CN108137663A - 皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白及包含其作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持弹性的化妆料组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子‑蜘蛛毒融合蛋白；编码由大肠杆菌密码子优化的SEQ ID NO：1的碱基序列组成的人表皮细胞生长因子‑蜘蛛毒融合蛋白的基因；包含所述基因的重组载体；由所述重组载体转化的宿主细胞；通过使用所述重组载体转化宿主细胞来生产人表皮细胞生长因子‑蜘蛛毒融合蛋白的方法；以及包含人表皮细胞生长因子‑蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的化妆料组合物；本发明的化妆料组合物具有热稳定性优异，并且能够增强改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的效果，因此，今后能够有效使用于功能性化妆品领域或美容整形领域中。

Description

皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因 子-蜘蛛毒融合蛋白及包含其作为有效成分的用于改善皮肤 皱纹及维持弹性的化妆料组合物
技术领域
本发明涉及皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白及包含其作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持弹性的化妆料组合物。
背景技术
皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成。皮肤阻止从外部流入的菌的渗透的同时对维持体内水分和维持体温起到重要的作用。表皮起到保护皮肤和调节体温及维持水分的功能，其由参与皮肤弹性及柔软性的细胞外基质(extracellular matrix)组成。真皮与皮肤老化有直接的关系。
人表皮细胞生长因子(Human epidermal growth factor，hEGF)与存在于细胞表面的表皮细胞生长因子受体结合，从而诱导表皮细胞生长因子受体的二聚反应(dimerization)。二聚体的表皮细胞生长因子受体使存在于受体内的酪氨酸激酶活化，从而诱导细胞内信号传递系统，并且通过这种过程在细胞内促进了糖酵解作用(glycolysis)和蛋白质合成，最终实现细胞的生长。
对皮肤再生起到重要作用的表皮细胞生长因子会随着老化的进行而减少，表皮细胞生长因子的减少会诱发皮肤细胞增殖及移动的减少，从而显示出皮肤的老化、皱纹的增加、弹性的减少等现象。
作为巴西流浪蜘蛛(Phoneutria nigriventer)的蜘蛛毒中的一种的PnTx2-6由403个核苷酸组成，所述核苷酸由多数的谷氨酸(glutamate)和信号肽(signal peptide)组成。已知PnTx2-6对钠离子通道(sodium channel)的流动产生影响，并且诱导经过麻醉的老鼠的勃起。
已知巴西流浪蜘蛛的蜘蛛毒为3,500～9,000Da大小的多肽且有100种以上，其在河豚毒素敏感型通道(TTX(tetrodotoxin)-sensitive way)中诱导乙酰胆碱(acetylcholine)和谷氨酸的分泌，使向皮质突触体(cortical synaptosomes)内的钠离子的流入增加，从而干扰钠通道的失活。由此会产生持续勃起症(priapism)现象。
诱导持续勃起症现象的巴西流浪蜘蛛的蜘蛛毒中的一种的PnTx2-6是2010年以后在全世界范围内可代替万艾可(Viagra)的天然蛋白质，正在对其进行持续的研究。然而，到目前为止准确的PnTx2-6的细胞内作用机理还不得而知，而且，已知的关于使用为代替万艾可的天然蛋白质的大量生产的研究也很少。
另外，韩国授权专利第1613302号公开了“SV82多肽及含有其作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持弹性的化妆料组合物”，韩国公开专利第2015-0056022号公开了“包含表皮细胞生长因子的融合蛋白的用于改善皮肤的化妆料组合物”，但是没有记载本发明的细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白及含有其作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持弹性的化妆料组合物。
发明内容
要解决的技术问题
本发明是根据如上所述的要求提出的，本发明人将人表皮细胞生长因子融合于蜘蛛毒蛋白质中，从而生产了新型的细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白。所述人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白不仅促进皮肤细胞的增殖，而且热稳定性非常优异，并且将其作为有效成分制备多种化妆品(化妆水、精华液、乳液及霜)剂型，然后进行皮肤测试的结果，确认了受试者的皮肤皱纹改善及弹性维持效果，从而完成了本发明。
技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
此外，本发明提供编码所述融合蛋白的基因。
此外，本发明提供包含所述基因的重组载体。
此外，本发明提供由所述重组载体转化的宿主细胞。
此外，本发明提供在宿主细胞中生产人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的方法，其包括通过使用重组载体转化宿主细胞来过表达编码人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因的步骤。
此外，本发明提供用于改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的化妆料组合物，其包含由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分。
发明效果
本发明的利用大肠杆菌密码子优化的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的编码基因的在大肠杆菌中的生产方法中，由于蛋白质在大肠杆菌内以包涵体的形态表达，从而简化了生产工序，并且实现了蛋白质的大量生产，通过所述方法生产的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白具有热稳定性，并且改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的功能优异，因此，能够有效地使用为功能性化妆料原料。
附图说明
图1为关于制作包含人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)编码基因的重组质粒(pET22b::ESV)的过程及转化至大肠杆菌中的模式图。
图2为确认在大肠杆菌中人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(人表皮细胞生长因子融合于蜘蛛毒蛋白质的氨基末端的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白，ESV)是否表达及分离的结果。A是为了确认是否表达而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中实施电泳的结果。1：尺寸标记；2～4：诱导(induction)表达前的细胞粗溶解物(crude lysate)；5～7：诱导表达后的细胞粗溶解物；8：诱导表达后的总水溶性蛋白质；9：诱导表达后的总不溶性(包涵体，inclusion body)蛋白质；箭头：预期的ESV。B为在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中对使用镍琼脂糖柱最终分离的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白进行电泳的结果；C是为了确认最终分离的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的人表皮细胞生长因子域而使用EGF检测试剂盒来确认人表皮细胞生长因子域的结果。C为EGF对照组；T为测试样品。
图3为用人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)处理皮肤成纤维细胞，然后通过结晶紫染色来确认皮肤成纤维细胞的细胞增殖效果的照片。
图4为为了鉴定蛋白质的热稳定性而对人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)分别进行γ射线灭菌或高压灭菌，然后用其处理皮肤成纤维细胞，并通过结晶紫染色确认基于各蛋白质处理的皮肤成纤维细胞的细胞是否增殖的照片。
图5为用人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)处理HaCaT细胞，然后确认HaCaT细胞的增殖效果的结果。
图6为用人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)处理HaCaT细胞，然后观察HaCaT细胞的伤口治愈效果的细胞照片。
图7为用HaCaT细胞处理涂布人表皮生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)的多孔，从而确认HaCaT细胞和人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白之间的结合效果的结果。
具体实施方式
为了实现本发明的目的，本发明提供皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
本发明的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的范围包括具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质及所述蛋白质的功能性等同物。“功能性等同物”是指氨基酸的添加、取代或缺失的结果，与所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少具有70％以上，优选具有80％以上，更优选具有90％以上，最优选具有95％以上的序列同源性，并且显示与由SEQ ID NO：2表示的蛋白质实质上相同的活性的蛋白质。“实质上相同的活性”是指改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的活性。并且，本发明包括人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的片段、衍生物及类似物(analogues)。本文中所使用的术语“片段”、“衍生物”及“类似物”是指具有与本发明的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白实质上相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白优选由103个SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成，并且可以为对由所述氨基酸序列中的第1位至第53位氨基酸序列组成的人表皮细胞生长因子蛋白质和由第54位至第103位氨基酸序列组成的蜘蛛毒蛋白质进行融合而制作的新型蛋白质。
此外，本发明提供编码所述皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因。所述基因可以由大肠杆菌密码子优化的SEQ ID NO：1的碱基序列组成，但并不限定于此。
本发明的所述编码皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因可以包含SEQ ID NO：1的碱基序列。并且，所述碱基序列的同源体包含于本发明的范围内。具体而言，所述基因可以包含与选自SEQ ID NO：1的碱基序列中的碱基序列分别具有70％以上，优选具有80％以上，更优选具有90％以上，最优选具有95％以上的序列同源性的碱基序列。对于多核苷酸的“序列同源性的％”是通过比较两个最佳排列的序列和比较区域来确认，与两个序列的最佳排列的参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较区域中的多核苷酸序列的一部分可以包含添加或缺失(即，缺口(gap))。
“密码子优化”是指在特定有机体中优选使用，使得经过编码的蛋白质在有机体中更有效地表达，其是指编码蛋白质的多核苷酸的密码子发生变化。鉴于大部分的氨基酸由称作“同义词”或“同义”密码子的几个密码子表示，虽然基因密码是退化性的，但是基于特定有机体的密码子用法不是随机的，并且偏向于特定的三联体密码子。就这种密码子用法的偏向性而言，与特定基因、共同功能或源自祖先的基因、高表达的蛋白质对低复制数蛋白质、以及有机体基因组的集合性蛋白质编码区域相关时，有可能会更高。本发明的所述SEQID NO：1的碱基序列为大肠杆菌密码子优化的序列，以使编码人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因能够在大肠杆菌内表达。
此外，本发明提供包含所述基因的重组载体及由所述重组载体转化的宿主细胞。
术语“重组”是指细胞复制异种的核酸，或者表达所述核酸，或者表达由肽、异种的肽或异种的核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞可以将所述细胞在天然形态中没有被发现的基因或基因片段表达为正义或反义形态中的一种。并且，重组细胞可以表达在天然状态的细胞中发现的基因，但是所述基因是经过变形的，是通过人为的手段重新导入于细胞内的。
本发明中，所述编码人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因可以插入重组表达载体内。术语“重组表达载体”是指细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒、或其他载体。大体地，任意的质粒及载体只要能够在宿主内复制及稳定化即可以使用。所述表达载体的重要的特性为具有复制起点、启动子、标记基因及转译调控因子(translation control element)。
包含编码人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因序列及适当的转录/转译调节信号的表达载体可以通过本领域技术人员公知的方法构建。所述方法包括试管内重组DNA技术、DNA合成技术及体内重组技术等。为了引导mRNA合成，所述DNA序列可以有效地连接于表达载体内的适当的启动子。此外，表达载体可以包含作为转译起始位点的核糖体结合位点及转录终止子。
本发明的一个具体例的重组载体的特征在于，将合成于pET22b载体的编码人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因(SEQ ID NO：1)在框架内(in frame)融合于5'末端(NdeI限制酶位点)和3'末端(XhoI限制酶位点)来制备，并且通过lac启动子(lacpromoter)和lacI阻遏物(lacI repressor)使所述基因有效地表达，从而制备人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白。
本发明的能够使载体既稳定又连续地克隆及表达于原核细胞的宿主细胞可以利用本领域公知的任何宿主细胞，例如，诸如大肠杆菌Rosetta(E.coli Rosetta)、大肠杆菌JM109(E.coli JM109)、大肠杆菌BL21(E.coli BL21)、大肠杆菌RR1(E.coli RR1)、大肠杆菌LE392(E.coli LE392)、大肠杆菌B(E.coli B)、大肠杆菌X 1776(E.coli X 1776)、大肠杆菌W3110(E.coli W3110)、枯草芽胞杆菌、苏云金杆菌的杆菌属菌株，以及诸如鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌及多种假单胞菌种的肠杆菌科菌株等。
此外，将本发明的载体转化至真核细胞中的情况下，作为宿主细胞可以利用酵母(酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae))、昆虫细胞、人类细胞(例如，CHO细胞株(中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary))、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN及MDCK细胞株)及植物细胞等。
本发明的一个具体例的由重组载体转化的宿主细胞可以为大肠杆菌E.coliRosetta2(DE3)pLysS，但并不限定于此。
就本发明的将载体运至宿主细胞中的方法而言，当宿主细胞为原核细胞时，可以通过CaCl2方法、Hanahan方法(Hanahan，D.,1983J.Mol.Biol.166，557-580)及电穿孔方法等来实施。此外，当宿主细胞为真核细胞时，可以通过显微注射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体介导转染法、DEAE-葡聚糖处理法及基因枪等将载体注入于宿主细胞内。
此外，本发明提供在宿主细胞中生产人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的方法，其包括通过使用所述重组载体转化宿主细胞来过表达编码人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因的步骤。
本发明的一个具体例的方法中，所述宿主细胞优选可以为大肠杆菌，更优选可以为大肠杆菌E.coli Rosetta2(DE3)pLysS，但并不限定于此。
此外，本发明提供用于改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的化妆料组合物，其包含由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分。
本发明的一个具体例的化妆料组合物中，相对于化妆料组合物的总重量，所述人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的含量可以为0.000001～0.02重量％，但并不限定于此。
本发明的化妆料组合物除了包含所述有效成分以外，还包含化妆品组合物中通常利用的成分，例如，包含诸如脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、浓缩剂及凝胶化剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、金属离子屏蔽剂及螯合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质囊泡的通常的助剂以及载体。
本发明的组合物可以制备成本领域通常制备的任何剂型，例如，可以剂型化为溶液、悬浮液、乳浊液、膏、凝胶、霜、乳液、粉、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡状粉底及喷雾等，但并不限定于此。更详细而言，可以制备成化妆水、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、牛奶乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、眼霜、保湿霜、护手霜、精华液、营养精华液、面膜、洁面泡沫、洁面水、洁面乳、洁面霜、身体乳液、身体洁肤露、香皂及粉的化妆品剂型。
本发明的化妆料组合物的剂型为膏、霜或凝胶的情况下，可以利用动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、硅石、滑石或氧化锌等作为载体成分。
本发明的化妆料组合物的剂型为粉或喷雾的情况下，可以利用乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末作为载体成分，尤其剂型为喷雾的情况下，可以进一步包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂。
本发明的化妆料组合物的剂型为溶液或乳浊液的情况下，利用溶剂、增溶剂或乳浊剂作为载体成分，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、脂肪族甘油酯、聚乙二醇或失水山梨糖醇脂肪酸酯。
本发明的化妆料组合物的剂型为悬浮液的情况下，可以利用诸如水、乙醇或丙二醇的液态稀释剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯及聚氧乙烯失水山梨糖醇酯的悬浮剂，微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等作为载体成分。
以下，通过实施例对本发明进行详细说明。但是，下述实施例仅用于例示本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。
实施例1：用于生产人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的重组表达载体及转化重组微生物的制备
通过如下所述的方法来制作了编码人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的优化基因、重组表达载体及转化重组微生物。
将编码蜘蛛毒蛋白质和作为伴侣蛋白所使用的人表皮细胞生长因子蛋白质的基因用作模板，制作及合成了经过优化而能够在宿主微生物内表达的、编码由103个氨基酸组成的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因(SEQ ID NO：1)片段。
为了合成编码人表皮细胞生长因子的羧基末端(C-末端)上结合蜘蛛毒蛋白质的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(SEQ ID NO：2)的基因，利用正向引物1(5'-AAGGAGATATACATATGAACTCAGAC-3'，SEQ ID NO：3)及反向引物1(5'-AGCCCTGGCGCGCAACTC-3'，SEQ ID NO：4)合成了经过优化以适合于大肠杆菌的编码人表皮细胞生长因子蛋白质的159个核甘酸(SEQ ID NO：1的第1～159位碱基序列)，并使用正向引物2(5'-GAGTTGCGCGCCAGGGCT-3'，SEQ ID NO：5)和反向引物2(5'-GTGCTCGAGTTTCTTGCA-3'，SEQ IDNO：6)合成了经过优化以适合于大肠杆菌的编码蜘蛛毒蛋白质的150个核甘酸(SEQ ID NO：1的第160～309位碱基序列)。将通过所述方法合成的分别编码人表皮细胞生长因子和蜘蛛毒蛋白质的基因作为模板，并通过聚合酶链式反应(PCR)，使用正向引物1(SEQ ID NO：3)和反向引物2(SEQ ID NO：6)最终合成了由编码人表皮细胞生长因子的C-末端上结合蜘蛛毒蛋白质的融合蛋白的309个核苷酸组成的基因。
使用相同的限制酶(5'末端NdeI及3'末端XhoI)切割并插入所述基因片段和重组质粒，从而制作了图1所示的重组质粒(pET22b::ESV)。将所制备的重组质粒转化至大肠杆菌E.coli TOP10中，从而从宿主微生物获得了大量的基因构建体。
之后，将所制备的重组质粒转化至大肠杆菌E.coli Rosetta2(DE3)pLysS(Novagen公司，德国)中，从而制作了用于生产人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的重组微生物。
实施例2：人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的表达诱导、分离及精制
分别使用1L的LB培养基(10％的色氨酸、10％的氯化钠及5％的酵母提取物)或BSB培养基(1％的色氨酸、0.5％的酵母提取物、1％的葡萄糖及0.1％的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)(pH为7.0)，纳丝真生命工学株式会社)，对实施例1中制备的E.coli Rosetta2(DE3)pLysS，进行分批培养(batch culture)时，培养至OD600＝0.6～0.8，或者使用20L的发酵器进行连续培养时，培养至OD600＝15～20。之后，向细胞培养培养基中分别最终添加1～5mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)或2％的乳糖，从而诱导了重组大肠杆菌的基因表达。诱导基因表达后，进一步培养3～4小时，并用离心分离法回收了细胞。将这些细胞完全悬浮于缓冲溶液(磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline)，8g的氯化钠、0.2g的氯化钾、1.44g的磷酸一氢钠(Na2HPO4)、0.24g的磷酸二氢钾(KH2PO4)/L，pH为7.4)，然后使用超声波破碎仪破坏细胞，从而分离了包含细胞内蛋白质的溶液。
将所述经过分离的溶液作为样品，通过15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认了蛋白质是否表达。其结果，在通过IPTG或乳糖来诱导表达的细胞粗溶解物中可以确认人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的表达(图2A)。
为了对已确认表达的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白进行分离、精制，用增溶缓冲溶液(5M的尿素(urea)，pH为11)对包涵体(inclusion body)进行增溶，然后利用超微细过滤方法(0.45μm的微孔滤膜和1K的超微滤膜)实施了重折叠(refolding)过程，并且使用储备用缓冲溶液(PBS)最终分离了人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白。
为了对所述融合蛋白进行充分精制，以1～3ml/分钟的速度将分离的融合蛋白通过镍-琼脂糖柱。接着用结合缓冲溶液对柱进行数次洗涤，然后将50、1000及250mM的咪唑溶液(pH为7.4)应用于柱，并在柱中每次以1ml的量分级、溶出人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白，然后使用10mM的磷酸钾(potassium phosphate)缓冲液去除缓冲液中的咪唑，从而最终精制为纯融合蛋白，并且为了了解其结果实施了15％的SDS-丙烯酰胺凝胶电泳。其结果，可在预期的尺寸附近(约14～16kDa，包含组氨酸标签(His-tag))确认到最终经过精制的融合蛋白(图2B)。最终使用EGF检测试剂盒确认了人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白内的EGF域(图2C)。
实施例3：人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的活性测量-皮肤成纤维细胞的细胞增殖效果
选择实施例2中经过分离、精制的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的存在得到确认的样品，测量了人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的活性。
培养皮肤成纤维细胞(成人皮肤成纤维细胞(Human Dermal Fibroblastsadult)，HDFa细胞)，然后分别以0、0.02ppm、0.2ppm的浓度的融合蛋白对细胞进行处理，然后在37℃下培养了3天。之后，通过结晶紫染色法确认了皮肤成纤维细胞是否增值。
其结果可以确认，与无处理对照组(0ppm)相比，随着人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的浓度(0.02～0.2ppm)的增加，皮肤成纤维细胞的增殖效果越优异(图3)。此外，观察到相比于各个单一蛋白质处理组(EGF，SV)，人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)的细胞增殖效果更高。这是因为分别进行处理的EGF及SV相当于人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的制备中所利用的各个活性域，而不是相当于各个全长(full-length)蛋白质，当使用相同浓度(例如，0.02ppm)的各个蛋白质及人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白进行处理时，人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的摩尔数与各个EGF及SV相比大致为1/2左右。因此，如果对相同的浓度显示出相似的皮肤成纤维细胞增殖效果，则人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白相比于各个EGF及SV具有2倍左右的皮肤成纤维细胞增殖效果。从图3可知，用人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白进行处理的情况下，相比于各个EGF及SV，皮肤成纤维细胞数量更多，因此可以知道至少具有2倍以上的皮肤成纤维细胞增殖效果。通过上述结果可以推导出人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的皮肤细胞增殖效果得到增加。
实施例4：人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的热稳定性分析
选择实施例2中经过分离、精制的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的存在得到确认的样品进行了热稳定性实验。热稳定性实验是通过如下方式进行：分别以0.02～0.2ppm的浓度用经过γ射线灭菌(照射35kgray)或高压灭菌(121℃，处理15分钟)的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白处理皮肤成纤维细胞，并在37℃下培养3天，然后通过结晶紫染色对基于蛋白质处理的细胞增殖程度进行比较并进行分析。
其结果可以确认，人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白在经过γ射线灭菌或高压灭菌处理的实验组中显示出与没有进行任何热处理的组相似水平的细胞增值(图4)。
通过上述结果，可以知道本发明的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白经过热处理也不会失去蛋白质的活性，并且认为皮肤细胞增殖效果得到增加的本发明的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白尤其可以非常有效地利用在利用热处理方法的无防腐剂化妆品的制备中。
实施例5：人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的活性测量-HaCaT细胞的细胞增殖、伤口治愈及细胞结合效果
选择实施例2中经过分离、精制的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的存在得到确认的样品，测量了人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的活性。测量融合蛋白的活性通过如下方式进行：培养HaCaT细胞，以0、0.02ppm、0.2ppm、2ppm及20ppm浓度的融合蛋白处理经过培养的细胞，并对培养细胞的细胞增殖、伤口治愈及细胞结合进行分析并进行评价。
首先使用PrestoBlueTM细胞活性(Cell Viability)试剂(英杰公司(Invitrogen)，美国)分析细胞增殖时，可以确认基于人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的处理的HaCaT细胞的细胞增殖效果，并且随着人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的浓度的增加(0.02～20ppm)，观察到优异的细胞增殖效果(图5)。
培养HaCaT细胞，然后以0、0.02ppm、0.2ppm、2ppm及20ppm的浓度的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白处理孔(well)，然后利用显微镜(奥林巴斯CK40，奥林巴斯公司(Olympus)，日本)，每6小时对细胞进行观察，从而观察了HaCaT细胞的伤口治愈效果。与人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的无处理对照组相比，用人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白进行处理的HaCaT细胞显示出伤口治愈效果，尤其，随着人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的浓度的增加(0.02～20ppm)，可以确认其效果更明显(图6)。
最后，将0、0.02ppm、0.2ppm、2ppm及20ppm浓度的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白涂布于96孔板，然后用HaCaT细胞进行处理，并在37℃下培养1天。之后，使用PrestoBlueTM细胞活性(Cell Viability)试剂对细胞和人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白之间的结合效果进行了分析。其结果，与用牛血清白蛋白(BSA，bovine serumalbumin)处理的阴性对照组相比，用人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白进行处理的HaCaT细胞显示出优异的结合效果，从而确认了人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白与皮肤细胞的结合效果(图7)。
实验例1：改善皮肤皱纹、维持皮肤弹性效果及皮肤刺激官能试验
将在所述实施例2中经过分离、精制的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分制备了制备例1、2、3及4和比较例1、2、3及4的化妆料组合物，并实施了官能试验。
具体而言，为了确认改善皱纹的情况，将30岁以上且未满60岁的女性和男性共30名(30岁年龄段10名、40岁年龄段10名、5～60岁年龄段10名)作为对象，在皱纹分布较多的面部左侧眼角部分或左侧嘴唇周边使用比较例(对照组)，面部右侧眼角部分或右侧嘴唇周边使用制备例(试验组)，一天使用一次并持续使用两周。评价是对眼睛或嘴唇周边部分的皱纹舒展程度进行了评价。此外，对所述功能项目之一的维持皮肤弹性的效果也通过相同的方法评价了维持皮肤弹性的程度。对于皮肤刺激项目也通过相同的方法对皮肤的瘙痒、发热及红斑现象等实施了官能试验。评价标准是基于下述的5分法标准实施：非常优异(5分)；优异(4分)；普通(3分)；差(2分)；非常差(1分)。
<制备例1及比较例1>
添加人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分，并按照下述表1中记载的成分和含量制备了制备例1的化妆水。
此外，没有添加人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分，并按照下述表1中记载的成分和含量制备了比较例1的化妆水。
[表1]
化妆水组合物
成分 制备例1(重量％) 比较例1(重量％)
人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白 0.01 -
氨基酸原液 0.1 0.1
矿物混合物 0.0007 0.0007
精制水 余量 余量
所述制备例1及比较例1的官能试验结果如下述表2所示。
[表2]
制备例1及比较例1的官能试验结果
<制备例2及比较例2>
添加人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分，并按照下述表3中记载的成分和含量制备了制备例2的精华液。
此外，没有添加人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分，并按照下述表3中记载的成分和含量制备了比较例2的精华液。
[表3]
精华液组合物
成分 制备例2(重量％) 比较例2(重量％)
人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白 0.01 -
氨基酸原液 0.05 0.05
矿物混合物 0.0007 0.0007
甘油 5 5
1,3-丁二醇 10 10
卡波普(carbopol)940 0.3 0.3
精制水 余量 余量
所述制备例2及比较例2的官能试验结果如下述表4所示。
[表4]
制备例2及比较例2的官能试验结果
<制备例3及比较例3>
添加人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分，并按照下述表5中记载的成分和含量制备了制备例3的乳液。此外，没有添加人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分，并按照下述表5中记载的成分和含量制备了比较例3的乳液。
[表5]
乳液组合物
成分 制备例3(重量％) 比较例3(重量％)
人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白 0.01 -
氨基酸原液 0.05 0.05
矿物混合物 0.0007 0.0007
甘油 3 3
1,3-丁二醇 10 10
矿物油 5 5
鲸蜡醇 2 2
黄原胶 0.5 0.5
精制水 余量 余量
关于所述制备例3及比较例3的改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性效果的皮肤刺激官能试验结果如下述表6所示。
[表6]
制备例3及比较例3的官能试验结果
<制备例4及比较例4>
添加人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分，并按照下述表7中记载的成分和含量制备了制备例4的霜。此外，没有添加人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分，并按照下述表7中记载的成分和含量制备了比较例4的霜。
[表7]
霜组合物
成分 制备例4(重量％) 比较例4(重量％)
人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白 0.01 -
氨基酸原液 0.05 0.05
矿物混合物 0.0007 0.0007
甘油 2 2
矿物油 10 10
橄榄油乳化蜡 3 3
鲸蜡醇 2 2
精制水 余量 余量
所述制备例4及比较例4的官能试验结果如下述表8所示。
[表8]
制备例4及比较例4的官能试验结果
通过所述官能试验结果可以确认包含本发明的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分的制备例1、2、3及4相比于所对应的比较例具有改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的效果。
<110> 纳丝真生命工学株式会社
李宣教
<120> 皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白及包含其作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持弹性的化妆料组合物
<130> KHP182110246.5
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF-SV
<400> 1
aactcagact ctgagtgccc actgtctcac gacggctact gccttcacga cggagtctgc 60
atgtacatcg aggctttgga taagtacgct tgtaattgcg tcgttggtta cattggagag 120
cgctgccaat accgtgactt aaaatggtgg gagttgcgcg ccagggctac ctgtgcaggg 180
caggatcagc catgcaaaga aacgtgcgat tgctgtggcg aacgtggcga atgcgtgtgt 240
ggtggtccgt gcatttgtcg ccaaggctat ttctggattg cgtggtacaa actggcgaac 300
tgcaagaaa 309
<210> 2
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF-SV
<400> 2
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg Ala Arg Ala Thr Cys Ala Gly Gln Asp Gln Pro
50 55 60
Cys Lys Glu Thr Cys Asp Cys Cys Gly Glu Arg Gly Glu Cys Val Cys
65 70 75 80
Gly Gly Pro Cys Ile Cys Arg Gln Gly Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr
85 90 95
Lys Leu Ala Asn Cys Lys Lys
100
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
aaggagatat acatatgaac tcagac 26
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
agccctggcg cgcaactc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gagttgcgcg ccagggct 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gtgctcgagt ttcttgca 18

Claims (8)

1.皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
2.基因，其为编码权利要求1所述的皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因由大肠杆菌密码子优化的SEQ IDNO：1的碱基序列组成。
4.重组载体，其包含权利要求2或权利要求3所述的基因。
5.宿主细胞，其由权利要求4所述的重组载体转化。
6.在宿主细胞中生产人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的方法，其包括通过使用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞来过表达编码人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因的步骤。
7.根据权利要求6所述的生产人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
8.用于改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的化妆料组合物，其包含由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分。
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