CZ283050B6

CZ283050B6 - Polypeptid, jeho subsekvence a jejich použití

Info

Publication number: CZ283050B6
Application number: CS906352A
Authority: CZ
Inventors: Lata Ramanathan; Gail F. Seelig; Paul P. Trotta
Original assignee: Schering Corporation
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-18
Publication date: 1997-12-17
Also published as: FI104180B1; HUT64568A; PT96230B; FI104180B; ES2085983T3; IE904589A1; HU9202073D0; DK0506826T3; IE74708B1; AU639754B2; SK279933B6; PT96230A; FI922847L; GR3020325T3; MX9203401A; NO922457D0; EP0506826A1; KR960016862B1; ATE136906T1; FI922847A0

Abstract

Polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-Arg-Rhe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu-Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro-Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met-Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser nebo jeho subsekvence a jejich použití k přípravě polyklonální a/nebo monoklonální protilátky.ŕ

Description

Vynález se týká polypeptidu, jeho subsekvencí ajejich použití pro přípravu polyklonální a/nebo monoklonální protilátky, která se specificky váže na lidský IL-4.

Dosavadní stav techniky

Interleukin-4 /IL-4/ je protein (bílkovina), ovlivňující široké spektrum hematopoetických (krvetvorných) buněk [Strober et al.: Pediatr. Res. 24:549 (1988)]. IL-4 zvyšuje některé činnosti, včetně funkce makrofág, tvorby IgG a IgE a bujení (novotvoření tkáně) imunoglubulinstimulovaných B buněk, antigen-stimulovaných T buněk a erythropoietin-stimulovaných předků červených krvinek. Také rovněž zvyšuje bujení IL-4-stimulovaných žímých buněk.

Spolu slgG hrají žímé buňky ústřední roli v alergických reakcích. Žímé buňky jsou buňky pojivové tkáně, obsahující granule; tyto buňky jsou umístěny co nejblíže k vlásečnicím všude v těle a obzvláště ve vysokých koncentracích jsou v plících, kůži a gastrointenstinálním a močopohlavním traktu. Při následujícím vystavení žímých buněk látce, vyvolávající tvorbu protilátek (antigenu), podléhají degranulaci a uvolňují chemické mediátory, jako je histamin, serotonin (5-hydroxytryptamin), heparin, prostaglandiny atd., působící na vyvolání alergické reakce.

Kvůli stimulačním účinkům IL-4 na tvorbu IgE a bujení žímých buněk může být antagonista IL-4 užitečný pro léčbu alergií tím, že dochází k poklesu růstu žímých buněk a tvorby IgE.

Někteří badatelé používali protilátky pro antagonistické působení na biologickou aktivitu IL-4. Například Finkelman se spolupracovníky [Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:9675 (1986)] použili monoklonální protilátku proti BSF-1 (nyní nazývaný IL-4) pro inhibování IL-4 indukované tvorby IgE u myší, infikovaných nematode parazitem Nippostrongylus brasiliensis, nebo u myší, které dostaly injekci rafinované (čištěné) kozí protilátky na lgD u myší. O obou léčbách bylo známo, že stimulují tvorbu IgE; podle pozdější léčby pak bylo také známo, že stimuluje vylučování IL-4.

Nedávno uveřejnil Chrentien se spolupracovníky [J. Immunol. Meth. 117:67 (1989)], že polyklonální králičí antisérum k částečně čištěnému rekombinantnímu lidskému IL-4 neutralizuje některé z biologických aktivit IL-4 in vitro. Monoklonální protilátky proti syntetickým polypeptidům, majícím pořadí nebo též sekvence (viz další strana) aminokyselin, odpovídající zbytkům 3 až 18, 31 až 46, 52 až 65 a 112 až 127 zralého lidského IL-4, však nestačí na neutralizování bioaktivity IL-4, ačkoliv se vážou k proteinu.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje polypeptidy, obsahující přibližně od 5 do 26 aminokyselinových zbytků, které mají pořadí aminokyselin, odpovídající pořadí nebo též sekvence (viz další strana) aminokyselinových zbytků 61 až 82 nebo 104 až 129 lidského IL-4, nebo z toho následující pořadí nebo též sekvence (viz další strana) - subpořadí (subsekvenci). Výhodné polypeptidy mají pořadí aminokyselin:

- 1 CZ 283050 B6

Lys-Asp-Thr-Arg-Cys,

Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His, Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-ArgPhe, Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met-Arg-Glu-Lys-TyrSer-Lys-Cys-Ser-Ser.

Tento předložený vynález dále poskytuje protilátky, které mají inhibiční účinek na vazebnost lidského IL-4 na buněčné receptory a specificky se vážou na takový IL-4 a na polypeptidy, obsahující přibližně od 5 do přibližně 26 aminokyselinových zbytků a mající pořadí nebo též sekvence (viz další strana) aminokyselin, odpovídající pořadí nebo též sekvence (viz další strana) aminokyselinových zbytků 61 až 82 nebo 104 až 129 lidského IL-4, nebo z toho následující pořadí nebo též sekvence (viz další strana) - subpořadí (subsekvenci), kteréžto protilátky inhibují vazebnost lidského IL-4 na buněčné receptory.

Tento vynález dále ještě poskytuje způsoby, jak umožnit tvorbu protilátek, které se specificky vážou a inhibují vazebnost lidských IL-4 na buněčné receptory, dále zahrnuje způsob podávání přiměřeného množství polypeptidů živým organismům (pokusným zvířatům), přičemž tento polypeptid obsahuje přibližně od 5 do přibližně 26 aminokyselinových zbytků a mající sekvenci aminokyselin, odpovídající sekvenci aminkyselinových zbytků 61 až 82 nebo 104 až 129 lidského IL-4 nebo její subsekvenci (tj. sekvenci, menší rozsahem, ale obsaženou v původní větší sekvenci, např. je-li sekvence ABCDE, subsekvence může být ABC, BCD atd.), čímž se způsobí, že tento živočich produkuje protilátky proti tomuto polypeptidů, který se specificky váže na lidský ÍL-4 a inhibuje vazebnost lidského IL-4 na buněčné receptory.

Tento vynález dále ještě poskytuje anti-idiotypové protilátky proti výše uvedeným protilátkám. Tyto protilátky mají velmi pravděpodobně antagonistický účinek na biologickou aktivitu IL-4, konkurující s IL-4, pokud jde o vazebnost na buněčné receptory.

Tento vynález ještě dále poskytuje způsob pro inhibiční vazebnost lidského IL-4 na buněčné receptory, zahrnující kontaktování lidského IL-4 s protilátkou, která se specificky váže na lidský IL-4 a na polypeptid, obsahující přibližně od 5 do přibližně 26 aminokyselinových zbytků a mající sekvenci aminokyselin, odpovídající sekvenci aminokyselinových zbytků 61 až 82 nebo 104 až 129 lidského IL-4 nebo její subsekvenci, kterážto protilátka inhibuje vazebnost lidského IL-4 na buněčné receptory.

Tento vynález dále ještě poskytuje způsob pro inhibiční vazebnost lidského IL-4 na buněčné receptoiy, zahrnující kontaktování buněk, nesoucích receptory pro lidský IL-4, s antiidiotypovými protilátkami proti protilátkám, které se specificky vážou na lidský IL-4 a na polypeptid, obsahující přibližně od 5 do 26 aminokyselinových zbytků a mající sekvenci aminokyselin, korespondující sekvenci aminokyselinových zbytků 61 až 82 nebo 104 až 129 lidského IL-4 nebo její subsekvenci, kterážto anti-idiotypová protilátka inhibuje vazebnost lidského IL-4 na buněčné receptory.

Antagonistické protilátky podle tohoto vynálezu jsou užitečné při studiích vazebnosti in vitro receptoru pro určování mechanismu působení IL-4 a/nebo identifikaci agonistů nebo jiných antagonistů IL-4. Jak již zde bylo dříve poznamenáno, mohou být také užitečné pro léčbu alergií tím, že dochází k poklesu bujení IL-4 stimulovaných žímých buněk a tvorby IgE.

Tento vynález může být více srozumitelný při odvolání na doprovázející obrázky, jejichž vysvětlení následuje:

Obrázek 1 ukazuje pořadí aminokyselin dospělého (zralého) IL-4, od amino- do karboxyl-konců (řetězců atomů).

-2CZ 283050 B6

Obrázek 2 je grafické znázornění vazebnosti IL-4 (křivka dolní) a polypeptidu č. 7 (horní křivka viz tabulka 1) na králičí IgG frakci proti polypeptidu při analyzování přímým způsobem ELISA. Množství vázaného proteinu/polypeptidu v pikomolech je znázorněno jako funkce absorbance při 414 nm.

Obrázek 3 ukazuje grafické znázornění inhibice specifické vazebnosti ^l25I-IL-4 na buňky Daudi na králičí IgG frakci proti polypeptidu č. 7, ukazující procentuální specificky vázanou radioaktivitu jako funkci vzrůstu koncentrace IgG.

Obrázek 4 ukazuje grafické znázornění inhibice specifické vazebnosti ^l25I-IL-4 na buňky Daudi na anti-idiotypické antisérum 1448, ukazující inhibici specificky vázané radioaktivity (v procentech) jako funkci poklesu koncentrace antiséra.

Obrázek 5 ukazuje grafické znázornění výsledků epitope analýzy, prováděné na králičím antiséru proti polypeptidu č. 7. Je ukázána ELISA absorbance, získaná vazebností tohoto antiséra na řadu oktapeptidů, použitá v této analýze. Počet oktapeptidů odpovídá počtu, uvedenému v tabulce 3.

Obrázek 6 ukazuje grafické znázornění výsledků epitope analýzy, prováděné na králičím antiséru proti polypeptidu č. 6. Je ukázána ELISA absorbance, získaná vazebností tohoto antiséra na řadu oktapeptidů, použitá v této analýze. Antisérum, použité pro získání výsledků, ukázaných na grafické tabulce A, které byly shromážděny na začátku průběhu imunizace na králičím antiséru a nedocházelo k inhibování vazebnosti na ¹²⁵IL-4 na buňky Daudi. Antisérum, použité v druhé grafické tabulce B, bylo získáno později a bylo silně inhibováno, pokud se týká vazebnosti označeného IL-4. Počet oktapeptidů odpovídá počtu, uvedenému v tabulce 4.

Všechny odkazy zde citované jsou přičleněny v souhrnné referenci. Pořadí nebo též sekvence aminokyselin polypeptidů ukazuje, že jsou ve standardní formě, označované jako standardní jednopísmenová nebo standardní třípísmenová forma (Lehninger: Principles of Biochemistry, 1982, Worth Publishers lne., New York, p. 96).

Předložený vynález poskytuje protilátky, které působí antagonisticky na vazebnost lidského IL-4 na buněčné receptory pomocí:

(a) spojování s oblastí, která je zřejmě zahrnuta v interakcích s receptory, nebo (b) simulování samotného IL-4 a tím konkurující, pokud jde o vazebnost na buněčné receptory.

Protože IL-4 stimuluje tvorbu IgE protilátek a bujení žímých buněk - dva efektory alergických reakcí - jsou antagonistické protilátky podle tohoto vynálezu užitečné pro léčbu alergií. Jsou užitečné také pro in vitro systémy vazebností receptorů, dále pro objasnění mechanismu působení IL-4 nebo pro stínění pro jiné IL-4 antagonisty nebo agonisty.

Lidským IL-4 se zde rozumí protein, který:

(a) má pořadí nebo též sekvence aminokyselin v podstatě identické s pořadím nebo též sekvencí dospělého lidského IL-4, ukázaného na obrázku 1, a (b) má biologickou aktivitu takovou, jaká je běžná u přirozeného (původního) IL-4.

V podstatě shodnou identitou pořadí nebo též sekvence aminokyselin se míní, že pořadí nebo též sekvence jiného IL-4 je při porovnání s pořadím nebo též sekvencí na obrázku 1 identické nebo se liší jednou nebo více změnami aminokyselin (vymizením, přidáním, substitucí), která podstatně nezmenší biologickou aktivitu.

-3 CZ 283050 B6

Ovšem pořadí nebo též sekvence aminokyselin v oblastech IL-4, které zde byly výše uvedeny, se mohou lišit v případě v podstatě identického IL-4s.

Výzkumy se syntetickými polypeptidy, popsané zde v dalším textu, ukazují, že v molekule lidského IL-4 jsou dvě oblasti, o nichž se ukazuje, že jsou zahrnuty do vazebnosti receptoru. Pokud jde o vhodné (doporučené) reference, pořadí nebo též sekvence aminokyselin těchto polypeptidů zde bude definováno polohami aminokyselinových zbytků v pořadí nebo též sekvencích aminokyselin dospělého lidského IL-4, ukázaném na obrázku 1, kde polohu, označenou číslem 1, má aminokoncový zbytek histidin a polohu, označenou číslem 129, má karboxykoncový zbytek serin.

Jako výsledek těchto výzkumů bylo nalezeno, že syntetické polypeptidy mající pořadí nebo též sekvenci aminokyselin, odpovídající pořadí nebo též sekvenci zbytků 52 až 82 a 104 až 129, nebo subsekvenci lidského IL-4, mohou být použity jako antigeny pro vyvolání tvorby protilátek ve zvířatech; tyto protilátky se mohou vázat na polypeptidy a na lidský IL-4. Pro jejich schopnost vázat se na takové specifické oblasti IL-4, inhibují protilátky podle tohoto vynálezu alespoň 60 % specifické vazebnosti ¹²⁵I-IL-4 na buňky nesoucí receptory pro IL-4.

Největší z předcházejících oblastí vazebnosti IL-4 (zbytky 52 až 82) obsahují přibližně kolem 30 aminokyselinových zbytků. Je velmi dobře známo ve vědě, že antigenní determinanty (epitopy) obecně obsahují alespoň přibližně kolem 5 aminokyselinových zbytků [Ohno et al.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:2945 (1985)]. Tedy polypeptidy podle tohoto vynálezu obsahují přibližně od 5 do přibližně 30 aminokyselinových zbytků a mají pořadí aminokyselin, jak zde již bylo výše uvedeno. Zda daný polypeptid spadá do oblasti podle tohoto vynálezu, lze snadno rozhodnout obvyklým experimentálním postupem za použití způsobů, které budou zde dále popsány.

Tyto polypeptidy se syntetizují vhodným způsobem, jako syntézou vylučování pevné fáze, metodami parciální (částečné) pevné fáze, fragmentovou kondenzací nebo klasickými roztokovými (rozpouštěcími) syntézami. Tyto polypeptidy se s výhodou připravují syntézou peptidů v pevné fázi, jak je popsána podle Merrifielda - Merrifield: J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963). Tato syntéza se provádí s aminokyselinami a ty jsou chráněny na alfa-aminokonci řetězce. Třífunkční aminokyseliny s labilními vedlejšími řetězci jsou také chráněny vhodnými skupinami pro preventivní zabránění nežádoucím chemickým reakcím, ke kterým může docházet během sestavování polypeptidů. Příslušné alfa-amino chránící skupiny se selektivně odstraňují tak, aby bylo umožněno následující reakci, aby proběhla na aminokonci řetězce. Podmínky pro odstraňování alfa-amino chránících skupin jsou takové, aby nedocházelo k odstraňování chránících skupin vedlejších řetězců.

Tyto alfa-amino chránící skupiny jsou takové, jaké jsou známé pro použití ve vědecké práci z postupné syntézy polypeptidů. Jsou zde zahrnuty acylové typy chránících skupin (například formylová, trifluoracetylová, acetylová), chránící skupiny typu aromatického urethanu (například benzyloxykarbonylová (Cbz), substituovaná benzyloxykarbonylová a 9-fluorenylmethoxyoxykarbonylová (Fmoc)), chránící skupiny typu alifatického urethanu (například terc.butyloxykarbonylová (Boc), isopropyloxykarbonylová, cyklohexyloxykarbonylová) a chránící skupiny alkylového typu (například benzylová, trifenylmethylová). Výhodná chránící skupina je Boc. Mezi chránící skupiny vedlejšího řetězce pro Tyr je zahrnut tetrahydropyranyl, terc.butyl, trifenylmethyl, benzyl Cbz, 4-Br-Cbz a 2,6-dichlorbenzyl. Výhodnou chránící skupinou pro Tyr je 2,6-dichlorbenzyl. Mezi chránící skupiny vedlejšího řetězce pro Asp je zahrnut benzyl, 2,6dichlorbenzyl, methyl, ethyl a cyklohexyl. Výhodnou chránící skupinou pro vedlejší řetězec je pro Asp cyklohexyl. Mezi chránící skupiny vedlejšího řetězce pro Thr a Ser je zahrnut acetyl, benzoyl, trifenylmethyl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-dichlorbenzyl a Cbz. Výhodnou chránící skupinou pro Thr a Ser je benzyl. Mezi chránící skupiny vedlejšího řetězce pro Arg je zahrnuta nitroskupina, Tos, Cbz, adamantyloxykarbonylová a Boc. Výhodná chránící skupina pro Arg je

-4CZ 283050 B6

Tos. Vedlejší řetězec aminoskupiny v Lys může být chráněn pomocí Cbz, 2-Cl-Cbz, Tos nebo Boc. Skupina 2-Cl-Cbz je výhodnou chránící skupinou pro Lys.

Vybrané chránící skupiny vedlejších řetězců musí zůstat nedotčené (neporušené) během spojování a nesmí být odstraňovány během sejmutí chránících skupiny aminokoncového řetězce nebo v průběhu uplatňování podmínek, při nichž dochází ke spojování. Chránící skupiny vedlejších řetězců musí být také odstranitelné při ukončení syntézy, za použití reakčních podmínek, které jsou takové, aby nedocházelo k přeměňování dokončeného (syntézou získaného) polypeptidu.

Syntéza na nerozpustném nosiči se obvykle provádí podle karboxylkoncových řetězců spojováním alfa-amino chráněných (chráněné vedlejší řetězce) aminokyselin na vhodném pevném nosiči. Esterové řetězení (spojení, vazba) se tvoří tehdy, jestliže se připojování provádí na chlormethylové nebo hydroxymethylové pryskyřici a výsledný polypeptid bude mít na karboxylokoncovém řetězci - na karboxylovém ukončení - volnou karboxylovou skupinu. Pokud se alternativně použije benzhydrylaminová nebo p-methyl-benzhydrylaminová pryskyřice, tvoří se amidová vazba a výsledný polypeptid bude mít na karboxylovém konci řetězce karboxyamidovou skupinu. Tyto pryskyřice jsou komerčně dostupné a jejich přípravu popisuje Stewart et al.: Solid Phase Peptide Synthesis (2nd Edition), Pierce Chemical Co., Rockford, IL., 1984.

C-koncová aminokyselina, chráněná pokud je to nezbytné na vedlejším řetězci a na alfaaminoskupině, se připojuje na benzhydrylaminové pryskyřici za použití rozmanitých aktivačních činidel, zahrnujících dicyklohexylkarbodiimid (DCC), Ν,Ν'-diisopropylkarbodiimid akarbonyldiimidazol. Po připojení na povrch pryskyřice se alfa-amino chránící skupina odstraňuje za použití trifluoroctové kyseliny (TFA) nebo HC1 v dioxanu při teplotě mezi 0 °C a 25 °C. Dimethylsulfid se přidává k této TFA po zavedení methioninu (Met) pro potlačení možnosti Salkylace. Po odstranění alfa-amino chránící skupiny se zbývající chráněné aminokyseliny přidávají (připojují) postupně v požadovaném pořádku, tak aby se získalo žádané pořadí.

Pro kondenzační reakce k vytvoření peptidové vazby se používají rozmanitá aktivační činidla, zahrnující DCC, Ν,Ν'-diisopropylkarbodiimid, benzotriazol-l-yl-oxy-tris-(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfat (BOP) a DCC-hydrobenzotriazol (HOBt). Každá chráněná aminokyselina se použije v přebytku (>2,0 ekvivalentů) a spojování se obvykle provádí v Nmethylpyrrolidonu (NMP) nebo v DMF, CH2CI2 nebo jejich směsích. Rozsah připojování se při této kondenzační reakci pro vytvoření peptidové vazby kontroluje v každém stupni, například pomocí ninhydrinové reakce, jak ji popisuje Kaiser et al.: Anal. Biochem. 34:595 (1970). V případě, že se zjistí neúplné spojování, se tato kondenzační reakce opakuje. Kondenzační reakce se mohou provádět automatizovaně za pomoci komerčně dostupných přístrojů.

Po úplném sestavení celého žádaného polypeptidu se systém polypeptid-pryskyřice štěpí pomocí činidla, jako je kapalný HF, po dobu jedné až dvou hodin při teplotě 0 °C, které odštěpí polypeptid od pryskyřice a odstraní všechny chránící skupiny vedlejších řetězců. Obvykle se používá kolektor (látka zachycující přechodně vznikající meziprodukty nebo vedlejší produkty), jako anisol s kapalným HF, pro prevenci tvorby kationtů během štěpení z alkylačních aminokyselinových zbytků, přítomných v polypeptidu. Systém polypeptid-pryskyřice může být podroben sejmutí chránící skupiny působení TFA/ditioethan před štěpením, pokud je to žádoucí.

Cyklizace vedlejšího řetězce na vedlejší řetězec na pevném nosiči vyžaduje použití ortogonálního uspořádání chránění, které umožňuje selektivní štěpení vedlejšího řetězce, působícího kyselost aminokyselin (například Asp), a zásadité aminokyseliny (například Lys). 9-fluorenylmethyl(Fm) chránící skupina pro vedlejší řetězec Asp a 9-fluorenyloxykarbonyl (Fmoc) chránící skupina pro vedlejší řetězec Lys může být použita pro tento účel. V těchto případech jsou vedlejší řetězec chránící skupiny Boc-chráněný polypeptid-pryskyřice selektivně odstraňována

-5 CZ 283050 B6 pomocí piperidinu v DMF. Cyklizace se dosahuje na pevných nosičích za použití rozličných aktivačních činidel, zahrnujících DCC, DCC/HOBt nebo BOP. Reakce HF se provádí na cyklizovaný polypeptid-pryskyřici, jak již zde bylo uvedeno.

Pro přípravu polypeptidů může být také použita rekombinantní DNA metodologie. Známý genetický kód, přizpůsobený pokud je to třeba známým výhodným kodónům pro účinnější vyjádření v daném hostitelském organismu, může být použit pro syntézu oligonukleotidů pro kódování požadovaného pořadí aminokyselin. Fosforamiditová metoda pevného nosiče podle Matteucci at al. [J. A. Chem. Soc. 103:3185 (1981)] nebo jiné známé metody je možno použít io pro takovéto syntézy. Výsledné oligonukleotidy mohou být vloženy do přiměřeného vektoru a vyjádřeny v kompatibilním hostitelském organismu.

Polypeptidy podle tohoto vynálezu lze čistit za použití HPLC, gelové filtrace, výměnou iontů a rozdělovači chromatografie, roztřepávání nebo jiných dobře známých metod a způsobů.

Protilátky mohou být připraveny proti polypeptidům podle předloženého vynálezu za použití standardních metod. Tak, jak se zde používá, slovo protilátka se týká jak polyklonálních, tak monoklonálních protilátek. Také zahrnuje všechny immunoglobuliny ajejich antigen vazebné fragmenty.

Polyklonální protilátky se mohou tvořit imunizací živočišného hostitele, jako je králík, krysa, koza, ovce, myš atd., s jedním z polypeptidů. Je výhodné, jestliže se po počáteční (zahajovací) injekci dá jedna nebo více posilovačích injekčních dávek, pro zlepšení protilátky (titru). Z živočicha se pak odebere krev a připraví se sérum a provede se depistáž standardními 25 metodami, jako je vázaný enzym imunosorpční stanovení (ELISA), používající polypeptid jako antigen.

S výhodou se imunogenetičnost polypeptidů zvyšuje spojením s pomocnou látkou a/nebo konverzí na rozsáhlejší formu před imunizací.

Vhodné pomocné látky pro očkování živočichů zahrnují ale neomezují se pouze na tyto látky: Adjuvant 65 (obsahující arašídový olej, mannidomonoleat a aluminiummonostearat (monostearat hlinitý)); úplné Freundovo adjuvans nebo neúplné adjuvans, minerální gely, jako je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a kamenec; povrchově aktivní látky, jako je hexadecylamin, 35 oktadecylamin, lysolecitin, dimethyldioktadecylamoniumbromid, N,N'-dioktadecyl-N',N',-bis(2hydroxymethyl)propandiamin, methoxyhexadecylglycerol a pluronické polyoly; polyanionty, jako je pyran, dextransulfat, póly IC, polyakrylová kyselina a karbopol; peptidy, jako je muramyldipeptid, dimethylglycin a tuftsin; a olejové emulze. Peptidy mohou být také podávány následujícím včleněním do liposomů nebo jiných mikronosičů (zřejmě jde o nosiče s velmi 40 jemnou strukturou - mikrostrukturou).

Imunogenetičnost polypeptidů může být také zvýšena zesíťováním nebo spojováním na imunogenní molekulu nosiče vlastností (tj. makromolekulu, mající vlastno nezávisle vyvolávat imunologickou odezvu v živočišném hostiteli, ke kterému se polypeptidy podle tohoto vynálezu 45 kovalentně vážou). Síťování nebo konjugace na molekulu nosiče se může požadovat proto, protože malé polypeptidy někdy působí jako hapteny (molekuly, které jsou schopné specifické vazebnosti na protilátku, ale nejsou schopné vyvolávat tvorbu protilátky, tj. nejsou imunogenní). Konjugace takových polypeptidů na imunogenní molekulu nosiče vlastností se umožňuje skrze imunogenní fragmenty, což je dohromady známo jako nosičový efekt.

Vhodné molekuly nosičů zahrnují například proteiny a přírodní nebo syntetické polymemí sloučeniny, jako jsou polypeptidy, polysacharidy, lipopolysacharidy atd. Užitečný nosič je glykosid nazývaný Quil A, který byl popsán Moreinem et al., Nátuře 308:457 (1984). Zvláště výhodné jsou molekuly nosiče proteiny, zahrnující, ale neomezující, hemokyaninová a savčí

-6CZ 283050 B6 proteinová séra, jako je lidský nebo hovězí gamaglobulin, lidské, hovězí nebo králičí sérumalbumin nebo methylované nebo jiné deriváty takových proteinů. Jiné proteinové nosiče budou zřejmé podle odborných vědeckých postupů. Výhodné, nikoliv však nezbytné, je aby byl proteinový nosič cizí živočišnému hostiteli, v jehož těle se vyvolávají protilátky proti polypeptidům.

Kovalentní vazba na molekulu nosiče se může provádět za použití metod, které jsou ve vědeckých postupech velmi dobře známé, přičemž přesná volba bude diktována povahou použité molekuly nosiče. Jestliže je imunogenní molekula nosiče protein, mohou se připojovat polypeptidy podle tohoto vynálezu, například za použití karbodiimidů, rozpustných ve vodě, jako je dicyklohexylkarbodiimid nebo glutaralaldehyd.

Činidla pro spojování jako taková mohou být použita též pro vlastni zesíťování polypeptidů bez použití samostatné molekuly nosiče. Takové zesíťování do agregátů (shluků) může též zvyšovat imugenocitu.

Sérum, získané ze zvířat, takto imunizovaných, může být použito přímo. Alternativně může být separována IgG frakce ze séra za použití standardních metod, jako je plazmoforéza nebo adsorpční chromatografie, používající IgG specifické adsorbenty, jako je ímobilizovaný Protein A.

Monoklonální protilátky mohou být připraveny za použití standardních metod, například jak popisuje Kohler et al.: Nátuře 256:495 (1975); Eur. J. Immunol. 6:511 (1976). V podstatě se živočichové imunizují tak, jak bylo zde již napsáno, aby mohlo dojít ke tvorbě somatických (tělních) buněk, vylučujících protilátky. Tyto buňky se pak odejímají z imunizovaného živočicha pro spojení s buňkami myelomu (nádoru kostní dřeně).

Somatické buňky se schopností tvořit protilátky, zvláště B-buňky, jsou vhodné pro spojení (vazbu) s linií buňky myelomu. Tyto somatické buňky se mohou odvodit od mízních uzlin, sleziny a obvodové krve primárně imunizovaných živočichů. V příkladové části tohoto vynálezu byly použity buňky sleziny myši, neboť tyto buňky produkují částečně vysoké procento, které se stabilně spojuje s linií myeloma u myší. Je však možné použít i místo toho buňky krysy, králíka, žáby nebo jiné.

Specializované linie buněk myeloma mohou být vyvinuty z lymfocytních nádorů pro použití v metodách hybridoma-produkujících spojení (syntézách) [Kohler a Milstein: Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Shulman et al.: Nátuře 276:269 (1978); Volk et al.: J. Virol. 42:220 (1982)]. Linie těchto buněk lze vyvíjet alespoň ze tří důvodů. První je usnadnění výběru spojujících se hybridomů z nespojovaných a podobně nedefinovatelných samomnožících buněk myeloma. Obvykle se toho dosáhne použitím myelomů s deficitním enzymem, což způsobí neschopnost růstu v určitých selektivních médiích a ovlivní kladně růst hybridomas. Druhý důvod vzniká z vrozené schopnosti lymfocitních nádorových buněk produkovat své vlastní protilátky. Účelem použití monoklonálních technik je získat spojované (fúzované) liniové buněčné hybridy s neomezenou životností, které produkují žádanou jednotlivou protilátku s genetickou regulací složky hybridoma tělní buňky. Pro eliminaci produkce protilátek nádorových buněk pomocí hybridomas se používají linie buněk myeloma, které nejsou schopné produkovat těžké nebo lehké (složité nebo malé) imunoglobulinové řetězce nebo nedostatečné v protilátkovém vyměšovacím mechanismu. Třetí důvod pro výběr linií těchto buněk tkví vjejich vhodnosti a účinnosti pro spojování (fúzi).

Pro produkování spojovaných (fúzovaných) buněčných hybridů lze použít mnoha linií buněk myeloma, zahrnující například P3X63-Ag8, P3/NSl-Ag4-l (NS-1), Sp2/O-Agl4 a S194/5.XXO.Bu.l. Buněčné linie P3X63-Ag8 aNS-1 byly popsány Kohlerem a Milsteinem: Eur. J. Immunol. 6:511 (1976). Shulman et al.: Nátuře 276:269 (1978) vyvinul linii myeloma

-7CZ 283050 B6

Sp2/O-Agl4. Linie S194/5.XXO.Bu.l popsal ve své práci Trowbridge: J. Exp. Med. 148:313 (1979).

Způsoby pro generování (tvoření) hybridů produkujících protilátku, a to hybridů buněk sleziny nebo mízních uzlin amyeloma buněk, obvykle zahrnují směšování tělních buněk s myeloma buňkami v poměru 10:1 (ačkoliv poměr může velmi kolísat od poměru přibližně 20:1 do přibližně 1:1), což se uvádí jako příklad, za přítomnosti některého činidla nebo činidel (chemických, virových nebo elektrických), která podporují fúzování buněčných membrán. Způsoby pro fúzování byly popsány Kohlerem a Milsteinem, supra, Gefterem et al.: Somatic Cell Genet. 3:231 (1977) a Volkem et al.: J. Virol. 42:220 (1982). Činidly, podporujícími fúzování, byly podle těchto badatelů Sendai virus a polyethylenglykol (PEG). Postup fúzování podle příkladu v předloženém vynálezu použil PEG.

Protože postupy pro fúzování produkují životaschopné hybridy ve velmi nízké četnosti (například když se použijí jako zdroj - místo vzniku - tělních buněk buňky sleziny, získá se pouze jeden hybrid ze zhruba každých 1 x 10⁵ buněk sleziny), je nezbytné mít prostředky, jak vybrat fúzované buněčné hybridy (lépe - jak oddělit, vytřídit, buněčné hybridy) ze zbylých nezfůzovaných buněk, zvláště nefuzované myeloma buňky. Rovněž jsou nezbytné prostředky pro detekci (zjišťování) žádaných protilátky produkujících hybridomas mezi jinými výslednými fúzovanými buněčnými hybridy.

Obecně se výběru fúzovaných buněčných hybridů dosahuje kultivací buněk v prostředí, podporujícím růst hybridomas, ale zabraňujícímu růstu nefúzovaných myeloma buněk, jenž by normálně pokračovalo nedefinovaným dělením. Tělní buňky, použité pro fúzování, nemají dlouhodobě uchovatelnou životaschopnost v in vitro kultuře a proto nedělají problémy. V příkladu podle předloženého vynálezu byly použity myeloma buňky, postrádající hypoxantinfosforibosyltransferázu (HPRT-negativní). Selekce vůči těmto buňkám se provádí v prostředí hypoxantin/aminopterin/thymidin (HAT), prostředí, ve kterém fúzované buněčné hybridy přežívají přiměřeně k HPRT-pozitivnímu genotypu buněk sleziny. Použité myeloma buňky s odlišnými genetickými nedostatečnostmi (citlivost na léky atd.) tak mohou být vytříděny vůči genotypicky soutěžícím hybridům, jejichž růst je v tomto prostředí, které růst podporuje, také možný.

Pro selektivitní kultivaci fúzovaných buněčných hybridů se požaduje několik týdnů. Na počátku tohoto časového období je nezbytné identifikovat ty hybridy, které produkují žádanou protilátku, tak, aby mohly být následně klonovány a množeny. Všeobecně platí, že kolem 10 % získaného hybridu produkuje žádanou protilátku, přičemž není neobvyklé, že se rozmezí pohybuje přibližně od 1 do přibližně 30 %. Detekce protilátky produkujících hybridů se může provádět některou z různých standardních metod stanovení, zahrnujících techniky imunologického stanovení vázaného enzymu a techniky radioimunologického stanovení, což je popsáno v literatuře [viz například Kennet et al. (editors): Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, pp. 376-384, Plenům Press, New York (1980)].

Jednou získané žádané fúzované buněčné hybridy byly vybrány a klonovány do individuálních protilátky produkujících buněčných linií, každá linie buněk může být množena jedním ze dvou standardních postupů. Suspenze buněk hybridoma může být injektována do histokompatibilního živočicha. Živočich, který dostal takovou injekci, bude vyvíjet pak nádory a ty budou vyměšovat specifickou monoklonální protilátku, produkovanou fúzovaným buněčným hybridem. Tělní tekutiny živočichů, jako je sérum nebo tekutina ascited (tekutina při vodnatelnosti břišní), může být odsáta dutou jehlou (punkce) a tak poskytne monoklonální protilátky ve vysoké koncentraci. Alternativně mohou být individuální buněčné linie množeny in vitro v laboratorních kultivačních nádobách. Kultivační půda, obsahující (jednorázovou) jednotlivou specifickou monoklonální protilátku ve vysokých koncentracích, může být získávána dekantací, filtrací nebo centrifugám'.

-8CZ 283050 B6

Zda jsou anti-polypeptidové protilátky vyrobené tak, jak bylo výše popsáno, vhodné pro použití v tomto vynálezu, se určí pomocí vyšetřovací metody, složené ze dvou částí, které zahrnují:

(a) ELISA-test, což je analýza, používající imunizovaný polypeptid a lidský IL-4 jako antigeny (v tomto případě), a (b) radioligandovou receptorovou vazebnou analýzu, ve které se měří inhibice specifické vazebnosti ¹²⁵I-IL-4 na buněčné receptory.

Rekombinantní lidský IL-4 pro použití v těchto stanoveních je komerční výrobek, dostupný například z Genzyme Corporation, Boston, MA. Alternativně může být produkován za použití známé nukleotidové sekvence IL-4 genu [Yokoto et al.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:5894 (1986)] a standardními rekombinantními metodami DNA [viz například Intemational Patent Application Publication No. WO 87/02990; Kimmenade et al.: Eur. Biochem. 173:109 (1988)].

Analýza ELISA se provádí standardními metodami, jako je metoda Chrentiena a kol.: J. Immunol. Meth. 117:67 (1989), používající polypeptid nebo IL-4, adsorbovaný na mikrotitrační destičce. Přítomnost protilátek, vázaných zmobilizovaný polypeptid nebo protein, se detekuje označenou anti-IgG druhou protilátkou. Takovéto druhé protilátky se výhodně označují některým enzymem, jako je peroxidáza, glukózooxidáza, β-galaktosidáza nebo alkali-fosfatáza (alkalická fosfatáza). Křenová peroxidáza může být detekována spektrofotometrickou analýzou své aktivity na substrátu, jako je pyrogallol, o-fenylendiamin nebo 2,2'-azinobis(3-ethyl-benzthiazolin-6sulfonová kyseliny).

Protilátky, u nichž bylo nalezeno, že se specificky vážou jak na imunizovaný polypeptid, tak na IL-4, jsou dále vyhodnocovány podle schopnosti inhibovat specifickou vazebnost označeného IL-4 na receptory na vhodných terčovitých buňkách. Antipolypeptidové protilátky podle tohoto vynálezu jsou charakterizovány schopností inhibovat alespoň 60 % této vazebnosti.

Pro stanovení vazebnosti mohou být použity některé nesoucí buňky IL-4 receptorů, jako je Jijoye, U-937, CCRF-CEM aCEM-CM3 buňky, ale buňky Daudi jsou vhodné a snadno dostupné. Buňky Daudi jsou dobře charakterizované B lymfooblastí buňkové linie, odvozené od nemocných Burkittovým lymfomem, které lze získat z Američan Type Culture Collection pod Accesion. No. ATCC CCL 213. ¹²⁵I-IL-4 pro použití ke stanovení (testu) mohou být připraveny značkováním UL-4 pomocí jodu-125, například laktoperoxidázovou metodou [David et al.: Biochemistry 13:1014 (1974)] nebo metodou Boltona et al.: Biochem. J. 133:259 (1973). Glykosylovaný rekombinantní lidský IL-4 je komerční výrobek, kteiý lze získat například od Genzyme Corporation, Boston, MA.

Anti-idiotypové protilátky podle tohoto vynálezu jsou přímé proti protilátkám, specifickým pro IL-4 antigenní determinanty, přítomné v polypeptidech podle tohoto vynálezu. Takové antiidiotypové protilátky napodobují nebo se chovají jako původní antigenní determinanty (viz například U.S.Patent No. 4,731,237 Reagana et al.). Podobně jako u samotného IL-4, dá se o těchto látkách předpokládat, že se specificky a přímo vážou na IL-4 receptory. Avšak antiidiotypové protilátky nemají biologickou aktivitu IL-4.

Takové anti-idiotypové protilátky se připravují očkováním živočichů protilátkou (polyklonální nebo monoklonální) proti polypeptidům podle tohoto vynálezu. Mohou být získávány (izolovány) jako celé polyklonální antisérum nebo jako jeho IgG frakce, nebo jako monoklonální protilátky, produkované klonovanými hybridomas, jak bylo výše uvedeno.

Mohou být připraveny farmaceutické prostředky o takovém složení, aby obsahovaly účinné množství jedné nebo více protilátky podle tohoto vynálezu a fyziologicky přijatelné nosiče.

-9CZ 283050 B6

Takové nosiče jsou velmi dobře známé z odborných postupů ve vědecké práci. Protilátky mohou být podávány přímo nebo ve formě farmaceutického prostředku (kompozice) lidskému pacientu pro léčení alergií nebo jiných stavů, zprostředkovaných IL-4. Farmaceutické prostředky se vyrábějí přimícháváním fyziologicky přijatelného nosiče k účinnému množství jedné nebo více protilátek.

Stanovení správného dávkování protilátky podle tohoto vynálezu pro zvláštní stavy je na vědecké odbornosti. Obecně se léčba začíná menšími dávkami, než je optimum. Potom se po malých přídavcích dávka zvyšuje, až po dosažení optimálního účinku podle okolností, pokud je to žádoucí, bývá výhodné rozdělit celkovou denní dávku na několik podílů, které se podávají postupně v průběhu dne.

Množství a frekvence (častost) podávání protilátek podle vynálezu lze regulovat podle posudku pro klinické ošetřování, zahrnujícího takové faktory, jako je věk, stav a a velikost pacienta a prudkost (naléhavost) symptomů (symptomu), které mají být ošetřovány.

Dále budou uvedeny příklady provedení vynálezu. Pokud nebude uvedeno jinak, dále uvedená procenta pro pevné látky v pevných směsích, kapaliny v kapalinách a pevné látky v kapalinách se udávají jako hmotnost/hmotnost, objem/objem a hmotnost/objem.

Protein byl stanovován způsobem, používajícím metodu podle Lowry et al.: J. Biol. Chem. 193:265 (1951), s použitím hovězího sérumalbuminu jako standardu. Biologická zkouška IL-4 byla prováděna tak, jak ji popisuje Mossman: J. Immunol. Methods 65:55 (1983), měření stimulace buněčného bujení jako MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid) příjem v PHA-stimulovaných lidských periferních lymfocytech. Jedna jednotka IL-4 aktivity je množství IL-4, které je vyvoláno polovinou maximální stimulace v 2 x 10⁵ buňkách při testu. Jeden mikrogram čistého lidského IL-4 má kolem 20,000 jednotek aktivity při testu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza polypeptidu

Byla syntetizována celá řada polypeptidů, jejichž sekvence aminokyselin, vzato dohromady, odpovídá sekvenci aminokyselin celého dospělého lidského IL-4 proteinu.

Polypeptidy byly syntetizovány za použití tzv. syntézy v tuhé fázi, kterou do chemie peptidů zavedl Merrifield [J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)] a byl při ní použit systém Applied Biosystems Model 430A. Jako amino-chránicí skupina byl použit terc.butylkarbonyl a symetrické anhydridy. Následovalo (po syntéze) odstranění chránících skupin a polypeptidy byly odštěpeny z pryskyřice (nosiče) pomocí fluorovodíku.

Polypeptidy se čistí chromatografií s obrácenými fázemi; HPLC s reverzními fázemi (stacionární fáze je nepolární) s použitím Rainin Dynamax® C-8 kolony, vyvinuté s gradientem acetonitrilu v 0,1 % kyseliny trifluoroctové. Eluát byl sledován ultrafialovou absorbancí při 214 nm. Totožnosti čištěných polypeptidů byly potvrzeny sekvenováním aminokyselin a hmotností spektrální analýzou za použití standardních metod.

Takto vyrobené polypeptidy, jejich sekvence aminokyselin a ty zbytky dospělého lidského IL-4 (tj. bez signálního peptidu; viz obrázek č. 1), jimž odpovídají sekvence polypeptidu, ukazuje tabulka 1.

- 10CZ 283050 B6

Tabulka 1: Struktury syntetických polypeptidů

Polypeptid číslo	Sekvence	Odpovídající IL-4 zbytky
1	HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTE	1-26
2	CDITLQEIIKTLNSLT	3-18
3	TEQKTLCTELTVTD	18-31
4	DIFAASKNTTEKETFC	31-46
5	ETFSRAATVLRQFYS*	43-57
6	LRQFYSHHEKDTRC	52-65
7	KDTRCLGATAQQFHRHKQLIRF	61-82
8	LKRLDRNLWGLAGLNSCPVK	83-102
9	AQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWG	70-92
10	CPVKEANQSTLEN	99-111
11	ANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS	104-129
12	FLERLKTIMREKYSKC	112-127
+ Sekvence aminokyselin polypeptidů č. 5 odpovídá zbytkům	43-57, s výjimkou, že zbytek
cystein v poloze	46 lidského IL-4, byl v polypeptidů nahrazen zbytkem šeřinu.

Analýza hydrofility lidského IL-4 se provádí podle Hoppa et al: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:3824 (1981) a ukazuje, že oblast odpovídající polypeptidů č. 7, obsahuje jak hydrofilní, tak hydrofobní zbytky, které jsou předpověděny podle modelů sekundární struktury pro možnou formu oblasti šroubovice (α-helix, a-spirální struktury) v IL-4.

Příklad 2

Příprava a charakterizace antipolypeptidových protilátek

Dva miligramy polypeptidů č. 7 (tabulka 1), korespondujícího aminokyselinovým zbytkům 61-82 lidského IL-4, se rozpustí v 0,4 ml 0,5M-Tris-HCl, pH 6,8 a 0,1 ml očkovací látky proti černému kašli (původ, kmen 18334, umrtvené teplem, 20 jednotek/ml, 1/10,000 zředění thimersal). Přidá se úplné Freundovo adjuvans (0,5 ml) a vzorek se homogenizuje v injekční stříkačce. Imunizují se novozélandští bílí králíci; každý dostává 1 ml vzorku po 0,1 ml (200 pg polypeptidů) nitrokožními injekcemi.

Po období přibližně čtyři měsíce a pak periodicky, se dávají posilovači injekce, jak je výše uvedeno. Periodicky se odebírala krev z ucha nebo stehenní žíly králíků a poskytovala pro srážení.

Ze séra jednoho z králíků se izoluje IgG frakce adsorbováním séra na Protein A-Sepharose® koloně (Pharmacia, Piscataway, NJ), uvedené v rovnováhu tlumivým roztokem l,5M-glycinu, pH 8,9. Chromatografie se provádí standardními metodami podle Fortona Biochem. Co. Podle posouzení má čištěná látka asi kolem 98 % čistého IgG podle SDS polyakrylamidové gelové elektroforézy - Laemmli: Nátuře 227:680 (1970). Tato látka se označuje jako antisérum 343-6 IgG frakce.

Za použití podobných metod se získají IgG frakce antiséra proti ostatním polypeptidům, uvedeným v tabulce 1.

ELISA-test se provádí na izolovaných IgG frakcích, nanášením na 96ti jamkové mikrotitrační destičky (Becton-Dickinson), přibližně 0,25 pgjednoho z rozmanitých polypeptidů v 50 μΐ Trispufrovaného fyziologického roztoku (TBS - Tris-buffered šalině; 50 nM Tris, 0,15 NaCl, pH 7,0)

- 11 CZ 283050 B6 na dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Následuje inkubace, jamky se pětkrát promyjí roztokem TBS, obsahujícím 0,1 % Twen 20 (polyoxyethylensorbitan monolaurat).

Promyté jamky se blokují 1 % hovězím sérumalbuminem (BSA - bovine sérum albumin) v TBS po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti, pětkrát se promyjí TBS, blokují 0,1 % nespecifického IgG v TBS po dobu dvě hodiny při teplotě místnosti, a pětkrát se promyjí tak, jak je výše popsáno. Do jamek se pak přidávají padesátimikrolitrové podíly rozličných zředění IgG frakcí v TBS a destičky se podrobí inkubaci při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny a pak se promývají stejným způsobem, jako je uvedeno výše.

Ke každé jamce se přidá 50 μΐ TBS, obsahujícího 2,5 ng kozí antikráličí IgG, značeného křenovou peroxidázou, a destičky se podrobí inkubaci po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Po promývání tak, jak je výše popsáno, se jamky vyvíjejí s peroxidem vodíku a 2,2azinodi(3-ethylbenzthiazolinsulfonátem).

Srovnávací jamky se vyvíjí stejně, ale jedna ze stanovovaných složek (tj. antigen, protilátka nebo značená druhá (druhotná, sekundární) protilátka) se vynechává. Vzorky se měří ve spektrofotometru Dynatech Model 650.

Výsledky takové analýzy, prováděné na antiséru 343-6 IgG frakce s použitím polypeptidu č. 7 (tabulka 1) a lidského IL-4 jako antigenů, ukazuje obrázek 2. Tam, kde se absorbance při 414 nm jako míra vazebnosti antigenů ukazuje jako funkce množství polypeptidu nebo lidského IL-4 na jamku, se může zdát, že se protilátky vážou na oba antigeny. Pro získání těchto výsledků se antisérum 343-6 IgG frakce ředí v poměru 1:200 před nanášením 50 μΐ do jamek.

Pro určení, která z protilátek v antipolypeptidové IgG frakci, specificky se vázající na lidský IL-4, by mohla takto inhibovat vazebnost IL-4 na buněčné receptory, se používá analýza vazebnosti radioligandů.

Čištěný rekombinantní lidský IL-4, vyjádřený v CHO buňkách [Le et al.: J. Biol. Chem. 263:10817 (1988)], byl značkován pomocí jodu-125 modifikací metody Boltona et al.: Biochem. J. 133:529 (1973), používající činidlo Bolton-Hunter firmy DuPont-NEN, Boston, MA. Stručně lze uvést, že při této metodě reaguje 2 mCi, tj. o radioaktivitě 7,4.10⁷ Bq, Boltonovo-Hunterovo činidlo s 5,0 μg čištěného IL-4 ve 100 μΐ tlumivého roztoku 50-mM fosforečnanu sodného, pH 8,0, po dobu dvě hodiny při teplotě 22 °C. Reakční systém se pak na jednu hodinu prudce ochladí (zamrzne) přidáním přiměřeného objemu 1,0M-2-aminoethanové kyseliny (glycinu).

Jodovaný protein se izoluje gelovou filtrací na PD-1 koloně (Pharmacia, Piscataway, NJ), ekvilibrované (uvedené do rovnováhy) 0,2 % želatiny v 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7,4. Radioaktivní eluční látka z kolony v mezerovém objemu se jímá a analyzuje. Specifická radioaktivita značeného IL-4 byla 1500 Ci/mmol (tj. 5,55 . 10¹³ Bq), určena samovytěsňovací metodou podle Calve et al.: Biochem. J. 212:259 (1983) a molámí poměr zavedení do molekuly byl 0,68 mol jodu najeden mol proteinu.

Postupně zřeďované rozmanité antipolypeptidové IgG frakce ve vazebném médiu (RPMI 1640 s 10 % plodového séra telete - fetal calf sérum - FCS) o objemu desetina mililitru u každého vzorku, se podrobí inkubaci s konstantním množstvím ^,25I-IL-4 (přibližně 2 x 10⁵ cpm) v 1,0 ml vazebného média ve zkumavkách o objemu 1,5 ml po dobu 18 hodin při teplotě 4 °C, před provedením testů na vazebnost. Následuje preinkubace, objemy zkumavek se spojí s2 x 10 Daudi buňkami a směsi se inkubují po dobu dvě hodiny při teplotě 4 °C.

Následuje inkubace, buňky se peletují při 800 nebo 12 000 x g po dobu 30 sekund při teplotě 4 °C a pak se odstraní jednotlivé podíly kapaliny nad sedlinou (supematant). Buňky se

- 12CZ 283050 B6 resuspendují v 0,1 ml čerstvého vazebného média bez označeného IL-4 při teplotě 4 °C, peletují se, jak je výše pospáno, resuspendují ve 100 μΙ zkušebního média a pokryjí vrstvou 100 μΐ dibutylftalátu a dioktylftalátu (1:1). Tyto buňky se peletují při 13 000 x g po dobu dvou minut, zmrazí v kapalném dusíku a pak se stanovuje počet impulzů v detektoru (čítači) záření gama. Nespecifická vazebnost se určuje v paralelních vzorcích, obsahujících 1,0 mg neznačeného lidského IL-4.

Výsledky předcházejících analýz ukazuje tabulka 2.

Tabulka 2: Analýza antipolypeptidových IgG frakcí

Polypeptid, použitý jako antigen*	Reaktivita protilátky s** polypeptidem	IL-4	% inhibice vazebnosti ^l25I-IL-4 vazebnosti
1	+	-	0
2	+	+	0
3	+	+	2,4
4	+	+	0
5	+	+	8,7
6	+	+	76
7	+	+	78
8	+	-	7,5
9	+	+	39
10	+	+	26
11	+	+	60
12	+	+	0
* Sekvence aminokyselin polypeptidů a korespondující o jsou ukázány v tabulce 1	blasti v molekule lidského IL-4
♦♦ Při určování reaktivity protilátky, + znamená absorbanci při 414 nm 0,05, po odečtení absorbance srovnávacích jamek.

Data, uvedená v tabulce 2, ukazují, že protilátky, produkované proti polypeptidům, korespondujícím aminokyselinovým zbytkům 52 - 65 (polypeptid č. 6), dále 61 - 82 (polypeptid č. 7) a 104 -129 (polypeptid č. 11) lidského IL-4, jsou velmi silné inhibitory vazebnosti ¹²⁵I-IL-4 na Daudi buňky. Tyto protilátky se specificky vážou jak na imunizované polypeptidy, tak na IL-4, ačkoliv pre-imunitní sérum se neváže na žádný a nemá žádný vliv na vazebnost receptoru.

Jak dále ukazuje tabulka 2, protilátky proti polypeptidům 6 a 7 mají stejně silný inhibiční účinek na vazebnost značeného IL-4. Tabulka 1 ukazuje, že tyto polypeptidy sdílí společnou subsekvenci aminokyselin KDTRC. Takovýto kombinovaný důkaz navrhuje tuto subsekvenci, která může konstituovat důležitý epitop, aby poskytla podporu pro polypeptidy podle tohoto vynálezu, které mohou obsahovat až 5 aminokyselinových zbytků.

Zvláště zajímavá je inhibice vazebnosti, kterou prokazují polyklonální protilátky proti polypeptidů č. 6. Jak již bylo zde uvedeno, Chrentien a jeho spolupracovníci nalezli, že monoklonální protilátka, produkovaná proti některému polypeptidů, nepůsobí neutralizačně na bioaktivitu IL-4. Následující epitopová analýza, která bude níže popsána, ale ukázala, že tato protilátka je pravděpodobně zaměřena proti aminokyselinovým zbytkům u aminokoncového zbytku polypeptidů, ne proti Lys-Asp-Thr-Arg-Cys subsekvenci u karboxykoncového zbytku. Polyklonální antisérum podle tohoto příkladu pravděpodobně inhibuje IL-4 vazebnost, protože některá z protilátek vněm byla zaměřena proti epitopu, obsahujícímu tuto specifickou subsekvenci.

- 13 CZ 283050 B6

Výsledky, získané s antisérem 343-6 IgG frakcí proti polypeptidu č. 7, jsou graficky znázorněné na obrázku 3, kdy se 2 x 10⁶ buněk Daudi inkubuje s 50 pM ¹²⁵I-IL-4 a indikuje se koncentrace stanovované protilátky po 2 hodinách při teplotě 4 °C. Specifická vazebnost za nepřítomnosti protilátky je 3,347 cpm. Byla pozorována silná inhibice vazebnosti, spojená se skutečností, že se protilátky specificky vážou na polypeptid č. 7 a na IL-4; je třeba ovšem připomenout, že aminokyselinové zbytky, proti kterým působí, mohou být exponovány na povrchu IL-4.

Příklad 3

Monoklonální antipolypeptidové protilátky

Monoklonální protilátky se připravují v podstatě tak, jak popisuje Kohler aMilstein: Nátuře 256:495 (1975). Všechny inkubace se prováděly při teplotě 37 °C v 5 % CO₂ v inkubátoru.

Balb/c (Charles River) myši se imunologicky zcitliví podáváním 500 μΐ 2,6,10,14-tetramethylpentadekanu (Přistane) intraperitoneálně (i.p.). Asi o čtyři dny později se 250 pg polypeptidu č. 7 (tabulka 1; odpovídající aminokyselinovým zbytkům 61 - 82 lidského IL-4) rozpustí v 250 μΐ objemech fosforečnanového pufrovaného fyziologického roztoku (phosphate buffered šalině - PBS), 250 pg podílů úplného Freundova adjuvans se pak přidá a směsi se homogenizují a každá z nich se podává i.p. každé z myší. Asi o jeden měsíc později se podávají i.p. posilovači injekce, obsahující 125 pg polypeptidu v poměru 1:1 rozpuštěné v neúplném Freundově adjuvans.

Asi o tři nebo čtyři měsíce později se podávají závěrečné i.p. injekce z 250 pg polypeptidu č. 7 v PBS. V průběhu imunizace se periodicky provádějí krevní zkoušky z krve, odebírané z ocasních tepen a analýza se provádí postupem ELISA, zde již popsaným. Čtyři dny po závěrečných imunizacích se zvířata obětují (usmrtí) a odstraní se jim sleziny.

Tyto sleziny se macerují mezi dvěma podložními sklíčky v čerstvém médiu RPMI 1640, obsahujícím 100 pg/ml streptomycinu a 100 jednotek/ml penicilinu (RPMI pen/strep médium) a potom se převedou do velké zkumavky. Po usazení případných zbytků po době jedné minuty, se buňky ve vrchní vrstvě zkumavky převedou do jiné zkumavky o objemu 5 ml. Přidají se čtyři mililitry média RPMI pen/strep, buňky se suspendují a pak sedimentují centrifugací při 300 x g po dobu 8 minut.

Při poměru 5:1 buněk sleziny kNS-1 myším myeloma buňkám (ATCC TIB 18) se buňky preparují a jednou promývají médiem RPMI pen/strep. Po peletizaci buněk a odstranění média se po kapkách přidá 0,5 ml PEG (2 g na litr v 75 mM HEPES tlumivého roztoku), majícího molekulovou hmotnost přibližně 1500 daltons po období přes jednu minutu při teplotě 37 °C, za mírného protřepání každých 20 sekund. Přídavek PEG se opakuje, nejprve s 0,5 ml a pak 1,0 ml roztoku PEG.

Následuje fúzování, buňky sedimentují a promývají se postupně vždy po dobu jedné minuty 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml, 16,0 ml a 32,0 ml média RPMI pen/strep. Fúzované buňky opět sedimentují tak, jak již bylo uvedeno, pak se odstraní médium, poté se přidá přibližně 1 x 10⁵ buněk sleziny z nedotčených myší (které nedostávaly injekce) jako zásobovač buněk v médiu RPMI pen/strep, obsahujícím 0,2933 mg/ml glutaminu a 10 % telecího plodového séra (fetal calf sérum - FCS) a buňky se míchají a pak sedimentují, jak již bylo popsáno. Po izolaci z myší den předtím se tyto zásobní buňky inkubují přes noc při teplotě 37 °C v médiu RPMI pen/strep, obsahujícím glutamin a FCS.

Fúzované a zásobní buňky pak rostou dohromady po sedm dní v médiu RPMI pen/strep, obsahujícím 0,2933 mg/ml glutaminu, 10 % FCS, 1 x 10’² hypoxanthinu, 4 x 10'⁵ aminopterinu

- 14CZ 283050 B6 a 1,6 x 10'³M-thimidinu (HAT médium) na mikrotitračních destičkách po 96ti jamkách s plochým dnem (COSTAR), 150 μΐ na jednu jamku. Po tomto inkubačním období se médium v každé jamce nahradilo HT médiem (HAT médium s nedostatkem aminopterinu) a v inkubaci se dále pokračuje.

Po několika dnech se provede ELISA na hybridoma supematantech, jak již zde bylo popsáno, s tou výjimkou, že se použije značená antimyší IgG protilátka. Hybridomas v jamkách testované pozitivně, byly klonovány limitním ředěním v HT médiu.

Tímto způsobem se produkuje úhrn 382 klonovaných hybridomas, všechny, které produkovaly monoklonální protilátky. Po třídění těchto hybridomas pomocí ELISA za použití polypeptidu č. 7 jako antigenu se identifikovalo 12 pozitivních buněčných linií. Z nich pak bylo nalezeno 10 pozitivních pomocí třídění ELISA proti IL-4.

Dalším tříděním osmi z pozitivních klonů, prováděných na agaru standardními metodami s imunoglobulin-specifickými antiséry, se prokázalo, že šest z těchto klonů produkují IgGl, jeden produkuje IgG2 a jeden produkuje IgM protilátky.

Příklad 4

Příprava anti-idiotypových protilátek

Pro přípravu anti-idiotypových protilátek se přidá 1,5 mg antiséra 343-6 IgG frakce, popsané v předešlém textu, v 0,5 ml fosforečnanového tlumivého (pufrovaného) fyziologického roztoku k úplnému Freundovu adjuvans a dokonale se promíchá, aby se utvořila emulze. Vzorek se aplikuje jako podkožní injekce ovci (Dorset kříženec). Posilovači očkování se podává v několikatýdenních intervalech potom stejným způsobem, s tou výjimkou, že se použije neúplné Freundovo adjuvans.

Vzorky krve, odebírané v průběhu imunizace náhodným výběrem, se analyzují analýzou ELISA za použití antiséra 343-6 IgG frakce jako antigenu, jak již zde bylo popsáno, stou výjimkou, že se vynechá blokování s imunoglobulinem a jako druhá (sekundární) protilátka se použije 5,0 ng křenovou peroxidázou-značeného oslího anti-ovčího IgG. U takto získaného ovčího antiséra (označeného jako antisérum 1448) bylo zjištěno, že se specificky váže na králičí antisérum 343-6 IgG frakce, nikoliv však na IL-4 nebo na polypeptid č. 7.

Pro zjištění, zda ovčí antisérum 1448 skutečně obsahuje anti-idiotypové protilátky, se antisérum postupně zřeďuje a podrobuje radioligandové receptorové vazebné analýze za použití ¹²⁵I-IL-4 a buněk Daudi tak, jak již zde bylo popsáno, s výsledky, které ukazuje obrázek 4. Každý vzorek při stanovování obsahoval 2 x 10⁶ buněk a 50 pM ¹²⁵I-IL-4 (2 x 10⁵ cpm). Specifická vazebnost za nepřítomnosti antiséra byla 5,931 cpm.

Jak ukazuje obrázek 4, ovčí antisérum 1448 je silný kompetitivní inhibitor vazebnosti značeného IL-4 na buňky, ruší více než 80 % specifické vazebnosti při nižších zředěních. Naopak ovčí preimunní sérum nemá žádný vliv na vazebnost na IL-4.

- 15 CZ 283050 B6

Příklad 5

Analýza epitopu

Pro určení, které aminokyselinové zbytky v polypeptidech č. 6 ač. 7 jsou rozhodující pro produkování protilátek, které mohou inhibovat vazebnost IL-4 na buněčné receptory, se prováděla analýza v podstatě tak, jak popisuje Geysen et al.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998 (1984).

io Metoda podle Geysena se spolupracovníky dovoluje lychlou konkurenční syntézu na pevných nosičích stovkám malých polypeptidů o dostatečné čistotě a v dostatečném množství k provedení ELISA, ale polypeptidy jsou stále poutány na pevné nosiče, na nichž probíhá syntéza. V principu se EEISA provádí na takových polypeptidových užívaných protilátkách, které by mohly být připraveny proti větším polypeptidům nebo proteinu, majícímu sekvenci aminokyselin takovou, 15 aby v ní byla zahrnuta sekvence malých polypeptidů. Jestliže protilátky jsou specifické pro některý epitop kromě většího imunogenu a ten je obklopen malými syntetickými polypeptidy, budou se tyto protilátky vázat na polypeptidy a mohou být tedy detekovány metodou ELISA.

Za použití metody Geysena se spolupracovníky, supra, se syntetizuje řada 15 oktapeptidů na polyethylenových (špendlíkách) částečkách drti (Cambridge Research Biochemicals, lne., Valley Stream, N. Y.), jejichž sekvence aminokyselin v celkovém úhrnu překlenuje všechny aminokyselinové zbytky v polypeptidů č. 7 (odpovídající aminokyselinovým zbytkům 61-82 dospělého lidského IL-4). Sekvence těchto oktapeptidů ukazuje tabulka 3.

Tabulka 3: Oktapeptidy, založené na aminokyselinových zbytcích 61-82 lidského dospělého IL-4

Polypeptid číslo	Sekvence	Odpovídající IL- 4 zbytky	Středový zbytek*
1 2 3 4 5 6 Ί 8 9 10 11 12 13 14 15	KDTRCLGA DTRCLGAT TRCLGATA RCLGATAQ CLGATAQQ LGATAQQF GATAQQFH ATAQQFHR TAQQFHRH AQQFHRHK QQFHRHKQ QFHRHKQL FHRHKQLI HRHKQLIR RHKQLIRF	61-68 62- 69 63- 70 64- 71 65- 72 66- 73 67- 74 68- 75 69- 76 70- 77 71- 78 72- 79 73- 80 74- 81 75- 82	65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79
* Středové zbytky oktapeptidů jsou libovolně označené přidáním čísla čtyři k poloze aminokyselinového zbytku v dospělém lidském IL-4, k němuž koresponduje aminokoncový zbytek každého oktapeptidů.

Podobným způsobem se připraví řada 17 oktapeptidů stejně imobilizovaných, které svou 30 sekvencí aminokyselinových zbytků překlenují v úhrnu odpovídající aminokyselinové zbytky

- 70 dospělého lidského IL-4. Aminokyselinové sekvence těchto oktapeptidů ukazuje tabulka 4.

- 16CZ 283050 B6

Tabulka 4: Oktapeptidy, založené na aminokyselinových zbytcích 47 - 70 dospělého lidského IL-4

Polypeptid číslo	Sekvence	Odpovídající IL-4 zbytky	Středový zbytek*
1	RAATVLRQ	47-54	51
2	AATVLRQF	48-55	52
3	ATVLRQFY	49-56	53
4	TVLRQFYS	50-57	54
5	VLRQFYSH	51-58	55
6	LRQFYSHH	52-59	56
7	RQFYSHHE	53-60	57
8	QFYSHHEK	54-61	58
9	FYSHHEKD	55-62	59
10	YSHHEKDT	56-63	60
11	SHHEKDTR	57-64	61
12	HHEKDTRC	58-65	62
13	HEKDTRCL	59-66	63
14	EKDTRCLG	60-67	64
15	KDTRCLGA	61-68	65
16	DTRCLGAT	62-69	66
17	TRCLGATA	63-70	67
* Středové zbytky oktapeptidů jsou libovolně označené přidáním čísla čtyři k poloze
aminokyselinového zbytku v dospělém lidském aminokyselinový zbytek každého oktapeptidů.	IL-4, k němuž	koresponduje

K provedení epitopové analýzy na polypeptidu č. 7 bylo podrobeno antisérum, označené 129-88 z imunizovaného králíka s polypeptidem, analýze ELISA tak, jak již zde bylo popsáno. Při této analýze ELISA se použije imobilizovaných oktapeptidů, ukázaných v tabulce 3, jako antigenu. Podle výsledku toto antisérum silně inhibuje vazebnost ¹²⁵I-IL-4 na buňky Daudi, a to při stanovení, provedeném tak, jak již zde bylo popsáno. ELISA se provádí na antiséru 129-88 v podstatě tak, jak již zde bylo popsáno, na 96ti jamkových mikrotitračních destičkách, s výjimkou, že se použijí do jamek jehličky místo nanášení volného antigenu do jamek. Dříve než se zaznamená barva vyvíjení za použití Titertek MCC 340 ELISA plate reader deskového snímače záznamu, se jehličky odstraní z jamek.

Výsledky této analýzy ukazuje obrázek 5, kde je ukázána absorbance při 414 nm pro každý z oktapeptidů. Čísla oktapeptidů, uvedených na obrázku 5, korespondují s čísly, uvedenými v tabulce 3. Z obrázku 5 je patrná silná vazebnost protilátek na oktapeptidy č. 5 až č. 12. S odvoláním na tabulku 3 je patrné, že aprosimativní středy těchto oktapeptidů korespondují s aminokyselinovými zbytky 69 - 76 dospělého lidského IL-4. Podle těchto údajů, spolu se skutečností, že antisérum 129-88 inhibuje vazebnost značeného IL-4 na buněčné receptory, lze se domnívat, že aminokyselinové zbytky 69 - 76 dospělého lidského IL-4 tvoří epitop (epitopy), protilátky proti inhibování vazebnosti lidského IL-4 na buněčné receptory.

Podobným způsobem utvořené imobilizované oktapeptidy, uvedené v tabulce 4, se použijí k analýze králičího antiséra, produkovaného proti polypeptidu č. 6. Toto antisérum, označené 342-6, se vyhodnocuje dvakrát na schopnost inhibovat vazebnost ¹²⁵I-IL-4 na buňky Daudi. Vzorky séra, připravené na začátku průběhu imunizace (rané antisérum 342-6) neprokazovaly inhibování vazebnosti značeného IL-4; vzorky připravené později v průběhu imunizace (pozdější antisérum 342-6) byly silnými inhibitory. Výsledky těchto analýz ukazuje obrázek 6A a 6B pro

- 17CZ 283050 B6 rané a pro pozdější antisérum. Čísla oktapeptidů, ukázaných na obrázku 6, korespondují s čísly oktapeptidů, uvedených v tabulce 4.

Jak ukazuje obrázek 6A, neinhibující rané antisérum 342-6 proti polypeptidu č. 6, obsahuje protilátky, reaktivní s oktapeptidy č. 3 až č. 7 a č. 9 až č. 13. S odvoláním na tabulku 4 je patrné, že středy těchto oktapeptidů korespondují aproximativně s aminokyselinovými zbytky 53 - 57, resp. 59 - 63 dospělého lidského IL-4.

Dále pak inhibiční antisérum 342-6 tvoří podobný vzorek vazebnosti (obrázek 6B), kromě toho také obsahuje protilátky, které prokazují silnější vazebnost vůči oktapeptidům 11-16, jejichž středy korespondují s aminokyselinovými zbytky 61-66 lidského IL-4. Podle údajů na panelech A a B na obrázku 6, vzato dohromady, je možné se domnívat, že aminokyselinové zbytky 61-66 dospělého lidského IL-4 tvoří epitop (epitopy), protilátky proti inhibování vazebnosti lidského IL-4 na buněčné receptory.

Tuto domněnku posilují studie pomocí ELISA, prováděné tak, jak již bylo popsáno, za použití polypeptidů č. 6 a č. 7 a jedné z monoklonálních protilátek proti polypeptidu č. 7. Tato protilátka se silně váže na oba polypeptidy. Také silně inhibuje vazebnost ¹²⁵I-IL-4 na buňky Daudi. Společná subsekvence v těchto polypeptidech je pouze K.DTRC, která koresponduje s aminokyselinovými zbytky 61 - 65 dospělého lidského IL-4. Z toho vyplývá, že tato inhibiční monoklonální protilátka musí působit právě proti této subsekvenci a (tedy) tato subsekvence musí tvořit (nějaký) důležitý epitop.

U tohoto vynálezu se dá udělat mnoho modifikací a variant, aniž by přitom došlo k odchýlení od jeho základní myšlenky (předmětu vynálezu) a rozsahu, jak je zjevné odborníkům v tomto vědním oboru. Specifické případy, které jsou zde popisovány, jsou pouze nabídnuté možnosti příkladů, jak využít původní myšlenku a tento vynález je limitován pouze podmínkami, uvedenými v připojených patentových nárocích.

Průmyslová využitelnost

Vynález se týká antagonistických protilátek, které jsou použitelné pro léčbu alergií nebo podobných stavů. Je využitelný z farmaceutického hlediska, neboť poskytuje způsoby pro tvoření farmaceutických prostředků ajejich složení.

Claims

1. Polypeptid, obsahující sekvenci aminokyselin

Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-ArgRhe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu-Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro-Val-LysGlu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met-Arg-Glu-LysTyr- Ser-Lys-Cys-Ser-Ser, nebo jeho subsekvence.

2. Polypeptid podle nároku 1, který je kovalentně vázaný na molekulu nosiče.

- 18CZ 283050 B6

3. Polypeptid podle nároku 1, který má sekvenci aminokyselin

Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-ArgRhe.

4. Polypeptid podle nároku 1, který má sekvenci aminokyselin

Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met-Arg-Glu-Lys-TyrSer-Lys-Cys-Ser-Ser.

5. Subsekvence polypeptidu podle nároku 1, která má sekvenci aminokyselin

Lys-Asp-Thr-Arg-Cys.

6. Subsekvence polypeptidu podle nároku 1, která má sekvenci aminokyselin

Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His.

7. Použití polypeptidu nebo subsekvence podle nároků 1 až 6 k přípravě polyklonální a/nebo monoklonální protilátky, která se specificky váže na lidský IL-4.