CN103260646B - Notum蛋白调节剂和使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了新的调节剂，包括抗体及其衍生物，和使用这样的调节剂来治疗过度增生性病症的方法。

Description

Notum蛋白调节剂和使用方法
交叉引用的申请
本申请根据美国法典第35篇第119(e)条要求2010年8月27日提交的美国临时申请号61/377,882、2010年9月3日提交的61/380,181、2010年9月30日提交的61/388,552和2011年7月21日提交的61/510,413的权益，其中所有申请完整地通过引用并入本文。
发明领域
本申请总体涉及组合物和它们在治疗或改善过度增生性病症、其增殖、复发、再发或转移中使用的方法。在广泛的方面，本发明涉及Notum调节剂、包括Notum拮抗剂和融合构建体用于治疗或预防肿瘤病症的用途。在特别优选的实施方案中，本发明提供了抗Notum抗体用于恶性肿瘤包括例如，在KRAS和/或APC突变的结肠直肠癌和KRAS突变的胰腺癌的免疫治疗性处理中的用途。
序列表
本申请含有已经经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，该序列表在此处完整地通过引用并入。所述ASCII拷贝，在2011年8月26日生成，名为11200.3.304.txt，大小为138,922字节。
发明背景
干细胞和祖细胞分化和细胞增殖是正常的进行过程，其一致作用以支持器官形成期间的组织生长和所有活生物体的寿命期间大部分组织的细胞更替和修复。分化和增殖决定经常是由许多因子和信号控制，所述因子和信号被平衡以维持细胞命运决定和组织构架。正常组织构架由于对应于微环境诱因的细胞而得以维持，所述微环境诱因调节细胞分裂和组织成熟。相应地，细胞增殖和分化通常只在对于更替损伤的或正在死亡的细胞或对于生长必要时发生。不幸的是，细胞增殖和/或分化的破坏可以由于无数因素而导致，所述因素包括，例如，各种信号传递化学物的不足或过多，改变的微环境的存在，遗传突变或其一些组合。当正常细胞增殖和/或分化受干扰或以某种方式破坏时，它可以导致各种疾病或病症，包括癌症。
用于癌症的常规治疗包括化疗、放疗、外科手术、免疫治疗(例如，生物反应调节剂、疫苗或有靶向治疗剂)或其组合。不幸的是，太多癌症对于这样的常规治疗是无应答或最小应答的，留给患者的选择很少。例如，一些患者亚群表现出基因突变(例如，KRAS)，所述基因突变使它们不应答，尽管某些疗法存在一般有效性。此外，根据癌症的类型，一些现有治疗，如外科手术，可能不是可行的替代方案。当尝试照顾以前经历治疗并随后复发的患者时，目前护理治疗剂的标准的固有限制特别明显。在这样的情况下，失败的治疗方案和导致的患者恶化可能导致难治性肿瘤，其经常使它们自身表现为侵袭性更大的疾病，后者最终证明是无法治愈的。尽管经过数年在癌症的诊断和治疗中已经有很大的改进，但是许多实体瘤的总体生存率主要维持不变，这是由于现有防止复发、肿瘤复发和转移的治疗的失败。因此，仍然存在开发更靶向和有效治疗的挑战。
一个有希望的研究领域涉及使用靶向治疗剂以追踪似乎是许多癌症基础的肿瘤发生“种子”细胞。为此，目前已知大部分实体组织包含成体、组织驻留干细胞群体(tissue-resident stem cell population)，所述干细胞群体生成包含该组织的大多数的分化的细胞类型。在这些组织中出现的肿瘤类似地由也由干细胞产生、但是其总体增殖和组织明显不同的细胞的异质群体组成。尽管越来越认识到大多数肿瘤细胞具有有限的增殖能力，但是肿瘤细胞的少数群体(通常被称为癌症干细胞或CSC)具有独有的广泛自我更新的能力，从而使它们具有肿瘤再起始能力。更具体地，癌干细胞假说提出，在每个肿瘤内存在独特的细胞亚组(即，CSC)(约0.1-10%)，所述细胞亚组能够无限自我更新并生成其复制能力渐进受限的肿瘤细胞，所述复制能力渐进受限是由于其分化为肿瘤祖细胞并随后分化为终末分化的肿瘤细胞而导致的。
近年来，已经变得更加明显的是，这些CSC(也被称为肿瘤永生细胞(tumor perpetuating cells)或TPC)可能对常规化疗剂或辐射更耐受，并且因此在临床护理治疗的标准后持续，以便后来促进复发性肿瘤的生长、继发性肿瘤和转移。此外，越来越多的证据表明，在CSC中调节器官发生和/或正常组织驻留干细胞的自我更新的通路被失调或改变，导致自我更新肿瘤细胞和肿瘤形成的不断增殖。一般参见Al-Hajj等人, 2004, PMID:15378087;和Dalerba等人, 2007, PMID:17548814; 其中每一个完整地通过引用并入本文。因此，常规的以及更新的靶向治疗方法的有效性显然已经受到下列事实的限制：存在和/或出现能够使癌症永生、甚至在面对这些多种治疗方法的情况下使癌症永生的耐受性癌细胞。Huff等人, European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006)和Zhou等人, Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009)，其中每一个完整地通过引用并入本文。通过常规减瘤剂一致性地无法显著增加患有实体瘤的患者的生存和通过发展关于肿瘤如何生长、复发和转移的越来越复杂的理解，验证了这样的观察结果。相应地，最近用于治疗肿瘤病症的策略已经认识到消除、耗竭、沉默或促进肿瘤永生细胞的分化，从而减少肿瘤复发、转移或患者复发的可能性的重要性。
开发这样的策略的努力已经引入了涉及非常规异种移植(NTX)模型的最近工作，其中在免疫功能低下小鼠中植入原代人实体瘤样本并唯一地传代。这样的技术验证了具有生成异质肿瘤并促进其无限生长的独特能力的细胞亚群的存在。如以前假设的，NTX模型中的工作已经验证，鉴定的肿瘤细胞的CSC亚群似乎对减瘤方案如化疗和辐射更耐受，这可能解释临床应答率和总生存之间的不同。此外，CSC研究中采用NTX模型已经引发了药物发现和药物候选的临床前评价的根本性变化，可能产生对肿瘤复发和转移具有主要影响并因此改善患者生存率的CSC靶向治疗。尽管已经取得了进展，与处理原代和/或异种移植肿瘤组织相关的固有技术困难，连同表征CSC身份和分化潜能的实验平台的缺乏，造成了巨大挑战。因此，仍然存在对于选择性靶向癌干细胞和开发可以用于过度增生性病症的治疗、预防和/或管理中的诊断、预防或治疗化合物或方法的大量需求。
发明概述
本发明提供这些和其他目的，在广泛意义上，其涉及可以用于治疗Notum相关病症(例如，过度增生性病症或肿瘤病症)的方法、化合物、组合物和制品。为此，本发明提供了有效靶向癌干细胞并且可以用于治疗患有多种恶性肿瘤的患者的新的Notum调节剂。在某些实施方案中，公开的Notum调节剂可以包括识别、竞争、激动(agonize)、拮抗、相互作用、结合或结合Notum多肽、其配体或其基因并调节、调整、改变、变化或修改Notum蛋白对一个或多个生理通路(例如，Wnt/β-联蛋白，Hh或BMP通路)的影响的任何化合物。在本发明的选择的实施方案中，Notum调节剂可以包含Notum自身或其片段，无论是分离的形式或与其他部分融合或关联(例如，Fc-Notum、PEG-Notum或与靶向部分结合的Notum)。在其他选择的实施方案中，Notum调节剂可以包含Notum拮抗剂，对于本申请的目的，所述Notum拮抗剂应当是指识别、竞争、相互作用、结合或结合Notum并中和、消除、降低、敏化、重编程、抑制或控制肿瘤细胞包括肿瘤起始细胞(tumor initiating cells)的生长的任何构建体或化合物。在优选的实施方案中，本发明的Notum调节剂包含抗Notum抗体或其片段或衍生物，已经意外地发现其沉默、中和、降低、减少、耗竭、减轻、减弱、重编程、消除或以其他方式抑制肿瘤起始细胞传播、维持、扩增、增殖或以其他方式促进肿瘤细胞的生存、复发、再生和/或转移的能力。
在一个实施方案中，Notum调节剂可以包括人源化抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:331中所述的重链可变区氨基酸序列和如SEQ ID NO:332中所述的轻链可变区氨基酸序列。在其他优选的实施方案中，本发明将是包含hSC2.D2.2抗体和药学上可接受的载体的组合物的形式。
在某些其他实施方案中，本发明将包含在施用于受试者后降低肿瘤起始细胞的频率的Notum调节剂。优选地，将使用体外或体内有限稀释分析确定频率的降低。在特别优选的实施方案中，可以使用体内有限稀释分析进行这样的分析，其包括将活的人肿瘤细胞移植进免疫功能低下的小鼠中。可替代地，可以使用体外有限稀释分析进行有限稀释分析，其包括将活的人肿瘤细胞有限稀释沉积进体外集落支持条件。在任一种情况下，频率降低的分析、计算或定量将优选包括使用泊松分布统计学以提供准确描述。将被理解的是，尽管这样的定量方法是优选的，但是其他更低劳动密集型方法如流式细胞术或免疫组织化学也可以用于提供期望值，并且相应地，被清楚地考虑为在本发明的范围内。在这样的情况下，可以使用已知用于富集肿瘤起始细胞的肿瘤细胞表面标记的流式细胞分析或免疫组织化学检测而确定频率的降低。
因此，在本发明的另一个优选实施方案中包括治疗Notum相关病症的方法，包括将治疗有效量的Notum调节剂施用于需要其的受试者，由此降低肿瘤起始细胞的频率。再次，将优选使用体外或体内有限稀释分析确定肿瘤起始细胞频率的降低。
在这方面，将被理解的是，本发明，至少部分，基于如下发现：Notum多肽和与涉及各种瘤形成的病因学的肿瘤永生细胞(即，癌干细胞)相关。更具体地，本申请意外地显示，各种示例性Notum调节剂的施用可以降低、抑制或消除由肿瘤起始细胞的肿瘤发生性信号传递(即，降低肿瘤起始细胞的频率)。该降低的信号传递，无论通过肿瘤起始细胞的降低或消除或重编程或沉默或通过改变肿瘤细胞形态(例如，诱导分化，生态位破坏(niche disruption))，进而允许通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持、扩增和/或转移和复发而更有效地治疗Notum相关病症。在其他实施方案中，公开的调节剂可以干扰、抑制或以其他方式延迟可以促进肿瘤生长的Notum介导的旁分泌信号传递。进一步，如下面将更详细地讨论的，Notum多肽密切参与Wnt/β-联蛋白、hedgehog(Hh)和骨形态发生蛋白(BMP)致癌生存通路。使用本文描述的新的Notum调节剂干预这些发育信号传递转导通路可以进一步通过多于一种机制(即，肿瘤起始细胞降低和破坏发育信号传递)改善病症以提供累加或协同效应。
因此，本发明的另一个优选实施方案包括治疗需要其的受试者中的Notum介导的病症的方法，其包括将Notum调节剂施用于所述受试者的步骤。在特别优选的实施方案中，Notum调节剂将与抗癌剂结合(例如，缀合)。此外，可以实现这样的破坏和附带利益，无论受试者肿瘤组织与正常邻近组织相比是否表现出升高水平的Notum或降低或抑制水平的Notum。
此外，有证据表明，本发明的调节剂在某些实体瘤的治疗中可以是特别有效的。因此，在其他特别优选的实施方案中，本发明包括治疗患有肿瘤病症的受试者的方法，所述肿瘤病症包含表现出KRAS突变、APC突变或CTNNB1突变的实体瘤，所述方法包括施用治疗有效量的至少一种Notum调节剂的步骤。
在仍其他实施方案中，本发明包括在需要其的受试者中抑制Notum介导的旁分泌信号传递的方法，其包括施用药学有效量的Notum调节剂的步骤。
本发明的其他方面利用公开的调节剂潜在破坏多个致癌生存通路而同时沉默肿瘤起始细胞的能力。这样的多活性Notum调节剂(例如，Notum拮抗剂)当与护理抗癌剂或减瘤剂的标准组合使用时可以证明是特别有效的。此外，两种或更多种Notum拮抗剂(例如，特异性结合Notum上两个离散表位的抗体)可以根据本教导组合使用。此外，如下面一些细节中所讨论的，本发明的Notum调节剂可以以缀合或非缀合状态和任选地作为与各种化学或生物抗癌剂组合的敏化剂使用。
因此，本发明的另一个优选实施方案包括在受试者中敏化肿瘤而用于用抗癌剂治疗的方法，其包括将Notum调节剂施用于所述受试者的步骤。在本发明的特别优选的方面，如使用体外或体内有限稀释分析所确定的，Notum调节剂将特别导致肿瘤起始细胞频率的降低。
类似地，由于本发明的化合物可以通过各种生理机制发挥治疗益处，本发明还涉及特别制造以利用某些细胞过程的选择的效应物或调节剂。例如，在某些实施方案中，可以工程改造优选的调节剂以便在肿瘤起始细胞的表面上或附近与Notum结合并刺激受试者的免疫应答。在其他实施方案中，效应物可以包括针对表位的抗体，其促进任何Notum酶活性的中和，然后用于降低Notum底物在肿瘤微环境中的量和任何相关旁分泌信号传递。在又其他实施方案中，公开的调节剂可以通过耗竭或消除Notum相关细胞起作用。因此，重要的是理解，本发明不限于任何特定的作用模式，而是包括实现期望结果的任何方法或Notum调节剂。
在这样的构架内，公开的实施方案的优选实施方案涉及治疗患有肿瘤病症的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的至少一种中和性Notum调节剂的步骤。
其他实施方案涉及治疗患有Notum相关病症的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的至少一种耗竭性Notum调节剂的步骤。
在又另一个实施方案中，本发明提供了维持治疗的方法，其中在设计用于去除至少一部分肿瘤块的初始程序(例如，化疗、放疗或外科手术)之后施用一段时间的公开的效应物。可以施用这样的治疗方案数周期间、数月期间甚至数年期间，其中Notum调节剂可以预防性地起作用以抑制转移和/或肿瘤复发。在又其他实施方案中，可以与已知减瘤方案一致地施用公开的调节剂以防止或延迟转移。
除上面讨论的治疗用途，还将被理解的是，本发明的调节剂可用于诊断Notum相关病症和，特别是过度增生性病症。因此，优选的实施方案包括在需要其的受试者中诊断过度增生性病症的方法，其包括以下步骤：
a. 从所述受试者获得组织样品；
b. 将所述组织样品与至少一种Notum调节剂接触；和
c. 检测或定量与所述样品结合的Notum调节剂。
这样的方法可以连同本申请容易地辨别，并且可以使用一般获得的商业技术如自动酶标仪、专用报道分子系统等容易地进行。在优选的实施方案中，检测或定量步骤将包括肿瘤起始细胞频率的降低。此外，有限稀释分析可以如前面上述所提到地进行，并将优选采用使用泊松分布统计学以提供关于频率降低的准确描述。
类似地，本发明还提供了用于诊断和监测Notum相关病症如癌症的试剂盒。为此，本发明优选提供了用于诊断或治疗Notum相关病症的制品，其包括包含Notum调节剂的容器和用于使用所述Notum调节剂以治疗或诊断Notum相关病症的说明书材料。
本发明的其他优选的实施方案还利用公开的调节剂作为工具的特性，所述工具可用于通过方法如荧光激活细胞分选(FACS)或激光介导的分隔来鉴定、分离、分隔或富集肿瘤起始细胞的群体或亚群。
因此，本发明的另一个优选的实施方案涉及鉴定、分离、分隔或富集肿瘤起始细胞的群体的方法，其包括将所述肿瘤起始细胞与Notum调节剂接触的步骤。
上述是概述，因此必然包含细节的简化、概括和省略；因而，本领域技术人员将理解，该概述仅是说明性的，并且不意在以任何方式限制。本文所述的方法、组合物和/或仪器和/或其他主题的其他方面、特征和优点将在本文所述的教导中变得显而易见。提供该概述以介绍简化形式的概念选择，其在下面详述中进一步描述。该概述并非意在鉴定要求保护的主题的关键特征或基本特征，也非意在用于帮助确定要求保护的主题的范围。
附图概述
图1A-D分别描述了编码人Notum的核酸序列(SEQ ID NO：1)、包含氨基末端信号序列的人Notum前体蛋白的相应氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、显示氨基酸差异的部分猕猴、鼠和人蛋白Notum序列的比对(SEQ ID NO：99-102)和Fc-Notum融合构建体形式的示例性Notum调节剂的氨基酸(SEQ ID NO：333)和核酸(SEQ ID NO：334) 序列，其中Notum部分加下划线；
图2图示描述使用全转录组测序获得的人Notum的基因表达水平；
图3图示显示如使用定量RT-PCR测量的在从未处理和伊立替康处理的具有三种不同非常规异种移植(NTX)结肠直肠肿瘤细胞系之一的小鼠获得的高度富集的肿瘤祖细胞(TProg)和肿瘤永生细胞(TPC)群体中人Notum的相对基因表达水平，并且针对非肿瘤发生(NTG)富集的细胞群体进行均一化；
图4A和4B图示显示在来自患有I-IV期疾病的患者的整个结肠直肠肿瘤样本中人Notum的相对基因表达水平，其针对正常结肠和直肠组织中的表达平均值进行均一化；
图5A和5B图示显示来自具有18种不同实体瘤类型之一的患者的整个肿瘤样本(灰色框)或匹配的NAT(白色框)中人Notum分别的相对或绝对基因表达水平；
图6图示显示在来自具有11种不同肿瘤类型之一的患者获得的样本的正常邻近组织(白色)或肿瘤组织(黑色)连同没有(白色)或有(黑色)p53过表达的293T对照细胞中正常人Notum蛋白的相对表达；
图7A和7B分别以表格显示如本文实施例中所述分离并克隆的38种不同Notum调节剂的如Chothia等人所定义的基因排列和重和轻链CDR序列；
图8A-X提供如本文实施例中所述分离并克隆的24种不同抗Notum抗体的重和轻链可变区的核酸和氨基酸序列；
图9A-D图示典型Wnt3A测定和如其所测定的可溶性Notum调节剂Notum-hFc和Notum-His(人、小鼠和猕猴)连同突变型Notum构建体S232A的影响；
图10图示显示如使用典型Wnt3A测定所测量的关于活性Notum的抑制的数种抗Notum抗体的活性，其针对未抑制的Wnt诱导的荧光素酶活性进行均一化；
图11A-D图示典型Wnt3A测定，其用于测量Notum调节剂SC2.D2.2和SC2.A106(又名10B3)在各种浓度对可溶性Notum构建体Notum-His和Notum-hFc的影响，其针对未抑制的Wnt诱导的荧光素酶活性进行均一化；
图12A和12B图示说明使用典型Wnt3A测定的Notum调节剂SC2.D2.2和SC2.A106(又名10B3)的活性的物种特异性缺乏，其中调节剂表现出Wnt通路的猕猴或鼠可溶性Notum构建体拮抗的很大抑制；
图13A和13B提供的数据建立有效的共培养Wnt3A测定，其显示在混合细胞群体中内源性表达的Notum的影响(图13A)和Notum调节剂SC2.D2.2对其的影响(图13B)；
图14A和14B表示显示针对Notum的多克隆抗体和本发明的单克隆抗体Notum调节剂检测在选择的蛋白细胞裂解物中的Notum的Western印迹；
图15A-G图示如使用Notum调节剂SC2.A109测量的来自个体患者细胞裂解物样品的Notum蛋白水平，其显示在数种不同肿瘤类型和在不同疾病阶段的Notum上调；
图16A-C显示在基于细胞的测定中hNotum蛋白(His和hFc)增加结肠直肠肿瘤细胞增殖和/或耐受凋亡的能力和Notum调节剂拮抗这样的Notum介导的效应的能力；
图17A-C图示生物化学测定的各个方面，其使用两种不同发色酯酶底物(乙酸对硝基苯酯(PNPA)和丁酸对硝基苯酯(PNPB))定量小鼠、猕猴和人Notum连同其无效突变体的酯酶活性；
图18A和18B显示公开的Notum调节剂在体外抑制hNotum的酯酶活性的能力，其中在图18A中hNotum的浓度变化，并且在图18B中Notum调节剂的浓度变化。
图19图示生物化学测定，其定量提供的hNotum(灰色条)和阳性对照猪胰脂肪酶(黑色条)的脂肪酶活性；
图20图示显示公开的Notum调节剂在体外抑制hNotum的脂肪酶活性的能力，其中hNotum的浓度保持恒定，并且Notum调节剂的浓度变化。
图21A和21B图示显示使用TCF报道分子测定(图21A)和4MUH测定(图21B)，点突变的人Notum(S232A和D340A)在293.TCF细胞中不能拮抗Wnt3A的活性；
图22是描述LEF/TCF转录因子活化的典型Wnt信号传递通路的简化图。
图23显示公开的Notum调节剂拮抗Notum介导的Wnt3A活性的能力，其通过293.TCF细胞中荧光素酶转录的活化所显示，其中LiCl充当阳性对照；
图24A和24B图示显示公开的Notum调节剂拮抗嵌合Notum蛋白抑制Wnt3A活性蛋白水平的能力的能力，其中图24A显示嵌合Notum可以抑制Wnt3A活性，图24B显示添加Notum调节剂可以恢复活性；
图25A和25B显示在TCF测定(图25A)和4MUH测定(图25B)中点突变的Notum构建体保留其干扰荧光素酶活性的Wnt3a诱导的能力；
图26A和26B图示表明，如TCF测定(图26A)和4MUH测定(图26B)中所测量的，人和猕猴Notum中进行的某些点突变可以干扰Notum调节剂SC2.D2.2拮抗Notum酶活性的能力；
图27A和27B图示显示，当Notum调节剂与Notum孵育并暴露于细胞随后添加Wnt3A CM(图27A)和与Wnt3A CM预孵育随后暴露于细胞(图27B)时，在TCF测定中公开的Notum调节剂抑制Wnt3A活性的Notum介导的拮抗的能力；
图28A和28B表明，如在240μM(图28A)和90μM(图28B)的4MUH浓度所测量的，奥利司他形式的小分子充当Notum调节剂并以剂量​​依赖的方式抑制Notum对4MUH的水解活性的能力；
图29A和29B是Western印迹，其代表在通过Notum体外脱脂后Wnt3a的分配(图29A)，和Notum调节剂抑制其的能力(图29B)；
图30图示显示如使用TCF测定所测量的，公开的Notum调节剂对猕猴、小鼠和人Notum的酶中和特性；
图31A和31B分别显示SC2.D2.2的重和轻链可变区(SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58)和人源化SC2.D2.2(SEQ ID NO：331和SEQ ID NO：332)的比对的氨基酸序列，其中顶端序列是人源化衍生物，垂直标记表明各自氨基酸是相同的，其中通过Chothia等人所定义的CDR序列加下划线；
图32A–C图示代表，如使用具有固定量的抗体和抗原的系列稀释的无标记相互作用分析所测定的，鼠SC2.D2.2针对五种不同浓度的抗原的测量的亲和力，并分别比较鼠SC2.D2.2和人源化SC2.D2.2的亲和力；和
图33A和33B分别显示使用公开的调节剂生成的标准曲线和如从健康受试者和患有卵巢癌的患者获得的样品中测量并从标准曲线外推的Notum的血浆浓度。
发明详述
I. 介绍
在广泛的意义上，本发明的实施方案涉及新的Notum调节剂和它们在治疗、管理、改善或预防过度增生性病症包括癌症的发生中的用途。不希望被任何特定理论束缚，已经发现，公开的调节剂在降低或延迟肿瘤生长和消除或中和肿瘤发生细胞以及改变这样的细胞对抗癌剂的敏感性中是有效的。进一步，已经令人惊讶地发现，在选择的肿瘤永生细胞(TPC)和已知为Notum的蛋白之间有迄今未知的表型关联。在这方面，已经发现，当与一起包含实体瘤的大部分的肿瘤祖细胞(TProg)和非肿瘤发生(NTG)细胞相比时，选择的TPC(即，癌干细胞或CSC)表达升高水平的Notum。因此，在选择的实施方案中，Notum包含肿瘤相关标记(或抗原)，并且已经发现提供有效的试剂，所述试剂用于检测、敏化和/或抑制TPC和相关瘤形成，所述TPC和相关瘤形成是由于与选择的细胞的表面相关的或肿瘤微环境中的蛋白的升高水平导致的。更具体地，并且甚至更令人惊讶地，鉴于Notum显然是分泌的(至少在一定程度上)，已经进一步发现，Notum调节剂，包括Fc-Notum构建体和免疫反应的拮抗剂(例如，针对该蛋白的抗体)，可以用于耗竭、敏化、消除、降低、重编程、促进这些肿瘤永生细胞的分化，或以其他方式排除或限制这些肿瘤永生细胞在患者中扩散和/或继续促进肿瘤生长或复发的能力。
在优选的实施方案中，本发明的Notum调节剂将包括核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽或多肽。如前面所提到并在下面详细讨论的，本文公开的选择的实施方案将包括以缀合或非缀合形式的针对Notum的抗体。Notum调节剂的其他实施方案将优选包括Notum或其形式、变体、衍生物或片段，包括，例如，Notum融合构建体(例如，Notum-Fc、Notum-靶向部分等)或Notum-缀合物(例如，Notum-PEG、Notum-细胞毒性剂等)。在又其他实施方案中，调节剂可以在基因水平上操作，并且可以包含化合物如反义构建体、siRNA、miRNA等。前述Notum调节剂可以通过竞争机制减弱肿瘤永生细胞的生长、增殖或生存和/或相关的瘤形成，激动或拮抗选择的通路或消除或耗竭特定细胞(包括非TPC支持细胞)，这取决于，例如，Notum调节剂或给药和递送方法的形式。
鉴于这些发现，本领域技术人员将理解，本发明的特别优选的实施方案主要涉及Notum调节剂和它们在降低肿瘤起始细胞的频率中的用途。如将在本文中广泛讨论的，与本发明相容的Notum调节剂广泛地包括结合、结合、复合或以其他方式反应或竞争Notum，并任选地提供肿瘤永生细胞频率的降低的任何化合物。本文公开的示例性调节剂包括核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽或多肽。在某些优选的实施方案中，选择的调节剂将包括针对Notum的抗体或其免疫反应片段或衍生物。这样的抗体可以本质上是拮抗或激动的。在其他优选的实施方案中，与本发明相容的效应物将包括包含Notum自身或其反应片段的Notum构建体。将被理解的是，这样的Notum构建体可以包括融合蛋白，并且可以包括来自其他多肽如免疫球蛋白、装订的肽(stapled peptides)或生物反应调节剂的反应结构域。在仍其他优选方面，Notum效应物或调节剂将包括在基因组水平行使期望效应的核酸装配体。与本教导相容的仍其他调节剂将在下面详细讨论。
在相关的注明中，下列讨论涉及Notum调节剂、Notum拮抗剂和抗Notum抗体。尽管下面提供了每个术语的更详细的定义，将被理解的是，术语对于本公开的目的在很大程度上是可互换的，并且不应被狭窄地解释，除非由上下文指示。例如，如果作出涉及Notum拮抗剂的点，那么它也适用于碰巧是拮抗的本发明的那些抗体。类似地，术语Notum调节剂清楚地包括公开的Notum拮抗剂和抗Notum抗体，并且对后者的引用在不被上下文排除的程度上也适用于调节剂。
II. Notum
如本文所使用的，术语Notum是指天然存在的Notum胶质乙酰酯酶蛋白、其片段或变体。代表性Notum直向同源物包括，但不限于，人(即hNotum)、小鼠、猕猴和果蝇。该基因的人直向同源物包括1488碱基对的开放阅读框，其提供496个氨基酸(aa)多肽构建体，具有约55.7 kDa的分子量。编码人Notum蛋白的示例性核酸序列显示在SEQ ID NO：1中，而相应的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：2中(分别为图1A和1B)。将被理解的是，人Notum蛋白包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-19的预测信号或前导序列，其被剪去以提供蛋白的成熟形式(即477 aa)。以引用的方式，鼠Notum(GenBank登录号：NM_175263)与人Notum约91％同源，而猕猴Notum(GenBank登录号：XM_001112829)约96％同源。除非通过直接引用或上下文的必要性而另有指示，术语Notum应当是指人Notum和免疫反应等同物。Notum的人同系物(GenBank登录号：NM_178493；GeneID 147111)在通过引用并入本文的Torisu等人，2008, PMID:18429952中更完整地描述。将进一步理解的是，该术语也是指含有抗体可以与之特异性结合的表位的Notum的天然或变体形式的片段。
再次，尽管不希望被任何特定理论所束缚，相信本发明的Notum调节剂和特别是Notum拮抗剂可以，至少部分地，通过干扰护理治疗方案(例如，伊立替康)的标准的背景之外的致癌生存，以及降低或消除肿瘤起始细胞信号传递而起作用。例如，通过拮抗Notum而消除TPC可以包括在面对消除增殖性细胞或促进TPC分化的化疗方案时简单促进细胞增殖，使得它们的自我更新(即，无限增殖)能力丧失。
正如前面所指明，Notum似乎特别参与Wnt、Hh和BMP通路。在这方面，本领域技术人员将理解，Notum是最初在果蝇中被鉴定为通过修饰硫酸肝素蛋白聚糖Dally样(Dally-like，Dlp)和Dally而抑制Wingless(Wg)活性的分泌的水解酶。在果蝇中，Notum基因似乎编码671个氨基酸残基的蛋白，这与α/β水解酶超家族的植物胶质乙酰酯酶相关。更近的证据已经表明，果蝇Notum(dNotum)也可以起脂肪酶的作用，其通过切割Dlp的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚而从细胞表面释放Dlp。通过Notum的这些细胞表面蛋白聚糖的修饰和/或释放导致如通过凝胶电泳证明的Dally蛋白表达的细胞表面水平急剧降低和Dlp转化为修饰的形式。这样的观察结果表明，dNotum拮抗由Dally和Dlp增强的Wg和Hedgehog(Hh)信号传递，最可能是通过修饰它们的糖胺聚糖侧链和/或从细胞表面释放Dlp。这些通过dNotum的修饰作用以修饰局部的Wg和Hedgehog浓度，并且因此拮抗这些形态发生素与其受体的相互作用。此外，与Dally或Dlp相关的Wg或Hedgehog蛋白从细胞表面的释放促进了这些形态发生素的长范围活性，这对发育过程中的组织模式化(tissue patterning)具有主要影响。一般参见：Ayers等人，2010, PMID:20412775；Giraldez等人，2002, PMID:12015973和Traister等人，2008, PMID:17967162；其中每一个完整地通过引用并入本文。
各种研究也已经显示，Dally和Dlp相关的蛋白聚糖可能在脊椎动物的Wnt信号传递中起重要作用(Topczewski等人2001, PMID:11702784和Filmus等人，2008, PMID:18505598)，并且Notum作用以经由Wnt的受体Frizzled而调节Wnt信号传递，就像类似蛋白在果蝇中一样。至于Wg，提出哺乳动物Notum通过从细胞表面释放糖基磷脂酰肌醇-锚定的(GPI)磷脂酰肌醇聚糖(类似于Dlp和Dally)而下调Wnt通路。(Traister等人，同上)。当结合至细胞表面时，GPI-锚定的磷脂酰肌醇聚糖通过稳定Wnt的各种形式与它们的Frizzled受体的相互作用而促进Wnt信号传递，而已经从细胞表面释放的磷脂酰肌醇聚糖通过竞争性抑制Wnt与邻近于Frizzled受体的GPI-锚定的细胞表面磷脂酰肌醇聚糖的相互作用而抑制Wnt信号传递(Filmus等人，同上)。磷脂酰肌醇聚糖的不存在或降低的局部浓度最起码增加必须存在于细胞表面以经由Fzd受体刺激β-联蛋白通路信号传递的Wnt浓度的阈值。这些数据，连同额外的研究已经显示，哺乳动物(例如人)Notum拮抗Wnt信号传递。Notum也已经被鉴定为对于转录激活的Wnt/β-联蛋白目标，提示Notum是Wnt/FZD/β-联蛋白信号传递级联的反馈抑制子。
Wnt/Fzd信号传递在许多组织内器官发生和发育过程中的细胞命运决定中起很大的作用，并且这些通路的干扰经常导致癌症。此外，其中下消化道的干细胞已经被鉴定和/或操作的多个小鼠遗传模型显示，经由Wnt/β-联蛋白通路的信号传递影响组织驻留干细胞分化决定(tissue-resident stem cell differentiation decisions)，导致生成Paneth细胞，其本身已经提示支持干细胞基于被称为隐窝的组织结构的自我更新和扩增；这是已知干细胞驻留的地方。Notum对Wnt信号传递的失调和/或TPC群体邻近的Notum的增加的局部浓度对该通路的反馈调节受损可能对肿瘤发生、继续的肿瘤生长和肿瘤复发有贡献。用Notum调节剂改变该贡献可能通过改变肿瘤细胞的细胞表面邻近的Wnt梯度形成而具有治疗益处。
鉴于Notum有效降低在细胞表面的磷脂酰肌醇聚糖浓度的能力，Notum也可能通过从细胞表面释放磷脂酰肌醇聚糖而发挥对Hedgehog(Hh)形态发生素梯度的控制作用。如上在果蝇中所述，Dall和Dlp相关的磷脂酰肌醇聚糖也可以结合Hh以便与Hh受体Patched(Ptc)活性竞争。与Ptc竞争Hh结合有效地降低了邻近Hh与Ptc的结合，导致通过Smoothened降低信号传递，所述Smoothened经由转录因子的Gli家族作用于Hh效应物通路。通过从细胞表面裂解磷脂酰肌醇聚糖，Notum降低了对于Hh的膜邻近竞争的浓度，并且因此通过促进Hh的更有效浓度而经由Smoothened增加Hh信号传递，可能重复经由Ptc的遗传失活而活化Hh信号传递级联的遗传模型，所述Hh结合并抑制Smoothened阻遏物Ptc(Traister等人,和Filmus, 两者同上)。如同Wnt家族蛋白，Hh蛋白被脂质修饰，并且在没有改善总复合物可溶性的相关蛋白(例如，磷脂酰肌醇聚糖)的帮助的情况下扩散非常小(Eaton S., 2006, PMID:16364628)。
Hh形态发生素梯度对于各种实体组织的器官发生和发育是至关重要的，Hh形态发生素梯度的干扰或经由Ptc抑制Smoothened信号传递的能力与发育异常和癌症是相关的。还应该认识到，通过促进磷脂酰肌醇聚糖及其相关Hh蛋白的增加的脱落，Notum也可以生成Hh的新的浓度梯度，所述Hh前面由于Hh的较差的溶解性特征及其与磷脂酰肌醇聚糖的紧密结合而不存在。尽管Hh信号传递通常与其他形态发生素信号传递通路一致作用以控制正常细胞命运决定，但是已经显示Smoothened的组成型活化导致基底细胞癌、成神经管细胞瘤和胰腺肿瘤。还有许多证据表明，提高的Hh信号传递可以与APC和/或KRAS病变配合，例如，以扩大癌症发生和严重度。由于Notum促进Hh的增加的局部浓度和预期地磷脂酰肌醇聚糖相关Hh的新的末端浓度梯度的能力，TPC邻近提高的Notum水平可能是关键的，并且作为在肿瘤发生和肿瘤进展中尚未认识的作用因素。
最后，已经显示磷脂酰肌醇聚糖在各种组织中调节BMP/TG​​F-β家族成员的局部浓度梯度(Paine-Saunders等人, 2000, PMID 10964473)，并且因此磷脂酰肌醇聚糖对Notum裂解的敏感性和从细胞表面的释放事实上可以促进癌症发展，正如在肿瘤和鼠癌症模型中观察到的，其中BMP受体信号传递减少和/或功能失活(Kodach等人, 2008, PMID:18008360和Hardwick等人, 2008, PMID:18756288)。通过实例的方式，BMP受体突变对人的幼年性息肉病综合症和癌症是偶然贡献因素。
如上所讨论的，磷脂酰肌醇聚糖以组织特异性的方式调节不同种类的生长因子和形态发生素。也已经显示磷脂酰肌醇聚糖的改变的基因表达，独立于Notum表达，介导癌发生。磷脂酰肌醇聚糖-3，例如，在某些肿瘤类型中抑制增殖并诱导细胞死亡。因此，磷脂酰肌醇聚糖-3作为肿瘤抑制基因起作用，并且在许多不同来源的肿瘤中下调(Filmus J, 2001, PMID:11320054)。在本发明的构架内，据信，在其中TPC表达升高水平的Notum的肿瘤中，磷脂酰肌醇聚糖浓度被有效地降低，并且这些降低有助于癌发生和肿瘤进展。如本文所公开的，提供的Notum调节剂可以减轻这些水平，并且可能赋予期望的抗肿瘤反应。
除上述磷脂酰肌醇聚糖介导的调控以外，Notum的脂肪酶活性(如下面实施例24中例举)提示了额外的机制，藉此它可以调节Wnt活性；例如，Wnt蛋白的脱脂可以调节它们与分子伴侣的相互作用，影响Wnts的更长范围的运输，以及干扰与Wnt受体和共受体的相互作用。基础广泛的脂肪酶活性也可以干扰通过脂质修饰的蛋白(例如BMP、Wnt & Hh)介导的其他信号传递通路。因此，本文公开的Notum调节剂可以干扰该酶活性，以进一步降低肿瘤起始细胞的频率并抑制肿瘤生长和/或转移。
虽然在过去几年中这些通路已被广泛研究，但是在阐述本发明之前Notum的作用还没有得到充分承认或利用。在这方面，各种实体瘤包括肝细胞癌、胃癌、结肠直肠癌和胰腺癌的基因表达谱分析已经显示Notum在患有这些肿瘤的患者中过表达。参见例如，U.S.S.N. 10/568,471、U.S.S.N. 10/301,822、U.S.P.N. 7,371,840和Torisu等人，同上；其中每一个完整地通过引用并入本文。尽管U.S.S.N. 10/568,471中记载了针对人Notum的单一抗体的生产，但是没有提供任何证据证明这样的抗体在任何类型的治疗设置中可以是有效的。此外，与本发明的新的Notum调节剂不同，绝对没有迹象表明公开的抗体可以拮抗分泌的Notum以产生本文公开的抗肿瘤效果。在任何参考文献中没有任何迹象表明Notum与肿瘤起始细胞相关，也没有任何迹象表明该关联提供有效的机制，通过该机制，这些肿瘤煽动者(tumor instigators)可以被敏化、消除或以其他方式中和，从而允许有效治疗异质肿瘤块。
III. 肿瘤起始细胞
在现有技术的任何教导相反，本发明提供了Notum调节剂，所述Notum调节剂特别可用于靶向肿瘤起始细胞，和特别是肿瘤永生细胞，从而促进肿瘤病症的治疗、管理或预防。更具体地，如前面所指出的，已经令人惊讶地发现，特定肿瘤细胞亚群表达Notum并可能修改对癌干细胞自我更新和细胞生存重要的形态发生素信号传递的局部协调。因此，在优选实施方案中，根据本教导，Notum调节剂可用于降低肿瘤起始细胞频率，并且从而促进过度增生性疾病的治疗或管理。
如本文所使用的，术语肿瘤起始细胞(TIC)包括肿瘤永生细胞(TPC，即，癌干细胞或CSC)和高度增殖性肿瘤祖细胞(称为TProg)，它们通常一起包含肿瘤块或量的独特亚群(即0.1-40％)。对于本公开的目的，术语肿瘤永生细胞和癌干细胞是等价的，并且可以在本文中互换使用。相反，TPC不同于TProg，因为它们可以完全概括肿瘤内存在的肿瘤细胞的组成，并具有无限的自我更新能力，正如通过少量分离的细胞的连续移植(通过小鼠的两次或更多次传代)所显示的。如下面将更详细讨论的，使用适当细胞表面标记的荧光激活细胞分选(FACS)是分离高度富集的细胞亚群(> 99.5％纯度)的可靠方法，这是，至少部分地，由于其区分单细胞和细胞团块(即成对物等)的能力。使用这样的技术，已经显示，当低细胞数量的高度纯化的TProg细胞移植进免疫功能低下的小鼠中时，它们可以在初次移植物中促进肿瘤生长。然而，与纯化的TPC亚群不同，TProg生成的肿瘤不完全反映亲本肿瘤的表型细胞异质性，并且在随后的移植物中再次起始连续肿瘤发生中是明确低效的。相反，TPC亚群完全重构亲本肿瘤的细胞异质性，并且当被连续分离和移植时可以有效地起始肿瘤。因此，本领域技术人员将认识到，TPC和TProg之间的明确差异，虽然两者都可以在初次移植中生成肿瘤，是TPC在以低细胞数量连续移植后永久促进异质肿瘤生长的独特的能力。表征TPC的其他常见方法涉及细胞表面标记的形态和检查、转录谱和药物响应，尽管标记表达可能随着培养条件和随着体外细胞系传代而变化。
相应地，对于本发明的目的，肿瘤永生细胞，像支持在正常组织中的细胞层次的正常干细胞，优选通过它们无限自我更新同时维持多谱系的能力的能力来定义。因此，肿瘤永生细胞能够生成肿瘤发生后代(即，肿瘤起始细胞：TPC和TProg)和非肿瘤发生(NTG)后代。如本文所使用的，非肿瘤发生细胞(NTG)是指从肿瘤起始细胞产生、但自身不具有自我更新或生成构成肿瘤的肿瘤细胞的异质谱系的能力的肿瘤细胞。在实验上，NTG细胞不能够在小鼠中重复地形成肿瘤，甚至当以过量细胞数移植时。
如所示，TProg也被分类为肿瘤起始细胞(或TIC)，因为它们在小鼠中生成肿瘤的能力有限。TProg是TPC的后代，并且一般能够有限数量的非自我更新性细胞分裂。此外，TProg细胞可以进一步被分为早期肿瘤祖细胞(ETP)和晚期肿瘤祖细胞(LTP)，其中每一种可以通过表型(例如，细胞表面标记)和不同的概括肿瘤细胞架构的能力加以区分。尽管有这样的技术差异，ETP和LTP在功能上都不同于TPC，因为当以低细胞数移植时它们一般都不太能够连续重构肿瘤，并且通常无法反映亲本肿瘤的异质性。尽管有上述区别，也已经显示，各种TProg群体，在稀有情况下，可以获得通常归因于干细胞的自我更新能力，并且它们自身变为TPC(或CSC)。在任何情况下，两种类型的肿瘤起始细胞都可能在单一患者的典型肿瘤量中被代表，并且经受本文公开的调节剂的治疗。换言之，公开的组合物在降低这样的Notum阳性肿瘤起始细胞的频率或改变这样的Notum阳性肿瘤起始细胞的化学敏感性中通常是有效的，无论特定实施方案或肿瘤中代表的混合物。
在本发明的上下文中，与构成肿瘤块的TProg(ETP和LTP)、NTG细胞和肿瘤浸润的非TPC衍生的细胞(如成纤维细胞/基质、内皮细胞 & 造血细胞)相比，TPC是更易肿瘤发生、相对更静止和往往更抗化学疗法。鉴于常规治疗和方案，在很大程度上，已经被设计既减瘤又攻击快速增殖细胞，TPC可能比更快速增殖TProg和其他大量肿瘤细胞群体对常规治疗和方案更耐受。进一步，TPC经常表现出使它们对常规治疗相对更抗化学疗法的其他特征，如多药耐药转运蛋白的增加的表达、增强的DNA修复机制和抗凋亡蛋白。这些特性(其每一种都有助于TPC的耐药性)构成了确保具有晚期肿瘤的大部分患者的长期利益的标准肿瘤学治疗方案的失败的关键原因；即无法充分靶向并根除那些促进继续肿瘤生长和复发的细胞(即TPC或CSC)。
与许多前述现有技术治疗不同，本发明的新的组合物优选在施用于受试者后降低肿瘤起始细胞的频率，无论选择的调节剂的形式或特定目标(例如，遗传物质、Notum或Notum配体)。如上所述，肿瘤起始细胞频率的降低可以作为如下的结果而发生：a)肿瘤起始细胞的消除、耗竭、敏化、沉默或抑制；b)控制肿瘤起始细胞的生长、扩增或复发；c)中断肿瘤起始细胞的起始、繁殖、维持或增殖；或d)通过以其他方式阻碍肿瘤生成细胞的生存、再生和/或转移。在一些实施方案中，肿瘤起始细胞频率的降低的发生作为一个或多个生理通路变化的结果而发生。通路中的变化，无论通过肿瘤起始细胞的降低或消除或通过改变它们的潜能(例如，诱导分化，生态位破坏(niche disruption))，或以其他方式干扰它们对肿瘤环境或其他细胞施加影响的能力，进而允许通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持和/或转移和复发而更有效地治疗Notum相关病症。
在可用于评价这样的肿瘤起始细胞频率降低的方法中，是体外或体内有限稀释分析，优选随后使用泊松分布统计学计算或评价预定义的确定事件的频率，如体内生成肿瘤或不生成肿瘤的能力。尽管这样的有限稀释分析是计算肿瘤起始细胞频率降低的优选方法，但是其他要求更低的方法也可以用于有效地确定期望值，尽管准确性略低，并且与本文教导完全相容。因此，如本领域技术人员将理解的，也可能通过众所周知的流式细胞或免疫组织化学方式来确定频率值的降低。至于所有前述方法，参见，例如，Dylla 等人， 2008, PMCID:PMC2413402 & Hoey等人，2009,PMID:19664991，其中每一个完整地通过引用并入本文。
关于有限稀释分析，可以通过将分级或未分级的人肿瘤细胞(例如，分别来自处理和未处理的肿瘤)沉积到培养集落形成的体外生长条件内而完成肿瘤起始细胞频率的体外计数。以这种方式，集落形成细胞可以通过简单计数和表征集落，或通过例如由以下组成的分析来计数：将人肿瘤细胞以连续稀释沉积进板并在铺板后至少10天关于集落形成将每个孔评分为阳性或阴性。体内有限稀释实验或分析，在它们确定肿瘤起始细胞频率的能力中通常更准确，包括将来自未处理的对照或处理的状况的人肿瘤细胞以连续稀释移植，例如，到免疫功能低下的小鼠中，并且随后在移植后至少60天关于肿瘤形成将每只小鼠评分为阳性或阴性。优选通过将泊松分布统计学应用于阳性和阴性事件的已知频率，从而提供符合阳性事件的定义的事件的频率(在这种情况下，分别为集落或肿瘤形成)，而进行体外或体内通过有限稀释分析的细胞频率值的推导。
至于可用于计算肿瘤起始细胞频率的与本发明相容的其他方法，最通常包括可以计量的流式细胞技术和免疫组织化学染色程序。虽然没有上面刚刚描述的有限稀释分析技术那样精确，但是这些程序劳动强度低得多，并且在相对短时间期间内提供合理值。因此，将被理解的是，本领域技术人员可以使用流式细胞术细胞表面标记谱测定，并且从而测量来自各种样品的TIC水平，所述表面标记谱测定采用一种或多种抗体或试剂，所述抗体或试剂结合本领域公认的已知用于富集肿瘤起始细胞的细胞表面蛋白(例如，可能相容的标记显示在下面的实施例1中)。在仍另一个相容的方法中，本领域技术人员可以通过使用一种或多种能够结合被认为区分这些细胞的细胞表面蛋白的抗体或试剂的免疫组织化学来原位(即组织切片)计算TIC频率。
使用上述方法中的任一种，然后可能定量由根据本文教导的公开的Notum调节剂提供的TIC(或其中TPC)的频率的降低。在一些情况下，本发明的化合物可以以10％、15％、20％、25％、30％或者甚至以35％降低TIC频率(通过上面提到的多种机制，包括消除、诱导分化、生态位破坏、沉默等)。在其他实施方案中，TIC频率的降低可以是40％、45％、50％、55％、60％或65％的顺序。在某些实施方案中，公开的化合物可以以70%、75%、80%、85%、90%或者甚至95%降低TIC频率。当然，将被理解的是，TIC频率的任何降低可能导致瘤形成的肿瘤发生性、持续性、复发和侵袭性的相应降低。
IV. Notum 调节剂
在任何情况下，本发明涉及Notum调节剂包括Notum拮抗剂用于诊断、治疗和/或预防多种Notum相关恶性肿瘤中任一种的用途。公开的调节剂可以单独使用，或连同多种抗癌化合物如化疗剂或免疫治疗剂或生物反应修饰剂一起使用。在其他选择的实施方案中，两种或更多种不同Notum调节剂可以组合使用，以提供增强的抗肿瘤效果，或可用于制造多特异性构建体。
在某些实施方案中，本发明的Notum调节剂将包括核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽或多肽。甚至更优选地，调节剂将包括可溶性Notum(sNotum)或其形式、变体、衍生物或片段，包括，例如，Notum融合构建体(例如，Notum-Fc、Notum-靶向部分等)或Notum-缀合物(例如，Notum-PEG、Notum-细胞毒性剂、Notum-brm等)。还将被理解的是，在其他实施方案中，Notum调节剂包括抗体(例如，抗Notum mAbs)或其免疫反应性片段或衍生物。在特别优选的实施方案中，本发明的调节剂将包括中和性抗体或其衍生物或片段。在其他实施方案中，Notum调节剂可以包括内化性抗体。在仍其他实施方案中，Notum调节剂可以包括耗竭性抗体。此外，如同前述融合构建体，这些抗体调节剂可以与选择的细胞毒性剂、聚合物、生物反应修饰剂(BRM)等缀合、连接或以其他方式结合，以提供具有各种(和任选的多种)作用机制的定向免疫疗法。在又其他实施方案中，调节剂可以在基因水平上操作，并且可以包含化合物如反义构建体、siRNA、微小RNA等。
将进一步被理解的是，公开的Notum调节剂可以通过多种机制，包括激动或拮抗选择的通路或消除特定细胞而耗竭或消除或抑制肿瘤细胞、特别是TPC和/或相关的瘤形成的生长、增殖或生存，这取决于，例如，Notum调节剂的形式、任何相关的载荷或给药和递送方法。相应地，尽管本文公开的优选实施方案涉及特定肿瘤细胞亚群如肿瘤永生细胞的耗竭、抑制或沉默，必须强调的是，这样的实施方案仅仅是说明性的，而在任何意义上都不是限制性的。相反，如随附权利要求中所述的，本发明广泛地涉及Notum调节剂及其无论任何特定机制或目标肿瘤细胞群体而在治疗、管理或预防各种Notum介导的过度增生性病症中的用途。
在相同意义上，本发明公开的实施方案包括一种或多种Notum拮抗剂。为此，将被理解的是，本发明的Notum拮抗剂可以包含任何配体、多肽、肽、融合蛋白、抗体或其免疫学活性片段或衍生物，所述配体、多肽、肽、融合蛋白、抗体或其免疫学活性片段或衍生物识别、反应、结合、组合、竞争、结合Notum蛋白或其片段或以其他方式与Notum蛋白或其片段相互作用，并且消除、沉默、降低、抑制、阻碍、束缚或控制肿瘤起始细胞或其他肿瘤细胞包括肿瘤块或NTG细胞的生长。在选择的实施方案中，Notum调节剂包括Notum拮抗剂。
如本文所使用的，拮抗剂是指能够中和、阻断、抑制、废除、降低或干扰特定或指定蛋白的活性的分子，所述活性包括受体与配体的相互作用或酶与底物的相互作用。更一般地，本发明的拮抗剂可以包括抗体和抗原结合片段或其衍生物、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、反义构建体、siRNA、miRNA、生物有机分子、肽模拟物、药物制剂和它们的代谢物、转录和翻译控制序列等。拮抗剂也可以包括小分子抑制剂、融合蛋白、受体分子和特异性结合蛋白从而隔绝其与其底物目标结合的衍生物、蛋白的拮抗剂变体、针对蛋白的反义分子、RNA适配体和针对蛋白的核酶。
如本文所使用并适用于两种或更多种分子或化合物，术语识别或特异性识别应当是指分子的共价或非共价的反应、结合、特异性结合、组合、结合、相互作用、联系、连接、聚结、联合、合并或接合，藉此一种分子对其他分子发挥作用。
此外，如本文的实施例中所示，人Notum的一些调节剂，在某些情况下，可以与来自除人以外的物种(例如，鼠)的Notum交叉反应。在其他情况下，示例性调节剂对于人Notum的一种或多种同种型可以是特异性的，并且将不表现出与来自其他物种的Notum直向同源物的交叉反应性。
在任何情况下，本领域技术人员将理解，可以以缀合或非缀合的形式使用公开的调节剂。换言之，调节剂可以(例如共价或非共价地)与药学活性化合物、生物反应修饰剂、细胞毒性或细胞生长抑制剂、诊断部分或生物相容的修饰剂结合或缀合。在这方面，将被理解的是，这样的缀合物可以包括肽、多肽、蛋白、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子和放射性同位素。此外，如上面所示，根据，至少部分，用于影响缀合的方法，选择的缀合物可以各种摩尔比共价或非共价地连接至Notum调节剂。
V. 抗体
a. 综述
如前面提到的，本发明的特别优选的实施方案包括抗体形式的Notum调节剂。本文中的术语抗体在最广泛的意义上使用，并且特别包括合成抗体、单克隆抗体、寡克隆或多克隆抗体、多克隆抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、灵长化抗体、Fab片段、F(ab’)片段、单链FvFc(scFvFc)、单链Fv(scFv)、抗-独特型(抗-Id)抗体和任何其他免疫活性抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性(即，Notum结合或结合)。在更广泛的意义上，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原结合位点的分子，其中这些片段可能与另一种免疫球蛋白结构域融合或可能不与其融合，所述另一种免疫球蛋白结构域包括但不限于，Fc区或其片段。进一步，如本文中更详细所述的，术语一种抗体和多种抗体具体包括如下所述的Fc变体，包括全长抗体和包含Fc区的变体Fc-融合体，或其片段，其任选地包含至少一个氨基酸残基修饰并且与免疫球蛋白的免疫活性片段融合。
如将在下面更详细讨论的，通用术语抗体或免疫球蛋白包括五种不同类型的抗体，所述抗体可以生物化学上区分，并且根据它们的重链恒定结构域的氨基酸序列，可以容易地被分配至适当的类型。由于历史原因，主要类型的完整抗体被称为IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。根据结构和某些生物化学特性，在人中，IgG和IgA类型可以被进一步分为公认的亚类(同种型)，即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。将被理解的是，在人中的IgG同种型是以它们在血清中的丰度的顺序命名的，其中IgG1是丰度最高的。
尽管所有五种类型的抗体(即IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM)和所有同种型(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2)，以及其变型，在本发明的范围内，用于说明的目的，将仅仅在一些细节中讨论包含IgG类型的免疫球蛋白的优选实施方案。然而，将被理解的是，这样的公开内容仅仅说明实施本发明的示例性组合物和方法，而不是以任何方式限制本发明的范围或随附的权利要求。
在这方面，人IgG免疫球蛋白包含两条相同的分子量约为23,000道尔顿的轻多肽链，和两条相同的取决于同种型的分子量53,000-70,000的重链。对应不同类型抗体的重链恒定结构域分别通过相应的下标希腊字母α、δ、ε、γ、和μ来表示。基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可以被分配为被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种明显不同的类型之一。本领域技术人员将理解，不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
该四条链通过二硫键以Y构型连接，其中所述轻链支持所述重链，其中所述重链从Y的口开始并继续通过可变区到Y的双末端。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而铰链区中的两个二硫键连接重链。各自的重和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥，其数量基于IgG的同种型可能变化。
每条重链在一个末端具有可变区(VH)和随后的多个恒定区。每条轻链在一个末端具有可变结构域(VL)，并且在其另一个末端具有恒定结构域;该轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。在这点上，将被理解的是，轻链(VL)和重链(VH)部分二者的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予和调节重要的生物特性例如分泌、经胎盘迁移、循环半衰期、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们距离抗体的抗原结合位点或氨基末端更远而增加。因此，抗体的氨基或N末端包含可变区而且羧基或C末端包含恒定区。因此，CH3和 CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
术语可变的是指下列事实：免疫球蛋白间的可变结构域的某些部分的序列广泛不同，并且这些热点在很大程度上定义特定抗体的结合和特异性特征。这些高可变位点分别在轻链和重链可变结构域中被称为互补性决定区(CDR)的三个区段中表现自身。CDR侧翼的可变结构域的更高保守部分被称为构架区(FR)。更具体地，在天然存在的单体IgG抗体中，抗体的每个臂上的六个CDR是短的非连续的氨基酸序列，其特异性定位以便当抗体假定其在水性环境中的三维构型时形成抗原结合位点。
包含重和轻链可变结构域的剩余部分的构架区显示更少的分子间的氨基酸序列变异。相反，构架区很大程度上采用β折叠构象而且CDR形成环，所述环连接β折叠结构且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，这些构架区起形成支架的作用，所述支架提供通过链间非共价相互作用而将六个CDR以正确方向定位。由定位的CDR形成的抗原结合位点定义了与免疫活性抗原(即Notum)上的表位互补的表面。该互补的表面促进抗体与免疫活性抗原表位的非共价结合。将被理解的是，本领域普通技术人员可以容易地鉴定CDR的位置。
如下面更详细讨论的，可以使用标准的重组和表达技术重组或工程改造全部或部分重和轻链可变区以提供有效的抗体。换言之，可以将来自第一种抗体的重或轻链可变区(或其任何部分)与来自第二种抗体的重或轻链可变区的任何选择的部分混合和匹配。例如，在一个实施方案中，可以将包含第一种抗体的3个轻链CDR的整个轻链可变区与包含第二种抗体的三个重链CDR的整个重链可变区配对，以提供有效的抗体。此外，在其他实施方案中，可以将源自各种抗体的个别重链和轻链CDR混合和匹配，以提供具有优化特征的期望的抗体。因此，示例性抗体可以包含来自第一种抗体的3个轻链CDR、源自第二种抗体的两个重链CDR和来自第三种抗体的第三重链CDR。
更具体地，本发明的上下文中，将被理解的是，可以根据本教导以这种方式将图7B中的任何公开的重链和轻链CDR进行重排，以提供优化的抗Notum(例如抗Notum)抗体。
在任何情况下，互补决定区残基编号可以如Kabat等人(1991，NIH Publication 91-3242，National Technical Information Service, Springfield, Va.)的那些定义，具体而言，轻链可变结构域中的残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)和重链可变结构域中的31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)。注意抗体与抗体之间差异很大(并且通过定义将无法显示与Kabat共有序列的同源性)。构架残基的最大比对经常需要将间隔区残基插入用于Fv区的编号系统中。此外，任何给定Kabat位点编号处的某些个别残基的身份在抗体链与抗体链之间可能因物种间或等位基因分歧性(allelic divergence)而不同。也参见Chothia等人，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 和MacCallum 等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) ，其中所述定义包括在互相相比较时氨基酸残基的重叠和亚组。前述参考文献中的每一个完整地通过引用并入本文，并且描述了包含如上文引用的各参考文献所定义CDR的氨基酸残基用于比较。
CDR定义
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96
1残基编号遵循同上Kabat等人的命名法
2残基编号遵循同上Chothia等人的命名法
3残基编号遵循同上MacCallum等人的命名法。
为了方便的目的，使用Chothia等人的命名法定义图7B中所述和图31A和31B中加下划线的CDR，尽管鉴于本申请的内容，对于每个各自的重和轻链序列，本领域技术人员可以容易地鉴定并计数如Kabat等人或MacCallum等人定义的CDR。相应地，包含通过这样的命名法定义的CDR的抗体清楚地包括在本发明的范围内。更广泛地，术语可变区CDR氨基酸残基包括如使用如上所述的任何基于序列或结构的方法鉴定的CDR中的氨基酸。
如本文所使用的，术语可变区构架(FR)氨基酸残基是指Ig链的构架区中的那些氨基酸。如本文所使用的，术语构架区或FR区包括是可变区的部分但不是CDR(例如，使用Kabat的CDR定义)的部分的氨基酸残基。因此，可变区构架是长度为约100-120氨基酸的非连续序列，但仅包括CDR之外的那些氨基酸。
对于重链可变区的具体实例和对于Kabat等人定义的CDR，构架区1对应于可变区中涵盖氨基酸1-30的结构域；构架区2对应于可变区中涵盖氨基酸36-49的结构域；构架区3对应于可变区中涵盖氨基酸66-94的结构域，并且构架区4对应于可变区中从氨基酸103到可变区末端的结构域。轻链的构架区类似地被每个轻链可变区CDR分隔。类似地，使用Chothia等人或McCallum等人的CDR定义，构架区边界由如上述的各自CDR末端分隔。
在记住上述结构考虑的情况下，本领域技术人员将理解，本发明的抗体可以包括多种实施方案中的任一种。在这方面，相容抗体可以包括在受试者中提供期望的生理反应的任何免疫反应性抗体(因为在本文中定义了术语)。尽管任何公开的抗体可以与本教导结合使用，但是本发明的某些实施方案将包括嵌合抗体、人源化抗体或人单克隆抗体或其免疫反应性片段。然而，其他实施方案可以，例如，包括同质或异质的多聚体构建体、Fc变体及缀合的或糖基化改变的抗体。此外，将被理解的是，这样的构型不是相互排斥的，并且相容的个别抗体可以包含本文公开的功能方面中的一个或多个。例如，相容抗体可以包括具有人源化可变区的单链双抗体或具有Fc修饰的完全人全长IgG3抗体，所述Fc修饰改变糖基化模式以调节血清半衰期。其他示例性实施方案对本领域技术人员是显而易见的，并且可以容易地被辨别为在本发明的范围内。
b. 抗体生成
如众所周知的，可以接种并使用各种宿主动物，包括兔、小鼠、大鼠等以提供根据本教导的抗体。根据接种的物种，可以用于增加免疫应答的本领域已知佐剂包括但不限于弗氏(完全的和不完全的)、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、多聚阴离子、肽、油乳化液、匙孔傶血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这样的佐剂可以通过在局部沉积中使之隔绝而保护抗原免于迅速扩散，或者它们可以含有刺激宿主分泌对于巨噬细胞趋化的因子和免疫系统的其他组分的物质。优选地，如果施用多肽，免疫时间安排将涉及两次或更多次施用多肽，其分布数周。
用Notum免疫原免疫动物后，可以使用本领域公认的技术从该动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。在一些实施方案中，通过放血或处死动物获得含有多克隆抗Notum抗体的血清。从动物获得的形式的血清可用于研究目的，或者，可替代地，可以部分或完全纯化抗Notum抗体以提供免疫球蛋白级分或均质的抗体制备物。
c. 单克隆抗体
尽管多克隆抗体可以与本发明的某些方面结合使用，优选的实施方案包括Notum反应性单克隆抗体的用途。如本文所使用的，术语单克隆抗体或mAb是指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即除了，可能以小量存在的可能的突变，例如天然产生的突变外，包括该群体的个别抗体是相同的。因此，修饰剂单克隆表明抗体不是不同抗体的混合物的特征，并且可以与任何类型的抗体结合使用。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体包括包含与Notum结合或相关的多肽序列的抗体，其中Notum-结合多肽序列是通过包括从多种多肽序列中选择单一目标结合多肽序列的过程得到的。
在优选的实施方案中，从由免疫的动物分离的细胞制备产生抗体的细胞系。免疫后，处死动物，并且通过本领域众所周知的方式将淋巴结和/或脾B细胞永生化。永生化细胞的方法包括，但不限于，用致癌基因转染它们，用致癌病毒感染它们和在选择永生化细胞的条件下培养它们，使它们经受致癌或突变化合物，将它们与永生化细胞例如骨髓瘤细胞融合，和将肿瘤抑制基因失活。如果使用与骨髓瘤细胞融合，骨髓瘤细胞优选不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞系)。使用Notum或其免疫反应部分筛选永生化细胞。在优选的实施方案中，使用酶联免疫测定法(ELISA)或放射免疫测定法进行初始筛选。
更具体地，可以使用本领域已知的各种各样的技术来制备与本发明一致的不同单克隆抗体，所述技术包括杂交瘤、重组技术、噬菌体展示技术、酵母文库、转基因动物(例如，XenoMouse®或HuMAb Mouse®)或其一些组合。例如，可以使用杂交瘤技术来产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术如上述广泛描述的和在下列中更详细教导的：例如Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版，1988); Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)，其中每一个通过引入并入全文。使用公开的方案，优选通过多次皮下或腹膜内注射相关抗原和佐剂来在哺乳动物中升高抗体。如前面所讨论的，该免疫通常引发这样的免疫应答，其包括从活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应性抗体(如果免疫动物是转基因的，其可以是完全人的)。虽然获得的抗体可从动物血清收集以提供多克隆制备物，但通常更期望从脾脏、淋巴结或外周血分离个别淋巴细胞以提供单克隆抗体的同质制备物。最典型地，从脾脏获得淋巴细胞并且永生化以提供杂交瘤。
例如，如上所述，选择过程可以是从多种克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当被理解的是，选择的Notum结合序列可进一步改变，例如，以改进对目标的亲和力、将目标结合序列人源化、改进其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、生成多特异性抗体等，而且包含改变的目标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其他可能交叉反应的免疫球蛋白的污染。
d. 嵌合抗体
在另一个实施方案中，本发明的抗体可以包含源自共价连接的来自至少两种不同物种或类型抗体的蛋白区段的嵌合抗体。将被理解的是，如本文所使用的，术语嵌合抗体涉及构建体，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的剩余部分与源自另一个物种或属于另一种抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。在一个示例性实施方案中，根据本文教导的嵌合抗体可以包含鼠VH和VL氨基酸序列和源自人来源的恒定区。在其他相容的实施方案中，本发明的嵌合抗体可以包含如下所述的CDR嫁接的或人源化抗体。
通常，制备嵌合抗体的目标是生成其中使来自预期主题物种的氨基酸的数量最大化的嵌合体。一个实例是CDR嫁接的抗体，其中所述抗体包含一个或多个来自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的互补决定区(CDR)，而一条或多条所述抗体链的剩余部分与源自另一个物种或属于另一种抗体类型或亚类的抗体中的相应序列是/是相同或同源。对于在人中的用途，来自啮齿动物抗体的可变区或选择的CDR经常被嫁接进人抗体，取代人抗体的天然存在的可变区或CDR。这些构建体通常具有如下优点：提供完全强度的调节剂功能(例如，CDC、ADCC等)，同时降低受试者针对所述抗体的不需要的免疫应答。
e. 人源化抗体
与CDR嫁接的抗体类似的是人源化抗体。通常，人源化抗体从初始在非人动物中产生的单克隆抗体产生。如本文所使用的，非人(例如鼠)抗体的人源化形式是指包含最少源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体CDR的残基被具有期望特异性、亲和力和/或能力的来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的CDR的残基所代替。
在选择的实施方案中，受体抗体可以包含共有序列。为了生成共有人构架，可以将来自数种人重链或轻链氨基酸序列的构架比对，以鉴定共有氨基酸序列。此外，在许多情况下，人免疫球蛋白的可变结构域中的一个或多个构架残基被来自供体抗体的相应非人残基所代替。使用本领域中众所周知的方法鉴定这些构架取代，例如通过对CDR和构架残基的相互作用进行建模以鉴定对于抗原结合重要的构架残基，并且通过序列对比来鉴定在特定位置的不常见构架残基。这样的取代帮助维持一个或多个嫁接的CDR的适当三维构型，并且相对于没有构架取代的类似构建体经常改善亲和力。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。可以使用众所周知的技术进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。
CDR嫁接和人源化抗体参见，例如，在U.S.P.N. 6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089、和5,530,101。通常，人源化抗体将包含至少一个，通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，所有或基本上所有的构架区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见，例如，Jones等人, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等人, Nature 332:323-329 (1988);和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。还参见，例如 Vaswani和Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle和Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 以及U.S.P.Ns. 6,982,321 和7,087,409。还有另一种方法被称为人源化工程(humaneering)，并且参见，例如，U.S. 2005/0008625。对于本申请的目的，术语人源化抗体将应当清楚地包括没有或具有最少构架取代的CDR嫁接的抗体(即包含一种或多种嫁接的非人CDR的人抗体)。
此外，也可以通过特异性缺失人T细胞表位或通过WO 98/52976和WO 00/34317中公开的方法的去免疫(deimmunization)而修饰非人抗Notum抗体。简而言之，可以关于结合II类MHC的肽分析抗体的重和轻链可变区；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义的)。对于检测潜在的T细胞表位，可以应用被称为肽线程(peptide threading)的计算机建模方法，此外，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述，可以关于VH和VL序列中存在的基序搜索人II类MHC结合肽的数据库。这些基序结合18种主要II类MHC DR同种异型中任一种，并且因此构成潜在的T细胞表位。可以通过取代可变区中的少量氨基酸残基，或通过单一氨基酸取代而消除检测到的潜在T细胞表位。尽可能地进行保守取代。经常，但非排他，可以使用对于人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。鉴定去免疫变化后，可以通过诱变或其他合成方法(例如，从头合成，盒代替，等)构建编码VH和VL的核酸。诱变的可变序列可以，任选地，与人恒定区融合。
在选择的实施方案中，至少60％、65％、70％、75％、或80％的人源化抗体可变区残基将对应于亲本构架区(FR)和CDR序列的那些。在其他实施方案中，至少85％或90％的人源化抗体残基将对应于亲本构架区(FR)和CDR序列的那些。在进一步优选的实施方案中，大于95％的人源化抗体残基将对应于亲本构架区(FR)和CDR序列的那些。
可以使用如本文所述的通常的分子生物学和生物分子工程技术制备人源化抗体。这些方法包括分离、操作和表达编码来自重或轻链中至少一条的免疫球蛋白Fv可变区中的全部或部分的核酸序列。这样的核酸的来源是本领域技术人员众所周知的，例如，可以获得自如上所述的产生针对预定目标的抗体或其免疫反应性片段的杂交瘤、真核细胞或噬菌体，获得自种系免疫球蛋白基因，或获得自合成的构建体。然后可以将编码人源化抗体的重组DNA克隆进适当的表达载体。
人种系序列，例如，公开于Tomlinson, I. A.等人，(1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P.等人，(1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D.等人，(1992) J. Mol. Bio. 227:799-817;和Tomlinson等人，(1995) EMBO J 14:4628-4638。V BASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的全面目录(参见Retter等人, (2005) Nuc Acid Res 33:671-674)。这些序列可以用作人序列的来源，例如，用于构架区和CDR。如本文所述，也可以使用共有人构架区，例如，如U.S.P.N. 6,300,064中所述。
f. 人抗体
除前述抗体以外，本领域技术人员将理解，本发明的抗体可以包含完全人抗体。对于本申请的目的，术语人抗体包含具有与由人产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于制备人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
可以使用本领域中已知的各种技术产生人抗体。如上面所提到的，可以使用噬菌体展示技术以提供根据本教导的免疫活性结合区域。因此，本发明的某些实施方案提供用于产生抗Notum抗体或其抗原结合部分的方法，其包括下述步骤：在噬菌体上合成(优选人)抗体文库，用Notum或其抗体结合部分筛选文库，分离结合Notum的噬菌体，并且由噬菌体获得免疫反应片段。通过实例的方式，用于制备在噬菌体展示技术中使用的抗体文库的一种方法包括下述步骤：用Notum或其抗原性部分免疫包含人或非人免疫球蛋白基因座的非人动物，以产生免疫应答，从免疫的动物中提取抗体生产细胞；从提取的细胞中分离编码本发明抗体的重链和轻链的RNA，将RNA逆转录以产生cDNA，使用引物扩增cDNA，并且将cDNA插入噬菌体展示载体内，从而使得抗体在噬菌体上表达。更具体地，通过PCR将编码VH和VL结构域的DNA与scFV接头一起重组并克隆进噬菌粒载体(如p CANTAB 6或pComb 3HSS)。然后，载体可以电穿孔进入大肠杆菌(E.coli)并用辅助噬菌体感染大肠杆菌。这些方法中所用噬菌体常为丝状噬菌体，包括fd和M13，并且通常将VH和VL结构域与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。
本发明的重组人抗-Notum抗体可以通过上述筛选重组组合抗体文库来分离。在优选的实施方案中，文库是scFv噬菌体展示文库，其使用由B细胞分离的mRNA制备的人VL和VH cDNA来生成。用于制备和筛选这样的文库的方法是本领域众所周知的并且生成噬菌体展示文库的试剂盒是商业上可获得的(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还存在可以用于生成且筛选抗体展示文库的其他方法和试剂(参见，例如，美国专利号5,223,409; PCT 公开号WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs 等人，Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay 等人，Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse 等人，Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty 等人，Nature 348:552-554 (1990); Griffiths 等人， EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins 等人, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson 等人, Nature 352:624-628 (1991); Gram等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad 等人， Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom 等人， Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); 以及 Barbas 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)。
产生自原初(naive)文库(天然或合成的)的抗体可具有中度的亲和力(约106 - 107 M-1的Ka)，但还可如本领域所描述的在体外通过构建并重选择第二文库而模拟亲和力成熟。例如，在Hawkins等人，J. Mol. Biol.，226：889-896(1992)的方法中或在Gram等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89：3576-3580(1992)的方法中，通过使用易错聚合酶(报道于Leung等人，Technique，1：11-15(1989)中)可在体外随机引入突变。此外，如在选择的个别Fv克隆及筛选更高亲和力的克隆中，例如，利用具有携带跨越目的CDR的随机序列的引物的PCR，可通过随机突变一个或多个CDR进行亲和力成熟。WO 9607754描述了一种用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以生成轻链基因文库的方法。另一种有效的方法是如Marks等人，Biotechnol.，10：779-783(1992)中所描述的，重组通过使用获得自未免疫的供体的天然存在的V结构域变体所有组成成分通过噬菌体展示选择的VH或VL结构域，并在几轮链重改组中筛选更高亲和力。该技术允许产生具有10-9 M或更少的解离常数Kd(koff/kon)的抗体和抗体片段。
将进一步理解的是，可以使用包含在其表面上表达结合对的真核细胞(例如，酵母)的文库而采用类似的程序。至于噬菌体展示技术，针对目的抗原(即，Notum)筛选真核文库，并且分离并克隆表达候选结合对的细胞。可以采取步骤来优化文库含量并用于反应结合对的亲和力成熟。参见，例如，U.S.P.N. 7,700,302和U.S.S.N. 12/404,059。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人Nature Biotechnology 14:309-314(1996) :Sheets 等人Proc. Natl. Acad. Sci. 95 :6157-6162 (1998)) ；Hoogenboom和 Winter，J. Mol.Biol. ,227 ：381(1991) ；Marks 等人，J. Mol. Biol.，222 :581 (1991))。在其他实施方案中，可以从真核细胞如酵母生成的组合抗体文库分离人结合对。参见，例如，U.S.P.N. 7,700,302。这样的技术有利地允许筛选大量的候选调节剂，并提供候选序列的相对容易的操作(例如，通过亲和力成熟或重组改组)。
也可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如小鼠来制备人抗体，在所述转基因动物中内源免疫球蛋白基因已被部分或全部失活。在攻击后，观察到人抗体的产生，其在所有方面非常类似于在人中观察到的，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分。该方法参见，例如U.S.P.Ns. 5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和美国专利号 6,075,181 和 6,150,584，关于Xenomouse®技术，连同以下科学出版物：Marks 等人，Bio/Tcchnology 10:779-783(1992) ;Lonbcrg 等人，Nature 368:856-859(1994)；Morrison, Nature 368:812-13(1994) ；Fishwild 等人，Nature Biotechnology 14: 845-51(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996) ；Lonberg 和 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 ：65-93 (1995)。可替代地，可经由永生化产生针对目标抗原的抗体的人B淋巴细胞(这样的B淋巴细胞可以从患有肿瘤病症的个体中回收，或可以已经在体外被免疫)制备人抗体。参见，例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77页 (1985)；Boerner 等人，J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991)；和美国专利号 5,750,373。
VI. 抗体特征
不管如何获得或抗体调节剂采用上述形式中的何种(例如，人源化、人等)，公开的调节剂的优选实施方案可以显示各种特性。在这方面，可以关于期望特性包括，例如，强有力的生长、高抗体产生和如下面更详细讨论的期望的抗体特征选择、克隆和进一步筛选产生抗Notum抗体的细胞(例如，杂交瘤或酵母集落)。可以体内在同系动物中，在缺乏免疫系统的动物，例如，裸鼠，或体外在细胞培养中扩增杂交瘤。选择、克隆和扩增杂交瘤和/或集落的方法(其中每个产生不同的抗体种类)是本领域普通技术人员众所周知的。
a. 中和性抗体
在特别优选的实施方案中，本发明的调节剂将包括中和性抗体或其衍生物或片段。术语中和性抗体或中和性拮抗剂是指下列抗体或拮抗剂：其与配体或酶结合或相互作用，防止配体或酶与其结合伴侣或底物结合，并且中断否则由两种分子的相互作用导致的生物反应。在评价抗体或其免疫功能性片段或衍生物的结合和特异性中，当过量抗体以至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多(如体外竞争结合测定如本文实施例中所述的TCF测定中所测量的)降低结合至目标分子的结合伴侣的量时，抗体或片段将实质上抑制配体或酶与其结合伴侣或底物的结合。在针对Notum的抗体的情况下，中和性抗体或拮抗剂将以至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多减少Notum裂解GPI的能力，并且从而降低游离磷脂酰肌醇聚糖的浓度。将被理解的是，可以直接使用本领域公认的技术测量，或者通过这样的降低将对Notum相关通路如Wnt、Hh或BMP具有的影响测量这种磷脂酰肌醇聚糖的减少的浓度。
b. 内化性抗体
尽管证据表明Notum可以由细胞分泌，但是至少一些Notum仍然可能保持与细胞表面结合，从而允许公开的调节剂的内化。相应地，抗Notum抗体可以，至少在一些程度上，由表达Notum的细胞所内化。例如，结合至肿瘤起始细胞的表面上的Notum的抗Notum抗体可以被肿瘤起始细胞所内化。在特别优选的实施方案中，这样的抗Notum抗体可以与内化后杀死细胞的细胞毒性部分结合或缀合。
如本文所使用的，内化的抗Notum抗体是在与哺乳动物细胞相关的Notum结合后被细胞所摄取的抗体。内化性抗体包括抗体片段、人或人源化抗体和抗体缀合物。内化可以在体外或体内发生。对于治疗应用，内化可以在体内发生。内化的抗体分子的数量对于杀死表达Notum的细胞，特别是表达Notum的肿瘤起始细胞可以是足够的或充分的。根据抗体或抗体缀合物的效力，在一些情况下，单一抗体分子摄取进入细胞对于杀死该抗体结合的目标细胞是足够的。例如，某些毒素在杀死中是高效的，使得一个与抗体缀合的毒素分子的内化对于杀死肿瘤细胞是足够的。可以通过各种测定包括下面实施例中所述的那些来确定抗Notum抗体在结合哺乳动物细胞上的Notum后是否内化。检测抗体是否内化进细胞的方法描述于U.S.P.N. 7,619,068，其完整地通过引用并入本文。
c. 耗竭性抗体
在其他优选的实施方案中，本发明的调节剂将包括耗竭性抗体或其衍生物或片段。术语耗竭性抗体是指下列抗体或片段：所述抗体或片段结合细胞表面上或附近的Notum或与细胞表面上或附近的Notum相关，促进或引起细胞的死亡或消除(例如，通过补体依赖的细胞毒性或抗体依赖的细胞的细胞毒性)。在下面更充分讨论的一些实施方案中，选择的耗竭性抗体将与细胞毒性剂相关或缀合。优选地，耗竭性抗体将能够去除、消除或杀死确定的细胞群体中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％的肿瘤永生细胞。在一些实施方案中，细胞群体可以包括富集的、分隔的、纯化的或分离的肿瘤永生细胞。在其他实施方案中，细胞群体可以包括整个肿瘤样品或包含肿瘤永生细胞的异质肿瘤提取物。本领域技术人员将理解，在下面实施例中所述的标准生化技术可用于根据本文的教导监测和定量肿瘤永生细胞的耗竭。
d. 表位结合
将被进一步理解的是，公开的抗Notum抗体将与一种或多种选择的目标呈递的离散表位或决定簇相关或结合。如本文所使用的，术语表位是指能够被特定抗体识别并特异性结合的目标抗原的部分。当抗原是多肽如Notum时，表位可以由连续氨基酸和通过蛋白的三级折叠并列的不连续氨基酸形成。从连续氨基酸形成的表位通常在蛋白变性后保留，而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白变性后丢失。表位通常包括在独特空间构象中的至少3个，和更通常，至少5个或8-10个氨基酸。更具体地，本领域技术人员将理解，术语表位包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白决定簇。表位决定簇一般由分子的化学活性表面组群如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成，并且通常具有特定三维结构特征，以及特定电荷特征。此外，表位可以是线性的或构象的。在线性表位中，蛋白和相互作用的分子(如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用点在蛋白上的氨基酸残基间出现，其线性地彼此分隔。
一旦确定抗原上期望的表位，可能，例如，使用本发明中所述的技术生成针对该表位的抗体。可替代地，在发现过程期间，抗体的生成和表征可以阐明关于期望表位的信息。从这些信息，然后可能关于与相同的表位的结合竞争性筛选抗体。实现这一点的方法是进行竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即抗体竞争与抗原的结合。用于基于其交叉竞争分级抗体的高通量方法描述于WO 03/48731。
如本文所使用的，术语分级是指基于它们的抗原结合特征将抗体分组的方法。分级的分配是有点任意的，取决于观察到的测试抗体的结合模式如何不同。因此，尽管该技术是用于对本发明的抗体分类的有用工具，但是分级并不总是与表位直接相关，并且这样的初始测定应当通过其他本领域公认的方法进一步验证。
因为这种告诫，可以通过使用本领域中已知并且在本文的实施例中所述的方法确定选择的初始抗体(或其片段)是否与第二种抗体结合相同的表位或交叉竞争与第二种抗体的结合。在一个实施方案中，将本发明的初始抗体在饱和条件下结合至Notum，然后测量第二种抗体结合至Notum的能力。如果测试抗体能够与初始抗Notum抗体同时结合至Notum，那么第二种抗体结合至不同于初始抗体的表位。然而，如果第二种抗体不能同时结合至Notum，那么第二种抗体结合相同的表位、重叠表位、或与初始抗体结合的表位紧密邻近的表位。如本领域中已知并且在下面实施例中详述的，可以使用固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)、夹心竞争测定、Biacore™系统(即，表面等离子体共振 - GE Healthcare)、ForteBio®分析仪(即，生物层干涉法 - ForteBio, Inc.)或流式细胞术方法获得期望的数据。如本文所使用的，术语表面等离子体共振是指一种光学现象，其允许通过检测生物传感器基质内蛋白浓度的变化分析实时生物特异性相互作用。在特别优选的实施方案中，使用如下面实施例中所示的Biacore或ForteBio仪器进行分析。
当在竞争相同表位的抗体的上下文中使用时，术语竞争是指通过测定来确定抗体之间的竞争，其中测试下的抗体或免疫功能性片段防止或抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。通常，这样的测定涉及使用结合至固体表面或具有这些未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白中任一种的细胞的纯化的抗原。通过确定在测试免疫球蛋白存在的情况下结合至固体表面或细胞的标记量而测量竞争性抑制。一般测试免疫球蛋白以过量存在。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体，和结合邻近表位的抗体，所述邻近表位与参考抗体结合的表位足够靠近足以发生空间位阻。关于用于确定竞争性结合的方法的其他细节在本文的实施例中提供。通常，当竞争抗体以过量存在时，它将以至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％、或97％或更多。
除表位特异性以外，可以使用许多不同的物理特性，包括，例如，结合亲和力、熔化温度(Tm)和等电点来表征公开的抗体。
e. 结合亲和力
在这方面，本发明进一步包括对Notum具有高结合亲和力的抗体的用途。当解离常数Kd (koff/kon)为≤ 10-8M时，本发明的抗体被称为特异性结合其目标抗原。当Kd为≤ 5x10-9M时，抗体以高亲和力特异性结合抗原，并且当Kd为≤ 5x10-10M时，抗体以非常高亲和力特异性结合抗原。在本发明的一个实施方案中，抗体具有≤ 10-9M的Kd和约1x10-4/sec的解离速率。在本发明的一个实施方案中，解离速率为< 1x10-5/sec。在本发明的其他实施方案中，抗体将以约10-8M至10-10M之间的Kd结合至Notum，并且在又另一个实施方案中，它将以Kd ≤ 2x10-10M结合。本发明的仍其他选择的实施方案包括具有下列解离常数或Kd (koff/kon)值的抗体：小于10-2M、小于5x10-2M、小于10-3M、小于5x10-3M、小于10-4M、小于5x10-4M、小于10-5M、小于5x10-5M、小于10-6M、小于5x10-6M、小于10-7M、小于5x10-7M、小于10-8M、小于5x10-8M、小于10-9M、小于5x10-9M、小于10-10M、小于5x10-10M、小于10-11M、小于5x10-11M、小于10-12M、小于5x10-12M、小于10-13M、小于5x10-13M、小于10-14M、小于5x10-14M、小于10-15M或小于5x10-15M。
在特定实施方案中，本发明的免疫特异性结合Notum的抗体具有下列结合速率常数或kon 速率(Notum (Ab) + 抗原(Ag)k on←Ab-Ag)：至少105M-ls-l、至少2x105M-ls-l、至少5x105M-ls-l、至少106M-ls-l、至少5x106M-ls-l、至少107M-ls-l、至少5x107M-ls-l、或至少108M-ls-l。
在另一个实施方案中，本发明的免疫特异性结合Notum的抗体具有下列koff 速率(Notum (Ab) + 抗原(Ag)k off←Ab-Ag)：小于l0-ls- l、小于5xl0-ls- l、小于l0-2s- l、小于5xl0-2s- l、小于l0-3s- l、小于5xl0-3s- l、小于l0-4s- l、小于5xl0-4s- l、小于l0-5s- l、小于5xl0-5s- l、小于l0-6s- l、小于5xl0-6s- l 小于l0-7s- l、小于5xl0-7s- l、小于l0-8s- l、小于5xl0-8s- l、小于l0-9s- l、小于5xl0-9s- l或小于l0-10s- l。
本发明的其他选择的实施方案中，抗Notum抗体将具有下列亲和力常数或Ka (kon/koff)：至少102M-1、至少5x102M-1、至少103M-1、至少5x103M-1、至少104M-1、至少5x104M-1、至少105M-1、至少5x105M-1、至少106M-1、至少5x106M-1、至少107M-1、至少5x107M-1、至少108M-1、至少5x108M-1、至少109M-1、至少5x109M-1、至少1010M-1、至少5x1010M-1、至少1011M-1、至少5x1011M-1、至少1012M-1、至少5x1012M-1、至少1013M-1、至少5x1013M-1、至少1014M-1、至少5x1014M-1、至少1015M-1或至少5x1015M-1。
f. 等电点
除上述结合特性以外，抗Notum抗体和它们的片段，像所有多肽一样具有等电点(pI)，其通常定义为多肽不携带净电荷时的pH。本领域已知，当溶液的pH等于蛋白的等电点(pI)时蛋白质的溶解度通常最低。因此，可能通过改变抗体中可电离残基的数目和位置以调节pI来优化溶解性。例如，可通过进行适当的氨基酸取代(例如，通过用带电荷的氨基酸，如赖氨酸取代不带电荷的残基，如丙氨酸)来操作多肽的pI。不希望受任何特定理论所束缚，导致所述抗体pI改变的抗体氨基酸取代可改善该抗体的溶解性和/或稳定性。本领域技术人员可以理解哪种氨基酸取代对于具体抗体实现期望pI是最适当的。
可以通过各种方法，包括但不限于：等电聚焦和各种计算机算法(参见，例如Bjellqvist等人，1993，Electrophoresis，14：1023)测定蛋白的pI。在一个实施方案中，本发明的抗Notum抗体的pI高于约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、或约9.0。在另一个实施方案中，本发明的抗Notum抗体的pI高于6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0。在又另一个实施方案中，导致本发明抗体的pI改变的取代将不会显著降低其对Notum的结合亲和力。如下面更详细讨论的，特别考虑导致与FcγR的结合改变的Fc区的一个或多个取代也可以导致pI的变化。在一个优选的实施方案中，特异性选择Fc区的一个或多个取代以影响FcγR结合中期望的改变和pI的任何期望的变化。如本文所使用的，pI值定义为主要电荷形式的pI。
g. 热稳定性
将进一步被理解的是，抗体Fab结构域的Tm可以是抗体热稳定性的良好指标，还提供了其保存期限的指标。Tm仅仅是对于给定结构域或序列50％解折叠的温度。Tm较低表明更多聚集/更低的稳定性，而Tm较高表明更少聚集/更高的稳定性。因此，优选具有更高Tm的抗体或片段或衍生物。此外，使用本领域公认的技术，可能改变抗Notum抗体或其结构域的组成以增加或优化分子稳定性。参见，例如，U.S.P.N. 7,960,142。因此，在一个实施方案中，选择的抗体的Fab结构域的Tm值高于至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃或120℃。在另一个实施方案中，抗体的Fab结构域的Tm值高于至少约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、约105℃、约110℃、约115℃或约120℃。可以使用本领域已知的任何标准方法，例如通过示差扫描量热法测量蛋白结构域(例如，Fab结构域)的热熔解温度(Tm)(参见，例如Vermeer等人，2000，Biophys.J.，78：394-404；Vermeer等人，2000，Biophys.J.，79：2150-2154，两者都通过引用并入本文)。
VII. Notum 调节剂片段和衍生物
无论本发明的试剂是否包含完整的融合构建体、抗体、片段或衍生物，选择的调节剂将与Notum反应、结合、组合、复合、连接、结合、连接、相互作用或以其他方式与Notum结合，从而提供期望的抗肿瘤效果。本领域技术人员将理解，包含抗Notum抗体的调节剂通过抗体上表达的一个或多个结合位点与Notum相互作用或结合。更具体地，如本文所使用的，术语结合位点包含负责与目的目标分子(例如，酶、抗原、配体、受体、底物或抑制剂)选择性结合的多肽区域。结合结构域包含至少一个结合位点(例如，完整IgG抗体将具有两个结合结构域和两个结合位点)。示例性结合结构域包括抗体可变结构域、配体的受体结合结构域、受体的配体-结合结构域或酶结构域。对于本发明的目的，Notum的酶活性区域(例如，作为Fc-notum融合构建体的部分)可以包含对于底物(例如，磷脂酰肌醇聚糖)的结合位点。
a. 片段
无论选择调节剂的何种形式(例如，嵌合的、人源化的、等)来实施本发明，将被理解的是，可以根据本文教导使用其免疫反应片段。在最广泛的意义上，术语抗体片段包含完整抗体的至少一部分(例如，天然存在的免疫球蛋白)。更具体地，术语片段是指抗体或抗体链(或在Fc融合体的情况下的Notum分子)的一部分或部分，其包含比整个或完整抗体或抗体链更少的氨基酸残基。术语抗原结合片段是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，该片段结合抗原或与完整抗体(即与它们来源的整个抗体)竞争结合抗原(即，特异性结合)。如本文所使用的，术语抗体分子的片段包括抗体的抗原结合片段，例如，抗体轻链(VL)、抗体重链(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab’)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。类似地，Notum的酶活性片段包含Notum分子的保留其与Notum底物相互作用并以类似于完整Notum(虽然可能具有稍微更低的效率)的方式修饰它们(例如，修剪它们)的部分。
本领域技术人员将理解，可以经由化学或酶处理整个或完整的调节剂(例如，抗体或抗体链)或通过重组方法获得片段。在这方面，尽管在整个抗体的消化方面定义了各种抗体片段，技术人员将理解，这样的片段可以化学地或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所使用的，术语抗体明确包括通过修饰整个抗体产生或使用重组DNA方法从头合成抗体或其片段或衍生物。
更具体地，用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，各自具有单一抗原结合位点，及剩余的Fc片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段通过在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基、包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸而不同于Fab片段。Fab′-SH是本文中对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有至少一个游离硫醇基的Fab′的指代。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的Fab′片段对产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。对于其他抗体片段的更详细描述，参见，例如，Fundamental Immunology, W. E. Paul, 编, Raven Press, N.Y. (1999)。
将进一步理解的是，Fv片段是包含完全抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。这个区由一个重链和一个轻链可变区紧密结合的二聚体组成，其本质上可以是共价的，例如在scFv中。在该构型中，每个可变区的三个CDR相互作用以定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总之，六个CDR及其亚组为抗体赋予抗原结合特异性。然而，甚至单一可变结构域(或只包含对抗原特异的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常亲和力低于整个结合位点。
在其他实施方案中，抗体片段，例如是包含Fc区的抗体片段，保留与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一种生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个与Fc序列相连的抗原结合臂，其能够为该片段赋予体内稳定性。
b. 衍生物
在另一个实施方案中，将进一步理解的是，本发明的调节剂可以是单价或多价的(例如，二价、三价、等)。如本文所使用的，术语价是指与抗体结合的潜在目标(即，Notum)结合位点的数量。每个目标结合位点特异性结合一个目标分子或目标分子上的特定位置或部位。当本发明的抗体包含多于一个目标结合位点(多价)时，每个目标结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如，可以结合不同的配体或不同的抗原，或在相同抗原上的不同的表位或位置)。对于本发明的目的，主题抗体将优选具有至少一个对于人Notum特异性的结合位点。在一个实施方案中，本发明的抗体将是单价的，因为分子的每个结合位点将特异性结合单一的Notum位置或表位。在其他实施方案中，抗体将是多价的，因为它们包含多于一个结合位点，并且不同的结合位点与多于一个单一位置或表位特异性结合。在这样的情况下，多个表位可以存在于选择的Notum多肽上，或单一表位可以存在于Notum上，而第二个不同的表位可以存在于另一种分子或表面上。参见，例如，U.S.P.N. 2009/0130105。
正如上面提到的，多价抗体可免疫特异性结合于期望目标分子的不同表位，或者可免疫特异性结合于目标分子以及异源表位，如异源多肽或固体支持物。尽管抗Notum抗体的优选实施方案仅结合两种抗原(即双特异性抗体)，但具有额外特异性的抗体如三特异性抗体也包括在本发明之内。双特异性抗体的实例包括但不限于那些一个臂针对Notum而另一个臂针对任何其他抗原(例如，调节剂细胞标记)的抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产是基于两对免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等人，1983，Nature，305：537-539)。其他更复杂的相容的多特异性构建体及其制备方法参见U.S.P.N. 2009/0155255。
在又其他实施方案中，将具有期望结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选与包含至少部分绞链区、CH2区和/或CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。一个实例中，在至少一种融合体中存在含有对于轻链结合必需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合体和如果需要的免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在构建中使用不等比例的三种多肽链提供最佳产量的实施方案中，这样为调节三种多肽片段的相互比例提供了极大灵活性。然而，当以相等比例表达至少两条多肽链导致高产量或者当该比例不是特别重要时，也可能将两条或所有三条多肽链的编码序列插入一种表达载体。
在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链(例如，Notum)和另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。发现这种不对称结构有助于将期望的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合分离，因为只在该双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了方便的分离方法。该方法参见WO 94/04690。产生双特异性抗体的其他细节可参见，例如Suresh等人，1986， Methods in Enzymology，121：210。根据WO96/27011所述的另一种方法，可以工程改造一对抗体分子以最大限度提高从重组细胞培养物中回收异源二聚体(heterodimer)的百分比。优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在此方法中，用更大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)代替第一种抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用更小氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)代替大氨基酸侧链在第二种抗体分子的界面上产生与一条或多条大侧链大小相同或相似的补偿性腔。这提供了增加异源二聚体产率超过不需要的最终产物如同源二聚体(homodimer)的机制。
双特异性抗体也包括交联的或异源偶联物(heteroconjugate)抗体。例如，该异源偶联物中的一种抗体可以与亲和素偶联，另一种抗体与生物素偶联。已经提出，例如这种抗体可以将免疫系统细胞靶向至不需要的细胞(美国专利号4,676,980)并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以采用任何常规的交联方法制备异源偶联物抗体。合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，参见美国专利号4,676,980。
VIII. Notum 调节剂 - 恒定区修饰
a. Fc 区和 Fc 受体
除上述对公开的调节剂的可变或结合区的各种修饰、取代、添加或缺失(例如，Fc-Notum或抗Notum抗体)以外，本领域技术人员将理解，本发明的选择的实施方案还可以包含恒定区(即Fc区)的取代或修饰。更具体地，考虑本发明的Notum调节剂可以尤其含有一种或多种额外的氨基酸残基取代、突变和/或修饰，其导致具有优选特征的化合物，所述特征包括但不限于：改变的药代动力学、增加血清半衰期、增加结合亲和力、降低的免疫原性、增加的产量、改变的Fc配体结合、增强或降低的ADCC和CDC活性、改变的糖基化和/或二硫键和修饰的结合特异性。在这方面，将被理解的是，这些Fc变体可以有利地用于增强公开的调节剂的有效抗肿瘤特性。
术语Fc区在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位的氨基酸残基，或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以被除去，例如，在生产或纯化抗体的过程中，或通过重组工程改造编码抗体的重链的核酸。相应地，完整抗体的组合物可以包含所有K447残基被除去的抗体群体、没有K447残基被除去的抗体群体、和具有有和没有K447残基的抗体的混合物的抗体群体。功能性Fc区具有天然序列Fc区的效应物功能。示例性效应物功能包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；细胞吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。这样的效应物功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以利用多种公开的测定，例如，本文中所定义的，对其所述效应物功能进行评价。
Fc受体或FcR描述了结合抗体的Fc区的受体。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、Fc.RII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和可替代地这些受体的剪接形式。FcγII受体包括FcγRIIA(活化受体)和FcγRIIB(抑制受体)，它们具有相似的氨基酸序列，主要不同之处在于其细胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见，例如，Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。FcR 综述参见，例如， Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel 等人， Immunomethods 4: 25-34 (1994);和 de Haas 等人，J. Lab. Clin. Med.126: 330-41 (1995)。其他FcR，包括将来鉴定的那些，包括在本文术语FcR之内。术语Fc受体或FcR也包括新生受体FcRn，在某些情况下，其负责将母体IgGs转移给胎儿(Guyer等人，J. Immunol. 117: 587 (1976)和 Kim 等人，J. Immunol. 24: 249 (1994))和调节免疫球蛋白的内稳态。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie和Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie 等人， Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton 等人， J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton 等人)。
b. Fc 功能
如本文所使用的，补体依赖性细胞毒性和CDC是指在补体存在下裂解目标细胞的能力。补体系统的第一成分(Clq)对与同源抗原复合的分子(例如抗体)的结合起始补体活化通路。为了评价补体活化，可以进行CDC测定法，例如参见Gazzano-Santoro等人，1996，J.Immunol.Methods 202：163。
进一步，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC是指细胞毒性形式，其中分泌的Ig与特定细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使这些细胞毒性效应细胞特异性结合具有抗原的目标细胞并随后用细胞毒素杀死目标细胞。针对目标的特异性的高亲和力IgG抗体武装了细胞毒性细胞，并且对于这种杀死是绝对需要的。目标细胞的裂解是细胞外的，需要直接的细胞-细胞接触，并且不涉及补体。
具有改变的FcR结合亲和力或ADCC活性的Notum调节剂变体是与亲本或未修饰的抗体相比或与包含天然序列Fc区的调节剂相比具有增强或减弱的FcR结合活性和/或ADCC活性的变体。显示与FcR结合增加的调节剂变体以比亲本或未修饰的抗体或包含天然序列Fc区的调节剂更好的亲和力结合至少一种FcR。显示与FcR结合减少的变体以比亲本或未修饰的抗体或包含天然序列Fc区的调节剂更差的亲和力结合至少一种FcR。例如，如本领域中众所周知的技术所确定的，与天然序列IgG Fc区相比，显示与FcR结合下降的这样的变体可能具有很少或没有与FcR的明显结合，例如，0-20％的与FcR的结合。
至于FcRn，本发明的抗体还包含或涵盖具有对恒定区的修饰的Fc变体，其提供在哺乳动物、优选人中的下列半衰期(例如，血清半衰期)：大于5天、大于10天、大于15天、优选大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月​​、大于3个月、大于4个月、或大于5个月。本发明的抗体(或含有Fc的分子)在哺乳动物、优选中人增加的半衰期导致所述抗体或抗体片段在哺乳动物中更高的血清滴度，并且因此，降低所述抗体或抗体片段的施用频率，和/或降低待施用的所述抗体或抗体片段的浓度。可以通过本领域技术人员已知的技术生成具有增加的体内半衰期的抗体。例如，可以通过修饰(例如，取代、缺失或添加)被鉴定为参与Fc结构域和FcRn受体之间相互作用的氨基酸残基而生成具有增加的体内半衰期的抗体(参见，例如，国际公开号WO 97/34631; WO 04/029207; U.S.P.N. 6,737,056和U.S.P.N. 2003/0190311。可以在例如表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或已对其施用了具有变体Fc区的多肽的灵长类中测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期。WO 2000/42072描述了具有与FcR的改进的或减弱的结合的抗体变体。还参见，例如Shields 等人， J. Biol. Chem. 9 (2) ：6591-6604 (2001)。
c. 糖基化修饰
在仍其他实施方案中，本发明的抗体的糖基化模式或组成是修饰的。更具体地，本发明的优选实施方案可以包含一种或多种工程改造的糖形式，即，与含有Fc区的分子共价连接的改变的糖基化模式或改变的碳水化合物组成。工程改造的糖形式可以用于多种目的，包括但不限于提高或降低效应物功能，增加抗体对于目标抗原的亲和力或促进抗体的生产。在其中期望降低的效应物功能的情况下，将被理解的是，可以将分子工程改造以便以未糖基化的形式表达。这样的碳水化合物修饰可以伴有，例如抗体序列中一个或多个糖基化位点的改变。换言之，可以进行一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代导致消除一个或多个可变区构架的糖基化位点从而消除该位点的糖基化(参见，例如美国专利号5,714,350和6,350,861。相反，可以通过在一个或多个额外的糖基化位点中工程改造而将增强的效应物功能或改进的结合赋予含有Fc的分子。
此外或者可替代地，可以制备Fc变体，所述Fc变体具有改变的糖基化组成，如具有降低量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体或具有增加的双分GlcNAc结构的抗体。已经证明这些和类似改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如，通过使用工程改造的或变体表达菌株，通过与一种或多种酶(例如N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTI11))共表达，通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子，或通过在已经表达包含Fc区的分子后修饰一种或多种碳水化合物而生成工程改造的糖形式。参见，例如Shields，R.L.等人，(2002)，J.Biol.Chem.，277：26733-26740；Umana等人，(1999)，Nat.Biotech.，17：176-1，以及欧洲专利号EP 1,176,195；PCT 公开WO 03/035835；WO 99/54342，Umana等人, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies等人, 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields等人, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa等人, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) U.S.P.N. 6,602,684; U.S.S.Ns. 10/277,370; 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; PotillegentTM技术(Biowa, Inc.); GlycoMAbTM 糖基化工程改造技术(GLYCART生物技术AG); WO 00061739; EA01229125; U.S.P.N. 2003/0115614; Okazaki等人., 2004, JMB, 336: 1239-49。
IX. 调节剂表达
a. 概述
可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码期望Notum调节剂的DNA。如果调节剂是抗体，分离和亚克隆的杂交瘤细胞(或噬菌体或酵母来源的集落)可以充当这样的DNA的优选来源。如果需要，可以如本文所述进一步操作核酸以生成试剂，包括融合蛋白、或嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。更具体地，可以如U.S.P.N. 7,709,611中所述使用分离的DNA(其可被修饰)以克隆用于制备抗体的恒定和可变区序列。
该示例性方法需要从选择的细胞提取RNA、转化为cDNA，并使用抗体特异性引物通过PCR扩增。合适的引物是本领域众所周知的，如本文所例举的，可以容易地从多种商业来源获得的。将被理解的是，为了表达通过筛选组合文库分离的重组的人或非人抗体，将编码抗体的DNA克隆进重组表达载体中，并引入宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中。在又其他实施方案中，将调节剂引入下列细胞并由下列细胞表达：猴COS细胞、NS0细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，所述细胞否则不产生期望的构建体。如下面将更详细地讨论的，表达期望的调节剂的转化的细胞可以以相对大量生长以提供融合构建体或免疫球蛋白的临床和商业供应。
编码Notum调节剂的期望部分的核酸是否获得自或源自噬菌体展示技术、酵母文库、基于杂交瘤的技术、合成或商业来源，将被理解的是，本发明明确地包括编码Notum调节剂的核酸分子和序列，所述Notum调节剂包括融合蛋白和抗Notum抗体或其抗原结合片段或衍生物。本发明进一步包括核酸或核酸分子(例如，多核苷酸)，所述核酸或核酸分子在高严谨下，或可替代地在中等或更低严谨杂交条件(例如，如下文定义)下与多核苷酸杂交，所述多核苷酸与具有编码本发明的调节剂或其片段或变体的多核苷酸序列的核酸互补。如本文所使用的，术语核酸分子或分离的核酸分子意在包括至少DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链DNA。此外，本发明包括引入编码这样的调节剂的多核苷酸的任何媒介物或构建体，包括，但不限于，载体、质粒、宿主细胞、粘粒或病毒构建体。
术语分离的核酸是指，该核酸是(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过切割和凝胶电泳分级分离，或(iv)合成的，例如通过化学合成。分离的核酸是对于通过重组DNA技术的操作是可获得的核酸。
更具体地，还提供了编码调节剂、包括本发明抗体的一条或两条链、或其片段、衍生物、突变蛋白、或变体的核酸，足以用作杂交探针的多核苷酸，用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物，用于抑制多核苷酸表达的反义核酸，和前述的互补序列。核酸可以是任何长度。它们可以是，例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000或更多核苷酸长度，和/或可以包含一个或多个额外的序列，例如，调控序列，和/或是更大核酸，例如，载体的部分。这些核酸可以是单链或双链的，并且可以包括RNA和/或DNA核苷酸，和其人工变体(例如，肽核酸)。已经优选如上所述分离编码本发明的调节剂、包括抗体或其免疫反应片段或衍生物的核酸。
b. 杂交和同一性
如所示，本发明进一步提供了在特定杂交条件下与其他核酸杂交的核酸。用于杂交核酸的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6。对于本申请的目的，中等严谨杂交条件使用含有5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)的预洗涤溶液，约50%甲酰胺、6xSSC的杂交缓冲液和55℃的杂交温度(或其他类似杂交溶液，如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，42℃的杂交温度)，和0.5xSSC、0.1% SDS中60℃的洗涤条件。严谨杂交条件在45℃在6xSSC中杂交，随后为在68℃在0.1xSSC, 0.2% SDS中的一次或多次洗涤。此外，本领域技术人员可以操作杂交和/或洗涤条件，以增加或减少杂交的严谨性，使得包含彼此至少65、70、75、80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列的核酸通常彼此保持杂交。更一般地，对于本公开的目的，关于核酸序列的术语基本上相同的可以被解释为表现出与参考核酸序列的至少约85％、或90％、或95％、或97％序列同一性的核苷酸序列。
影响杂交条件选择的基本参数和对于制定合适条件的指导参见，例如，Sambrook, Fritsch,和Maniatis (1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 第9和11章；和Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel等人, 编, John Wiley & Sons, Inc., 2.10和6.3-6.4部分)，并且可以容易地由本领域普通技术人员基于，例如，核酸的长度和/或碱基组成而确定。
将被进一步理解的是，根据本发明，核酸可以单独存在或与其他同源或异源的核酸组合存在。在优选的实施方案中，核酸功能性连接于表达控制序列，所述表达控制序列关于所述核酸可以是同源或异源的。在该上下文中，术语同源的是指天然地核酸还功能性连接于表达控制序列，并且术语异源的是指天然地核酸没有功能性连接于表达控制序列。
c. 表达
核酸，如表达RNA和/或蛋白或肽的核酸，和表达控制序列，彼此功能性连接，如果它们以一定方式彼此共价连接，所述方式使得所述核酸的表达或转录在所述表达控制序列的控制下或影响下。如果核酸被翻译成功能蛋白，那么，具有与编码序列功能性连接的表达控制序列，所述表达控制序列的诱导导致所述核酸的转录，而不引起编码序列的读框偏移或所述编码序列不能够被翻译成期望的蛋白或肽。
根据本发明，术语表达控制序列包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因的转录或mRNA的翻译的其他控制元件。在本发明的特定实施方案中，可以调控表达控制序列。表达控制序列的确切结构可以根据物种或细胞类型而变化，但通常包含分别参与转录和翻译的起始的5'-非转录序列和5'-和3'-非翻译序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5'-非转录的表达控制序列包含启动子区域，所述启动子区域包括用于功能性连接的核酸的转录控制的启动子序列。表达控制序列还可以包括增强子序列或上游激活子序列。
根据本发明，术语启动子或启动子区域涉及位于被表达的核酸序列的上游(5')并且通过提供对于RNA聚合酶的识别和结合位点而控制序列的表达的核酸序列。启动子区域可以包括对于参与调控基因转录的进一步因子的识别和结合位点。启动子可以控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是可诱导的，并且可以响应于诱导剂而起始转录，或者如果转录没有被诱导剂控制，可以是组成型的。如果诱导剂不存在，在诱导型启动子控制下的基因不表达，或仅仅在很小程度上表达。在诱导剂存在的情况下，基因被开启或转录水平被增加。这一般是由特定转录因子的结合所介导的。
根据本发明优选的启动子包括SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6 RNA启动子、CMV启动子、和其人工杂合启动子(例如，CMV)，其中一部分或多部分与其他细胞蛋白的基因的启动子的一部分或多部分融合并且包括或不包括一个或多个额外的内含子，所述其他细胞蛋白例如人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)。
根据本发明，术语表达在其最一般的意义上使用，并且包括产生RNA或RNA和蛋白/肽。它也包括核酸的部分表达。此外，可以瞬时或稳定地进行表达。
在一个优选的实施方案中，核酸分子根据本发明存在于载体中，在适当情况下具有控制核酸的表达的启动子。术语载体在其最一般的意义上使用，并且包括用于核酸的中间媒介物，所述媒介物帮助所述核酸，例如，被引入原核和/或真核细胞，并且在适当情况下，被整合进基因组。这种类型的载体优选在细胞中复制和/或表达。载体可以包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。如本文所使用的，术语质粒一般涉及染色体外遗传物质的构建体，通常为环状DNA双链体，其可以独立于染色体DNA复制。
在实施本发明中，将被理解的是，任选使用许多分子生物学、微生物学和重组DNA技术的常规技术。这样的常规技术涉及如本文所定义的载体、宿主细胞和重组方法。这些技术是众所周知的，并且在下列参考文献中解释，例如，Berger和Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 第152卷 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.；Sambrook等人, Molecular Cloning-A Laboratory Manual (第3版)，第1-3卷, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000和Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel等人,编，同上。例如，用于细胞分离和培养(例如，用于随后的核酸或蛋白分离)的其他有用的参考文献包括Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss, New York和其中引用的参考文献；Payne等人，(1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg和Phillips (编) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks (编) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla。上述参考文献中描述了制备核酸的方法(例如，通过体外扩增、从细胞纯化、或化学合成)、用于操作核酸的方法(例如，位点定向诱变、通过限制性内切酶消化、连接等)，以及可用于操作和制备核酸的各种载体、细胞系等。此外，基本上任何多核苷酸(包括，例如，标记的或生物素化的多核苷酸)可以是定制的或从各种商业来源订购的标准品。
因此，在一个方面，本发明提供了重组宿主细胞，其允许本发明的抗体或其部分的重组表达。通过在这样的重组宿主细胞中的表达而产生的抗体在本文被称为重组抗体。本发明还提供了这样的宿主细胞的后代细胞和由其产生的抗体。
如本文所使用的，术语重组宿主细胞(或简称宿主细胞)是指其中已经引入重组表达载体的细胞。应当理解的是，重组宿主细胞和宿主细胞不仅是指特定主题细胞，而且是指这样的细胞的后代。因为某些修饰可以由于突变或环境的影响发生在后代中，这样的后代，实际上可能与亲本细胞不相同，但仍然被包括在如本文所使用的术语宿主细胞的范围内。这样的细胞可以包含如上所述的本发明的载体。
在另一个方面，本发明提供了用于制备如本文所述的抗体或其部分的方法。根据一个实施方案，所述方法包括培养用如上所述的载体转染或转化的细胞，并且回收抗体或其部分。
如上所示，本发明的抗体(或其片段或变体)的表达优选包括一种或多种含有编码期望的抗Notum抗体的多核苷酸的表达载体。可以采用本领域技术人员众所周知的方法来构建含有编码抗体的序列及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，本发明实施方案提供含有编码本发明的抗Notum抗体(例如，整个抗体、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变结构域或其部分、或者重链或轻链CDR、单链抗体或其片段或变体)并与启动子操作性相连的核苷酸序列的可复制载体。在优选的实施方案中，这样的载体可以包括编码抗体分子的重链(或其片段)的核苷酸序列、编码抗体的轻链(或其片段)或重和轻链两者​​的核苷酸序列。
一旦已经根据本文的教导分离并修饰本发明的核苷酸，它们可用于产生选择的调节剂，包括抗Notum抗体或其片段。
X. 调节剂产生和纯化
使用本领域公认的分子生物学技术和目前的蛋白表达方法，可以产生大量的期望的调节剂。更具体地，可以将编码调节剂如如上所述获得并工程改造的抗体的核酸分子整合进众所周知并商业上可获得的蛋白生产系统，包括各种类型的宿主细胞，以提供临床前、临床或商业数量的期望的药物产品。将被理解的是，在优选的实施方案中，将编码调节剂的核酸分子工程改造进载体或表达载体中，所述载体或表达载体提供有效整合进选择的宿主细胞和随后的高表达水平的期望的Notum调节剂。
优选地，编码Notum调节剂的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可用于转染合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞，尽管将被理解的是，原核系统可用于产生调节剂。转染可以是用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域众所周知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、一种或多种多核苷酸封装在脂质体中、和DNA直接显微注射进细胞核。此外，核酸分子可以通过病毒载体引入哺乳动物细胞。转化哺乳动物细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，U.S.P.Ns 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461,和4,959,455。进一步，转化植物细胞的方法是本领域众所周知的，包括，例如，农杆菌介导的转化、基因枪转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域众所周知的。
此外，宿主细胞可以用两种本发明的表达载体共转染，例如，第一种载体编码重链来源的多肽，第二种载体编码轻链来源的多肽。这两种载体可含有相同的可选择标记，从而能基本上等同地表达重链多肽和轻链多肽。可替代地，可以使用编码和能够表达重链多肽和轻链多肽二者的单一载体。在这样的情况下，优选将轻链置于重链之前，以避免过量的毒性游离重链。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
a. 宿主表达系统
许多商业上可获得的多种宿主表达载体系统与本文的教导是相容的，并且可用于表达本发明的调节剂。这样的宿主表达系统代表了通过其可以表达并随后纯化目的编码序列的媒介物，但也代表了当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明的分子的细胞。这样的系统包括但不限于：用含有调节剂编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(如大肠杆菌(E.coli)，枯草芽胞杆菌(B.subtilis)，链霉菌(streptomyces))；用含有调节剂编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母(如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有调节剂编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有调节剂编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有调节剂编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转染的植物细胞系统(如烟草(Nicotiana)、拟南芥、浮萍(duckweed)、玉米、小麦、土豆等)；或具有含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。
在细菌系统中，根据所表达分子的用途有利地选择许多表达载体。例如，为了产生调节剂的药物组合物，当要产生大量这样的蛋白时，引导容易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体是期望的。这样的载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO 1.2：1791(1983))，该载体中编码序列可以单独与lacZ编码区同框地连接进载体中，使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res. 13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J. Biol. Chem.24：5503-5509 (1989))；等等。也可以使用pGEX载体来表达外源多肽作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这样的融合蛋白是可溶的，通过与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠吸附和结合然后在游离谷胱甘肽存在的情况下洗脱可以容易地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体设计为包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可以用作表达外源基因的载体。该病毒可在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将编码序列单独克隆进该病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，多种基于病毒的表达系统可以用来引入期望的核苷酸序列。在使用腺病毒作为表达载体的情况中，可以将目的编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三分前导序列相连。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)将导致是存活的并能够在感染的宿主中表达分子的重组病毒(例如，参见Logan和Shenk，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359 (1984))。特异性起始信号对于插入的编码序列的有效翻译也是需要的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，起始密码子必须位于期望编码序列的阅读框相中以确保翻译整个插入物。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，天然的和合成的。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等增强表达的效率。(参见，例如Bittner等人， Methods in Enzymol. 153：51-544 (1987))。因此，作为表达宿主可获得的相容的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可获得的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、293 Freestyle细胞(Life Technologies, San Diego)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、和多种其他细胞系。
为长期高产量地产生重组蛋白，稳定表达是优选的。相应地，可以使用标准的本领域公认的技术工程改造稳定表达选择的调节剂的细胞系。除了使用含有病毒复制起点的表达载体外，可以用受适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选择标记控制的DNA转化宿主细胞。引入外源DNA后，允许工程改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换为选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予对选择的抗性，允许细胞将质粒稳定地整合进它们的染色体并生长以形成灶，进而可以被克隆和扩增为细胞系。有利地使用该方法来工程改造表达分子的细胞系。这样的工程改造的细胞系特别可用于筛选和评价与分子直接或间接相互作用的组合物。
多种选择系统是本领域众所周知且可以使用的，包括但不限于：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc. Natl. Acad. Sci. USA48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，Cell，22：817(1980))基因，可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。也可以基于选择下列基于使用抗代谢物抗性：赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr(Wigler等人，Natl. Acad. Sci. USA 77：357(1980)；O′Hare等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：1527(1981))；赋予对霉酚酸抗性的gpt(Mulligan和Berg，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：2072(1981))；赋予对氨基糖苷类 G-418抗性的neo(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy，3：87-95 (1991)；Tolstoshev，Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.，32：573-596 (1993)；Mulligan， Science 260：926-932 (1993)；以及Morgan和Anderson，Ann. Rev. Biochem.，62：191-217 (1993)；TIB TECH，11(5)：155-215 (May, 1993))；和赋予对潮霉素抗性的hygro(Santerre等人，Gene 30：147(1984))。可以常规应用重组DNA技术领域通常已知的方法来选择期望的重组克隆，并且这样的方法参见Ausubel等人（编），Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY (1993)；Kriegler；Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) ；Dracopoli等人（编），Current Protocols in Human Genetics, 第 12和13章，John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapin等人，J. Mol. Biol.，150：1(1981)。将被理解的是，一种特别优选的建立稳定高产量细胞系的方法包含谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)，其提供了用于在某些条件下增强表达的有效方法。GS系统在EP专利0 216 846、0 256 055、0 323 997和0 338 841中完整地或与之相关地部分讨论，其中每个专利通过引用并入本文。
此外，可以选择调节插入序列表达或以期望的特定方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)可能对该蛋白的功能和/或纯化是重要的。不同宿主细胞对于蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性或特定的机制。如本领域已知的，可以选择适当细胞系或宿主系统以确保表达的多肽的期望修饰和加工。为此，具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞对于本发明中的用途是特别有效的。相应地，特别优选的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、NS0、MDCK、293、3T3、WI38，以及乳腺癌细胞系，例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常乳腺细胞系例如CRL7O3O和HsS78Bst。根据调节剂和选择的生产系统，本领域技术人员可以容易地选择并优化适当的宿主细胞用于高效表达调节剂。
b. 化学合成
除上述宿主细胞系统以外，将被理解的是本发明的调节剂可以使用本领域已知技术化学合成(例如，参见Creighton，1983，Proteins : Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N. Y 和 Hunkapiller 等人，1984，Nature, 310 :105-111)。例如，可以通过使用肽合成仪合成对应于本发明多肽片段的肽。此外，如果期望，可以引入非典型氨基酸或化学氨基酸类似物取代或添加到多肽序列。非典型氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D异构体，2，4-二氨基丁酸、a-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、b-丙氨酸、氟-氨基酸、设计氨基酸如b-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸和一般氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)型。
c. 转基因系统
也可以通过生成对于目的免疫球蛋白重和轻链序列(或其片段或衍生物或变体)转基因的哺乳动物或植物和产生可收回形式的期望化合物而产生本发明的Notum调节剂。关于哺乳动物中的转基因生产，抗Notum抗体，例如，可以在山羊、牛、或其他哺乳动物的乳中生产并从其回收。参见，例如，U.S.P.Ns. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, 和5,741,957。在一些实施方案中，用如上所述的Notum或其免疫原性部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物。对于在植物中制备抗体的方法参见，例如，U.S.P.Ns. 6,046,037和5,959,177。
根据本文的教导，可以通过使用标准转基因技术将一种或多种编码本发明的Notum调节剂的核酸分子引入动物或植物而产生非人转基因动物或植物。参见Hogan和U.S. Pat. No. 6,417,429。用于制备转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞或体细胞或受精卵。转基因非人生物体可以是嵌合的、非嵌合的杂合子、非嵌合的纯合子。参见，例如，Hogan等人, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 第2版, Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson等人, Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000);和Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)。在一些实施方案中，转基因非人动物具有靶向断裂和被编码，例如，目的重链和/或轻链的靶向构建体的代替。在一个实施方案中，转基因动物包含并表达编码特异性结合Notum的重和轻链的核酸分子。尽管可以在任何转基因动物中制备抗Notum抗体，在特别优选的实施方案中，非人动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。在进一步的实施方案中，非人转基因动物在血液、乳、尿、唾液、泪液、粘液和其他体液中表达期望的药物产物，使用本领域公认的纯化技术其是从所述液体中容易得到的。
可能由不同细胞系或在转基因动物中表达的调节剂、包括抗体将具有彼此不同的糖基化模式。然而，由本文中提供的核酸分子编码或包含本文中提供的氨基酸序列的所有调节剂是本发明的部分，无论分子的糖基化状态，和更一般地，无论存在或不存在一种或多种翻译后修饰。此外，本发明包括在翻译过程中或翻译后不同修饰的调节剂，如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体连接等。很多化学修饰中任何一个都可通过已知技术实施，包括但不限于溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4的特异性化学切割，乙酰化、甲酰化、氧化、还原，在衣霉素存在下代谢合成等。本发明也包括各种翻译后修饰，例如N连接的或O连接的碳水化合物链、N末端或C末端)的加工、化学部分与氨基酸骨架的结合、N连接的或O连接的碳水化合物链的化学修饰和原核宿主细胞表达导致的N末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。此外，如文中和以下实施例中所述，多肽也可以用可检测标记修饰，如酶、荧光、放射性同位素或亲和标记以允许检测和分离调节剂。
d. 纯化
一旦已经通过本文公开的重组表达或其他技术中的任一种产生本发明的调节剂，它可以通过本领域中已知用于纯化免疫球蛋白的任何方法，或更一般地通过用于纯化蛋白的任何其他标准技术来纯化。在这方面，调节剂可以是分离的。如本文所使用的，分离的Notum调节剂是已经被鉴定并且从其天然环境的成分中分离和/或回收的Notum调节剂。其天然环境的污染性成分是指将干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白的溶质。分离的调节剂包括重组细胞内的原位调节剂，因为多肽天然环境的至少一种成分将不存在。
在使用重组技术时，Notum调节剂(例如，抗Notum抗体或其衍生物或其片段)可以在细胞内产生，在周质空间内产生，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生期望分子，那么作为第一步，可以例如通过离心或超滤去除颗粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。例如，Carter等人, Bio/Technology 10:163 (1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌的周质空间的抗体的程序。简而言之，将细胞糊状物在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲磺酰氟(PMSF)存在的情况下解冻约30分钟。可以通过离心除去细胞碎片。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商业上可获得的蛋白浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可以在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(亲和层析是优选的纯化技术)来纯化从细胞制备的调节剂(例如，fc-Notum或抗Notum抗体)组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于选择的构建体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人IgG3(Guss等人，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体结合的基质最常用的是琼脂糖，但是其他基质也是可用的。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯允许获得比用琼脂糖获得的更快的流速和更短的处理时间。如果抗体包含CH3结构域，则Bakerbond ABXTM树脂(J. T. Baker，Phillipsburg，NJ)可以用于纯化。根据待回收的抗体，其他蛋白纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的琼脂糖层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的。在特别优选的实施方案中，将，至少部分地，使用蛋白A或蛋白G亲和层析纯化本发明的调节剂。
XI. 缀合的 Notum 调节剂
一旦已经根据本文的教导纯化本发明的调节剂，可以将它们与药物活性或诊断部分或生物相容的修饰剂连接、融合、缀合(例如，共价或非共价地)或以其他方式结合。如本文所使用的，术语缀合物将被广泛使用，并且应当是指无论结合方法的与公开的调节剂结合的任何分子。在这方面，将被理解的是，这样的缀合物可以包括肽、多肽、蛋白、聚合物、核酸分子、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子和放射性同位素。此外，如上面所示，根据，至少部分，用于影响缀合的方法，选择的缀合物可以与调节剂共价或非共价地连接并显示各种摩尔比。
在优选的实施方案中，将显而易见的是，可以将本发明的调节剂与赋予选择特征的蛋白、多肽或肽(例如，生物毒素、生物标记、纯化标签，等)缀合或结合。更一般地，在选择的实施方案中，本发明包括使用调节剂或其片段，所述调节剂或其片段与异源蛋白或多肽重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)，其中所述多肽包含至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸。构建体不一定是直接连接，但可以通过接头序列发生。例如，抗体可以用于通过将本发明的调节剂与对于特定细胞表面受体特异性的抗体融合或缀合而体外或体内将异源多肽靶向至表达Notum的特定细胞类型。此外，与异源多肽融合或缀合的调节剂也可以用于体外免疫测定中，并且可以与本领域中已知的纯化方法相容。参见例如，国际公开号WO 93/21232；欧洲专利号EP 439,095；Naramura等人，1994，Immunol. Lett.39：91-99；美国专利号5,474,981；Gillies等人，1992，PNAS 89：1428-1432；和Fell等人，1991，J. Immunol.146：2446-2452。
a. 生物相容的修饰剂
在一个优选的实施方案中，本发明的调节剂可以与生物相容的修饰剂缀合或以其他方式结合，所述生物相容的修饰剂可用于如期望地调整、改变、改进或减轻调节剂特性。例如，可以通过结合相对高分子量聚合物分子如商业上获得的聚乙二醇(PEG)或类似的生物相容的聚合物而生成具有增加的体内半衰期的抗体或融合构建体。本领域技术人员将理解，可以以许多不同分子量和分子构型获得PEG，可以选择所述分子量和分子构型为抗体赋予特定特性(例如，可以定制半衰期)。可以通过将PEG位点特异性缀合至所述抗体或抗体片段的N-或C-末端，或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基而将PEG连接至有或没有多功能接头的调节剂或抗体片段或衍生物。可以使用导致生物学活性最小丧失的直链或支链聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱密切监测缀合程度，从而确保PEG分子与抗体分子最佳缀合。可以通过如大小排阻层析或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG缀合物相分离。以类似的方式，可以将公开的调节剂与白蛋白缀合，以使抗体或抗体片段在体内更稳定或具有更长的体内半衰期。该技术是本领域众所周知的，参见，例如，国际公开号WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利号 EP 413,622。其他生物相容的缀合物对于普通技术人员是显而易见的，并且可以根据本文的教导容易地鉴定。
b. 诊断或检测试剂
在其他优选的实施方案中，本发明的调节剂或其片段或其衍生物与诊断或检测试剂缀合，所述诊断或检测试剂可以是生物分子(例如，肽或核苷酸)或小分子或放射性同位素。这样的调节剂可用于监测过度增生性病症的发展或进展或作为临床测试程序的部分来测定特定治疗包括公开的调节剂的功效。这样的标记也可以用于纯化选择的调节剂、分开或分离TIC或用于临床前程序或毒理学研究中。
可以将调节剂与可检测物质偶联来实现这种诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于：各种酶，包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素及亲和素/生物素；荧光材料，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、 丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光物质，例如但不限于萤光素酶、萤光素和水母蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(131I、125I、123I、121I,)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In,)和锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、和117Tin；使用各种正电子发射断层显像的正电子发射金属、非放射性顺磁金属离子和放射性标记或与特定放射性同位素缀合的分子。在这样的实施方案中，适当的检测方法是本领域中众所周知的，并且可以容易地从许多商业来源获得。
如上所述，在其他实施方案中，可以将调节剂或其片段与标记序列如肽或荧光团融合，以促进纯化或诊断程序如免疫组织化学或FAC。在优选的实施方案中，所述标记氨基酸序列是六个组氨酸的肽，例如pQE载体中提供的标签(QIAGEN)，其中许多可通过商业获得。如Gentz等人，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，86：821-824中所述，六个组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于：对应于源自流感血凝素蛋白的表位的血凝素“HA”标签(Wilson等人，1984，Cell 37：767)和“flag”标签(U.S.P.N. 4,703,004)。
c. 治疗部分
如前面所提到的，调节剂或其片段或衍生物也可以与治疗部分缀合、连接或融合或以其他方式结合，所述治疗部分如细胞毒素或细胞毒素剂(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(例如，α或β发射体)。如本文所述，细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害并且可以抑制细胞生长或存活的任何试剂或治疗部分。实例包括：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素 (dihydroxy anthracin)、美登木塑生物碱(maytansinoids)如DM-1和DM-4(Immunogen, Inc.)、二羟蒽醌、丝裂霉素、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、柔红霉素和环磷酰胺以及它们的类似物或同系物。其他细胞毒素包含auristatins，包括单甲基auristatin E(MMAE)和单甲基auristatin F(MMAF) (Seattle Genetics, Inc.)、鹅膏蕈碱如α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱或ε-鹅膏蕈碱(Heidelberg Pharma AG)、DNA小沟结合剂，如duocarmycin衍生物(Syntarga, B.V.)和修饰的吡咯苯二氮卓二聚体(PBDs, Spirogen, Ltd)。此外，在一个实施方案中，本发明的Notum调节剂可以与抗-CD3结合分子结合以招募细胞毒性T细胞，并使它们靶向肿瘤起始细胞(BiTE技术;参见，例如，Fuhrmann, S. 等人，Annual Meeting of AACR Abstract No. 5625 (2010) 其通过引用并入本文)。
额外相容的治疗部分包括细胞毒性剂，包括但不限于，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺)；烷化剂(例如，氮芥、thioepa chlorambucil、美法仑、亚硝基脲氮芥(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)；环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)；蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)；抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))；和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。治疗部分的更广泛的列表可以参见PCT公开WO 03/075957和U.S.P.N. 2009/0155255，其中每一个通过引用并入本文。
选择的调节剂可以与治疗部分缀合，所述治疗部分如放射性物质或用于缀合放射性离子的大环螯合剂(放射性物质的实例见上文)。在某些实施方案中，所述大环螯合剂是可以经由接头分子与抗体相连的1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”-四乙酸(DOTA)。这种接头分子通常是本领域已知的并且参见Denardo等人，1998，Clin Cancer Res.4：2483；Peterson等人，1999，Bioconjug. Chem.10：553；以及Zimmerman等人，1999，Nucl. Med. Biol. 26：943。
可以与本发明的该方面相容的示例性放射性同位素包括，但不限于，碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、铜(62Cu、64Cu、67Cu)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In)、铋(212Bi、213Bi)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Tin、225Ac、76Br和211At。其他放射性核素也可以作为诊断和治疗剂，特别是60至4,000keV的能量范围内的那些。根据待治疗的状况和期望的治疗概况，本领域技术人员可以容易地选择适当的放射性同位素用于与公开的调节剂使用。
本发明的Notum调节剂也可以与改变给定生物反应的治疗部分或药物缀合。换言之，与本发明相容的治疗剂或部分不应当被解释为限于典型化疗剂。例如，在特别优选的实施方案中，药物部分可以是具有期望生物学活性的蛋白或多肽或其片段。这样的蛋白可以包括，例如，毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、豹蛙酶(或另一种细胞毒性RNase)、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂(如TNF-α、TNF-β)、AIM I(参见国际公开号WO 97/33899)、AIM II(参见国际公开号WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等人，1994, J. Immunol., 6:1567)、和VEGI(参见国际公开号WO 99/23105)；血栓形成药或抗血管发生药，例如制管张素或内皮生长抑制素；或者生物反应修饰剂，如淋巴因子(例如，白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))、或生长因子(如，生长激素(“GH”))。如上所述，用于将调节剂融合于或缀合于多肽部分的方法是本领域已知的。除以前公开的主题参考文献以外，参见，例如，U.S.P.Ns. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851,和5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT公开WO 96/04388和WO 91/06570; Ashkenazi等人, 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng等人, 1995, J Immunol 154:5590;和Vil等人, 1992, PNAS USA 89:11337，其中每一个通过引用并入本文。调节剂与部分的结合不一定需要是直接的，也可通过接头序列发生。这些接头分子是本领域众所周知的，参见Denardo等人，1998，Clin Cancer Res 4：2483；Peterson等人，1999，Bioconjug. Chem.10：553；Zimmerman等人，1999，Nucl Med Biol 26：943；Garnett，2002，Adv Drug Deliv Rev 53:171，其中每一个通过引用并入本文。
更具体地，将治疗部分或细胞毒素剂缀合于调节剂的技术是众所周知的。可通过本领域已知的任何方法将部分缀合于调节剂，所述方法包括但不限于：醛/席夫键、巯基键、酸不稳定键、顺式乌头键、腙键、酶可降解键(通常参见Garnett，2002，Adv Drug Deliv Rev 53：171)。也参见，例如，Arnon等人，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等人(编)，第243-56页 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (第二版), Robinson 等人 (编), 第623-53页 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe，"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: 综述", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera 等人 (编), 第475-506页 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等人 (编), 第 303-16 页(Academic Press 1985),以及Thorpe等人，1982，Immunol. Rev. 62：119。在优选的实施方案中，在结合与细胞表面相关的Notum分子后，与治疗部分或细胞毒性剂缀合的Notum调节剂可以被细胞内化，从而递送治疗有效载荷(therapeutic payload)。
XII. 诊断和筛选
如所示，本发明提供了用于检测或诊断过度增生性病症的方法和筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤起始细胞的方法。这样的方法包括鉴定具有癌症的个体用于治疗或监测癌症进程，包括将从患者获得的样品与如本文所述的Notum调节剂接触，以及检测样品中调节剂与结合或游离的Notum的结合的存在或不存在或水平。当调节剂包括抗体或其免疫学活性片段时，样品中与Notum的结合表明，样品可能含有肿瘤永生细胞(例如，癌干细胞)，表明可以用如本文所述的Notum调节剂有效地治疗具有癌症的个体。该方法可以进一步包括将结合水平与对照比较的步骤。相反，当选择的调节剂是Fc-Notum时，可以(直接或间接)监测如本文所述的分子当与样品接触时的酶学特性，以提供期望信息。与本文的教导相容的其他诊断方法是本领域众所周知的，并且可以使用商业材料如专用的报道系统来实施。
示例性相容的测定方法包括放射免疫测定法、酶免疫测定、竞争结合测定、荧光免疫测定、免疫印迹测定、Western印迹分析、流式细胞术测定和ELISA测定。更一般地，可以使用任何本领域已知的测定完成生物样品中Notum的检测或Notum酶活性(或其抑制)的测量。
在另一个方面，并且如下面更详细讨论的，本发明提供了用于检测、监测或诊断过度增生性病症，鉴定具有这样的病症的个体用于患者中病症的可能治疗或监测进程(或复原)的试剂盒，其中所述试剂盒包括如本文所述的调节剂和用于检测所述调节剂对样品的影响的试剂。
Notum调节剂和包含其的细胞、培养物、群体和组合物，包括其后代，也可以用于筛选或鉴定通过与Notum(例如，其多肽或遗传成分)相互作用而影响肿瘤起始细胞或其后代的功能或活性的化合物或试剂(例如，药物)。因此，本发明进一步提供了用于评价或鉴定可以通过与Notum或其底物结合而影响肿瘤起始细胞或其后代的功能或活性的化合物或试剂的系统和方法。这样的化合物和试剂可以是被筛选用于治疗例如过度增生病症的药物候选。在一个实施方案中，系统或方法包括呈现Notum的肿瘤起始细胞和化合物或试剂(例如，药物)，其中所述细胞和化合物或试剂(例如，药物)彼此接触。
本发明进一步提供了筛选和鉴定用于改变肿瘤起始细胞或后代细胞的活性或功能的Notum调节剂或试剂和化合物的方法。在一个实施方案中，方法包括将肿瘤起始细胞或其后代与测试试剂或化合物接触；并确定测试试剂或化合物是否调节Notum+肿瘤起始细胞的活性或功能。
调节群体内这样的肿瘤起始细胞或其后代的Notum相关活性或功能的测试试剂或化合物将测试试剂或化合物鉴定为活性试剂。可以被调节的示例性活性或功能包括细胞形态的变化、标记的表达、分化或去分化、成熟、增殖、活力、凋亡或细胞死亡神经祖细胞或其后代。
当关于细胞或细胞培养物或方法步骤或处理中使用时，接触是指组合物(例如，Notum+细胞或细胞培养物)和另一种引用的实体之间直接或间接的相互作用。直接相互作用的特定实例是物理相互作用。间接相互作用的特定实例是其中组合物作用于中间分子，其进而作用于引用的实体(例如，细胞或细胞培养物)。
在本发明的该方面，调节表明以与检测对细胞活性或功能的影响相容的方式影响肿瘤起始细胞或后代细胞的活性或功能，所述细胞活性或功能已经被确定与本发明的肿瘤起始细胞或后代细胞的特定方面(例如，转移或增殖)有关。示例性的活性和功能包括，但不限于，测量形态、发育标记、分化、增殖、活力、细胞呼吸、线粒体活性，膜完整性、或与特定状况相关的标记的表达。相应地，化合物或试剂(例如，药物候选)可以通过将这样的细胞或后代细胞与化合物或试剂接触，并如本文公开或者技术人员已知地测量肿瘤起始细胞或后代细胞的活性或功能的任何调节而关于其对肿瘤起始细胞或后代细胞的影响来评价。
筛选和鉴定试剂和化合物的方法包括适合于高通量筛选的那些，其包括任选以预先确定的位置或地址定位或放置的单元阵列(例如，微阵列)。高通量机器人或手动处理方法可以探测化学相互作用并确定在短时间期间内许多基因的表达水平。已经开发了使用分子信号(例如，荧光团)和以非常快速处理信息的自动分析的技术(参见，例如，Pinhasov等人, Comb. Chem. High Throughput Screen. 7:133 (2004))。例如，已经广泛采用微阵列技术以一次探测数千个基因的相互作用，同时提供关于特定基因的信息(参见，例如，Mocellin和Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593:19 (2007))。
这样的筛选方法(例如高通量)可以快速和有效地鉴定活性剂和化合物。例如，细胞可以任选以确定的位置位于或置于(预接种)在培养皿，管，瓶，滚瓶或板上(例如，单一多孔板或皿如8、16、32、64、96、384和1536多孔板或皿)，用于鉴定潜在治疗性分子。可以进行筛选的文库包括，例如，小分子文库、噬菌体展示文库、完全人抗体酵母展示文库(Adimab，LLC)、siRNA文库和腺病毒转染载体。
XIII. 药物制剂和治疗用途
a. 制剂和施用途径
基于调节剂连同任何任选的缀合物的形式、期望递送的模式、待治疗或监测的疾病和许多其他变量，可以使用本领域公认的技术配制本发明的组合物。换言之，在本发明的多个实施方案中，将包含Notum调节剂的组合物与多种药学上可接受的载体一起配制 (参见，例如，Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus，第20版(2003) ；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第 7 版，Lippencott Williams 和 Wilkins (2004) ;Kibbe 等人，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Pharmaceutical Press (2000))。多种药学上可接受的载体是从多种商业来源获得的，其包括赋形剂、佐剂和稀释剂。此外，多种药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等也是可获得的。某些非限制性示例性的载体包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合。
更具体地，将被理解的是，在一些实施方案中，本发明的治疗组合物可以单独施用或与最少的额外组分施用。相反，本发明的Notum调节剂可以任选地配制以含有包含赋形剂和助剂的合适的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体是本领域众所周知的，并且是相对惰性的物质，其促进调节剂的施用，或帮助活性化合物加工进入对于递送至作用部位药学优化的制剂中。例如，赋形剂可以提供形式或一致性或充当稀释剂以改善调节剂的药代动力学。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐、包封剂、缓冲剂、和皮肤渗透增强剂。
用于全身施用的公开的调节剂可以配制用于肠内、肠胃外或局部施用。事实上，所有三种类型的制剂可以同时使用以实现活性成分的全身施用。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂记载于Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第20版. Mack Publishing (2000)中。用于肠胃外施用的合适的制剂包括以水溶性形式例如水溶性盐的活性化合物的水溶液。此外，可以施用视情况用于油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯、甘油三酯。水性注射悬液可以含有增加悬浮液粘度的物质，并且包括，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有稳定剂。脂质体也可用于封装试剂而用于递送进细胞。
用于肠内施用的合适制剂包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂，包括包衣片剂、酏剂、悬浮液、糖浆剂或吸入剂和其控释形式。
通常，可以通过各种途径将包含Notum调节剂的本发明的化合物和组合物体内施用于需要其的受试者，所述途径包括，但不限于，口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌内、心内、心室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮、和鞘内、或另外通过植入或吸入进行。所述主题组合物可以配制成固体、半固体、液体、或气体形式的制剂；包括、但不限于、片剂、胶囊、粉剂、粒剂、药膏、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂、和气雾剂。可以根据预期的应用和治疗方案选择适当的制剂和施用途径。
b. 剂量
类似地，特定剂量方案，即，剂量、时机和重复，将取决于特定个体和该个体的医疗史。经验上的考虑，如半衰期，一般将有助于确定剂量。施用频率可以经治疗过程确定和调节，并且基于降低过度增生性细胞或肿瘤细胞、包括肿瘤起始细胞的数量，维持这样的肿瘤细胞的降低，降低肿瘤细胞的增殖，或延迟转移的发展。可替代地，主题治疗组合物的持续连续释放制剂可以是适当的。如上所提到的，用于实现缓释的各种制剂和设备是本领域已知的。
从治疗的角度，药物组合物以有效用于治疗或预防具体适应症的量施用。治疗有效量典型地取决于被治疗的受试者的体重、他/她的身体或健康状况、待治疗的病症的广泛性、或被治疗的受试者的年龄。通常，可以以每个剂量约10 μg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量施用本发明的Notum调节剂。在某些实施方案中，可以以每个剂量约50 μg/kg体重至约5 mg/kg体重范围内的量施用本发明的Notum调节剂。在某些其他实施方案中，可以以每个剂量约100 μg/kg体重至约10 mg/kg体重范围内的量施用本发明的Notum调节剂。任选地，可以以每个剂量约100 μg/kg体重至约20 mg/kg体重范围内的量施用本发明的Notum调节剂。进一步任选地，可以以每个剂量约0.5 mg/kg体重至约20 mg/kg体重范围内的量施用本发明的Notum调节剂。在某些实施方案中，提供了本发明的化合物，施用至少约100 μg/kg体重、至少约250 μg/kg体重、至少约750 μg/kg体重、至少约3 mg/kg体重、至少约5 mg/kg体重、至少约10 mg/kg体重的剂量。
其他给药方案可以基于如完整地通过引用并入本文的U.S.P.N. 7,744,877中公开的体表面积(BSA)计算法。如本领域众所周知的，BSA使用患者的身高和体重来计算，并提供了由他或她身体的表面积所代表的受试者大小的量度。在使用BSA的本发明的选择的实施方案中，可以以10 mg/m2至800 mg/m2的剂量施用调节剂。在其他优选的实施方案中，将以50 mg/m2至500 mg/m2的剂量并且甚至更优选100 mg/m2、150 mg/m2、200 mg/m2、250 mg/m2、300 mg/m2、350 mg/m2、400 mg/m2或450 mg/m2的剂量施用调节剂。当然，将被理解的是，无论如何计算剂量，可以经选择的时间期间施用多个剂量以提供实质上高于个别施用的绝对剂量。
在任何情况下，Notum调节优选根据需要施用于需要其的受试者。施用频率的确定可以由本领域技术人员如由主治医师基于被治疗的状况、被治疗的受试者的年龄、被治疗的状况的严重性、被治疗受试者的整体健康状态等的考虑而确定。通常，将有效剂量的Notum调节剂一次或多次施用于受试者。更具体地，以一个月一次、一个月多于一次或一个月少于一次将有效剂量的调节剂施用于受试者。在某些实施方案中，可以多次施用有效剂量的Notum调节剂，包括持续至少一个月、至少6个月、或至少一年的期间。
对于已经给予一次或多次施用的个体中公开的治疗组合物，也可以凭经验确定剂量和方案。例如，可以给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。为了评价选择的组合物的功效，可以跟踪特定疾病、病症或状况的标记。在其中个体患有癌症的实施方案中，这些包括经由触诊或目视观察的肿瘤大小的直接测量，通过X-射线或其他成像技术的肿瘤大小的间接测量；如通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查所评价的改善；根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标记(例如，对于前列腺癌的PSA)或抗原的测量，疼痛或麻痹的减少；改善的与肿瘤相关的讲话、视觉、呼吸或其他残疾；增加的食欲；或如通过接受的测试或生存的延长所测量的生活质量的增加。对本领域技术人员将显而易见的是，剂量将取决于个体、肿瘤状况的类型、肿瘤状况的阶段、个体中肿瘤状况是否已经开始转移至其他位置和过去和同时正在使用的治疗而变化。
c. 组合治疗
本发明考虑的组合治疗特别可用于降低或抑制不需要的肿瘤细胞增殖(例如内皮细胞)，降低癌症的发生，减少或预防癌症的复发，或减少或预防癌症的扩散或转移。在这样的情况下，本发明的化合物可以通过除去TPC支持并保持肿瘤块(例如NTG细胞)而充当敏化或化学敏化剂，并允许更有效地使用护理减瘤或抗癌剂的现行标准。换言之，包含Notum调节剂和一种或多种抗癌剂的组合治疗可用于减小建立的癌症，例如，减少存在的癌细胞数量和/或减少肿瘤负荷，或改善癌症的至少一种表现或副作用。因此，组合治疗是指施用Notum调节剂和一种或多种抗癌剂，所述抗癌剂包括但不限于，细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、化疗剂、靶向的抗癌症剂、生物反应调节剂、免疫治疗剂、癌症疫苗、抗血管生成剂、细胞因子、激素疗法、放射疗法和抗转移剂。
根据本发明的方法，当分开进行每种治疗(例如，​​抗Notum抗体和抗肿瘤剂)时，不要求组合的结果是观察到的效果的累加。尽管通常期望至少累加性效果，但是高于单一疗法之一的任何增加的抗肿瘤效果都是有益的。此外，本发明不需要组合治疗表现出协同效应。然而，本领域技术人员将理解，使用包含优选的实施方案的某些选择的组合，可以观察到协同作用。
为了实施根据本发明的组合治疗，可以将Notum调节剂(例如，抗Notum抗体)组合一种或多种抗癌剂以在受试者中有效导致抗癌活性的方式施用于需要其的受试者。提供Notum调节剂和抗癌剂，其量和持续时间有效导致它们组合的存在以及如期望的它们在肿瘤环境中的组合作用。为了实现该目标，可以使用相同或不同的施用途径或以单一组合物、或作为两种或更多种不同组合物将Notum调节剂和抗癌剂同时施用于受试者。
可替代地，调节剂可以在抗癌剂治疗之前，或之后，例如，间隔为数分钟至数周。在其中抗肿瘤剂和抗体分开应用于受试者的某些实施方案中，每次递送时间之间的时间期间使得抗肿瘤剂和调节剂能够发挥对肿瘤的组合效果。在一个特定的实施方案中，考虑在彼此的约5分钟至约两周内施用抗癌剂和Notum调节剂。
在又其他实施方案中，在施用调节剂和抗癌剂之间可以经过数天(2、3、4、5、6或7)、数周(1、2、3、4、5、6、7或8)或数个月(1、2、3、4、5、6、7或8)。Notum调节剂和一种或多种抗癌剂(组合治疗)可以施用一次、两次或至少一段时间，直到状况被治疗、减轻或治愈。优选地，施用多次组合治疗。可以每天三次至每六个月一次施用组合治疗。施用可以按下列时间表，如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每个月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次，或可以经由微泵连续施用。如前面所示，可以经由口服、粘膜、颊、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌肉内、肠胃外、瘤内或局部途径施用组合治疗。可以在远离肿瘤部位的部位施用组合治疗。通常将施用组合治疗持续的时间和肿瘤存在的时间一样长，条件是组合治疗引起肿瘤或癌症停止生长或重量或体积减少。
在一个实施方案中，将Notum调节剂与一种或多种抗癌剂组合持续短治疗周期施用于癌症患者以治疗癌症。用抗体治疗的持续时间可能根据使用的特定抗癌剂而变化。本发明还考虑了不连续施用或分为数个部分施用的每日剂量。技术人员将理解对于特定抗癌剂的适当的治疗时间，并且本发明考虑了对于每种抗癌剂的最佳治疗时间表的连续评价。
本发明考虑了至少一个周期，优选多于一个周期，在其期间施用组合治疗。技术人员将理解对于一个周期的适当的时间期间，也将理解周期总数和周期之间的间隔。本发明考虑了对于每种调节剂和抗癌剂的最佳治疗时间安排的连续评价。此外，本发明还提供了抗Notum抗体或抗癌剂的多于一次施用。调节剂和抗癌剂可以交替数天或数周互换地施用；或者可以给予一系列的抗体治疗，随后一次或多次抗癌剂治疗的处理。在任何情况下，如本领域普通技术人员将理解的，化疗剂的适当剂量一般在临床治疗中已经采用的那些附近，其中化疗剂单独施用或与其他化疗剂组合施用。
在另一个优选的实施方案中，本发明的Notum调节剂可用于维持治疗中以降低或消除在疾病的首发症状后肿瘤复发的机会。优选地，病症将已经被治疗，并且初始肿瘤块消除、减少或以其他方式改善，所以患者是无症状的或缓解中的。当此时，受试者可以施用药学有效量的公开的效应物一种或多次，即使使用标准诊断程序有很少或没有疾病迹象。在一些实施方案中，将经一定时间期间根据规则的时间表施用效应物。例如，可以每周一次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次或每年一次施用Notum调节剂。鉴于本文的教导，本领域技术人员可以容易地确定有利剂量和给药方案以降低病症复发的可能。此外，根据患者应答和临床和诊断参数，这样的治疗可以继续持续数周、数月、数年的期间或者甚至无限期。
在又另一个优选的实施方案中，本发明的效应物可用于预防地防止或降低减瘤程序后肿瘤转移的可能性。如本公开中所使用的，减瘤程序是广泛定义的，应当是指消除、降低、治疗或改善肿瘤或肿瘤增殖的任何程序、技术或方法。示例性减瘤程序包括，但不限于，外科手术、放射治疗(即，束辐射)、化疗或切除。以本领域技术人员鉴于本公开容易地确定的适当次数，可以如降低肿瘤转移的临床和诊断程序所建议地施用Notum调节剂。可以使用标准技术以确定的药学有效剂量一次或多次施用效应物。优选地，给药方案将伴随适当的诊断或监测技术，所述技术允许其必要时进行修改。
d. 抗癌剂
如本文所使用的，术语抗癌剂是指可用于治疗细胞增生性病症如癌症的任何试剂，包括细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化疗剂、放射治疗和放射治疗剂、靶向的抗癌剂、生物反应调节剂、抗体和免疫治疗剂。将被理解的是，在如上面所讨论的选择的实施方案中，抗癌剂可以包含缀合物，并且可以在施用前与调节剂结合。
术语细胞毒性剂是指降低或抑制细胞的功能和/或引起细胞的破坏的物质，即，该物质对细胞有毒性。通常，该物质是源自活的生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于小分子毒素或细菌酶学活性毒素(例如，白喉毒素(Diptheria toxin)、假单胞菌内毒素和外毒素、葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A)), 真菌酶学活性毒素(例如，α-八叠球菌、局限曲菌素(restrictocin))、植物酶学活性毒素 (例如，相思豆毒蛋白、 蓖麻毒素、蒴莲素(modeccin)、 槲寄生素(viscumin)、 美洲商陆抗病毒蛋白、皂素、白树毒素、momoridin、天花粉蛋白、大麦毒素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白 (PAPI、PAPII、和 PAP-S)、观赏苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、植物核糖体失活蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitegellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、伊诺霉素和tricothecenes)或动物酶学活性毒素，例如，细胞毒性RNase，如胞外胰Rnase；DNase I，包括其片段和/或变体。
化疗剂是指非特异性减少或抑制癌细胞的生长、增殖和/或生存的化学化合物(例如，细胞毒性或细胞生长抑制剂)。这样的化学试剂经常针对对于细胞生长或分裂必需的细胞内过程，并且因此针对一般生长和分裂迅速的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，并且因此抑制细胞进入有丝分裂。通常，化疗剂可以包括抑制、或设计用来抑制癌细胞或可能变为癌性或产生肿瘤生成的后代的细胞(例如，TIC)的任何化学剂。这样的试剂经常施用，并且经常在组合时，例如，在制剂CHOP中是最有效的。
可以用于和本发明的调节剂组合使用(或缀合的)抗癌剂的实例，包括，但不限于烷化剂、烷基磺酸酯、氮丙啶类(aziridines)、乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)、番荔枝内酯类(acetogenin)、喜树碱(camptothecin)、苔藓抑素(bryostatin)、callystatin、CC-1065、隐藻素类(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)，duocarmycin、艾榴塞洛素(eleutherobin)，pancratistatin、sarcodictyin、海绵抑素(spongistatin)，氮芥类(nitrogen mustards)、抗生素、烯二炔抗生素、蒽环类抗生素(dynemicin)、二膦酸盐类(bisphosphonates)、埃斯波霉素(esperamicin)，色蛋白烯二炔类抗生素发色团(chromoprotein enediyne antiobiotic chromophores)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN®多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素(anti-adrenals)、叶酸补充剂诸如亚叶酸(folinic acid)、醋葡醛内酯(aceglatone)、醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)、 恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、bestrabucil、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、defofamine、地美可辛(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、elfornithine、依利醋铵(elliptinium acetate)、埃坡霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓(gallium nitrate)、羟脲(hydroxyurea)、香菇多糖(lentinan)、氯尼达明(lonidamine)、美登木素生物碱类(maytansinoids)，米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌达醇(mopidamol)、二胺硝吖啶(nitracrine)、喷司他丁(pentostatin)、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌、podophyllinic acid、2-乙基酰肼(ethylhydrazide)、甲基苄肼(procarbazine)、PSK®多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)、雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺、单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(vermcarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))、乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)、达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(Ara-C)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、塞替派(thiotepa)、类紫杉醇(taxoids)、苯丁酸氮芥(chlorambucil) 、 GEMZAR®吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤(thioguanine)、 巯基嘌呤(mercaptopurine)、 甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(Vincristine)；NAVELBINE®长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他滨(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (Camptosar、CPT-11)、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)；卡培他滨(capecitabine)；康普立停(combretastatin); 亚叶酸(leucovorin) (LV); 奥沙利铂(oxaliplatin)；降低细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A 的抑制剂以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括作用为调节或抑制肿瘤的激素效果的抗激素剂，如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素生成，以及抗雄激素药物；以及曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸；核酶类(ribozyme)例如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗、PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN®拓扑异构酶 1 抑制剂；ABARELIX® rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯培拉毒素(Esperamicin)以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。其他实施方案包括使用批准用于癌症治疗的抗体，包括，但不限于，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、patitumumab、ofatumumab、伊匹单抗和brentuximab vedotin。本领域技术人员将能够容易地鉴定与本文的教导相容的额外抗癌剂。
e. 放射治疗
本发明还提供了Notum调节剂与放射治疗(即，用于诱导肿瘤细胞内局部DNA损伤的任何机制，如γ辐射、X-射线、UV辐射、微波、电子发射等)的组合。还考虑了使用将放射性同位素靶向递送至肿瘤细胞的组合治疗，并且可以和靶向的抗癌剂或其他靶向方式联系使用。通常，在约1至约2周的时间期间以脉冲形式施用放射治疗。可以将放射治疗施用于患有头颈部癌症的受试者持续约6至7周。任选地，可以作为单一剂量或作为多个连续剂量施用放射治疗。
f. 肿瘤状况
无论单独或与抗癌剂或放射治疗组合施用，本发明的Notum调节剂对于通常治疗患者或受试者中的肿瘤状况是特别有用的，所述肿瘤状况包括良性或恶性肿瘤(例如、肾癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌；肉瘤；成胶质细胞瘤；和各种头颈部肿瘤)；白血病和淋巴恶性肿瘤；其他病症如神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其他腺体、巨噬细胞、上皮细胞、基质和囊胚腔病症；和炎症、血管生成、免疫病症和病原体引起的病症。对于用本发明的治疗组合物和方法的治疗的特别优选的目标是包含实体瘤的肿瘤状况。在其他优选的实施方案中，本发明的调节剂可用于诊断、预防或治疗恶性血液病。优选地，待治疗的受试者或患者将是人，尽管如本文所使用的，术语应当清楚地包括任何哺乳动物物种。
更具体地，经受根据本发明的治疗的肿瘤状况可以选自下列组中，所述组包括但不限于，肾上腺瘤、AIDS相关癌症、软组织腺泡状肉瘤、星状细胞肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌和移行细胞癌)、骨癌(釉质瘤、动脉瘤性骨嚢肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索癌、嫌色性肾脏细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤因瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性结构不良、胆嚢和胆管癌、妊娠滋养层成瘤性疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、胰岛细胞瘤、卡波氏肉瘤、肾脏癌(肾脏母细胞瘤、乳头状肾脏细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等)、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌肿瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、神经母细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、小儿癌症、外周神经鞘膜肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、后代眼色素层黑色素瘤(posterious unveal melanoma)、罕见性血液性病症、肾脏转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌和子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌和平滑肌瘤)。在某些优选的实施方案中，癌细胞选自实体瘤，包括，但不限于乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、肉瘤、肾转移癌、甲状腺转移癌和透明细胞癌。
关于恶性血液病将，进一步被理解的是，本发明的化合物和方法在治疗下列疾病中可以特别有效：各种B-细胞淋巴瘤，包括低级/NHL滤泡细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、扩散大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL(small non-cleaved cell NHL)、巨大肿瘤疾病(bulky disease) NHL、 Waldenstrom 巨球蛋白血症、 淋巴浆细胞样(lymhoplasmacytoid )淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、扩散大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤(BL)、AIDS-相关淋巴瘤、单核细胞B细胞性淋巴瘤、血管成免疫细胞淋巴结病、小淋巴细胞、滤泡、扩散大细胞、扩散小分裂细胞、大细胞免疫细胞成淋巴细胞瘤、小的没有分裂的、伯基特氏和非伯基特氏、滤泡、显著大细胞；滤泡、显著小裂解细胞；和滤泡、混合的小裂解的和大细胞性淋巴瘤。参见Gaidono等人，”Lymphomas"，IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol. 2: 2131-2145 (DeVita 等人，编，第五版，1997)。对于本领域技术人员应当清楚的是，这些淋巴瘤由于不断变化的分类系统经常具有不同的名称，并且具有根据不同名称分类的淋巴瘤的患者也可以受益于本发明的组合的治疗方案。
在又其他优选实施方案中，Notum调节剂可用于有效治疗某些髓系恶性血液病包括白血病，如慢性淋巴细胞性白血病(CLL或B-CLL)。CLL主要是老年人的疾病，其在50岁后发病率开始增加，并且在六十岁后期达到高峰。它通常涉及肿瘤外周血淋巴细胞的增殖。CLL的临床发现涉及淋巴细胞增多、淋巴结病、脾肿大、贫血和血小板减少。CLL的特征性特点是单克隆B细胞增殖和在分化的中间状态停滞的B-淋巴细胞的累积，其中这样的B细胞表达表面IgM (sIgM)或sIgM和sIgD，和密度低于正常B细胞上的单一轻链。然而，如上所讨论的并且随附的实施例中所示，选择的Notum表达(例如，Notum)在B-CLL细胞上上调，从而提供了对于公开的调节剂的有吸引力的目标。
本发明还提供了呈现具有良性或癌前期的肿瘤的受试者的防止或预防性治疗。不相信任何特定类型的肿瘤或肿瘤病症应当从使用本发明的治疗中排除。然而，肿瘤细胞的类型可能和本发明与第二种治疗剂、特别是化疗剂和靶向的抗癌剂组合的用途相关。
如本文所讨论的，本发明的优选的实施方案包括使用Notum调节剂以治疗患有实体瘤的受试者。在这样的受试者中，这些实体瘤中的许多包含表现各种基因突变的组织，所述基因突变可能使它们对公开的效应物的治疗特别敏感。例如，KRAS、APC和CTNNB1突变在患有结肠直肠癌的患者中相对常见。此外，患有具有这些突变的肿瘤的患者对于目前的治疗通常是最难治的；特别是具有KRAS突变的那些患者。KRAS活化突变，其通常导致单一氨基酸取代，也涉及其他难于治疗的恶性肿瘤，包括肺腺癌、粘液性腺瘤、和胰腺的导管癌。
目前，结肠直肠癌患者是否将对EGFR或VEGF抑制药物响应的最可靠的预测，例如，是测试某些KRAS“活化”突变。KRAS在35-45％的结肠直肠癌中是突变的，并且其肿瘤表达突变的KRAS的患者对这些药物没有很好地响应。例如，KRAS突变预测在结肠直肠癌中对帕尼单抗和西妥昔单抗治疗的响应的缺乏(Lievre等人，Cancer Res 66:3992–5; Karapetis等人，NEJM 359:1757-1765)。约85％的患有结肠直肠癌的患者在APC基因中具有突变(Markowitz & Bertagnolli. NEJM 361:2449-60)，并且在具有家族性腺瘤性息肉病和结肠直肠癌的患者中已经表征了多于800个APC突变。大部分这些突变导致截短的APC蛋白，其介导β-联蛋白的破坏的功能性能力降低。在β-联蛋白基因CTNNB1中的突变也可以导致蛋白的增加的稳定化，导致核输入和数种致癌基因转录程序的后续激活，这也是由突变的APC未能适当介导β-联蛋白破坏导致的癌形成的机制，而所述β-联蛋白破坏对于保持正常的细胞增殖和分化程序受检查是需要的。如本文的实施例所示，包含这样的突变的肿瘤可以证明对用本发明的Notum调节剂的治疗是特别敏感的。
XIV. 制品
还提供了包含一个或多​​个容器的药物包装和试剂盒，所述容器包含一个或多​​个剂量的Notum调节剂。在某些实施方案中，提供了单位剂量，其中所述单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含，例如，抗Notum抗体，有或没有一种或多种额外药剂。在其他实施方案中，将所述单位剂量提供在单次使用的预先填充的注射用注射器中。在其他实施方案中，单位剂量中所包含的组合物可以包括盐水，蔗糖等；缓冲剂，如磷酸盐等；和/或在稳定且有效的pH范围内配制。可替代地，在某些实施方案中，所述组合物可以提供为冻干的粉剂，其可以在添加适当的液体如无菌水时重构。在某些优选实施方案中，所述组合物包括一种或多种抑制蛋白聚集的物质，其包括但不限于，蔗糖和精氨酸。一个或多个容器上，或与其相关的任何标签表明，封闭的组合物用于诊断或治疗选择的疾病状况。
本发明还提供了用于产生Notum调节剂和，任选地，一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。试剂盒包括容器、容器上或与容器相关的标签或包装附件。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以用多种材料制备例如玻璃或塑料。容器盛有对治疗选择状况有效的组合物，且可以具有无菌入口(例如容器可以是静脉内用溶液包或具有皮下注射针可穿透塞子的小瓶)。这样的试剂盒一般在合适的容器中含有Notum调节剂和，任选地，在相同的或不同的容器中的一种或多种抗癌剂的药学上可接受的制剂。试剂盒还可以含有用于诊断或组合治疗的其他药学上可接受的制剂。例如，除本发明的Notum调节剂以外，这样的试剂盒可以含有一系列抗癌剂中的任何一种或多种，所述抗癌剂如化疗或放射治疗药物；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向的抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。这样的试剂盒也可以提供适当的试剂以便用抗癌剂或诊断剂缀合Notum调节剂(例如，参见U.S.P.N. 7,422,739，其完整地通过引用并入本文)。
更具体地，试剂盒可以具有单一容器，所述容器含有Notum调节剂，有或没有额外的组分，或者它们对于每种期望的药剂可以具有不同的容器。当提供组合治疗用于配合时，单一溶液可以是预混合的，或以摩尔等量组合，或与一个组分超过其他组分。可替代地，药剂盒的Notum调节剂和任何任选的抗癌剂在施用于患者前可以分开地保持在不同的容器内。试剂盒还可以包含第二/第三容器装置，所述容器装置用于含有无菌的药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂，如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。
当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，所述液体溶液优选为水溶液，无菌水溶液是特别优选的。然而，试剂盒的组分可以作为一种或多种干燥的粉末提供。当试剂或组分作为干燥粉末提供时，所述粉末可以通过加入合适的溶剂进行重构。可以想象溶剂也可以在另一个容器中提供。
如上所简示，药剂盒还可以含有一种装置，通过所述装置将抗体和任何任选组分施用于动物或患者，例如，一个或多个针或注射器，或甚至眼滴管、移液管、或其他这样的装置，可以从该装置将制剂注射或引入动物或应用于身体的病变区域。本发明的试剂盒也将通常包括用于包含小瓶的装置，或这样的类似物，和用于商业销售的密闭的其他组分，如，例如，注塑或吹塑成型的塑料容器，其中放置并保留期望的小瓶和其他装置。任何标签或包装插页表明Notum调节剂组合物用于治疗癌症，例如结肠直肠癌。
XV. 研究试剂
本发明的其他优选的实施方案还使用公开的调节剂作为工具的特性，所述工具可用于通过方法如荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活的细胞分选(MACS)或激光介导的分隔来鉴定、分离、分隔或富集肿瘤起始细胞的群体或亚群。本领域技术人员将理解，调节剂可用于用于表征和操作TIC包括癌干细胞的数种相容技术(例如，参见U.S.S.Ns. 12/686,359、12/669,136和12/757,649，649，其中每一个完整地通过引用并入本文)。
XVI. 杂项
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。更具体地，如说明书和随附的权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另有指出。因此，例如，提到“一种蛋白”包括多种蛋白；提到“一种细胞”包括多种细胞的混合物，等等。此外，在说明书和随附的权利要求中提供的范围包括两端点和端点之间的所有点。因此，2.0至3.0的范围包括2.0、3.0、和2.0和3.0之间的所有点。
通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交关联使用的命名，和其技术，是本领域众所周知并且通常使用的那些。通常根据本领域众所周知的常规方法，并且如本说明书通篇引用并讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述，进行本发明的方法和技术，除非另有指明。参见，例如，Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel等人, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow和Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998);和Coligan等人, Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)。如本领域中通常完成的，或者如本文所述，根据制造商的说明进行酶促反应和纯化技术。与本文所述的分析化学、合成有机化学和医药和药物化学关联使用的命名法，和其实验程序和技术，是本领域众所周知并且常用的那些。
本说明书内公开或引用的所有参考文献或文献非限制性地完整地通过引用并入本文。此外，本文所用的任何部分标题仅是用于组织目的，不应该解释为限制所述的主题。
实施例
通过参考以下实施例将更容易理解因此通常描述的本发明，所述实施例通过举例的方式提供，而不是意在限制本发明。所述实施例不意在表示下述实验是所有的或仅是进行的实验。除非另外指明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是处于或接近大气压。
实施例1
肿瘤起始细胞群体的表征
为了表征实体瘤当它们存在于癌症患者中的细胞异质性，使用特定的表型标记阐明肿瘤永生细胞(TPC；即癌干细胞：CSC)的身份并鉴定临床相关的治疗目标，使用本领域公认的技术开发并维护大型非常规异种移植(NTX)肿瘤文库。通过从受各种实体瘤恶性肿瘤折磨的许多癌症患者初始获得的异种肿瘤细胞的多次传代将包含大量不同的肿瘤细胞系的NTX肿瘤文库在免疫功能低下的小鼠中增殖。大量具有良好定义的谱系的不同早代NTX肿瘤细胞系的持续的可获得性极大地促进了TPC的鉴定和分离，因为它们允许从细胞系纯化的细胞的重复和反复的表征。更具体地，根据其在概括细胞来源的患者肿瘤样品的小鼠中表型和形态地生成异质肿瘤的能力，追溯地最准确地定义分离并纯化的TPC。因此，在小鼠中使用分离细胞的小群体生成完全异质肿瘤的能力强烈说明分离的细胞包含TPC这一事实。在这样的工作中，最低限度传代的NTX细胞系的使用极大地简化了体内实验，并提供了容易验证的结果。此外，早代NTX肿瘤也对治疗药物如伊立替康(即Camptosar®)响应，其提供了对驱动肿瘤生长、对目前治疗耐受和肿瘤复发的根本机制的临床相关的洞察。
由于建立了NTX肿瘤细胞系，使用流式细胞术分析组成的肿瘤细胞表型，以鉴定可以用于在这样的群体内表征、分离、纯化或富集肿瘤起始细胞(TIC)和分离或分析TPC和TProg细胞的不同标记。在这方面，本发明人采用专用的基于蛋白质组的平台(即PhenoPrint™阵列)，所述平台提供了基于蛋白表达的细胞的快速表征和潜在有用标记伴随鉴定。PhenoPrint阵列是专用的蛋白组平台，其包含在96孔板中阵列的数百种不同的结合分子，许多从商业来源获得，其中每个孔含有在藻红蛋白荧光通道中的独特抗体和在横跨板的每个孔中阵列的以不同荧光团的多种额外抗体。这允许通过快速并入相关细胞或经由非藻红蛋白通道去除无关细胞而在选择的肿瘤细胞亚群中测定目的抗原的表达水平。当PhenoPrint阵列组合本领域中众所周知的组织分离、移植和干细胞技术(Al-Hajj等人, 2004, Dalerba等人, 2007和Dylla等人, 2008，所有同上，其中每一个完整地通过引用并入本文)使用时，可能有效地鉴定相关标记，并随后以高效率分离和移植特定的人肿瘤细胞亚群。
相应地，如对于在严重免疫功能低下小鼠中的人肿瘤通常进行地建立各种NTX肿瘤细胞系之后，在肿瘤达到800 - 2,000 mm3后从小鼠切出肿瘤，并使用本领域公认的酶消化技术将细胞解离成单细胞悬浮液(参见例如U.S.P.N. 2007/0292414，其并入本文)。使用PhenoPrint阵列从这些悬浮液获得的数据提供了基于细胞对细胞(cell-by-cell)的绝对(每个细胞)和相对(相对于群体中的其他细胞)表面蛋白表达，导致细胞群体的更复杂的表征和分层。更具体地，使用PhenoPrint阵列允许快速鉴定期望地区分TIC或TPC与NTG块肿瘤细胞和肿瘤基质的蛋白或标记，并且当从NTX肿瘤模型分离时，提供了表达不同水平的特定细胞表面蛋白的肿瘤细胞亚群的相对快速表征。具体地，在整个肿瘤细胞群体具有异质表达的蛋白允许独特的且高度纯化的表达高和低水平的特定蛋白或标记的肿瘤细胞亚群的分离并移植进免疫功能低下的小鼠，从而促进TPC是否富集在一个亚群或另一个亚群的评价。
术语富集与分离细胞同义地使用，是指与起始或初始细胞群体相比一种类型的细胞的产率(分数)比其他类型的细胞的分数增加。优选地，富集是指与起始细胞群体相比，细胞群体中一种类型的细胞增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％或大于50％的百分比。
如本文所使用的，在细胞或组织的上下文中，标记是指，以化学或生物实体形式的任何特征，其被鉴定地与特定细胞、细胞群体或组织相关，或特异性地在特定细胞、细胞群体或组织中或特定细胞、细胞群体或组织上被发现，包括在受疾病或病症影响的组织或细胞群体中或受疾病或病症影响的组织或细胞群体上鉴定的那些。如表现的，标记在性质上可以是形态的、功能的或生物化学的。在优选的实施方案中，标记是由特定细胞类型(例如，TPC)，或由细胞在某些条件下(例如，在细胞生命周期的特定点期间或特定生态位的细胞中)差异或优先表达的细胞表面抗原。优选地，这样的标记是蛋白，更优选地，具有如本领域中已知的对于抗体、适配体或其他结合分子的表位。然而，标记可以由细胞表面上或细胞内发现的任何分子组成，包括，但不限于，蛋白(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇。形态标记特征或性状的实例包括，但不限于，形状、大小、和细胞核细胞质比值。功能标记特征或性状的实例包括，但不限于，粘附特定基底的能力、掺入或排除特定染料的能力，例如但不限于亲脂性染料的排除、在特定条件下迁移能力和沿特定谱系分化的能力。标记也可以是从报道基因表达的蛋白，例如由于将编码报道基因的核酸序列引入细胞和导致可以用作标记的报道蛋白的产生的其转录而导致的由细胞表达的报道基因。可以用作标记的这样的报道基因是，例如但不限于荧光蛋白酶、染色粒蛋白、抗性基因等。
在相关的意义上，在组织、细胞或细胞群体(例如，稳定的TPC表型)的上下文中，术语标记表型是指可以用于表征、鉴定、分开、分离或富集特定细胞或细胞群体的任何标记或标记的组合。在特定的实施方案中，标记表型是可以通过检测或鉴定细胞表面标记的组合的表达而确定的细胞表面表型。
本领域技术人员将认识到许多标记(或它们的不存在)已经与各种群体的癌干细胞相关并用于分离或表征肿瘤细胞亚群。在这方面，示例性的癌干细胞标记包括OCT4、Nanog、STAT3、EPCAM、CD24、CD34、NB84、TrkA、GD2、CD133、CD20、CD56、CD29、B7H3、CD46、转铁蛋白受体、JAM3、羧肽酶M、ADAM9、抑癌蛋白M、Lgr5、Lgr6、CD324、CD325、巢蛋白、Sox1、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、mf2、yy1、smarcA3、smarckA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、(TCF4) SLC7A8、IL1RAP、TEM8、TMPRSS4、MUC16、GPRC5B、SLC6A14、SLC4A11、PPAP2C、CAV1、CAV2、PTPN3、EPHA1、EPHA2、SLC1A1、CX3CL1、ADORA2A、MPZL1、FLJ10052、C4.4A、EDG3、RARRES1、TMEPAI、PTS、CEACAM6、NID2、STEAP、ABCA3、CRIM1、IL1R1、OPN3、DAF、MUC1、MCP、CPD、NMA、ADAM9、GJA1、SLC19A2、ABCA1、PCDH7、ADCY9、SLC39A1、NPC1、ENPP1、N33、GPNMB、LY6E、CELSR1、LRP3、C20orf52、TMEPAI、FLVCR、PCDHA10、GPR54、TGFBR3、SEMA4B、PCDHB2、ABCG2、CD166、AFP、BMP-4、β-联蛋白、CD2、CD3、CD9、CD14、CD31、CD38、CD44、CD45、CD74、CD90、CXCR4、核心蛋白聚糖、EGFR、CD105、CD64、CD16、CD16a、CD16b、GLI1、GLI2、CD49b、和CD49f。参见，例如Schulenburg等人，2010, PMID:20185329, U.S.P.N. 7,632,678和U.S.P.Ns. 2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416和2011/0020221，其中每个通过引用并入本文。将被理解的是，许多这些标记包括在上述PhenoPrint阵列中。
类似地，与某些肿瘤类型的癌干细胞相关的细胞表面表型的非限制性实例包括CD44+CD24low、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38−、CD44+CD24−、CD46+CD324+CD66c−、CD133+CD34+CD10−CD19−、CD138−CD34−CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2 β1 hiCD133 +、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及本领域已知的其他癌干细胞表面表型。参见，例如，Schulenburg等人., 2010,同上, Visvader等人., 2008, PMID:18784658和U.S.P.N. 2008/0138313，其中每一个完整地通过引用并入本文。本领域技术人员将理解，可以使用标记表型如上面刚刚例举的那些结合标准的流式细胞分析和细胞分选技术来表征、分离、纯化或富集TIC和/或TPC细胞或细胞群体用于进一步分析。关于本发明感兴趣的是， CD46、CD324和任选地CD66c或高度或异质表达在下述许多细胞的表面上：人结肠直肠癌(“CR”)、乳腺癌(“BR”)、非小细胞肺癌(NSCLC) 、小细胞肺癌(SCLC)、胰腺癌(“PA”)、黑色素瘤(“Mel”)、卵巢癌(“OV”)和头颈癌(”HN“)肿瘤细胞，无论被分析的肿瘤样本是否初始患者肿瘤样本或患者来源的NTX肿瘤。
实施例2
从富集的肿瘤起始细胞群体分离并分析RNA样品
使用建立的结肠直肠癌NTX细胞系(SCRx-CR4)在免疫功能低下的小鼠中起始肿瘤。一旦平均肿瘤负荷达到~ 300 mm3，将小鼠随机化并用15mg/kg伊立替康或媒介物对照(PBS)每周两次处理，持续20天期间，在该时间点及时对小鼠实施安乐死，通常使用如实施例1中所述的标记表型分别从新鲜切除NTX肿瘤分离TPC、TProg和NTG细胞。更具体地，使用CD46、CD324和CD66c标记通过荧光激活的细胞分选(FACS)分离细胞群体，并立即沉淀并在Qiagen RLTPlus RNA裂解缓冲液(Qiagen, Inc.)中裂解。裂解物然后储存在-80℃直到使用。RNA细胞裂解物解冻后，根据供应商的说明使用Qiagen RNEasy分离试剂盒(Qiagen, Inc.)提取总RNA，使用供应商的方案和推荐的仪器设置在Nanodrop (Thermo Scientific)和再次Bioanalyzer 2100 (Agilent)上定量。得到的总RNA制备物适合于基因测序和分析。
制备从如上所述从媒介物或伊立替康处理的小鼠分离的TPC、TProg和NTG细胞群体获得的RNA样品，用于用Applied Biosystems SOLiD 3.0 (通过Oligo连接/检测测序)下一代测序平台(Life Technologies)的全转录组测序，所述测序用5 ng总RNA/每份样品开始。通过作图至来自人基因组的34,609个基因的SOLiD平台产生的数据能够检测Notum，并在所有样品中提供了Notum水平的可验证的测量。
通常，SOLiD3下一代测序平台使连接至珠粒的克隆扩增的RNA / DNA片段的平行测序成为可能。然后使用用染料标记的寡核苷酸的边连接边测序(Sequencing by ligation)生成样品中存在的每个片段的50个碱基读取值，总共大于50百万读取值，生成基因组中蛋白的mRNA转录物水平表达的准确得更多的代表。SOLiD3平台不仅能够捕获表达，而且能够捕获SNP、已知和未知的可替代的剪接事件，和可能地仅仅基于读取值覆盖(对于基因组位置独特地绘制的读取值)的新的外显子发现。因此，使用这种下一代平台允许在转录水平表达中差异的确定以及那些表达的mRNA转录物的特定剪接变体的差异或偏好。此外，使用来自Applied Biosystems的修改的全转录组方案用SOLiD3平台的分析只需要约5 ng的起始原料预扩增。这对于从分选的细胞群体提取总RNA是重要的，在所述分选的细胞群体中，TPC亚组的细胞，例如，在数量上远远小于NTG或块肿瘤，并且因此导致非常少量可用的起始材料。
如标准工业实践中，将来自SOLiD3平台的测序数据的一式两份运行进行均一化、转化并计算倍数比。如图2中所见，数据分析显示，与TProg和NTG群体相比，在TPC 中Notum的转录物水平上调2至5倍，并在用15 mg/kg伊立替康每周两次处理的具有NTX肿瘤的小鼠中进一步评价。使用极端敏感的SOLiD3分析平台观察到的Notum在NTX肿瘤样品中TPC亚群中的过表达表明，Notum可能在结肠直肠肿瘤发生和维持中发挥重要作用。
实施例3
在富集的肿瘤起始细胞群体中Notum的实时PCR分析
为了验证在TPC群体中相比于TProg和NTG细胞中Notum的增强的表达，使用TaqMan实时定量PCR测量在从如上所述的各种NTX细胞系分离的各自的细胞群体中的基因表达水平。将被理解的是，这样的实时PCR分析允许使用对特定目的基因特异性的引物和探针组更直接和快速测量对于不同目标的基因表达水平。在Applied Biosystems 5900HT机器(Life Technologies)上进行TaqMan实时定量PCR，其用于测量多个源自患者的NTX系细胞群体和相应对照中的Notum基因表达。如与TaqMan系统提供的说明书中指定的并使用商业上获得的Notum引物/探针组(Life Technologies)进行随后的分析。
在图3中可见，询问在从3种不同结肠直肠NTX肿瘤细胞系(例如，CR2、CR4和CR5)分离的NTG、TProg和TPC群体中基因表达的定量实时PCR显示，Notum基因表达在TPC细胞中升高约2倍，并且该表达在正在接受伊立替康处理的小鼠中进一步升高至约4倍。使用实时定量PCR的更广泛接受的方法的NTX TPC细胞制备物中相比于TProg和NTG细胞对照升高的Notum表达的观察结果验证了前面实施例的SOLiD3全转录组测序数据，并且进一步表明Notum是结肠直肠肿瘤中的驱动因素。此外，在用抗癌剂处理的肿瘤中增加的Notum表达显示，Notum调节剂或拮抗剂可以证明作为辅助疗法是有价值的。
实施例4
在未分级的结肠直肠癌肿瘤样品中Notum的表达
鉴于发现在来自结肠直肠肿瘤的TPC群体中相比于TProg和NTG细胞中Notum基因表达升高的事实，进行实验以确定在未分级的结肠直肠肿瘤样品相比于正常邻近组织(NAT)和其他正常组织样品中Notum表达水平是否也升高。根据提供的方案设计并定制含有110份结肠直肠患者肿瘤样本、正常邻近组织和48份正常组织的定制TumorScan qPCR (Origene Technologies) 384孔阵列。使用实施例3中详述的程序和相同的Notum特异性引物/探针组，然后在定制板的孔中进行TaqMan实时定量PCR。
图4A和4B显示针对正常结肠和直肠组织中的平均表达均一化的以图形格式的表达数据的结果。更具体地，图4A总结了使用从110例结肠直肠癌(其中35份组织样本是来自结肠直肠癌患者的正常邻近组织)和48份正常组织获得的168份组织样本生成的数据。在图中，数据表示为框须图，中值表示为框内的线。类似地，图4B含有来自从肿瘤或正常邻近组织获得的24份匹配的结肠直肠癌患者样本的数据。此处，作图数据通过具有各自肿瘤和NAT 之间的联系的样品基础表示在样品上。图4A和4B都表明，在提出的所有四个阶段中，在结肠直肠肿瘤和匹配的肿瘤样本中相比于正常相邻组织中Notum基因的表达水平都升高。
更具体地，在这些原代患者肿瘤样品(与NTX肿瘤相比)上的实时PCR结果显示，在患者肿瘤相比于正常邻近组织(NAT)中，无论癌症阶段(即阶段I – IV疾病)，Notum基因表达要高约1,000倍。类似地，与NAT 相比，在匹配的肿瘤中Notum基因表达升高约10-100倍。此外，Notum表达在大多数正常组织中是相对低的，仅仅正常胎盘和肝组织含有在阶段聚集的结肠直肠癌患者肿瘤中观察到的中值水平或高于该中值水平的基因表达水平。在未分级的结肠直肠肿瘤样品中Notum的升高表达和正常对照组织中相对低的表达水平再次提示Notum基因产物在恶性肿瘤的发育和支持中的作用。
实施例5
在示例性肿瘤样品中Notum的差异表达
为了进一步评价在额外结肠直肠癌患者肿瘤样品和诊断为17种其他不同实体瘤类型中1种的患者的肿瘤样本中的Notum基因表达，使用根据如实施例4中提供的方案定制装配的TissueScan qPCR (Origene Technologies)384孔阵列进行TaqMan qRT-PCR。测量结果显示在图5A和5B中，并且显示在多种肿瘤样品中Notum的基因表达显著升高。
在这方面，图5A和5B显示来自具有18种不同实体瘤类型之一的患者的整个肿瘤样本(灰色框)或匹配的NAT(白色框)中人Notum分别的相对或绝对基因表达水平。在图5A中，对于分析的每种肿瘤类型，将数据针对平均NAT基因表达进行均一化。在图5B中，在各种组织/肿瘤中评价Notum的绝对表达，将数据绘制为通过定量实时PCR达到指数扩增需要的循环数(Ct)。没有扩增的样本指定为45的Ct值，其代表在实验方案中最后的扩增循环。数据表示为框须图，中值表示为框内的线。
除诊断为结肠直肠癌的患者以外，相比于NAT，诊断为子宫内膜癌、食道癌和子宫癌的那些患者在其肿瘤中也具有显著更多的Notum基因表达，这提示Notum也可能通过影响这些肿瘤中的TPC自我更新和增殖发挥病理作用。卵巢肿瘤、前列腺肿瘤和甲状腺肿瘤也具有升高的Notum表达，尽管不那么显著。从这些研究中也很清楚的是，在大多数NAT样品中Notum基因表达一般低至检测不到；在肝、睾丸和肺中观察到最高的表达。再次，这些数据提示，Notum表达对于多种过度增生性病症中的肿瘤发生或永生化是指示性的，并且可能是决定性的。
实施例6
在各种合并的组织裂解物中的差异Notum蛋白表达
在如前面实施例所证明地记录多种肿瘤发生样品中增强的Notum基因表达后，寻求在类似肿瘤样品中Notum蛋白的相应增加的证据。在这方面，提供包含来自11种肿瘤类型或它们各自正常邻近组织的2份合并的一式两份的裂解物连同有或没有如外源启动子(OriGene Technologies)所驱动的TP53过表达的293细胞的对照的反相蛋白阵列。使用针对人Notum生成的小鼠多克隆抗体和供应商提供的比色检测试剂和方案检测裂解物中的Notum蛋白表达。使用平板扫描仪将制备的阵列上的斑点转化为数字图象，并且然后使用AlphaEaseFc软件(Alpha Innotech, Inc)内的SpotDenso功能进行定量。
来自这些阵列的结果显示于图6中，并且表明在数个不同类型的肿瘤中Notum蛋白的表达上调。更具体地，图6显示在来自从具有11种不同肿瘤类型之一的患者获得的样本(即，原代肿瘤样品)的正常邻近组织和293T P53阴性对照(白色)或293T P53阳性对照和肿瘤组织(黑色)中人Notum蛋白的表达水平。数据如上所述生成，并表示为每个点的平均像素强度。绘制的数据代表平均值±SEM。
除结肠直肠癌以外，Notum蛋白表达似乎在来自患有黑色素瘤、前列腺癌和胰腺癌的患者的肿瘤样本中显著升高。这些数据提示， Notum过表达可能参与这些肿瘤中的TPC增殖和/或生存。此外， Notum蛋白的检测对于这些疾病是预后性的。
鉴于前述实施例，其显示Notum在TPC富集的细胞群体和各种肿瘤中过表达(在基因和蛋白质组水平)，加上这样的升高的表达水平与肿瘤发生和肿瘤传播相关的可能性，决定构建可以用于生成Notum调节剂的Notum免疫原。
实施例7
标签的Notum调节剂的构建和表达
如下所述构造并表达构建体用于生成Notum调节剂。作为起点，从商业来源(Open Biosystems; 登录号BC060882)获得编码整个开放阅读框(ORF) SEQ ID NO:1的人Notum cDNA。通过DNA测序验证cDNA克隆ORF序列相对于参考序列(GenBank NM_178493)没有突变。
为了便于重组产物的纯化和检测，通过PCR修饰编码全长Notum ORF的cDNA以包括编码8x-His和Strep-标签II表位(IBA GmBH)的序列。用QiaQuick PCR净化柱(Qiagen)从PCR纯化编码修饰的Notum ORF的DNA，亚克隆pCMV-Script (Stratagene, Inc.)的Not I和Xho I位点之间的DNA，并通过DNA测序验证没有突变。在这种情况下，野生型Notum信号肽序列引导重组蛋白的分泌。
根据本发明，构建pSEC表达载体用于生产期望的重组产物。pSEC-CAG表达载体含有CAG启动子，其由人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期基因增强子/启动子区域、即位于增强子/启动子区域下游的β-球蛋白/IgG嵌合内含子构成。pSEC-CAG载体在许多细胞类型中促进克隆的cDNA插入物强烈的组成型表达。pSEC-CAG也含有IgK信号肽/前导序列，以促进表达的重组蛋白从质粒转染的细胞的增强的分泌。通过PCR将来自pCMV-Script的表位标签的Notum ORF亚克隆进pSEC-CAG载体的Sfi I和Xho I位点之间以产生pSEC-CAG-NOTUM-StrepHis。
使用pSEC-CAG-NOTUM-StrepHis DNA用于1升悬浮293细胞的转染，使用镍-NTA柱从转染细胞的上清液纯化重组蛋白。更具体地，通过根据制造商说明书使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies)转染质粒pSEC-CAG-NOTUM-StrepHis而在贴壁HEK293T细胞中产生重组Notum蛋白。在48小时时收获贴壁细胞的上清液，并使用AKTA主要仪器在Ni-NTA HisTrap柱(GE Amersham)上纯化重组His标签的蛋白。使用线性梯度的咪唑(终浓度500 mM)从柱洗脱重组蛋白(即，hNotum-His)，合并含有Notum蛋白的级分，浓缩，并进一步使用AKTA FPLC在Superdex200大小排阻柱上纯化以收集单体蛋白。通过ELISA并通过蛋白印迹分析验证纯化的Notum蛋白。收集的物质用于随后的实施例中的免疫。
类似地，随后如刚刚上面所述使用基本相同的技术制备并表达His标签的小鼠Notum(即，Notum-His)，小鼠Notum基因在下面实施例8中描述。如随后的实施例中所述，该构建体还用于表征本发明的调节剂。
实施例8
Fc-Notum融合调节剂的构建和表达
产生额外的相对更可溶的Notum蛋白用作调节剂、免疫原、测定试剂和用于体内研究。更具体地，分别使用人Notum和小鼠和恒河猴(猕猴(Macaca mulatta)或猕猴(macaque))的直向同源物制备Fc构建体。对于本申请的目的，除非另有规定，这样的构建体的Fc部分将是人来源的。
如实施例7中所述，通过PCR扩增编码成熟人Notum蛋白的DNA，以包括符合读框的侧翼EcoRⅠ和NcoⅠ限制性位点，并亚克隆在pFUSE-mIgG2b载体(Invivogen)的EcoRⅠ和NcoⅠ位点之间以生成pFUSE-NOTUM-mIgG，其包含IL-2信号肽序列，符合读框地融合至编码成熟人Notum蛋白的序列，符合读框地与编码源自小鼠IgG2b基因的Fc结构域的序列融合。小鼠IgG2b Fc结构域被编码人IgG2 Fc的DNA序列代替，所述编码人IgG2 Fc的DNA序列已通过PCR从质粒pFUSE-hIgG2 (Invivogen)扩增。用BglⅡ和Nhe消化人IgG2 Fc PCR产物，并亚克隆进载体pFUSE-NOTUM-mIgG中相同的位点以产生pNOTUM-hIgG2 hFc，其包含IL-2信号肽序列，符合读框地融合至编码成熟人Notum蛋白的序列，符合读框地与编码源自人IgG2基因的Fc结构域的序列融合。示例性人Fc-Notum融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO：333)和核酸序列(SEQ ID NO：334)描述于图1D，其中所述分子的Notum部分加下划线。
在使用线性聚乙烯亚胺和标准方法(参见例如，Durocher, Y.等人.Nucleic Acids Res.(2002) 30:e9，其通过引用并入本文)用pNOTUM-hIgG2 hFc质粒转染的CHO-S细胞(Life Technologies)中产生重组人Notum-Fc蛋白(即，hNotum-Fc)。转染后5天，使用蛋白A柱和制造商说明书(GE Amersham)从上清液中纯化重组蛋白。浓缩从柱洗脱的物质(至约1 mg/mL)并缓冲液交换为PBS。
使用类似的分子生物学和DNA克隆技术，制备包含小鼠Notum和猕猴Notum和人Fc区域的融合构建体用于在测定开发努力和体内产品开发中使用。由GENEArt (Regensburg, Germany)从寡核苷酸合成对应于小家鼠Notum(GenBank NM_175263)和猕猴Notum(GenBank XM_001112829)的ORF的序列。通过PCR从GENEArt提供的载体扩增编码成熟小鼠Notum蛋白的DNA，并亚克隆进pSCRXv003的EcoRⅠ和NcoⅠ位点，所述pSCRXv003质粒源自pFUSE-mIgG2b，其中编码小鼠IgG2b Fc结构域的序列已经用编码人IgG2 Fc结构域的序列替换。这产生了质粒pSCRXv3-mus-Notum，这在很大程度上与pNOTUM-hIgG2 hFc是相似的，其具有小鼠Notum取代人Notum。Durocher, Y. 等人，同上
类似地，通过PCR从GENEArt提供的载体扩增编码成熟猕猴Notum蛋白的DNA，并亚克隆进pSCRXv003的EcoRⅠ和Bgl II位点以产生pSCRXv003-mac-Notum(再次与pNOTUM-IgG2 hFc相似，其具有猕猴Notum取代人Notum)。如上对于人-Fc标签的人Notum所述根据需要在CHO-S细胞中产生重组鼠和猕猴Notum-人Fc标签的蛋白。
实施例9
使用Notum构建体生成抗Notum抗体
根据本文的教导通过用hNotum-His或hNotum-Fc接种产生鼠抗体形式的Notum调节剂。在这方面，使用三个品系的小鼠来生成高亲和力鼠单克隆抗体，该抗体可治疗性地用于抑制Notum的作用以治疗肿瘤病症。具体而言，用人重组Notum免疫Balb/c、CD-1和FVB小鼠品系并用于如下产生杂交瘤：
通过用Notum抗原的各种制备物免疫6只雌性小鼠(各2只：Balb/c、CD-1、FVB)而生成鼠抗体。免疫原包括在293细胞中表达的His标签的人Notum或Notum-Fc。对于所有注射经由脚掌途径免疫小鼠。使用与等体积TITERMAX或铝佐剂乳化的10 μg Notum免疫原用于免疫。
使用固相ELISA测定来对于人Notum特异性的小鼠IgG抗体筛选小鼠血清。简而言之，以在PBS中范围为0.01-1 μg/mL的不同浓度用Notum-His(来自实施例7)将板包被过夜。用含有0.02% (v/v) Tween 20的PBS洗涤后，在RT用200 μL/孔的PBS中的3% (w/v) BSA封闭孔1小时。在RT以50 μL/孔在Notum-His包被的板上孵育小鼠血清稀释液1小时。洗涤板，然后在RT用在3% BSA-PBS中1:10,000稀释的50 μL/孔HRP-标记的山羊抗小鼠IgG孵育1小时。洗涤板，并加入100μL/孔的TMB底物溶液，在RT 15分钟。洗涤后，用TMB底物(Thermo Scientific 34028)使板显色，并在OD 450nm处通过分光光度计分析。
将血清阳性的免疫小鼠处死并解剖出引流淋巴结(如果扩大，腿弯部和腹股沟)，并用作用于抗体产生细胞的来源。通过电融合以1:1的比例用非分泌P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC #CRL-1580)融合B细胞(6.35X107细胞)的单细胞悬浮液。使用融合发生器，ECM2001型(Genetronic, Inc.)进行电细胞融合。将细胞重悬浮在补充含有15%胎儿克隆I血清(Hyclone)、1 mM丙酮酸钠、4 mM L-谷氨酰胺、10 μg/mL庆大霉素、50 μM 2-巯基乙醇、100 μM次黄嘌呤、0.4 μM氨基喋呤和16 μM胸苷)的HAT (Sigma #A9666) (DMEM (Cellgro 目录号15-017-CM)培养基的杂交瘤选择培养基中，然后以200 μL/孔铺在20块96孔平底组织培养板中，最终铺板为2X106 B细胞/每96孔板。然后将板放置在含有5% CO 2 和95%空气的湿润37℃培养箱中持续7-10天。
使用类似于上述的ELISA测定对于Notum特异性筛选分泌小鼠免疫球蛋白的生长阳性杂交瘤孔。简而言之，在4℃用碳酸钠缓冲液中的0.4 μg/mL人Notum-His包被96孔板(VWR, 610744)过夜。洗涤板，在37℃用1% BSA-PBS封闭1小时，并立即使用或保存在4℃。未稀释的杂交瘤上清液在RT在板上孵育1小时。洗涤板，并在RT用在1% BSA-PBS中1:10,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG探测1小时。然后如上所述用底物溶液孵育板并在OD 450处读数。
可替代地，用山羊抗人IgG Fc包被ELISA板以将hNotum-Fc捕获至ELISA板。洗涤板，在RT用3% BSA-PBS封闭1小时，并用于筛选未稀释的杂交瘤上清液。随后，洗涤板，并在RT用在3% BSA-PBS中1:10,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG探测1小时。然后如上所述用底物溶液孵育板并在OD 450处读数。
Notum特异性杂交瘤在细胞培养中扩增，重新铺板，再筛选并通过有限稀释或单细胞FACS分选连续亚克隆。扩增获得的克隆群体，冷冻保存在冷冻介质(90％FBS，10％DMSO)中，并储存于液氮中。
ELISA分析证实，从这些杂交瘤的大部分或全部纯化的抗体以浓度依赖的方式结合Notum。应当指出，Notum直接结合至ELISA板可以导致蛋白的变性，并且表观结合亲和力不能反映与未变性蛋白的结合。
进行两次融合，将每次融合物接种在20块板(1920孔/融合)中。这产生几十种对人Notum特异性的鼠抗体。
实施例10
Notum调节剂的表征
如下表征在前述实施例中产生的Notum调节剂：
使用抗体捕获Biacore技术评价抗体的结合特征。对于选择的抗体测定解离常数值Kd (koff/kon )。Biacore 3000 (GE Healthcare)生物传感器用于表面等离子体共振(SPR)动力学测量。使用纯化的抗体，通过在传感器表面上捕获抗体衍生定量的koff常数。使用标准胺偶联化学将抗小鼠IgG固定在传感器芯片的CM5表面。将每种mAb捕获至抗IgG表面上，然后将抗原注射至固定的抗体上，允许分析抗体-抗原相互作用。
使用抗Notum抗体的Biacore分析获得的定量Kd值揭示了数种单克隆抗体具有非常高的亲和力，Kd测量值范围为1×10 − 7M至7×10 − 10M。
实施例11
Notum调节剂的表位确定
通过引用并入本文的Jia等人, 2004, PMID:15183088描述了多重竞争抗体分级。将多重Luminex珠粒与抗小鼠IgG偶联以捕获参考mAb。每个珠粒具有独特的光谱编码，使得每个mAb与独特的光谱地址相关。将所有mAb珠粒复合物合并为母液混合物，并等分进96孔微量滴度板的各个孔中。每个孔中参考抗体-珠粒复合物的母液混合物首先与抗原孵育，然后与探针mAb孵育，每个孔具有一个不同的探针mAb。竞争抗体分级测定中的抗原是重组Notum-His。探针mAb仅结合已经被识别不同表位的参考mAb的捕获的抗原。信号在Luminex 100上被阅读为RFU。该实验显示，筛选的抗体结合Notum蛋白上的至少四个不同的表位。
实施例12
Notum调节剂的测序
基于上述内容，选择以显然高亲和力结合固定的人Notum的多种示例性的不同的单克隆抗体。如图7A和7B中的表格形式所示，来自实施例9的编码mAb的DNA的序列分析证实，许多具有独特的VDJ重排并显示新的互补决定区。注意，根据同上的Chothia等人定义图7B中所述的互补决定区
为了开始测序，从Invitrogen (Life Technologies)购买TRIZOL试剂。从Qiagen, Inc.购买一步RT PCR试剂盒和QIAquick PCR纯化试剂盒，RNasin购自Promega。从Integrated DNA Technologies购买定制的寡核苷酸。
将杂交细胞裂解在TRIZOL试剂中用于制备RNA。104 μL和105之间的细胞重悬浮于1ml TRIZOL中。将管剧烈振摇，然后加入200μl氯仿。在4℃将样品离心10分钟。将水相转移至新的微量离心管中，并加入等体积的异丙醇。将管剧烈振摇，并允许在室温下孵育10分钟。然后在4℃将样品离心10分钟。沉淀用1 ml 70%乙醇洗涤一次，并在室温短暂干燥。用40 μl DEPC-处理水重悬浮RNA沉淀。通过在1％琼脂糖凝胶中分离3μL而测定RNA制备物的质量。将RNA储存-80℃冰箱中，直至使用。
使用可变结构域引物的混合物获得用对于鼠免疫球蛋白重链和κ轻链特异性的共有引物组扩增的杂交瘤的可变DNA序列。使用一步RT-PCR试剂盒从每份RNA样品扩增VH和VK基因区段。Qiagen一步RT-PCR试剂盒提供了Sensiscript和Omniscript逆转录酶、HotStarTaq DNA聚合酶、Qiagen一步RT-PCR缓冲液、dNTP混合物和Q溶液(一种帮助有效扩增“困难”(例如，富含GC)模板的新的添加剂)的混合物。
制备反应混合物，其包括3 μL RNA、0.5的100 μM重链或κ轻链引物、5 μL 5× RT-PCR缓冲液、1 μL dNTP、1 μL含有逆转录酶和DNA聚合酶的酶混合物和0.4 μL核糖核酸酶抑制剂RNasin (1单位)。反应混合物含有对于逆转录和PCR所需的所有试剂。热循环仪程序为RT步骤50℃持续30分钟，95℃持续15分钟，随后为30个循环的(95℃持续30秒，48℃持续30秒，72℃持续1.0分钟)。然后是在72℃最终孵育10分钟。
为了制备用于直接DNA测序的PCR产物，它们根据制造商的方案使用QIAquick™ PCR纯化试剂盒进行纯化。所述DNA使用50 μL无菌水从离心柱洗脱，然后从两条链直接测序。PCR片段直接测序，DNA序列使用VBASE2分析(Retter等人，Nucleic Acid Res.33; 671-674, 2005)。
如上所讨论的，二十四(24)种示例性抗体重和轻链可变区的氨基酸和核酸序列分别描述在图8A - 8X(SEQ ID NO:3-98)中，而这些和额外的抗-hNotum抗体的基因排列和衍生的CDR(如上文的Chothia等人所定义)分别以表格形式描述于图7A和图7B(SEQ ID NO：103-330)中。
实施例13
包含点突变的Notum调节剂的构建
如前面所讨论的，Notum是酶的α/β水解酶超家族的成员。Notum的序列分析鉴定了在Gly230开始的GXSXG的标识催化性肘序列(elbow sequence)，其Ser232可能是该超家族特征性的亲核体、酸性残基和组氨酸的催化三联体的推定亲核残基​​。果蝇(S237A，Kreuger, 2004, PMID:15469839)和鼠(S239A，同上的Traister, 2008)形式中直向同源残基的位点定向诱变导致无活性蛋白；因此，使用标准分子生物学技术(快速改变诱变试剂盒，Stratagene/Agilent, Inc.)来进行野生型人Notum蛋白上的位点定向诱变以便在蛋白的His标签版本中生成S232A突变(即，hNotum-S232A-His)。同样地，序列比对提示，人D340是催化性酸性残基；因此，使用相同试剂盒改变该残基以生成分子的D340A突变版本。如实施例7和8中所述，使用PCR克隆来将含有该突变的Notum结构域克隆进人Notum-hFc表达载体中(即hNotum-S232A-hFc)。然后如上所述表达并纯化构建体。
实施例14
Notum调节剂改变Wnt3A典型信号传递
已经显示果蝇Notum是Wingless信号传递的功能性拮抗剂，而已经显示鼠Notum在瞬时转染测定中拮抗β-联蛋白荧光素酶报道分子的诱导。
为了生成含有用于活化典型Wnt信号传递的报道分子的细胞的稳定群体，用慢病毒载体pGreenFire1-TCF (System Biosciences)转导HEK 293T细胞，所述载体编码在用于TCF的转录响应元件的4个串联重复连接的最小CMV报道分子控制下的双功能GFP和荧光素酶报道分子盒。被称为293.TCF细胞的转导的细胞群体随后用于如下Wnt3A典型信号传递测定中：在96孔组织培养板的每孔中将2.5 x 104 293.TCF细胞铺板在50μL无血清DME培养基中。血清饥饿24小时后，将25 μL来自L/Wnt3A细胞(ATCC CRL-2647; Willert, 2003)的条件培养基(CM)的各种稀释液或来自亲本L-细胞(ATCC CRL-2648)的未稀释的CM连同25 μL DMEM +0.2% FBS加入每个孔中。添加CM 后18小时，将100 μL One-Glo溶液(ProMega Corp.) 加入每个孔中。然后将每个孔中的内容物充分混合以裂解细胞，将100μL裂解物转移至黑色96孔板，并在5 min后使用Wallac Victor3多标记计数器(Perkin-Elmer Corp)读取每个孔中的发光。如在图9A中可见，相对于暴露于L-细胞对照CM的细胞，暴露于不同浓度的含有Wnt3A的CM 的细胞通常显示出荧光素酶信号的2至4倍诱导。更具体地，当Wnt3A+ CM培养基从25％向下稀释至约3％时，Wnt通路的活化随着发光的相应减少而降低。
一旦建立荧光素酶报道系统，如下进行用于测定各种Notum调节剂的生物活性的测定。在96孔组织培养板的每孔中将2.5 x 104 293.TCF细胞铺板在50μL无血清培养基中。血清饥饿23小时后，将25 μL含有各种浓度的各种Notum调节剂(例如，根据上述实施例7、8和13获得的hNotum-His、hNotum-hFc、hNotum-S232A-His、鼠Notum-His、鼠Notum-hFc、猕猴Notum-hFc、对照蛋白-His或对照蛋白-hFc)的DMEM+0.2% FBS加入细胞。1小时后，将25μL Wnt3A或对照L-细胞CM加入每个孔中。加入CM后18小时，将100 μL One-Glo溶液(ProMega Corp.)加入每个孔中，充分混合每个孔的内容物以裂解细胞，将100μL裂解物转移至黑色96孔板，并在5分钟后读取发光。
如图9B、9C和9D中可见，人Notum-His、人Notum-hFc、鼠Notum-His、鼠Notum-hFc和猕猴Notum-hFc在293.TCF细胞中都功能性拮抗Wnt3A介导的荧光素酶的诱导，而来自实施例13的人-NOTUM S232A突变体(His和HFc)和对照-His和对照-hFc蛋白在293.TCF细胞中没有拮抗Wnt3A介导的荧光素酶的诱导。
除显示开发用于表征本发明的化合物的功能性测定以外，图9B - 9D显示，根据本文的教导，可溶性His标签的Notum构建体和Fc-Notum融合蛋白有效地作为Notum调节剂起作用。更具体地，图9B显示hNotum-Fc和hNotum-His调节剂对Wnt通路的浓度依赖性影响，正如荧光素酶活性的降低所显示的，其中计算的IC50分别为0.4702和0.5031。图9C中验证了这些结果，其图示地说明，Notum-hFc和Notum-His调节剂以浓度依赖的方式拮抗Wnt3A 通路，而实施例13的突变型Notum调节剂则没有。类似地，图9D显示，鼠Notum调节剂(His和Fc)和猕猴Notum-hFc也以浓度依赖的方式拮抗Wnt3A典型通路。上述数据验证了Notum / Wnt生物测定，并显示包含Notum细胞外结构域的至少一部分的各种可溶性Notum构建体可以拮抗Wnt通路。
实施例15
Notum调节剂在体外中和Notum活性
使用上述293.TCF细胞，如下对于其中和hNotum-His或hNotum-Fc活性的能力筛选通过ELISA测定(实施例9)显示结合Notum的来自杂交瘤的上清液和/或纯化的抗体。在96孔组织培养板的每孔中将2.5 x 104 293.TCF细胞铺板在50μL无血清培养基中。血清饥饿23小时后，将10μL含有各种浓度的各种Notum蛋白的DMEM+0.2% FBS与15 μL来自杂交瘤的上清液和/或15 μL各种浓度的纯化的抗体混合，并允许在室温孵育5分钟。然后将25 μL抗体：Notum混合物加至293.TCF细胞。1小时后，将25μL Wnt3A或对照L-细胞CM加入每个孔中。添加CM 后18小时，将100 μL One-Glo溶液(ProMega Corp.) 加入每个孔中。然后将每个孔中的内容物充分混合以裂解细胞，将100μL裂解物转移至黑色96孔板，并在5分钟后读取发光。为了分析抗体活性，绘制RAW荧光素酶RLU，或将数据进行均一化，以设置在1的Wnt3A CM 活性和在零的L-细胞对照培养基(图示为均一化的Wnt3-诱导的荧光素酶活性)，或者均一化以设置在1的Wnt3A CM活性和为零的最大Notum拮抗剂活性的荧光素酶信号(图示为％中和活性)。
如图10中可见，数种抗体当以10 μg/mL的浓度添加时能够抑制Notum活性。此外，选择的Notum调节剂(例如，SC2.A106 [又名10B3]和SC2.D2.2)被证明是特别有效的，并在相同浓度显示大于80％的Notum抑制。进一步表征抗体SC2.D2.2以表明其在293.TCF荧光素酶诱导测定中抑制人Notum的活性的能力，其将荧光素酶信号恢复至接近于阴性对照相同的水平(图11A)。更具体地，图11A显示，SC2.D2.2上清液和纯化的抗体以浓度依赖的方式起作用以拮抗添加的hNotum-His的效果。图11B和11C中进一步说明了该效果，其中分别针对各种浓度的Notum-His(图11B)和Notum-HFc(图11C)滴定SC2.D2.2纯化的抗体。在每个图中获得的曲线中的拐点验证了抗体的调节活性以浓度依赖的方式起作用以相对于绝对量的可溶性Notum拮抗Notum活性。此外，如在图11D中可见，第二种Notum调节剂SC2.A106也能够抑制人Notum-His的活性，尽管显然没有和SC2.D2.2相同的程度。综上所述，这些结果显示，本文公开的Notum调节剂提供了有效的中和候选，并且强烈表明这样的化合物降低肿瘤起始细胞频率的用途。
实施例16
Notum调节剂的ELISA表征
抗体显示的高度特异性往往导致针对抗原直向同源物的不同效力，这可以影响这些分子在不同动物疾病模型中的功效。为了研究Notum的结构-功能关系，克隆了编码人、猕猴和小鼠的Notum蛋白 (实施例7和8)的cDNA序列。来自这些动物的Notum蛋白的推导的氨基酸序列显示出高度同源性，这解释了已经在许多物种中观察到的生物学和免疫学交叉反应性。如前面所讨论的，人Notum与猴Notum97％相同，与小鼠Notum 91％相同。存在如下的完全保守：(1)二硫键(在成熟人Notum序列中的16个Cys残基在小鼠Notum序列中是保守的)(2)N-糖基化位点；和(3)基于共有酶促活性的预测的活性结构域。大部分氨基酸替换是保守的。人和小鼠序列的N-末端部分显示最大的变异，具有数个氨基酸取代、缺失、和/或插入(图1C)。
根据实施例9，使用人Notum抗原构建体来免疫小鼠并产生调节剂。在人和小鼠Notum蛋白之间具有91％序列同源性的情况下，预计这些抗体的大部分与小鼠Notum蛋白交叉反应。
使用ELISA测定测试选择的杂交瘤衍生的小鼠mAb与从人和小鼠Notum cDNA的瞬时转染生成的纯化的Notum抗原的结合。用本领域公认的技术使用人和小鼠Notum来直接包被ELISA板。用HRP缀合的山羊抗小鼠抗体和随后的比色的辣根过氧化物酶底物(TMB底物，Thermo Scientific)检测小鼠mAb的结合。在酶标仪上在450nm处测量ELISA板的每个孔的吸光度。
如正下方表1中所见，测试的46种抗体中的22种对人Notum是特异性的：
表 1
实施例17
SC2.D2.2 Notum调节剂的表位作图
为了更好地理解SC2.D2.2与人Notum相互作用的结构基础，构建了嵌合Notum蛋白。该方法使用直向同源物结构相关这一事实。为此，生成由与小鼠Notum(小鼠残基150-484)融合的人成熟Notum蛋白的N末端(残基19-144)构成的嵌合Notum分子(基因都与实施例7一致)，并以与前述实施例中所述相同的方式表达。人Notum基因中的BamHI限制性切割位点用于构建符合读框融合体Notum嵌合蛋白。然后构建含有His标签的嵌合Notum序列的表达载体。测试嵌合Notum分子，发现其在上述Wnt生物测定中在功能上是有活性的(参见下面的实施例27)。
使用ELISA测定以直接包被在ELISA板上的人Notum、小鼠Notum和嵌合人/小鼠Notum测试SC2.D2.2和其他小鼠mAb与从人和小鼠Notum cDNA的瞬时转染生成的纯化的Notum分子的结合。用HRP缀合的山羊抗小鼠抗体和随后的比色的辣根过氧化物酶底物(TMB底物 Thermo Scientific)检测抗Notum mAb的结合。在自动酶标仪上在450nm处测量ELISA板的每个孔的吸光度。
上述ELISA测定证实了SC2.D2.2抗体与人Notum和与Notum嵌合蛋白的结合，证实了SC2.D2.2表位在人Notum蛋白的N末端的前135残基内。
实施例18
Notum调节剂显示差异物种活性
使用293.TCF细胞，如下对于其中和鼠Notum-His或猕猴Notum-Fc活性的能力测试纯化的SC2.D2.2和SC2.A106抗体。在96孔组织培养板的每孔中将2.5 x 104 293.TCF细胞铺板在50μL无血清培养基中。血清饥饿23小时后，将10μL含有各种浓度的Notum蛋白的DMEM+0.2% FBS与15 μL各种浓度的纯化的抗体混合，并允许在室温孵育5分钟。然后将25 μL抗体/Notum混合物加至293.TCF细胞。1小时后，将25μL Wnt3A或对照L-细胞CM加入每个孔中。添加CM 后18小时，将100 μL One-Glo溶液(ProMega Corp.) 加入每个孔中。将每个孔中的内容物充分混合以裂解细胞，将100μL裂解物转移至黑色96孔板，并在5分钟后读取发光。
除了不如实施例16中所见与鼠Notum交叉反应之外，SC2.D2.2没有抑制鼠Notum或猕猴Notum的活性(图12A)。类似地，抗体SC2.A106没有抑制鼠或猕猴Notum的活性(图12B)，尽管显示出实施例16中的与鼠Notum的交叉反应性。
根据实施例17中的ELISA数据(其表明表位在成熟Notum蛋白的N-末端的前135个氨基酸残基中，并且SC2.D2.2不能抑制猕猴Notum的功能或结合鼠Notum或抑制鼠Notum的功能)，SC2.D2.2的结合可能干扰Asn129(从成熟Notum蛋白的开始处编号)活性。参见图1C中的序列比对。换言之，因为猕猴和人Notum的相关部分中唯一的氨基酸差异在Asn129，强烈提示通过直接闭塞(即表位包含表位)或构象变化或空间位阻而干扰该位点。
实施例19
在共培养测定中Notum调节剂降低Wnt通路的Notum拮抗
为了更密切模拟Notum产生细胞在体内的行为，进行共培养实验，其中将效应细胞、或亲本293T细胞(293.null)或表达可溶性Notum的293T细胞(即293.Notum细胞)，以不同比例与报道293.TCF细胞混合。然后在用Wnt3A CM处理后从这些细胞混合物测定在抗体存在下的Notum活性或抑制。简而言之，通过在铺板前在每孔50 μL无血清培养基中混合细胞而测试三种不同比例的效应细胞与报道细胞：2:1、1:1和1:2.5，对应于5 x 104：2.5 x 104、2.5 x 104：2.5 x 104细胞或2.5 x 104:1.0 x 104细胞/96孔板的每孔。
对于直接共培养试验，血清饥饿23小时后，将25 μL Wnt3A或对照L-细胞CM连同25 μL DMEM + 0.2% FBS/孔加入每个孔至100μL的最终体积。添加CM 后18小时，将100 μL One-Glo溶液(ProMega Corp.) 加入每个孔中。然后将每个孔中的内容物充分混合以裂解细胞，将100μL裂解物转移至黑色96孔板，并在5分钟后读取发光。
如在图 13A中可见，在所有情况下，在所有比例时，和与亲本293T效应细胞共培养相比，与分泌Notum的效应细胞的共培养导致更低水平的Wnt3A诱导的荧光素酶活性。有趣的是，随着每孔的细胞总数的降低，荧光素酶活性的总诱导增加，提示培养基耗竭效应或可能由于从亲本293细胞本身分泌的低水平Notum导致的效应。
对于抗体拮抗实验，将细胞混合物铺进含有25 μL DMEM + 0.2% FBS和终浓度为10μg/ mL的抗体的孔中。铺板后23小时，将25μL Wnt3A或对照L-细胞CM加入每个孔中。添加CM 后18小时，将100 μL One-Glo溶液(ProMega Corp.) 加入每个孔中。然后将每个孔中的内容物充分混合以裂解细胞，将100μL裂解物转移至黑色96孔板，并在5分钟后读取发光。
如在图13B中所见，将SC2.D2.2加入293.null和293.TCF细胞的共培养物对Wnt3A CM对荧光素酶活性的诱导具有很小的影响。在293.Notum加入293.TCF细胞共培养的情况下，加入SC2.D2.2抗体增加了Wnt3A诱导的荧光素酶的量，这与抗体抑制Notum从293-Notum细胞分泌并且阻断其对293.TCF细胞的旁分泌效应相一致。在更接近模拟体内条件(例如，Notum的自分泌或旁分泌作用)的实验系统中的这样的结果提示，本文公开的Notum调节剂在动物中可以有效影响Notum介导的事件。
实施例20
细胞裂解物中Notum蛋白的检测
在通过Western 印迹和可能的免疫组织化学鉴定检测蛋白表达的小鼠单克隆抗体的尝试中，使用本领域的标准技术在变性条件下在NuPAGE 4-12% Bis-tris凝胶(Life Technologies)上运行来自四种不同细胞系(HepG2、SW480、K562和CHO)的蛋白细胞裂解物。然后根据生产商的方案使用iBlot®干印迹系统(Life Technologies)将蛋白转移至PVDF膜，并且用PBST中3％BSA将膜封闭2小时。用1 μg/mL鼠多克隆、或两种鼠单克隆抗体之一(SC2.A101或SC2.A109)探测膜并在PBST中洗涤3次且在封闭、一级抗体和二级抗体孵育之间间隔10分钟后，以在封闭缓冲液中1:5000的稀释度用AP-AffiniPure山羊抗小鼠IgG, Fcγ Frag特异性(Jackson ImmunoResearch)检测Notum。然后使用NBT/BCIP底物(即用，用于碱性磷酸酶的沉淀底物系统)检测Notum。该底物系统产生不溶性硝基蓝二甲四唑(NBT diformazan)最终产物，其颜色为蓝色至紫色，可以视觉观察。
用于探测细胞裂解物的每种抗体都在SW480裂解物中检测到人Notum，其大小似乎是作为单体的 ~50kDa和作为多聚体的~125 kDa(图14A-14B)。当用所有三种抗体探测时，还观察到~60 kDa的范围中稍大的条带，可能代表未二聚化的糖形式。
实施例21
在各种合并的组织裂解物中的差异Notum蛋白表达
记录如前面实施例证明的在许多肿瘤发生样品中增强的Notum基因表达后，进行包括反相蛋白验证阵列，其包含来自11种不同肿瘤类型或它们各自正常邻近组织的裂解物的两个合并重复(实施例6，OriGene Technologies)，其中使用小鼠多克隆抗体检测Notum蛋白表达。使用通过Western印迹识别人Notum的SCRx2.A109小鼠单克隆抗体，获得并进行包含来自11种肿瘤类型或它们各自正常邻近组织的432份组织裂解物的4种稀释物连同有或没有如外源启动子(OriGene Technologies)所驱动的TP53过表达的293细胞的对照。比色检测试剂和方案由ProteoScan阵列(OriGene Technologies)的制造商所提供，并使用平板扫描仪和BZScan2 java软件(http://tagc.univ-mrs.fr/ComputationalBiology/bzscan/)将制造的阵列上的点转换为数字图像以定量点强度。数据如上所述生成，并表示为每个斑点的平均像素强度。绘制的数据代表每个组织标本的个别点密度，以线代表几何平均值。
来自这些阵列的结果显示于图15A-15G中，并表明在数个不同肿瘤类型(包括癌症患者的特定亚群)中Notum蛋白的表达上调。更具体地，图15A-15G显示患有除黑色素瘤以外的乳腺癌、结肠直肠癌和卵巢癌的患者亚组中人Notum蛋白表达水平升高。此外，Notum蛋白表达似乎在患有胰腺癌的神经内分泌亚型的大部分患者中升高(图15B)。在癌症患者、特别是患有晚期结肠直肠癌和胰腺神经内分泌亚型(胰岛细胞瘤)疾病的患者的各种亚组中升高的Notum蛋白表达提示Notum在这些肿瘤类型中促进进展的疾病和/或转移中的作用。
还有图15F和15G中的结果显示的是在肾脏和肝脏肿瘤中Notum蛋白表达的明显降低。该降低在疾病的更晚期(除IV期肝癌以外)一般更大，并提示降低的局部Notum水平可能在肿瘤发生和肿瘤进展中发挥作用。尽管胆管癌肿瘤具有较少Notum(图15G)，但是胆管癌是胆管癌症，并且在ProteoScan阵列上没有正常胆管组织用于比较。
实施例22
Notum调节剂拮抗Notum诱导的细胞生存/增殖
如实施例2和3中所述，表明Notum表达在来自结肠直肠肿瘤的肿瘤永生细胞中升高。为了确定Notum蛋白是否影响人结肠直肠癌细胞的细胞增殖和/或凋亡，将HCT-116细胞或小鼠谱系耗竭的NTX肿瘤细胞(即人肿瘤细胞)如下铺板，并暴露于重组hNotum(例如hNotum-His或hNotum-hFc)和抗Notum抗体。然后12-14天后评价细胞数量。
更具体地，将来自SCRx-CR4或SCRx-CR42肿瘤的小鼠谱系耗竭的NTX肿瘤细胞以20,000个细胞/孔铺板在无血清培养基中，所述无血清培养基以前已经证明在体外维持肿瘤发生细胞，随后24小时后，在Notum调节剂SC2.D2.2或SC2.10B，或同种型对照抗体(即MOPC)存在或不存在的情况下加入重组人Notum(His或hFc)。然后细胞在37℃、5% CO2和5% O2时孵育14天，并根据制造商说明书使用Promega’s CellTiterGlo测定试剂盒评价活细胞的数量。对于HCT-116细胞系(商业上获得的结肠直肠肿瘤细胞系)，将细胞以2,000个细胞/孔铺板于DMEM + 1% FBS中，随后24小时后，在单克隆抗体SC2.D2.2或SC2.10B3存在或不存在的情况下加入含有重组人Notum的无血清DMEM。然后HCT-116细胞在37℃、5% CO2时孵育12天，并使用Promega’s CellTiterGlo测定试剂盒评价细胞活力。更高的读数指示更高的活细胞计数。
来自患者SCRx-CR42的小鼠谱系耗竭的NTX肿瘤细胞的hNotum-His (10 μg/mL)暴露(图16A)或SCRx-CR4的hNotum- Fc (1或10 μg/mL)暴露(图16B)导致与其他未处理的对照或暴露于MOPC同种型对照抗体的细胞相比细胞计数的20-45％增加。相反，与适当MOPC同种型对照抗体处理的细胞相比，将SCRx-CR4细胞(表达升高水平的Notum基因)暴露于人Notum中和抗体SC2.D2.2 (10 μg/mL)显示出显著更低的增殖(图16B)。类似地，抗Notum抗体SC2.10B3 (10 μg/mL)也能够负面影响细胞数量，虽然不完全和SC2.D2.2一样有效(图16B)。验证刚刚上面做出的观察结果，将HCT-116细胞暴露于10 μg/mL hNotum导致细胞数量的多于2倍增加。显著的是，通过抗Notum单克隆抗体SC2.D2.2的存在阻断由hNotum暴露导致的细胞数量的增加，这似乎是剂量依赖的(图16C)。这些观察结果表明，人Notum蛋白(例如，His或hFc形式)可以增加细胞增殖和/或损害凋亡，导致上述测定中更高的细胞计数。此外，根据本文的教导，hNotum中和性单克隆抗体SC2.D2.2能够阻断该活性并损害Notum介导的增殖。
实施例23
Notum调节剂拮抗Notum诱导的酯酶活性
除在动物物种间发现的其直向同源物以外，人Notum与植物果胶乙酰酯酶是最密切相关的。它也是α/β水解酶超家族的成员。这些关系提示该酶可能的生物化学功能。
为了测试Notum是否具有羧基酯酶活性，使用标准测定条件(West等人，PMID：19225166)将纯化的重组hNotum-His与生色酯酶底物乙酸对硝基苯酯(PNPA)和丁酸对硝基苯酯(PNPB)孵育。简而言之，将PNPA或PNPB溶解/稀释在异丙醇中至终浓度为10mM。将这些底物溶液1:10稀释在测定缓冲液(0.1％阿拉伯胶，2.3 mg/mL脱氧胆酸钠，1X PBS)中并与确定量的hNotum酶孵育，并通过405nm处的吸光度测量值监测生色团对硝基苯酚的酶促释放。
如图17A中所见，在37℃孵育1小时后，渐增量的hNotum从PNBA释放渐增量的对硝基苯酚，表明Notum具有羧基酯酶活性。突变体Notum(S232A)，其中推定的催化性亲核体已经通过位点定向诱变改变，显示出大大降低的酯酶活性。如图17B中所示，鼠和猕猴Notum蛋白也显示酯酶活性。在测定中还包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌的重组酯酶(Sigma-Aldrich)作为阳性对照(图17C)。具体而言，图17C显示，在任何特定时间点，与PNPB底物(空心方形和虚线)相比，hNotum对于从PNPA释放的对硝基苯酚产生更强的信号(实心黑色方形和实线)，而与PNPA(实心圆和实线)相比，芽孢杆菌酯酶似乎优先水解PNPB底物(空心圆和虚线)。该数据表明hNotum能够以可定量的方式诱导酯酶活性。
上面刚刚提供的结果表明，测量的酯酶活性可用于提供一种测定，该测定允许进一步表征公开的Notum调节剂。在这方面，图18A和18B表明，hNotum蛋白与Notum调节剂SC2.D2.2预孵育以及随后加入PNPA和PNBA底物导致酯酶活性大大降低。这与前面实施例中提供的数据完全一致，再次证明了SC2.D2.2抗体中和hNotum酶功能的活性。更具体地，图18A显示了剂量-响应曲线，其中SC2.D2.2的量是固定的(无或10 μg/mL)并且Notum浓度是变化的。如图18A中可见，hNotum水平的增加了测量的酶活性，甚至在存在SC2.D2.2抗体的情况下，在一些程度上增加了测量的酶活性。相反，图18B提供了测量的酶活性的剂量响应曲线，其中hNotum的量被固定在1 μg/mL并且SC2.D2.2的浓度是变化的。获得的曲线清楚地显示，Notum调节剂的存在以浓度依赖的方式急剧降低hNotum酶活性的量。相反，对照抗体(MOPC)对Notum的酯酶活性没有影响(数据未显示)。
本领域技术人员将理解，本实施例证明了另一种测定，所述测定可通过测量公开的Notum调节剂对Notum的酶活性的影响而用来表征公开的Notum调节剂。
实施例24
Notum调节剂拮抗Notum诱导的脂肪酶活性
基于Notum被表征为α/β水解酶超家族的成员和其证明的酯酶活性，假设该蛋白还可以作为脂肪酶起作用。本领域技术人员将理解，可以使用测量Tween 20的脂解的浊度测定测量蛋白的脂肪酶活性(Pratt等人，2000, PMID:10706660)。因此，进行了实验，所述实验包括脂解Tween 20来测量hNotum的脂肪酶活性，并提供了可用来表征本发明的Notum调节剂的又一种测定。
简而言之，将重组hNotum(1 μg/孔)加入含有50 mM Tris, pH 7.4、33.3 mM CaCl2和0.33% Tween-20的测定缓冲液。当Tween 20单月桂基被脂肪酶(例如hNotum)裂解时，游离脂肪酸与Ca2+阳离子形成不溶性复合物，导致浑浊溶液，其OD可以在405nm处测量以提供脂肪酶活性的量度。作为阳性对照，在相同测定中测量猪胰脂肪酶(Sigma Aldrich)的活性。图19显示纯化的重组Notum能够以剂量依赖性的方式裂解Tween 20，并表明这样的测量值提供了通过其来表征本发明的化合物的另一种方法。
为了使用这种酶特性并进一步举例说明本发明的特性，运行测定以确定Notum调节剂对Notum的脂解活性的影响。为此，将各种浓度的SC2.D2.2与hNotum预孵育设定期间，然后将该混合物加入测定缓冲液并如上所述测量获得的酶活性。测定的结果图示表示在图20中
获得的曲线清楚地显示，几乎所有浓度的Notum调节剂SC2.D2.2基本上消除了Notum的脂肪酶活性，而没有严重影响猪酶阳性对照的脂肪酶活性。此外，图20显示阴性对照抗体(MOPC)没有抑制Notum或猪胰脂肪酶的脂肪酶活性。
这样的结果清楚地说明了公开的Notum调节剂干扰或破坏Notum蛋白的酶特性并可能影响其在生理设置中固有的肿瘤发生潜能。
实施例25
Notum水解酶活性的荧光测定和包含点突变的Notum调节剂中的活性损失
除实施例23和24中所述的测定以外，荧光酯酶底物4-甲基伞形酮庚酯(Sigma)可用于使用标准测定条件测量水解酶的活性(Richardson和Smith, 2007, PMID:17620441; Jack和Kircher, 1967, PMID:5582971)。简而言之，将4-MUH溶解于DMSO中至终浓度为1.2 mM。将该底物1:10稀释在测定缓冲液(0.1M Tris, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05% Brij)中并与确定量的Notum酶或点突变的Notum酶孵育，并使用Wallac Victor3多标记计数器(Perkin Elmer)监测荧光分子4-甲基伞形酮的酶促释放。
图21A显示，渐增量的野生型人Notum酶可以以剂量依赖的方式抑制293.TCF细胞对Wnt3A的应答(在实施例14中详细描述的测定)。然而，点突变S232A和D340A在293.TCF细胞中没有显示拮抗Wnt3A的活性的能力。类似地，正如相对荧光信号随时间的线性增加所证明的，野生型人Notum(62.5 ng/每个反应)能够水解4-MUH底物，而S232A和D340A点突变没有显示水解4-MUH底物的能力(图21B)。
实施例26
Notum在典型Wnt通路中Gsk3上游的步骤起作用
典型(如LEF / TCF)信号传递通路的简化表示表示在图22中。通常，β-联蛋白(CTNNB1)在(1)当它是细胞中AXIN/APC/GSK3破坏复合物的部分时其被GSK3(和图22中未描述的其他激酶)磷酸化和(2)随后的泛素化之后被迅速移交至细胞的细胞质中的蛋白酶体。Wnt分子与它们的受体Fzd的结合促进Dsh的磷酸化，其从复合物招募Axin并导致β-联蛋白从破坏复合物的释放。这允许β联蛋白转位至细胞核，在细胞核内它与LEF/TCF转录因子复合以激活Wnt应答基因。LiCl是GSK3的小分子抑制剂(Klein和Melton, 1996, PMID:8710892)，其在典型Wnt信号传递通路的背景中通过促进β-联蛋白稳定和释放而导致Wnt应答基因的下游活化。
如在图23中可见，Wnt3A CM和LiCl (40 mM)在293.TCF细胞中都激活荧光素酶转录。人Notum拮抗Wnt3A CM，而SC2.D2.2单独不抑制由于Wnt3A CM导致的荧光素酶的诱导。然而，SC2.D2.2可以以剂量依赖的方式抑制人Notum的活性，导致恢复Wnt3A诱导的荧光素酶表达。最重要的是，LiCl能够激活荧光素酶报道分子，而不依赖于人NOTUM和/或SC2.D2.2的存在，表明Notum和调节性抗体产生其GSK3上游效果。
实施例27
SC2.D2.2表位中与其生物活性相关的关键残基的描述
将实施例17中描述的嵌合人/鼠Notum蛋白置于293.TCF测定中。图24A显示嵌合分子能够抑制Wnt3A CM介导的荧光素酶的诱导，尽管其具有比野生型蛋白更低的功效。图24B显示该活性可以用 SC2.D2.2中和，表明SC2.D2.2的表位包含在Notum的前144个残基内，这与实施例17中提供的ELISA数据一致。综上所述，SC2.D2.2中和嵌合分子的生物活性的能力，如实施例18中所示的SC2.D2.2针对Notum的各种物种形式的活性数据和图1C所示的序列比对提示，人Notum的D141残基可能是SC2.D2.2的表位中的关键残基。(注意，图1C基于从成熟Notum蛋白的开始编号将该残基注释为D129，而D141注释是基于野生型人蛋白前体的考虑)。
为了形式上证明表位中该残基的重要性，采用标准分子生物学技术以便将人Notum中的该残基点突变为猕猴(D141N)或鼠(D141S)残基。类似地，将该位置处的猕猴残基点突变为人残基(N141D)。图25显示，这些点突变中的每一个产生在293.TCF测定(图25A)和4-MUH水解测定(图25B)中保留生物活性的蛋白。然而，这些点突变体在它们被SC2.D2.2中和的能力中不同(图26)。将人残基突变为猕猴或鼠残基消除了SC2.D2.2中和突变型Notum蛋白的能力(图26A)，而将猕猴蛋白残基变为人残基(N141D)现在使SC2.D2 0.2中和突变型蛋白成为可能(图26A)，尽管不能中和野生型猕猴蛋白(图12A)。在4-MUH测定中对于突变蛋白也观察到这种SC2.D2.2中和行为的模式(图26B)： 人D141残基的改变消除了SC2.D2.2中和获得的蛋白(D141N、D141S)的能力，而猕猴残基N141的改变使抗体中和突变型蛋白(猕猴N141D)成为可能。这些数据清楚地证明D141残基对于SC2.D2.2中和Notum蛋白的生物活性的能力的重要性。
实施例28
Notum与rhWnt3A的孵育导致Wnt活性的失活
为了确定Wnt3a信号传递的Notum介导的拮抗的动力学，重组Notum单独或在SC2.D2.2存在的情况下与重组人Wnt3A(rhWnt3A)在 37°C预孵育2小时，然后将复合物加入293.TCF细胞。将该获得rhWnt3A对荧光素酶的诱导与使用293.TCF测定的标准方案(其中将Notum单独或Notum + SC2.D2.2加入细胞2小时，随后加入rhWnt3A)观察的进行比较。如在图27A中可见，标准测定条件显示在SC2.D2.2不存在的情况下Notum能够在暴露于250 ng/mL rhWnt3A的293.TCF细胞中抑制荧光素酶的诱导(封闭圆)，并且Notum与10 μg/mL SC2.D2.2孵育以及随后加入rhWnt3A阻断了Notum拮抗rhWnt3A的能力(空心圆)。然而，感兴趣的是Notum和rhWnt3A预孵育以及然后加入293.TCF细胞。在该情况下，细胞对rhWnt3A的应答大大降低(实心圆 图27B)。相比之下，Notum与SC2.D2.2复合以及然后与rhWnt3A预孵育恢复了细胞对rhWnt3A的敏感性(空心方形图27B)。综上所述，这些数据提示，Notum可以直接使rhWnt3A失活，这和在细胞表面存在的情况下与分子的相互作用相反。
实施例29
Notum活性的小分子抑制
实施例23、24和25中所示的研究表明，N​​otum具有水解酯和脂质的能力，而实施例2​​8中提供的数据提示，其可直接作用于rhWnt3A。与对于Notum的推定水解酶活性一致，可以假设该失活与Notum使Wnt3A脱脂的能力相关。已知两种脂质连接至Wnt3a，在Cys77处饱和的棕榈酸酯链和在S209处不饱和的棕榈油酰链(palmitoleoylic chain)(Lorenowicz和Korswagen, 2009, PMID:19559695)。已经提示两种脂质链对于分泌Wnt3A和信号传递都是重要的(Franch-Marro等人，2008, PMID:18430784)。因为棕榈酸酯经由Cys77处的硫酯键连接至Wnt3A，这提示，Notum可以被硫酯酶酶的已知抑制剂所失活。一种这样的小分子是奥利司他(Xenical®)，其已经显示抑制多亚基酶脂肪酸合酶的硫酯酶亚基(Kridel等人，2004, PMID:15026345)。因此，在不同量的4-MUH底物(240μM或90μM)和奥利司他(0-170μM)存在的情况下进行实施例25中所述的4-MUH测定。如在图28中可见，奥利司他以剂量依赖的方式抑制Notum对4MUH的水解活性，证明小分子和已知的脂肪酶抑制药物二者抑制Notum的能力。
实施例30
Wnt3A的生理行为对与Notum孵育应答的变化
如果Notum直接作用于Wnt3A以使蛋白脱脂，这种裂解应该导致蛋白疏水性的变化，这可以通过在Triton X114分配测定(Bordier, 1981, PMID:6257680)中其在水和去污剂相之间的分配行为的变化而测量(Bordier, 1981, PMID:6257680)：将发现脂化的Wnt3A在水相中，而脱脂的Wnt3A应当出现在水相中(Willert等人，2003, PMID:12717451)。为了证明Notum的酶特性，将0.1% BSA中的1.5 μg rhWnt3A(R & D Systems)与250 ng Notum在室温孵育过夜。将等体积的4.5% Triton X114加入混合物，将混合物在冰上孵育5分钟，然后在37℃5分钟，然后在室温使用2000×g离心5分钟而分开相。分离后，调整每份样品以便使离子强度和Triton X114含量均一化，然后通过PAGE电泳分析等分试样。运行凝胶后，将蛋白条带转移至膜用于使用抗rhWnt3A抗体(Cell Signaling Technology)的免疫印迹。使用SuperSignal West Pico化学发光底物(Thermo Fisher Scientific)显现条带。
如图29A中所示印迹中可见，在Notum不存在的情况下，rhWnt3A仅在Triton X114相中出现(泳道6)，而不在水相中出现(泳道5)。相反，rhWnt 3A与Notum的孵育导致在水相(泳道8)以及Triton X114泳道(泳道9)中rhWnt3A的出现。这些数据提示Notum使Wnt3A脱脂的能力。然而，可能这样的脱脂在本实验条件下是不完全的，从而导致观察到的一些rhWnt3A保留在Triton X114相中。
还有趣的是，已经将Notum与果蝇中Sonic hedgehog(SHH)的调节联系起来(Ayers等人，2010, PMID:20412775)。Shh是另一种脂质修饰的蛋白，特别是含有通过成熟蛋白N末端Cys24的α-氨基酯化的棕榈酸链的蛋白(Pepinsky等人，2008, PMID:9593755)。因此，以前所述的Notum与Hedgehog信号传递通路的基因相互作用也可能反映了Hedgehog蛋白的基于脂肪酶的脱脂作用，使它们的信号传递特性失调，具有随之发生的促进肿瘤发生中的影响。
在任何情况下，如图29B中所示，Notum调节剂SC2.D2.2可以阻断证明的Notum改变rhWnt3A的理化行为的能力。泳道1是对于rhWnt3A的阳性分子量标记，而在各自泳道上方注明了每个等分试样中试剂的存在或不存在(其中，a是水相，t是Triton X-114级分，并且滑动条指示notum调节剂的浓度)。再次，未处理的rhWnt3A仅在Triton X114相中出现(泳道3)，但没有在水相中出现(泳道2)。与hNotum-Fc的过夜孵育再次导致rhWnt3A再分布进水相(比较泳道4和5)。如果hNotum-Fc与SC2.D2.2首先孵育，可以阻止这种再分布(分别将泳道6和7与泳道4和5比较)。该阻止作用取决于SC2.D2.2的使用量；更高量的SC2.D2.2导致更多的rhWnt3A被保留在Triton X114相中(比较泳道7和9)。再分布的阻止也取决于Notum调节剂的特异性；如果hNotum-Fc首先与对照单克隆抗体MOPC预孵育，则没有观察到再分布的阻止(泳道10和11)。
实施例31
人、鼠和猴Notum的调节
如上面所证明的，已经显示单克隆抗体SC2.D2.2特异性抑制Notum的人版本，而不抑制蛋白的鼠或猕猴版本。使用上面实施例14中所述的293.TCF测定表征第二种人Notum的单克隆抗体调节剂SC2.D16抑制鼠和猕猴Notum的能力。如图30中所示，SC2.D16以相似功效抑制人和猴Notum，并且针对鼠Notum可能比任一种灵长类动物Notum蛋白稍微更有效。
实施例32
单克隆抗体Notum调节剂的人源化
使用计算机辅助CDR移植方法(Abysis Database, UCL Business Plc.)和标准分子工程改造技术使鼠抗体SC2.D2.2人源化以提供hSC2.D2.2调节剂。基于其与小鼠构架序列及其规范结构的最高的序列同源性选择人可变区的构架区。为了分析的目的，将氨基酸分配至每个CDR结构域是根据Chothia等人编号法。制备数种人源化抗体变体以生成最佳的人源化抗体。还构建包含整个鼠轻和重链可变区和人恒定区的鼠抗体的嵌合版本用于评价的目的。
使用本领域公认的技术进行分子工程改造程序。为此，根据制造商的方案(Trizol® Plus RNA纯化系统，Life Technologies)从SC2.D2.2杂交瘤提取总mRNA。使用包含32种设计针对完整小鼠所有组成成分的小鼠特异性5’前导序列引物的引物混合物与3'小鼠Cγ1引物组合以扩增并测序SC2.D2.2重链的可变区。类似地，使用32种设计用于扩增每个Vk小鼠家族的5' Vk前导序列引物混合物组合对小鼠κ恒定区特异性的单一反向引物以扩增并测序κ轻链。使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从100 ng总RNA扩增VH和VL转录物。
对于SC2.D2.2杂交瘤运行总共8个RT-PCR反应：对于Vκ轻链为4个，对于Vγ重链(γ1)为4个。QIAGEN一步RT-PCR试剂盒用于扩增(Qiagen, Inc.)。使用特异性V区引物直接测序提取的PCR产物。使用IMGT鉴定核苷酸序列以鉴定具有最高序列同源性的种系V、D和J基因成员。使用V-BASE2并通过将VH和VL基因与小鼠种系数据库比对而将衍生的序列与Ig V-和J-区的已知种系DNA序列进行比较。
序列分析： 从核苷酸序列信息获得关于SC2.D2.2的重和轻链的V、D和J基因区段的数据。基于序列数据，设计对SC2.D2.2的Ig VH和VK链的前导序列特异性的新的引物组用于克隆重组小鼠D2单克隆抗体。随后将V-(D)-J序列与小鼠Ig种系序列比对。SC2.D2.2的重链基因被鉴定为IGHV5-17、DQ52a.1和JH1。轻链基因来自V kappa IGKV3-12和Jkappa5种系基因家族。
将获得的重和轻链序列与功能性人可变区序列比对。发现与人VH3-48和VK A19的种系序列的序列同源性分别为81％和62％同一性。将这些种系挑选为用于人源化SC2.D2.2 mAb的人构架。设计编码人源化VL和VH的蛋白序列的核苷酸序列，一般使用在人和小鼠序列中发现的密码子。由Integrated DNA Technologies, Inc合成每个V基因的合成的DNA片段。
在图31A和B中，人源化SC2.D2.2重(图31A)和轻(图31B)链V结构域的序列(上部序列 - SEQ ID NO:331和332)与相应的鼠SC2.D2.2 V结构域(下部序列 - SEQ ID NO:56和58)比对。垂直标记表明在鼠和人源化版本中的氨基酸是相同的。Chothia等人定义的CDR加下划线。一旦生成可变区，产生人源化和嵌合抗体用于进一步表征。
对于抗体产生，进行将鼠和人源化可变基因PCR产物定向克隆进人免疫球蛋白表达载体中。Ig基因特异性PCR中使用的所有引物包括限制性位点(分别地，对于IgH为AgeI和XhoI，对于IgK为XmaI和DraIII，这允许直接克隆进含有人IgG1和IGK恒定区的表达载体中。简而言之，用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Inc.)纯化PCR产物，随后分别用AgeI和XhoI (IgH)、XmaI和DraIII (IgK)消化。纯化消化的PCR产物，然后连接进表达载体中。在具有200U T4-DNA连接酶(New England Biolabs)、7.5 μL消化和纯化的基因特异性PCR产物和25ng线性化载体DNA的10 μL总体积中进行连接反应。用3 μL连接产物经由在42°C的热休克转化感受态大肠杆菌DH10B细菌(Life Technologies)，并铺板在氨苄青霉素板上(100 μg/mL)。然后将VH区的AgeI-EcoRI片段插入pEE6.4HuIgG1表达载体的相同位点，而将合成的XmaI-DraIII VK插入物克隆进各自pEE12.4Hu-κ表达载体的XmaI-DraIII位点。
通过使用293fectin用适当质粒转染HEK 293细胞而生成产生人源化(即hSC2.D2.2)抗体和嵌合SC2.D2.2抗体的细胞。在这方面，用QIAprep离心柱(Qiagen)纯化质粒DNA。将人胚肾(HEK)293T(ATCC No CRL-11268)细胞在标准条件下培养在150mm板(Falcon, Becton Dickinson)中补充10%热灭活FCS、100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素G (所有来自Life Technologies)的Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)中。
对于瞬时转染，细胞生长至80％汇合。将等量IgH和相应IgL链载体DNA(12.5 μg每种载体DNA)加入1.5 mL Opti-MEM中，1.5 mL opti-MEM中具有50 μL HEK 293转染试剂。混合物在室温下孵育30 min，并均匀地分布至培养板。上清液在转染后3天收获，用20 mL补充10% FBS的新鲜DMEM替换并在转染后的6天再次收获。通过在800×g离心10 min而使培养上清液去除细胞碎片而澄清，并储存于4℃。用蛋白G珠粒(GE Healthcare)纯化重组嵌合和人源化抗体。
实施例33
单克隆抗体Notum调节剂的表征
使用三种方法来表征人源化SC2.D2.2相对于其具有鼠可变区的类似mAb的亲和力。首先，在ELISA形式中关于针对抗原的系列稀释液探测的固定量的抗体测量结合信号。测量的信号水平基本上相似(数据未显示)。其次，使用表面等离子体共振(SPR)通过Biacore测量鼠SC2.D2.2的亲和力以提供图32A中所示的结果。基于12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125nM的浓度系列并使用1:1 Langmuir结合模型，评价该抗体与抗原结合的Kd小于0.1nM。对于该相互作用的长解离速率使得难以通过动力学准确测定亲和力。然后使用250、125和62.5nM抗原的浓度系列在ForteBIO RED (ForteBIO, Inc.)上使用生物层干涉分析将鼠抗体与人源化衍生物直接比较。如图32B(鼠可变区)和图32C(人源化可变区)中所见，每种抗体显示优异的亲和力，并产生几乎相同的结合曲线。将被理解的是，曲线的相似性表明，人源化过程没有对衍生抗体的动力学产生不利影响。
实施例34
Notum调节剂可以用作诊断试剂
根据本文的教导，公开的Notum调节剂可以用作诊断试剂来检测来自患者的生物样品中Notum相关的生物标记。
已知Notum在一定程度上是被分泌的，并可能作为细胞外液中的可溶性分子或通过与细胞外基质结合而以对相邻细胞的旁分泌方式起作用。表现这样的特性的Notum在某些疾病状况的体液如血清或血浆中应当是可检测的，并且因此可以用于诊断目的或用作疾病生物标记。为了验证本发明的这个方面，使用如图33A中所示的夹心ELISA形式用抗Notum抗体生成标准曲线。如图33B中所示，然后使用获得的曲线来定量从健康受试者和患有卵巢癌的患者获得的血浆样品中的Notum水平。
更具体地，以50mM碳酸钠缓冲液，pH9.6中2 μg/ml将鼠SC2.D2.2吸附在标准ELISA板上。用含有0.05% (v/v) Tween-20 (PBST)的PBS洗涤板后，在环境温度在含有2% (w/v)牛血清白蛋白(BSA缓冲液)的PBS中封闭板2小时。弹去板的内容物，并将不同浓度的纯化的重组Notum-His(即，提供标准曲线)或在BSA缓冲液中稀释的患者样品加入板，在环境温度持续最少2小时。在PBST中洗涤板，然后加入BSA缓冲液中0.5 μg/ml的与生物素缀合的Notum特异性小鼠多克隆抗体。孵育1小时后，用PBST再次洗涤板，并用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素(Jackson Immuno Research)的1:2000稀释液孵育30分钟。所有板用PBST洗涤两次后，将100 μl TMB底物(Thermo Scientific)加入孔并在暗处孵育30分钟。通过加入100 μl/孔2M硫酸终止显色反应。使用标准酶标仪读取所有孔中在OD 450 nm的吸光度。
使用从图33A中标准曲线外推的值，ELISA夹心形式允许灵敏检测在患者血浆样品中Notum分析物浓度。更具体地，图33B显示来自健康成人(n=12)和和一组疾病阶段2-4的卵巢癌患者(n=7)的血浆样品中推导的Notum分析物浓度。数据显示，健康成人血浆样品中的平均Notum浓度约为8.6 ± 10.3 ng/ml，而卵巢癌患者中Notum浓度似乎显著更高，为36.5 ± 25.2 ng/ml。这些结果清楚地表明，本发明公开的调节剂可以作为用于检测和/或监测肿瘤病症的诊断试剂有效地起作用。
本领域技术人员将进一步理解，本发明可以在不脱离其精神或中心属性的情况下以其他特定形式体现。因为本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，可以考虑在本发明的范围内的其他变型。相应地，本发明并不限于本文中已经详细描述的特定实施方案。相反，应当参照指示本发明的范围和内容的随附的权利要求书。
序列表
<110> STEM CENTRX, LLC
<120> Notum蛋白调节剂和使用方法
<130> 11200.0003-00304
<140>
<141>
<150> 61/510,413
<151> 2011-07-21
<150> 61/388,552
<151> 2010-09-30
<150> 61/380,181
<151> 2010-09-03
<150> 61/377,882
<151> 2010-08-27
<160> 334
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1491
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
atgggccgag gggtgcgcgt gctgctgctg ctgagcctgc tgcactgcgc cgggggcagc 60
gagggcagga agacctggcg gcgccggggt cagcagccgc ctcctccccc gcggaccgag 120
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ggcctggctg actccggctg gttcctggac aacaagcagt atcgccacac agactgcgtc 840
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cagggactgg agcccagtga gctgctgggg atgctgagca acggaagcta g 1491
<210> 2
<211> 496
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Gly Arg Gly Val Arg Val Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu His Cys
1 5 10 15
Ala Gly Gly Ser Glu Gly Arg Lys Thr Trp Arg Arg Arg Gly Gln Gln
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Pro Arg Thr Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gln Pro
35 40 45
Val Glu Ser Phe Pro Leu Asp Phe Thr Ala Val Glu Gly Asn Met Asp
50 55 60
Ser Phe Met Ala Gln Val Lys Ser Leu Ala Gln Ser Leu Tyr Pro Cys
65 70 75 80
Ser Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Arg Leu His Leu Leu Leu Asn
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Glu Ser Arg Gly Ser Arg Arg Trp Leu Leu Phe Leu Glu Gly Gly Trp
115 120 125
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130 135 140
Arg Leu Met Ser Ser Arg Asp Trp Pro Arg Thr Arg Thr Gly Thr Gly
145 150 155 160
Ile Leu Ser Ser Gln Pro Glu Glu Asn Pro Tyr Trp Trp Asn Ala Asn
165 170 175
Met Val Phe Ile Pro Tyr Cys Ser Ser Asp Val Trp Ser Gly Ala Ser
180 185 190
Ser Lys Ser Glu Lys Asn Glu Tyr Ala Phe Met Gly Ala Leu Ile Ile
195 200 205
Gln Glu Val Val Arg Glu Leu Leu Gly Arg Gly Leu Ser Gly Ala Lys
210 215 220
Val Leu Leu Leu Ala Gly Ser Ser Ala Gly Gly Thr Gly Val Leu Leu
225 230 235 240
Asn Val Asp Arg Val Ala Glu Gln Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Pro Ala
245 250 255
Ile Gln Val Arg Gly Leu Ala Asp Ser Gly Trp Phe Leu Asp Asn Lys
260 265 270
Gln Tyr Arg His Thr Asp Cys Val Asp Thr Ile Thr Cys Ala Pro Thr
275 280 285
Glu Ala Ile Arg Arg Gly Ile Arg Tyr Trp Asn Gly Val Val Pro Glu
290 295 300
Arg Cys Arg Arg Gln Phe Gln Glu Gly Glu Glu Trp Asn Cys Phe Phe
305 310 315 320
Gly Tyr Lys Val Tyr Pro Thr Leu Arg Cys Pro Val Phe Val Val Gln
325 330 335
Trp Leu Phe Asp Glu Ala Gln Leu Thr Val Asp Asn Val His Leu Thr
340 345 350
Gly Gln Pro Val Gln Glu Gly Leu Arg Leu Tyr Ile Gln Asn Leu Gly
355 360 365
Arg Glu Leu Arg His Thr Leu Lys Asp Val Pro Ala Ser Phe Ala Pro
370 375 380
Ala Cys Leu Ser His Glu Ile Ile Ile Arg Ser His Trp Thr Asp Val
385 390 395 400
Gln Val Lys Gly Thr Ser Leu Pro Arg Ala Leu His Cys Trp Asp Arg
405 410 415
Ser Leu His Asp Ser His Lys Ala Ser Lys Thr Pro Leu Lys Gly Cys
420 425 430
Pro Val His Leu Val Asp Ser Cys Pro Trp Pro His Cys Asn Pro Ser
435 440 445
Cys Pro Thr Val Arg Asp Gln Phe Thr Gly Gln Glu Met Asn Val Ala
450 455 460
Gln Phe Leu Met His Met Gly Phe Asp Met Gln Thr Val Ala Gln Pro
465 470 475 480
Gln Gly Leu Glu Pro Ser Glu Leu Leu Gly Met Leu Ser Asn Gly Ser
485 490 495
<210> 3
<211> 351
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 3
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agatactgga taagctgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagat ttttatcctg gtagtggtag aaccgactac 180
aatgagaagt tcaagaccaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagagacggt 300
cacggcgagg gtgactactg gggccagggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Asp Gly His Gly Glu Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 5
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 6
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
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<211> 354
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 7
caggtccaac tgcagcagcc tgggactgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt taagcagagg 120
cctggacgag gccttgagtg gattggaagg attgatccta atcgtggtgg ttctaagttc 180
aatgagaagt tcaagaccaa ggccacactg actgtagaca aaccctccag cacagcctac 240
atgcagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtgc aagagattct 300
tacgggccct acttagacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
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<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Arg Gly Gly Ser Lys Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Gly Pro Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<211> 336
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 9
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctttg gtgcatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
ccggtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaaaga ggatcctccg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgg 336
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 11
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 11
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact ggctactaca tacactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggacgt gttaatccta acaatggtgg tactacctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccataata actgtagaca agtcatccaa cacagcctac 240
atggagttcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtac aaatgaaggg 300
acgttctggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca 339
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<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 12
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Ile Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Asn Glu Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser
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<211> 336
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 13
gacattgtac tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctccagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgtagat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatt ctgcatccga tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttat tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
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<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
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<212> DNA
<213> 小鼠种
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caggtccaac tgctgcagcc tgggtctgtg ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattcacc agctactgga tgcactgggt gaagcggagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag atttatccta ataatggtcg gactacctac 180
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<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 16
Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Arg Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 17
<211> 342
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 17
gacattatga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
ctgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacgtggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaagtgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga ggacctggca gtttatcact gtcagcaata ttatcgctat 300
ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gg 342
<210> 18
<211> 114
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 18
Asp Ile Met Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr His Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Arg Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 19
<211> 354
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 19
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctaatggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcactg tctcagggtt ctcgttaacc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120
cctggaaagg gtctggagtg gctgggagta atttgggctg gtggaagcac agactataat 180
tcaactctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagtca agttttcata 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccaa acagaatagg 300
tacgacggga tctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 20
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Met Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Ile
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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Lys Gln Asn Arg Tyr Asp Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 21
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgacctgca cgtccagtca gagcctttta tttagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120
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atcagcagtg tggaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300
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<212> PRT
<213> 小鼠种
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Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser
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Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Tyr Tyr Ser Tyr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 23
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga tacactgggt gaagcagagg 120
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ggtaactacc ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe
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Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 25
gacatccaga tgacacaatc ttcatcctac ttgtctgtat ctctaggagg cagagtcacc 60
attacttgca aggcaagtga ccacattaat aattggttag cctggtatca gcagaaacca 120
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gggaccaagc tggagctgaa a 321
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<213> 小鼠种
<400> 26
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Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<213> 小鼠种
<400> 27
caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaact aattatggtg tacactgggt tcgccagtct 120
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gtagctttca tatccagact gagcatcagc aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240
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agtaattatg actactttga ctactggggc cgaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 28
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
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Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 29
gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60
atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120
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aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcaa cctgcagcct 240
gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atcctctgac gttcggtgga 300
ggcacccagc tggagatcaa a 321
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 30
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 357
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 31
caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180
aatggaaatc tcaaggggaa agccacactg actgcagaca gatcctccag cacagcctac 240
atccagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacagctc 300
gggctacctt atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
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Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Leu
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 324
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 33
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60
atcacttgcc atgcaagtca ggacattagc agtaatatag ggtggttgca gcagaaacca 120
gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggaagatgg agttccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggagcagat tattctctca ccatcaccag cctggaatct 240
gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa acgg 324
<210> 34
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 34
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211> 357
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 35
gacgtgaagc tggtggagtc tggggaaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gtggtgatta catctactat 180
gcagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagaggat 300
ggttattact ctactatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
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<212> PRT
<213> 小鼠种
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Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
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Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Glu Asp Gly Tyr Tyr Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 324
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 37
gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60
atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcagccagat tggtagatgg ggtcccatcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240
gaagatatgg gagtttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa acgg 324
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<212> PRT
<213> 小鼠种
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Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
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Tyr Arg Ala Ala Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
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Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 39
caggtgcaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 40
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Glu Phe Ser Leu Asn Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
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Phe Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
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Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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Leu Ala Pro Val Ser
115
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 41
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttaca 60
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<212> PRT
<213> 小鼠种
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Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
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Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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115
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<212> DNA
<213> 小鼠种
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caggtccaat tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
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<213> 小鼠种
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
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Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Ile Phe
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115
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<212> DNA
<213> 小鼠种
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atgttttgat gacccaaact ccactctccc tgcctgtcag tcttggagat caagcctcct 60
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<212> PRT
<213> 小鼠种
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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Arg
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<212> DNA
<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Phe
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Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg Gly Gly Trp Asp Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser
115
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 49
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<213> 小鼠种
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Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Arg
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<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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<212> DNA
<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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Asp Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gly Ser Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
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Pro Val Glu Glu Asp Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Met
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Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<211> 357
<212> DNA
<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Arg Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<213> 小鼠种
<400> 57
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<400> 58
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 59
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 61
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60
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gggaccaagc tggaaataaa acgg 324
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<211> 108
<212> PRT
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<400> 62
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 63
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Gly Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala
115
<210> 65
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 65
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg 120
ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt gggtcaggaa cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339
<210> 66
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 66
Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val
1 5 10 15
Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
20 25 30
Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro
35 40 45
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Arg
115
<210> 67
<211> 351
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 67
caagtaactc taaaagagtc tggccctggg atattgaagc cctcacagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcactcattt ggtgggatga tgataaatac 180
tataacccat ccctgaagag ccagctcaca atctccaagg atacctccag aaaccaggta 240
ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgttcgaact 300
tatggttact atgagagctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 68
<211> 117
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 68
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Thr Tyr Gly Tyr Tyr Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 69
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 69
gatgttgtga tgccccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcgc actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300
cagacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339
<210> 70
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 70
Asp Val Val Met Pro Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 71
<211> 354
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 71
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ttggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattcact gactactaca tgcactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggatat atttatccta acaatggtgg taatggctac 180
aaccagaagt tcaagggcag ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240
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gccactgggt tctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 72
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 72
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Asn Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ala Thr Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 73
gacatccaga tgactcagtc tccagactcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga aaatatttac agtactttag catggtatca gcagacaccg 120
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gaggattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttatggta cggtcacgtt cggtgctggg 300
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Thr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Glu Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Thr Gly Thr Asn Leu Ala Asp Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Lys Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Tyr Gly Thr Val Thr
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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 75
caggttcagc tgcagcagtc tggggatgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 76
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
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Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Gly Pro His Trp Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
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Thr Val Ser Ser
115
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<212> DNA
<213> 小鼠种
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gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 79
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa attgtgaggc ctggggcttc agtgaaactg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttacc gactattgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gatcggagca attgatcctt ctatttctta tactacctac 180
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 80
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Ile Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Asp Pro Ser Ile Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
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Ala Arg Asp Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ala Val Ser Ala
100 105 110
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 81
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggttg ccattggaca accagcctcc 60
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<210> 82
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 82
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Ala Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
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Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
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Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 83
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<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 84
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<210> 85
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 85
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
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<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 86
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ile
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Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
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<211> 363
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 87
caggtacagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
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ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatgggctg gtggaagaat aaaatataat 180
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gca 363
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<213> 小鼠种
<400> 88
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asn Phe
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Gly Val Gln Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Arg Ile Lys Tyr Asn Ser Thr Leu Met
50 55 60
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Arg Asp Leu Gly Leu Asn Trp Asp Pro Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<210> 89
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 89
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
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<213> 小鼠种
<400> 90
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
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Arg
<210> 91
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<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 91
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gataggtacg acggctatgt tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
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<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 92
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
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<210> 93
<211> 327
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 93
caggctgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60
acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca actagttact atgccaactg ggtccaagaa 120
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cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240
cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acaacaacca ttgggtgttc 300
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<210> 94
<211> 109
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 94
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Tyr Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
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85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 95
<211> 345
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 95
gaggtgaagc ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcagtac gataaactat 180
acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac 240
ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac acagcccttt attactgtgc atccctacct 300
ttagtggact actggggtcg aggaacctca gtcaccgtct cctca 345
<210> 96
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 96
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
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Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Pro Leu Val Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 97
<211> 324
<212> DNA
<213> 小鼠种
<400> 97
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actagtgttg cctggtttca acagagacca 120
ggacaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagactattt ctgtgagcaa tataaaagct atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaggc tggaaataaa acgg 324
<210> 98
<211> 108
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 98
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Glu Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 99
<211> 143
<212> PRT
<213> 猕猴种
<400> 99
Ser Glu Gly Arg Lys Thr Trp Arg Arg Arg Gly Gln Gln Pro Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Arg Thr Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gln Pro Val Glu Ser
20 25 30
Phe Pro Leu Asp Phe Thr Ala Val Glu Gly Asn Met Asp Ser Phe Met
35 40 45
Ala Gln Val Lys Ser Leu Ala Gln Ser Leu Tyr Pro Cys Ser Ala Gln
50 55 60
Gln Leu Asn Glu Asp Leu Arg Leu His Leu Leu Leu Asn Thr Ser Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Asp Gly Ser Pro Ala Gly Tyr Tyr Leu Lys Glu Ser Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Arg Trp Leu Leu Phe Leu Glu Gly Gly Trp Tyr Cys Phe
100 105 110
Asn Arg Glu Asn Cys Asp Ser Arg Tyr Asn Thr Met Arg Arg Leu Met
115 120 125
Ser Ser Arg Asp Trp Pro Arg Thr Arg Thr Gly Thr Gly Ile Leu
130 135 140
<210> 100
<211> 143
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Ser Glu Gly Arg Lys Thr Trp Arg Arg Arg Gly Gln Gln Pro Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Arg Thr Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gln Pro Val Glu Ser
20 25 30
Phe Pro Leu Asp Phe Thr Ala Val Glu Gly Asn Met Asp Ser Phe Met
35 40 45
Ala Gln Val Lys Ser Leu Ala Gln Ser Leu Tyr Pro Cys Ser Ala Gln
50 55 60
Gln Leu Asn Glu Asp Leu Arg Leu His Leu Leu Leu Asn Thr Ser Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Asp Gly Ser Pro Ala Gly Tyr Tyr Leu Lys Glu Ser Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Arg Trp Leu Leu Phe Leu Glu Gly Gly Trp Tyr Cys Phe
100 105 110
Asn Arg Glu Asn Cys Asp Ser Arg Tyr Asp Thr Met Arg Arg Leu Met
115 120 125
Ser Ser Arg Asp Trp Pro Arg Thr Arg Thr Gly Thr Gly Ile Leu
130 135 140
<210> 101
<211> 150
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 101
Ser Glu Gly Arg Lys Thr Trp Arg Arg Arg Gly Gln Gln Pro Pro Gln
1 5 10 15
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gln Arg Ala Glu Val Glu Pro Gly
20 25 30
Ala Gly Gln Pro Val Glu Ser Phe Pro Leu Asp Phe Thr Ala Val Glu
35 40 45
Gly Asn Met Asp Ser Phe Met Ala Gln Val Lys Ser Leu Ala Gln Ser
50 55 60
Leu Tyr Pro Cys Ser Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Arg Leu His
65 70 75 80
Leu Leu Leu Asn Thr Ser Val Thr Cys Asn Asp Gly Ser Pro Ala Gly
85 90 95
Tyr Tyr Leu Lys Glu Ser Lys Gly Ser Arg Arg Trp Leu Leu Phe Leu
100 105 110
Glu Gly Gly Trp Tyr Cys Phe Asn Arg Glu Asn Cys Asp Ser Arg Tyr
115 120 125
Ser Thr Met Arg Arg Leu Met Ser Ser Lys Asp Trp Pro His Thr Arg
130 135 140
Thr Gly Thr Gly Ile Leu
145 150
<210> 102
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明:合成的共有序列"
<400> 102
Ser Glu Gly Arg Lys Thr Trp Arg Arg Arg Gly Gln Gln Pro Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Arg Thr Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gln Pro Val Glu Ser
20 25 30
Phe Pro Leu Asp Phe Thr Ala Val Glu Gly Asn Met Asp Ser Phe Met
35 40 45
Ala Gln Val Lys Ser Leu Ala Gln Ser Leu Tyr Pro Cys Ser Ala Gln
50 55 60
Gln Leu Asn Glu Asp Leu Arg Leu His Leu Leu Leu Asn Thr Ser Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Asp Gly Ser Pro Ala Gly Tyr Tyr Leu Lys Glu Ser Arg
85 90 95
Gly Ser Arg Arg Trp Leu Leu Phe Leu Glu Gly Gly Trp Tyr Cys Phe
100 105 110
Asn Arg Glu Asn Cys Asp Ser Arg Tyr Asn Thr Met Arg Arg Leu Met
115 120 125
Ser Ser Arg Asp Trp Pro Arg Thr Arg Thr Gly Thr Gly Ile Leu
130 135 140
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 103
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 104
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 105
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 106
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Asp Met Gly
1 5 10
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 107
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 108
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 109
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 110
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 111
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 112
Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Ser
1 5 10
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 113
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile His
1 5 10
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 114
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 115
Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 116
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 117
Glu Phe Ser Leu Asn Ser Tyr Gly Val His
1 5 10
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 118
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn
1 5 10
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 119
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 120
Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 121
Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 122
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 123
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp
1 5
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 124
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Gly
1 5
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 125
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Leu Gly
1 5 10
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 126
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp
1 5
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 127
Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 128
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asp Asn
1 5
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 129
Gly Phe Val Phe Ser Ser His Asp
1 5
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 130
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 131
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Leu Gly
1 5 10
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 132
Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Phe Tyr
1 5
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 133
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp
1 5
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 134
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp
1 5
<210> 135
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 135
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 136
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 137
Gly Phe Ser Leu Ile Asn Phe Gly
1 5
<210> 138
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 138
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 139
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 139
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp
1 5
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 140
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp
1 5
<210> 141
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 141
Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr
1 5
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 142
Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr
1 5
<210> 143
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 143
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr
1 5
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 144
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 145
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 145
Ile Asp Pro Asn Arg Gly Gly Ser
1 5
<210> 146
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 146
Val Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
1 5
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 147
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 148
Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 149
Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Arg Thr
1 5
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 150
Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 151
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 151
Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr
1 5
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 152
Met Trp Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 153
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 153
Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 154
Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile
1 5
<210> 155
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 155
Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr
1 5
<210> 156
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 156
Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr
1 5
<210> 157
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 157
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Ser
1 5
<210> 158
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 158
Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr
1 5
<210> 159
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 159
Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 160
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 160
Ile Ser Ser Ser Thr Val Thr Thr
1 5
<210> 161
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 161
Ile Asp Pro Ser Tyr Ser Tyr Pro
1 5
<210> 162
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 162
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 163
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 163
Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys
1 5
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 164
Ile Asn Pro Thr Ser Asp Tyr Gly
1 5
<210> 165
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 165
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 166
Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr
1 5
<210> 167
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 167
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Asn
1 5
<210> 168
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 168
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Glu
1 5
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 169
Ile Trp Trp Asp Asp Ser Lys
1 5
<210> 170
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 170
Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asn Thr
1 5
<210> 171
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 171
Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Thr
1 5
<210> 172
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 172
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
1 5
<210> 173
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 173
Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Ala
1 5
<210> 174
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 174
Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Thr
1 5
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 175
Ile Trp Ala Gly Gly Arg Ile
1 5
<210> 176
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 176
Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Asn
1 5
<210> 177
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 177
Ile Asp Pro Ser Ile Ser Tyr Thr
1 5
<210> 178
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 178
Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile
1 5
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 179
Ala Arg Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 180
Ser Arg Asp Gly His Gly Glu Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 181
<211> 15
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 181
Thr Arg Glu Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 182
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 182
Val Arg Ile Ser Thr Glu Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 183
Ala Arg Asp Ser Tyr Gly Pro Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 184
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 184
Thr Lys Ser Gly Gly Asp Phe Val Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 185
Val Arg Thr Tyr Gly Tyr Tyr Glu Ser
1 5
<210> 186
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 186
Thr Asn Glu Gly Thr Phe
1 5
<210> 187
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 187
Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 188
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 188
Ala Lys Gln Asn Arg Tyr Asp Gly Ile Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 189
Ala Arg Asn Tyr Gly Asn Tyr Arg Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 190
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 190
Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 191
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 191
Ala Arg Gln Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 192
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 192
Thr Arg Glu Asp Gly Tyr Tyr Ser Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 193
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 193
Ala Arg Ser Tyr Asn Tyr Asp Val Val Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 194
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 194
Ala Arg Ser Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 195
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 195
Ala Arg Tyr Gly Gly Thr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
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<213> 小鼠种
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1 5
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<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 198
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1 5 10
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<213> 小鼠种
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1 5 10
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<213> 小鼠种
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1 5 10
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<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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Tyr
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<213> 小鼠种
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Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
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Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
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Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
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Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
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Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
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<211> 9
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<213> 小鼠种
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<211> 9
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<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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<211> 9
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<213> 小鼠种
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<211> 9
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<213> 小鼠种
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Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Tyr Thr
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<211> 10
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<213> 小鼠种
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Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Pro Trp Thr
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<213> 小鼠种
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Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Leu Thr
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<213> 小鼠种
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Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr
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<211> 9
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<213> 小鼠种
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<211> 9
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<213> 小鼠种
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Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Pro Tyr Thr
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<211> 9
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<213> 小鼠种
<400> 308
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
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<211> 9
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<213> 小鼠种
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Met Gln Ser Met Glu Asp Pro Phe Thr
1 5
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<213> 小鼠种
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Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr
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<213> 小鼠种
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Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Arg Thr
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<213> 小鼠种
<400> 312
Gln His Ser Arg Ala Leu Pro Leu Thr
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<213> 小鼠种
<400> 313
Gln Gln Tyr Trp Ser Pro Pro Trp Thr
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<213> 小鼠种
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<213> 小鼠种
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Trp Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr
1 5
<210> 316
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 316
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 317
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 317
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 318
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 318
Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 319
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 319
Ala Leu Trp Tyr Asn Asn His Trp Val
1 5
<210> 320
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 320
Gly Gln Ser Tyr Arg Tyr Pro Thr
1 5
<210> 321
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 321
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 322
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 322
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 323
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 323
Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 324
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 324
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 325
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 325
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Gln Tyr Thr
1 5 10
<210> 326
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 326
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 327
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 327
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 328
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 328
Gln His Phe Tyr Gly Thr Val Thr
1 5
<210> 329
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 329
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr
1 5
<210> 330
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠种
<400> 330
Glu Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 331
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明:合成的多肽"
<400> 331
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Gln Asn Trp Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 332
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明:合成的多肽"
<400> 332
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Ala Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 110
<210> 333
<211> 727
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明:合成的多肽"
<400> 333
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ser Glu Gly Arg Lys Thr Trp Arg Arg Arg Gly Gln
20 25 30
Gln Pro Pro Pro Pro Pro Arg Thr Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Pro Val Glu Ser Phe Pro Leu Asp Phe Thr Ala Val Glu Gly Asn Met
50 55 60
Asp Ser Phe Met Ala Gln Val Lys Ser Leu Ala Gln Ser Leu Tyr Pro
65 70 75 80
Cys Ser Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Arg Leu His Leu Leu Leu
85 90 95
Asn Thr Ser Val Thr Cys Asn Asp Gly Ser Pro Ala Gly Tyr Tyr Leu
100 105 110
Lys Glu Ser Arg Gly Ser Arg Arg Trp Leu Leu Phe Leu Glu Gly Gly
115 120 125
Trp Tyr Cys Phe Asn Arg Glu Asn Cys Asp Ser Arg Tyr Asp Thr Met
130 135 140
Arg Arg Leu Met Ser Ser Arg Asp Trp Pro Arg Thr Arg Thr Gly Thr
145 150 155 160
Gly Ile Leu Ser Ser Gln Pro Glu Glu Asn Pro Tyr Trp Trp Asn Ala
165 170 175
Asn Met Val Phe Ile Pro Tyr Cys Ser Ser Asp Val Trp Ser Gly Ala
180 185 190
Ser Ser Lys Ser Glu Lys Asn Glu Tyr Ala Phe Met Gly Ala Leu Ile
195 200 205
Ile Gln Glu Val Val Arg Glu Leu Leu Gly Arg Gly Leu Ser Gly Ala
210 215 220
Lys Val Leu Leu Leu Ala Gly Ser Ser Ala Gly Gly Thr Gly Val Leu
225 230 235 240
Leu Asn Val Asp Arg Val Ala Glu Gln Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Pro
245 250 255
Ala Ile Gln Val Arg Gly Leu Ala Asp Ser Gly Trp Phe Leu Asp Asn
260 265 270
Lys Gln Tyr Arg His Thr Asp Cys Val Asp Thr Ile Thr Cys Ala Pro
275 280 285
Thr Glu Ala Ile Arg Arg Gly Ile Arg Tyr Trp Asn Gly Val Val Pro
290 295 300
Glu Arg Cys Arg Arg Gln Phe Gln Glu Gly Glu Glu Trp Asn Cys Phe
305 310 315 320
Phe Gly Tyr Lys Val Tyr Pro Thr Leu Arg Cys Pro Val Phe Val Val
325 330 335
Gln Trp Leu Phe Asp Glu Ala Gln Leu Thr Val Asp Asn Val His Leu
340 345 350
Thr Gly Gln Pro Val Gln Glu Gly Leu Arg Leu Tyr Ile Gln Asn Leu
355 360 365
Gly Arg Glu Leu Arg His Thr Leu Lys Asp Val Pro Ala Ser Phe Ala
370 375 380
Pro Ala Cys Leu Ser His Glu Ile Ile Ile Arg Ser His Trp Thr Asp
385 390 395 400
Val Gln Val Lys Gly Thr Ser Leu Pro Arg Ala Leu His Cys Trp Asp
405 410 415
Arg Ser Leu His Asp Ser His Lys Ala Ser Lys Thr Pro Leu Lys Gly
420 425 430
Cys Pro Val His Leu Val Asp Ser Cys Pro Trp Pro His Cys Asn Pro
435 440 445
Ser Cys Pro Thr Val Arg Asp Gln Phe Thr Gly Gln Glu Met Asn Val
450 455 460
Ala Gln Phe Leu Met His Met Gly Phe Asp Met Gln Thr Val Ala Gln
465 470 475 480
Pro Gln Gly Leu Glu Pro Ser Glu Leu Leu Gly Met Leu Ser Asn Gly
485 490 495
Ser Ile Ser Ala Met Val Arg Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
500 505 510
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
515 520 525
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
530 535 540
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
545 550 555 560
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
565 570 575
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
580 585 590
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
595 600 605
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
610 615 620
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
625 630 635 640
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
645 650 655
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
660 665 670
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
675 680 685
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
690 695 700
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
705 710 715 720
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
725
<210> 334
<211> 2184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明:合成的多肽"
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2181)
<400> 334
atg tac agg atg caa ctc ctg tct tgc att gca cta agt ctt gca ctt 48
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
gtc acg aat tcg agc gag ggc agg aag acc tgg cgg cgc cgg ggt cag 96
Val Thr Asn Ser Ser Glu Gly Arg Lys Thr Trp Arg Arg Arg Gly Gln
20 25 30
cag ccg cct cct ccc ccg cgg acc gag gcg gcg ccg gcg gcc gga cag 144
Gln Pro Pro Pro Pro Pro Arg Thr Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gln
35 40 45
ccc gtg gag agc ttc ccg ctg gac ttc acg gcc gtg gag ggt aac atg 192
Pro Val Glu Ser Phe Pro Leu Asp Phe Thr Ala Val Glu Gly Asn Met
50 55 60
gac agc ttc atg gcg caa gtc aag agc ctg gcg cag tcc ctg tac ccc 240
Asp Ser Phe Met Ala Gln Val Lys Ser Leu Ala Gln Ser Leu Tyr Pro
65 70 75 80
tgc tcc gcg cag cag ctc aac gag gac ctg cgc ctg cac ctc cta ctc 288
Cys Ser Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Arg Leu His Leu Leu Leu
85 90 95
aac acc tcg gtg acc tgc aac gac ggc agc ccc gcc ggc tac tac ctg 336
Asn Thr Ser Val Thr Cys Asn Asp Gly Ser Pro Ala Gly Tyr Tyr Leu
100 105 110
aag gag tcc agg ggc agc cgg cgg tgg ctc ctc ttc ctg gaa ggc ggc 384
Lys Glu Ser Arg Gly Ser Arg Arg Trp Leu Leu Phe Leu Glu Gly Gly
115 120 125
tgg tac tgc ttc aac cgc gag aac tgc gac tcc aga tac gac acc atg 432
Trp Tyr Cys Phe Asn Arg Glu Asn Cys Asp Ser Arg Tyr Asp Thr Met
130 135 140
cgg cgc ctc atg agc tcc cgg gac tgg ccg cgc act cgc aca ggc aca 480
Arg Arg Leu Met Ser Ser Arg Asp Trp Pro Arg Thr Arg Thr Gly Thr
145 150 155 160
ggg atc ctg tcc tca cag ccg gag gag aac ccc tac tgg tgg aac gca 528
Gly Ile Leu Ser Ser Gln Pro Glu Glu Asn Pro Tyr Trp Trp Asn Ala
165 170 175
aac atg gtc ttc atc ccc tac tgc tcc agt gat gtt tgg agc ggg gct 576
Asn Met Val Phe Ile Pro Tyr Cys Ser Ser Asp Val Trp Ser Gly Ala
180 185 190
tca tcc aag tct gag aag aac gag tac gcc ttc atg ggc gcc ctc atc 624
Ser Ser Lys Ser Glu Lys Asn Glu Tyr Ala Phe Met Gly Ala Leu Ile
195 200 205
atc cag gag gtg gtg cgg gag ctt ctg ggc aga ggg ctg agc ggg gcc 672
Ile Gln Glu Val Val Arg Glu Leu Leu Gly Arg Gly Leu Ser Gly Ala
210 215 220
aag gtg ctg ctg ctg gcc ggg agc agc gcg ggg ggc acc ggg gtg ctc 720
Lys Val Leu Leu Leu Ala Gly Ser Ser Ala Gly Gly Thr Gly Val Leu
225 230 235 240
ctg aat gtg gac cgt gtg gct gag cag ctg gag aag ctg ggc tac cca 768
Leu Asn Val Asp Arg Val Ala Glu Gln Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Pro
245 250 255
gcc atc cag gtg cga ggc ctg gct gac tcc ggc tgg ttc ctg gac aac 816
Ala Ile Gln Val Arg Gly Leu Ala Asp Ser Gly Trp Phe Leu Asp Asn
260 265 270
aag cag tat cgc cac aca gac tgc gtc gac acg atc acg tgc gcg ccc 864
Lys Gln Tyr Arg His Thr Asp Cys Val Asp Thr Ile Thr Cys Ala Pro
275 280 285
acg gag gcc atc cgc cgt ggc atc agg tac tgg aac ggg gtg gtc ccg 912
Thr Glu Ala Ile Arg Arg Gly Ile Arg Tyr Trp Asn Gly Val Val Pro
290 295 300
gag cgc tgc cga cgc cag ttc cag gag ggc gag gag tgg aac tgc ttc 960
Glu Arg Cys Arg Arg Gln Phe Gln Glu Gly Glu Glu Trp Asn Cys Phe
305 310 315 320
ttt ggc tac aag gtc tac ccg acc ctg cgc tgc cct gtg ttc gtg gtg 1008
Phe Gly Tyr Lys Val Tyr Pro Thr Leu Arg Cys Pro Val Phe Val Val
325 330 335
cag tgg ctg ttt gac gag gca cag ctg acg gtg gac aac gtg cac ctg 1056
Gln Trp Leu Phe Asp Glu Ala Gln Leu Thr Val Asp Asn Val His Leu
340 345 350
acg ggg cag ccg gtg cag gag ggc ctg cgg ctg tac atc cag aac ctc 1104
Thr Gly Gln Pro Val Gln Glu Gly Leu Arg Leu Tyr Ile Gln Asn Leu
355 360 365
ggc cgc gag ctg cgc cac aca ctc aag gac gtg ccg gcc agc ttt gcc 1152
Gly Arg Glu Leu Arg His Thr Leu Lys Asp Val Pro Ala Ser Phe Ala
370 375 380
ccc gcc tgc ctc tcc cat gag atc atc atc cgg agc cac tgg acg gat 1200
Pro Ala Cys Leu Ser His Glu Ile Ile Ile Arg Ser His Trp Thr Asp
385 390 395 400
gtc cag gtg aag ggg acg tcg ctg ccc cga gca ctg cac tgc tgg gac 1248
Val Gln Val Lys Gly Thr Ser Leu Pro Arg Ala Leu His Cys Trp Asp
405 410 415
agg agc ctc cat gac agc cac aag gcc agc aag acc ccc ctc aag ggc 1296
Arg Ser Leu His Asp Ser His Lys Ala Ser Lys Thr Pro Leu Lys Gly
420 425 430
tgc ccc gtc cac ctg gtg gac agc tgc ccc tgg ccc cac tgc aac ccc 1344
Cys Pro Val His Leu Val Asp Ser Cys Pro Trp Pro His Cys Asn Pro
435 440 445
tca tgc ccc acc gtc cga gac cag ttc acg ggg caa gag atg aac gtg 1392
Ser Cys Pro Thr Val Arg Asp Gln Phe Thr Gly Gln Glu Met Asn Val
450 455 460
gcc cag ttc ctc atg cac atg ggc ttc gac atg cag acg gtg gcc cag 1440
Ala Gln Phe Leu Met His Met Gly Phe Asp Met Gln Thr Val Ala Gln
465 470 475 480
ccg cag gga ctg gag ccc agt gag ctg ctg ggg atg ctg agc aac gga 1488
Pro Gln Gly Leu Glu Pro Ser Glu Leu Leu Gly Met Leu Ser Asn Gly
485 490 495
agc ata tcg gcc atg gtt aga tct gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca 1536
Ser Ile Ser Ala Met Val Arg Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
500 505 510
cca cct gtg gca gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 1584
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
515 520 525
gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg 1632
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
530 535 540
gac gtg agc cac gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac 1680
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
545 550 555 560
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc 1728
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
565 570 575
aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtt gtg cac cag gac 1776
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
580 585 590
tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc 1824
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
595 600 605
cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga 1872
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
610 615 620
gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1920
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
625 630 635 640
aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac 1968
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
645 650 655
atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 2016
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
660 665 670
acc acg cct ccc atg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 2064
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
675 680 685
aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca 2112
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
690 695 700
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc 2160
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
705 710 715 720
ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 2184
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
725

Claims (10)

1.分离的抗体，其选自：
包含用于CDR-L1的SEQ ID NO: 14的残基24-34、用于CDR-L2的SEQ ID NO: 14的残基50-56、用于CDR-L3的SEQ ID NO: 14的残基89-97、用于CDR-H1的SEQ ID NO: 12的残基31-35、用于CDR-H2的SEQ ID NO: 12的残基50-65和用于CDR-H3的SEQ ID NO: 12的残基95-102的抗体，其中所述残基根据Kabat编号；
包含用于CDR-L1的SEQ ID NO: 18的残基24-34、用于CDR-L2的SEQ ID NO: 18的残基50-56、用于CDR-L3的SEQ ID NO: 18的残基89-97、用于CDR-H1的SEQ ID NO: 16的残基31-35、用于CDR-H2的SEQ ID NO: 16的残基50-65和用于CDR-H3的SEQ ID NO: 16的残基95-102的抗体，其中所述残基根据Kabat编号；
包含用于CDR-L1的SEQ ID NO: 50的残基24-34、用于CDR-L2的SEQ ID NO: 50的残基50-56、用于CDR-L3的SEQ ID NO: 50的残基89-97、用于CDR-H1的SEQ ID NO: 48的残基31-35、用于CDR-H2的SEQ ID NO: 48的残基50-65和用于CDR-H3的SEQ ID NO: 48的残基95-102的抗体，其中所述残基根据Kabat编号；
包含用于CDR-L1的SEQ ID NO: 58的残基24-34、用于CDR-L2的SEQ ID NO: 58的残基50-56、用于CDR-L3的SEQ ID NO: 58的残基89-97、用于CDR-H1的SEQ ID NO: 56的残基31-35、用于CDR-H2的SEQ ID NO: 56的残基50-65和用于CDR-H3的SEQ ID NO: 56的残基95-102的抗体，其中所述残基根据Kabat编号；和
包含用于CDR-L1的SEQ ID NO: 98的残基24-34、用于CDR-L2的SEQ ID NO: 98的残基50-56、用于CDR-L3的SEQ ID NO: 98的残基89-97、用于CDR-H1的SEQ ID NO: 96的残基31-35、用于CDR-H2的SEQ ID NO: 96的残基50-65和用于CDR-H3的SEQ ID NO: 96的残基95-102的抗体，其中所述残基根据Kabat编号；
其中所述抗体结合Notum。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体与抗癌剂缀合。
3.权利要求1-2中任一项的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
4.权利要求1-3中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗具有至少一种肿瘤病症的患者，所述肿瘤病症选自肾上腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和癌转移。
5.权利要求4的用途，其中所述患者具有实体瘤，所述实体瘤表现出至少一种选自KRAS突变、APC突变和CTNNB1突变的突变。
6.权利要求4或权利要求5的用途，其中所述治疗降低所述患者中肿瘤起始细胞的频率，其中所述频率的降低如下确定：使用已知用于富集肿瘤起始细胞的肿瘤细胞表面标记的流式细胞分析；使用已知用于富集肿瘤起始细胞的肿瘤细胞表面标记的免疫组织化学检测；
使用体外或体内有限稀释分析；使用体内有限稀释分析，包括将活的人肿瘤细胞移植进免疫功能低下的小鼠；使用体内有限稀释分析，包括使用泊松分布统计定量肿瘤起始细胞频率；使用体外有限稀释分析，包括将活的人肿瘤细胞有限稀释沉积进体外集落支持条件；或使用体外有限稀释分析，包括使用泊松分布统计定量肿瘤起始细胞频率。
7.组合物，包含权利要求1-3中任一项的抗体和药学上可接受的载体。
8.分离的组合物，包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸编码重链和所述第二多核苷酸编码轻链，和其中所述第一和第二多核苷酸编码权利要求1-3中任一项的抗体。
9.分离的宿主细胞，包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸编码重链和所述第二多核苷酸编码轻链，和其中所述第一和第二多核苷酸编码权利要求1-3中任一项的抗体。
10.权利要求1-3中任一项的抗Notum抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断患者中过度增生性病症，所述诊断包括：
a. 从所述患者获得组织样品；
b. 将所述组织样品与权利要求1-3中任一项的抗Notum抗体接触；和
c. 检测或定量与所述样品结合的所述抗Notum抗体。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010138621A2 (en) * 2009-05-26 2010-12-02 The Uab Research Foundation Diagnosing and treating iga nephropathy
SG10201506782XA (en) * 2010-08-27 2015-10-29 Stem Centrx Inc Notum protein modulators and methods of use
EP2611463A2 (en) * 2010-09-03 2013-07-10 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
RU2013123793A (ru) * 2010-11-24 2014-12-27 Лексикон Фармасьютикалз, Инк. Антитела, связывающиеся с notum пектинацетилэстеразой
US8802365B2 (en) * 2011-03-22 2014-08-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for identifying candidate modulators of NOTUM activity
US10323081B2 (en) * 2011-07-06 2019-06-18 Genmag A/S Modulation of complement-dependent cytotoxicity through modifications of the C-terminus of antibody heavy chains
EP2961853B1 (en) * 2013-02-28 2018-09-19 The Board of Regents of The University of Texas System Methods for classifying a cancer as susceptible to tmepai-directed therapies and treating such cancers
MX2016004579A (es) * 2013-10-10 2016-12-09 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Proteinas de union del miembro 1 de la familia de transmembrana 4 l-seis (tm4sf1) y metodos de uso de las mismas.
CN105793439B (zh) 2013-11-06 2020-09-04 阿斯图特医药公司 以生物样品进行的针对igfbp7的具有改进的性能的测定
AU2015213735A1 (en) * 2014-02-10 2016-08-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Antibodies that bind to human Tau and assay for quantifying human Tau using the antibodies
KR20150105505A (ko) * 2014-03-06 2015-09-17 (주)노바셀테크놀로지 신규 대장암의 바이오마커 및 그를 표적으로 하는 항암제
WO2015200522A2 (en) * 2014-06-25 2015-12-30 Integrated Biotherapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed against envelope glycoproteins from multiple filovirus species
EP3455251A4 (en) * 2016-05-09 2020-04-22 Icahn School of Medicine at Mount Sinai WIDE NEUTRALIZING HUMAN ANTI-CYTOMEGALOVIRUS ANTIBODIES AND METHODS OF USE
WO2018156434A1 (en) * 2017-02-22 2018-08-30 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Tim3-binding chimeric antigen receptors
EA201992248A1 (ru) * 2017-03-23 2020-02-06 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания АНТИ-C5a-АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
US11525004B2 (en) 2017-07-20 2022-12-13 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Recombinant CD123-binding antibodies
AU2020298324A1 (en) * 2019-06-21 2022-01-27 Single Cell Technology, Inc. Anti-TIGIT antibodies
CN110950960B (zh) * 2019-11-26 2021-05-14 中国农业大学 基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法
US20230235034A1 (en) * 2020-05-26 2023-07-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies against pathological tau, and methods using same
US11883432B2 (en) 2020-12-18 2024-01-30 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor system with adaptable receptor specificity
CN117430702A (zh) * 2022-07-21 2024-01-23 东莞市朋志生物科技有限公司 抗b型尿钠肽抗体或其功能性片段、检测b型尿钠肽的试剂和试剂盒

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
WO1992010591A1 (en) 1990-12-14 1992-06-25 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
CA2141602A1 (en) 1992-08-26 1994-03-03 Philip Leder Use of the cytokine ip-10 as an anti-tumor agent
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
CA2196200A1 (en) 1994-07-29 1996-02-15 Michael Joseph Browne Novel compounds
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
WO1997033899A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
DE69731289D1 (de) 1996-03-18 2004-11-25 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
CA2248868A1 (en) 1996-03-22 1997-09-25 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule ii
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
EP1992633A1 (en) 1997-11-03 2008-11-19 Human Genome Sciences, Inc. VEGI, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
EP1134231B1 (en) * 2000-03-14 2009-04-15 Unilever N.V. Antibody heavy chain variable domains against human dietary lipases, and their uses
EP1276849A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2424977C (en) 2000-10-06 2008-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7138496B2 (en) 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
EP2341060B1 (en) 2000-12-12 2019-02-20 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
EA009125B1 (ru) 2001-05-16 2007-10-26 Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко., Лтд. Применение ингибиторов il-18 для лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
GB0201808D0 (en) * 2002-01-25 2002-03-13 European Molecular Biology Lab Embl Protein
EP1487492A4 (en) 2002-03-04 2008-10-01 Medimmune Inc PREVENTION OR TREATMENT OF CANCER USING INTEGRIN ALPHAVBETA3 ANTAGONISTS COMBINED WITH OTHER AGENTS
BRPI0314814C1 (pt) 2002-09-27 2021-07-27 Xencor Inc anticorpo compreendendo uma variante de fc
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7371840B2 (en) * 2003-01-08 2008-05-13 The University Of Southern California Isolation and characterization of ECA1, a gene overexpressed in endometrioid carcinomas of ovary and endometrium
US20050008625A1 (en) 2003-02-13 2005-01-13 Kalobios, Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
JP4884224B2 (ja) 2003-05-09 2012-02-29 ディアデクサス インコーポレーテッド Ｏｖｒ１１０抗体組成物および使用方法
EP2311468B1 (en) * 2003-08-08 2014-01-15 Perseus Proteomics Inc. Gene overexpressed in cancer
US20070037204A1 (en) * 2003-08-08 2007-02-15 Hiroyuki ABURANTAI Gene overexpressed in cancer
WO2006015373A2 (en) 2004-08-04 2006-02-09 Amgen Inc Antibodies to dkk-1
US20070123448A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 The Hospital For Sick Children Novel chemical entities affecting neuroblastoma tumor-initiating cells
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
JP2009539374A (ja) 2006-06-06 2009-11-19 ユニバーシティ・オブ・テネシー・リサーチ・ファウンデーション 腫瘍性幹細胞が富化された組成物及びそれを含む方法
DK2063907T3 (da) 2006-09-07 2017-11-13 Arthur E Frankel Fremgangsmåder og sammensætninger baseret på difteritoksin-interleukin-3-konjugater
KR20100052545A (ko) 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
US20090155255A1 (en) 2007-09-27 2009-06-18 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
SG10201506782XA (en) * 2010-08-27 2015-10-29 Stem Centrx Inc Notum protein modulators and methods of use
RU2013123793A (ru) * 2010-11-24 2014-12-27 Лексикон Фармасьютикалз, Инк. Антитела, связывающиеся с notum пектинацетилэстеразой
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

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