JP2009539374A - 腫瘍性幹細胞が富化された組成物及びそれを含む方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＯＣＴ４発現について富化された腫瘍性幹細胞集団を提供する。
【解決手段】ＯＣＴ４転写因子の発現について富化された腫瘍性幹細胞集団、並びにその同定、単離及び富化方法が開示されている。前記ＯＣＴ４が富化された腫瘍性幹細胞集団は、動物の癌の誘発及び分析にも使用される。さらに、ＯＣＴ４抑制によって、癌、腫瘍成長及び転移を、防止、停止又は抑制する方法が提供される。
【選択図】図１

Description

本発明は、腫瘍性幹細胞が富化された組成物及びそれを含む方法に関する。
今日まで、腫瘍性細胞を分析する方法は、研究目的のためには十分に効率的でも一様でもなかった。組織サンプルから様々な分画方法によって単離された腫瘍性幹細胞は、混合された細胞型から成る。腫瘍性幹細胞の効率的な単離は、癌細胞細胞学及び疾患の基本的機構を研究する方法を提供する。インビトロ及びインビボ研究用の大きな腫瘍性幹細胞集団を得るために、細胞亜集団を特異的及び効率的に単離する及び増殖させる方法が求められている。
腫瘍細胞内の幹細胞マーカーを同定することによって、臨床及び基礎研究の両方の分野において様々な用途に役立つ有益な情報が得られる。腫瘍性幹細胞（neoplastic stem cell：ＮＳＣ）の同定、及びＮＳＣ同定後の特定の腫瘍及び転移病巣からの単離は、例えば、病状の診断及び／又は進行中の病状を対象にした合理的な治療法の開発に有用である。ある場合には、生理学的機序及び分子機構を調査する更なるインビボ研究のために、ＮＳＣの単離及び／又は富化が望ましく、別の場合には、癌の進行又は治療についての更なる研究のために、実験動物を接種するのに前記細胞を使用することができる。
ＮＳＣは、例えばＦＡＣＳ（図１０）や抗生物質選択分析などの技術を使用してソートすることができるが、前記分析技術は、細胞亜集団をそれらの生物学的活性及び／又は生理学的機能に基づいて区別することはできない。さらに、前記分析技術は、天然の非抗生物質発現又は治療した幹細胞の回復を妨げるという問題がある。また、細胞の同定並びに同定後の単離及び／又は富化についての他の方法（例えばゲル電気泳動）には、純粋な集団を検出することができない、汚染の影響を受ける、及び／又は細胞の生存が脅かされるという問題がある。
本発明は、他の実施形態では、ＯＣＴ４の発現について富化（エンリッチ）された腫瘍性幹細胞集団（neoplastic stem cell population）に関する。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍性幹細胞を同定する方法であって、（１）ＯＣＴ４と特異的に相互作用する作用物質を腫瘍細胞集団に接触させるステップと、（２）前記作用物質が特異的に相互作用する細胞を同定するステップとを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍性幹細胞を単離する方法であって、（ａ）ＯＣＴ４と特異的に相互作用する作用物質を腫瘍細胞集団に接触させるステップと、（ｂ）前記作用物質が特異的に相互作用した細胞を単離するステップとを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞集団を腫瘍性幹細胞について富化する方法であって、（１）複数の癌性細胞を含有する混合細胞集団に、ＯＣＴ４プロモータに作動可能に連結された抗生物質抵抗性遺伝子を含有するベクターを接触させるステップと、（２）前記抗生物質の存在下で前記細胞を培養するステップとを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、癌を誘発する方法であって、ＯＣＴ４の発現について富化された腫瘍性幹細胞集団を哺乳類に導入するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、癌の進行及び／又は発症をインビボで分析する方法であって、（１）ＯＣＴ４高腫瘍性幹細胞を動物に移植するステップと、（２）前記動物における癌の進行及び／又は発症を分析するステップとを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、癌を停止又は抑制するための方法であって、腫瘍細胞内でのＯＣＴ４発現又は機能を抑制する作用物質を、腫瘍細胞に接触させるステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍成長を停止又は抑制するための方法であって、腫瘍細胞内でのＯＣＴ４発現又は機能を抑制する作用物質を、腫瘍細胞に接触させるステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、細胞転移を防止又は停止するための方法であって、腫瘍細胞内でのＯＣＴ４発現又は機能を抑制する作用物質を、腫瘍細胞に接触させるステップを含む方法を提供する。
ポリクローナル抗ＯＣＴ４抗体でプローブされた固形腫瘍の連続切片及び対照切片の光学マイクロ写真を示す。図１Ａは軟骨肉腫腫瘍の断面、図１Ｂは骨肉腫腫瘍の断面、図１Ｃは多形グリア芽細胞腫（ＧＢＭ）腫瘍の断面、図１Ｄは陽性対照に用いた胎児ヒト精巣の断面である。矢印はＯＣＴ４陽性核を示す。 図２Ａは、ＯＣＴ４、ＳＴＡＴ３及びＮａｎｏｇ ｍＲＮＡ発現に対する半定量ＲＴ‐ＰＣＲプローブ法の結果を示し、ここでは、βチューブリン及びＧＦＡＰは、代表的なグリア芽細胞腫初代培養（ＭＴ９１７、ＭＴ９２６、ＭＴ９２８、ＭＴ１２３１）及び細胞株（ＬＮ１８、ＬＮ２２９、ＬＮ４２８、Ｕ２５１）において、標準対照（normalized control）である。図２Ｂは、ＯＣＴ４、ＳＴＡＴ３及びＮａｎｏｇタンパク質発現のウエスタンブロット解析の結果を示し、ここでは、βチューブリン及びＧＦＡＰは、細胞株（ＬＮ１８、ＬＮ２２９、ＬＮ３１９、ＬＮ４２８、Ｄ２４７、Ｕ２５１、Ｕ３７３、Ｔ９８Ｇ）において、標準対照である。ブロットは、抗ＯＣＴ４、抗ホスホＳＴＡＴ３及び抗Ｎａｎｏｇでプローブされた。 付着細胞の培養物及び浮遊骨肉腫由来球体におけるＯＣＴ４及びｎａｎｏｇ遺伝子発現をプローブする２次元定量ＰＣＲの結果をプロットしたものである。基質付着培養物は、有意に（ｐ＜０．０５）より低いＯＣＴ４及びＮａｎｏｇの発現を示した。肉腫球におけるＯＣＴ４（Ｘ軸）とＮａｎｏｇ（Ｙ軸）の両方の発現は、基質付着培養物におけるものよりも有意に（ｐ＜０．０５）高い。 グリア芽細胞腫由来細胞のクローン形成能に対するＯＣＴ４ ｓｉＲＮＡの抑制を示す。図４Ａは、ウエスタンブロット解析の結果を示し、ここでは、トランスフェクトされた細胞培養物における外因性ＯＣＴ４タンパク質の抑制が、ＤＮＡ配列：ＴＴＧＡＴＣＣＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＡＡを含む特異的なＯＣＴ４ ｓｉＲＮＡによる処置によって達成された。図４Ｂは、選択されたグリア芽細胞腫細胞（ＭＴ３１７、ＬＮ−２２９、ＭＴ‐９１７）によるクローン形成の頻度をプロットしたものである。細胞にｅＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）及びＯＣＴ４ ｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクトした。実験は３通り行った。バー（横棒）は標準誤差を表す。 図５Ａは、ＭＣＦ‐７Ｒ乳癌細胞株に由来し、メチルセルロース中で培養された懸濁した乳房球の光学マイクロ写真画像（×２００）である。図５Ｂは、メチルセルロースから移され、基層に付着され、ＯＣＴ４（白色）及びパンサイトケラチン（灰色）発現に対して免疫染色された乳房球の蛍光顕微鏡写真（×２００）である。 ＯＣＴ４発現のプローブのために免疫組織化学的に染色された乳癌腫瘍の光学マイクロ写真（×２００）を示す。色が濃い点状染色はＯＣＴ４陽性核である。図６Ａは腺管癌腫瘍の断面、図６Ｂは脳への乳癌転移の断面である。矢印はＯＣＴ４陽性核を示す。 メチルセルロースにおける最初の分裂後のＯＣＴ４‐ＥＧＦＰトランスフェクト・グリア芽細胞腫細胞の蛍光顕微鏡（×２００）画像（図７Ａ）である。数回の分裂後のＯＣＴ‐ＥＧＦＰトランスフェクト細胞のグリア芽細胞腫遊走神経球（クローン）を図７Ｂに示す。 ＯＣＴ４応答性プロモータによりＥＧＦＰを発現する培養乳癌細胞（Ａ）、骨肉腫（Ｂ）及び多形グリア芽細胞腫細胞（Ｃ）の蛍光顕微鏡画像（×２００）である。 Ｎａｎｏｇ応答性プロモータによりＥＧＦＰを発現する培養グリア芽細胞腫細胞株Ｌｎ４２８（×２００）（Ａ）及び骨肉腫ＯＳ５２１（×１００）（Ｂ）の蛍光顕微鏡画像である。 培養グリア芽細胞腫細胞株Ｌｎ４２８からのＯＣＴ４発現腫瘍細胞の亜集団のＦＡＣＳフロー分離グラフを示す。Ｍ２ゲートは、ＯＣＴ４陽性細胞を表す。図１０Ａは、混合したクローンのＯＣＴ４細胞集団のＯＣＴ４陽性細胞に対する初期のＦＡＣＳソートを表す。図１０Ｂは、２回の継代（おおよそ２週間）後に単離されたＯＣＴ４陽性細胞ＦＡＣＳ解析（Ｂ）を表す。これらの細胞の純度を判定するためにＦＡＣＳ解析を行ったところ、この集団は、ＯＣＴ４タンパク質発現に関しては純度９６．１６％であることが分かった。 ＯＣＴ４‐ＥＧＦＲをトランスフェクトしたＯＣＴ４陽性及びＯＣＴ４陰性ＭＤＡ ＭＢ ２３１乳癌細胞の腫瘍形成能を示すグラフである。 創薬研究を含む癌関連研究のために、任意の腫瘍組織からＯＣＴ４富化腫瘍幹細胞を得る手順を概略的に示す。Ａ段階：細胞の準備：１）腫瘍を外科的に切除する。２）単細胞懸濁液を作成するための細分化及び調整を行う。Ｂ段階：ＯＣＴ４応答性プロモータによる腫瘍幹細胞の安定標識：１）腫瘍幹細胞を増殖及び選択するために、適切な条件下、単細胞懸濁の状態で腫瘍幹細胞を培養する。２）ＯＣＴ４応答性プロモータの制御下でＥＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクトする（Ｃ段階）。Ｃ段階：高純度の腫瘍幹細胞培養物の作成：ＥＧＦＰ発現細胞をＦＡＣＳによってさらに選択し、増殖のために再培養して大量の培養物を得る。Ｄ段階：Ｄ１，厳密な細胞及び分子生物学技術を用いて腫瘍幹細胞をさらに調べる。Ｄ２，腫瘍幹細胞を多種多様な薬物に曝す。Ｅ段階：単離された腫瘍幹細胞を免疫不全マウスに接種し、異種移植腫瘍モデルを作成した後、有効性、安全性（または毒性の欠如）及び結果に関して基本的な検討を行い、最終薬物リストを作成する。 ＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５黒色腫細胞株から由来し、Ｏｃｔ‐３／４発現ＮＳＣに関してバイオマークされた乳房球培養物の顕微鏡画像（×２００）である。図１３Ａは、メチルセルロース中で培養した懸濁腫瘍由来球の光学マイクロ写真である。図１３Ｂは、図１３Ａに示されている懸濁腫瘍由来球の蛍光顕微鏡写真である。図１３Ｃは、基層への付着後の腫瘍球の光学マイクロ写真である。図１３Ｄは、図１３Ｃに示した付着腫瘍球の蛍光顕微鏡写真である。
以下の詳細な説明には、本発明を十分に理解できるように多くの特定の詳細が記載されている。しかし、当業者であれば、これらの特定の詳細がなくとも本発明を実施できることが理解できるであろう。他の例では、本発明を不明瞭にしないために、既知の方法、手順及び成分については詳細に記載していない。
本発明のある特徴がここに例示され、説明された一方、通常の技術的知識を有する者には多くの修正、代用、変更及び等価物が思い浮かぶであろう。したがって、特許請求の範囲は、本発明の技術的思想内にある修正及び変更をすべて含むことを理解されたい。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３又はそれらの組み合わせの発現について富化（エンリッチ）された、腫瘍性幹細胞（neoplastic stem cell：ＮＳＣ）集団を含む。他の実施形態では、ＮＳＣは、長時間を経た後に癌を開始及び維持することが可能な腫瘍細胞を含有する集団内における細胞亜集団に相当する。他の実施形態では、ＮＳＣは、腫瘍の形成及び成長を駆動する（図１１）。他の実施形態では、ここで使用される駆動（drive）という用語は、案内する、制御する、導く、開始する、経由する、侵入する、又はそれらの組み合わせを意味する。
他の実施形態では、ＮＳＣは、長命、自己再生、及び休止という性質を有する。他の実施形態では、ＮＳＣは、強力な浸潤能力を有する。他の実施形態では、ＮＳＣは、多能性であり、自己複製能力を有し、肉腫から増殖性の肉腫球（sarcosphere）を、脳腫瘍から神経球（neurosphere）を、乳癌から乳房球（mammasphere）をそれぞれ生成することが可能である（図５）。他の実施形態では、ＮＳＣは、インビトロ培養での１〜１００代の継体間に、自己再生能力を維持することが可能である。他の実施形態では、ＮＳＣは、インビトロ培養での１〜９０代の継体間に、自己再生能力を維持することが可能である。他の実施形態では、ＮＳＣは、インビトロ培養での２０〜６０代の継体間に、自己再生能力を維持することが可能である。他の実施形態では、ＮＳＣは、ＮＳＣ（例えば、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３又はそれらの組み合わせなど）の特定の機能及び／又は自己再生に関与する遺伝子を発現する。
他の実施形態では、本発明は、共通の創始細胞又はＮＳＣに由来する細胞集団に相当する固形癌を提供する。他の実施形態では、本発明は、共通の創始細胞又はＮＳＣに由来する細胞集団に相当する腫瘍を提供する。他の実施形態では、本発明は、通常の幹細胞の表現型と多くの点で類似するＮＳＣ表現型を提供する。他の実施形態では、本発明は、通常の幹細胞の表現型とは全く異なり、異常発達様相という不規則性を有するＮＳＣ表現型を提供する。他の実施形態では、本発明は、通常の幹細胞の表現型とは全く異なり、主要増殖制御（key proliferation control）の欠如という不規則性を有するＮＳＣ表現型を提供する。
他の実施形態では、本発明は、真性又は母ＮＳＣと、ＮＳＣに由来する腫瘍性前駆細胞との混合を含むＮＳＣ集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、母ＮＳＣとは主要な点（key way）が異なる、ＮＳＣに由来する前駆細胞を提供する。他の実施形態では、前記異なる主要な点は、高い増殖動態を含む。他の実施形態では、本発明は、通常は、癌細胞集団全体と比較すると非常に低いパーセンテージで存在するＮＳＣを提供する。前記パーセンテージは、環境の「対立性（hostility）」（すなわち、例えば、原発乳房組織部における乳房ＮＳＣなどの自然環境、対、脳などの転移及び／又は異なる部位における乳房ＮＳＣ）とおおよそ相関する。
他の実施形態では、本発明は、原発性親癌集団（parental primary cancer population）の約０．００１〜１％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、原発性親癌集団の約０．００５〜１％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、原発性親癌集団の約０．０１〜０．１％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、原発性親癌集団の約０．０５〜０．１％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、原発性親癌集団の約０．００５〜０．０１％を構成するＮＳＣを提供する。
他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株（permanent cancer cell lines parental）内の約１〜８０％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約１〜１０％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約７〜１４％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約１５〜２５％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約１０〜３０％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約３０〜５０％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約２０〜４０％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約５０〜８０％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約１〜５％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約５〜１０％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約３〜８％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、永久親癌細胞株内の約７〜１０％の細胞集団を構成するＮＳＣを提供する。
他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団（parental metastatic cancer population cell）の約１〜１００％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団の約１〜１０％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団の約１０〜３０％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団の約３０〜５０％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団の約５０〜７５％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団の約７５〜１００％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団の約３０〜８０％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団の約２０〜９０％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団の約１０〜１００％を構成するＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、転移性親癌細胞集団の約２０〜４０％を構成するＮＳＣを提供する。
他の実施形態では、本発明は、原発固形腫瘍由来の癌細胞集団の大部分を構成するバルク癌細胞（bulk cancer cell：ＢＣＣ）を提供する。他の実施形態では、本発明は、癌由来永久培養細胞株の癌細胞集団の大部分を構成するＢＣＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、幹細胞特性を欠いたＢＣＣ集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４発現を欠いたＢＣＣ集団を提供する。
他の実施形態では、本発明は、検出を可能にするために事前に操作及びバイオマークされたＮＳＣを選択することによって癌組織バイオプシ及び永久癌細胞株からＮＳＣを単離する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、ＮＳＣにＯＣＴ４応答性プロモータにより調節された蛍光又は発光タンパクを発現するＤＮＡベクターを安定的にトランスフェクトする方法を提供する（図１２）。他の実施形態では、本発明は、蛍光性バイオマーカーを使用してＦＡＣＳソートすることによって癌細胞集団全体からＮＳＣを分離する方法を提供し、それによって、高純度の培養物を得ることができる。他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４プロモータにより駆動されるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現する細胞をＦＡＣＳソートすることによって全癌細胞集団からＮＳＣを分離する方法を提供し、それによって、高純度の培養物を得ることができる（図９）。
他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４ ＣＤＮＡの配列は、次の配列を含む。
ｔｃｃｃｔｔｃｇｃａａｇｃｃｃｔｃａｔｔｔｃａｃｃａｇｇｃｃｃｃｃｇｇｃｔｔｇｇｇｇｃｇｃｃｔｔｃｃｔｔｃｃｃｃａｔｇｇｃｇｇｇａｃａｃｃｔｇｇｃｔｔｃｇｇａｔｔｔｃｇｃｃｔｔｃｔｃｇｃｃｃｃｃｔｃｃａｇｇｔｇｇｔｇｇａｇｇｔｇａｔｇｇｇｃｃａｇｇｇｇｇｇｃｃｇｇａｇｃｃｇｇｇｃｔｇｇｇｔｔｇａｔｃｃｔｃｇｇａｃｃｔｇｇｃｔａａｇｃｔｔｃｃａａｇｇｃｃｃｔｃｃｔｇｇａｇｇｇｃｃａｇｇａａｔｃｇｇｇｃｃｇｇｇｇｇｔｔｇｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｇａｇｇｔｇｔｇｇｇｇｇａｔｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃｃｃｃｇｃｃｇｔａｔｇａｇｔｔｃｔｇｔｇｇｇｇｇｇａｔｇｇｃｇｔａｃｔｇｔｇｇｇｃｃｃｃａｇｇｔｔｇｇａｇｔｇｇｇｇｃｔａｇｔｇｃｃｃｃａａｇｇｃｇｇｃｔｔｇｇａｇａｃｃｔｃｔｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｇａａｇｃａｇｇａｇｔｃｇｇｇｇｔｇｇａｇａｇｃａａｃｔｃｃｇａｔｇｇｇｇｃｃｔｃｃｃｃｇｇａｇｃｃｃｔｇｃａｃｃｇｔｃａｃｃｃｃｔｇｇｔｇｃｃｇｔｇａａｇｃｔｇｇａｇａａｇｇａｇａａｇｃｔｇｇａｇｃａａａａｃｃｃｇｇａｇｇａｇｔｃｃｃａｇｇａｃａｔｃａａａｇｃｔｃｔｇｃａｇａａａｇａａｃｔｃｇａｇｃａａｔｔｔｇｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａａｇｃａｇａａｇａｇｇａｔｃａｃｃｃｔｇｇｇａｔａｔａｃａｃａｇｇｃｃｇａｔｇｔｇｇｇｇｃｔｃａｃｃｃｔｇｇｇｇｇｔｔｃｔａｔｔｔｇｇｇａａｇｇｔａｔｔｃａｇｃｃａａａｃｇａｃｃａｔｃｔｇｃｃｇｃｔｔｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｇｃｔｔａｇｃｔｔｃａａｇａａｃａｔｇｔｇｔａａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｃｔｔｇｃｔｇｃａｇａａｇｔｇｇｇｔｇｇａｇｇａａｇｃｔｇａｃａａｃａａｔｇａａａａｔｃｔｔｃａｇｇａｇａｔａｔｇｃａａａｇｃａｇａａａｃｃｃｔｃｇｔｇｃａｇｇｃｃｃｇａａａｇａｇａａａｇｃｇａａｃｃａｇｔａｔｃｇａｇａａｃｃｇａｇｔｇａｇａｇｇｃａａｃｃｔｇｇａｇａａｔｔｔｇｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｇｃｃｃｇａａａｃｃｃａｃａｃｔｇｃａｇｃａｇａｔｃａｇｃｃａｃａｔｃｇｃｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃｔｃｇａｇａａｇｇａｔｇｔｇｇｔｃｃｇａｇｔｇｔｇｇｔｔｃｔｇｔａａｃｃｇｇｃｇｃｃａｇａａｇｇｇｃａａｇｃｇａｔｃａａｇｃａｇｃｇａｃｔａｔｇｃａｃａａｃｇａｇａｇｇａｔｔｔｔｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｇｇｔｃｔｃｃｔｔｔｃｔｃａｇｇｇｇｇａｃｃａｇｔｇｔｃｃｔｔｔｃｃｔｃｔｇｇｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｃａｔｔｔｔｇｇｔａｃｃｃｃａｇｇｃｔａｔｇｇｇａｇｃｃｃｔｃａｃｔｔｃａｃｔｇｃａｃｔｇｔａｃｔｃｃｔｃｇｇｔｃｃｃｔｔｔｃｃｃｔｇａｇｇｇｇｇａａｇｃｃｔｔｔｃｃｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｔｃａｃｃａｃｔｃｔｇｇｇｃｔｃｔｃｃｃａｔｇｃａｔｔｃａａａｃｔｇａｇｇｔｇｃｃｔｇｃｃｃｔｔｃｔａｇｇａａｔｇｇｇｇｇａｃａｇｇｇｇｇａｇｇｇｇａｇｇａｇｃｔａｇｇｇａａａｇａａａａｃｃｔｇｇａｇｔｔｔｇｔｇｃｃａｇｇｇｔｔｔｔｔｇｇｇａｔｔａａｇｔｔｃｔｔｃａｔｔｃａｃｔａａｇｇａａｇｇａａｔｔｇｇｇａａｃａｃａａａｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｇａｇｔｔｔｇｇｇｇｃａａｃｔｇｇｔｔｇｇａｇｇｇａａｇｇｔｇａａｇｔｔｃａａｔｇａｔｇｃｔｃｔｔｇａｔｔｔｔａａｔｃｃｃａｃａｔｃａｔｇｔａｔｃａｃｔｔｔｔｔｔｃｔｔａａａｔａａａｇａａｇｃｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ（ＳＥＱ ＩＤ番号１）。
他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４ ＣＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号１と相同な核酸配列を含む。他の実施形態では、前記Ｏｃｔ４ ＣＤＮＡは、ホモサピエンスのＯｃｔ４ ＣＤＮＡ配列である。他の実施形態では、前記Ｏｃｔ４ ＣＤＮＡは、非人類種に由来する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４ ＣＤＮＡの配列は、次の配列を含む。
ｇｔａｇｔｃｃｔｔｔｇｔｔａｃａｔｇｃａｔｇａｇｔｃａｇｔｇａａｃａｇｇｇａａｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｃａｔｔｔｇｔｇｇｇｔａｇｇｔｔａｔｔｔｃｔａｇａａｇｔｔａｇｇｔｇｇｇｃａｇｃｔｔｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇｃａｃｔｔｃｔａｃａｇａｃｔａｔｔｃｃｔｔｇｇｇｇｃｃａｃａｃｇｔａｇｇｔｔｃｔｔｇａａｔｃｃｃｇａａｔｇｇａａａｇｇｇｇａｇａｔｔｇａｔａａｃｔｇｇｔｇｔｇｔｔｔａｔｇｔｔｃｔｔａｃａａｇｔｃｔｔｃｔｇｃｃｔｔｔｔａａａａｔｃｃａｇｔｃｃｃａｇｇａｃａｔｃａａａｇｃｔｃｔｇｃａｇａａａｇａａｃｔｃｇａｇｃａａｔｔｔｇｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａａｇｃａｇａａｇａｇｇａｔｃａｃｃｃｔｇｇｇａｔａｔａｃａｃａｇｇｃｃｇａｔｇｔｇｇｇｇｃｔｃａｃｃｃｔｇｇｇｇｇｔｔｃｔａｔｔｔｇｇｇａａｇｇｔａｔｔｃａｇｃｃａａａｃｇａｃｃａｔｃｔｇｃｃｇｃｔｔｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｇｃｔｔａｇｃｔｔｃａａｇａａｃａｔｇｔｇｔａａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｃｔｔｇｃｔｇｃａｇａａｇｔｇｇｇｔｇｇａｇｇａａｇｃｔｇａｃａａｃａａｔｇａａａａｔｃｔｔｃａｇｇａｇａｔａｔｇｃａａａｇｃａｇａａａｃｃｃｔｃｇｔｇｃａｇｇｃｃｃｇａａａｇａｇａａａｇｃｇａａｃｃａｇｔａｔｃｇａｇａａｃｃｇａｇｔｇａｇａｇｇｃａａｃｃｔｇｇａｇａａｔｔｔｇｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｇｃｃｃｇａａａｃｃｃａｃａｃｔｇｃａｇｃａｇａｔｃａｇｃｃａｃａｔｃｇｃｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃｔｃｇａｇａａｇｇａｔｇｔｇｇｔｃｃｇａｇｔｇｔｇｇｔｔｃｔｇｔａａｃｃｇｇｃｇｃｃａｇａａｇｇｇｃａａｇｃｇａｔｃａａｇｃａｇｃｇａｃｔａｔｇｃａｃａａｃｇａｇａｇｇａｔｔｔｔｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｇｇｔｃｔｃｃｔｔｔｃｔｃａｇｇｇｇｇａｃｃａｇｔｇｔｃｃｔｔｔｃｃｔｃｔｇｇｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｃａｔｔｔｔｇｇｔａｃｃｃｃａｇｇｃｔａｔｇｇｇａｇｃｃｃｔｃａｃｔｔｃａｃｔｇｃａｃｔｇｔａｃｔｃｃｔｃｇｇｔｃｃｃｔｔｔｃｃｃｔｇａｇｇｇｇｇａａｇｃｃｔｔｔｃｃｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｔｃａｃｃａｃｔｃｔｇｇｇｃｔｃｔｃｃｃａｔｇｃａｔｔｃａａａｃｔｇａｇｇｔｇｃｃｔｇｃｃｃｔｔｃｔａｇｇａａｔｇｇｇｇｇａｃａｇｇｇｇｇａｇｇｇｇａｇｇａｇｃｔａｇｇｇａａａｇａａａａｃｃｔｇｇａｇｔｔｔｇｔｇｃｃａｇｇｇｔｔｔｔｔｇｇｇａｔｔａａｇｔｔｃｔｔｃａｔｔｃａｃｔａａｇｇａａｇｇａａｔｔｇｇｇａａｃａｃａａａｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｇａｇｔｔｔｇｇｇｇｃａａｃｔｇｇｔｔｇｇａｇｇｇａａｇｇｔｇａａｇｔｔｃａａｔｇａｔｇｃｔｃｔｔｇａｔｔｔｔａａｔｃｃｃａｃａｔｃａｔｇｔａｔｃａｃｔｔｔｔｔｔｃｔｔａａａｔａａａｇａａｇｃｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ（ＳＥＱ ＩＤ番号２）。
他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４ ＣＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ番号２と相同な核酸配列を含む。他の実施形態では、前記Ｏｃｔ４ ＣＤＮＡは、ホモサピエンスのＯｃｔ４ ＣＤＮＡ配列である。他の実施形態では、前記Ｏｃｔ４ ＣＤＮＡは、非人類種に由来する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明のＯＣＴ４タンパク質の配列は、次の配列を含む。
ＭＡＧＨＬＡＳＤＦＡＦＳＰＰＰＧＧＧＧＤＧＰＧＧＰＥＰＧＷＶＤＰＲＴＷＬＳＦＱＧＰＰＧＧＰＧＩＧＰＧＶＧＰＧＳＥＶＷＧＩＰＰＣＰＰＰＹＥＦＣＧＧＭＡＹＣＧＰＱＶＧＶＧＬＶＰＱＧＧＬＥＴＳＱＰＥＧＥＡＧＶＧＶＥＳＮＳＤＧＡＳＰＥＰＣＴＶＴＰＧＡＶＫＬＥＫＥＩＣＬＥＱＮＰＥＥＳＱＤＩＫＡＬＱＫＥＬＥＱＦＡＫＬＬＫＱＫＲＩＴＬＧＹＴＱＡＤＶＧＬＴＬＧＶＬＦＧＫＶＦＳＱＴＣＲＦＥＡＬＱＬＳＦＫＮＭＣＫＬＲＰＬＬＱＫＷＶＥＥＡＤＮＮＥＮＬＱＥＩＣＫＡＥＴＬＶＱＡＲＫＲＫＲＴＳＩＥＮＲＶＲＧＮＬＥＮＬＦＬＱＣＰＫＰＴＬＱＱＩＳＨＩＡＱＱＬＧＬＥＫＤＶＶＲＶＷＦＣＮＲＲＱＫＧＫＲＳＳＳＤＹＡＱＲＥＤＦＥＡＡＧＳＰＦＳＧＧＰＶＳＦＰＬＡＰＧＰＨＦＧＴＰＧＹＧＳＰＨＦＴＡＬＹＳＳＶＰＦＰＥＧＥＡＦＰＰＶＳＶＴＴＬＧＳＰＭＨＳＮ（ＳＥＱ ＩＤ番号３）。
他の実施形態では、本発明のＯＣＴ４タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ番号３と相同なアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、前記ＯＣＴ４タンパク質は、ホモサピエンスのＯＣＴ４タンパク質配列である。他の実施形態では、前記ＯＣＴ４タンパク質は、非人類種に由来する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明のＯＣＴ４タンパク質の配列は、次の配列を含む。
ＭＣＫＬＲＰＬＬＱＫＷＶＥＥＡＤＮＮＥＮＬＱＥＩＣＫＡＥＴＬＶＱＡＲＫＲＫＲＴＳＩＥＮＲＶＲＧＮＬＥＮＬＦＬＱＣＰＫＰＴＬＱＱＩＳＨＩＡＱＱＬＧＬＥＫＤＶＶＲＶＷＦＣＮＲＲＱＫＧＫＲＳＳＳＤＹＡＱＲＥＤＦＥＡＡＧＳＰＦＳＧＧＰＶＳＦＰＬＡＰＧＰＨＦＧＴＰＧＹＧＳＰＨＦＴＡＬＹＳＳＶＰＦＰＥＧＥＡＦＰＰＶＳＶＴＴＬＧＳＰＭＨＳＮ（ＳＥＱ ＩＤ番号４）。
他の実施形態では、本発明の前記ＯＣＴ４タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ番号４と相同なアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、前記ＯＣＴ４タンパク質は、ホモサピエンスのＯＣＴ４タンパク質である。他の実施形態では、前記ＯＣＴ４タンパク質は、非ヒト種に由来する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４応答性プロモータの配列は、
ｃａｃｃｃａｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｃａｇａｇｇｔｃａａｇｇｃｔａｇａｇｇｇｔｇｇｇ（ＳＥＱ ＩＤ番号５）を含む。
他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４応答性プロモータは、ＳＥＱ ＩＤ番号５と相同な核酸配列を含む。他の実施形態では、前記Ｏｃｔ４応答性プロモータは、マウスのＯＣＴ４応答性プロモータ配列である。他の実施形態では、前記Ｏｃｔ４応答性プロモータは、ホモサピエンスに由来する。他の実施形態では、前記Ｏｃｔ４応答性プロモータは、非ヒト種に由来する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号１又は２の配列と少なくとも６０％相同する。他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号１又は２の配列と少なくとも７０％相同する。他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号１又は２の配列と少なくとも８０％相同する。他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号１又は２の配列と少なくとも９０％相同する。他の実施形態では、本発明のＯｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号１又は２の配列と少なくとも９５％相同する。
他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号５の配列と少なくとも６０％相同する。他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号５の配列と少なくとも７０％相同する。他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号５の配列と少なくとも８０％相同する。他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号５の配列と少なくとも９０％相同する。他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号５の配列と少なくとも９５％相同する。
他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号３又は４の配列と少なくとも６０％相同する。他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号３又は４の配列と少なくとも７０％相同する。他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号３又は４の配列と少なくとも８０％相同する。他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号３又は４の配列と少なくとも９０％相同する。他の実施形態では、本発明の前記Ｏｃｔ４ ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ番号３又は４の配列と少なくとも９５％相同する。
他の実施形態では、本発明の方法は、高純度のバイオマークされたＮＳＣ集団を提供する。他の実施形態では、本発明の方法によって提供された高純度のバイオマークされたＮＳＣ集団は、それらの蛍光特性を利用して様々な方法で研究される（図７〜９）。
他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく、少なくとも５世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも８世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも１０世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも１５世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも２０世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも２５世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも３０世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも３５世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも４０世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも４５世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＳＣ表現型を失うことなく少なくとも５０世代に渡って継代することができるＮＳＣを提供する。
他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも５世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも１０世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。
他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも１５世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも２０世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも２５世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも３０世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも３５世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも４０世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも４５世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、継代及びＯｃｔ４発現の維持を、少なくとも５０世代に渡ってすることができるＮＳＣを提供する。
他の実施形態では、本発明の方法は、大容量培地内に拡散させた際に、望ましい純粋なＮＳＣ表現型を長期間失わないＮＳＣ集団を提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、大容量培地内に拡散させた際に、ＯＣＴ４発現を長期間失わないＮＳＣ集団を提供する。
他の実施形態では、ＮＳＣは、幹細胞マーカーについて富化されている。他の実施形態では、前記幹細胞マーカーは、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、又はそれらの組み合わせである。他の実施形態では、前記幹細胞マーカーは、ＯＣＴ４などの転写因子である。他の実施形態では、ＯＣＴ４は、ＮＳＣ内で差次的に発現される。他の実施形態では、表面抗原に対する親和性に基づいてＯＣＴ４発現細胞を富化する免疫学的方法が使用される。他の実施形態では、ＮＳＣは、免疫磁性に基づいた細胞分離技術によって富化される。他の実施形態では、ＮＳＣは、表面抗原に対して特異的な抗体との培養による電気泳動移動度の減少に基づいた電気泳動細胞分離技術によって富化される。他の実施形態では、表面抗原に対して特異的な抗体との培養による電気泳動移動度の減少は、非キャッピング条件下（non-capping conditions）で実施される。他の実施形態では、ＮＳＣは、蛍光活性化細胞選別装置（fluorescence-activated cell sorter：ＦＡＣＳ）、免疫磁性ビーズ、又は磁気活性化細胞選別装置（magnetic-activated cell sorter：ＭＡＣＳ）によってさらに富化される。
他の実施形態では、癌性細胞の混合集団は、ＯＣＴ４陽性ＮＳＣを富化することができる球状細胞群（「球体（sphere）」）がＮＳＣによって形成される非接着性細胞培養条件下で、成長させられる。他の実施形態では、図３に示すように、浮遊性球体に由来する細胞は、同等の接着性細胞培養物よりも高レベルのＯＣＴ４及びＮａｎｏｇ ｍＲＮＡを発現する。他の実施形態では、前記球体を構成する細胞は、浮遊性である。他の実施形態では、乳房の腫瘍試料からのＮＳＣのインビトロ富化（in-vitro enrichment）は、非接着性の乳房球（mammasphere）細胞培養系を使用して実施される。他の実施形態では、骨肉腫瘍細胞からのＮＳＣのインビトロ富化は、非接着性の肉腫球（sarcosphere）細胞培養系を使用して実施される。他の実施形態では、脳腫瘍細胞からのＮＳＣのインビトロ富化は、非接着性の神経球（neurosphere）細胞培養系を使用して実施される。他の実施形態では、脳腫瘍細胞からのＮＳＣのインビトロ富化は、浮遊性球体を使用して実施される。
他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＯＣＴ４発現について少なくとも６０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＯＣＴ４発現について少なくとも７０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＯＣＴ４発現について少なくとも８０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、Ｎａｎｏｇ発現について少なくとも８０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＳＴＡＴ３発現について少なくとも８０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＯＣＴ４発現、Ｎａｎｏｇ発現、ＳＴＡＴ３発現、又はそれらの組み合わせについて少なくとも８０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＯＣＴ４発現について少なくとも９０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、Ｎａｎｏｇ発現について少なくとも９０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＳＴＡＴ３発現について少なくとも９０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＯＣＴ４発現、Ｎａｎｏｇ発現、ＳＴＡＴ３発現又はそれらの組み合わせについて少なくとも９０％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＯＣＴ４発現について少なくとも９５％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、Ｎａｎｏｇ発現について少なくとも９５％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＳＴＡＴ３発現について少なくとも９５％陽性である。他の実施形態では、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団は、ＯＣＴ４発現、Ｎａｎｏｇ発現、ＳＴＡＴ３発現又はそれらの組み合わせについて少なくとも８０％陽性である。
他の実施形態では、本発明は、「材料及び方法」の欄で説明するように、ＦＡＣＳ分析（図１０）、in situ ハイブリダイゼーション、免疫組織化学、又はそれらの組み合わせによって、ＮＳＣが富化された癌性細胞亜集団のレベル測定を提供する。
他の実施形態では、前記ＮＳＣが富化された集団は、ＯＣＴ４発現が高いという特徴を有する。他の実施形態では、ＯＣＴ４高発現は、βアクチン発現の少なくとも２倍である。他の実施形態では、ＯＣＴ４高発現は、βアクチン発現の少なくとも４倍である。他の実施形態では、前記ＮＳＣが富化された集団は、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３又はそれらの組み合わせの発現が高いという特徴を有する。
他の実施形態では、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ又はＳＴＡＴ３の発現レベルは、ｍＲＮＡ転写レベルにより測定される。他の実施形態では、前記転写レベルは、図２Ａに示すように及び「材料及び方法」の欄で説明するようにして、定量的又は半定量的ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ方法により測定される。他の実施形態では、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ又はＳＴＡＴ３の発現レベルは、タンパク質発現レベルにより測定される。他の実施形態では、前記タンパク質発現レベルは、図２Ｂに示すように及び「材料及び方法」の欄で説明するようにして、ウエスタンブロット分析により測定される。他の実施形態では、タンパク質の発現レベルは、レポーター遺伝子を使用して間接的に測定される。他の実施形態では、前記レポーター遺伝子は、ＥＧＦＰ構成体を含む。他の実施形態では、ＯＣＴ４−ＥＧＦＰをトランスフェクトされたグリア芽腫の細胞培養物（図７及び８参照）におけるＯＣＴ４発現レベルが、「材料及び方法」の欄で説明するようにして測定される。
他の実施形態では、前記ＮＳＣ亜集団は、「軟性」又は「硬性」腫瘍から富化される。他の実施形態では、「硬性」腫瘍は、他の実施形態において「軟性」に分類される白血病、リンパ腫、メラノーマ及び多発性骨髄腫を除く全ての腫瘍を含む。他の実施形態では、前記ＮＳＣ亜集団は、単離された転移細胞から富化される。他の実施形態では、前記ＮＳＣ亜集団は、腫瘍由来細胞株に由来する細胞を含有する組織培養物から富化される。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４発現について富化されたＮＳＣ集団を含有する組成物を含む。他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４高発現について富化されたＮＳＣ集団を含有する組成物を含む。他の実施形態では、前記組成物は、ここで説明されるような、ＮＳＣを急激に増殖させ、ＮＳＣ子孫細胞を生成させるような適切な環境をさらに有する。他の実施形態では、（ＮＳＣ子孫細胞が置かれる）環境という用語は、ＮＳＣの成長及び発育に作用する及び影響を与える、外部又は外因性の物理的及び／又は化学的条件の組み合わせを指す。他の実施形態では、前記環境は、エクスビボ又はインビボであり得る。他の実施形態では、循環系（血管とリンパ管）は、子孫細胞を生成するようにＮＳＣを誘導するインビボ環境としての機能を果すことができる。他の実施形態では、前記環境はエクスビボであり、培養器内の細胞培養媒体に置かれたＮＳＣを含む。
他の実施形態では、前記環境は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有する細胞培養媒体をさらに含む。他の実施形態では、前記細胞培養媒体は、最終濃度が３％未満、好ましくは１．５％未満のメチルセルロースをさらに含有する。他の実施形態では、前記媒体には、８〜２０％のウシ胎仔血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ）、３０〜７０％の初代ヒト包皮線維芽細胞の培養物由来媒体、又はそれらの組み合わせが添加される。他の実施形態では、前記媒体は、ＯＣＴ４と結合するスクリーニング剤をさらに含有する。他の実施形態では、前記媒体は、ＯＣＴ４応答配列と相互作用するスクリーニング剤をさらに含有する。
他の実施形態では、前記媒体に、５〜５００μＭのプロゲステロン、５〜５００μＭのプロゲステロン、５〜５００μＭのプトレッシン、２〜１００ｎｇ／ｍｌの組み換え型ＥＧＦ、２０〜４０μＭの亜セレン酸ナトリウム、１０〜４０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５〜５０μｇ／ｍｌのインスリン、２〜１００ｎｇ／ｍｌの組み換え型ＦＧＦ２、又はそれらの組み合わせがさらに添加される。他の実施形態では、前記媒体に、８〜２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、３０〜７０％の初代ヒト包皮線維芽細胞の培養物由来培地、又はそれらの組み合わせが添加される。他の実施形態では、前記媒体は、核酸を含有する。他の実施形態では、前記媒体は、プラスミドＤＮＡを含有する。他の実施形態では、前記プラスミドＤＮＡは、ＯＣＴ４応答性プロモータを含む。他の実施形態では、前記ＯＣＴ４応答性プロモータは、レポーター遺伝子に連結されている（図８）。他の実施形態では、前記ＯＣＴ４応答性プロモータは、抗生物質抵抗性遺伝子に連結されている。他の実施形態では、前記媒体は、ｓｉＲＮＡを含有する。他の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡアンチセンスは、抗ＯＣＴ４、抗Ｎａｎｏｇ、抗ＳＴＡＴ３、又はそれらの組み合わせをコードする。他の実施形態では、前記抗ＯＣＴ４ｓｉＲＮＡは、ＯＣＴ４タンパク質のデノボ生成を抑制することによって（図４Ａ）、クローン形成を抑制する（図４Ｂ）。
他の実施形態では、細胞は、超低接着性の培養プレート上にプレートされる。他の実施形態では、前記細胞は、３６〜４２℃の温度に維持された培養器に入れられる。他の実施形態では、前記培養器は、さらに、４〜８％のＣＯ２に維持される。他の実施形態では、前記培養器は、９０〜１００％の湿度に維持される。他の実施形態では、細胞は、１×１０２〜１×１０６細胞／ｃｍ２の最終密度でプレートされる。
他の実施形態では、本発明のＮＳＣは、細胞株に由来する。他の実施形態では、本発明のＮＳＣは、初代細胞培養物に由来する。他の実施形態では、ＮＳＣを含む前記初代細胞培養物は、腫瘍又は転移細胞に由来する。他の実施形態では、本発明は、ＮＳＣを含有する腫瘍又は転移細胞を含む。他の実施形態では、腫瘍又は転移細胞は、次のものに由来する（ただし、これらに限定されるわけではない）。副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体部腫瘍、視床下部膠腫、乳癌、カルチノイド腫瘍、癌腫、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、ユーイングファミリー腫瘍（原始神経外胚葉性腫瘍）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼癌、眼内黒色腫、胆嚢癌、胃癌、胚細胞腫瘍、性腺外妊娠性絨毛腫瘍、頭頸部癌、下咽頭癌、島細胞癌、喉頭癌、白血病、急性リンパ性白血病、口腔癌、肝臓癌、肺癌、小細胞性リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、転移性扁平上皮癌、多発性骨髄腫、形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖症候群、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口腔咽頭癌、骨肉腫、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵臓外分泌腺癌、島細胞癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体癌、形質細胞腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、直腸癌、腎細胞癌、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚癌、カポジ肉腫、皮膚癌、黒色腫、小腸癌、軟部組織肉腫、軟部組織肉腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺悪性腫瘍、尿道癌、子宮癌、肉腫、小児にまれな癌、膣癌、外陰癌、又はウィルムス腫瘍。
他の実施形態では、本発明は、ＮＳＣを同定する方法であって、ＯＣＴ４と特異的に相互作用する作用物質を、初代細胞培養物又は細胞株培養物を含む細胞培養物に導入することによって、腫瘍細胞集団に接触させるステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、ＮＳＣ亜集団は、「軟性又は硬性」の腫瘍内で同定される。他の実施形態では、「硬性」の腫瘍は、「軟性」に分類される白血病、リンパ腫、メラノーマ、及び多発性骨髄腫を除く全ての腫瘍を含む。他の実施形態では、ＮＳＣは、転移細胞内で同定される。
他の実施形態では、本発明は、ＮＳＣを同定する方法であって、ここに記載したように、ＯＣＴ４と特異的に相互作用する作用物質を、腫瘍細胞集団に接触させるステップと、前記作用物質が特異的に相互作用した細胞を同定するステップとを含む方法を提供する。他の実施形態では、ＯＣＴ４を同定する前記作用物質は、細胞膜と相互作用する。他の実施形態では、前記作用物質は、ＯＣＴ４又はその断片をコードするＰＯＵ５Ｆ１遺伝子と相互作用する。他の実施形態では、前記作用物質は、ＯＣＴ４又はその断片をコードするｍＲＮＡと相互作用する。他の実施形態では、前記作用物質は、ＯＣＴ４タンパク質又はその断片と相互作用する。他の実施形態では、前記作用物質は、これに限定するものではないが、例えばリン酸化ＯＣＴ４タンパク質などの、ＯＣＴ４の特定の翻訳後形態と相互作用する。
他の実施形態では、本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖の形でＯＣＴ４ ｍＲＮＡと特異的に相互作用するＤＮＡプローブを使用してＮＳＣを同定する方法を提供する。他の実施形態では、前記ＮＳＣを同定する方法は、ＲＮＡ−ＲＮＡホモ二重鎖の形でＯＣＴ４ ｍＲＮＡと特異的に相互作用するＲＮＡプローブを使用する。他の実施形態では、前記ＮＳＣを同定する方法は、ＰＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖の形でＯＣＴ４ ｍＲＮＡと特異的に相互作用するペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを使用する。他の実施形態では、前記核酸プローブ又はＰＮＡプローブは、容易に同定できるラベルをさらに含む。他の実施形態では、前記方法は、ＯＣＴ４発現細胞の選択的な同定を可能にする核酸を含む特異的プローブを使用する。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４タンパク質又はその断片と特異的に相互作用するリガンドを含有するＮＳＣを同定する方法を提供する。他の実施形態では、単クローン性又は多クローン性の抗ＯＣＴ４抗体は、ＯＣＴ４を検出するのに使用される。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４発現細胞を検出する方法を提供する。他の実施形態では、前記検出方法は直接的であり、放射性標識を使用する。他の実施形態では、前記放射性標識は、例えば３２Ｐ又は１２５Ｉなどの放射性化合物を含む。他の実施形態では、直接的な標識方法は、蛍光性、化学発光法、又は金標識を含む。他の実施形態では、前記検出方法は間接的であり、当業者に周知の免疫組織化学的プローブと類似する核酸プローブを含む。他の実施形態では、プローブは、検出可能な事象（例えば、化学発光、比色分析又は蛍光性）を引き起こす酵素をハイブリダイゼーションの部位に移動させるハプテン又はビオチンによって標識化される。他の実施形態では、検出信号の増幅が必要とされる場合は、一次抗体を特異的に同定する二次標識化抗体が使用される。他の実施形態では、抗体を含む特異的プローブを使用する前記方法は、ＯＣＴ４発現細胞の選択的な同定を可能にする。
他の実施形態では、ＯＣＴ４発現のための異種細胞集団には、同定可能なレポーター遺伝子産物の発現を制御するＯＣＴ４応答性プロモータを含有するプラスミドがトランスフェクトされる。他の実施形態では、前記同定可能な遺伝子産物は、緑色蛍光タンパク質（GFP、Emerald、Azami Green又はZsGreenlなど）、青色蛍光タンパク質（EBFP又はSapphire）、シアン色蛍光タンパク質（Cerulean、 ECFP、AmCyanl又はMidoriishi-Cyan）、黄色蛍光タンパク質（ZsYellowl、PhiYFP、Citrine又はVenus）、オレンジ色蛍光タンパク質（Kusabira-Orange又はmOrange）、赤色蛍光タンパク質（DsRed、HcRed、mPlum、mRaspberry、mTomato、mStrawberry又はgreen-to-red fluorescent Dendra）を含む。他の実施形態では、前記同定可能な遺伝子産物は、細胞発現ＯＣＴ４と非発現ＯＣＴ４との間で、識別可能マーカーとしての役割を果す（図８）。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４を発現するＮＳＣを同定する方法であって、検出されたＮＳＣを可視化するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、ＯＣＴ４を発現するＮＳＣの可視化は、標識化された試料をフイルムに露出することにより行われる。他の実施形態では、ＯＣＴ４を発現するＮＳＣの可視化は、蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。他の実施形態では、ＯＣＴ４を発現するＮＳＣの可視化は、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。他の実施形態では、ＯＣＴ４を発現するＮＳＣの可視化は、電子顕微鏡を用いて行うことができる。他の実施形態では、ＯＣＴ４を発現するＮＳＣの可視化には、光学顕微鏡が使用される。一方、他の実施形態では、前記信号は、裸眼で検出可能である。他の実施形態では、上述した可視化方法の検出結果は、さらに、記録及び／又はＣＣＤカメラ上で可視化することができる。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍性幹細胞を単離する方法であって、ＯＣＴ４と特異的に相互作用する作用物質を、腫瘍細胞集団に接触させるステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、初代細胞培養物又は細胞株培養物を含む細胞培養物が用いられる。
他の実施形態では、本発明は、細胞単離方法を含む細胞分離方法を提供する。他の実施形態では、細胞分離方法の前に、組織解離技術が用いられる。他の実施形態では、組織分離を効果的にするために、例えば、リベラーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ディスパーゼ、コラゲナーゼ又はそれらの組み合わせなどの酵素が用いられる。他の実施形態では、必要があれば、さらに細胞集合体をピペットの先端で粉砕して粉々にする。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍性幹細胞を単離する方法であって、腫瘍細胞に、ＯＣＴ４と特異的に相互作用する作用物質を接触させるステップと、前記作用物質が特異的に相互作用する前記細胞を単離するステップとを含む方法を提供する。他の実施形態では、上述した、腫瘍性幹細胞を同定するための前記方法は、特に、腫瘍細胞に、ＯＣＴ４タンパク質又はｍＲＮＡと特異的に相互作用する作用物質を接触させるステップは、ＮＳＣの単離にも使用可能である。
他の実施形態では、本発明は、同定可能な及び／又は選択可能な遺伝子産物の発現を制御するＯＣＴ４応答性プロモータを含有するプラスミドがトランスフェクトされた異種細胞集団を提供する（図８）。他の実施形態では、上述した、様々な同定可能な蛍光タンパク質配列の使用を含む腫瘍性幹細胞を同定するための前記方法は、細胞分離方法にも用いられる。他の実施形態では、前記同定可能な遺伝子産物は、ＯＣＴ４発現細胞を単離するのに選択的に使用され、結果として均一なＯＣＴ４発現ＮＳＣが得られる。
他の実施形態では、ＯＣＴ４を発現するＮＳＣが、クロマトグラフィーカラム内で分離される。前記カラムに付着されたＯＣＴ４に特異的な抗体が、ＯＣＴ４発現ＮＳＣと結合することにより、前記ＯＣＴ４発現ＮＳＣを分離する。他の実施形態では、磁粉と共有結合しており、ＯＣＴ４と特異的に相互作用する作用物質が、磁界内でＯＣＴ４発現ＮＳＣを保持するのに使用される。他の実施形態では、図１０に示すように、蛍光標識を含む抗体で標識化されたＯＣＴ４発現ＮＳＣのＦＡＣＳソートが、異種細胞集団からＮＳＣを分離するのに用いられる。他の実施形態では、ここに記載した前記分離方法によって、単離されたＯＣＴ４発現細胞の集団を得ることができる。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４を発現するＮＳＣを富化する方法を提供する。他の実施形態では、初代細胞培養物は、ＯＣＴ４発現細胞について富化されている。他の実施形態では、ＯＣＴ４発現ＮＳＣを富化する方法に用いられる前記初代細胞培養物は、軟性腫瘍、硬性腫瘍又は転移細胞集団に由来する。他の実施形態では、前記ＯＣＴ４発現ＮＳＣ亜集団は、細胞株に由来する細胞を含有する組織培養物から富化される。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４発現ＮＳＣを富化する方法であって、選択可能な遺伝子産物の発現を制御するＯＣＴ４応答性プロモータを含有するプラスミドを異種細胞集団にトランスフェクトするステップを含む方法を提供する（図８）。他の実施形態では、前記選択可能な遺伝子産物は、抗生物質抵抗性タンパク質をコードする。他の実施形態では、前記細胞富化方法は、選択物質をさらに含む。他の実施形態では、前記選択物質は、ＯＣＴ４非発現細胞を選択的に除去する抗生物質であり、結果として富化されたＯＣＴ４発現ＮＳＣ細胞集団を得られる。
他の実施形態では、本発明は、癌を誘発する方法であって、ＯＣＴ４発現について富化された腫瘍性幹細胞集団を哺乳類に導入する方法を提供する。他の実施形態では、前記癌を誘発する方法は、癌をもたらす細胞成長を促進するステップを含む。他の実施形態では、前記癌を誘発する方法は、癌を引き起こす転移細胞を提供するステップを含む。
他の実施形態では、本発明のＮＳＣは、乳房球（mammasphere）、肉腫球（sarcosphere）又は神経球（neurosphere）から単離され、癌誘発因子として使用される。他の実施形態では、動物にＮＳＣが接種される。他の実施形態では、ＮＳＣは、静脈注入される。他の実施形態では、ＮＳＣは、骨に注入される。他の実施形態では、ＮＳＣは、動物の皮内、筋肉内又は腹腔内に注入される。他の実施形態では、ＮＳＣは、モデル動物の乳腺に直接的に注入される。他の実施形態では、接種は、モデル動物の脂肪体へのＮＳＣの注入を含む。
他の実施形態では、本発明は、癌を誘発する方法を提供する。他の実施形態では、ここに記載した前記癌を誘発する方法は、免疫不全げっ歯類を対象にして行われる。他の実施形態では、前記免疫不全げっ歯類は、ヌードマウス又はラットである。他の実施形態では、前記免疫不全げっ歯類は、ＳＣＩＤマウスである。他の実施形態では、前記免疫不全げっ歯類は、ＮＩＨ−ＩＩＩマウスである。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍又は転移を誘発する方法であって、ＯＣＴ４発現について富化された腫瘍性幹細胞集団を哺乳類に導入するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、同所性腫瘍又は異所性腫瘍が誘発される（図１１）。他の実施形態では、転移は、リンパ系を介して、血流を介して、体腔を介して広がることにより、又は、移植を介して起きる。
他の実施形態では、本発明は、癌の進行及び／又は発症をインビボで分析する方法であって、ＯＣＴ４高腫瘍性幹細胞を動物に移植するステップと、前記動物における癌の進行及び／又は発症を分析するステップとを含む方法を提供する。他の実施形態では、癌は、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、又は骨髄腫を含む。
他の実施形態では、本発明のＮＳＣは、ＯＣＴ４高腫瘍性幹細胞に蛍光タンパク質をトランスフェクトすることにより標識化される。他の実施形態では、前記同定可能な遺伝子産物は、上述したような様々な蛍光タンパク質を含む。他の実施形態では、前記同定可能な遺伝子産物は、発光タンパクを含む。他の実施形態では、前記発光タンパクは、発光酵素である。他の実施形態では、動物モデルに移植された前記ＯＣＴ４高腫瘍性幹細胞を追跡するのに、アイソトープが使用される。他の実施形態では、前記アイソトープは、３２Ｐ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１２３Ｉ、１４Ｃ、１０９Ｃｄ、５１Ｃｒ、６７Ｃｕ、１７９Ｔａ、１１１Ｉｎ、１８Ｆ、又はそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、細胞検出に、磁気標識が使用される。
他の実施形態では、本発明の移植された標識化細胞は、単光子放射型コンピュータ断層撮影（single-photon emission computerised tomography：ＳＰＥＣＴ）装置、又は陽電子放出型断層撮影（positron emission tomography：ＰＥＴ）装置により追跡される。他の実施形態では、細胞を磁気標識した場合は、ＭＲＩが細胞検出に使用される。他の実施形態では、背面照射型の冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラが発光検出に使用される。他の実施形態では、励起フィルター及び発光フィルターによるＬＥＤ発光が、蛍光標識された細胞の検出に使用される。他の実施形態では、約４９０ｎｍで発光する光ファイバーを有する照明ボックス、及び前記ボックスの頂部に配置されたフィルターが、大型腫瘍を画像化するのに使用される。他の実施形態では、光源及び約４９０ｎｍで励起させるフィルターを備える蛍光解剖顕微鏡使用して、小型腫瘍及び転移が可視化される。他の実施形態では、カラーＣＣＤカメラ並びに二重光子レーザが、蛍光タンパク質発現のインビボでの超高分解能画像化に使用される。
他の実施形態では、本発明は、癌の進行及び／又は発症をインビボで分析する方法であって、細胞転移を検出するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、細胞転移の分析は、原発腫瘍とは不連続の部位での細胞の累進的成長の測定を含む。他の実施形態では、細胞転移の部位の分析は、新生腫瘍拡散の経路を含む。或る実施形態では、細胞は、血管、リンパ管、体腔、又はそれらの組み合わせを経由して分散する。他の実施形態では、細胞転移分析は、細胞移動、散布度、管外遊出、増殖又はそれらの組み合わせを考慮して行われる。
他の実施形態では、本発明は、癌の進行及び／又は発症をインビボで分析する方法を提供する。他の実施形態では、癌の進行及び／又は発症のインビボでの分析は、腫瘍進行の程度の測定を含む。他の実施形態では、分析は、腫瘍の同定を含む（図１１）。他の実施形態では、腫瘍進行の分析は、元の腫瘍又は「原発腫瘍」に対して行われる。他の実施形態では、当業者には周知のように、分析は、癌の種類に応じて長期間行われる（図１１）。他の実施形態では、原発腫瘍の転移細胞に由来する二次性腫瘍がインビボで分析される。他の実施形態では、二次性腫瘍のサイズ及び形状が分析される。或る実施形態では、さらに、体外での分析が行われる。他の実施形態では、図１に示すように、軟骨肉腫又は骨肉腫におけるＯＣＴ４発現細胞の頻度が評価される。
他の実施形態では、「評価（assessed）」、「スクリーン（screened）」、「評価」（evaluated）、「分析（analyzed）」は、同じ意味で使用される。
他の実施形態では、当業者には周知のように、転移又は腫瘍の病理学的サンプルが、特定の時点で評価される。他の実施形態では、腫瘍抑制遺伝子、癌遺伝子、アポトーシス遺伝子、情報伝達遺伝子、レセプター、転写因子、リガンド又はそれらの組み合わせを分析する定量的又は定質的な方法は、ＰＣＲ、ウエスタンブロット法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、免疫組織化学的又はin situ ハイブリダイゼーションがさらに用いられる。
他の実施形態では、腫瘍又は転移細胞が、更なる分析のために、病理学的サンプルから単離される。他の実施形態では、腫瘍又は転移細胞が、病理学的サンプルから単離され、培養物内で成長させられる。他の実施形態では、原発腫瘍細胞培養物の細胞増殖力が評価される。他の実施形態では、ＯＣＴ４陽性細胞は、上述した方法に従って、腫瘍又は転移細胞を含有している病理学的サンプルから単離及び／又は富化される。他の実施形態では、前記腫瘍から単離されたＯＣＴ４陽性細胞が、さらに分析される。或る実施形態では、様々な作用物質がさらに、腫瘍又は転移初代細胞培養物に使用される。他の実施形態では、前記物質は、発癌物質である。他の実施形態では、前記物質は、プロアポトーシス物質又は分化誘発物質である。
他の実施形態では、本発明は、初代細胞培養物に対する発癌物質の効果を評価する方法を提供する。他の実施形態では、前記発癌物質は、これに限定するものではないが、国際癌研究機関（International Agency for Research on Cancer：ＩＡＲＣ）が分類したカテゴリー１〜３の発癌性物質を含む。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍又は転移細胞に由来する初代細胞培養物に対する治療薬の効果を評価する方法を提供する。他の実施形態では、腫瘍又は転移細胞に由来する初代細胞培養物において、治療薬がエクスビボでスクリーンされる。他の実施形態では、前記治療薬は、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗作用物質、抗腫瘍抗生作用物質、植物性（ビンカ）アルカロイド、ステロイドホルモン、又はそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、前記治療薬は、化学療法薬剤である。他の実施形態では、前記化学療法薬剤は、非特異的であり、それゆえに、細胞周期の全ての段階において癌性細胞を殺滅する。他の実施形態では、前記化学療法薬剤は、特異的であり、それゆえに、細胞周期の特定の段階において癌性細胞を殺滅する。
他の実施形態では、本発明は、臨床腫瘍試料（原発的なものであろうと転移性であろうと）又は永久腫瘍細胞株に由来し、各癌幹細胞集団の単離及び増殖を可能にすべく操作可能な異種癌細胞集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、Ｏｃｔ３／４転写因子プロモータによって駆動される蛍光性（又は発光性）タンパク質の発現を維持する能力に基づいて、ＮＳＣのサブセットを、同定、選別、及び培地内で安定的に維持するための方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、胚発育（自己再生の過程を含む）に関して、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ及びＳＴＡＴ３と協力して、正常な幹細胞表現型の調節因子として作用するＯｃｔ３／４転写因子を提供する。
他の実施形態では、本発明のＮＳＣは、癌に関しては、適切な増殖制御を有しない。したがって、ＮＳＣの自己再生プロセスはチェックされないので、増殖部位において組織塊の形成異常が引き起こされる。他の実施形態では、本発明の方法は、上述した分子機構と平行して調節されるバイオカーカーの使用を提供する。他の実施形態では、これらの調節されたバイオマーカーは、癌細胞の「幹細胞らしさ（stemness）」をモニタする。
他の実施形態では、本発明は、ＮＳＣ集団の「相対的生存能力」及び「幹細胞らしさ」のモニタを可能にする。
他の実施形態では、本発明は、体内器官への転移の原因となるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、体内器官への転移に必要なＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明は、治療（手術、放射線療法、化学療法）の実施後に原発部位での再発癌の成長の原因となるＮＳＣを提供する。他の実施形態では、本発明の方法は、転移能力を有するＮＳＣを標的にする薬剤の同定を可能にするプラットフォームを提供する。
他の実施形態では、本発明の方法は、小型フォーマットで培養された細胞を使用して実施される。他の実施形態では、本発明の小型フォーマットで培養された細胞は、マルチウェルプレートを含む。他の実施形態では、本発明のマルチウェルプレートは、９６ウエルを含む。他の実施形態では、本発明のマルチウェルプレートは、３８４ウエルを含む（実施例２）。他の実施形態では、本発明のマルチウェルプレートは、１５３６ウエルを含む。他の実施形態では、本発明のマルチウェルプレートは、２〜５０００ウエルを含む。他の実施形態では、本発明のマルチウェルプレートは、２０〜３０００ウエルを含む。他の実施形態では、本発明のマルチウェルプレートは、９６〜２０００ウエルを含む。
他の実施形態では、本発明は、初代細胞培養物に由来する腫瘍に対する、光線力学療法（photodynamic therapy：ＰＤＴ）の効果を評価する方法を提供する。他の実施形態では、初代細胞培養物に由来する腫瘍に対する、単独での又は他の任意の治療薬と組み合わせた放射線治療又は高周波アブレーションの効果がさらに評価される。他の実施形態では、初代細胞培養物に由来する腫瘍に対する、化学塞栓術の効果がさらに評価される。他の実施形態では、初代細胞培養物に由来する腫瘍に対する、局所温熱法の効果が分析される。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４発現ＮＳＣが移植された動物に、所望の作用物質をインビボで投与する方法を提供する。他の実施形態では、前記ＯＣＴ４発現ＮＳＣは、ＯＣＴ４高を発現する。他の実施形態では、作用物質の投与は、当該技術分野では周知の方法に従って行われる。他の実施形態では、当該技術分野では周知のように、単数又は複数の作用物質の単数回又は複数回の投与が必要とされる。他の実施形態では、前記単数又は複数の作用物質は、当該技術分野では周知のように、癌の進行及び／又は退行に応じて、数日又は数週間或いは数ヶ月〜数年の期間に渡って投与される。他の実施形態では、前記作用物質は、発癌性物質である。他の実施形態では、前記発癌性物質は、国際癌研究機関（ＩＡＲＣ）が分類したカテゴリー１〜３の発癌性物質を含む。他の実施形態では、前記作用物質は、治療薬である。
他の実施形態では、本発明は、癌進行に対する治療薬の効果を調査するための手段を提供する（図１２）。他の実施形態では、細胞転移能力に対する治療薬の効果が評価される。他の実施形態では、軟性腫瘍に対する治療薬の効果が評価される。他の実施形態では、硬性腫瘍に対する治療薬の効果が評価される。他の実施形態では、一次的及び／又は二次的腫瘍の成長に対する治療薬の効果が評価される。
他の実施形態では、ＯＣＴ４又はＯＣＴ４高腫瘍性幹細胞（図１２）が移植された動物にインビボで投与される前記治療薬は、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、植物性（ビンカ）アルカロイド、ステロイドホルモン、又はそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、前記治療薬は、化学療法薬剤である。他の実施形態では、前記化学療法薬剤は、非特異性であり、それゆえに、細胞周期のあらゆる段階において癌性細胞を殺滅する能力を有する。他の実施形態では、前記化学療法薬剤は特異性であり、それゆえに、細胞周期の特定の段階において癌性細胞を殺滅する。
他の実施形態では、ＯＣＴ４高腫瘍性幹細胞が移植された動物におけるＰＤＴのインビボでの効果が評価される。他の実施形態では、単独での又は他の任意の治療薬と組み合わせた放射線治療又は高周波アブレーションのインビボでの効果がさらに評価される。他の実施形態では、癌進行及び／又は退行に対する、化学塞栓術又は局所温熱法のインビボでの効果がさらに評価される。
他の実施形態では、腫瘍又は初代細胞培養物に由来するＯＣＴ４高腫瘍性幹細胞が形質移入された動物における、生物学的療法のインビボでの効果が分析される。他の実施形態では、生物学的療法は、免疫療法を含む。他の実施形態では、免疫療法は、上述したような、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、ＯＣＴ４又はそれらの組み合わせ由来する免疫原性断片を含むワクチンの使用を含む。他の実施形態では、非特異的免疫抑制薬の効果が評価される。他の実施形態では、前記非特異的免疫抑制薬は、ＢＣＧ（bacillus Calmette-Gueriri）又はレバミゾールである。
他の実施形態では、ＯＣＴ４修飾因子が、ＯＣＴ４ｈｉ腫瘍性幹細胞が移植された動物の癌の進行又は退行について、インビボでスクリーンされる（図１２）。他の実施形態では、ＯＣＴ４モノクローナル抗体が、インビボでスクリーンされる。他の実施形態では、ＯＣＴ４タンパク質に特異的なイントラボディ（intrabody）が、インビボでスクリーンされる。他の実施形態では、図４に示すように、ＰＮＡ、アプタマー、又はアンチセンスのｓｉＲＮＡが、インビボでさらに評価される。
他の実施形態では、本発明は、癌、腫瘍成長、細胞転移、又はそれらの組み合わせを、予防、治療、阻害又は抑制する方法であって、ＯＣＴ４の発現又は機能を抑制する薬剤を腫瘍細胞に接触させるステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、ＯＣＴ４は、一時的に抑制される。他の実施形態では、ＯＣＴ４は、構成的に抑制される。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４を抑制する方法であって、ＤＮＡレベルでのＯＣＴ４発現を目的とし、それにより、ＯＣＴ４転写を抑制又は阻害するようにしたステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、ＤＮＡレベルでのＯＣＴ４の抑制は、ＤＮＡ三本鎖構造の形成によって達成される。他の実施形態では、前記三本らせん抑制複合体は、ＯＣＴ４遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドとしてデザインされ、それにより、ＯＣＴ４転写を抑制する。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４を抑制する方法であって、ＲＮＡレベルでＯＣＴ４発現を目的とし、それにより、ＯＣＴ４発現を抑制するようにしたステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。他の実施形態では、アンチセンスに基づいた治療が、ＯＣＴ４の抑制に使用される。他の実施形態では、合成オリゴヌクレオチドが、特定のＯＣＴ４ ｍＲＮＡ配列と相補的になるように設計され、それにより、ＯＣＴ４発現を抑制される。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４ ｍＲＮＡ配列とハイブリタイズしてＯＣＴ４発現を抑制するように人工的に構成されたペプチド核酸（ＰＮＡ）を提供する。他の実施形態では、前記結合物質は、ＯＣＴ４ ｍＲＮＡ転写物を開裂してＯＣＴ４発現を抑制するように特に人工的に作り出されたリボザイムである。
他の実施形態では、ＯＣＴ４機能を抑制する前記方法は、ＯＣＴ４タンパク質を標的にするステップを含む。他の実施形態では、ＯＣＴ４機能の抑制は、抗体のＯＣＴ４タンパク質への特異的結合によって達成され、それにより、ＯＣＴ４タンパク質のＯＣＴ４ ＤＮＡ応答配列への結合を抑制又は阻害する。他の実施形態では、免疫療法後に増加させられたイントラボディ（intabody）又は抗体が、ＯＣＴ４機能を抑制又は阻害する。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４タンパク質に特異的なイントラボディを提供する。他の実施形態では、イントラボディは、軽鎖の可変領域にペプチドリンカーを介して結合された重鎖の可変領域の単一鎖を有し、ＯＣＴ４タンパク質のＯＣＴ４ ＤＮＡ応答配列への結合を阻害するのに使用される。他の実施形態では、イントラボディは、細胞核に導かれ、ＯＣＴ４タンパク質のＯＣＴ４ ＤＮＡ応答配列への結合を抑制又は阻害する。他の実施形態では、前記イントラボディは、ＯＣＴ４タンパク質のＤＮＡ結合領域を標的にし、それにより、ＯＣＴ４タンパク質のＯＣＴ４ ＤＮＡ応答配列への結合を抑制又は阻害する。
他の実施形態では、本発明は、ＯＣＴ４ペプチドを含有するワクチンを提供する。他の実施形態では、前記ＯＣＴ４ペプチドは、ＯＣＴ４に対して特異的な抗体を増加させる。他の実施形態では、前記ペプチドは、完全長ＯＣＴ４遺伝子から成る。他の実施形態では、前記ペプチドは、ＯＣＴ４の突然変異型である。他の実施形態では、長さが４〜１８アミノ酸のＯＣＴ４ペプチドが使用される。他の実施形態では、前記ワクチンは、長さ及び配列が均一なＯＣＴ４ペプチドを含有する。他の実施形態では、前記ワクチンは、長さ及び配列の両方が異なる複数のＯＣＴ４ペプチドの混合物を含有する。
他の実施形態では、ＯＣＴ４タンパク配列と特異的に結合するオリゴヌクレオチド・アプタマーが使用され、それにより、ＯＣＴ４タンパク質のＯＣＴ４ＤＮＡ応答配列への結合を抑制又は阻害する。
他の実施形態では、本発明は、変異型ＯＣＴ４タンパク質を提供する。他の実施形態では、前記変異型ＯＣＴ４タンパク質は、下流ＯＣＴ４応答性遺伝子の転写を阻害するのに使用される。他の実施形態では、ＯＣＴ４応答性遺伝子発現の抑制又は阻害に使用される前記変異型ＯＣＴ４タンパク質は、ＯＣＴ４ＤＮＡ応答性遺伝子に対しては、野生型ＯＣＴ４タンパク質と同様な親和性を有する。他の実施形態では、ＯＣＴ４応答性遺伝子発現の抑制又は阻害に使用される前記変異型ＯＣＴ４タンパク質は、ＯＣＴ４ＤＮＡ応答性遺伝子に対しては、野生型ＯＣＴ４タンパク質よりも高い親和性を有する。
≪材料及び方法≫
組織におけるＯＣＴ４、ＳＴＡＴ３又はＮａｎｏｇ陽性細胞の免疫組織化学的同定
ヒト及びマウスからの腫瘍生検のＯＣＴ４、ＳＴＡＴ３又はＮａｎｏｇ組織学的解析のための免疫組織化学的染色を次のようにして行った。ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した組織切片（５μｍ）を、トリロジー（Trilogy，登録商標）アンマスキング溶液（Cell Marque, Hot Springs AR）内において９５℃で２５分間抗原回復を行った後、連続的に脱パラフィンし、再水和し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。ヤギＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｋｉｔ（Vector Labs, Burlingame, CA）を用いて、スライドをビオチンブロッキングし、血清ブロッキングし、免疫染色した。ＯＣＴ３／４、ＳＴＡＴ３及びＮａｎｏｇに対する抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN）を、１：５０希釈で加え、室温で１時間反応させた。ＤＡＢ（3,3'-Diaminobenzidene）によりポジティブ染色を検出し、ライトグリーンＳＦイエローイッシュ又はヘマトキシリン（Sigma, St. Louis, MO）を対比染色剤として用いた。あるいは、クライオスタットによる薄片作成のために原発性乳癌病巣及び脳及び肺を収集した。組織をクライオスタットで１６μｍに切断し、軸平面（乳房及び肺）及び冠状面（脳）のセットを作成した。あるセットにはヘマトキシリン‐エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色法を実行し、別のセットには免疫組織化学法を行った。免疫組織化学法は次の手順で実施した。凍結した乳房、肺及び脳切片を、（１）２％無脂肪乳及び０．３％トライトンＸを含むＰＢＳ中で１時間インキュベートし、（２）ＯＣＴ４、ＳＴＡＴ３又はＮａｎｏｇ抗体を含む３％ロバ血清及び０．１％トライトンＸ中で、室温で一晩インキュベートし、（３）ＰＢＳで３回洗浄し、（４）二次抗体で、室温で４時間インキュベートし、（５）ＰＢＳで３回洗浄し、（６）濃度勾配エタノールにより脱水し、キシレンで洗浄し、ＤＰＸ封入剤でカバースリッピングした（44581, Fluka Biochemika）。免疫活性をバイオ・ラッド社製の共焦点顕微鏡により可視化し、後の解析のために画像をコンピュータに収集した。
ＯＣＴ４、ＳＴＡＴ３又はＮａｎｏｇ陽性細胞培養物の免疫細胞化学的同定
ヒト及びマウスの腫瘍バイオプシの初代培養におけるＯＣＴ４、ＳＴＡＴ３又はＮａｎｏｇ陽性細胞を同定するための免疫組織化学的染色を行った。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において試料を３００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ・タイプＩＩ（Gibco BRL Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA）で３〜６時間消化して小粒子に細分化した後、７０μｍセルストレーナー（Cell Strainer）（Becton Dickinson Lab Ware, Franklin Lakes, NJ USA）を通過させて単細胞懸濁液を作成した。次に、培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗浄し、培養培地に懸濁させてプレートした。細胞が付着した後、０．１％のトライトンＸ‐１００と共に新鮮な４％ホルマリンを含む固定化溶液を加えた。ヤギＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｋｉｔ（Vector Labs, Burlingame, CA）を用いてビオチンブロッキング、血清ブロッキング、免疫染色した後に、細胞の内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。ＯＣＴ３／４、ＳＴＡＴ３及びＮａｎｏｇに対する抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN）を１：２００の希釈率で加え、室温で３０分間反応させた。ＤＡＢ（3,3'-Diaminobenzidene）によりポジティブ染色を検出し、ヘマトキシリン（Sigma, St. Louis, MO）を対比染色剤として用いた。
ＯＣＴ４−ＥＧＦＰ及びＮａｎｏｇ−ＥＧＦＰ構築物
従来公知の方法及び技術（Gerrard et al., 2005）を用いて、ＯＣＴ４−ＥＧＦＰ及びＮａｎｏｇ−ＥＧＦＰ構築物を作成した。ＯＣＴ４及びＮａｎｏｇプロモータの制御下で、ＥＧＦＰレポーター（ｐＥＧＦＰ１，BD Biosciences）及び選択可能なマーカーＧ４１８を含むプラスミドを使用した。ヒトＯＣＴ４のプロモータ断片は、ＯＣＴ４遺伝子の塩基‐３９１７から塩基＋５５まで（ｈＯＣＴ４ｐｒ：ヒトＤＮＡ配列において６７５３９から７１４９０まで）に及ぶ、特異的なＥＧＦＰ発現を発生させるように駆動する２つの適切な調節要素を含む。ヒトＮａｎｏｇのプロモータ断片は、塩基−１３２から塩基＋３００まで（染色体１２のヒトゲノムＤＮＡ配列において塩基６９７９６９から塩基７０１２６９まで）に及ぶ。
バイオマークされた細胞を作成するために用いられる発現ベクター
Ｏｃｔ−４プロモータ（ＯＣＴ４ｈＰ，アクセス番号ＡＰ０００５０９のヒトＤＮＡ配列において６７５３９から７１４９０まで）を用いてＯＣＴ４ｈＰ‐ｅＧＦＰプラスミドを構築した。Ｏｃｔ−４プロモータは、ヒトゲノムＤＮＡ（Promega G3041）を鋳型として用いて、プライマーＯｃｔ４ｈＰ‐Ｆ（5'-TT CCC ATG TCA AGT AAG TGG GGT GG-3'）及びＯｃｔ４ｈＰ−Ｒ（5'-CGA GAA GGC AAA ATC TGA AGC CAG G-3'）を使用したポリメラーゼ連鎖反応法により増幅させた。この断片をＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にクローンし、ＤＮＡ配列の忠実度を双方向性ＤＮＡシーケンシングにより確認した。次に、ＯＣＴ４ｈＰを、発現ベクターｐＥＧＦＰｌ（Clontech Cat # 6086-1，Genbankアクセス番号Ｕ５５７６１）のｅＧＦＰの上流にあるＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨ１部位に挿入することによってこのプラスミドにクローンした（図１２Ａ）。
グリア芽細胞腫、骨肉腫及び乳癌からのＮＳＣの単離及び解析のための神経球培養系の改変
ワイスとレイノルズ（Weiss and Raynolds, 1992）が提唱した神経球培養系を、半固体メチルセルロース（ＭＣ）において多面発現的な成長因子ＥＧＦ、ＦＧＦ２及びインスリンを活用して細胞の基質付着能力を抑制することによって改変した。この実験では、図７に示すように、ＮＳＣに、ＯＣＴ４のヒトプロモータ下流でＥＦＧＰ及びＧ４１８遺伝子を有するＥＧＦＰレポータープラスミドをトランスフェクトした。
病変及び病巣の精査
ＧＦＰ３フィルタ（蛍光能力用）を備えたライカＭＺ１６ＦＡ解剖顕微鏡と、インビトロ試験及び分子解析用のＲＧＢフィルタを備えたＱＩｍａｇｉｎｇ社のＲｅｔｉｇａ ＥＸｉモノクロデジタルカメラとを用いて、病変及び病巣をそれらのそれぞれの組織位置から精査した。この腫瘍物質を、様々な分析法を用いてさらに試験した。
ＲＮＡ単離及び標的ｃＤＮＡ増幅
ＲＮｅａｓｙミニキット及びＤＮＡアーゼ処理用のＲＮＡアーゼフリー・ＤＮアーゼセット（Qiagensciences, MD, USA）を用いて全ＲＮＡを単離した。スーパースクリプトＩＩ ＲＮアーゼ Ｈ＋逆転写酵素ファーストストランド合成システム（InVitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）をプライミングすることによって１．５μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。プラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（InVitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて３７サイクルのＰＣＲを行うことによって、標的ｃＤＮＡを増幅した。ヒトβチューブリンＩＩＩ用のプライマーを使用して、Ｈｂｅｔａ４遺伝子の非翻訳３’ＵＴＲ領域から転写された１３５６〜１４９７ｂｐ産物を増幅した（Kavallaris et al., 1997）。ヒトＯＣＴ３／４（アクセス番号Ｚ１１８９８）、Ｎａｎｏｇ（ＮＭ ０２４８６５）、ＳＴＡＴ３（ＮＭ １３９２７６）、Ｇａｔａ−４（ＮＭ ００２０５２）、‐６（ＮＭ ００５２５７）、ＡＦＰ（ＮＭ ００１１３４）、Ｒｕｎｘ １（ＮＭ ００１７５４）のためのプライマーを、Ｏｌｉｇｏ５．１プログラムを用いることによって独自に作成した。全てのプライマーを表１に示す。
Figure 2009539374
ウエスタンブロット解析
５０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ４０、０．１％のＳＤＳ、１％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のバナジン酸ナトリウムと、以下のプロテアーゼ阻害剤、すなわち、５μｇ／ｍｌのペプスタチン、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＮａＦ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）とを含む溶解緩衝液に、細胞を、少なくとも１時間氷上で溶解した。遠心分離（１２，０００ｇで４℃、１０分間）した後、上清のタンパク質濃度を、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋマイクロプレートリーダー（Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を用いてＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, IL）によって測定した。溶解産物をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）と混合した（１：１）。１５μｇのタンパク質を、８〜１６％又は１０〜２０％のＴｒｉｓ‐ＨＣｌレディーゲル（Bio Rad Laboratories, Hercules, CA）の各レーンに入れ、電気泳動によって分離した。タンパク質が転写されたニトロセルロース膜（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を、メーカーが推奨するようにブロックし、４℃で振盪しながら対応する一次抗体と共に一晩インキュベートした。ここで、一次抗体は、ＳＴＡＴ３（R&D Systems）、ホスホ‐Ｔｙｒ７０５ ＳＴＡＴ３（Cell Signaling Technology, BL）、βＩＩＩチューブリン（BAbCO, Berkeley, CA）、βアクチン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、αフェトプロテイン（Santa Cruz Biotech, CA）、ＯＣＴ‐３／４（Santa Cruz Biotech, CA）、Ｎａｎｏｇ（RD systems）に対する一次抗体であり、５％ウシ血清（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）及び０．１％トウィーン２０（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を含む溶液で希釈されたものである。０．１％トウィーン２０を含むＴＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス又はウサギＩｇＧ二次抗体（Cell Signaling Technology, IL）又はウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA）と共にブロットをインキュベートした。免疫反応バンドをＥＣＬ+ウエスタンブロッティング検出試薬（Amersham Biosciences, UK）によって６０秒間以上検出し、Ｘ線フィルムに露光した。
トランスフェクションの前及び後の細胞培養液
３７℃、７．０％ ＣＯ２下で、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のキャラクタライズド・ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（HyClone, Logan, Utah, USA）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて細胞を培養した。ギブコ社製のセルポレーターパルサーを用いて電気穿孔法によって全ての細胞をトランスフェクトした。細胞懸濁液に１０μｇのプラスミドＤＮＡを添加し、当業者に既知のプロトコルに従ってトランスフェクトした（図１１Ｃ）。電気穿孔法の後、０．８％のＭＣ、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレッシン（１００μＭ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）、トランスフェリン（２５μｇ／ｍｌ）、インスリン（２０μｇ／ｍｌ）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）、成長因子ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及び組換えＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に全懸濁液を６０，０００細胞／２ｍｌ／ｗｅｌｌの密度でプレートした。
トランスフェクトされたＥＧＦＰ‐乳房球クローンの選択
トランスフェクトされたＥＧＦＰ‐乳房球クローンを選択するため、３日間の培養の後、Ｇ４１８を加えた（２００ｍｇ／ｍｌ）。Ｇ４１８を含んだプレート中では、緑色ＥＧＦＰ陽性クローンのみが発生し、更なる操作のためにそれらの細胞を収集した。作成したＥＧＦＰ陽性乳房球を用いて、ＥＧＦＰが安定に組み込まれたＥＧＦＰ亜集団を確立した。Ｏｃｔ４プロモータの制御下でＥＧＦＰを発現する緑色緑色乳房球は、付着せずに、懸濁した状態で増殖した（図７Ｂ）。蛍光顕微鏡下でＥＧＦＰ細胞を直接的に単離した（図１１Ｄ）。
例１：腫瘍におけるＯＣＴ４発現細胞の頻度
腫瘍におけるＯＣＴ４発現細胞の頻度をより良好に調査するために、骨肉腫腫瘍、グリア芽細胞腫腫瘍及び腺管癌に由来する連続切片に関して免疫組織化学的解析を行った。図１の結果は、骨肉腫及びグリア芽細胞腫の腫瘍にＯＣＴ４陽性核が存在することを示しており、さらに、図６Ａ及び図６Ｂの結果は、それぞれ、腺管癌及び脳に転移した乳癌にもＯＣＴ４陽性核が存在することを示している。ＯＣＴ４陽性細胞は腺管癌及び転移した乳癌の両方において観察されるが、腺管癌に包含される原発性乳癌（図６Ａ）に比べてより高頻度のＯＣＴ４陽性核が脳に転移した乳癌（図６Ｂ）で観察された。腫瘍及び転移癌は共にＯＣＴ４陽性細胞を含むので、本明細書に記載の方法によれば、これらのＯＣＴ４陽性細胞は癌治療において有効な標的であることがわかる。
例２：ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ及びＳＴＡＴ３は、グリア芽細胞腫臨床材料及び細胞株において一斉に発現する
ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ及びＳＴＡＴ３がグリア芽細胞腫臨床材料及び細胞株ＬＮ１８、ＬＮ２２９、ＬＮ４２８及びＵ２５１で同時発現するか否かを判定するために、半定量ＲＴ−ＰＣＲ解析を行い、その後にウエスタンブロット解析を行った。図２Ａに示されている結果は、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ及びＳＴＡＴ３のｍＲＮＡ発現が中程度から高いことを示す。タンパク質発現レベルは、図２Ｂに示されているように、ｍＲＮＡ発現レベルと相関していた。図２Ｂでは、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ及びＳＴＡＴ３のタンパク質発現レベルが中程度から高いことが示されている
例３：基質に付着状態又は非付着状態で増殖した腫瘍細胞におけるＯＣＴ４発現
腫瘍細胞におけるＯＣＴ４発現の細胞−基質付着に対する影響を調べるために、骨肉腫及び乳癌細胞を基質に付着させた状態で、或いは、肉腫球又は乳房球として非付着状態で増殖させた。図３に示す結果は、次のことを示す。ＯＣＴ４及びＮａｎｏｇの高発現は細胞付着に依存しているので、非付着状態すなわち肉腫球及び乳房球の形態で増殖した腫瘍細胞ではＯＣＴ４及びＮａｎｏｇは高度に発現されるが、付着状態で増殖した腫瘍細胞ではＮａｎｏｇ及びＯＣＴ４の発現は比較的低い（発現は抑制される）。
例４：神経球系で培養された神経膠腫由来の腫瘍幹細胞からのクローン生成におけるＯＣＴ４の役割
モデル培養系において自己複製の維持におけるＯＣＴ４遺伝子の機能的役割をテストするために、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４遺伝子に対してｓｉＲＮＡサイレンシングを行い、評価した（図４）。この目的のために、２つの細胞株及び患者から単離された原発腫瘍培養物を含む３つの代表的なグリア芽細胞腫細胞型に由来する腫瘍細胞に、ＥＧＦＰ及びＯＣＴ４ ｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクトし、神経球培養系内でプレートした。これと並行して、ＥＧＦＰ及びスクランブル対照ｓｉＲＮＡを細胞に同時にトランスフェクトして実験を行った。ＥＧＦＰ及びｓｉＲＮＡを形質移入されたクローンは、プレーティング後７日目に可視化された（図４Ａ）。細胞にＯＣＴ４‐ｓｉＲＮＡをトランスフェクトすることにより作成された検出可能なＥＧＦＰを有するクローンの割合は、対照のものと比較して６０％以上低下した（図４Ｂ）。これらの結果は、成長抑圧条件下で神経球培養系にプレートした腫瘍由来細胞の内因性ＯＣＴ４をｓｉＲＮＡで下方制御すると、腫瘍由来ＥＧＦＰ含有細胞によるクローン形成が著しく低下することを示す。
例５：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株をＥＧＦＰで標識し、同所性腫瘍形成におけるＮＳＣの関与を判断する
ヌードマウスにおいてＯｃｔ４プロモータ下でＥＧＦＰを安定的に発現する乳癌細胞株細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の腫瘍幹細胞を使用して、ＮＳＣの同所性腫瘍形成能を評価した。この分析は、ＥＧＦＰ発現が内因性ＯＣＴ４遺伝子発現と相関するという推測に基づいて行った。ＯＣＴ４陽性及びＯＣＴ４陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞にＯＣＴ４‐ＥＧＦＲ構築物をトランスフェクトし、ＦＡＣＳでソーティングし、４つのグループ（各グループ：３匹）に分けられたマウスに接種した。グループ１には動物１匹につき５，０００のＯＣＴ４陽性細胞を接種し、グループ２には動物１匹につき５０，０００のＯＣＴ４陽性細胞を接種し、グループ３には動物１匹につき５００，０００のＯＣＴ４陽性細胞を接種し、グループ４には動物１匹につき５００，０００のＯＣＴ４陰性細胞を接種した。図１１のグラフは、ＯＣＴ４陽性細胞を接種した動物では、接種後３７日目に腫瘍の発生は始まったが、ＯＣＴ４陰性細胞を接種した動物では、５０日目に腫瘍の発生が始まったことを示している。また、この結果は、単離されたＥＧＦＰ陽性細胞が、ＯＣＴ４、ＥＧＦＰ、ＣＤ４４、ＡＣ１３３及びＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ４を発現したことも示している（表２参照）。
表２：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞及び陽性対照細胞における幹細胞マーカーのＦＡＣＳ分析（結果はパーセンテージで示している）
Figure 2009539374
例６：Ｏｃｔ３／４プロモータによって駆動される蛍光バイオマーカーは、強力であり、癌幹細胞に対して特異的である
乳房球培養物はＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５黒色腫細胞株に由来し、Ｏｃｔ‐３／４発現癌幹細胞の存在についてバイオマークされている。ＯＣＴ４ｈＰ‐ｅＧＦＰ及びＣＭＶ‐ｍＲＦＰをＭＤＡ‐ＭＢ‐４３５細胞に、安定的にトランスフェクトした。その後、前記細胞をＧＦＰ発現細胞についてＦＡＣＳソートして、更なる研究用の高純度の癌幹細胞集団を作成した。図１３Ｂに示す懸濁状態の腫瘍由来球体の蛍光顕微鏡写真は、Ｏｃｔ３／４プロモータによって駆動される蛍光バイオマーカーが強力であり、癌幹細胞に対して特異的であることを実証している。さらに、図１３Ｄに示す付着腫瘍球体の蛍光顕微鏡写真も、同様のことを実証している。これらの結果は、Ｏｃｔ３／４プロモータにより駆動された蛍光は、強力であり、様々な系における治療対象として研究のためにバイオマークされた癌幹細胞に対して特異的であることを実証している。

Claims (33)

  1. ＯＣＴ４の発現について富化された単離された腫瘍性幹細胞集団。
  2. 請求項１に記載の集団であって、ＯＣＴ４の高発現に特徴付けられる集団。
  3. 請求項１に記載の集団を含有する組成物。
  4. 請求項３に記載の組成物であって、
    細胞培地をさらに含み、
    前記培地の約５０％が、初代ヒト包皮線維芽細胞の培地に由来することを特徴とする組成物。
  5. 請求項４に記載の組成物であって、
    前記培地が、最大で約１５％の血清を含有することを特徴とする組成物。
  6. 請求項４に記載の組成物であって、
    前記培地は、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、インスリン又はそれらの組み合わせが欠失していることを特徴とする組成物。
  7. 腫瘍性幹細胞を同定する方法であって、
    （ａ）ＯＣＴ４と特異的に相互作用する作用物質を、腫瘍細胞集団に接触させるステップと、
    （ｂ）前記作用物質が特異的に相互作用する細胞を同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
  8. 腫瘍性幹細胞を単離する方法であって、
    （ａ）ＯＣＴ４と特異的に相互作用する作用物質を、腫瘍細胞集団に接触させるステップと、
    （ｂ）前記作用物質が特異的に相互作用した細胞を単離するステップとを含むことを特徴とする方法。
  9. 請求項７又は８に記載の方法であって、
    前記作用物質が核酸を含むことを特徴とする方法。
  10. 請求項７又は８に記載の方法であって、
    前記作用物質がＯＣＴ４抗体であることを特徴とする方法。
  11. 請求項７又は８に記載の方法であって、
    前記同定するステップは、蛍光顕微鏡又は蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）の使用をさらに含むことを特徴とする方法。
  12. 請求項７又は８に記載の方法であって、
    前記腫瘍細胞は、固形腫瘍に由来することを特徴とする方法。
  13. 請求項７又は８に記載の方法であって、
    腫瘍細胞は、転移性であることを特徴とする方法。
  14. 腫瘍細胞集団を腫瘍性幹細胞について富化する方法であって、
    （ａ）複数の癌性細胞を含有する混合細胞集団に、ＯＣＴ４プロモータに作動可能に連結された抗生物質抵抗性遺伝子を含有するベクターを接触させるステップと、
    （ｂ）前記抗生物質の存在下で前記細胞を培養するステップとを含むことを特徴とする方法。
  15. 請求項１４に記載の方法であって、
    前記培養するステップは、細胞培地で行われ、
    前記細胞培地の約５０％が初代ヒト包皮線維芽細胞の培養培地に由来することを特徴とする方法。
  16. 請求項１４に記載の方法であって、
    前記混合細胞集団は、細胞株に由来することを特徴とする方法。
  17. 請求項１４に記載の方法であって、
    前記混合細胞集団は、腫瘍に由来する初代細胞培養物であることを特徴とする方法。
  18. 癌を誘発する方法であって、
    ＯＣＴ４の発現について富化された腫瘍性幹細胞集団を哺乳類に導入するステップを含むことを特徴とする方法。
  19. 請求項１８に記載の方法であって、
    前記腫瘍性幹細胞集団は、インビボで同所性腫瘍を引き起こすことを特徴とする方法。
  20. 請求項１８に記載の方法であって、
    前記腫瘍性幹細胞集団は、インビボで異所性腫瘍を引き起こすことを特徴とする方法。
  21. 請求項１８に記載の方法であって、
    前記腫瘍性幹細胞集団は、インビボで転移を開始することを特徴とする方法。
  22. 癌の進行及び／又は発症をインビボで分析する方法であって、
    （ａ）ＯＣＴ４高瘍性幹細胞を動物に移植するステップと、
    （ｂ）前記動物における癌の進行及び／又は発症を分析するステップとを含むことを特徴とする方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であって、
    前記ＯＣＴ４高腫瘍性幹細胞を標識化するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
  24. 請求項２２に記載の方法であって、
    癌の進行の分析は、細胞転移の測定を含むことを特徴とする方法。
  25. 請求項２２に記載の方法であって、
    癌の進行の分析は、転移進行の測定を含むことを特徴とする方法。
  26. 請求項２２に記載の方法であって、
    所望の作用物質を投与するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
  27. 請求項２６に記載の方法であって、
    前記作用物質が治療薬であることを特徴とする方法。
  28. 癌を治療、停止又は抑制するための医薬組成物を製造するための、腫瘍細胞内でＯＣＴ４の発現を抑制する作用物質の使用。
  29. 癌を治療、停止又は抑制するための医薬組成物を製造するための、腫瘍細胞内でＯＣＴ４の機能を抑制する作用物質の使用。
  30. 請求項２８又は２９に記載の使用であって、
    前記癌が腫瘍成長を含むことを特徴とする使用。
  31. 請求項２８又は２９に記載の使用であって、
    前記癌が細胞転移を含むことを特徴とする使用。
  32. 請求項２８又は２９に記載の使用であって、
    前記作用物質が核酸を含むことを特徴とする使用。
  33. 請求項２８又は２９に記載の使用であって、
    前記作用物質がＯＣＴ４抗体であることを特徴とする使用。
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