CN104013957A

CN104013957A - 用新的抗il13单克隆抗体治疗癌症

Info

Publication number: CN104013957A
Application number: CN201410077001.6A
Authority: CN
Inventors: 冯锡忠; 马修·莫伊尔
Original assignee: Tanox Inc
Current assignee: Genetic Technology Research Corp.
Priority date: 2003-12-23
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2024-12-23
Also published as: RU2752833C1; HK1201457A1; PL1711528T3; CA2551110A1; HRP20200592T1; CN1973053A; KR20130041373A; HUE049161T2; SI3718564T1; US8088618B2; JP2007537146A; CA2550651C; CN1973053B; US20120214971A1; IL176042A0; CY1113009T1; MX361174B; US8067199B2; US7674459B2; CA2550651A1

Abstract

本发明涉及IL13依赖性肿瘤疾病的治疗，包括给予新的抗IL13抗体。本发明还包括使用本发明的抗体检测患者体内的IL13过表达而诊断这类肿瘤或癌症。

Description

用新的抗IL13单克隆抗体治疗癌症

本申请是申请号为200480038820.4，申请日为2004年12月23日，发明名称为“用新的抗IL13单克隆抗体治疗癌症”的中国专利申请的分案申请。

发明背景

IL13是主要由CD4⁺T-辅助细胞2型细胞以及NKT细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生的多效性Th2细胞因子(Hershey,GKK,JAllergy Clin Immunol.(2003)111:677-90)。除了在哮喘、纤维化、慢性肺部阻塞性疾病和溃疡性结肠炎中的病原学作用之外(Wynn,TA,Annu Rev Immunol.(2003)21:425-56；Wynn TA.,Nat RevImmunol.(2004)4:583-94；Heller F et al.,Immunity(2002)17:629-38)，也已知IL13在肿瘤生长(Kapp U et al.,J Exp Med.(1999)189:1939-4；Trieu Y et al.,Cancer Res.2004；64:3271-5)和肿瘤免疫性调节(Terabe M et al.,Cancer Immunol Immunother.2004；53:79-85；Terabe M et al.,Nat Immunol.2000；1:515-20)中起重要作用。因此，IL13及其受体是癌症的潜在治疗靶。

霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma，HL)是一种淋巴结恶性疾病，其特征在于从HL的恶性细胞群Reed-Stemberg(RS)细胞中异常产生多种细胞因子(见Kapp等及Trieu等，如前所述)。IL13还显示出通过自分泌机制促进HL增殖。抗IL13中和单克隆抗体(MAb)显示出在体外抑制HL细胞增殖(Trieu等，如前所述)。

累积的证据表明IL13受体在多种人恶性肿瘤细胞系上表达(例如成胶质细胞瘤、头颈部肿瘤、鳞状细胞癌、肾细胞癌、AIDS-相关的Kaposi's癌、前列腺癌、胰腺癌、及上皮癌如胃、结肠和皮肤的腺癌)(见例如Debinski W et al.J Biol Chem.(1995)270:16775-80；Puri RKet al.Blood(1996)87:4333-9；Maini A et al.J Urol.(1997)158:948-53；Debinski W et al.Clin Cancer Res.(1995)1:1253-8；Kornmann M et al.Anticancer Res.(1999)19:125-31；Husain SR et al.Blood(2000)95:3506-13；Kawakami K et al.Cancer Res.(2001)61:6194-6200)。一种包含与突变形式的假单胞菌外毒素偶联的IL13的重组融合蛋白示出在体外特异性杀死这些肿瘤细胞。因此，这些数据提示IL13受体是介导选择性杀死肿瘤的引人注目的靶位。

现在已知抗肿瘤免疫性的主要介体是CD4⁺Th1细胞和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。由于朝向Th2的免疫偏移抑制Th1发生，已经提示在癌症患者体内诱导Th2应答是阻遏肿瘤免疫监视的主要机制。Terabe等人示出IL13抑制剂(sIL13R2-Fc)在小鼠模型中抑制肿瘤复发。应用STAT6或IL4R剔除的小鼠也发现相似的观测结果，但应用IL4剔除的小鼠没有观察到类似的结果。总之，这些结果表明IL13在体内抑制抗肿瘤免疫性中起重要作用。因此，抑制IL13可以促进癌症患者的抗肿瘤免疫性。

已经证实基于抗体的治疗方法在治疗各种癌症中非常有效。例如，已经分别被成功用于治疗乳腺癌和非霍奇金淋巴瘤。本发明提供了治疗癌症的另外的方法，这些方法克服了常规治疗方法的限制，并提供了从下文详细描述中将显而易见的额外优势。

发明概述

本发明涉及用新的抗IL13单克隆抗体治疗表达IL13的癌症和/或肿瘤。本发明使用的抗体包括新的抗IL13抗体，它们特异性并高亲和性地结合糖基化和非糖基化的人IL13，但不结合小鼠IL13，并且以约1:2(MAb:IL13)的摩尔比中和人IL13活性。包含衍生自所述抗体的轻链和/或重链可变区的抗原结合区的抗体也包括在本发明中。本发明的抗体可以是单克隆的，单克隆抗体可以是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

这些抗体例如是228B/C-1、228A-4、227-26和227-43。产生这些抗体的杂交瘤于2003年11月20日保藏在美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection,10801University Blvd.,Manassas,VA20110-2209），保藏号分别为PTA-5657、PTA-5656、PA-5654和PTA-5655。这些抗体在体内可以靶向表达IL13的肿瘤细胞。这些抗体在共同在审专利申请(WO05062972,申请日为2004年12月23日)中描述，所述文献并入本文作参考。

可用于本发明的抗体还包括如下抗体：具有与SEQ ID NO:3所示序列有至少95％同源性的VL序列及与SEQ ID NO:4所示序列有至少95％同源性的VH序列的抗体；具有与SEQ ID NO:5所示序列有至少95％同源性的VL序列及与SEQ ID NO:6所示序列有至少95％同源性的VH序列的抗体；具有与SEQ ID NO:7所示序列有至少95％同源性的VL序列及与SEQ ID NO:8所示序列有至少95％同源性的VH序列的抗体。本发明还包括一种重组抗体分子或者其结合IL13的片段，其包含至少一个抗体重链或其结合IL13的片段和至少一个抗体轻链或其结合IL13的片段以及来自人单克隆抗体的构架区，所述至少一个抗体重链或其结合IL13的片段在第31－35(CDR1)、50－65(CDR2)和95-102(CDR3)(Kabat编号)位包含来自小鼠抗IL13抗体的非人CDR，其中第27－30位具有氨基酸Gly26、Phe27、Ser28、Leu29、Asn30(SEQ ID NO:18)，所述至少一个抗体轻链或其结合IL13的片段在第24－34(CDR1)、50－56(CDR2)和89-97(CDR3)位包含来自小鼠抗IL13抗体的非人CDR。

用于本发明的抗体还包括本发明的抗体的结合人抗原的抗体片段，包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)。本发明还包括包含VL或VH结构域的单域抗体。一个实例是具有SEQ ID NO:152所示序列的scFv。

用于本发明的抗体还包括单克隆抗体228B/C-1的人源化序列。这些人源化的重组抗体分子包含一个可变轻链区，其包含式为FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的氨基酸序列，其中FRL1由SEQ ID NO:20－25的任一个序列组成；CDRL1由SEQ IDNO:99－103的任一个序列组成；FRL2由SEQ ID NO:29组成；CDRL2由SEQ ID NO:104－114的任一个序列组成；FRL3由SEQ ID NO:30－56的任一个序列组成；CDRL3由SEQ ID NO:115－116的任一个序列组成；FRL4由SEQ ID NO:57－59的任一个序列组成；所述人源化的重组抗体分子还包含一个可变重链区，其包含式为FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4的氨基酸序列，其中FRH1由SEQ ID NO:60－66的任一个序列组成；CDRH1由SEQ IDNO:117－122的任一个序列组成；FRH2由SEQ ID NO:67－75的任一个序列组成；CDRH2由SEQ ID NO:123－134的任一个序列组成；FRH3由SEQ ID NO:76－90的任一个序列组成；CDRH3由SEQ IDNo:135－141的任一个序列组成；FRH4由SEQ ID NO:91－92的任一个序列组成。所述可变重链区可进一步包含恒定区的至少CH1结构域或者恒定区的CH1、CH2和CH3结构域。所述重链恒定区可包含一种IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或者IgG4抗体。

另外，本发明包括的抗体包含重组抗体分子，其中可变轻链选自SEQ ID NO:3、5、7、93、95、97、142、144和150中的任一个序列，可变重链选自SEQ ID NO:4、6、8、94、96、98、143、145、146、147、148和149中的任一个序列。一种特定的抗体包括具有SEQ IDNO:142所示序列的可变轻链和具有SEQ ID NO:143所示序列的可变重链。

MAb228B/C-1的结合表位被定位于IL13上的一个负责与IL4Rα相互作用的独特位点，其组成多聚的IL13R复合物的一部分。IL13上的这个结合位点远离负责IL13R相互作用的位点，因此，228B/C-1可以与结合在过表达IL13R的肿瘤细胞上的IL13结合。本发明还提供了竞争结合由上述任何单克隆抗体识别的相同表位的抗体。本发明还包括结合与228B/C-1所结合的相同的表位的抗体。表位肽包括基本上包含或者由ESLINVSG(SEQ ID NO:18)或YCAALESLINVS(SEQ ID NO:19)组成的肽。

在另一个实施方案中，提供了一种分离的抗IL13单克隆抗体，其在体内抑制表达IL13的癌细胞生长，或者其在体内对这种细胞及含有这种细胞的肿瘤是毒性的。本发明提供了与胞毒剂或生长抑制剂缀合的抗IL13抗体。所述胞毒剂可以是毒素、细胞毒性小分子药物、高能放射性同位素、可光活化的药物、促凋亡（pro-apoptotic）的蛋白质或药物、细胞溶解酶或核溶解酶。

用于本发明中使抗体可包含一个人IgG1恒定区，其可通过补体介导的细胞溶解(CMC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)而介导杀死肿瘤细胞。这种抗体也可以抑制IL13依赖性肿瘤细胞生长。

前述实施方案中的抗IL13抗体包括完整的（全长）抗体以及抗体片段。在一个实施方案中，前述任一个实施方案的抗IL13抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。本发明的抗体的结合人抗原的抗体片段包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)。本发明还包括包含VL或者VH结构域的单域抗体。一个实例是具有SEQ ID NO：152所示序列的scFv。

本发明还涵盖了包含上述实施方案的任一个抗IL13抗体及一种载体的组合物在本发明方法中的应用。所述载体是药物可接受的载体。这些组合物可以以制造品或药盒提供而用于治疗癌症。

本发明的再一方面是一种杀死表达IL13的癌细胞的方法，所述方法包括将所述癌细胞与上述任一实施方案的抗IL13抗体接触，从而杀死癌细胞。本发明另一方面是一种减轻或治疗哺乳动物中表达IL13的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的抗IL13抗体给予所述哺乳动物。在前述方法的实施方案中，所述癌症是肾细胞癌、神经胶质瘤、脑瘤、霍奇金淋巴瘤或者在其表面表达IL13受体的其它肿瘤或癌症。在这些方法的一个优选实施方案中，所述抗IL13抗体是人抗体或人源化抗体。在另一个优选实施方案中，所述抗体与一种胞毒剂如毒素或者放射性同位素及一种细胞生长抑制剂如细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂缀合。

减轻表达IL13的癌症的方法预期将抗IL13抗体与其它形式的癌症治疗方法如放疗和化疗联合给予。对于后者，哺乳动物还接受至少一种化疗剂。在一个特异的实施方案中，所述化疗剂选自一组药物如但不限于阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、环磷酰胺、硫替派（Thiotepa），白消安（Busulfan），Cytoxin，Taxol、氨甲喋呤、顺铂、美法仑（Melphalan）、长春碱（Vinblastine）、博来霉素和卡铂（Carboplatin）。在另一个特异的实施方案中，所述抗IL13可以与其它抗肿瘤抗体例如但不限于抗VEGF MAb、抗Her2MAb、抗EGFRMAb、抗EpCam MAb、抗神经节苷脂MAb，抗组织因子MAb和抗整联蛋白MAb联合使用。

另一方面，本发明提供了制造品（article of manufacture），包括一种容器和其中包含的组合物，其中所述组合物包含上述实施方案的抗IL13抗体，该制造品进一步包含一个包装插页，指示所述组合物可用于减轻或治疗表达IL13的癌症。

本发明的另一方面包括诊断过表达IL13的癌症或肿瘤，所述诊断包括使用本发明的抗IL13抗体检测取自怀疑患有所述癌症或肿瘤的患者的生物学样品中IL13的过表达情况。

附图简述

图1描述了抗IL13单克隆抗体与人IL13的结合。

图2描述了抗IL13单克隆抗体与突变体IL13-Fc的结合。

图3例证了mAb JES10-5A2(Pharmingen)对mAb228B/C-1与人IL13的结合无抑制作用。

图4例证了抗IL13单克隆抗体对霍奇金淋巴瘤L-1236细胞增殖的影响。

图5例证了抗IL13单克隆抗体对IL13诱导的对人单核细胞中CD14表达的抑制作用的影响。

图6例证了抗IL13单克隆抗体对IL13诱导的人单核细胞中CD23表达的正调节作用的影响。

图7例证了抗IL13单克隆抗体对IL13诱导的THP-1细胞中STAT6磷酸化的影响。

图8描述了单克隆抗体228B/C-1的VH和VL区的氨基酸序列。

图9描述了衍生自单克隆抗体228B/C-1的一些人源化抗体的VH和VL区的氨基酸序列。

详细描述

本发明不限于本文所述的特定方法学、方案、细胞系、载体或试剂，因为这些是可以变化的。另外，本文所用术语只是为了描述特定的实施方案而无限制本发明的范围之意。如本文及所附权利要求书所用，单数形式的“一个”、“一种”等除非上下文特别说明则包括复数形式，例如“一种宿主细胞”包括多个这类宿主细胞。

除非另外限定，则本文所用的所有技术和学术术语和任何缩写均具有与本领域技术人员普遍理解的含义相同的含义。尽管在实施本发明时可以使用与本文所述相似或相同的任何方法和材料，但本文还是描述了使用设备和材料。

本文提及的所有专利和出版物均在法律允许的程度内引入本文作为参考，以用于描述和披露这些专利和出版物中报道的可能用于本发明的蛋白质、酶、载体、宿主细胞和方法学。但是本文内容不应被理解为承认本发明由于在先发明而使本发明无法占先于这种披露。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、任何类别（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1hIgA2）或亚类的免疫球蛋白分子。另外，术语“抗体”（Ab）或“单克隆抗体”（mAb）意在包括完整分子以及能特异性结合蛋白质的抗体片段(例如Fab和F(ab')₂片段)。Fab和F(ab')₂片段缺少完整抗体的Fc片段，更快速地从动物或植物的循环中清除，且与完整抗体相比可具有更低的非特异性组织结合(Wahl et al.,J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。

如本文所用，术语“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，及包括分离自人免疫球蛋白文库或者分离自用一或多种人免疫球蛋白转基因但不表达内源免疫球蛋白的动物的抗体，如下文所述及例如Kucherlapati等的美国专利No.5,939,598所述。

抗体“效应子功能（effector function）”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或者氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随着抗体同种型而变化。抗体效应子功能例如包括：C1q结合及补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的负调节及B细胞激活作用。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或者“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤细胞(NK)、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fcγ受体(FcγR)，使得这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞，随之用细胞酶或者氧化自由基杀死靶细胞。抗体“武装（arm）”细胞毒性细胞并且是这种杀伤所需要的。介导ADCC的主要细胞－NK细胞－只表达FCγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。为了评价感兴趣分子的ADCC活性，可以进行如下文所述的体外ADCC分析。用于这类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或另外，感兴趣的分子的ADCC活性可以在体内评价，例如在动物模型如Clynes et al.PNAS(USA)95:652－656(1998)所揭示的动物模型中进行。

免疫原

使用重组IL13免疫小鼠以产生能产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。重组IL13可商购自许多来源(见例如R&D Systems,Minneapolis,MN,PeproTech,Inc.,NJ,和Sanofi Bio-Industries,Inc.,Tervose,PA.)。或者，可以根据本领域熟知的方法将编码IL13的基因或cDNA克隆进质粒或其它表达载体中，并在多种表达系统中的任一种中表达。克隆和表达IL13的方法及IL13的核酸序列是公知的(见例如U.S.专利5,652,123所述)。由于遗传密码的简并性，可以产生多个编码IL13多肽的核苷酸序列。人们可以通过选择基于可能的密码子选择的组合来改变核苷酸序列。这些组合是根据用于编码天然发生的IL13多肽的核苷酸序列的标准三联体遗传密码产生的，所有这些变化均加以考虑。这些多肽的任一种均可以用于免疫动物以产生结合IL13的抗体。

当有益时，免疫原IL13多肽可表达为融合蛋白，所述融合蛋白具有与融合区段附着的IL13多肽。所述融合区段例如通过允许经亲和层析分离和纯化融合蛋白而通常有助于蛋白质纯化。融合蛋白可以通过培养用融合核酸序列转化的重组细胞而产生，所述融合核酸序列编码包括附着于蛋白质的羧基末端和/或氨基末端的融合区段的蛋白质。融合区段可包括但不限于免疫球蛋白Fc区、谷胱甘肽-S-转移酶、β-半乳糖苷酶、能结合二价金属离子的聚组氨酸区段和麦芽糖结合蛋白。

使用包含突变形式的人IL13的融合蛋白产生本发明的抗体。这种突变形式的IL13含有一个单突变，产生失活形式的蛋白质(Thompson et al.,J.Biol.Chem.274:2994(1969))。为了产生具有高亲和性的中和抗体，所述融合蛋白包含与免疫球蛋白Fc特别是IgG1融合的突变IL13蛋白，并在哺乳动物细胞系中表达，由此重组蛋白质是天然糖基化的。融合蛋白的Fc部分可以提供一种暴露关键表位的构象结构。所述糖基化可以增加表位的免疫原性，使得可以产生针对这一特殊表位的抗体。

在大肠杆菌中表达的IL13多肽缺乏糖基化，并且被测试的商购抗体使用这种蛋白质产生。我们测试了这些抗体，例如R&DSystems和Pharmingen，发现它们与本发明的抗体所结合的表位不交叉反应。

抗体产生

本发明的抗体可以通过本领域已知的任何合适方法产生。本发明的抗体可以包含多克隆抗体。本领域技术人员已知制备多克隆抗体的方法(Harlow,et al.,Antibodies:a Laboratory Manual,(Cold springHarbor Laboratory Press,2nd ed.(1988)，在此以其全文并入参考)。

例如，上述免疫原可以被给予各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导产生含有特异于该抗原的多克隆抗体的血清。所述免疫原的给予可以伴随一或多次免疫制剂以及佐剂（如果需要）的注射。根据宿主物种，可以使用各种佐剂以增加免疫学应答，所述佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、矿物质凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic polyols、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔嘁血蓝蛋白、二硝基苯酚及潜在有用的人用佐剂如BCG(bacille Calmette-Guerin)和短小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。可以采用的其它佐剂的例子包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A、合成的海藻糖dicorynomycolate)。免疫方案是本领域熟知的，可以通过在选定的宿主体内激发免疫应答的任何方法进行。佐剂也是为本领域技术人员所熟知的。

典型地，免疫原（有或无佐剂）通过多次皮下或腹膜内注射或者经肌内或通过静脉内注射进哺乳动物体内。所述免疫原可包括一种IL13多肽、一种融合蛋白或其变体。根据所述多肽的性质（即疏水性百分比，亲水性百分比，稳定性，净电荷，等电点等等），可以将所述免疫原与已知在被免疫的动物体内是免疫原性的蛋白质缀合。这种缀合包括通过衍生化所述免疫原和待缀合的免疫原性蛋白质的活性化学官能团由此形成共价键而进行的化学缀合，或者通过基于融合蛋白的方法学或者本领域技术人员已知的其它方法进行缀合。这种免疫原性蛋白质包括但不限于匙孔嘁血蓝蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂及混杂（promiscuous）T辅助细胞肽。可以使用各种佐剂增加如上所述的免疫应答。

本发明的抗体包括单克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤技术制备，如Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975)和美国专利No.4,376,110，Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold springHarbor Laboratory Press,2.sup.nd ed.(1988),Hammerling,et al.,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(Elsevier,N.Y.,(1981))，或者技术人员已知的其它方法。可以用于产生单克隆抗体的其它方法例如包括但不限于人B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.,1983,Immunology Today4:72；Cole et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole et al.,1985,MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)，这类抗体可以是任何类别的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。产生本发明的mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。

使用典型的杂交瘤技术，将宿主如小鼠、人源化小鼠（具有人免疫系统的小鼠）、仓鼠、兔、骆驼或任何其它合适的宿主动物用免疫原典型地免疫，以引发产生或能产生特异性结合IL13的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外用抗原免疫。

一般地，在制备产生抗体的杂交瘤过程中，如果希望是人源细胞则使用外周血淋巴细胞(PBL)，如果希望是非人哺乳动物来源则使用脾细胞或者淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与无限增殖化的细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986),pp.59-103)。无限增殖化的细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛或人源的骨髓瘤细胞。典型地，应用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。所述杂交瘤细胞可以在适当的培养基中培养，所述培养基优选地含有抑制未融合的无限增殖化细胞生长或存活的一或多种物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基典型地包括阻止HGPRT缺乏的细胞生长的物质次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)。

优选的无限增殖化细胞系是有效融合、支持所选择的产生抗体的细胞稳定高水平表达抗体并且对培养基如HAT培养基是敏感的那些细胞系。更优选的无限增殖化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可以例如得自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.和American Type Culture Collection,Manassas,Va。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也可以用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)pp.51-63)。

然后分析培养杂交瘤细胞的培养基中针对IL13的单克隆抗体的存在情况。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过例如免疫沉淀方法或者通过体外结合分析如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)而确定。这种技术为本领域所已知并且在技术人员的技能范围内。IL13的单克隆抗体的结合亲和性可例如通过Scatchard分析(Munson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980))而确定。

在鉴别了希望的杂交瘤细胞后，可以将这些克隆通过限制稀释程序亚克隆并通过标准方法(Goding，如前述)培养。用于此目的的合适培养基包括例如Dulbecco's Modified Eagle's培养基和RPMI-1640。由这些亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序分离或纯化自培养基，所述纯化程序例如是蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳、透析或者亲和层析。

本领域现有许多生产单克隆抗体的方法，因此本发明的抗体不限于仅在杂交瘤中产生。例如，单克隆抗体可以通过重组DNA方法产生，如美国专利No.4,816,567所述方法。在文中，术语“单克隆抗体”是指衍生自单一真核细胞、噬菌体或原核细胞克隆的抗体。编码本发明的单克隆抗体的DNA可使用常规程序分离并测序(例如通过使用能特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链或者来自人、人源化的或其它来源的这些链的基因的寡核苷酸探针进行)。本发明的杂交瘤细胞是这种DNA的优选来源。分离后，可以将DNA置于表达载体中，然后将载体转化进宿主细胞如NSO细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。所述DNA也可以是修饰的，例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison et al,如前述)或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列共价连接而进行。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本发明抗体的恒定结构域，或者可以取代本发明抗体的一个抗原组合位点的可变结构域，以产生嵌合的二价抗体。

所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法为本领域所熟知。例如，一种方法包括重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重链。所述重链通常是在Fc区的任一点被截短以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基用另一种氨基酸残基取代或者缺失以防止交联。

识别特异性表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，本发明的Fab和F(ab')₂片段可以通过使用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或者胃蛋白酶(产生F(ab')₂片段)对免疫球蛋白分子进行蛋白酶解而产生。F(ab')₂片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。

对于一些应用，包括抗体在人体内及在体外检测分析中的应用，可优选使用嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法为本领域所已知，见例如Morrison,Science229:1202(1985)；Oi et al.,BioTechniques4:214(1986)；Gillieset al.,(1989)J.Immunol.Methods125:191-202；美国专利No:5,807,715；4,816,567和4,816,397所述，这些文献和专利的全部内容并入本文作参考。

人源化抗体是在非人物种中产生的结合希望的抗原的抗体分子，其具有来自非人物种的一或多个互补决定区(CDR)及来自人免疫球蛋白分子的构架区(FR)。通常地，人构架区中的构架残基被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变、优选地改善抗原结合。这些构架取代通过本领域熟知的方法鉴别，例如通过CDR与构架残基的相互作用的建模以鉴别对于抗原结合重要的构架残基，并进行序列对比以鉴别在特定位置的与众不同的构架残基(见例如Queen et al.,美国专利No.5,585,089；Riechmann et al.,Nature332:323(1988)，所述文献以其全文并入参考)。抗体可以使用本领域已知的多种技术人源化，例如CDR移植(EP239,400；PCT出版物WO91/09967；美国专利No:5,225,539；5,530,101和5,585,089)，veneering或resurfacing(EP592,106；EP519,596；Padlan,Molecular Immunology28(4/5):489-498(1991)；Studnicka et al.,Protein Engineering7(6):805-814(1994)；Roguska.et al.,PNAS91:969-973(1994))和链改组(美国专利No.5,565,332)。

通常地，人源化抗体中被导入来自非人来源的一或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称作“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化基本上根据Winter及其同事所述的方法(Joneset al.,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列而进行。因此，这种“人源化的”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中完整的人可变结构域的少部分被来自非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体典型地是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中的相似位点取代。

完全的人抗体对于人类患者的治疗是特别希望的。人抗体可以通过本领域已知的多种方法生产，包括上述使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。也见例如美国专利No:4,444,887和4,716,111，及PCT出版物WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16664、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741所述；所述文献均以其全文并入参考。Cole等和Boerder等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Riss,(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95,(1991))。

利用不能表达功能性的内源性免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠也可以生产人抗体。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机地导入或通过同源重组导入到小鼠胚胎干细胞内。或者，除了人重链和轻链基因以外，还可以将人可变区、恒定区、和多变区导入到小鼠胚胎干细胞内。通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座可以使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因分别或同时变成无功能。特别地，JH区的纯合缺失阻止了内源性抗体产生。扩增经修饰的胚胎干细胞，并将其显微注射到胚泡内以产生嵌合小鼠。然后对所述嵌合小鼠进行育种以产生表达人抗体的纯合后代。所述转基因小鼠用所选择的抗原例如本发明的多肽的全部或一部分以正常的方式免疫。通过传统杂交瘤技术可以从经免疫的转基因小鼠中得到针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠内所含有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间进行重排，并在此之后进行类别转换和体细胞突变(somatic mutation)。因此，利用这个技术生产治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体是有可能的。对于该生产人抗体的技术的综述，参见Lonberg和Huszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。对于该生产人抗体和人单克隆抗体的技术以及生产这些抗体的方案的详细讨论参见例如PCT文献WO98/24893、WO92/01047、WO96/34096、WO96/33735、欧洲专利No.0598877、美国专利NO.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771、和5,939,598，这些文献在此以其全文并入本文作参考。另外，利用与上述相似的技术，公司例如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)、Genpharm(San Jose,Calif.)和Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)可以被委托提供针对所选择的抗原的人抗体。

也可以通过对移植了人外周血白细胞、脾细胞或骨髓的小鼠进行免疫而制备人MAb(例如XTL的三元杂交瘤技术(Triomatechniques))。可以利用被称作为“引导选择(guided selection)”的技术产生识别选定表位的完整的人抗体。在这个方法中，用所选择的非人的单克隆抗体例如小鼠抗体引导对识别相同表位的完整的人抗体的选择(Jespers et al.,Bio/technology12:899-903(1988))。

另外，接下来利用本领域人员熟知的技术可以用针对本发明的多肽的抗体产生“模拟”本发明的多肽的抗独特型抗体(见，例如，Greenspan&Bona,FASEB J.7(5):437-444；(1989)and Nissinoff,J.Immunol.147(8):2429-2438(1991))。例如，可以用结合并竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明的多肽与配体结合的抗体产生“模拟”多肽多聚化和/或结合区并因此结合及中和多肽和/或其配体的抗独特型抗体。在治疗方案中，可以用这些中和抗独特型抗体或这些抗独特型抗体的Fab片段中和多肽配体。例如，可以用这些抗独特型抗体结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，并因此阻断其生物学活性。

本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是单克隆抗体，优选地是人或人源化的单克隆抗体，它们具有针对至少两种不同抗原的结合特异性。在本发明中，其中一种结合特异性可以针对IL13，另一种可以针对任何其它抗原，优选地针对细胞表面蛋白质、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源的蛋白质、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源的蛋白质、或细菌表面蛋白质等等。

用于制备双特异性抗体的方法是熟知的。传统上，对双特异性抗体的重组生产是基于两种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达进行的，其中两种重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，这些杂交瘤(四元杂交瘤(quadromas))产生十种不同抗体分子的可能的混和物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。常常用亲和层析步骤完成对所述正确分子的纯化。在1993年5月13日公开的WO93/08829以及在Traunecker et al.,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中公开了相似的方法。

具有所希望的结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)可以与免疫球蛋白恒定区序列融合。所述融合优选与包括至少绞链区、CH2和CH3区的一部分的免疫球蛋白重链恒定区进行。它可以具有第一重链恒定区(CH1)，所述第一重链恒定区含有在至少一种融合体中存在的轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合体以及免疫球蛋白轻链(如果希望)的DNA插入到独立的表达载体内，并将其共转化到合适的宿主生物体内。对于产生双特异性抗体的更详细的描述参见例如Suresh et al.,Meth.In Enzym.,121:210(1986)。

本发明还包括异源缀合抗体(heteroconjugate antibody)。异源缀合抗体由两种共价连接的抗体构成。这些抗体已经例如被提议将免疫系统细胞靶向于不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)。利用在合成蛋白质化学领域中的已知方法可以在体外制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，利用二硫键交换反应或通过形成硫酯键都可以构建出免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇(iminothiolate)和甲基-4-mercaptobutyrimidate，和那些在例如美国专利No.4,676,980中所公开的试剂。

另外，可以产生IL13的单域抗体。WO9425591中已经描述了关于来源于骆驼科(Camelidae)重链Ig的抗体这个技术的实例，以及US20030130496中描述了从噬菌体文库中分离出单区完全人抗体。

抗IL13抗体的鉴定

本发明提供了抑制并中和IL13作用的拮抗单克隆抗体。特别地，本发明的抗体与IL13结合并抑制IL13受体复合物的激活。本发明的抗体包括被命名为228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43的抗体，并公开了228B/C-1的人源化克隆。本发明也包括与单克隆抗体228B/C-1结合相同表位的抗体。

用酶联免疫吸附测定(EILISA)、Western免疫印迹、或其它免疫化学技术测试候选的抗IL13抗体。用于鉴定单个抗体的检测包括：(1)抑制霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)细胞系HDLM-2和L-1236的IL13-自分泌增殖；(2)抑制IL13诱导的THP-1细胞内的STAT6磷酸化；(3)抑制IL13诱导的对原代人单核细胞中的CD14表达的抑制；和(4)抑制IL13诱导的对原代人单核细胞上的CD23表达的上调。在实施例中描述了试验的细节。

本发明的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、Fab表达文库所产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明的抗体的抗Id抗体)、和上述任一抗体的表位结合片段。

抗体可以是本发明的结合人抗原的抗体片段，包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)₂、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包括VL或VH结构域的单域抗体。包括单链抗体在内的结合抗原的抗体片段可以包括单独的可变区或与以下的全部或一部分组合的可变区：绞链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明也包括抗原结合片段，其包括可变区与绞链区、CH1、CH2和CH3结构域的任一组合。本发明的抗体可以来自任何动物来源包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体来自于人、非人灵长类、啮齿类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。

本发明的抗体可以是单特异的、双特异的、三特异的或具有更高的多特异性。多特异性抗体可以是特异于IL13的不同表位，或者可以是特异于IL13以及一种异源表位，所述异源表位例如异源多肽或固相支持材料。参见例如PCT文献WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360、WO92/05793、Tutt,et al.,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利NO.4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819；Kostelny et al.,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。

可以根据抗体所识别的或特异结合的IL13的表位或一部分描述或说明本发明的抗体。可以如本文所述说明表位或多肽部分，例如通过N末端和C末端位置，通过连续氨基酸残基的大小，或表和图中所列出的进行说明。

也可以根据抗体的交叉反应性描述或说明本发明的抗体。本发明也包括与IL13多肽结合的抗体，所述IL13多肽与IL13具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、和至少50%的相同性(如利用本领域已知的和本文所述方法所计算的)。

在特定实施方案中，本发明的抗体与人IL13的猴同源物以及其相应表位交叉反应。在一个特定实施方案中，上述交叉反应性相关于任何单一特异抗原性或免疫原性多肽，或相关于本文所述特异抗原性和/或免疫原性多肽的组合。

本发明还包括与在严格杂交条件下与编码IL13的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽结合的抗体。也可以根据抗体与本发明的多肽的结合亲和力描述或说明本发明的抗体。优选的结合亲和力包括那些具有从10^-8到10^-15M的平衡解离常数或K_D的抗体。本发明也提供了根据本领域已知的任何用于确定竞争性结合的方法例如本文所述的免疫测定法所确定的竞争性抑制抗体与本发明的表位结合的抗体。在优选的实施方案中，抗体竞争性地抑制至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、或至少50%与表位的结合。

本发明进一步包括结合与本发明的抗IL13抗体所结合的相同的表位的抗体。为了确定一种抗体是否竞争性结合与本发明的抗IL13抗体（包括通过使用在ATCC保藏的杂交瘤产生的抗体）结合的表位相同的表位，可以进行一种交叉阻断分析，例如竞争性ELISA分析。在一个竞争性ELISA实例中，将包被在微量滴定板的孔上的IL13与或不与候选的竞争抗体预先保温，然后加入生物素标记的本发明的抗IL13抗体。与孔中IL13抗原结合的标记的抗IL13抗体的量使用抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物及合适的底物进行测定。所述抗体可以用放射性或荧光标记或者一些其它可检测和可测定的标记物进行标记。与抗原结合的标记的抗IL13抗体的量与候选的竞争抗体（测试抗体）竞争结合相同表位的能力间接相关，即测试抗体与相同表位的亲和性越高，则越少的标记抗体结合抗原包被的孔。如果与没有候选的竞争抗体的平行进行的对照实验相比，候选抗体可以阻断至少20%、优选至少20－50%、更优选至少50%的IL13抗体的结合，则认为候选的竞争抗体是充分结合相同表位的抗体或者与本发明的抗IL13抗体竞争结合相同表位的抗体。应理解可以进行变化形式的这种分析以达到相同的数量值。

载体和宿主细胞

在另一个方面，本发明提供了包括编码本发明的抗体的核苷酸序列的载体构建体以及包括这样一种载体的宿主细胞。可以用进行克隆和转化的标准技术制备表达本发明的抗体的细胞系。

利用熟知的技术可以制备含有编码本发明抗体的核苷酸序列的重组表达载体。所述表达载体包括与合适的转录或翻译调节核苷酸序列可操纵地连接的核苷酸序列，所述转录或翻译调节核苷酸序列例如那些起源于哺乳动物、微生物、病毒、或昆虫基因的序列。调节序列的实例包括转录启动子、操纵子、增强子、mRNA核糖体结合位点、和/或其它控制转录和翻译起始和终止的合适序列。当所述调节序列与合适的多肽的核苷酸序列功能性相关时，核苷酸序列是“可操纵地连接的”。因此，如果一个启动子核苷酸序列控制合适的核苷酸序列的转录，那么所述启动子核苷酸序列就是可操纵地连接于例如抗体重链序列的。

另外，可以将编码不与抗体重链和/或轻链序列天然相关的合适的信号肽的序列掺入到表达载体内。例如，可以符合读码框地(in-frame)将信号肽(分泌前导肽)的核苷酸序列与多肽序列融合，使得抗体可以被分泌到胞质外周空间或分泌到培养基中。在所希望的宿主细胞内具有功能的信号肽增强合适的抗体的胞外分泌。在抗体从细胞中分泌之后，信号肽可以从多肽中被切割下。这些分泌信号的实例是熟知的并包括例如在US5698435、US5698417、和US6204023中所描述的那些分泌信号。

可用于本发明的宿主细胞包括但不限于微生物，例如经含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母菌例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)；烟草花叶病毒(TMV)感染的或经含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。

载体可以是质粒载体、单链或双链噬菌体载体、或单链或双链RNA或DNA病毒载体。用熟知的将DNA和RNA导入到细胞内的技术可以将这些载体作为多核苷酸导入到细胞内。在噬菌体和病毒载体的情况下，也可以用熟知的感染和转导的技术将载体作为包装病毒或包囊化病毒导入到细胞内。病毒载体可以是可复制的或有复制缺陷的。在后一情况中，通常只有在互补的宿主细胞内才会发生病毒繁殖。利用来源于本DNA构建体的RNA，也可以采用无细胞的翻译系统产生蛋白质。这些载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(见，例如PCT文献WO86/05807、PCT文献WO89/01036、美国专利No.5,122,464)，并且可以将抗体的可变结构域克隆到这样的载体内，用于表达整个重链或轻链。

在本发明中可用作宿主细胞的原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。在原核宿主细胞内所用的表达载体通常包括一个或多个表型选择标记基因。例如，表型选择标记基因是编码赋予抗生素抗性或提供自养需求的蛋白质的基因。用于原核宿主细胞的有用的表达载体的实例包括那些来源于可商购的质粒的表达载体，例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)、pGEM1(Promega Biotec,Madison,Wisconsin.,USA)、和pET(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)以及pRSET(InvitrogenCorporation,Carlsbad,California,USA)载体系列(Studier,F.W.,J.Mol.Biol.219:37(1991);Schoepfer,R.Gene124:83(1993))。通常用于重组的原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括T7(Rosenberg,et al.Gene56,125-135(1987))、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang etal.,Nature275:615,(1978)；和Goeddel et al.,Nature281:544,(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.,Nucl.Acids Res.8:4057,(1980))、和tac启动子(Sambrook et al.,1990,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2dEd.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.)。

在本发明中有用的酵母包括那些来自酵母属、毕赤酵母属、放线菌(Actinomycetes)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母。酵母载体常常含有一个来自2μ酵母质粒的复制序列起点、一个自主复制序列(ARS)、启动子区、聚腺苷酸化序列、转录终止序列和选择标记基因。酵母载体的合适启动子序列包括但不限于金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.255:2073,(1980))或其它的糖酵解酶(Holland et al.,Biochem.17:4900,(1978))例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。在Fleer et al.,Gene,107:285-195(1991)中还描述了用于酵母表达的其它合适的载体和启动子。用于酵母和酵母转化方案的其它合适的启动子和载体在本领域是熟知的。酵母转化方案是熟知的。在Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,75:1929(1978)中描述了一种这样的方案。Hinnen方案在选择培养基中选择出Trp⁺转化体。

也可以采用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统表达重组抗体，例如用于生产异源蛋白质的杆状病毒系统。在一个昆虫系统中，可以将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus,AcNPV)用作表达外源基因的载体。所述病毒生长在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞内。可以将抗体编码序列单个地克隆到病毒的非必要区内(例如多角体蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制之下。

可以将NS0或中华仓鼠卵巢细胞(CHO)用于在哺乳动物中表达本发明的抗体。可以从病毒基因组中切割下用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译的控制序列。常用的启动子序列和增强子序列来源于多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)、和人巨细胞病毒(CMV)。可以用来源于SV40病毒基因组的DNA序列提供用于在哺乳动物宿主细胞内表达结构基因序列的其它遗传元件，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪切和聚腺苷酸化位点。病毒的早期和晚期启动子是特别有用的，因为容易从病毒基因组中作为片段得到这两种启动子，所述片段也可以含有病毒的复制起点。用于哺乳动物宿主细胞的所例举的表达载体是可商购的。

编码抗体的多核苷酸

本发明还提供了包括编码本发明的抗体和其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也包括在严格的或较低严格的条件下能与编码本发明的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。

可以利用本领域任一已知的方法得到多核苷酸，并确定出多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果已知了抗体的核苷酸序列，就可以从化学合成的寡核苷酸装配出编码所述抗体的多核苷酸(例如如在Kutmeier et al.,BioTechniques17:242(1994)中所述那样)。简要地，所述装配包括含有编码所述抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成、这些寡核苷酸的退火和连接、以及接下来用PCR对所连接的寡核苷酸的扩增。

或者，可以从来自合适来源的核酸中产生编码抗体的多核苷酸。如果无法得到含有编码特定抗体的核酸的克隆，但已知所述抗体分子的序列，那么可以通过化学合成得到编码所述免疫球蛋白的核酸，或利用与所述序列的3’和5’末端可杂交的合成引物从合适的来源(例如抗体cDNA文库、或从表达所述抗体的任一组织或细胞例如所选择的用于表达本发明的抗体的杂交瘤细胞中所产生的cDNA文库，或从中所分离到的核酸，优选聚A⁺RNA)通过PCR扩增得到编码所述免疫球蛋白的核酸，或通过利用特异于所述特定基因序列的寡核苷酸探针通过克隆得到编码所述免疫球蛋白的核酸，以例如从cDNA文库中鉴定出编码所述抗体的cDNA克隆。然后可以利用本领域任一熟知的方法将PCR所产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体内。

一旦确定了抗体的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列，就可以利用本领域熟知的处理核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、定位诱变、PCR等处理抗体的核苷酸序列(参见例如Sambrook et al.,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel et al.,eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY，以其全文并入本文作参考)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失、和/或插入。

在一个特定的实施方案中，可以用熟知的方法检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以鉴定出CDR的序列，所述方法例如通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较以确定出序列的高变异性区域。利用常规重组DNA技术，可以将一个或多个CDR插入到构架区内，例如插入到人构架区内以人源化非人抗体，如上面所述。构架区可以是天然发生的或共有的构架区，以及优选地是人构架区(见例如，Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)中的人构架区的列表)。优选地，通过构架区和CDR的组合所产生的多核苷酸编码与本发明的多肽特异结合的抗体。优选地，如上面所讨论的，在构架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，以及优选地所述氨基酸取代提高了抗体与其抗原的结合。另外，可以用这些方法对参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基进行取代或删除，以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。本发明包括对多核苷酸的其它改变，这也在本领域人员的技术范围之内。

另外，可以使用为通过将具有合适抗原特异性的来自小鼠抗体分子的基因与具有合适生物学活性的人抗体分子的基因剪切在一起而产生“嵌合抗体”所开发的技术(Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855(1984);Neuberger et al.,Nature312:604-608(1984);Takedaet al.,Nature314:452-454(1985))。如上面所述，嵌合抗体是一种不同的部分来源于不同的动物物种的分子，例如具有来源于小鼠MAb的可变区以及人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体，例如人源化抗体。

或者，可以调整所描述的用于生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778;Bird,Science242:423-42(1988);Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988);和Ward et al.,Nature334:544-54(1989))以适于生产单链抗体。单链抗体通过经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段以得到一条单链多肽而形成。也可以使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science242:1038-1041(1988))。

生产抗IL13抗体的方法

用本领域已知的用于合成抗体的任一方法，特别是通过化学合成或优选地通过重组表达技术可以产生本发明的抗体。

本发明的抗体或其片段、衍生物或类似物(例如本发明的抗体的重链或轻链或本发明的单链抗体)的重组表达要求构建含有编码所述抗体或抗体片段的多核苷酸的表达载体。一旦已经得到了编码抗体分子的多核苷酸，就可以用重组DNA技术产生用于产生抗体的载体。构建含有抗体编码序列以及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。

利用传统技术将表达载体转移到宿主细胞内，然后用传统技术培养所转染的细胞以产生本发明的抗体。如下面所详细描述的，在本发明的一个方面，可以在宿主细胞内共表达编码重链和轻链的载体，以便表达整个免疫球蛋白分子。

如上所述，可以利用各种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分子。这样的宿主表达系统不仅代表通过其可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体(vehicles)，也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染后可以原位表达本发明的抗体分子的细胞。通常用细菌细胞例如大肠杆菌和真核细胞表达重组抗体分子，特别是表达完整重组抗体分子。例如，与载体例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件相结合的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是抗体的有效的表达系统(Foecking et al.,Gene45:101(1986)；Cockett et al.,Bio/Technology8:2(1990))。

另外，可以选择宿主细胞株，其调控所插入序列的表达，或以所希望的特定方式修饰和加工基因产物。这些对蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性的和特定的机制。可以选择出合适的细胞系或宿主系统以保证对所表达的外源蛋白质的正确的修饰和加工。为此，可以使用具有对基因产物的初级转录、糖基化、和磷酸化的正确加工的细胞机制的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤细胞。

为了长期、高产量地产生重组蛋白质，稳定的表达是优选的。例如，可以对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程化。可以用受合适的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标记转化宿主细胞，而不是用含有病毒的复制起点的表达载体。在导入外源DNA之后，可以使工程化的细胞在富集培养基中生长1到2天，然后将其转换到选择培养基中。重组质粒中的选择标记赋予了对选择的抗性，使得细胞稳定地将质粒整合到其染色体内并生长形成灶(foci)，接下来这可以被克隆并扩增成为细胞系。这种方法可以有利地用于对表达抗体分子的细胞系进行工程化。这些工程化的细胞系可以被特别用于筛选和评价与所述抗体分子直接或间接相互作用的化合物。

可以使用多种选择系统，其包括但不限于可以在tk、hgprt或aprt-细胞内分别采用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigier et al.,Cell11:223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:202(1992))、和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.,Cell22:817(1980))基因。也可以基于抗代谢物抗性对下列基因进行选择：产生对甲氨蝶呤的抗性的dhfr(Wigler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci..USA77:357(1980);O'Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527(1981))；产生对霉酚酸的抗性的gpt(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072(1981))；产生对氨基糖苷G-418的抗性的neo(Wu and Wu,Biotherapy3:87-95(1991))；和产生对潮霉素的抗性的hygro(Santerre et al.,Gene30:147(1984))。可以常规地采用在重组DNA技术领域通常已知的方法选择所希望的重组克隆，例如在Ausubel et al.(eds),Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,ALaboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);和in chapter12and13,Dracopoli et al.(eds),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994);Colberre-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981)中描述了这些技术，这些文献以其全文并入本文作参考。

通过载体扩增可以增加抗体分子的表达水平(综述参见Bebbington and Hentschel,“The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells”(DNA cloning,Vol.3.Academic Press,New York,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的标记时，宿主细胞培养物中所存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。因为扩增区与抗体基因相关，因此抗体的产生也会增加(Crouse et al.,Mol.Cell Biol.3:257(1983))。

可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一种载体编码重链来源的多肽，而第二种载体编码轻链来源的多肽。两种载体都可以含有相同的能使得重链和轻链多肽等量表达的选择标记。或者，可以使用编码并能表达重链以及轻链多肽的单个载体。在这种情况中，轻链应当置于重链的前面，以避免有毒的游离重链的过量产生(Proudfoot,Nature322:52(1986);Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2197(1980))。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。

一旦已经用动物、化学合成或重组表达产生了本发明的抗体分子，可以用本领域已知的任一用于纯化免疫球蛋白分子的方法进行纯化，例如通过层析(例如，离子交换层析、亲和层析特别是通过在蛋白A之后的与特异抗原的亲和力进行的层析，以及体积排阻层析)、离心、差异溶解度、或任何其它的用于纯化蛋白质的标准技术。另外，还可以将本发明的抗体或其片段与本文所述或本领域已知的异源多肽序列融合，以促进纯化。

本发明包括与多肽重组融合的或化学缀合的(包括共价和非共价缀合的)抗体。可以用本发明的融合或缀合抗体使得纯化更为简便。参见例如Harbor等(见上)和PCT文献WO93/21232、EP439,095、Naramura et al.,Immunol.Lett.39:91-99(1994)；美国专利No.5,474,981；Gillies et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.89:1428-1432(1992)；Fell et al.,J.Immunol.146:2446-2452(1991)，以其全文并入本文作参考。

此外，本发明的抗体或其片段可以与标记物序列例如肽融合以促进纯化。在优选的实施方案中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如在pQE载体中所提供的标签(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)等等，其中许多都是可商购的。例如在Gentzet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所述，六组氨酸提供了对融合蛋白的便利纯化。其它对纯化有用的肽标签包括但不限于“HA”标签，它对应于来源于流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson etal.,Cell37:767(1984))以及“flag”标签。

抗IL13抗体的诊断应用

本发明的抗体包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与所述抗体的共价连接而进行的修饰，所述共价连接并不干扰抗体与IL13的结合。例如，抗体衍生物包括那些已经被例如生物素、HRP、或任何其它的可检测组分修饰的衍生物，但这并非是限定。

本发明的抗体可以被用于例如但不限于检测癌症患者的IL13水平，包括在体外和在体内的诊断方法中。例如所述抗体可应用于定性或定量测定生物学样品中的IL13水平的免疫测定中。参见例如Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring HarborLaboratory Press,2nd ed.1988)(以其全文并入本文作参考)。

如在下面更为详细讨论的，可以单独地或联合其它的组合物一起使用本发明的抗体。所述抗体还可以在N或C末端与异源多肽重组融合，或与多肽或其它组合物化学缀合(包括共价的或非共价的缀合)。例如，本发明的抗体可以与在检测测定中用作标记的分子重组融合或缀合。

本发明还包括与诊断剂缀合的抗体或其片段。所述抗体可以作为临床测试方法的一部分被诊断性地用于例如监测癌症的发生或进展，以例如确定给定治疗方案的效力。通过将抗体偶联到可检测物质可以促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、利用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属、以及非放射性的顺磁性金属离子。利用本领域已知的技术，可检测物质可以直接地与抗体(或其片段)偶联或缀合，或经中间物(例如本领域已知的接头)间接地偶联或缀合。参见例如关于金属离子的美国专利No.4,741,900，其中所述金属离子可以与抗体缀合，用作本发明的诊断剂。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、dichlorotriazinylamine荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白；合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或⁹⁹Tc。

抗体也可以被附着到固相支持物，这对于靶抗原的免疫测定或纯化是特别有用的。这些固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙稀或聚丙烯。

与IL13特异性结合的标记抗体及其衍生物和类似物都可被用于诊断目的，以检测、诊断、或监测与IL13的异常表达和/或活性相关的疾病、病症、和/或病态。本发明提供了对IL13异常表达的检测，其包括(a)用一种或多种特异于IL13的本发明的抗体检测个体的细胞或体液中的IL13的表达，和(b)比较基因表达水平与标准的基因表达水平，与标准的表达水平比较所检测到的IL13表达水平的增高或降低是异常表达的提示。

本发明提供了一种用于诊断病症的诊断检测，包括(a)用一种或多种特异于IL13的本发明的抗体检测个体的细胞或体液中的IL13的表达；和(b)比较基因表达水平与标准的基因表达水平，与标准的表达水平比较，所检测到的基因表达水平的增高或降低是特定疾病的提示。

可以利用本领域技术人员已知的经典的免疫组织学方法用本发明的抗体检测生物样品中的蛋白质水平(参见例如Jalkanen,et al.,J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen,et al.,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987))。其它用于检测蛋白质基因表达的基于抗体的方法包括免疫测定例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记在本领域是已知的，并包括酶标记例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素例如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹²In)、和锝(⁹⁹Tc)；发光标记例如鲁米诺；荧光标记例如荧光素和罗丹明；以及生物素。

本发明的一个方面是对与动物(优选地是哺乳动物，以及最优选地是人)中的IL13的异常表达相关的疾病或病症的检测和诊断。在一个实施方案中，诊断包括：a)给对象施用(例如肠胃外、皮下、或腹腔内)有效量的与IL13特异结合的被标记的分子；b)在给药后等待一段时间间隔，以使得被标记的分子优先地积聚在对象体内的表达多肽的位置上(并使得未结合的标记分子被清除到背景水平)；c)确定背景水平；和d)检测对象体内的被标记的分子，这样检测到超过背景水平的被标记的分子提示对象患有与IL13的异常表达相关的特定疾病或病症。可以用各种方法确定出背景水平，包括将所检测到的被标记的分子的量与预先确定好的某一特定系统的标准值进行比较。

本领域人员知道对象的大小和所用的成像系统将决定产生诊断性图像所需的成像组分的量。就放射性同位素组分而言，对于人体对象，所注射的放射性的量的范围通常从约5毫居里到20毫居里的⁹⁹Tc。然后被标记的抗体或抗体片段将优先地积聚在含有特定蛋白质的细胞的部位。在S.W.Burchiel et al.,“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments.”Chapter13in TumorImaging：The Radiochemical Detection of Cancer,S.W.Burchiel and B.A.Rhodes,eds.,Masson Publishing Inc.(1982)中描述了体内成像。

依据一些变量包括所用标记物的类型以及给药模式，在给药后使得被标记的分子优先地在对象体内的位置上积聚和使得未结合的被标记的分子被清除到背景水平的时间间隔是6到48小时或6到24个小时或6到12小时。在另一实施方案中，给药后的时间间隔是5到20天或5到10天。

在一个实施方案中，通过重复用于诊断疾病或病症的方法进行对疾病或病症的监视，例如在初次诊断后1个月重复，在初次诊断后6个月重复，在初次诊断后1年重复等。

利用本领域已知的用于体内扫描的方法可以检测患者体内的被标记的分子的存在。这些方法依赖于所用的标记的类型。本领域技术人员能确定出用于检测特定标记的合适方法。在本发明的诊断方法中可以使用的方法和设备包括但不限于计算机断层扫描(CT)、全身扫描例如正电子发射断层扫描(PET)、核磁共振显像(MRI)、和超声波。

在一个特定的实施方案中，用放射性同位素标记分子，并用放射应答外科装置检测患者体内的被标记的分子(Thurston等的美国专利No.5,441,050)。在另一个实施方案中，用荧光化合物标记分子并用荧光应答扫描装置检测患者体内的被标记的分子。在另一个实施方案中，用正电子发射金属标记分子并用正电子发射断层扫描检测患者体内的被标记的分子。在另一个实施方案中，用顺磁标记物标记分子并用核磁共振显像(MRI)检测患者体内的被标记的分子。

在另一个方面，本发明提供了一种用于诊断患者发生由未受调节的细胞因子的表达所引起的疾病的易感性的方法。在某些患者细胞、组织或体液中的IL13的量的增加可能提示该患者对某些疾病易感。在一个实施方案中，所述方法包括收集已知具有低或正常水平的IL13的对象的细胞、组织、或体液样品；针对组织或体液分析组织中是否存在IL13；并根据组织或体液中的IL13表达水平预测患者对某些免疫疾病的易感性。在另一个实施方案中，所述方法包括从患者中收集已知含有确定水平的IL13的细胞、组织、或体液样品；分析组织或体液中的IL13的量；并根据与正常细胞、组织或体液中已建立的确定水平或测定水平比较时的IL13量的变化预测患者对某些疾病的易感性。IL13的确定水平可以是依据文献数值的已知量或可以通过测定正常细胞、组织或体液中的量而事先确定。特别地，对某些组织或体液中的IL13水平的确定使得特异地和早期地检测到患者体内的免疫疾病，优选地是在疾病发生之前。利用本方法可以诊断的免疫疾病包括但不限于本文所述的免疫疾病。在优选的实施方案中，所述组织或体液是外周血、外周血白细胞、生物活检组织例如肺或皮肤活检、和组织。

抗IL13抗体的治疗应用

单独施用或联合细胞毒性因子或细胞抑制因子一起施用的抗体(有或没有与之缀合的治疗组分)可以被用作为一种治疗剂。本发明涉及基于抗体的治疗，其包括给动物、哺乳动物、或人施用本发明的抗体，以治疗IL13介导的疾病、病症或病变。针对IL13的抗体对于抑制动物体内的肿瘤或癌细胞增殖是有用的，所述动物包括但不限于牛、猪、马、鸡、猫、狗、非人灵长类等以及人。例如，通过施用治疗可接受剂量的本发明的抗体、或本发明抗体的混合物、或联合施用各种来源的其它抗体，可以减轻或消除所治疗哺乳动物体内的对癌症或肿瘤。

本发明的治疗化合物包括但不限于本发明的抗体(包括如本文所述其片段、类似物和衍生物)和编码下面所述本发明的抗体(包括如本文所述其片段、类似物和衍生物以及抗独特型抗体)的核酸。可以用本发明的抗体治疗、抑制或预防与IL13的异常表达和/或活性相关的疾病、病症、或病变，所述疾病、病症或病变包括但不限于本文所述任何一种或多种疾病、病症、或病变。对与IL13的异常表达和/或活性相关的疾病、病症、或病变的治疗和/或预防包括但不限于缓解与这些疾病、病症、或病变相关的症状。可以以如本领域已知的或本文所述药物学可接受的组合物提供本发明的抗体。

可以在多种疾病中治疗性地应用本发明的抗IL13抗体。本发明提供了一种预防或治疗哺乳动物中IL13介导的疾病的方法。所述方法包括给所述哺乳动物施用疾病预防或治疗量的抗IL13抗体。抗IL13抗体与IL13结合，并调节细胞因子和细胞受体的表达，产生表现为非疾病状态的细胞因子水平。

可以用标准的临床技术确定出能有效地治疗、抑制和预防与IL13的异常表达和/或活性相关的疾病或病症的抗体的量。可以按与疾病相一致的治疗方案施用抗体，例如在一天到数天内施用单次或数次剂量以缓解疾病状态，或在一段延长的时间内施用周期性的剂量以预防过敏或哮喘。另外，可以任选地采用体外测定以帮助鉴别出最佳的剂量范围。在配制品中所采用的精确剂量也依赖于给药途径以及疾病或病症的严重程度，并应当根据医生的判断以及每个患者的情况做出决定。从来源于体外模型或动物模型测试系统的剂量效应曲线可以外推出有效的剂量。

对于抗体，施用给患者的剂量通常是每kg患者体重0.1mg到100mg。优选地，施用给患者的剂量是在每kg患者体重0.1mg和20mg之间，更优选地是在每kg患者体重1mg到10mg之间。一般而言，人抗体在人体内具有比其它物种的抗体更长的半衰期，这是由于人体对外源多肽的免疫应答。因此，更低剂量的人抗体以及更少频率的给药常常是可能的。另外，通过修饰例如脂质化增强抗体的摄取和组织通透性(例如进入到脑部)可以减少本发明的抗体的给药剂量和频率。

可以联合例如其它的单克隆或嵌合抗体、或淋巴因子或造血生长因子(例如IL-2、IL-3、IL-7、IFN、GCSF、GMCSF、Flt3、IL21)或含非甲基化CpG的寡肽有利地利用本发明的抗体，这些物质可以增加与抗体相互作用的效应细胞的数目或活性。

可以单独地或联合其它类型的治疗例如化疗和放疗施用本发明的抗体。

在一个优选的方面，抗体是被充分纯化的(例如，基本上没有限制其作用或产生非所希望的副作用的物质)。

可以按任何可接受的形式给哺乳动物施用抗IL13抗体。导入的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、吸入和口服途径。可以用任何便利的途径施用抗体或组合物，例如通过输注或推注，或通过经上皮或皮肤粘膜内层的吸收(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)，以及可以与其它的生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，可能希望通过任何合适的途径(包括脑室内和鞘内注射)将本发明的治疗抗体或组合物导入到中枢神经系统内；通过脑室内导管例如连接到储存池如Ommaya囊的导管可以有助于脑室内注射。

也可以采用肺部给药，例如通过使用吸入器或雾化器以及雾化剂的剂型。也可以给患者的肺部施用干粉组合物形式的抗体(参见例如美国专利No.6,514,496)。

在一个特定的实施方案中，希望将本发明的治疗性抗体或组合物局部地施用到所希望治疗的部位；例如通过(并不限于此)局部输注、局部应用、通过注射、通过导管的方式、通过栓剂的方式、或通过植入物的方式可以实现这一点，所述植入物是多孔的、非多孔的、或胶状的材料，包括膜，例如sialastic膜，或纤维。优选地，当施用本发明的抗体时，必须小心地使用蛋白质所不吸附的材料。

在另一个实施方案中，可以在载体中送递抗体，特别是在脂质体中(见，Langer,Science249:1527-1533(1990)；Treat et al.,in Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein andFidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez Berestein,ibid.,pp.317-327;see generally ibid.)。

在另一个实施方案中，可以用控释系统送递抗体。在一个实施方案中，可以使用泵(见，Langer,如上;Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald et al.,Surgery88:507(1980)；Saudek etal.,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(见，Medical Applications of Controlled Release,Langer andWise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger and Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)；也见Levy et al.,Science228:190(1985)；During et al.,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard et al.,J.Neurosurg.71:105(1989))。在另一个实施方案中，可以将控释系统置于治疗靶点的附近。

本发明也提供了药物组合物。这些组合物包括治疗有效量的抗体，以及生理学可接受的载体。在一个特定的实施方案中，术语“生理学可接受的”意思是经联邦或州政府的审批机构所认证的或在美国药典或其它普遍公认的用于动物(以及更特别地用于人)的药典中所罗列的。术语“载体”指的是与治疗药物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这些生理学载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用所述药物组合物时，水是一种优选的载体。也可以采用盐溶液和葡萄糖和甘油水溶液作为液体载体，特别是作为可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果希望，所述组合物也可以含有少量的湿化剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放配制品等形式。用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯可以将所述组合物配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体例如药物纯级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述了合适载体的实例。这些组合物含有有效量的抗体(优选地是纯化形式的抗体)以及合适量的载体，以便提供能适当地施用给患者的形式。剂型应当适应于给药的模式。

在一个实施方案中，根据常规方法将组合物配制成为适用于静脉内施用给人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是无菌等张的水性缓冲溶液。如果需要，组合物也可以含有增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。一般地，组分可以分别地或一起混和在单位剂量形式中提供，例如作为在标明活性剂的量的熔封容器例如安瓿或密封袋(sachette)内的冻干粉末或无水浓缩物提供。如果要通过输注施用所述组合物，可以用含有无菌的药物纯级水或盐水的输液瓶配药。如果要通过注射施用所述组合物，可以提供一安瓿的注射用无菌水或盐水，使得可以在给药之前混和组分。

本发明也提供了包括一个或多个装有本发明的药物组合物的一种或多种组分的容器的药物包装或试剂盒。与这些容器任选地伴随的可以是以管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的说明，这些说明反映了管理人体施用的药物的生产、使用或销售的机构的认证。

此外，本发明的抗体可以与各种效应分子例如异源多肽、药物、放射性核素、或毒素缀合。参见例如PCT文献WO92/08495、WO91/14438、WO89/12624、美国专利No.5,314,995、和EP396,387。抗体或其片段可以与治疗组分缀合，所述治疗组分例如细胞毒素如细胞生长抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子例如α粒子辐射剂例如213Bi。细胞毒素或细胞毒剂包括任何对细胞有害的物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、dihydroxyanthracin dione、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、更生霉素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，氨甲蝶呤、6-硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、马法兰(melphalan)、卡氯芥(carmustine,BSNU)和环己亚硝脲(lomustine,CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、顺二氯化二氨亚铂（II）(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(daunorubicin,以前称为daunomycin)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前叫放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和蒽霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

用于将这些治疗组分与抗体缀合的技术是熟知的，见例如Arnonet al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss Inc.1985)；Hellstrom et al.,“AntibodiesFor Drug Delivery”,in Controlled Drug Delivery(2^nd Ed.),Robinson etal.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",inMonoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy",in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press1985)，和Thorpe etal.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates",Immunol.Rev.62:119-58(1982)。或者，抗体可以与第二种抗体缀合以形成抗体异源缀合物。(见例如Segal的美国专利No.4,676,980)。

本发明的缀合物可以被用于修饰给定的生物应答，治疗剂或药物组分不应被解释成限定为经典的化学治疗剂。例如，药物组分可以是具有所希望的生物活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可以包括例如毒素如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白纤溶酶激活剂；凋亡剂例如TNFα、TNFβ、AIM I(见国际文献No.WO97/33899)、AIM II(见，国际文献No.WO97/34911)、Fas配体(Takahashi et al.,Int.immunol.,6:1567-1574(1994))、VEGI(见，国际文献No.WO99/23105)；血栓形成剂或抗血管生成剂例如血管抑素(angiostatin)或血管内皮抑素(endostatin)；或生物应答修饰剂例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其它的生长因子。

实施例

实施例1

IL13免疫原(一种突变的、失活的人IL13/Fc(MT-IL13/Fc))的制备

A.MT-IL13/Fc的表达质粒的克隆和构建

据报道在第13位氨基酸残基上具有突变(谷氨酸突变成赖氨酸)的人IL13能以相同的或更高的亲和力与IL13Rα1结合，但其已经丧失了激活具有IL13Rα1的细胞的能力(Thompson et al.,J.Biol.Chem.,274:29944(1999))。在人胚胎肾细胞293-T内表达该突变的、失活的IL13(称为MT-IL13)。用纯化的重组蛋白作为本发明的免疫原，以产生抗IL13单克隆抗体。合成了2种对应于MT-IL13的寡核苷酸序列的寡核苷酸引物

5'AAGCTTTCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCAT3'(SEQ ID NO9)和

5'CTCGAGGTTGAACCGTCCCTCGCGAAAAAG3'(SEQ ID NO10)，并将其用作聚合酶链反应(PCR)中的模板，以从人睾丸cDNA文库(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)中克隆IL13基因。将缺少预期的IL13的信号肽序列的PCR片段(342个碱基对)连接到pSecTag/FRT载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，所述pSecTag/FRT载体在其5’末端含有分泌信号肽序列以及在3’末端含有人Fcγ1(绞链区和恒定区CH2及CH3)序列。通过测序确认该构建体的组成。

B.从所转染的293T细胞中产生MT-IL13/Fc

为了短暂表达MT-IL13/Fc，根据生产商说明书，用Lipofectamine2000(Invitrogen)将纯化的质粒DNA转染到293T细胞内。在转染后72个小时，收集转染细胞的培养物上清液用于纯化。为了稳定地表达MT-IL13/Fc，用Flp-In293T细胞系(Invitrogen)建立细胞系。为了确认表达，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析培养物上清液。将所分离的蛋白转移到硝基纤维素膜上，并通过与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的小鼠抗人IgG(Fc)单克隆抗体(Sigma,St.Louis,MO)或多克隆的山羊抗IL13抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)的反应进行检测，然后用HRP-驴抗山羊IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)对上述单克隆或多克隆抗体进行检测。利用增强的化学发光检测(Supersignal WestPicoChemiluminescent Substrate,Pierce,Rockford,IL)在膜上鉴别出免疫反应性蛋白。

C.MT-IL13/Fc的纯化

用经磷酸盐缓冲液(PBS)平衡的hyper-D蛋白A亲和柱(Invitrogen)纯化MT-IL13/Fc。在往柱中加入细胞培养物上清液后，用超过20倍柱体积的PBS洗涤树脂。然后，用SCC缓冲液(0.05M柠檬酸钠、0.5M氯化钠，pH6.0)洗涤树脂，以去除未结合的蛋白质。然后洗脱出IL13融合蛋白(0.05M柠檬酸钠、0.15M氯化钠，pH3.0)，并在PBS中进行透析。

用SDS-PAGE分析含有MT-IL13/Fc的得自亲和柱的级分。用考马斯蓝染色分析蛋白的纯度，以及如上所述用利用山羊抗人IgG(Fc)抗体(Sigma)和山羊抗人IL13抗体(R&D Systems)的Western免疫印迹法进行蛋白的鉴定。

实施例2

抗IL13单克隆抗体的产生

给8-12周龄的雄性A/J小鼠(Harlan，Indianpolis，IN)皮下注射200μl含20μg MT-IL13/Fc和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,MI)的PBS(pH7.4)。在两周的间隔内，给小鼠皮下注射两次处于弗氏不完全佐剂中的20μg MT-IL13/Fc。然后，在两周后以及在处死前3天，再次给小鼠腹腔内注射含有20μg同种免疫原的PBS。将从经一种或多种抗原免疫的小鼠中所分离到的脾细胞用于融合。对于大肠杆菌表达的人IL13(R&D Systems)作为免疫原时，也使用相似的免疫接种和融合的方法。

在导致产生抗IL13MAb228B/C-1的融合中，组合来自两种免疫小鼠的26.4x10⁶个脾细胞和58.8x10⁶个脾细胞。对于每种融合，从免疫小鼠的脾中制备出单细胞悬液，并将其用于与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。在含有50%聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak,Rochester,NY)和5%二甲基亚砜(Sigma)的培养基中，按1:1的比例融合Sp2/0和脾细胞。然后在加有10%胎牛血清、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、和16μM胸腺嘧啶的DMEM培养基(Invitrogen,CA)中将细胞调整至浓度为每250μL悬浮液中1.5x10⁵个脾细胞。往约50个96孔微量培养板的每个孔内加入250微升细胞悬浮液。在约10天以后，取出培养物上清，用于在ELISA中筛选与MT-IL13/Fc的反应性。

通过加入纯化的MT-IL13/Fc(0.1μg/mL)将Immulon2(DynatechLaboratories,Chantilly,VA)微量测定板的孔在室温下过夜包被。通过轻弹平板去除包被液之后，往每孔内加入200μL封闭/稀释缓冲液(含有2%小牛血清白蛋白和0.05%的PBS)1个小时以封闭非特异性位点。在1小时之后，用PBST缓冲液(含有0.05%的PBS)洗涤孔。从每个融合孔内收集50微升培养物上清液，并将其与50μL封闭/稀释缓冲液混和，然后将其加入到微量测定板的单个孔内。在温育1个小时之后，用PBST洗涤孔。然后通过与HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc特异的)(Jackson ImmunoResearchLab，West Grove，PA)的反应检测所结合的鼠抗体，并用封闭/稀释缓冲液按1:2,000将其稀释。往孔内加入含有0.1%3,3,5,5四甲基联苯胺(Sigma，St.Louis,MO)和0.003%过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶底物溶液进行显色30分钟。通过每孔加入50μL2M H₂SO₄终止反应。用BioTek ELISA读数器(BioTek Instruments,Winooski,VM)测定反应混和物的OD₄₅₀值。

然后测定得自MT-IL13/Fc筛选阳性孔的培养物上清液与无关的Fγ1融合蛋白的阴性结合。然后通过有限稀释选择出单细胞克隆的最终阳性孔。用ELISA重新测定得自单克隆抗体的培养物上清液以确认其活性。将所选择的杂交瘤生长在锥形瓶内，并收集用过的培养物上清液用于通过蛋白A亲和层析进行抗体纯化。

用四种测试测试纯化的抗体：i)与293T细胞表达的MT-IL13/Fc以及大肠杆菌表达的小鼠IL13的交叉反应性；ii)抑制HDLM-2和L-1236细胞的IL13自分泌性增殖；iii)抑制IL13诱导的THP-1细胞中的STAT6磷酸化；和iv)抑制IL13调节的人单核细胞的CD14及CD23的表达。

从在MT-IL13/Fc和IL13免疫的小鼠中进行的融合中得到了73种抗IL13MAb。纯化了39种Mab用于通过ELISA和基于细胞的测试描述它们的特征。这39种MAb中有13种MAb抑制自分泌性IL13诱导的HDLM-2和L-1236细胞的增殖(见实施例5中的测试描述和结果)。ELISA中发现了4种MAb与人IL13有着强反应，并且它们在基于功能性细胞的测试中中和人IL13。这些单克隆抗体被称作228B/C-1、228A-4、227-26、和227-43。所有的这些抗体都是利用糖基化MT-IL13/Fc作为免疫原产生的。

实施例3

ELISA测定的抗IL13单克隆抗体与人及小鼠IL13的反应性

用ELISA测试各种抗IL13单克隆抗体的反应性。通过添加100μL含有0.1μg/mL IL13蛋白的PBS溶液，96孔微量测定板的不同孔用大肠杆菌表达的非糖基化的人IL13(R&D Systems)、293T细胞表达的糖基化MT-IL13/Fc、或大肠杆菌表达的小鼠IL13(R&D Systems)包被。在室温下过夜温育之后，用PBSTB(含有2%BSA的PBST)处理孔以饱和剩余的结合位点。然后用PBST洗涤孔。

在室温下往孔内加入100微升2倍系列稀释的抗IL13mAb(从0.5μg/mL(3.33nM)到0.05ng/mL(0.00033nM))1个小时。同时测定来自(BD Biosciences-Pharmingen,San Diego,CA)的抗IL13mAb JES-5A2，并将其作为阳性对照。这种抗体是通过利用大肠杆菌表达的人IL13作为免疫原产生的。将同种型匹配的小鼠抗HIV-1gp120MAb作为无关的阴性对照。然后用PBST洗涤孔。通过与稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch)在室温下温育1个小时检测所结合的抗体。然后如上述的加入过氧化物酶底物溶液显色。用ELISA读数器测定OD₄₅₀。

图1显示了ELISA测定的抗IL13mAb228B/C-1、228A-4、227-26、227-43和阴性对照的剂量依赖性结合。在这些mAb中，228B/C-1表现出最强的反应性。图2显示了ELISA测定的抗IL13mAb与MT-IL13/Fc的剂量依赖性的结合。228B/C-1和228A-4表现出与MT-IL13/Fc最强的反应性，而227-26和227-43表现出中等的反应性。

图1和2显示228B/C-1在所有被测试的抗IL13mAb中具有与糖基化及非糖基化的人IL13最高的亲和力。在ELISA测定中，所有这些抗IL13mAb与小鼠IL13都没有交叉反应(数据未显示)。

实施例4

JES10-5A2缺乏对228B/C-1-Hrp与人IL13结合的竞争

为了研究JES10-5A2和228B/C-1是否与人IL13上的相同的表位结合，用竞争性ELISA检查JES10-5A2对228B/C-1-HRP与大肠杆菌表达的人IL13结合的作用。96孔微量测定板中的每个孔都与100μL含有0.1μg/mL IL13蛋白的PBS溶液温育。在室温下过夜温育之后，用PBSTB(含有2%BSA的PBS)处理孔以饱和剩余的结合位点。然后用PBST洗涤孔。将50微升2倍系列稀释的228B/C-1和JES10-5A2(终浓度从20μg/mL到9.76ng/mL)与50μL预先滴定的228B/C-1-HRP(1:6,400稀释)混和。然后将混和物加入到孔中，并在室温下温育1个小时。然后如上所述加入过氧化氢酶底物溶液显色。用ELISA读数器测定OD₄₅₀。

图3证实了JES10-5A2不竞争228B/C-1-HRP与人IL13的结合，说明228B/C-1和JES10-5A2与人IL13上的不同位点相结合。

实施例5

通过利用L-1236和HDLM-2细胞的IL-13自分泌依赖性增殖测试筛选抗IL13的中和单克隆抗体

L-1236和HDLM-2是从德国Collection of Microorganisms andCell Cultures(DSMZ,Braunschweig,Germany)得到的霍奇金淋巴瘤细胞系。这些细胞系产生IL13，而IL13接下来以自分泌的方式激活它们的细胞增殖(Kapp U et al.,J.Exp.Med.189:1939(1999))。在有或没有不同的抗IL13mAb(0.2、0.02和0.002μg/mL)时，将细胞在5%CO₂、37℃下培养(25,000个细胞/孔)3到5天。然后通过利用四唑盐化合物MTS(Promega,Madison,WI)的测试(在OD₄₉₀读取)或通过掺入³H-胸腺嘧啶(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)测定细胞增殖。

预计往这些细胞系的培养物中添加抗IL13中和mAb将通过结合并使这些细胞所产生的IL13失活而抑制细胞的增殖。图4所示的结果显示了本发明的抗IL13mAb对L-1235细胞增殖的作用。在所测试的中和抗体中，mAb228B/C-1显示出最高效力地以剂量依赖性方式抑制L-1236细胞增殖。而TA1-37(用大肠杆菌表达的人IL13作为免疫原所产生的抗IL13mAb)甚至在剂量高到0.2μg/mL也没有任何的抑制活性。用HDLM-2细胞得到了相似的结果。

实施例6

对原代人单核细胞上的IL13调节的CD14和CD23表达的测试

IL13诱导对人单核细胞上的CD14表达的抑制以及对CD23表达的上调(de Waal Malefyt et al.,J.Immunol.,151:6370(1993)；Chomaratet al.,Int.Rev.Immunol.,17:1(1998))。通过在Histopaque-1077(Sigma)中的密度梯度离心从新鲜收集的、肝素化的健康人供体的全血中分离出外周血白细胞(PBLs)。向含有重组IL13(终浓度10ng/mL=0.813nM)和抗IL13单克隆抗体或无关抗体(三倍系列稀释，始自终浓度12μg/mL=80nM)的96孔组织培养板的每个孔内都加入悬浮在加有5%小牛血清的RPMI-1640(Invitrogen)中的PBLs(1.5x10⁶)。通过向温育培养基中加入0.813nM人IL13分别抑制或上调了单核细胞上的CD14表达或CD23表达。对照培养基含有RPMI-1640/FBS培养基，但不含有重组IL13。

将细胞在5%CO₂、37℃下温育2天。收集细胞，用抗CD14-FITC或抗CD23-PE(BD Biosciences-Pharmingen)染色。用流式细胞术测定单核细胞群上的CD14和CD23的表达水平，并用中位荧光强度(Median Fluorescence Intensity,MFI)表示。

图5描述了抗IL13mAb对受IL13抑制的人单核细胞上的CD14表达的作用。在所有测试的抗IL13mAb中，228B/C-1在抑制IL13对CD14表达的作用上具有最高的效力。在0.33nM浓度上，达到对IL13作用的完全抑制。mAb227-26和228A-4的抑制活性是中等的，而JES10-5A2具有弱活性。甚至在80nM浓度上，JES10-5A2仍不能完全地抑制IL13的作用。

图6描述了抗IL13MAb对IL13诱导的人单核细胞上的CD23表达上调的作用。与CD14表达中的结果相似(图5)，在所有测试的抗IL13MAb中，228B/C-1最强力地抑制IL13对CD23表达的作用。0.33nM浓度的228B/C-1达到完全抑制。JES10-5A2具有弱抑制效力。

根据图5和6所示的结果，在摩尔化学计量比为1:2(mAb:IL13)时，228B/C-1可以实现对IL13的完全抑制，因此，228B/C-1是一种具有非常高亲和力的抗人IL13的中和MAb。

实施例7

IL13诱导的THP-1细胞中的STAT6磷酸化的测试

IL13能激活髓细胞系THP-1(ATCC，Manassas，VA)以诱导STAT6的磷酸化，这是IL13的信号传导途径中的关键步骤(Murata T et al.,Int.Immunol.10:1103-1110(1998))。在这个测试中，测试了抗IL13MAb对IL13的抑制作用。

将THP-1细胞维持在加有5%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Invitrogen)中。在试验当天，洗涤细胞并将其在无血清的DMEM中、37℃和5%CO₂下温育2个小时。然后向96孔圆底平板的每个孔内都加入80μL含有0.3x10⁶个细胞的无血清培养基，和120μL含有人IL13(终浓度为10ng/mL=0.813nM)和抗IL13MAb(5倍系列稀释液，始自终浓度0.5μg/mL=3.333nM)。阴性对照孔不含有IL13或含有IL13以及同种型匹配的无关MAb。

将混和物在5%CO₂、37℃下温育10分钟。然后将平板在4℃、300xg下离心3分钟。在倒掉上清液之后，将细胞沉淀物重悬在100μLLaemmli非还原样品缓冲液(SDS-PAGE上样缓冲液，BioRad，CA)中，然后将其转移到微量离心管内。将所述离心管在95℃下加热5分钟，然后在室温下10,000xg离心10分钟。收集上清液，并用4-20%梯度SDS-PAGE分析。将所分离的蛋白质转移到PVDF膜上，然后将膜与稀释的小鼠抗人Stat6(Y641，磷酸特异的)mAb(BD BiosciensesPharmingen)一起温育。

用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc)抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories)检测结合的抗体。利用增强的化学发光测试(SupersignalWest Pico Chemiluminescent Substrate,Pierce)鉴定膜上的免疫反应性蛋白。图7描述了抗IL13MAb对IL13诱导的THP-1细胞中的Stat6磷酸化的作用的结果。在经0.813nM人IL13处理的THP-1细胞中，Stat6被磷酸化。当用MAb228B/C-1、228A-4、227-26、227-43和JES10-5A2处理细胞时，发现了对Stat6磷酸化的剂量依赖性的抑制作用。在所测试的抗IL13mAb中，MAb228B/C-1是作用最强的中和抗体。浓度为0.667nM和0.133nM之间的228B/C-1可以达到完全抑制。完全抑制时的228B/C-1和IL13之间的近似摩尔化学计量比是1:2。这与图5和6中所示的数据一致。

实施例8

对编码抗IL13单克隆抗体的重链和轻链基因的分子克隆

用QIAGEN试剂盒(Valencia，CA)从杂交瘤细胞中分离出总RNA。如下进行逆转录(第一链cDNA)反应：将1-1.5mg总RNA与1ml10mM dNTPs、50ng随机六聚物、以及无RNase的水混和，终体积为12mL。

将反应混和物在65℃下温育5分钟，并立即将其放置于冰上1分钟。在短暂离心之后，加入以下试剂：4mL5X第一链缓冲液(250mM Tris-HCl、pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl₂)、2mL0.1mM DTT、和1mL RNaseOUT RNase抑制物(40U/mL)。在混和之后，将反应物在室温下温育2分钟。然后向混和物中加入1mL Superscript IIRT(50U/mL)，在25℃温育10分钟，随后在42℃温育50分钟。在短暂离心之后，将反应物在70℃温育15分钟以灭活逆转录酶。然后加入1μL RNaseH(2U/mL)，并将反应物在37℃温育20分钟以破坏RNA。

为了扩增重链和轻链的可变区，使用了O’Brien和Jones(O'BrienS.and Jones T.,"Humanizing antibodies by CDR grafting",AntibodyEngineering,Springer Lab manual,Eds.Kontermann and Duble,S(2001))描述的方法。简要而言，从信号肽区选择5’引物(轻链有11组，重链有12组简并引物)，从轻链或重链的恒定区内选择3’引物。将5’和3’引物(1.5mL10mM)与5mL10X PCR缓冲液(250mM Tris-HCI、pH8.8，20mM MgSO₄，100mM KCl，100mM(NH4)₂SO₄，1%TritonX-100，1mg/mL无核酸酶的BSA)、先前制备的1mL cDNA、1mL Turbopfu(Stratagene)混和，并用水将其终体积调整为50mL。如下进行PCR：1个循环的94℃下4分钟；25个循环的94℃下30秒、53℃下30秒、和72℃下45秒；1个循环的72℃下7分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析反应混和物。

纯化所扩增的DNA片段，并将其克隆到pcDNA3.1载体内。根据厂家所推荐的方案，利用Invitrogen TOPO克隆试剂盒进行克隆。15到20个转化大肠杆菌的克隆被用于质粒纯化。用T7引物对质粒进行测序。通过杂交诱变技术(Glaser S.et al.Antibody Engineering(Oxford University Press,New York(1995)),Near RI,BioTechniques12:88(1992))将重链和轻链的优势序列(predominant sequences)克隆到M13Fab表达载体内。用ELISA确认所表达的Fab的结合性质。图8描述了228B/C的VH和VL链的氨基酸序列。

实施例9

表位定位

抗IL-13MAb228B/C-1与一个构象表位结合，并以与人IL13结合相同的高亲和力与cynomologous猴的IL13结合。但是，228B/C不与鼠IL13结合。因此，设计用于表位定位的策略是将猴IL13的小部分与相应的小鼠IL13序列互换。合成重叠寡核苷酸。进行两轮PCR以装配出IL13杂交构建体，使得用来自小鼠IL13的相应序列取代猴IL13的一部分序列。利用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将最终的PCR扩增的IL13编码区符合读框地克隆到具有V5标签的pcDNA3.1载体内。通过测序确认所有的PCR扩增的区域都只含有所希望的结构域交换突变(domain swapping mutation)，并且在表达载体中没有其它的非所希望的突变。

抗IL13MAb结合表位被鉴定为从氨基酸#49到56的8肽ESLINVSG(SEQ ID NO18)。这个表位位于人IL13的B螺旋和BC环中。当来源于cyno-IL13的表位肽被用于交换鼠IL13中的相应序列时，所形成的杂交IL13分子能与228B/C结合，其结合亲和力与原始的cynoIL13的结合亲和力相似，进一步确认了228B/C MAb在残基#49-56之间的肽上与cyno或人IL13结合。人、cyno、和鼠IL13的序列比较显示人IL13中只有三个残基Ile52、Val54、Gly56不是保守的，提示这三个残基中的一个或多个的组合决定了IL13和抗IL13MAb通过该8肽相互作用的关键残基。

用肽点分析(peptide spot analysis)进一步确认该表位。用一系列经SPOT在纤维素膜上合成的重叠的12肽扫描整个人IL13肽。唯一的抗IL13MAb反应性肽被鉴定为氨基酸#44-56的12肽，YCAALESLINVS(SEQ ID NO19)，该序列与通过结构域交换试验中所鉴别的区域重叠。

实施例10：抗-IL-13MAb的ADCC分析

PBMC通过标准离心技术使用Ficoll-paque分离自新鲜肝素化的血样(50ml淡黄色表层提供～300×10⁶PBMC)。将PBMC用在RPMI1640/10%FCS中的IL-2(10U/ml)在37℃、5％CO₂的条件下刺激24小时(20×10⁶PBMC)。

24小时后，将HDLM-2或L-1236(霍奇金淋巴瘤细胞系)靶细胞(2×10⁶个细胞)通过与400uCi的⁵¹Cr(铬酸钠)在37℃保温过夜而标记。将⁵¹Cr标记的细胞洗涤4次并再悬浮于RPM11640/5%FCS中。然后将标记的细胞等份加入96孔U型底平板中(一式两孔)。然后以不同的E:T比率(例如80:1、20:1)加入IL-2刺激的PBMC。

将测试的抗IL13MAb系列稀释并等份加入孔中，以便终MAb浓度在例如0、0.5、5、50μg/ml之间。在保温后，将平板在900rpm离心3分钟。从每个孔中收集上清，计数放射性的量。细胞裂解百分比根据如下等式计算：

%细胞裂解=(Cpm_test-Cpm_spont)/(Cpm_max-Cpm_spont)×100%

[额外的ADCC信息见例如L.M.Weiner et at,Cancer Res.,48:2568-2573(1988)；P.Hersey et al,Cancer Res.,46:6083-6090(1988)；C.J.Hansik et al,Proc.Natl.Acad.Sci.,83:7893-97(1986)所述]。

实施例11：补体介导的细胞毒性(CMC)的分析

肿瘤细胞（5×10⁴于50μL的DMEM培养基中）、正常人血清（于50μL培养基中1:1稀释）及各种浓度的人源化抗IL13MAb（IgG1）（于100μL培养基中）可以在96孔平底平板中在37℃、5％CO₂下保温2小时。一种不相关的同种型匹配的抗体可用作阴性对照。加入细胞增殖试剂WST-1（15μL，Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）并在37℃保温5小时。生色反应的光密度用ELISA平板读数器在450nm读数。CMC被抗IL13MAb的抑制百分比＝100×(OD_s/a－OD_s)/(OD_ns-OD_s)，OD_s/a是用血清和抗体处理孔的OD，OD_s是用血清处理孔的OD，OD_ns是无血清和抗体处理孔的OD。

保藏

下面的培养物已经被保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection,10801University Boulevard,Manassas Va.20110-2209USA(ATCC))：

杂交瘤	ATCC编号	保藏日期
			抗IL13228B/C-1	PTA-5657	2003年11月20日
抗IL13228A-4	PTA-5656	2003年11月20日
			抗IL13227-26	PTA-5654	2003年11月20日
抗IL13227-43	PTA-5655	2003年11月20日

本保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约及其细则(布达佩斯条约)的相关规定进行的。这保证了从保藏之日起保持该活培养物30年。在布达佩斯协议的范围下，通过ATCC可以获得该生物体，这保证了在相关的美国专利授权之后，公众可以永久地、不受限制地获得该培养物的后代。

本申请的受让人已经同意如果当在合适条件下培养的被保藏培养物死亡或丢失或被损害时，将在被通知后迅速地用相同培养物的活体样品代替。保藏菌株的获得并不作为在违反任何政府主管部门根据其专利法所赋予的权利下实施本发明的许可。

上面所写的说明书据信足以使得本领域技术人员能够实施本发明。本发明并不受所保藏的培养物的范围的限定，因为所保藏的实施方式只是用作举例说明本发明的一个方面，任何功能上等价的培养物都在本发明的范围之内。本文材料的保藏不构成对本文所含的所写的描述不足以能实施本发明的任何方面(包括本发明的最佳模式)的承认，它也不被用于将本权利要求书的范围限定到本文所呈现的特定的举例说明。事实上，通过上面的描述，对本发明的各种除了本文所示的和所述以外的修饰对于本领域人员将是显而易见的，并且都在附录的权利要求书的范围之内。

本领域人员将认识到，或者能确信应用不超出常规试验范围的、与本文所述特异的实施方式等价的多个等价物。下面的权利要求书包括这些等价物。

Claims

1.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含治疗有效量的特异性结合人IL-13的拮抗性抗人IL-13抗体或其抗原结合片段和生理学可接受的载体，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含一可变轻链区和一可变重链区，所述可变轻链区包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：99的CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO：104的CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO：115的CDR3；所述可变重链区包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：117的CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO：123的CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO：135的CDR3。

2.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含治疗有效量的特异性结合人IL-13的拮抗性抗人IL-13抗体或其抗原结合片段和生理学可接受的载体，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含ATCC保藏号为PTA-5657的杂交瘤228B/C-1产生的抗体的6个互补决定区(CDR)。

3.权利要求1的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含ATCC保藏号为PTA-5657的杂交瘤228B/C-1产生的抗体的人源化序列或来自ATCC保藏号为PTA-5657的杂交瘤228B/C-1产生的抗体的轻链可变区和重链可变区的抗原结合区。

4.权利要求2的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含ATCC保藏号为PTA-5657的杂交瘤228B/C-1产生的抗体的人源化序列或来自ATCC保藏号为PTA-5657的杂交瘤228B/C-1产生的抗体的可变轻链区和可变重链区的抗原结合区。

5.权利要求1的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含可变轻链区，所述可变轻链区包含氨基酸序列SEQ ID NO：142、144或150，且所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含可变重链区，所述可变重链区包含氨基酸序列SEQ ID NO：143、145、146、147、148或149。

6.权利要求2的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含可变轻链区，所述可变轻链区包含氨基酸序列SEQ ID NO：142、144或150，且所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含可变重链区，所述可变重链区包含氨基酸序列SEQ ID NO：143、145、146、147、148或149。

7.权利要求1的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO：3所示序列，所述可变重链区包含SEQ ID NO：4所示序列。

8.权利要求2的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO：3所示序列，所述可变重链区包含SEQ ID NO：4所示序列。

9.权利要求1的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含与SEQ ID NO：3所示序列具有至少95%相同性的氨基酸序列，所述可变重链区包含与SEQ ID NO：4所示序列具有至少95%相同性的氨基酸序列。

10.权利要求2的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含与SEQ ID NO：3所示序列具有至少95%相同性的氨基酸序列，所述可变重链区包含与SEQ ID NO：4所示序列具有至少95%相同性的氨基酸序列。

11.权利要求1的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含一可变轻链区和一可变重链区，所述可变轻链区包含氨基酸序列SEQ ID NO：142；所述可变重链区包含氨基酸序列SEQ ID NO：143。

12.权利要求2的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含一可变轻链区和一可变重链区，所述可变轻链区包含氨基酸序列SEQ ID NO：142；所述可变重链区包含氨基酸序列SEQ ID NO：143。

13.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段是单克隆抗体。

14.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段是IgG抗体。

15.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

16.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体或其片段。

17.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段是单链抗体、单价抗体或多特异性抗体。

18.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述拮抗性抗体介导通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性的肿瘤细胞杀灭，且所述抗体包含人IgG1的恒定区。

19.权利要求17的药物组合物，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。

20.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述生理学可接受的载体是稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。

21.权利要求16的药物组合物，其中所述生理学可接受的载体是稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。

22.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述药物组合物用于通过吸入、推注或灌注给予。

23.权利要求16的药物组合物，其中所述药物组合物用于通过吸入、推注或灌注给予。

24.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述癌症是霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、头颈部癌症、肾细胞癌、鳞状细胞癌、AIDS-相关的Kaposi's癌或脑癌。

25.权利要求16的药物组合物，其中所述癌症是霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、头颈部癌症、肾细胞癌、鳞状细胞癌、AIDS-相关的Kaposi's癌或脑癌。

26.权利要求1-12任一项的药物组合物，其中所述抗体或抗原结合片段与一种细胞毒剂缀合。

27.权利要求26的药物组合物，其中所述细胞毒剂是毒素、放射性同位素或者细胞生长抑制剂。

28.一种用于诊断生物学样品中癌症或肿瘤的组合物，其中所述癌症或肿瘤过表达IL-13，所述组合物包含特异性结合人IL-13的拮抗性抗人IL-13抗体或其抗原结合片段，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含一可变轻链区和一可变重链区，所述可变轻链区包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：99的CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO：104的CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO：115的CDR3；所述可变重链区包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：117的CDR1、具有氨基酸序列SEQ ID NO：123的CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO：135的CDR3。

29.权利要求28的组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含ATCC保藏号为PTA-5657的杂交瘤228B/C-1产生的抗体的人源化序列或来自ATCC保藏号为PTA-5657的杂交瘤228B/C-1产生的抗体的轻链可变区和重链可变区的抗原结合区。

30.权利要求28的组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：142、144或150之一的VL链，且所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：143、145、146、147、148或149之一的VH链。

31.权利要求28的组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含VL链和VH链，所述VL链包含SEQ ID NO：3所示序列，所述VH链包含SEQ ID NO：4所示序列。

32.权利要求28的药物组合物，其中所述拮抗性抗体或抗原结合片段包含一可变轻链和一可变重链，所述可变轻链包含SEQ ID NO：142所示的氨基酸序列；所述可变重链包含SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列。

33.权利要求24的药物组合物，其中所述癌症是霍奇金淋巴瘤。