KR101657299B1 - 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물 - Google Patents
세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질, 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 융합단백질 코딩 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 융합단백질을 생산하는 방법 및 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 세포 증식 효과와 더불어, 피부 주름 개선 및 미백 효과를 통한 노화방지 기능이 우수하여, 기능성 화장료 원료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.
인간 상피세포재생인자(human Epidermal Growth Factor, hEGF)는 세포 표면에 존재하는 상피세포재생인자 수용체와 결합하여 상피세포재생인자 수용체의 이합체화(dimerization)를 유도한다. 이합체의 상피세포재생인자 수용체는 수용체 내에 존재하는 타이로신 키나아제(tyrosine kinase)를 활성화시켜 세포 내 신호전달 시스템을 유도하게 된다. 이러한 일련의 과정을 통해 세포 내에서는 해당 작용 (glycolysis)과 단백질 합성 등이 촉진되어 최종적으로 세포의 성장이 진행된다.
피부 재생의 중추적인 역할을 수행하는 인간 상피세포재생인자는 노화가 진행될수록 감소한다. 그 결과 피부 세포 증식 및 이동이 감소하여 피부의 노화, 주름 증가, 탄력 감소 등의 원인이 될 수 있으며, 현재에는 피부세포 성장을 촉진하는 의약품 또는 기능성 화장품으로 사용되고 있다.
인간 성장호르몬(human growth hormone)은 골격의 성장, 근육의 증가, 지방의 분해, 장기의 성장, 성적인 성숙 등 인체의 여러 기관에 영향을 미친다. 일반적으로 인간 성장호르몬은 주사제로 사용하여 심장순환계의 강화, 운동 능력의 향상, 근육의 강화 등 의약품으로 사용되어 왔다. 특히 지방 분해 효과, 관절염 개선, 피부 두께의 증가, 심폐 기능의 개선, 근육량의 증가 등 대사 개선 효과와 탄력 있는 피부를 가꾸는데 효과가 입증되어 성장호르몬이 노화 방지에도 탁월한 효과가 있다는 사실이 알려졌다.
성장호르몬의 분비는 사춘기에 최고를 이루고, 20대 이후 서서히 감소하지만 40세까지도 성장호르몬의 분비는 왕성하다. 그러나 60대가 넘으면 20대의 50% 이하 수준으로 떨어지게 된다. 성장호르몬의 감소는 피부 두께와 피부 콜라겐의 감소에 따른 피부의 탄력 저하, 특히 눈 및 입 주위의 잔주름 증가에 영향을 미친다. 이러한 노화 과정을 방지하기 위한 대표적인 약물 투여법으로 사용된 것이 바로 성장호르몬이다.
성장호르몬은 심혈관 질환 치료와 함께 주름 개선 등 탄력 있는 피부를 유지시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 피부 미용뿐만 아니라 노화 방지를 위한 스킨케어용으로 사용될 수 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 인간 상피세포재생인자의 피부 재생 기능과 인간 성장호르몬의 주름 개선 효과 및 노화 방지 기능 유지를 위한 새로운 단백질 개발을 진행한 결과, 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 효능을 모두 갖춘 새로운 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 개발에 성공하였다.
한편, 한국공개특허 제2015-0056022호에는 '상피세포 성장인자의 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0056021호에는 피부투과 촉진용 펩타이드를 이용한 '인간 성장호르몬의 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬을 융합하여 세포 증식 효과가 증가된 신규의 융합단백질을 생산하였다. 상기 융합단백질은 피부세포의 성장을 촉진시킬 뿐만 아니라, 상기 융합단백질을 유효성분으로 하여 다양한 화장품 제형을 제조한 후 피부 테스트를 수행한 결과, 피험자들의 피부 주름 개선 및 미백 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질은 우수한 세포 증식 효과와 더불어, 피부 주름 개선 및 미백 효과를 통한 노화방지 기능이 우수하여, 기능성 화장료 원료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드(pET22b::EGF-GH 및 pET22b::GH-EGF)의 제작 과정 및 대장균으로의 형질전환에 관한 모식도이다.
도 2는 형질전환 대장균에서 인간 상피세포재생인자(EGF)와 인간 성장호르몬(GH)의 융합단백질 발현 여부를 확인하기 위하여 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 수행한 결과이다. A는 분리, 정제한 융합단백질의 전기영동 결과이며, B는 융합단백질 내 인간 상피세포재생인자 도메인을 확인하기 위해 검출 키트를 사용하여 확인한 결과이다. M, 단백질 크기 마커; 1, EG(EGF-GH); 2, GE(GH-EGF); C, EGF 대조군; T, 테스트 시료.
도 3은 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 피부섬유아세포에 대한 세포 증식 효과를 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 확인한 사진이다. EG, EGF-GH; GE, GH-EGF.
도 4는 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 세포 증식 효과를 HaCaT 세포에서 확인한 결과이다. EG, EGF-GH; GE, GH-EGF.
도 5는 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 상처 치유 효과를 HaCaT 세포에서 확인한 결과로, a는 EG(EGF-GH) b는 GE(GH-EGF)에 대한 결과이다.
도 6은 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 세포 접합 효과를 HaCaT 세포에서 확인한 결과로, a는 EG(EGF-GH) b는 GE(GH-EGF)에 대한 결과이다.
도 2는 형질전환 대장균에서 인간 상피세포재생인자(EGF)와 인간 성장호르몬(GH)의 융합단백질 발현 여부를 확인하기 위하여 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 수행한 결과이다. A는 분리, 정제한 융합단백질의 전기영동 결과이며, B는 융합단백질 내 인간 상피세포재생인자 도메인을 확인하기 위해 검출 키트를 사용하여 확인한 결과이다. M, 단백질 크기 마커; 1, EG(EGF-GH); 2, GE(GH-EGF); C, EGF 대조군; T, 테스트 시료.
도 3은 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 피부섬유아세포에 대한 세포 증식 효과를 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 확인한 사진이다. EG, EGF-GH; GE, GH-EGF.
도 4는 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 세포 증식 효과를 HaCaT 세포에서 확인한 결과이다. EG, EGF-GH; GE, GH-EGF.
도 5는 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 상처 치유 효과를 HaCaT 세포에서 확인한 결과로, a는 EG(EGF-GH) b는 GE(GH-EGF)에 대한 결과이다.
도 6은 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 세포 접합 효과를 HaCaT 세포에서 확인한 결과로, a는 EG(EGF-GH) b는 GE(GH-EGF)에 대한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬 융합단백질의 범위는 서열번호 3(인간 성장호르몬 단백질이 인간 상피세포재생인자의 카복실 말단에 융합) 또는 서열번호 4(인간 성장호르몬 단백질이 인간 상피세포재생인자의 아미노 말단에 융합)의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 세포 증식 효과를 가지면서 피부 주름 개선 활성을 의미한다.
본 발명은 또한, 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질 코딩 유전자는 서열번호 1(인간 성장호르몬 단백질이 인간 상피세포재생인자의 카복실 말단에 융합된 단백질의 코딩 유전자) 또는 서열번호 2(인간 성장호르몬 단백질이 인간 상피세포재생인자의 아미노 말단에 융합된 단백질의 코딩 유전자)의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로는, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
"코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 본 발명의 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열은 인간 상피세포재생인자 및 인간 성장호르몬 단백질 코딩 유전자가 대장균 내에서 발현될 수 있도록 대장균의 코돈에 최적화된 서열이다.
본 발명은 또한, 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 코딩 유전자는 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터는, pET22b 벡터에 합성한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1 또는 서열번호 2)를 5' 말단(NdeI 제한효소 사이트)과 3' 말단 (XhoI 제한효소 사이트)에 인프레임(in frame)으로 융합하여 제조하였고, 상기 유전자를 lac 프로모터(lac promoter)와 lac I 리프레서(lac I repressor)에 의하여 효과적으로 발현시켜 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는 벡터이다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Rosetta, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 생산 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 단백질로, 인간 상피세포재생인자에 의해 피부 주름 개선의 효과를, 인간 성장호르몬에 의해 항노화 효과를 기대할 수 있는 단백질이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서, 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 함량은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000001 내지 0.0001 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.
상기 단백질의 함량이 0.000001 중량% 미만인 경우에는 피부 재생 효과와 노화 방지 효과가 미비하며, 0.0001 중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있을 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬 융합단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물의 제조
인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬 융합단백질을 코딩하는 최적화된 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물은 아래의 방법으로 제작하였다.
인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬 융합단백질을 코딩하는 유전자를 주형으로 하여 숙주 미생물 내에서 발현될 수 있도록 최적화된, 245개의 아미노산으로 이루어진 인간성장호르몬의 융합단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1 및 서열번호 2) 단편들을 제작, 합성하였다. 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬 융합단백질 합성에 사용한 프라이머는 다음과 같다: 정방향 프라이머 (1): 5'-aaggagatatacatatgAACTCAGACTCTGAGTGC-3'(서열번호 5) 및 역방향 프라이머 (1): 5'-ggtggtggtgctcgagAAAGCCGCAGGAACCCTC-3'(서열번호 6), 정방향 프라이머 (2): 5'-aaggagatatacatatgTTCCCCACTATTCCGCTG-3'(서열번호 7) 및 역방향 프라이머 (2): 5'-ggtggtggtgctcgagGCGCAACTCCCACCATTTTAA-3'(서열번호 8).
상기 유전자 단편과 재조합 플라스미드를 동일한 제한효소(5'-말단 NdeI 제한효소와 3'-말단 XhoI 제한효소)로 절단하고 삽입하여, 도 1에 나타낸 재조합 플라스미드(pET22b::EGFGH 및 pET22b::GHEGF)를 제작하였다. 상기에서 제조된 재조합 플라스미드 반응물을 E. coli TOP10에 각각 형질전환시켜서, 숙주 미생물로부터 유전자 컨스트럭트를 대량 얻었다. 또한, 상기 각각의 재조합 플라스미드를 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS에 각각 형질전환시켜서, 숙주 미생물에 유전자 컨스트럭트가 삽입되어 있는, 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 생산을 위한 재조합 미생물을 제작하였다.
실시예 2. 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬 융합단백질의 발현유도 및 분리
실시예 1에서 제조한 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS를 각각 1ℓ LB 혹은 BSB 배지에서 회분 배양(batch culture) 시 OD600=0.6~0.8이 될 때까지 혹은, 20ℓ 발효기를 사용하여 연속 배양 시 OD600=15~20이 될 때까지 배양하였다. 이후, 세포 배양 배지에 각각 최종 1~5mM IPTG 또는 2% 락토오즈를 가하여 재조합 대장균의 유전자 발현을 유도하였다. 유전자 발현 유도 후 3~4시간 더 배양하고 세포들을 원심분리방법으로 회수하였다. 이 세포들을 완충용액(Phosphate buffered saline, NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g/L, pH 7.4)에 완전히 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기를 사용하여 세포를 파괴하고 세포 내 단백질 포함 용액을 분리하였다.
상기 분리된 용액을 시료로 하여 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 단백질 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, IPTG 또는 락토오즈를 통해 발현 유도를 한 세포 조용해물에서 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 2A). 도 2B는 분리한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 EGF 검출 키트를 사용하여 융합단백질 내 EGF 함유 여부를 확인한 결과이다.
실시예 3. 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬 융합단백질의 활성 측정-세포 증식 효과
실시예 2에서 분리, 정제된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 존재가 확인된 시료를 택하여 융합단백질의 활성을 측정하였다.
인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬 융합단백질의 활성측정을 위해 배양한 피부섬유아세포에 0, 0.02 ppm 및 0.2 ppm 농도의 융합단백질 및 인간 상피세포재생인자 단백질을 각각 처리한 후 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 크리스털 바이올렛 염색법으로 세포증식 여부를 확인하였다.
그 결과 융합단백질의 농도가 증가할수록 무처리 대조군과 비교하여 피부섬유아세포의 증식 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(도 3). 또한, 인간 성장호르몬 단백질을 융합하지 않은 인간 상피세포재생인자 단백질 처리군에 비해서 융합단백질의 세포 증식 효과가 더 높게 관찰되었다. 상기 결과를 통해, 인간 성장호르몬 단백질을 융합한 인간 상피세포재생인자 융합단백질은 세포 증식 효과가 증가되었음을 유추할 수 있었다.
실시예 4. 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬 융합단백질의 활성 측정-HaCaT 세포의 세포 증식, 상처 치유 및 세포 접합 효과
실시예 2에서 분리, 정제된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 존재가 확인된 시료를 택하여, HaCaT(normal keratinocyte cell) 세포에서 융합단백질의 활성을 측정하였다. 간단하게, 융합단백질의 활성 측정 방법은 HaCaT 세포를 배양하고, 배양된 세포에 융합단백질을 0, 0.02ppm, 0.2ppm, 2ppm 및 20ppm 농도로 처리하여 배양 세포의 세포 증식, 상처 치유 및 세포 접합을 분석하여 평가하였다.
먼저 PrestoBlueTM Cell Viability 시약(Invitrogen, 미국)을 사용하여 세포 증식을 분석하였을 때, 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 처리에 의한 HaCaT 세포의 세포 증식 효과를 확인할 수 있었고(도 4), 특히 0.2~2ppm 농도의 융합단백질 처리시에 우수한 세포 증식 효과를 관찰하였다. 상기 결과를 통해 융합단백질은 피부 세포 내로 침투하여 활성을 나타내며, 저농도에서도 탁월한 세포 증식 효과를 보임을 알 수 있었다.
두 번째로, HaCaT 세포를 배양한 후 웰에 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 0, 0.02ppm, 0.2ppm, 2ppm 및 20ppm 농도로 처한 후, 매 6시간 마다 현미경(올림푸스 CK40, 올림푸스, 일본)으로 세포를 관찰하여 HaCaT 세포의 상처 치유 효과를 관찰하였다. 융합단백질을 처리한 HaCaT 세포는 무처리 대조군에 비해 우수한 상처 치유 효과를 나타냈으며, 특히 모든 농도 구간에서 그 효과가 뚜렷한 것을 확인할 수 있었다(도 5).
마지막으로, 0, 0.02ppm, 0.2ppm, 2ppm 및 20ppm 농도의 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 96 웰 플레이트에 코팅한 후 HaCaT 세포를 처리하고 1일 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후, PrestoBlueTM Cell Viability 시약을 사용하여 세포와 융합단백질 사이의 접합 효과를 분석하였다. 그 결과, 융합단백질을 처리한 HaCaT 세포는 BSA(bovine serum albumin)를 처리한 대조군에 비해 우수한 접합 효과를 나타냄을 확인하였고(도 6), 이를 통해 세포 증식을 촉진함을 유추할 수 있었다.
실험예 1. 주름 개선 및 미백 등의 피부 재생 기능과 항노화 효능에 관한 피부 자극 관능시험
상기 실시예 2에서 분리, 정제한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 유효성분으로 하여 제조예 1, 2, 3 및 4와 비교예 1, 2, 3 및 4의 화장료 조성물을 제조하여 관능시험을 실시하였다.
구체적으로는, 피부 재생 기능 항목 중 주름 개선 사항을 확인하기 위해 30세 이상 60세 미만의 여성과 남성 총 30명(30대 10명, 40대 10명, 5~60대 10명)을 대상으로 하여, 안면 왼쪽 눈가 부분에는 비교예(대조군)를, 안면 오른쪽 눈가 부분에는 제조예(시험군)를 1일 1회 2주간 지속적으로 사용하게 하였다. 평가는 눈 주위의 주름 펴짐 현상을 평가하였다. 또한, 상기 기능 항목 중 하나인 미백 관련 사항에 대해서도 동일한 방법으로 피부색 톤의 변화 정도를 평가하였다. 또한, 상기 기능 항목 중 하나인 항노화 효과에 대해서도 동일한 방법으로 주름 펴짐 및 유지 일수로 평가하였다. 피부 자극 항목에 대해서도 동일한 방법으로 피부의 가려움, 따가움 및 홍반현상 등에 관하여 관능시험을 실시하였다. 평가 기준은 매우 우수(5점), 우수(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였다.
<제조예 1 및 비교예 1>
인간 상피세포재생인자-인간 성장호르몬의 융합단백질(EGF-GH)을 첨가 또는 무첨가하여 하기 표 1에 기재된 성분과 함량으로 스킨을 제조하였다.
| 성분 | 제조예 1 (중량 %) | 비교예 1 (중량 %) |
| EGF-GH | 0.002 | - |
| 아미노산 스탁 | 0.1 | 0.1 |
| 미네랄 혼합물 | 0.0007 | 0.0007 |
| 정제수 | 잔량 | 잔량 |
상기의 제조예 1 및 비교예 1의 관능시험 결과는 하기 표 2와 같다.
<제조예 2 및 비교예 2>
인간 상피세포재생인자-인간 성장호르몬의 융합단백질(EGF-GH)을 첨가 또는 무첨가하여 하기 표 3에 기재된 성분과 함량으로 에센스를 제조하였다.
| 성분 | 제조예 2 (중량 %) | 비교예 2 (중량 %) |
| EGF-GH | 0.002 | - |
| 아미노산 스탁 | 0.05 | 0.05 |
| 미네랄 혼합물 | 0.0007 | 0.0007 |
| 글리세롤 | 5 | 5 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 10 | 10 |
| 카보폴 940 | 0.3 | 0.3 |
| 정제수 | 잔량 | 잔량 |
상기의 제조예 2 및 비교예 2의 관능시험 결과는 하기 표 4와 같다.
<제조예 3 및 비교예 3>
인간 상피세포재생인자-인간 성장호르몬의 융합단백질(EGF-GH)을 첨가 또는 무첨가하여 하기 표 5에 기재된 성분과 함량으로 로션을 제조하였다.
| 성분 | 제조예 3 (중량 %) | 비교예 3 (중량 %) |
| EGF-GH | 0.002 | - |
| 아미노산 스탁 | 0.05 | 0.05 |
| 미네랄 혼합물 | 0.0007 | 0.0007 |
| 글리세롤 | 3 | 3 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 10 | 10 |
| 미네랄 오일 | 5 | 5 |
| 세틸알코올 | 2 | 2 |
| 잔탄검 | 0.5 | 0.5 |
| 정제수 | 잔량 | 잔량 |
상기의 제조예 3 및 비교예 3의 관능시험 결과는 하기 표 6과 같다.
<제조예 4 및 비교예 4>
인간 상피세포재생인자-인간 성장호르몬의 융합단백질(EGF-GH)을 첨가 또는 무첨가하여 하기 표 7에 기재된 성분과 함량으로 크림을 제조하였다.
| 성분 | 제조예 4 (중량 %) | 비교예 4 (중량%) |
| EGF-GH | 0.002 | - |
| 아미노산 스탁 | 0.05 | 0.05 |
| 미네랄 혼합물 | 0.0007 | 0.0007 |
| 글리세롤 | 2 | 2 |
| 미네랄 오일 | 10 | 10 |
| 올르브유화 왁스 | 3 | 3 |
| 세틸알코올 | 2 | 2 |
| 정제수 | 잔량 | 잔량 |
상기의 제조예 4와 비교예 4의 관능시험 결과는 하기 표 8과 같다.
<110> Nexgen Biotechnologies, Inc.
<120> Human epidermal growth factor and human growth hormone fusion
protein with increased cell proliferation effect and cosmetic
composition for anti-wrinkle and anti-aging comprising the same
as effective component
<130> PN15463
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGF-GH
<400> 1
atgaacagcg atagcgaatg cccgctgagc catgatggct attgcctgca tgatggcgtg 60
tgcatgtata ttgaagcgct ggataaatat gcgtgcaact gcgtggtggg ctatattggc 120
gaacgctgcc agtatcgcga tctgaaatgg tgggaactgc gcttccccac tattccgctg 180
tcgcgacttt ttgacaatgc aatgctccgt gcccacaggc tacatcaact cgcgttcgat 240
acctatcagg agttcgaaga ggcttatatt ccaaaggagc aaaaatacag cttccttcag 300
aaccctcaaa cgtcactctg tttctccgaa tccatcccca ctccatccaa tcgcgaggag 360
actcagcaaa agtctaacct tgagctgctg cggataagtt tgctgttgat ccagtcctgg 420
ttggaacctg tgcagttcct taggagcgtt ttcgctaaca gcctcgtata cggagccagc 480
gacagcaatg tttatgatct ccttaaggat ttggaagaag gtatccaaac actgatgggc 540
cggctggagg atggatcacc aagaaccgga caaattttta agcagaccta ctctaaattc 600
gacaccaatt cgcataacga tgacgctttg ctcaagaact acgggcttct ctactgtttt 660
cgtaaagata tggacaaggt ggaaacattt ctcaggatcg tccaatgccg ctctgtcgag 720
ggttcctgcg gcttt 735
<210> 2
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-EGF
<400> 2
atgttcccca ctattccgct gtcgcgactt tttgacaatg caatgctccg tgcccacagg 60
ctacatcaac tcgcgttcga tacctatcag gagttcgaag aggcttatat tccaaaggag 120
caaaaataca gcttccttca gaaccctcaa acgtcactct gtttctccga atccatcccc 180
actccatcca atcgcgagga gactcagcaa aagtctaacc ttgagctgct gcggataagt 240
ttgctgttga tccagtcctg gttggaacct gtgcagttcc ttaggagcgt tttcgctaac 300
agcctcgtat acggagccag cgacagcaat gtttatgatc tccttaagga tttggaagaa 360
ggtatccaaa cactgatggg ccggctggag gatggatcac caagaaccgg acaaattttt 420
aagcagacct actctaaatt cgacaccaat tcgcataacg atgacgcttt gctcaagaac 480
tacgggcttc tctactgttt tcgtaaagat atggacaagg tggaaacatt tctcaggatc 540
gtccaatgcc gctctgtcga gggttcctgc ggctttaaca gcgatagcga atgcccgctg 600
agccatgatg gctattgcct gcatgatggc gtgtgcatgt atattgaagc gctggataaa 660
tatgcgtgca actgcgtggt gggctatatt ggcgaacgct gccagtatcg cgatctgaaa 720
tggtgggaac tgcgc 735
<210> 3
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGF-GH
<400> 3
Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu
1 5 10 15
His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys
20 25 30
Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu
35 40 45
Lys Trp Trp Glu Leu Arg Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50 55 60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85 90 95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100 105 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115 120 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130 135 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145 150 155 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165 170 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180 185 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195 200 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210 215 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225 230 235 240
Gly Ser Cys Gly Phe
245
<210> 4
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-EGF
<400> 4
Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn
35 40 45
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
115 120 125
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
130 135 140
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
195 200 205
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
210 215 220
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
225 230 235 240
Trp Trp Glu Leu Arg
245
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
aaggagatat acatatgaac tcagactctg agtgc 35
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
ggtggtggtg ctcgagaaag ccgcaggaac cctc 34
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
aaggagatat acatatgttc cccactattc cgctg 35
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
ggtggtggtg ctcgaggcgc aactcccacc attttaa 37
Claims (10)
- 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질.
- 제1항의 피부 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 코딩하는 유전자.
- 제2항에 있어서, 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 제4항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 생산 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질의 생산 방법.
- 제6항의 방법에 의해 생산된 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질.
- 제1항 또는 제8항의 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160013620A KR101657299B1 (ko) | 2016-02-03 | 2016-02-03 | 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020160013620A KR101657299B1 (ko) | 2016-02-03 | 2016-02-03 | 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물 |
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| KR101657299B1 true KR101657299B1 (ko) | 2016-09-13 |
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ID=56946714
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| KR1020160013620A KR101657299B1 (ko) | 2016-02-03 | 2016-02-03 | 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물 |
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| KR (1) | KR101657299B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180080494A (ko) * | 2017-01-04 | 2018-07-12 | 연세대학교 산학협력단 | 세포 노화 억제용 또는 피부 노화 개선용 조성물 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050036946A (ko) * | 2002-07-03 | 2005-04-20 | (주)넥스젠 | 상피세포재생인자 및 인간 혈청 알부민을 포함하는 융합폴리펩타이드 |
| KR20140091986A (ko) * | 2013-01-14 | 2014-07-23 | (주)넥스젠바이오텍 | 녹색형광단백질―인간상피세포재생인자 융합단백질의 생산을 위한 유전자 컨스트럭트 및 이를 이용한 녹색형광단백질-인간상피세포재생인자 융합단백질의 생산방법 |
-
2016
- 2016-02-03 KR KR1020160013620A patent/KR101657299B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050036946A (ko) * | 2002-07-03 | 2005-04-20 | (주)넥스젠 | 상피세포재생인자 및 인간 혈청 알부민을 포함하는 융합폴리펩타이드 |
| KR20140091986A (ko) * | 2013-01-14 | 2014-07-23 | (주)넥스젠바이오텍 | 녹색형광단백질―인간상피세포재생인자 융합단백질의 생산을 위한 유전자 컨스트럭트 및 이를 이용한 녹색형광단백질-인간상피세포재생인자 융합단백질의 생산방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180080494A (ko) * | 2017-01-04 | 2018-07-12 | 연세대학교 산학협력단 | 세포 노화 억제용 또는 피부 노화 개선용 조성물 |
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