ES2620437T3 - Péptidos derivados de IL-4 para la modulación de la respuesta inflamatoria crónica y el tratamiento de enfermedades autoinmunes - Google Patents

Péptidos derivados de IL-4 para la modulación de la respuesta inflamatoria crónica y el tratamiento de enfermedades autoinmunes Download PDF

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Abstract

Un compuesto que está constituido por uno o más péptidos, estando constituido cada péptido por**Fórmula** (SEC ID Nº: 1), o una variante de la misma que tiene un aminoácido diferente en una posición, en el que dicho péptido es capaz de inhibir la activación de macrófagos.

Description

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Todavía en otra realización, el péptido de acuerdo con la divulgación es capaz de inhibir la activación de macrófagos.
Tanto los fragmentos como las variantes de secuencias de aminoácidos de acuerdo con la divulgación son equivalentes funcionales de dichas secuencias.
La expresión "equivalente funcional" de una secuencia de aminoácidos en el presente contexto se refiere a una molécula que cumple los criterios de una variante o un fragmento de dicha secuencia de aminoácidos descrita anteriormente y que es capaz de una o más actividades funcionales de dicha secuencia o un compuesto que comprende dicha secuencia. En una realización preferida, el equivalente funcional de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la divulgación es capaz de interaccionar con el receptor de IL-4 y modular la señalización del receptor de IL-4.
La divulgación se refiere tanto a péptidos aislados de acuerdo con la divulgación como a proteínas de fusión que comprenden péptidos de acuerdo con la divulgación.
En una realización, el péptido de acuerdo con la divulgación es un péptido aislado. La expresión "péptido aislado" se refiere a que el péptido de acuerdo con la divulgación es un compuesto individual y no una parte de otro compuesto. El péptido aislado se puede producir mediante el uso de cualquier procedimiento de tecnología recombinante o síntesis química y separarse de otros compuestos, o se puede separar de un polipéptido más largo o proteína mediante un procedimiento de escisión enzimática o química y separarse adicionalmente de otros fragmentos proteicos.
La secuencia peptídica puede estar presente en el compuesto en una sola copia, es decir, formulada en forma de monómero de la secuencia peptídica, o puede estar presente en forma de varias copias de la misma secuencia, por ejemplo en forma de multímero que comprende dos o más copias de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 1 a 37, o dos o más copias de un fragmento o una variante de dicha secuencia.
Un péptido aislado de acuerdo con la divulgación puede comprender un fragmento de interleucina-4 que está constituido por una secuencia de aminoácidos contiguos derivados de la interleucina-4, seleccionada de las SEC ID Nº: 1 a 37 o una variante de las mismas. De acuerdo con la presente divulgación, el péptido aislado puede estar constituido por una o más de las secuencias de SEC ID Nº: 1 a 37.
Producción de secuencias peptídicas
Las secuencias peptídicas de la presente divulgación se pueden preparar mediante cualquier procedimiento sintético convencional, tecnologías de ADN recombinante, escisión enzimática de proteínas de longitud completa de las que se derivan las secuencias peptídicas, o una combinación de dichos procedimientos.
Preparación sintética
Los procedimientos para la producción sintética de péptidos son bien conocidos en la técnica. Se pueden encontrar descripciones detalladas, así como consejos prácticos para producir péptidos sintéticos, en “Synthetic Peptides: A User's Guide (Advances in Molecular Biology)”, Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002, o en: “Pharmaceutical Formulation: Development of Peptides and Proteins”, Frokjaer and Hovgaard eds., Taylor y Francis, 1999.
Los péptidos pueden por ejemplo ser sintetizados usando química de Fmoc y con cisteínas protegidas con Acm. Después de la purificación por HPLC de fase inversa, los péptidos se pueden procesar adicionalmente para obtener, por ejemplo, isoformas cíclicas o modificadas en la parte C-o N-terminal. Los procedimientos para la ciclación y modificación terminal son bien conocidos en la técnica y se describen en detalle en los manuales citados anteriormente.
En una realización preferida, las secuencias peptídicas se producen sintéticamente, en particular, por medio del procedimiento de síntesis peptídica asistida por secuencia (SAPS).
Los péptidos se pueden sintetizar o bien por lotes en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración, o en la versión de flujo continuo del procedimiento en fase sólida de poliamida (Dryland,
A. y Sheppard, RC, (1986) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 -137) en un sintetizador de péptidos totalmente automatizado usando 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) o terc -butiloxicarbonilo, (Boc) en forma de grupo de protección de N-a-amino y grupos de protección comunes adecuados para la funcionalidad de la cadena lateral.
Preparación recombinante
Así pues, en una realización, los péptidos se producen por el uso de tecnologías de ADN recombinante.
La secuencia de ADN que codifica un péptido, o la proteína de longitud completa correspondiente a partir de la cual se origina el péptido, se puede preparar sintéticamente por medio de procedimientos estándares establecidos, por ejemplo el procedimiento de fosfoamidina descrito por Beaucage y Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859
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1869, o el procedimiento descrito por Matthes y col., 1984, EMBO J. 3:801-805. De acuerdo con el procedimiento de fosfoamidina, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, reasocian, ligan y clonan en vectores adecuados.
La secuencia de ADN que codifica un péptido se puede preparar también por medio de la fragmentación de las secuencias de ADN que codifican la proteína de longitud completa correspondiente de origen peptídico, usando ADNasa I de acuerdo con un protocolo estándar (Sambrook y col, “Molecular cloning: A Laboratory Manual”. 2ª ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). La presente divulgación se refiere a proteínas de longitud completa seleccionadas de los grupos de proteínas identificadas anteriormente. El ADN que codifica las proteínas de longitud completa de la divulgación, como alternativa, se puede fragmentar usando endonucleasas de restricción específicas. Los fragmentos de ADN se purificaron adicionalmente usando procedimientos estándares descritos en Sambrook y col., “Molecular cloning.: A Laboratory Manual”. 2ª ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
La secuencia de ADN que codifica una proteína de longitud completa también puede ser de origen genómico o ADNc, por ejemplo obtenida preparando una colección genómica o de ADNc y detectando secuencias de ADN que codifican toda o parte de la proteína de longitud completa mediante hibridación usando sondas de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con técnicas estándares (véase Sambrook y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, 1989). La secuencia de ADN también se puede preparar por reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en el documento US4683202 o Saiki y col., 1988, Science 239:487-491.
Después, la secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión recombinante, que puede ser cualquier vector, que se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante. La elección del vector dependerá con frecuencia de la célula hospedadora en la que se va a introducir. Así pues, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe en forma de entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el (los) cromosoma(s) en que se ha integrado.
En el vector, la secuencia de ADN que codifica un péptido o una proteína de longitud completa debería conectarse de manera operativa a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora de elección y se puede derivar de genes que codifican proteínas bien homólogas o heterólogas de la célula hospedadora. Son ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN de codificación en las células de mamíferos el promotor de SV 40 (Subramani y col., 1981, Mol. Cell Biol. 1: 854-864), el promotor de MT-1 (gen de la metalotioneína) (Palmiter y col., 1983, Science 222: 809-814) o el promotor principal tardío del adenovirus 2. Un promotor adecuado para usar en células de insecto es el promotor de polihedrina (Vasuvedan y col., 1992, FEBS Lett. 311: 7-11). Los promotores adecuados para usar en células hospedadoras de levadura incluyen promotores de genes glucolíticos de levadura (Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 12073-12080; Alber y Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419-434) o genes de alcohol deshidrogenasa (Young y col., 1982, en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al, eds., Plenum Press, Nueva York), o los promotores de TPI1 (documento US4599311) o ADH2-4c (Russell y col., 1983, Nature 304: 652-654). Los promotores adecuados para usar en células hospedadoras de hongos filamentosos son, por ejemplo, el promotor de ADH3 (McKnight y col., 1985, EMBO J. 4: 2093-2099) o el promotor de tpiA.
La secuencia de ADN de codificación también puede estar conectada operativamente a un terminador adecuado, tal como el terminador de la hormona de crecimiento humana (Palmiter y col., op. cit.) o (para hospedadores fúngicos), los promotores de TPI1 (Alber y Kawasaki, op. cit.) o ADH3 (McKnight y col., op. cit.). El vector puede comprender adicionalmente elementos tales como señales de poliadenilación (por ejemplo, de SV 40 o la región Elb de adenovirus 5), secuencias potenciadoras transcripcionales (por ejemplo, el potenciador de SV 40) y secuencias potenciadoras traduccionales (por ejemplo, las que codifican ARN VA de adenovirus).
El vector de expresión recombinante puede comprender además una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula hospedadora en cuestión. Un ejemplo de dicha secuencia (cuando la célula hospedadora es una célula de mamífero) es el origen de replicación de SV 40. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula hospedadora, tal como el gen que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) o uno que confiere resistencia a un fármaco, por ejemplo, neomicina, hidromicina o metotrexato.
Los procedimientos usados para ligar las secuencias de ADN que codifican los péptidos o proteínas de longitud completa, el promotor y el terminador, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos para las personas expertas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y col., op.cit.).
Para obtener péptidos recombinantes, las secuencias de codificación de ADN se pueden fusionar de forma útil con una segunda secuencia de codificación de péptido y una secuencia de codificación del sitio de escisión de la proteasa, dando un constructo de ADN que codifica la proteína de fusión, en el que se inserta la secuencia de
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codificación del sitio de escisión de la proteasa colocada entre el fragmento HBP y el segundo ADN de codificación de péptido en un vector de expresión recombinante, y se expresa en células hospedadoras recombinantes. En una realización, dicho segundo péptido se selecciona de, pero no limitado por, el grupo que comprende glutatión-Sreductasa, timosina de ternero, tiorredoxina bacteriana o variantes naturales o sintéticas de ubiquitina humana o péptidos de las mismas. De acuerdo con la presente divulgación, una secuencia peptídica que comprende un sitio de escisión de la proteasa puede ser el sitio de escisión del Factor Xa, con la secuencia de aminoácidos IEGR, enterocinasa, con la secuencia de aminoácidos DDDDK, trombina, con la secuencia de aminoácidos LVPR/GS, o Acharombacter lyticus, con la secuencia de aminoácidos XKX.
La célula hospedadora en la que se introduce el vector de expresión puede ser cualquier célula que tenga capacidad de expresión de los péptidos o proteínas de longitud completa, y es preferiblemente una célula eucariota, tal como células de invertebrados (insecto) o células de vertebrados, por ejemplo, ovocitos de Xenopus laevis o células de mamíferos, en particular células de insectos y de mamíferos. Los ejemplos de líneas celulares de mamífero adecuadas son las líneas celulares HEK293 (ATCC CRL-1573), COS (ATCC CRL-1650), BHK (ATCC CRL-1632, ATCC CCL-10) o CHO (ATCC CCL-61). Los procedimientos de transfección de células de mamíferos y expresión de secuencias de ADN introducidas en las células se describen en, por ejemplo, Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, pág. 601-621.; Southern y Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341; Loyter y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 422-426; Wigler y col, 1978, Cell 14:725; Corsaro y Pearson, 1981, en "Somatic Cell Genetics 7", pág. 603; Graham y van der Eb, 1973, Virol. 52:456; y Neumann y col, 1982, EMBO J. 1:841-845.
De forma alternativa, pueden usarse células fúngicas (incluyendo células de levadura) como células hospedadoras. Los ejemplos de células de levadura adecuadas incluyen células de Saccharomyces spp. o Schizosaccharomyces spp., en particular cepas de Saccharomyces cerevisiae. Son ejemplos de otras células fúngicas células de hongos filamentosos, por ejemplo, Aspergillus spp. o Neurospora spp., en particular cepas de Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. El uso de Aspergillus spp. para la expresión de proteínas se describe en, por ejemplo, el documento EP238023.
El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el cultivo de células de mamíferos, tales como un medio que contiene suero o libre de suero que contiene suplementos apropiados, o un medio adecuado para el cultivo de células de insecto, levadura o fúngicas. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con fórmulas publicadas (por ejemplo en catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo).
Los péptidos o proteínas de longitud completa producidas de forma recombinante por las células después pueden recuperarse del medio de cultivo por procedimientos convencionales que incluyen separación de las células hospedadoras del medio por centrifugación o filtración, precipitación de los componentes proteicos del sobrenadante
o filtrado mediante una sal, por ejemplo sulfato de amonio, purificación mediante una diversidad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo HPLC, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.
Medicamento
Es un objetivo de la divulgación proporcionar un compuesto capaz de modular la actividad de IL-4, dicho compuesto de acuerdo con la divulgación puede usarse en forma de medicamento para el tratamiento de enfermedades, en el que la modulación de la señalización de IL-4 se puede considerar como una condición esencial para la curación.
Por consiguiente, la divulgación se refiere al uso de uno o más de los péptidos que comprenden una secuencia derivada de IL-4 o un fragmento o variante de la misma para la fabricación de un medicamento.
En una realización, el medicamento comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 1-37 o fragmentos o variantes de dichas secuencias. En otra realización, el medicamento de la divulgación comprende un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo en IL-4 o un fragmento del mismo o un fragmento o variante de dicho anticuerpo.
El medicamento de la divulgación comprende una cantidad eficaz de uno o más de los compuestos como se han definido anteriormente, o una composición que comprende un compuesto como se ha definido anteriormente, en combinación con aditivos farmacéuticamente aceptables. Dicho medicamento puede formularse adecuadamente para administración oral, percutánea, subcutánea, tópica, intramuscular, intravenosa, intracraneal, intratecal, intracerebroventricular, nasal, intranasal o pulmonar o administración parental complementada con administración intraarticular en o cerca de las cápsulas articulares.
Las estrategias en el desarrollo de formulaciones de medicamentos y composiciones basados en los péptidos de la presente divulgación generalmente corresponden a estrategias de formulación para cualquier otro producto de fármacos basados en proteínas. Los problemas potenciales y las directrices necesarias para superar estos problemas se tratan en varios libros de texto, por ejemplo "Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems", Ed. A.K. Banga, Technomic Publishing AG, Basilea, 1995.
De forma habitual, se preparan inyectables bien en forma de soluciones o bien de suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación también se
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puede emulsionar. El principio activo se mezcla a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, en caso conveniente, la preparación puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulgentes, agentes tamponantes del pH, o que potencian la eficacia o el transporte de la preparación.
Las formulaciones de los compuestos de la divulgación se pueden preparar por medio de técnicas conocidas para la persona experta en la técnica. Las formulaciones pueden contener vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables, entre los que se incluyen microesferas, liposomas, microcápsulas, nanopartículas o similares.
La preparación se puede administrar adecuadamente por inyección, opcionalmente en el sitio en el que el principio activo va a ejercer su efecto. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones de supositorios, nasales, pulmonares y, en algunos casos, orales. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales incluyen polialquilenglicoles o triglicéridos. Dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el (los) principio(s) activo(s) en el intervalo del 0,5 % al 10 %, preferiblemente del 1 % al 2 %. Las formulaciones orales incluyen excipientes comúnmente empleados tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen generalmente del 10 % al 95 % del (los) principios(s) activo(s), preferiblemente del 25 % al 70 %.
Otras formulaciones son aquellas adecuadas para administración nasal y pulmonar, por ejemplo, inhaladores y aerosoles.
El compuesto activo puede formularse como formas neutras o salinas.
Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácidos (por ejemplo formadas con los grupos amino libres del compuesto peptídico) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, fosfórico, sulfúrico, nítrico y similares, o ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, acético, tricloroacético, trifluoroacético, propiónico, benzoico, cinámico, cítrico, fumárico, glicólico, láctico, maleico, málico, malónico, mandélico, oxálico, pícrico, pirúvico, salicílico, succínico, metanosulfónico, etanosulfónico, tartárico, ascórbico, pamoico, bismetilensalicílico, etanodisulfónico, glucónico, citracónico, aspártico, esteárico, palmítico, EDTA, glicólico, p-aminobenzoico, glutámico, bencenosulfónico, p-toluenosulfónico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.
Otros ejemplos de sales de adición de ácidos orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables incluyen las sales farmacéuticamente aceptables enumeradas en J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2. Ejemplos de sales de metales incluyen sales de litio, sodio, potasio, magnesio y similares. Ejemplos de sales de amonio y amonio alquilado incluyen sales de amonio, metilamonio, dimetilamonio, trimetilamonio, etilamonio, hidroxietilamonio, dietilamonio, butilamonio, tetrametilamonio y similares.
Las preparaciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal como para que sea terapéuticamente eficaz. La cantidad que se va a administrar depende del sujeto que se va a tratar, incluyendo, por ejemplo, el peso y la edad del sujeto, la enfermedad que se va a tratar y la etapa de la enfermedad. Los intervalos de dosificación adecuados son por kilo de peso corporal, normalmente del orden de varios cientos de μg de ingrediente activo por administración, con un intervalo preferido de aproximadamente 0,1 μg a 5000 μg por kilo de peso corporal. Con el uso de formas monoméricas de los compuestos, las dosificaciones adecuadas están con frecuencia en el intervalo de 0,1 μg a 5000 μg por kilo de peso corporal, tal como en el intervalo de aproximadamente 0,1 μg a 3000 μg por kilo de peso corporal, y especialmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 μg a 1000 μg por kilo de peso corporal. Con el uso de formas multiméricas de los compuestos, las dosificaciones adecuadas están con frecuencia en el intervalo de 0,1 μg a 1000 μg por kilo de peso corporal, tal como en el intervalo de aproximadamente 0,1 μg a 750 μg por kilo de peso corporal, y especialmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 μg a 500 μg por kilo de peso corporal, tal como en el intervalo de aproximadamente 0,1 μg a 250 μg por kilo de peso corporal. En particular, cuando se administran por vía nasal, se usan dosificaciones más pequeñas que cuando se administran por otras vías. La administración puede llevarse a cabo una vez o puede estar seguida por administraciones posteriores. La dosificación también dependerá de la vía de administración y variará con la edad y el peso del sujeto que se va a tratar. Una dosificación preferida de formas multiméricas estaría en el intervalo de 1 mg a 70 mg por cada 70 kg de peso corporal.
Para la mayoría de indicaciones, se prefiere una aplicación localizada o sustancialmente localizada.
Algunos de los compuestos de la presente divulgación son suficientemente activos, pero para algunos de los otros, el efecto se potenciará si la preparación comprende además aditivos y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dichos aditivos y vehículos serán conocidos en la técnica. En algunos casos, será ventajoso incluir un compuesto, que promueva el suministro de la sustancia activa a su diana.
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En muchos casos, será necesario administrar la formulación varias veces. La administración puede ser una infusión continua, tal como infusión intraventricular o una administración en más dosis, tal como más veces al día, diaria, más veces por semana, semanal, etc. Se prefiere que la administración del medicamento se inicie antes o poco después de que el individuo se haya sometido al factor o factores que pueden conducir a la muerte celular. Preferiblemente, el medicamento se administra dentro de las 8 horas desde la aparición del factor, tal como dentro de las 5 horas desde la aparición del factor. Muchos de los compuestos exhiben un efecto a largo plazo mediante el cual la administración de los compuestos puede llevarse a cabo con intervalos largos, tales como 1 semana o 2 semanas.
En relación con el uso en las guías nerviosas, la administración puede ser continua o en pequeñas porciones, en base a la liberación controlada del (los) compuesto(s) activo(s). Además, los precursores se pueden usar para controlar la velocidad de liberación y/o el sitio de liberación. Otros tipos de implantes así como la administración oral pueden estar basados de manera similar en la liberación controlada y/o el uso de precursores.
Como se describió anteriormente, la presente divulgación se refiere al tratamiento de individuos para inducir la diferenciación, modular la proliferación, estimular la regeneración, la plasticidad neuronal y la supervivencia de las células in vitro o in vivo, implicando el tratamiento la administración de una cantidad eficaz de uno o más compuestos como se define anteriormente.
Otra estrategia para la administración es implantar o inyectar células capaces de expresar y secretar el compuesto en cuestión. De esta manera, el compuesto puede ser producido en el lugar donde va a actuar.
Tratamiento
Los compuestos de acuerdo con la divulgación son particularmente útiles para el tratamiento de enfermedades y afecciones inflamatorias. Los compuestos son útiles para las enfermedades y afecciones mencionadas a continuación, en particular, son útiles para el tratamiento de la inflamación asociada a la artritis reumatoide y enfermedades autoinmunitarias, así como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington.
Los ejemplos de trastornos asociados a la inflamación que se pueden tratar con los compuestos de la divulgación incluyen; neuroinflamación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington, asma y otras reacciones alérgicas, enfermedades autoinmunitarias tales como encefalomielitis diseminada aguda (ADEM), enfermedad de Addison, ELA, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (APS), anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno, penfigoide bulloso, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermatomiositis, diabetes sacarina de tipo 1, endometriosis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (GBS), enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurativa, púrpura trombocitopénica idiopática, cistitis intersticial, lupus eritematoso, morfea, esclerosis múltiple, miastenia grave, narcolepsia, neuromiotonía, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide, esquizofrenia, esclerodermia, síndrome de Sjogren, LES, arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"), vasculitis, vitíligo, granulomatosis de Wegener; inflamación crónica, prostatitis crónica, glomerulonefritis, hipersensibilidades, enfermedades inflamatorias del intestino, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, vasculitis, osteoartritis, tendovaginitis, y artritis.
El tratamiento también puede ser de inflamación aguda persistente debida a patógenos no degradables, cuerpos extraños persistentes, o reacciones autoinmunitarias, enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central, tal como meningitis, encefalitis, neuropatía inflamatoria y tóxica, incluyendo polineuritis infecciosa aguda, trastornos inflamatorios con daño tisular, VIH, hepatitis, osteoartritis, tendovaginitis, y artritis.
En una realización, el tratamiento puede ser de enfermedades no inmunitarias con orígenes etiológicos en procesos inflamatorios, entre las que se incluyen cáncer, aterosclerosis y enfermedad cardíaca isquémica.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se diseñaron y sintetizaron cuatro péptidos derivados de IL-4 (SEC ID Nº: 1-4). La identificación de la localización de los péptidos se llevó a cabo empleando el software PyMOL™, basado en PyMOL v0.99 (DeLano Scientific LLC, South San Francisco, California, EE.UU.). Esto se hizo en base a la estructura cristalina del complejo ternario de II4ll4r-ll13ra humano, PDB ID: 3BPN y 3BPL (LaPorte y col., 2008).
IL-4 interacciona con dos módulos de fibronectina de tipo III (FN3-1 y FN3-2) de la parte extracelular de IL-4Rα) (Figura 1 y 2). IL-4 interacciona con dos módulos de fibronectina de tipo III (FN3-1 y FN3-2) de la parte extracelular de IL-4Rα y γc (Figuras 3 y 4).
Ejemplo 2
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Se ensayó el efecto de los péptidos con las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 6, y 19 en la inhibición de una respuesta inflamatoria en cultivos celulares de macrófagos. Los resultados se muestran en las figuras 7, 10 y 13-17.
Ejemplo 4
Estudios de unión que usan análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR)
5 Se inmovilizó IL4Rα recombinante sobre un chip sensor de CM5. El procedimiento de inmovilización se llevó a cabo mediante la activación de la matriz de dextrano carboximetilado con 35 μl de solución de activación seguido de una inyección de proteína en solución de acetato de sodio 10 mM (pH 5,0). Después de inmovilizar un nivel deseado de proteína, se inyectaron 35 μl de solución de desactivación para desactivar cualquier grupo carboximetilado libre en la matriz de dextrano. Una celda de flujo siempre estaba vacía como control. Se diluyó cada analito (IL-4 recombinante
10 o péptidos derivados de IL-4) en PBS y se inyectó a un caudal de 10 μl/min. Los datos obtenidos se analizaron mediante la realización de un ajuste de curvas no lineales usando el software BIAevaluation v.4 de Biacore. Las curvas se ajustaron a un modelo de unión de Langmuir 1:1 que describe la interacción de dos moléculas en complejo 1:1. Se calculó la constante de afinidad (KD) a partir de la constante de velocidad de asociación (ka) y la constante de velocidad de disociación (kd). Esto se realizó mediante el uso de la siguiente fórmula, en la que L es el
15 ligando inmovilizado, A el analito, y LA es el complejo analito-ligando:
Modelo 1:1 de Langmuir:
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Velocidad de disminución de la concentración de ligando:
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Velocidad de aumento de la concentración de producto:
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25 Resultados:
Se estudió la unión entre Ph2 (SEC ID Nº: 3) e IL4rα, y entre Ph3 (SEC ID Nº: 1) e IL4rα. Los resultados se muestran en las figuras 8 y 11, respectivamente.
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