanofiltro.
25 Tratamiento a pH bajo (etapa 12)
[0419] El pH del producto nanofiltrado se ajusta a 3,4 ± 0,1 con 50 mM de glicina, pH 2,35 y se mantiene a este pH durante 30 ± 10 minutos. Tras el tratamiento a pH bajo, el pH del producto se ajusta a 6,5 ± 0,2 con 1,0 M de base Tris.
6.3 INTERACCIÓN DE ANTICUERPOS DE IL-9 CON IL-9 HUMANA RECOMBINANTE
30 [0420] La interacción de MH9A3 y 7F3com-2H2 soluble (ambos en forma de IgG y Fab) con rhu-IL-9 inmovilizada fue monitorizada mediante detección de resonancia superficial de plasmones utilizando un instrumento BIAcore 3000 (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden). Se unió rhu-IL-9 a la matriz de dextrano de un chip sensor CM5 (Pharmacia Biosensor) utilizando un kit de enlace amino a una densidad superficial de entre 100 y 200 RU. Se diluyó 7F3com-2H2 en 0,01 M HPES pH 7,4 que contenía 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA y P20 al 0,005%. Todas las diluciones
35 posteriores se realizaron en el mismo tampón. Todos los experimentos de enlace se llevaron a cabo a 25 ºC con concetraciones que oscilan entre 0,19 nM y 100 nM a un caudal de 75 μL/min; se recogieron datos durante aproximadamente 35 minutos y se utilizaron tres pulsos de 1 minuto de 30 mM HCl para regenerar las superficies. Se hicieron fluir también los anticuerpos sobre una célula no recubierta y los sensogramas de estas zonas en blanco se sustrajeron de aquellos obtenidos con los chips unidos a rhu-IL-9. Los datos se adaptaron a un modelo de enlace
40 Langmuir 1:1. El algortimo calcula tanto kon como koff, a partir de las cuales se deduce la constante de disociación de equilibrio aparente, KD, como la proporción de las dos constantes (koff/kon). Estos valores obtenidos se indican en la Tabla 6 a continuación:
Tabla 6
Molécula
kon (M-1 s-1) koff (s-1) KD (pM)
7F3com-2H2 Fab
1,68 x 105 3,62 x 10-5 215
7F3com-2H2 IgG
4,76 x 105 2,65 x 10-6 6
MH9A3 Fab
2,89 x 105 1,80 x 10-4 623
MH9A3 IgG
3,02 x 105 8,94 x 10-6 30
LISTA DE SECUENCIAS
[0421]
<110> MedImmune, Inc.
<120> ANTICUERPOS DE IL-9 RECOMBINANTE Y USOS DE LOS
MISMOS
5
<130> 10271-112-228
<140>
<141>
<150> 60/462,259 <151> 2003-04-11
<150> 60/477,797 <151> 2003-06-10
10
<160> 60
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
15
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3 25 <211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
30 <210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5 5 <211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
10 <210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens 20 <400> 7
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 10 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12 15 <211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
20 <210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14
<211> 7
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 120 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19 10 <211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
15 <210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26 10 <211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211> 62
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
10 <210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
<210> 29
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35 20 <211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
5 <210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15 <400> 37
<210> 38
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210>
39 25 <211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
<210>
42 15 <211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
20 <210> 43
<211> 366
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44 ggaggcacct tcagctatta ctggatagag 30
<210> 45
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45 gagattttac ctggaagtgg tactactaac ccgaatgaga agttcaaggg c 51
<210> 46
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46 gcggattact acggtagtga ttacgtcaag tttgactac 39
<210> 47
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48 aaggcaagtc agcatgtgat tactcatgta acc 33
<210> 49
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
5
<400> 49
gggacatcct acagc
15
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
10
<213> Homo sapiens
<400> 50
cagcaatttt acgagtatcc tctcacg
27
<210> 51
<211> 591
15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
<210> 52
<211> 144
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
<210> 53
<211> 808
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
<210> 54
<211> 140
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
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<211> 2171
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
<210> 56
<211> 2175
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
<210> 57
<211> 1451
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
<210> 58
<211> 521
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
<210> 59
<211> 332
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
<210> 60
<211> 369
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VH CDR2
<400> 61
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VL CDR1
<400> 62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VL CDR3
<400> 63
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VL CDR3
<400> 64
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VL CDR2
<400> 65

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo de IL-9 que comprende:
    (a)
    una región de determinación de complementariedad (CDR) 1 del dominio variable pesado (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:26; y una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2; y una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3; y una VL CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:62; y una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:65; y una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:20; o
    (b)
    un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:27; y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:28;
    donde el anticuerpo se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de IL-9 humano con alta afinidad, donde la alta afinidad se caracteriza por:
    (i) una constante de velocidad de asociación (kon) de al menos 105 M-1s-1; y una constante de velocidad de disociación (koff) de menos de 2 x 10-4s-1; o (ii) una constante de disociación (Kd) de menos de 10-9 M
    donde la alta afinidad se mide por Biacore.
  2. 2.
    El anticuerpo de IL-9 según la reivindicación 1 que comprende:
    un VH que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 27 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:28.
  3. 3.
    El anticuerpo de IL-9 de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.
  4. 4.
    El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en el que el anticuerpo se conjuga a un marcador o un agente terapéutico.
  5. 5.
    Una composición farmacéutica que comrpende el anticuerpo de IL-9 de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, y un portador farmacéuticamente aceptable.
  6. 6.
    El uso de una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva del anticuerpo de IL-9 de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 para la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar y/o mejorar un trastorno inflamatorio, estando adaptado dicho medicamento para su administración a un sujeto que lo necesite.
  7. 7.
    El uso de la reivindicación 6, en el que el trastorno inflamatorio es asma, una alergia o artritis.
  8. 8.
    El uso de la reivindicación 6 comprendiendo además una dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos del anticuerpo de IL
  9. 9.
  10. 9.
    El uso de la reivindicación 8, en el que al menos uno de los agentes profilácticos o terapéuticos es un agente antiangiogénico, un antagonista de TNF-α, un agente inmunomodulador o un agente antiinflamatorio.
  11. 10.
    El uso de la reivindicación 9, en el que el agente antiangiogénico es un antagonista de la integrina alfav beta3.
  12. 11.
    El uso de la reivindicación 9, en el que el agente inmunomodulador es siplizumab o un anticuerpo anti-Epha2.
  13. 12.
    El uso de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo de IL-9 está adaptado para su administración parenteral, intranasal u oral.
  14. 13.
    Un método in vitro de diagnóstico, pronóstico o vigilancia de un trastorno o enfermedad caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de IL-9 o la expresión y/o actividad aberrante de un IL-9R que comprende:
    el análisis del nivel de IL-9 en las células o en una muestra de tejido de un sujeto usando el anticuerpo de IL-9 de cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y comparar el nivel analizado de IL-9 con una muestra biológica normal, por la cual un aumento o disminución en el nivel analizado de IL-9 en comparación con la muestra biológica normal de IL-9 es indicativo de dicho trastorno o enfermedad.
  15. 14.
    Un kit que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 e instrucciones para el uso, en uno o más recipientes.
  16. 15.
    Un artículo de fabricación que comprende un material de envasado y un agente farmacéutico contenido en dicho material de envasado, en el que dicho agente farmacéutico comprende el anticuerpo de IL-9 de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 y un portador farmacéuticamente aceptable.
    124 125 126 127 128 129
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