CN103898151A - 含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法 - Google Patents

含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103898151A
CN103898151A CN201210587375.3A CN201210587375A CN103898151A CN 103898151 A CN103898151 A CN 103898151A CN 201210587375 A CN201210587375 A CN 201210587375A CN 103898151 A CN103898151 A CN 103898151A
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression vector
carrier
expression
pmd18t
fusion protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201210587375.3A
Other languages
English (en)
Inventor
万晓春
吕卫东
于广
邓宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to CN201210587375.3A priority Critical patent/CN103898151A/zh
Publication of CN103898151A publication Critical patent/CN103898151A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法，步骤如下：制备Fc基因片段；将所得的Fc基因片段连接到pMD18-T载体中，得连接产物pMD18T-Fc；构建表达载体：将所得的连接产物pMD18T-Fc和表达载体pCDNA3.1经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc。本发明制得含Fc端融合蛋白的真核表达载体，可直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体中，快速、高效的表达含Fc端的融合蛋白。

Description

含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种真核表达载体及其构建方法，特别涉及一种含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法。
背景技术
抗体的Fc端负责抗体的效应功能,如激活补体、结合Fc受体、穿越胎盘等。Fc融合蛋白主要是将生物活性蛋白与IgG的绞链区及CH2、CH3区结合。Fc融合蛋白具有如下特征:（1）通过与抗IgG或蛋白A结合用于检测或纯化；（2）通过该蛋白分子与其配体的相互作用将Fc段的生物学效应引到特定目标，如ADCC、固定补体及免疫调节作用等；（3）增加该蛋白在血液中的半衰期，利于重组蛋白作为治疗药物在临床中的实际应用；（4）IgG、IgM和IgA的Fc结构域可形成多聚合分子，使重组蛋白具有更强的抗原结合力。
目前常用的表达载体中未含有Fc端融合蛋白的基因，在表达该类蛋白时需要自己构建，而现有技术方案是将生物活性蛋白的基因与Fc段基因通过重叠PCR连接好后，再构建到表达载体中，比较费时，费力。
发明内容
基于此，针对现有技术表达载体中未含有Fc端融合蛋白的基因，构建含有Fc的表达载体时，费时费力的问题，本发明提供含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法。
解决上述技术问题的具体技术方案如下：
一种含Fc融合蛋白的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：
（1）制备Fc基因片段，所述Fc基因片段碱基组成如SEQ ID NO.3所示；
（2）将步骤（1）所得的Fc基因片段连接到pMD18-T载体中，得连接产物pMD18T-Fc；
（3）构建表达载体：将步骤（2）所得的连接产物pMD18T-Fc和表达载体pCDNA3.1经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc。
在其中一些实施例中，步骤（1）所述的Fc基因片段的制备方法为：以人IgG1的重链恒定区为模板，用引物扩增，得Fc基因片段。
在其中一些实施例中，所述的引物为：
上游引物：GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，
下游引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
在其中一些实施例中，步骤（2）所述的连接为：于21-23℃连接0.9-1.1h。
根据上述构建方法制得一种含Fc融合蛋白的真核表达载体。
本发明一种含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法具有以下优点和有益效果：
本发明的构建方法，可快速、高效的表达含Fc端的融合蛋白，利用该方法得到的含Fc端融合蛋白的真核表达载体，可直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体中，显著改善的非Ig蛋白药物动力学特性。
附图说明
图1为人IgG1Fc基因的PCR扩增结果示意图；
图2为所制备的载体pCDNA3.1-Fc构建示意图；
图3为pCDNA3.1-Fc琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例
本发明通过将IgG1的绞链区及CH2、CH3区即Fc段，构建到真核表达pCDNA3.1中，获得一种含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法，该构建方法可快速、高效的表达含Fc端的融合蛋白。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂或者试剂盒，均为市售产品。
其中，质粒H：暨南大学邓宁教授惠赠PMD18T-PLCH；
所用培养基的配方如下：
LB培养基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，溶于100mL去离子水中，高压蒸气灭菌。
含Amp的LB琼脂平板培养基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，1.5g琼脂条溶于100mL去离子水中，高压蒸气灭菌，灭菌完成后待温度降为50℃是加入Amp，使终浓度为50μg/mL。
含Zeocin的LB固体平板培养基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，1.5g琼脂条溶于100mL去离子水中，高压蒸气灭菌，灭菌完成后待温度降为50℃是加入Zeocin，使终浓度为25μg/mL。
以下将结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1
1.制备Fc基因片段：
以人IgG1的重链恒定区为模板，用引物人扩增，得Fc基因片段；
其中，所述的引物为：
SEQ ID NO.1
上游引物：GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，
SEQ ID NO.2
下游引物：GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
（PCR扩增结果参见图1，其中M为DNA Marker;1为Fc基因片段）
其中，Fc基因片段的碱基组成为：
SEQ ID NO.3
GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。
具体扩增体系如下（所用dNTP Mixture、Taq均购自日本宝生物工程株式会社TaKaRa Bio Inc）：
PCR反应体系
PCR reaction system
Figure BDA00002676631500051
PCR扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后,72℃延伸10min。取5μL反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后，胶回收PCR产物，得Fc基因片段，其碱基组成如SEQ IDNO.3。
2、获得连接产物pMD18T-Fc
①将步骤（1）扩增得到的Fc基因片段连接到pMD18-T载体中，于22℃连接1h，得连接产物pMD18T-Fc（pMD18-T载体购自日本宝生物工程株式会社TaKaRa Bio Inc）；
连接反应体系如下：
连接体系
Ligase reaction system
Figure BDA00002676631500061
②连接产物pMD18T-Fc转化DH5α感受态细胞：
将上述所得的连接产物pMD18T-Fc转化DH5α感受态细胞中，并涂布到含有Amp的LB琼脂平板培养基进行培养，经过测序确定为正确表达序列；
具体步骤如下：
1)于30μLDH5α感受态细胞中加入2μL连接产物pMD18T-Fc，轻轻旋动以混匀，冰中放置30min；
2)42℃水浴热激90s；
3)迅速将管转移到冰浴中放置2min；
4)每管加入1mL LB培养基，于37℃，160rpm振荡培养1h；
5)取100μL涂布到含有Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板置于37℃放置1h后倒置平皿，于37℃培养过夜。
6)挑取阳性克隆于3mL含Amp的LB液体培养基中培养12h，克隆载体pMD18T-Fc利用OMEGA质粒小提试剂盒小量提取后进行酶切验证，酶切体系如下：
pMD18T-Fc载体酶切体系
pMD18T-Fc digestion system
pMD18T-Fc载体酶切体系
pMD18T-Fc digestion system
Figure BDA00002676631500071
7)37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定并将鉴定的阳性克隆送至上海生工测序。
3、构建表达载体：
①将步骤（2）所得的pMD18T-Fc和表达载体pCDNA3.1经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得连接产物pCDNA3.1-Fc，即含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc，构建示意图参见图2，（所用表达载体pCDNA3.1购自invitrogen公司）；
具体步骤如下：
1）将pMD18T-Fc连接至表达载体pCDNA3.1中,得含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc，连接反应体系如下：
连接反应
Ligase reaction system
Figure BDA00002676631500072
②连接产物pCDNA3.1-Fc转化DH5α感受态细胞：
将上述所得的连接产物pCDNA3.1-Fc转化DH5α感受态细胞，涂布于含Zeocin的LB固体平板培养基，经过测序确定为正确表达序列；
具体步骤如下：
1）将连接产物pCDNA3.1-Fc转化DH5α感受态细胞，涂布于含Zeocin的LB固体平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒并酶切鉴定，酶切体系如下：
pCDNA3.1-Fc载体酶切体系
The vector of pCDNA3.1-Fc digestion system
Figure BDA00002676631500081
2）37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定（电泳图参见图3，图中M为DNA Marker;1-3为pCDNA3.1-Fc双酶切鉴定）并将鉴定的阳性克隆进行测序，测得的含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc碱基组成如SEQ ID NO.4：GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCGGCCGCTCGAGAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure IDA00002676632300021
Figure IDA00002676632300031
Figure IDA00002676632300041
Figure IDA00002676632300051

Claims (5)

1.一种含Fc融合蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备Fc基因片段，所述Fc基因片段的碱基组成如SEQ ID NO.3所示；
（2）将步骤（1）所得的Fc基因片段连接到pMD18-T载体中，得连接产物pMD18T-Fc；
（3）构建表达载体：将步骤（2）所得的连接产物pMD18T-Fc和表达载体pCDNA3.1经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述的制备Fc基因片段的制备方法为：以人IgG1的重链恒定区为模板，用引物扩增，得Fc基因片段。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述引物为：
上游引物：GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，
下游引物：GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）所述的连接为：于21-23℃连接0.9-1.1h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法制得一种含Fc融合蛋白的真核表达载体。
CN201210587375.3A 2012-12-28 2012-12-28 含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法 Pending CN103898151A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210587375.3A CN103898151A (zh) 2012-12-28 2012-12-28 含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210587375.3A CN103898151A (zh) 2012-12-28 2012-12-28 含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103898151A true CN103898151A (zh) 2014-07-02

Family

ID=50989719

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210587375.3A Pending CN103898151A (zh) 2012-12-28 2012-12-28 含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103898151A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101311192A (zh) * 2007-05-21 2008-11-26 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101311192A (zh) * 2007-05-21 2008-11-26 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种在酵母中高效表达sTNFR/Fc融合蛋白的方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MICHAEL W. TRAXLMAYR ET AL.: "Integrin binding human antibody constant domains—Probing the C-terminal structural loops for grafting the RGD motif", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
叶祥忠 等: "TPO 模拟肽与人IgG1Fc 融合蛋白在毕赤酵母中的表达及活性鉴定", 《生物工程学报》 *
高士争 等: "抗脂肪细胞40000特异膜蛋白scFv-Fc融合抗体毕赤酵母表达载体的构建", 《中国兽医学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105061589B (zh) 一种重组人ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法
CN110117323B (zh) 一种可溶性人源角蛋白及其应用
CN104402975B (zh) 抗衰老短肽及其制备方法
CN103275223B (zh) 降钙素原抗体的制备方法
Kim et al. Construction of chimeric human epidermal growth factor containing short collagen-binding domain moieties for use as a wound tissue healing agent
CN102757974A (zh) 一种重组人表皮生长因子的新型制备方法
CN104328138A (zh) 基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒
CN110054687B (zh) 草鱼atg12多克隆抗体及其制备方法
CN108642073A (zh) 一种梨PbrRALF2蛋白质的体外表达及其多克隆抗体的制备方法
CN107033245A (zh) 一种鸡caspase‑1多克隆抗体的制备方法和用途
CN106632643A (zh) 一种中华鲟vtg蛋白抗原及抗体及制备方法和应用
CN108070606A (zh) 利用分子伴侣prsA构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
CN103898151A (zh) 含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法
Mi et al. Stability improvement of human collagen α1 (I) chain using insulin as a fusion partner
CN107226846A (zh) 新型透明质酸结合肽及透皮吸收与皮下靶向释放制剂
Chen et al. Clostridium thermocellum nitrilase expression and surface display on Bacillus subtilis spores
CN106754647B (zh) 一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法
CN110256562A (zh) Pd-1纳米抗体、制备方法及其应用
CN102660550B (zh) 基因重组人胸腺素β4的制备方法
CN103898154A (zh) 含Fc融合蛋白的酵母表达载体及其构建方法
CN109777807A (zh) 一种在线粒体中定位表达外源蛋白的方法
CN107881181A (zh) 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
CN104892769B (zh) 一种溶血素融合蛋白PeLa‑EK‑10His‑SLO及其表达质粒与应用
CN104672333A (zh) 一种人源ctla4融合蛋白及其制备方法和应用
CN108165539A (zh) 一种梨S7-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140702