CN101255197B - 血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂的融合蛋白及应用 - Google Patents
血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂的融合蛋白及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白，含有人血清白蛋白HSA、肽接头和人白介素1受体拮抗剂IL1ra，肽接头长0～20个氨基酸，存在于人HSA和人IL1ra之间，使用[GlyGlyGlyGlySer]n，n为0-4的整数。通过构建重组毕赤酵母细胞系；重组融合蛋白在其生长培养基中诱导表达；纯化获得。本发明的融合蛋白，在保持IL1ra原有的体内、外生物学功能基础上，降低IL1ra在体内的清除率，延长IL1ra在体内的半衰期，能减低剂量以及减少注射的频率，起最大的治疗作用及减小IL1ra的潜在副作用或毒性，改善安全性和耐受性，能显著地有助于治疗中度和严重的类风湿性关节炎，可在制备白介素受体拮抗剂药物中应用。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，具体而言，涉及生物半衰期提高的血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂的融合蛋白。
技术背景
血清白蛋白是血浆的重要成份，也是许多内源因子和外源药物的载体，正常情况下不易透过肾小球。人血清白蛋白(序列1)是一种585个氨基酸残基组成的蛋白质(A.Dugaiczyk et a1.，PNAS，1982 79：71-75)，其分子量约为66.5KD，血浆半衰期长达2周以上。
人血清白蛋白(HSA)在细胞中是以一种含18个氨基酸残基的信号肽和6个前肽的原肽形式合成的，信号肽和前肽在转运和分泌过程被切除。人血清白蛋白己成功地在多种宿主中表达(EP330451和EP361991)。
白介素1受体拮抗剂(Interleukin 1 receptor antagonist，IL-1ra)，是一种与IL-1受体结合的蛋白，并可抑制受体与IL-1-α和IL-1-β的结合，从而阻断IL-1的生物学活性。其结果使这两个细胞因子在生理学和病理生理学免疫和炎症反应中的生物学活性被中和。IL-1ra是天然存在功能和作为专一受体拮抗剂的第一个蛋白质分子。IL-1Ra的cDNA含编码177个氨基酸多肽的开放读码框架，其中包括一个由25个氨基酸组成的信号肽序列。重组人白介素-1受体拮抗剂(rhIL-1Ra)是在大肠杆菌中表达的非糖基化蛋白，含153个氨基酸，分子量为17.3KDa，与天然的人IL-1Ra相比，其氨基端多了一个蛋氨酸残基(Met)，rhIL-1Ra药用原理和IL-1Ra相同。
2001年11月14日美国FDA正式公布批准美国Amgen公司生产的商品名为Kineret的重组(rh-)IL-1ra用于治疗类风湿性关节炎，批准适应症为“18岁以上的中度和严重的类风湿性关节炎患者，在使用一种或多种改善疾病的抗风湿药物后失效时，明显减轻病人的体征和症状”。
由于IL1ra分子量较小，易被肾小球滤过，因而临床应用时，血浆半衰期较短，一般需要大剂量频繁用药，如每周2-3次，而IL1ra治疗类风湿性关节炎时，治疗周期常常长达数月甚至数年，这种长期大剂量频繁用药不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易产生毒副反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂(HSA-Gn-IL1ra)融合蛋白，这种融合蛋白含有人血清白蛋白HSA、肽接头(以G表示)和人白介素1受体拮抗剂IL1ra，其中所述的肽接头长0～20个氨基酸，该肽接头存在于人HSA和人IL1ra之间，且所述肽接头的氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸，使用[GlyGlyGlyGlySer]n，n为0-4的整数。
本发明的白介素1受体拮抗剂为天然的rIL1ra。
本发明的另一个目的是提供所述的融合蛋白的制备方法，通过以下步骤实现：(a)构建重组毕赤酵母细胞系；(b)重组融合蛋白在其生长培养基中经3天诱导表达，表达量达0.1mg/ml的条件下，培养这种细胞系；(c)纯化步骤(b)表达的蛋白质，其中重组蛋白显示的生物半衰期在摩尔基础上比rIL1ra高10倍。
所述的步骤(a)中，本发明提供编码本发明融合蛋白的DNA序列。包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人白介素1受体拮抗剂氨基酸残基序列相同的第二区的融合蛋白的DNA序列。其中第一区与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同，第二区与人白介素1受体拮抗剂氨基酸残基序列相同，直接融合或者中间设有[GlyGlyGlyGlySer]n的柔性肽接头(n为0-4的整数)的融合蛋白。
所述的步骤(a)中，本发明还提供携带编码本发明融合蛋白的DNA序列的重组表达载体。本发明的重组表达载体包括pPIC9-HSA-IL1ra质粒、pPIC9-IL1ra-HSA质粒、pPIC9-HSA-(G)n-IL1ra质粒、pPIC9-IL1ra-(G)n-HSA质粒等。
所述的步骤(b)中，经3天的诱导表达，产生超过0.3mg/ml的融合蛋白。
在本发明的一个实施例中，公开了一种从酵母表达系统如重组毕赤酵母细胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法。培养转化的细胞系，使得重组融合蛋白在其生长培养基中经3天诱导表达，产生超过0.1(较佳的为0.3)mg/ml的融合蛋白。这些HSA-Gn-IL1ra融合蛋白保持了IL1ra原有的体内、体外的生物学功能且显示出更长的血清半衰期而无不良副作用，从而改善了药物动力学和药效，进而降低了实现类似药效所需的剂量和注射次数。
人血清白蛋白天然存在多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括这些多态型。
编码HSA的多聚核苷酸和编码hIL1ra的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR(Saiki等Science.239：487-491，1988)、RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得，用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞、及文库等，如从人肝胎cDNA文库获得。也可以用人工合成的方法获得，人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。编码IL1ra的多聚核苷酸可以用RT-PCR的方法从人肝胎cDNA文库中获得。若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其它多聚核苷酸连接等。编码HSA和编码hIL1ra的多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端，编码HSA和编码hIL1ra的多聚核苷酸的粘性末端用DNA连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因。如果需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。
许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如pGEM-T，酵母表达载体pPIC9，pPIC9k，(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)，动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。优选的方法是将编码本发明中的融合蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表达载体pPIC9、pPIC9k等，这些质粒为酵母整合型质粒，带有His4选择性标记。醇氧化酶操纵子(AOX1)5’序列和3′序列，用于方便编码基因整合至酵母染色体，和控制编码基因的表达。这些质粒及对应的宿主菌等可以从Invitrogen Corp.SanDiego.Califomia.USA购得，优选的启动子为AOX1。
表达融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等。融合蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是酵母MFα信号肽或天然的人血清白蛋白的信号肽，或这两种信号肽的类似物。更优选的用酵母MFα信号肽，用该信号肽时融合蛋白表达水平较高。融合蛋白或多肽也可以不用信号肽，而在酵母中以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。
转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。或者，细胞培养上清中或细胞破碎液中的蛋白可用抗HSA或抗IL1ra的抗体检测。
可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌、转基因动植物等，生产本发明的融合蛋白。具体的培养方法，可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)的生长，第二阶段主要用于合成产物。
可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。
本发明中的融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰产物等。如在多肽的氨基、羧基、羟基、琉基上再进行修饰。所用修饰剂可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。
本发明的再一个目的是所述的融合蛋白在制备白介素受体拮抗剂药物中应用。
本发明中的融合蛋白及其衍生物可单独使用，优选的为与一个或多个药学上可接受的载体一起组成药物制剂。药物载体一般应与融合蛋白相容且不能对受体自身有害，典型的载体为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸，它们需无菌且无致热原。药物制剂可以单位剂量的形式存在，并可通过任何本领域已知的方法制备。这些方法包括将融合蛋白与具有一种或多种辅助成分混合的步骤。优选的药物制剂包括含水的液体制剂和含水量低于10％或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子糖类等，使药物的渗透性与受体血液中的渗透性相等或相似。药物制剂可存在于单元剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓶，锡林瓶或小管中。冻干制剂是将液体制剂冷冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射用水。优选的单元剂量包括有融合蛋白的日用剂量或单元日用剂量或其适当的亚分。
本发明中的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、静脉输注、透皮、吸入、口服等方法给药。优选的方法为注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。本发明的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物，作为白介素受体拮抗剂药物可用于治疗类风湿性关节炎等。作为白介素-1抑制剂可用于治疗与白介素-1或其受体过量表达有关的疾病，如变态反应等。
使用剂量可通过融合蛋白相对于IL1ra的效价计算出，同时考虑融合蛋白相对于天然工IL1ra延长的半衰期。典型用量为100-150mg/d。在由全长HSA和全长IL1ra融合蛋白中，按照摩尔数相当即意味着使用较大重量的融合蛋白，但使用频率可降低，如一周一次或更少。
本发明的特点：血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂的融合蛋白，在保持IL1ra原有的体内、体外的生物学功能基础上，降低IL1ra在体内的清除率，延长IL1ra在体内的半衰期，能减低剂量以及减少注射的频率，起最大的治疗作用及减小IL1ra的潜在副作用或毒性。血清中药物浓度波动的减少意味着安全性和耐受性的改善，注射频率的减低能使患者有更好的顺应性和生活质量，因此融合人血清白蛋白的人白介素1受体拮抗剂能显著地有助于治疗中度和严重的类风湿性关节炎。另外，融合人血清白蛋白有助于在毕赤酵母中高效表达，有利于产业化发展。
说明书附图
图1为pPIC9-HSA-IL1ra质粒的构建。
图2为pPIC9-HSA-(G)n-IL1ra质粒的构建。
图3为重组载体的酶切鉴定。
图4为纯化的融合蛋白的SDS-PAGE分析。
图5为融合蛋白的Western blotting分析。
图6为融合蛋白对A375.S2细胞作用结果的镜检照片。
图7为融合蛋白生物学活性测定结果。
图8为HSA/IL1ra和rhIL1ra在小鼠中的血药浓度一时间曲线示意图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例做进一步的说明。
实施例1：HSA cDNA的克隆
用PCR方法从人肝胎cDNA文库中获得不带有信号肽编码序列的HSAcDNA，所用的引物HSA up(SEQ ID NO：1)和HSA dn(SEQ ID NO：2)用寡聚核苷酸合成仪合成，上下游引物分别引入EcoRI和BamHI位点和保护碱基，划线处为内切酶识别序列。
HSA-up：5’ATGCGAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTT 3’
HSA-down：5’ATGCGGATCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACT 3’
PCR反应条件：100μL反应体系中，加入1.5μL肝组织cDNA，20μmol/L的上下游引物各1.5μL，10mmol/L的dNTP(脱氧核苷酸)1μL，10×反应缓冲液10μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，剩余用ddH2O补足。用EPPENDORF公司的(型号为Matstercycler Gradient)PCR仪，PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃变性40s；54℃退火45s；72℃延伸2min，共33个循环以后，再72℃延伸10min。通过0.8％凝胶电泳分析得到预期为1.8kb的条带。PCR产物电泳纯化用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。取纯化的HSA cDNA 3μL，加入1μL pGEM-T载体，5μL 2×反应缓冲液，1μL T4 DNA连接酶，16℃反应过夜，转化新鲜制作的DH5α感受态细胞。转化菌铺于x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种至5mL含50μg/mlLB液体培养基中，37℃培养过夜，用试剂盒进行小量质粒抽提，用EcoRI和BamHI双酶切后进行电泳鉴定挑选片段插入的阳性克隆。
从pGEM-T载体的多克隆位点两端分别测序，完成HSA cDNA全长测序。获得了含有序列正确的HSA cDNA的克隆。
实施例2：IL1ra cDNA的克隆
用RT-PCR方法从人肝中获得IL1ra cDNA基因序列，所用的引物IL1raup(SEQ ID NO：3)和IL1ra dn(SEQ ID NO：4)用寡聚核苷酸合成仪合成，在IL1ra up 5’端添加BamHI酶切位点，如此可通过BamHI酶切、连接从而融合HSA基因和IL1ra基因。在IL1ra dn 5’端设计了EcoRI酶切位点，用于与选定的pPIC9载体连接。划线处为内切酶识别序列。
IL1ra up：5′-CC GGATCCCG AC CC TCTG GG AGAAAATC-3′
IL1ra dn：5′-GCA GAATTC CTACTCGTCCTCCTGGA-3′
PCR反应条件：100μL反应体系中，加入1.5μL肝组织cDNA，20μmol/L的上下游引物各1.5μL，10mmol/L的dNTP(脱氧核苷酸)1μL，10×反应缓冲液10μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，剩余用ddH2O补足。用EPPENDORF公司的(型号为Matstercycler Gradient)PCR仪，PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃变性40s；54℃退火45s；72℃延伸2min，共33个循环以后，再72℃延伸10min。通过0.8％凝胶电泳分析得到预期约为0.5kb大小的条带。PCR产物电泳纯化用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。取纯化的IL1ra cDNA3μL，加入1μL pGEM-T载体，5μL2×反应缓冲液，1μL T4 DNA连接酶，16℃反应过夜，转化新鲜制作的DH5α感受态细胞。转化菌铺于x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种至5mL含50μg/ml LB液体培养基中，37℃培养过夜，用试剂盒进行小量质粒抽提，用EcoRI和BamHI双酶切后进行电泳鉴定挑选片段插入的阳性克隆。
从pGEM-T载体的多克隆位点两端分别测序，完成IL1ra cDNA全长测序。得了含有序列正确的IL1ra cDNA的克隆。
实施例3：无连接肽的融合蛋白的表达
为了将HSA与IL1ra以直接连接的融合蛋白形式从毕赤酵母分泌表达，参见图1，选择pPIC9质粒作为载体(Invitrogen Corp.USA)，在该载体AoX启动子下游XhoI与EcoRI位点间插入融合蛋白的基因。
用与实施例1、2相似的PCR方法从实施例1、2构建的PGEM-T-HSA、PGEM-T-IL1ra中获得修饰的HSA、IL1ra的cDNA，所用的引物改为HSA 1(SEQ ID NO：5)、HSA 2(SEQ ID NO：6)和IL1ra 1(SEQ ID NO：7)、IL1ra 2(SEQ IDNO：8)。
HSA 1：5’-GC ctcgag(XhoI)GATGCACACAAGAGTGAGG-3’
HSA 2：5’-GGATTTTCTCCCAGAGGGTCG(IL1ra序列)
TAAGCCTAAGGCAGCTTGAC(HSA序列)-3’
IL1ra 1：5′-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTA(HSA序列)
CGACCCTCTGGGAGAAAATCCAGCAA(IL1ra序列)-3′
IL1ra 2：5′-GCA gaattc(EcoRI)CTACTCGTCCTCCTGGA-3′
其中HSA 15’端设计了XhoI酶切位点，粗体字部分为毕赤酵母中蛋白酶Kex2的识别位点氨基酸Lys和Arg的密码子，加入这两个氨基酸密码子可以使表达的蛋白序列只含有预期的HSA-IL1ra的肽序列。在IL1ra 25’端设计了EcoRI酶切位点。
HSA2、IL1ra 1之间存在41bp的反向互补序列。
PCR产物电泳纯化、胶回收，得到的PCR产物HSA和IL1ra基因等摩尔比例混合作为模板，PCR反应拼接HSA基因和IL1ra基因。
PCR反应条件：50μL反应体系中，加入1.5μL混合PCR模板，10mmol/L的dNTP(脱氧核苷酸)0.5μL，10×反应缓冲液5μL，Mg2+2.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，剩余用ddH2O补足。用EPPENDORF公司的(型号为MatstercyclerGradient)PCR仪，PCR反应条件为95℃预变性5分钟；94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸3min，共20个循环以后；再72℃延伸8min；10℃保温。
再以上步PCR产物做为模板，HSA 1、IL1ra 2为引物，PCR扩增融合基因。反应体系如下：
模板 1ul
HSA 12ul
IL1ra 2 2ul
Mg2+ 2.5ul
BSA 2.5ul
dNTP 0.5ul
Taq酶 0.5ul
10*Buffer 5ul
加ddH2O至总体系为50μl。置PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应条件如下：
95℃预变性5min；94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸3.5min，循环30次；72℃延伸8min；10℃保温。
PCR产物电泳纯化后，用XhoI/EcoRI酶解，电泳回收；pPIC9质粒同样用Xho1/EcoRI酶切，回收线性化片段，将这两个片段用T4DNA连接酶连接，转化入DH5α，挑选阳性克隆，分别用XhoI/EcoRI和PstI(pPIC9上有两个PstI酶切位点，HSA上有一个PstI酶切位点)酶切鉴定(参见图3)。DNA测序结果表明此克隆序列和HSA-IL1ra编码序列完全相同。再抽提该质粒约10μg，用SalI酶切。线性化后转化毕赤酵母GS115(酵母表达试剂盒由Invitrogen Corp.USA提供)，转化后的GS115，铺于含山梨醇的RDB琼脂平板【1mol/L山梨醇，1％葡萄糖，4*10-5％生物素，1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Difeocorp.)，0.005％氨基酸混合液(谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸各0.005％)】，37℃培养3-5天，挑取His+克隆。接种至装有25ml BMGY培养基(100mmol/L磷酸钾，pH6.0，4*10-5％生物素，1.34％无氨基酸酵母氮源，1％甘油)300ml三角瓶，250转/分钟30℃培养48小时，加甲醇1％/24h，诱导培养3天，离心取上清，SDS-PAGE分析。
图3A为重组质粒pPIC9-HSA-IL1ra的酶切鉴定图，其中泳道1：DNA分子标准、泳道2：XhoI/EcoRI双酶切鉴定、泳道3：PstI单酶切鉴定、泳道4：酶切前；图3B为重组质粒pPIC9-HSA-G-IL1ra的酶切鉴定，其中泳道1-3：XhoI/EcoRI双酶切鉴定、泳道4：DNA分子标准、泳道5-7：PstI单酶切鉴定；图3C为重组质粒pPIC9-HSA-G2-IL1ra的酶切鉴定，其中泳道1-2：PstI单酶切鉴定、泳道3：DNA分子标准、泳道4、5：XhoI/EcoRI双酶切鉴定；图3D为重组质粒pPIC9-IL1ra-G-HSA的酶切鉴定，其中泳道1：DNA分子标准、泳道2：酶切前、泳道3：PstI单酶切鉴定、泳道4：XhoI/EcoRI双酶切鉴定。
实施例4：连接肽为GlyGlyGlyGlySer时本发明融合蛋白的表达
为了将HSA通过连接肽与IL1ra以融合蛋白形式从毕赤酵母分泌表达，参见图2，选择pPIC9质粒作为载体(Invitrogen Corp.USA)，在该载体AoX启动子下游XhoI与EcoRI位点间插入融合蛋白的基因。
用与实施例1相似的PCR方法从实施例1构建的pGEM-T-HSA中获得修饰的HSA cDNA，所用的引物改为HSA 3(SEQ ID NO：9)和HSA 4(SEQ IDNO：10)。
HSA 3：5’-GC ctcgag(XhoI)
GATGCACACAAGAGTGAGG-3’
HSA 4：5’-C ggattc(BamHI)ACCACCACCTAAGCCTAAGGC-3’
PCR扩增后在cDNA 5’端引入了XhoI酶切位点，同时在XhoI酶切位点下游引入毕赤酵母中蛋白酶Kex2的识别位点氨基酸Lys和Arg的密码子，用以切除表达的融合蛋白的信号肽，加入这两个氨基酸密码子可以使表达的蛋白序列只含有预期的HSA-IL1ra的肽序列；在cDNA的3’端引入BamHI位点，同时在BamHI位点上游引入连接肽序列。PCR产物电泳纯化，用XhoI/BamHI酶解，电泳回收。
用与实施例2相似的PCR方法从实施例2构建的PGEM-T-IL1ra中获得修饰的IL1ra cDNA，所用的引物改为IL1ra 3(SEQ ID NO：11)和IL1ra 4(SEQID NO：12)。
IL1ra 3：5′-CC ggattc(BamHI)CGACCCTCTGGGAGAAAATC-3′
IL1ra 4：5′-GCA gaattc(EcoRI)CTACTCGTCCTCCTGGA-3′
PCR扩增后，在cDNA的5’端引入一个BamHI位点，用以与PCR修饰的HSA酶切连接；3’端引入EcoRI位点。PCR产物电泳纯化后，用BamHI/EcoRI酶解，电泳回收。
将用XhoI/BamHI酶解的HSA基因片段和用BamHI/EcoRI酶解的IL1ra基因片段连接克隆到用XhoI/EcoRI酶解的pPIC9质粒上，形成pPIC9-HSA-G-IL1ra(G代表连接肽)。转化入DH5α后，铺于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定(参见图3)，获得阳性克隆DH5α(pPIC9-HSA-G-IL1ra)。DNA测序结果表明此克隆序列和IL1ra-G-HSA编码序列相同。再抽提该质粒约10μg，用SalI酶切。线性化后转化毕赤酵母GS115(酵母表达试剂盒由Invitrogen Corp.USA提供)，转化后的GS115，铺于含山梨醇的RDB琼脂平皿(配方同实施例3)，30℃培养3-5天，挑取His+克隆。摇瓶培养和表达菌株筛选方法同实施例3，工程酵母的培养、产物纯化同实施例7，活性测定方法同实施例8。结果表明表达的IL1ra-G-HSA融合蛋白，分子量正确，具有IL1ra的活性、IL1ra和HSA的特性。
实施例5：带不同接头的融合蛋白的表达
在实施例4的基础上可构建带不同接头的HSA/IL1ra融合蛋白基因。如[GlyGlyGlyGlySer]n，n可以是1-10的整数。如当n＝2时，可合成寡聚核苷酸HSA dn(G2)(SEQ ID NO：13)：
HSA dn(G2)：5′-TTggatcc(BamH1)ACC ACC ACC GGA ACC ACC ACC ACCTAA GCC-3′
代替实施例4中的HSA 4，其余操作同实施例4。
当n＝3时，可可合成寡聚核苷酸HSA dn(G3)(SEQ ID NO：14)：
HSA dn(G3)：5′-TT ggatcc(BamH1)ACC ACC ACC GGA ACC ACC ACC ACC GGA ACC ACC ACC ACC TAA GCC-3′
代替实施例4中的HSA 4，其余操作同实施例4。
实施例6：工程酵母的发酵和融合蛋白的纯化
以实施例4构建的表达HSA-G-IL1ra融合蛋白的工程酵母发酵和融合蛋白的纯化为例，其它工程酵母的发酵和融合蛋白的纯化可用相同或相似的方法。
工程酵母接种100mlYPD培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)，摇床30℃，280转/分钟培养24h。接种至装有2L基础盐培养基的5L发酵罐(NBS)，其中基础盐培养基的配制方法为：浓磷酸3.5ml/L，CaSO4.2H2O 0.15g/L，K2SO4 2.4g/L，MgSO4.7H2O 1.95g/L，KOH 0.65g/L，121℃高压灭菌30分钟，再加入3Oml/L甘油(单独121℃高压灭菌30分钟)，1ml/L PTM(配方为CuSO4.5H2O 6.0g/L，CoCl2.6H2O，MnSO4.H2O 3.0g/L，H3BO3 0.02g/L，FeSO4.7H2O 65.0g/L，NaMoO4.2H2O 0.2g/L，ZnSO47H2O 20.0g/L，Kl 0.1g/L，浓硫酸5ml/L，0.5ml/L 0.02％生物素，过滤除菌)。接种前用氨水将培养基pH调至5.0。发酵过程控制温度为30℃，溶氧始终大于30％饱和度.培养至甘油耗尽后，开始流加甘油(50％甘油，加12ml/L PTM)，继续培养，至密度0D600值约为150时，开始补加甲醇(分析纯甲醇，加12ml/L PTM)诱导。诱导培养72小时。取50ml培养液离心取上清，加入硫酸按至20％饱和度，混匀后4℃放置过夜，离心取沉淀，用3ml 25mmol/L Tris-HCl(pH 6.5)溶解，用Supdex200(Amersham Pharmacia Biotech UK)Φ1.6*100cm柱层析分离，流动相为25mmol/L Tris-HCl(pH 6.5)，0.15mol/L Nacl，流速为1ml/L，紫外检测，收集第一峰，即为纯化的融合蛋白，SDS-PAGE分析，融合蛋白分子量为84KD(参见图4，其中，泳道1：蛋白分子量标准，自上而下分别为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4KD；泳道2：纯化的融合蛋白的HSA-G-IL1ra)。Western blotting分析，融合蛋白具有IL1ra和HSA的结构域，参见图5，A为以抗IL1ra多抗为一抗，B为以抗HSA多抗为一抗，其中1为纯化的融合蛋白，2为HSA标准品，3为IL1ra标准品)。
实施例7：融合蛋白的生物学活性测定
通过A375.S2细胞测定IL-1ra生物学活性的方法。该细胞株属于人黑素瘤细胞株，对IL-1敏感，500pg/ml IL-1就对该细胞产生细胞毒性。当加入IL-1ra，IL-1对它的细胞毒性就被去除，通过测定该细胞存活量来检测rhIL-1ra的生物效价。
取rhIL-1ra参考品，以1ml无血清的RPM1640/DMEM(1∶1)培养液(含4ng/ml的IL-1β)完全溶解，并预稀释至100AU/ml，同法稀释待检样品(根据标示效价，预稀释至100AU/ml或1000ng/ml)。将已预稀释的参考品和待检样品以上述培养液于96孔培养板上进行3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度设3个复孔。A375.S2细胞以含10％胎牛血清的RPM1640/DMEM(1∶1)培养液在37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养，生长成单层时传代，48h后消化收集细胞，制成8.0×104个/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μl，再加入稀释好的参考品待检样品，每孔100μl(此时血清终浓度为5％)，于37℃，5％CO2条件下继续培养72h，显微镜观察，参见图6，A：5ng/ml IL-1杀伤对照细胞组；B：未加IL-1的正常细胞组；C：500ng/ml+5ng/ml IL-1阳性对照细胞组；D：HAS 1.95ug/ml+5ng/ml IL-1细胞组；E：H-G-I 2.47ug/ml+5ng/ml IL-1细胞组。加CCK-8试剂，存活细胞代谢XTT使之成为可用读板检测的水溶性盐，用酶标仪测定OD值。读数波长为570nm，参考波长为630nm。
计算样品的生物活性(参见图7)。
实施例8：融合蛋白的半衰期测定
1.给药及采血方法 采集每个时间点3只动物的血样，再将血样离心30min后分离血清，-20℃保存待测。皮下注射给药，采血参数如下：HSA-G-IL1ra(5mg/kg)采血时间：0，0.5，2，4，8，12，24，48，72，96，120，144，168h；IL1ra(1mg/kg)采血时间：0，5，15，30min，1，2，4，8，12，24h。*SC＝subcutaneous；D1＝first day
2.双抗体夹心ELISA法检测样品用Human IL1ra ELISA试剂盒(R&DSystems)。
1)稀释捕捉抗体到工作浓度(用不带蛋白的PBS稀释)，马上以100ul/孔将稀释好的捕捉抗体铺96孔板，密封板在室温下温育过夜。
2)抽吸每孔，并用洗涤试剂冲洗，重复二次，总共三次，每次用400ul洗涤。每次需吸干洗液，或将板倒置于干净纸上吸干。
3)加300ul的稀释试剂到每一孔，在室温下温育1h。
4)重复步骤2，为加样准备好板。
5)加100ul样品或标准品(在稀释试剂中)到每个孔中，密封，在室温下温育2h。
6)重复步骤2。
7)加100ul检测抗体(稀释好的)到每孔，密封，室温下温育2h。
8)重复步骤2。
9)加100ul HRP到每孔(稀释好的)，密封，避光，室温下温育20min。
10)重复步骤2。
11)加100ul底物溶液到每孔，室温下温育20min，避光。
12)另50ul终止溶液到每孔，轻微拍板，保证充分混合。
13)用酶标仪在450nm检测光密度。
3.数据处理及药代参数计算得到标准品的数据用MicroCal Origin软件中的四参数逻辑曲线绘制标准曲线，并求回归方程及相关统计参数；用MicrosoftExcel 2003软件将样品数据代入标准曲线的回归方程计算相关数值并作图，参见图8；最后用3P87软件进行曲线拟合并计算主要药代动力学参数。
本发明涉及的序列
Claims (2)
1.一种血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂的融合蛋白，其特征是：所述的融合蛋白由人血清白蛋白HSA、肽接头和人白介素1受体拮抗剂IL1ra组成，或由人血清白蛋白HSA和人白介素1受体拮抗剂IL1ra组成；所述肽接头存在于人HSA和人IL1ra之间，序列为[GlyGlyGlyGlySer]n，n为0-4的整数；所述人血清白蛋白HSA的序列如SEQ ID No.1所示，人白介素受体1拮抗剂IL1ra的序列如SEQ ID No.15所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白在制备白介素受体拮抗剂药物中的应用。
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