CN102757974A - 一种重组人表皮生长因子的新型制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种方法简单、价格低廉的Ssp内含肽系统介导重组人表皮生长因子的制备方法，该方法利用液相切割和离子交换层析代替传统的柱上切割和几丁质亲和层析。采用液相切割代替了传统Ssp内含肽系统介导的蛋白纯化方法中所用的柱上切割，降低了由于融合蛋白自动裂解造成的目的蛋白的损失；采用离子交换层析替代了昂贵的几丁质亲和层析，大幅度的降低了重组人表皮生长因子的纯化成本，简化了操作步骤，克服了大规模工业化生产重组人表皮生长因子的瓶颈。

Description

一种重组人表皮生长因子的新型制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种Ssp内含肽系统介导的重组人表皮细胞生长因子的新型制备方法。

背景技术

人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)是由53个氨基酸组成的的小分子多肽，分子量6.2KD左右，等电点4.2-4.6，对热稳定，耐胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的消化。该分子中含有六个半胱氨酸，在半胱氨酸6-20、14-31、33-42之间形成三个二硫键，从而分别形成三个环，这些环状结构使得hEGF对蛋白酶具有较高的稳定性。

人表皮生长因子是一种强有力的细胞分裂促进因子，它能够刺激表皮、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和毛细血管生长，因此用于可用于治疗皮肤烧伤、外科伤口的愈合，以及外伤性角膜溃疡、角膜损伤、化学试剂灼伤角膜以及角膜移植；hEGF能够抑制胃酸分泌，增加细胞内DNA、RNA和蛋白质合成量，促进胃肠上皮细胞生长，从而促进胃溃疡、十二指肠溃疡愈合。

hEGF在化妆品中具有促进皮肤组织细胞增殖与生长，使新生年轻细胞迅速代替衰老或死亡细胞，从而降低构成细胞的平均年龄，达到美白、抗衰老和增加皮肤弹性和光泽的作用，因此作为化妆品原料添加于化妆品中对肌肤有修复、调养、祛痘等功能。hEGF作为添加剂还可以添加到牙齿护理剂、牙膏、洗发水以及饲料添加剂中。

目前hEGF生产有三种方法，①化学合成：1988年Marchi等人首先完成了EGF的全合成，由于hEGF分子中二硫键及其他多种官能团的存在，因而合成的产物纯度及产率都无法满足工业化生产要求；②生物来源提取：主要从人尿液中分离回收，天然来源中hEGF浓度低，一般小于1ug/L左右，因而分离提纯效率低；③基因工程技术：hEGF的生产目前重点在基因工程技术的研究。

利用基因工程方法独立表达hEGF非常困难，因为hEGF是小分子多肽，分子量仅为6.2KD左右，且含有3对二硫键，在细菌胞质中很难单独形成包涵体，表达产物在胞内的堆积会造成蛋白酶的攻击而发生降解。目前多采用分泌表达载体或融合表达载体实现hEGF在细胞中的高水平表达。分泌表达载体表达的发酵液中hEGF初始浓度较高，但是发酵后获得的发酵液体系大，纯化工艺复杂，通常需要3-6步层析操作才能够获得纯度较高的rhEGF，收率仅为20％左右；胞内融合表达rhEGF是在目的蛋白之前或之后加入特定的亲和标签，如His、Gst等，形成融合蛋白，这些亲和标签能够通过亲和层析获得纯化的融合蛋白。由于融合蛋白中含有亲和标签，所以需要蛋白酶将亲和标签从融合蛋白中移除下来，从而获得纯化的目的蛋白。但是所需要的蛋白酶不仅价格昂贵，而且带来了另外的问题：①需要将目的蛋白从亲和标签、融合蛋白以及蛋白酶中分离出来，增加了纯化的步骤，降低了目的蛋白的收率；②目的蛋白上可能存在蛋白酶的敏感位点，造成错误切割，降低得率。

采用自切割内含肽介导的蛋白表达纯化方法可以克服以上缺陷。已有商品化的自切割亲和纯化系统主要有New England Biolabs(NEB)公司的IMPACT、IMPACT-CN及IMPACT-TWIN等系统，该系统中的pTWIN1、pTWIN2等表达载体首先将编码亲和标签、内含肽以及目标蛋白的基因序列连接在一起，在合适的宿主系统中表达出一个标签-内含肽-目标蛋白的三联体，再采用几丁质亲和纯化及柱上切割的方式在某些理化因素作用下(如pH、温度的变化或者巯基化合物的加入)，在亲和层析柱上发生自切割纯化出目标蛋白。Roman S.Esipov等人利用几丁质亲和层析纯化对rhEGF进行纯化，1L发酵培养基中可纯化获得17mg目的蛋白(Productiom of recombinant human epidermal growth factor usingSsp dnaB mini-intein system，2008，61：1-6.)。该纯化方法采用的几丁质珠填料价格高昂，100ml填料2790元，且该填料仅能重复使用3-5次，对扩大化生产应用是一个很大的限制。另外，柱上切割会导致目的蛋白的损失，试验中发现采用NEB公司的pTWIN1和pTWIN2载体表达蛋白的过程中，目的蛋白与内含肽之间存在自动裂解或不能控制性的裂解，柱上切割之前就有目的蛋白的损失，从而导致获得的蛋白质产量较低。因此，找到替代几丁质珠亲和层析和柱上切割法纯化内含肽介导的重组人表皮生长因子是Ssp内含肽介导的纯化技术能否扩大化生产重组人表皮生长因子的关键。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种方法简单、价格低廉的利用液相切割和离子交换层析纯化Ssp内含肽介导的重组人表皮生长因子的方法，该方法成本低、工艺条件简单。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

1)将hEGF、内含肽和几丁质结合域融合表达，表达载体为pTWIN1或pTWIN2，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)或ER2566，连接顺序为几丁质结合域-内含肽-hEGF。

2)将表达融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心获得沉淀，融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，包涵体经洗涤、溶解、复性后，通过液相切割诱导内含肽自切割位点释放hEGF蛋白，再通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析纯化获得纯度大于97％的不含有多余氨基酸的hEGF蛋白。

所述的人表皮生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实现上述新型人表皮生长因子的纯化方法，包括以下步骤：

1)构建包含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的重组原核表达载体pTWIN1-rhEGF；

2)将构建好的重组表达载体转染宿主细胞BL21(DE3)或ER2566，在含有氨苄西林的LB平板上筛选出阳性克隆的重组细胞，并对其进行增殖培养；当菌液浓度A600为0.3～0.6时，用终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG诱导3～5h，离心收集重组细胞。

3)人表皮生长因子的纯化：

①包涵体复性及重组人表皮生长因子的切割

将重组细胞裂解后离心分离得到沉淀，将其溶解于含有8M尿素的包涵体溶解液中，4℃溶解过夜，离心保留上清得到融合蛋白的包涵体溶解上清；

包涵体溶解上清在含有10-50mmol/L Tris或Na-HEPES或Na-Phosphate的复性缓冲液中进行透析复性，在复性过程中通过降低缓冲液pH值，实现hEGF与Ssp内含肽-几丁质结合域的有效切割，获得hEGF和Ssp-CBD的切割混合物。

②硫酸铵分级沉淀去除杂蛋白

采用较低饱和浓度的硫酸铵(10％-40％)沉淀切割混合物以去除杂蛋白，最后采用较高饱和浓度硫酸铵(60％-80％)沉淀目的蛋白，并将沉淀获得的目的蛋白溶解于双蒸水中，透析去除盐离子。

③阴离子交换层析纯化重组人表皮生长因子

样品经过阴离子交换层析进行进一步纯化，洗脱缓冲液1进一步去除杂蛋白，洗脱缓冲液1为含有10-50mM NaCl的10-50mmol/L Tris或Na-HEPES或Na-Phosphate缓冲液，洗脱缓冲液2洗脱rhEGF蛋白，洗脱缓冲液2为100-500mM NaCl的10-50mmol/L Tris或Na-HEPES或Na-Phosphate缓冲液，洗脱缓冲液1和2的pH为6.0-10.0。

④重组人表皮生长因子收率

采用本发明所公开的重组人表皮生长因子的制备方法，12L发酵液收获纯度大于97％的rhEGF冻干粉4.1g。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.本发明构建的重组人表皮生长因子的原核表达载体，将rhEGF与原核表达载体中的Ssp内含肽与CBD几丁质结合域融合表达，克服了人表皮生长因子独立表达困难的问题，并且提高了rhEGF的表达量(＞30％)。

2.将hEGF的N端与内含肽Ssp DnaB的C端融合表达，通过内含肽SspDnaB的自切割作用获得不含有多余氨基酸的rhEGF蛋白，解决了N端多余氨基酸对其活性的影响；

3.传统胞内融合表达hEGF，需要经过蛋白酶的水解作用移除亲和标签才能够得到纯化的rhEGF，蛋白酶本身较高的价格以及纯化后期还需要清除蛋白酶会增加纯化成本，延长纯化周期，降低得率。本发明利用内含肽Ssp DnaB的自切割作用克服了使用蛋白酶的局限性，简化了纯化步骤，降低了纯化成本。

4.本发明提供的重组人表皮生长因子的新型制备方法，采用液相切割代替了传统Ssp内含肽介导的蛋白纯化方法中所用的柱上切割，降低了由于融合蛋白自动裂解造成的目的蛋白的损失；

5.采用阴离子交换层析替代了昂贵的几丁质亲和层析，避免了几丁质亲和层析在纯化过程中的应用(Esipov，R.S.，V.N.Stepanenko，et al，Production ofrecombinant human epidermal growth factor using Ssp dnaB mini-intein system.Protein Expr Purif，2008，61(1)：1-6.)，大幅度的降低了重组人表皮生长因子的纯化成本，简化了操作步骤，克服了大规模工业化生产内含肽介导的重组人表皮生长因子的瓶颈；采用该重组人表皮生长因子的新型制备方法较Sharma K等人生产工艺获得的产量提高53％(Sharma，K.，P.V.Babu，et al，Recombinanthuman epidermal growth factor inclusion body solubilization and refolding at largescale using expanded-bed adsorption chromatography from Escherichia coli.Protein Expr Purif，2008，60(1)：7-14.)。

附图说明

图1重组表达质粒pTWIN1-rhEGF酶切鉴定结果图；

图2pTWIN1-rhEGF质粒结构图；

图3诱导表达的pTWIN1-rhEGF/BL21的SDS-PAGE分析结果图；

图4rhEGF纯化结果图；

图5rhEGF鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细描述：

1.人表皮生长因子表达载体的构建

根据人表皮生长因子基因序列设计引物，上游引物5’GGTTGCTCTTCCAACAATAGCGACTCTGAATGT 3’下游引物5’GGTCTGCAGTTAGCGCAGTTCCCACCACTT 3’，上游引物包含Sap I酶切位点，下游引物包含Pst I酶切位点。以本实验室构建的重组质粒PET-CecropinB-rhEGF为模板，PCR扩增hEGF基因序列，反应体系为：模板1μl，上下游引物各0.5μl，10×Bμffer 5μl，dNTP 4μl，Taq酶1μl，ddH2O补足50μl。反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。PCR产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果后进行切胶回收，回收产物、pTWIN1质粒分别用Sap I和Pst I双酶切，胶回收试剂盒分别回收载体大片段和rhEGF小片段，在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜，热休克法将连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α中，在含氨苄西林(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，PCR鉴定重组质粒，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增结果显示扩增条带与预期相符，PCR鉴定结果如图1所示。对其进行测序，测序结果显示所克隆的人表皮生长因子基因序列正确。提取的质粒转化于感受态细胞BL21(DE3)，在含氨苄西林(100μg/ml)的LB平板上进行筛选，阳性克隆命名为pTWIN1-rhEGF(见图2)。

2.工程菌的发酵

分别将保存的pTWIN1-rhEGF/BL21(DE3)甘油菌种划平板，37℃培养过夜，挑取单菌落于100mL含氨苄西林的种子液培养基，振荡培养至A600＝0.6左右，按20mL/L接种于含有种子液的摇瓶中，振荡培养至对数中期，作为发酵罐的种子液。

发酵采用GUJS-20全自动不锈钢发酵罐，装液量约为60％，加入少许消泡剂，2％将种子液接种于发酵罐中，发酵温度为37℃，初始溶氧设为35％，发酵过程中流加补料，对数后期时加入乳糖使终浓度达到1g/L进行诱导，12,000rpm离心收集菌体，15％SDS-PAGE鉴定表达情况，以未诱导的含pTWIN1-rhEGF质粒的重组菌作为对照，发酵pTWIN1-rhEGF/BL2116h，OD600为65，表达结果如图3所示，泳道M为蛋白质marker；泳道1为未经诱导的重组菌；泳道2，3为经IPTG诱导的pTWIN1-rhEGF重组菌；对比泳道1与泳道2、3，CBD-Ssp-rhEGF在30kD处有特异的蛋白表达条带，说明融合蛋白在宿主细胞中得到了有效的表达。

3.融合蛋白的裂解及包涵体的溶解

将诱导表达的pTWIN1-rhEGF/BL21(DE3)菌体用裂解缓冲液(10mmol/LTris，1mmol/L EDTA，pH8.5)悬浮，加入溶菌酶4℃裂解20min，再加入DNase、MgCl2及脱氧胆酸钠，充分搅拌，4℃，12,000r/min离心，15％SDS-PAGE检测融合蛋白在裂菌上清和沉淀中的表达情况，结果显示目的蛋白存在于裂菌沉淀中。裂菌沉淀溶解于溶解液(8mol/L脲，20mmol/L Tris)中，磁力搅拌1-3h，4℃溶解过夜。12,000r/min离心30min，弃沉淀保留上清得到包涵体溶解上清。

4.人表皮生长因子的复性、切割及纯化

包涵体溶解上清分步在复性缓冲液Buffer1(2mol/L脲，20mmol/L Tris)，复性缓冲液Buffer2(20mmol/L Tris)中进行透析复性，在复性过程中通过降低缓冲液pH值，在切割缓冲液Buffer3(20mmol/L Tris)中进行切割，使hEGF从CBD-Ssp-hEGF融合蛋白中切割下来，获得hEGF和CBD-Ssp蛋白的混合物。

20％硫酸铵沉淀切割混合物以去除杂蛋白，70％硫酸铵沉淀目的蛋白，并将沉淀获得的目的蛋白溶解于双蒸水中，透析去除盐离子。

透析上清中加入0.5M Tris-HCl使其终浓度为20mmol/L，离子交换层析进行纯化，洗脱缓冲液(20mmol/L Tris，100-500mmol/L NaCl，优选200mmol/LNaCl，pH8.0)洗脱rhEGF蛋白，纯度经HPLC测定，纯度大于97％，结果见图4(A为离子交换层析图；B为rhEGF纯化产物肽电泳图谱，泳道1为蛋白质marker，泳道2为pTWIN1-rhEGF/BL21(DE3)裂解沉淀，泳道3为70％硫酸铵沉淀，泳道4为离子交换层析纯化产物；C为HPLC测定图谱)。

5.重组人表皮生长因子鉴定

a.质谱分析：纯化产物的质谱结果显示rhEGF蛋白纯化产物分子量为6224Da(图5A)，与hEGF分子量相符。

b.ELISA检测重组人表皮生长因子与其单克隆抗体在体外的结合能力。包被缓冲液4倍梯度稀释纯化的重组人表皮生长因子蛋白，包被液包被酶联板，牛血清白蛋白作为阴性对照，每孔加入100μl包被液，轻弹混匀，4℃包被过夜。次日用洗涤液TBST(1×TBS，0.05％Tween-20)洗5次后，每孔中加入200μl封闭液(TBS，0.1％Tween-20，1％BSA)，37℃封闭2h。用TBST洗5次，每孔中加入100μl一抗稀释液(1∶1000)，37℃温浴2h后，TBST清洗5次，每孔中加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶1000)，37℃温浴2h。TBST清洗5次后，加入100μlTMB显色，室温放置10-30min，每孔中加入50μl 2M H2SO4终止反应，450nm处读取吸光值。图5B结果表明rhEGF与EGF单抗有较好的抗原抗体结合能力，说明本研究方法获得的rhEGF蛋白纯化产物具有免疫原性。

c.MTT法测定rhEGF纯化产物活性：预稀释4000倍rhEGF及10倍rhEGF标准品(效价为400IU/ml)；在含有10％的新生牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养Balb/c 3T3细胞株24-36h，调整浓度为10⁴细胞/ml，转接于96孔板中，37℃，5％CO₂培养24h；24h后换成含有4‰的新生牛血清的RPMI 1640维持培养液中继续37℃，5％CO₂培养24h；分别加入梯度浓度稀释的rhEGF和rhEGF标准品，37℃，5％CO₂培养64-72h，然后每孔加入MTT溶液20μl，继续培养5h，弃去上清，向每孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，混匀后置于酶标仪上，于波长570nm处测定吸光度。

经下述计算：

实验结果表明rhEGF对Balb/c细胞具有明显的促增殖作用，40ng/ml rhEGF促细胞增殖作用是0ng/ml rhEGF促细胞增殖作用的1.7倍，方差分析具有显著性差异(P＜0.05)(见图5C)。

序列：

<210>1

<211>53

<212>PRT

<213>人表皮生长因子

<400>1

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys 1

5                     10                    15                    20

Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu

25                    30                     35                      40

Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg

                 45                      50

Claims (8)

1.一种重组人表皮生长因子的新型制备方法，其特征在于：按照以下步骤依次进行：

1)将hEGF与内含肽、几丁质结合域融合表达，表达载体为pTWIN1或pTWIN2，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)或ER2566；

2)将表达融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心获得沉淀，融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，包涵体经洗涤、溶解、复性后，通过液相切割诱导内含肽自切割位点释放hEGF蛋白，再通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析纯化获得纯度大于97％的不含有多余氨基酸的hEGF蛋白。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述权利要求1步骤1)中hEGF、内含肽和几丁质结合域融合表达的连接顺序为几丁质结合域-内含肽-hEGF。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：

所述权利要求1步骤2)中的重组人表皮生长因子的切割方法为具有自切割功能的内含肽的自切割。

4.如权利要求3所述的重组人表皮生长因子的制备方法，其特征在于：所述的具有自切割功能的内含肽为Ssp DnaB。

5.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的制备方法，其特征在于：所述权利要求1步骤2)中的重组人表皮生长因子的切割方法为液相切割，即通过降低复性缓冲液pH值，室温诱导Ssp DnaB内含肽自切割，释放出hEGF。

6.如权利要求5所述复性缓冲液初始pH值为8.0-10.0；降低后的复性缓冲液pH值为6.0-7.0。

7.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的制备方法，其特征在于：所述权利要求1步骤2)中硫酸铵分级沉淀的纯化方法为10％-40％硫酸铵溶液除 去杂蛋白，60％-80％硫酸铵溶液沉淀hEGF。

8.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的制备方法，其特征在于：所述权利要求1步骤2)中的重组人表皮生长因子的纯化方法为阴离子交换层析，优选DEAE琼脂糖阴离子交换层析。 

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