CN101311192B - 一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法及其应用，属于医药领域。一种用酵母制备肿瘤坏死因子可溶型受体和抗体IgG Fc片段融合蛋白的方法：(1)培养含编码该融合蛋白的基因的酵母，(2)从培养物中纯化制备该融合蛋白。本发明的优点是：本发明公开了一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白，及其纯化的方法。酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物易于培养、培养成本低廉、繁殖快、便于大规模培养和高密度发酵等特性，同时又具有真核生物的糖链加工系统，还能将外源蛋白分泌到培养液中，利于纯化。因而具有良好的应用前景。

Description

一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法及其应用，更具体地说是提供了肿瘤坏死因子可溶型受体和抗体IgG Fc片段的融合蛋白、其高效表达方法和该融合蛋白用于诊断、治疗与瘤坏死因子相关疾病的药物的用途，属于生物工程和医药领域。

背景技术

肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种前炎症因子，可以通过与细胞表面的TNF-α受体结合，刺激中性粒细胞、成纤维细胞、软骨细胞等表达其他炎性因子(如IL-1β、IL-6、IL-8、白血病抑制因子)和蛋白酶(包括胶原酶、中性金属蛋白酶)。TNF-α也可诱导内皮黏附分子的表达，这些分子导致白细胞和淋巴细胞通过血管壁，向炎症部位聚集，导致许多炎症反应的迁延不愈(Emergingtherapies for rheumatoid arthritis.1998，24(3)：579-591.)。研究表明，TNF-α在多种自身免疫性疾病的发生和发展过程中起了重要的作用(Immunology.1998，10：423-434.)。抑制TNF-α，可能有助于某些相关疾病的治疗。TNF-α在体内主要有两种受体与之结合，介导其生物学活性：TNF受体I(TNF receptor I，TNFRI)和TNF受体II(TNF receptorII，TNFRII)。在某些因素的作用下，TNF受体的N端可从细胞膜上被酶解下来，成为可溶型的TNF受体(soluble TNFR，sTNFR)(Biochemistry.1993；32：3131-3138.)。sTNFR可以与TNF-α结合，从而抑制TNF-α与细胞膜上的TNFR结合，从而阻断其生物活性，可望用于各种TNF-α相关的疾病的治疗。但是单价的sTNFR与TNF-α的结合力较弱。

抗体的Fc片段，由两条相同的肽链，通过绞链区的链间二硫键连接而成的二聚体，它通常包括重链的C_H2和C_H3两个结构域，sTNFR与抗体Fc片段融合后，可望通过Fc片段中肽链间的二硫键形成二聚体，从而提高与TNF-α的结合力。因而sTNFR/Fc融合蛋白具有广泛的用途，但是，sTNFR/Fc是一个糖蛋白，含有多对分子内和分子间二硫键，原核表达系统表达产物没有活性。哺乳动物细胞虽然可以表达具有生物活性的sTNFR/Fc融合蛋白，但哺乳动物细胞具有生长缓慢、培养成本高、大规模培养困难等问题。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是：提供一种sTNFR/Fc融合蛋白及其编码基因。

本发明要解决的第二个技术问题是：提供酵母制备肿瘤坏死因子可溶型受体和抗体IgG Fc片段的融合蛋白(简写为sTNFR/Fc)的方法。

本发明要解决的第三个技术问题是：提供sTNFR/Fc融合蛋白的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

sTNFR/Fc融合蛋白，其具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.1同源性大于90％的氨基酸序列，采用以下方法制备：

(1)培养含编码该融合蛋白的基因的酵母；

(2)从培养物中纯化制备该融合蛋白。

本发明采用酵母体系表达sTNFR/Fc融合蛋白，具有天然的糖基化位点，利于在人体使用。

编码SEQ ID No.1所示sTNFR/Fc融合蛋白的基因序列，该序列具有序列表SEQID No.2或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。其中序列3为通过人工合成的优化的基因序列，用该序列可以在酵母中获得更高的sTNFR/Fc融合蛋白表达。

人体中有两种肿瘤坏死因子受体分别称为TNF受体I(TNF receptor I，TNFRI)和TNF受体II(TNF receptor II，TNFRII)。各种哺乳动物的肿瘤坏死因子受体具有较高的同源性。在某些因素的作用下，这些受体的N端可从细胞膜上被酶解下来，成为可溶性的TNF受体(soluble TNFR，sTNFR)(Biochemistry.1993；32：3131-3138.)。本发明的肿瘤坏死因子可溶型受体包括上述各种可溶型受体及其同源性大于90％的类似物。

抗体IgG为典型的单体Ig，木瓜蛋白酶(papain)可以将IgG裂解为三部分：两个Fab片段和一个Fc片段；Fc片段包括C_H2和C_H3两个结构域(免疫生物学.哈尔滨：哈尔滨出版社，1996.10.)。Fc片段具有多种生物功能，如可以结合C1q和甘露糖结合蛋白(mannose binding protein，MBP，结构与C1q相似)，由此激活补体反应；可以结合细胞上的Fcγ受体等，各种哺乳动物的Fc具有较高同源性。抗体IgG有多种亚型，如IgG1、IgG2、IgG3等，本发明的抗体IgG Fc包括上述各种抗体IgG Fc，及其同源性大于90％的类似物，优选的为抗体IgG1的Fc片段。

编码上述可溶型受体和抗体IgG的Fc片段的核酸序列，及其氨基酸序列均可以从公开的美国国立卫生研究所医学图书馆的数据库(pubMed)中获得。

编码上述TNF可溶型受体和抗体IgG的Fc片段的核酸多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR(Saiki等Science.239：487-491，1988)、RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得，用作RT-PCR模板或用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞、及文库等，如从LPS激活的外周血淋巴细胞中获得。也可以用人工合成的方法获得，人工合成时可通过选用宿主偏爱的密码子，优化mRNA二级结构等方法，获得适合于上述蛋白在酵母中高表达的基因。若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其它多聚核苷酸连接等。编码TNF可溶型受体和编码抗体IgG的Fc的多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过重叠PCR的方法。如果需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。本发明公开了一种人肿瘤坏死因子可溶型受体II和人抗体IgG 1Fc片段的融合蛋白(序列1)，及编码该融合蛋白的核酸序列(序列2，3)，其中序列3为通过人工合成的优化的序列，用该序列可以在酵母中获得更高的sTNFR/Fc融合蛋白表达

一种在酵母中高效表达权利要求1所述的sTNFR/Fc融合蛋白的方法，其特征在于：包括(1)培养含编码该融合蛋白的基因的酵母；(2)从培养物中纯化制备该融合蛋白。

所述酵母选自甲醇营养型酵母或其改构体和乳酸克鲁维酵母或其改构体中的一种。

所述甲醇营养型酵母为毕赤酵母或其改构体。其中毕赤酵母改构体为编号CGMCCNo.1853的GJK0601菌株。

α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株CGMCC No.1853，其编码区被选择性标记ADE基因所取代，且两侧没有大于20bp的同源序列，因而菌株稳定。该菌株用于表达外源糖蛋白时，与野生型毕赤酵母不同，其产物不会被过度甘露糖化，因而在生物制药领域具有广泛的应用前景。该菌株还可用于进一步的糖基工程改造，获得具有杂合型和复杂型N-糖基合成能力的菌株。这些菌株可广泛用于各种糖蛋白的生产。

毕赤酵母菌株CGMCC No.1853在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏日为2006年10月30日，保藏号为CGMCC No.1853，参据的微生物株为GJK0601，建议的分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。

表达融合蛋白的宿主可以是各种酵母，如甲醇营养酵母、克鲁维酵母、酿酒酵母等，其中甲醇营养酵母可以是毕赤酵母、汉逊酵母等，克鲁维酵母可以是乳酸克鲁维酵母、脆璧克鲁维酵母等。表达融合蛋白的宿主还可以是上述各种酵母的变构体，这些变构体包括在酵母宿主菌中缺失一个或多个糖基合成酶、转移酶、蛋白酶等，或(及)表达一个或多个外源的糖基转移酶、糖苷酶的酵母。如各种甘露糖转移酶缺陷的变构体、表达各种复杂型糖基合成酶的变构体、各种蛋白酶缺陷的变构体等。sTNFR/Fc是一种糖蛋白，但酵母表达蛋白的糖基化修饰，常产生过度甘露糖化。用一些甘露糖转移酶，如α-1，6-甘露糖转移酶、α-1，3-甘露糖转移酶缺陷的酵母变构体，可以避免这个问题。用表达各种复杂型糖基合成酶的变构体则可以使表达的sTNFR/Fc上的糖基成为复杂型糖基。优选的包括本发明实施例3所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株(中国菌种保藏中心，保藏号CGMCC NO1853)，及在该菌株中进一步缺失和表达各种糖基修饰酶获得的菌株。酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物易于培养、培养成本低廉、繁殖快、便于大规模培养和高密度发酵等特性，同时又具有真核生物的糖链加工系统，还能将外源蛋白分泌到培养液中，利于纯化。

融合蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，可以为碱性磷酸酶信号肽、酵母α交配因子信号肽等，优选的是用酵母α交配因子信号肽。融合蛋白也可以不用信号肽，而在酵母中以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。

表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如毕赤酵母表达载体pHIL-D₂，pPIC9，pHIL-S₁(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)。

乳酸克鲁维酵母表达载体pLACl(NEB)，酿酒酵母表达载体pYES2(InvitrogenCorp.San Diego.California.USA)。

转化各种DNA构建体至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。或者，细胞培养上清中或细胞破碎液中的蛋白可用抗IgGFc的抗体的ELISA或Western分析鉴定。

培养含有本发明DNA构建体的重组酵母可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可以用一阶段培养，即菌体生长的同时，合成融合蛋白。也可以分两个阶段，第一阶段主要用于菌体的生长，第二阶段主要用于融合蛋白合成。

所述纯化制备该融合蛋白的方法为液相层析，优选蛋白A亲和液相层析。

可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

sTNFR/Fc融合蛋白用于制备检测或治疗与肿瘤坏死因子-α相关疾病的药物的用途。例如：本发明制备的sTNFR/Fc融合蛋白可用于TNF-α的检测，TNF-α活性的阻断，及与TNF-α有关的各种疾病，如类风湿性关节炎、浓毒症等的治疗。

本发明中的sTNFR/Fc融合蛋白及其衍生物可单独使用，优选的为与一个或多个药学上可接受的载体一起组成药物制剂。药物载体一般应与融合蛋白相容且不能对受体自身有害，典型的载体为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸。药物制剂可以单位剂量的形式存在，并可通过任何本领域已知的方法制备。这些方法包括将融合蛋白与具有一种或多种辅助成分混合的步骤。优选的药物制剂包括含水的液体制剂和含水量低于10％或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子糖类等，使药物的渗透性与受体血液中的渗透性相等或相似。药物制剂可存在于单元剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管中。冻干制剂是将液体制剂冷冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射用水。

优选的单元剂量包括有融合蛋白的日用剂量或单元日用剂量或其适当的亚分。单元日用剂量优选的为10-100mg/人。

本发明中的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、静脉输注、透皮、吸入、口服等方法给药。优选的方法为静脉输注或注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。

发明的优点是：本发明公开了一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白，及其纯化的方法。酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物易于培养、培养成本低廉、繁殖快、便于大规模培养和高密度发酵等特性，同时又具有真核生物的糖链加工系统，还能将外源蛋白分泌到培养液中，利于纯化。因而具有良好的应用前景。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为pPIC9-sTNFRII-IgGFc1的构建示意图。

图2为sTNFRII/Fc在毕赤酵母菌中的高效表达：pPIC9-sTNFRII-IgGFc1表达载体电转至毕赤酵母感受态细胞中并筛选阳性转化子。将ELISA筛选阳性的重组酵母接种于装有500mL BMGY的2L摇瓶中培养。摇瓶诱导培养72h时，ELISA测定不同诱导时间上清中sTNFRII-IgGFc1融合蛋白的表达量。诱导培养72h时，ELISA测定上清中pPIC9-sTNFRII-IgGFc1融合蛋白的表达量为2mg/L。

图3为pPIC9-sTNFRII-IgGFc2的酶切鉴定：对PCR鉴定阳性的克隆抽提质粒，然后将得到的质粒进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定。酶切反应后的产物直接经0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下可见两条带，质粒中插入约1.4kb大小的片段，与嵌合体基因的大小一致。1：分子量标准，自上而下分别为15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp

2：重组质粒pPIC9-sTNFRII-IgGFc2的EcoRI/XhoI双酶切。

图4为优化的人sTNFRII/Fc基因在毕赤酵母菌中的高效表达；将ELISA筛选阳性的工程菌株接种于接种于5L发酵罐中，24h后开始诱导，诱导96h后收菌。ELISA测定不同诱导时间上清中sTNFRII-IgGFc2融合蛋白的表达量。诱导培养96h时，ELISA测定上清中sTNFRII-IgGFc2融合蛋白的表达量为240mg/L。

图5为sTNFRII/Fc融合蛋白在α-1，6-甘露糖转移酶缺失的酵母中表达：取转入融合蛋白sTNFRII/Fc2的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的菌株和野生型菌株GS115的表达上清进行SDS-PAGE，野生型菌株GS115在分子量在66kD与80kD之间，而敲除了α-1，6-甘露糖转移酶的菌株的分子量明显低于野生型菌株GS115，在66KD处有的表达，说明其过度糖基化程度得到了明显的改善。1：α-1，6-甘露糖转移酶缺失菌株的表达上清；2：野生型菌株GS115表达上清；3：分子量标准，自上而下分别为97，66，45KD。

图6为pKLACl-sTNFRII-IgGFc的构建示意图。

图7为sTNFRII/Fc在K·lactis中的高效表达：将ELISA筛选阳性的工程菌株接种于接种于5L发酵罐中，诱导96h后收菌。ELISA测定不同诱导时间上清中sTNFRII-IgGFc2融合蛋白的表达量。诱导培养96h时，ELISA测定上清中sTNFRII-IgGFc2融合蛋白的表达量为200mg/L。

图8为制备的sTNFRII/Fc融合蛋白纯度分析：经Protein A亲和柱一次纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白进行10％SDS-PAGE，经考马斯亮蓝染色，结果如下图7所示：泳道1为还原的目的蛋白条带，泳道2为非还原的目的蛋白条带。从蛋白条带的位置来看，还原的融合蛋白大小在66kD与80kD之间，而非还原的融合蛋白大小小于116kD，说明该融合蛋白为通过分子间二硫键连接形成的二聚体。1：还原的目的蛋白2：非还原的目的蛋白；3：蛋白中分子量标准。

图9为sTNFRII/Fc融合蛋白抑制TNF-α细胞毒的活性分析：用10％胎牛血清的1640培养基(含2μg/mL放线菌素D)稀释TNF-α至终浓度为50U/mL，然后在96孔板上依次进行融合蛋白样品的梯度稀释，观察融合蛋白抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用。如图8所示，随着融合蛋白浓度的提高，OD₅₇₀呈明显上升趋势，说明融合蛋白能够抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用。

具体实施方式

实施例1：人sTNFRII/Fc在毕赤酵母菌中的高效表达

一.表达载体的构建

取健康人的酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝静脉血，Hanks液稀释后，用淋巴细胞分离液离心获得淋巴细胞，用含10％胎牛血清的(Hyclone公司)的1640培养基(GIBCO)调细胞数为5×10⁶个/mL，置于细胞培养箱温育2h后换用含酯多糖(LPS，20μg/mL)(Sigma)和10％胎牛血清的1640的新鲜培养基，继续培养5h后离心富集细胞；TRIzol(上海生工生物工程技术服务有限公司)法提取总RNA(按照TRIzol说明书进行操作)；总RNA经RT-PCR后得到cDNA(按照RT-PCR试剂盒说明进行操作，)，然后以之为模板，利用引物N1/C1，N2/C2，pfu聚合酶(TaKaRa)PCR分别钓取sTNFRII和IgGFc。然后利用引物N1和L2(引物序列分别为5’-ATCTCGAGAAAAGAGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCAT-3’(SEQ ID No.4)5’-AGTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGC-3’(SEQ IDNo.5))进行PCR反应，使sTNFRII的C端带上含有IgGFc的N端部分的序列。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，循环30次；最后72℃延伸10min；同样利用引物L1和C2(引物序列分别为5’-GCTGAAGGGAGCACTGGCGACGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT-3’(SEQID No.6)和5’-ACGAATTCTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQ ID No.7)使IgGFc的N端带上含有sTNFRII的C端部分的序列。PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，循环30次；最后72℃延伸10min；将得到的两个基因片段通过重叠延伸PCR的方法进行体外拼接，以带有接头的两个基因片段为模板，N1和C2为引物，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，循环30次；最后72℃延伸10min。获得嵌合体基因后将其进行XhoI/EcoRI(本试验所用的限制性内切酶均购自宝生物工程有限公司，大连)双酶切，酶切后的嵌合体基因插入同样双酶切处理的质粒pPIC9(购自Invitrogen Corp.USA)中，构建成巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9-sTNFRII-IgGFc1(简写为pPIC9-TF，图1)，测序结果与序列2相同。

二.融合蛋白在毕赤酵母GS115中的表达

将测序正确的pPIC9-TF载体用StuI内切酶线性化后，用电转法将其转至毕赤酵母感受态细胞中，电转化的方法为本领域所共知的(如A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)，采用MD(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖，琼脂％1.5)平板进行筛选。接种转化子至YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中，30℃下以250rpm培养24h。以4％接种量接种于25mL BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，100mMpB，pH6.0)培养基中30℃、250rpm培养24h后开始0.05％甲醇适应性诱导，12h后进行0.5％甲醇诱导，其后每隔12h补加0.5％甲醇。诱导72h后离心获取上清，用ELISA筛选阳性克隆：上清用抗原包被液(0.15％Na₂CO₃，0.293％NaHCO₃，pH9.6)稀释至原来的1/625，然后各取100μL样品加入酶联板中，4℃包被过夜加入羊抗人IgG-HRP(1:500)(华美生物工程公司，洛阳)，每孔各加100μL显色液(1.84％Na₂HPO₄·12H₂O，0.5％柠檬酸，临用前再加0.04％OPD和0.15％H₂O₂)，37℃避光温育15min，最后每孔加20μL终止液(2M H₂SO₄)以终止显色，于492nm处比色。

将ELISA筛选阳性的重组酵母接种于装有500mL BMGY的2L摇瓶中培养，培养和诱导方法同克隆筛选。摇瓶诱导培养72h时，ELISA测定上清中sTNFRII-IgGFc融合蛋白的表达量为2mg/L(图2)。

实施例2：优化的人sTNFRII/Fc融合基因在毕赤酵母菌中的高效表达

一.基因优化和合成

在不改变氨基酸序列的前提下，通过用酵母偏爱密码子替代序列2中的密码子，并优化mRNA的二级结构，减少发卡结构，设计出序列3的DNA序列。为了合成该基因，我们采用分段合成，PCR拼接的方法。即先合成序列3的DNA正向片段，每段58bp，及其反向互补序列58bp/段，每条反向片段分别与正向序列前一段和后一段各有29bp互补。(上海生工生物工程技术服务有限公司)。所有DNA片段各取1pmol，混合，用引物1：ATCTCGAGAAAAGAGCTTTGCCAGCTCAAGTTGCTTTCA(SEQID No.8)和引物2：ACGAATTCTCTAGATCATTACTTACCTGGAGACAAAG(SEQID No.9)为正向和反向引物，PCR扩增拼接基因，PCR条件为：引物1，2各100pmol，10mmol/L的dNTP1μl，合成的DNA片段各取1pmol，10X反应缓冲液5μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有限公司产品)，加水到501μl。PCR条件为94℃变性30秒，52℃退火1分钟，72℃延伸120秒，循环40次。

PCR扩增产物回收后，用EcoR I和Xho I双酶切后与同样酶切的毕赤酵母表达质粒pPIC9(购自Invitrogen Corp.USA)连接，将所得连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自北京天根科技有限公司)，涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。37℃培养过夜。挑取生长的菌落，接种至3ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基，37℃培养过夜，质粒提取试剂盒(Promega SV Minipreps)抽提质粒，用EcoR I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析，发现1.4kb插入片段的为阳性克隆(图3)。取阳性克隆质粒，用AOX primer和AOX terminal primer(购自Invitrogen Corp.USA)引物测序。取正确插入序列3的克隆，命名为pPIC9-sTNFRII-IgGFc2。

二.融合蛋白在毕赤酵母GS115中的表达

质粒提取试剂盒(Promega SV Minipreps)抽提重组质粒，用Bgl II线性化，电转化制备好的GS115宿主菌，将其涂布到MD平板上。30℃培养3天，得到酵母转化子。按实施例1中方法筛选阳性转化子，将ELISA筛选阳性的工程菌株接种于BMGY培养基中30℃培养24小时后，作为种子接种于5L发酵罐中。发酵培养基也为BMGY培养基，发酵温度30℃，pH6.0，控制溶解氧不低于20％。菌体生长24小时后加入甲醇诱导表达，起始甲醇添加量控制为每升每小时1-2ml，随后逐渐增大为每升每小时5-10ml，通过调节搅拌速度和通气量保持溶氧值不低于20％。连续诱导培养96h后收获培养液，离心收集上清，按实施例1中ELISA方法得到融合蛋白表达量为240mg/L(图4)。

实施例3：在α-1，6-甘露糖转移酶缺失的酵母中高效表达sTNFRII/Fc融合蛋白

本例利用α-1，6-甘露糖转移酶(Ochlp)基因敲除后的Pichia pastoris GS115(中国菌种保藏中心，保藏号CGMCC NO.1853)表达系统表达TNF融合蛋白。用pPIC9作为表达载体。

将实施例2中构建的pPIC9-sTNFRII-IgGFc2质粒用Bgl II线性化，电转化制备好的α-1，6-甘露糖转移酶(Ochlp)基因敲除后的Pichiapastoris GS115宿主菌，将其涂布到MD平板上。30℃培养3天，得到酵母转化子。接种转化子至YPD培养基中，30℃下以250rpm培养24h。以4％接种量接种于25mL BMGY培养基中30℃、250rpm培养24h后开始0.05％甲醇适应性诱导，12h后进行0.5％甲醇诱导，其后每隔12h补加0.5％甲醇。诱导72h后离心获取上清，上清用羊抗人IgG-HRP进行ELISA，筛选阳性转化子。

将ELISA筛选阳性的重组酵母接种于装有500mL BMGY的2L摇瓶中培养，培养和诱导方法同克隆筛选。

取转入融合蛋白sTNFRII/Fc2的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的菌株和野生型菌株GS115的表达上清进行SDS-PAGE，蛋白质的SDS-PAGE电泳方法为本领域所共知的(如D.R.马歇克等，《蛋白质纯化与鉴定实验指南》，科学出版社，1999)。

由电泳结果可以看出，野生型菌株GS115在分子量在66kD与80kD之间，而敲除了α-1，6-甘露糖转移酶的菌株的分子量明显低于野生型菌株GS115，在66KD处有的表达，说明其过度糖基化程度得到了明显的改善(图5)。

实施例4：sTNFRII/Fc在K·lactis中的高效表达

一.筛选酵母转化子

用Not I和Xho I切开表达载体pKLACl，与经Not I和Xho I处理的融合蛋白基因片段连接，构建成克鲁维酵母分泌表达载体pKLACl-sTNFRII-IgGFc(图6)。将所得连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含有100μg/mlAmp的LB平板上。筛选转化子得到重组质粒，经菌落PCR鉴定，筛选转化子得到重组质粒。大量抽提重组质粒，用BstXI线性化，电转化制备好的K·lactis宿主菌，将其涂布到YCB平板上。30℃培养3天，得到酵母转化子。

二.制备融合蛋白

从YCB平板上挑取10个单菌落，接种到2mL YPD液体培养基中，30℃250rpm振摇培养24h。取1mL培养物转接到20mL YPGal培养基中(接种量5％)，30℃250rpm振摇诱导72h后，4℃7000rpm离心10min，收集上清。上清用羊抗人IgG-HRP进行ELISA(方法同实施例1)，筛选阳性转化子。将ELISA筛选阳性的工程菌株接种于BMGY培养基中30℃培养24小时后，作为种子接种于5L发酵罐中。发酵培养基也为BMGY培养基，发酵温度30℃，pH6.0，通过调节搅拌速度和通气量保持溶氧值不低于20％。连续诱导培养96h后收获培养液，离心收集上清，按实施例1中ELISA方法得到融合蛋白表达量为200mg/L(图7)。

实施例5：表达上清的柱纯化与活性分析

一.表达上清的柱纯化

将培养的菌液经离心获得的上清调pH至7.0后，用HiTrap rProteinA FF亲合柱进行纯化：层析柱先用20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡，以1mL/min的流速上样，上样结束后，先用5倍柱体积的20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液洗柱，然后再用0.1M柠檬酸溶液(pH3.0)进行洗脱，洗脱液pH值用1M Tris-HCl(pH9.0)调至中性。纯化后的蛋白浓度采用Bradford蛋白定量试剂盒进行测定，测得纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白浓度约为0.1mg/mL。

经Protein A亲和柱一次纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白进行10％SDS-PAGE，蛋白质的SDS-PAGE方法为本领域所共知的(如D.R.马歇克等，《蛋白质纯化与鉴定实验指南》，科学出版社，1999)。经考马斯亮蓝染色，结果如下图7所示：泳道1为还原的目的蛋白条带，泳道2为非还原的目的蛋白条带。从蛋白条带的位置来看，还原的融合蛋白大小在66kD与80kD之间，而非还原的融合蛋白大小小于116kD，说明该融合蛋白为通过分子间二硫键连接形成的二聚体。SDS-PAGE纯度扫描分析结果(图8)，纯度达90％左右。

二.融合蛋白抑制TNF-α细胞毒的活性分析

将生长良好的L929细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)用含10％胎牛血清的1640培养基稀释至2×10⁵/Ml，每孔加入100μL细胞悬液，放置于37℃、5％CO₂水汽饱和的细胞培养箱中培养24h。

用10％胎牛血清的1640培养基(含2μg/mL放线菌素D)稀释TNF-α至终浓度为50U/mL，然后在96孔板上依次进行融合蛋白样品的梯度稀释，起始为原液浓度的1/10，然后依次进行1/4稀释。吸弃96孔板中的细胞培养上清，将上述配制好的梯度样品转移至96孔板，继续培养24h，培养时间以阳性对照细胞基本死亡为准；每孔加入20μL MTT，在酶联免疫检测仪上570nm处测定各孔光吸收度值，记录结果。纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白能较好的抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用，经计算，纯化后的融合蛋白抑制50U/mL TNF-α的EC₅₀约为170ng/mL(图9)。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法及其应用

<130>

<160>9

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>468

<212>PRT

<213>人属，人种

<400>1

<210>2

<211>1407

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>2

<210>3

<211>1407

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

<210>5

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

<210>6

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

<210>9

<211>37

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

Claims (3)

1.一种用于表达sTNFR/Fc融合蛋白的酵母，其特征在于，所述酵母为α-1，6-甘露糖转移酶基因敲除后的毕赤酵母改构体，其保藏编号为CGMCC NO.1853。

2.一种在权利要求1所述的酵母中表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法，其特征在于：包括

(1)培养含编码该融合蛋白的基因的酵母，所述sTNFR/Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，并且由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列编码；

(2)从培养物中纯化制备该融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种在权利要求1所述的酵母中表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法，其特征在于：所述纯化制备该融合蛋白的方法为液相层析，所述液相层析为蛋白A亲和液相层析。

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