KR101657298B1 - 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질, 대장균 코돈 최적화된 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 인간 상피세포재생인자 융합단백질 코딩 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 생산하는 방법 및 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 피부 탄력 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 세포 증식 효과가 있으면서, 피부 주름 개선 및 피부 탄력 유지 효과를 증진시킬 수 있으므로, 기능성 화장료 원료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물{Human epidermal growth factor fusion protein with increased cell proliferation effect and cosmetic composition for improving wrinkle and elasticity of skin comprising the same as effective component}

본 발명은 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품 산업의 급속한 발전은 화장품 신소재 개발을 유도해 왔다. 현재 화장품 산업 전반에 걸쳐 신소재 개발을 위한 기술과 고 기능성 화장품의 개발 등이 지속적으로 이루어지고 있는 실정이다. 특히 인간 상피세포재생인자(Human Epidermal Growth Factor, hEGF)는 주름 개선, 미백 등 피부 재생 효과가 뛰어나 소비자의 주목을 받고 있는 소재 중 하나이다.

사람의 피부는 성년(~25세) 이후 신진대사나 세포의 재생 능력이 저하됨에 따라 색소 침착 및 주름 형성 등이 유발되며 피부 노화 현상이 진행된다. 피부 재생 효과가 우수한 인간 상피세포재생인자는 피부 재생을 위한 의약품 치료제로서 사용되어 왔으나, 피부의 저하된 재생능력을 돕고 피부 세포의 새로운 세포 성장을 촉진할 수 있는 기능을 가진 노화 방지용 기능성 화장품의 원료로 사용하기 위한 연구가 집중되어 왔다.

스피드로인(spidroin)이 주성분인 거미줄 단백질은 거미가 만드는 단백질 섬유로 7종의 실크 단백질이 존재한다. 거미 실크 단백질 중 가장 강한 드래그라인(dragline) 실크는 p-aramid 섬유인 케블라(kevlar)와 비슷한 장력을 가지며 편모상 실크는 드래그라인 실크보다 약 2배의 탄성력을 가진 것으로 알려져 있다.

거미 실크 단백질은 셀룰로스(cellulose)처럼 글라이신(glycine)과 알라닌(alanine)과 같은 아미노산 모티프의 반복된 형태를 가지며, 대부분 이러한 염기서열은 팽창된 실크의 β-sheet 부위에서 발견되었다. 이러한 β-sheet 부위들은 섬유에서 결정체 부위를 연결하는 형태를 이루며 실크 단백질의 높은 장력을 부여한다. 거미줄의 피롤리딘(pyrrolidine) 성분은 흡습성(hygroscopic property)을 가지며 동시에 거미줄에 촉촉함을 유지시켜 준다. 또한 인산 수소 칼륨은 수용액 속에서 양성자를 생성하여 실크의 산성화를 유도함으로써 곰팡이와 박테리아로부터 거미줄을 보호하는 역할을 한다. 거미 실크 단백질의 이러한 특성은 보습 및 피부 탄력 유지를 위해 화장품 원료로 많이 사용되고 있는 고분자의 콜라겐을 대체할 수 있는 신소재 원료로 유용할 것이다.

인간 상피세포재생인자의 생산을 위해 많은 연구가 진행되어 왔으나, 정제과정 중 발생하는 여러 문제점들 특히, 침전 및 빈번한 농축 과정에서 발생하는 회수율 감소 등으로 대량생산 공정에는 적합하지 못한 문제점들이 발생하였다. 이 후, 인간 상피세포재생인자를 암호화하는 유전자를 대장균, 고초균, 효모 등에서 발현시키고자 하는 시도가 보고되었지만, 고초균 및 효모에서의 발현율은 매우 낮았으며, 대장균에서 발현시킬 경우에는 세포 내에서 쉽게 단백질 분해효소에 의해 분해되어 발현율과 수율이 낮은 것으로 확인되었다. 이 후, 순도가 높은 인간 상피세포재생인자를 얻기 위한 과정으로 C18 컬럼을 사용한 고속액체 크로마토그래피(HPLC) 정제 방법 등의 공정단계가 필요하여 가격이 매우 비싸지는 단점을 가지고 있었다.

고분자의 거미 실크 단백질 합성은 대장균에서 처음 성공하였으며, 2000년 캐나다 생명공학 회사인 넥시아(Nexia)는 유전자가 이식된 염소의 우유로부터 거미 실크 단백질을 얻었다. 독일의 암실크(AMSilk)사는 박테리아를 사용하여 거미 실크 단백질을 만드는데 성공하였으나, 고분자의 불용성 거미 실크 단백질 합성에 의해 활성을 지닌 거미 실크 단백질을 얻기 위해서는 여러 공정을 필요로 하여 가격이 매우 비싼 단점이 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 거미 실크 단백질과 인간 상피세포재생인자의 공정단계의 문제점들을 해소하고 거미 실크 단백질과 인간 상피세포재생인자의 특성을 가진 신규 융합단백질을 보다 고수율로 간이하게 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 한 결과, 인간 상피세포재생인자와 거미 실크 단백질의 융합단백질을 응집체(inclusion bodies) 형태로 대장균과 같은 숙주세포 내에서 생산함으로써, 대장균 내 발현시킨 경우에도 안정된 융합단백질의 형태로 존재하여 발현율 및 수율이 높으며 분리정제가 간이하도록 하였으며, 대량 생산공정에 적합함을 발견하였다.

한편, 한국등록특허 제1565542호에는 '거미줄 추출물을 함유하는 피부 리프팅 및 노화 방지용 화장료 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0056022호에는 '상피세포 성장인자의 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인간 상피세포재생인자에 거미 실크 단백질을 융합하여 세포 증식 효과가 증가된 신규의 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 생산하였다. 상기 인간 상피세포재생인자 융합단백질은 피부세포의 성장을 촉진시킬 뿐만 아니라, 상기 융합단백질을 유효성분으로하여 다양한 화장품(스킨, 에센스, 로션 및 크림) 제형을 제조한 후 피부 테스트를 수행한 결과, 피험자들의 피부 주름 개선, 미백 및 탄력 유지 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 대장균 코돈 최적화된 인간 상피세포재생인자-거미 실크 단백질 융합단백질 코딩 유전자를 이용한 대장균에서의 생산 방법은 대장균 내에서 단백질이 응집체 형태로 발현되어 생산공정을 간소화하였으며, 단백질의 대량생산을 가능하게 하였고, 상기 방법에 의해 생산된 거미 실크 단백질과 융합된 인간 상피세포재생인자 융합단백질은 세포 증식 효과의 증가와 더불어, 피부 주름 개선 및 피부 탄력 유지를 통한 노화방지 기능이 우수하여, 기능성 화장료 원료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 인간 상피세포재생인자의 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드(pET22b::EGFSSP 및 pET22b::SSPEGF)의 제작 과정 및 대장균으로의 형질전환에 관한 모식도이다.
도 2는 대장균에서 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 수행한 결과이다. A는 단백질 발현 유도 전 또는 후의 세포를 초음파 파쇄기를 사용하여 파쇄한 세포 용해물의 전기영동 결과이며, B는 발현 유도 후의 세포 파쇄물 중 수용성 분획물과 응집체 분획물을 각각 로딩하여 융합단백질의 발현을 확인한 결과이다. M, 단백질 크기 마커; BI, 발현 유도(induction) 전 세포 조용해물(crude lysate); AI, 발현 유도 후 세포 조용해물; SE, 거미 실크 단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질; ES, 인간 상피세포재생인자-거미 실크 단백질 융합단백질; S, 발현 유도 후 세포 조용해물의 수용성 분획; IB, 발현 유도 후 세포 조용해물의 응집체 분획.
도 3은 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 정제 모식도이다.
도 4는 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 최종 분리, 정제 후 융합단백질을 확인하기 위한 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 결과(A)와 융합단백질 내 인간 상피세포재생인자 도메인을 확인하기 위해 검출 키트를 사용하여 확인한 결과(B)이다. C, EGF 대조군; T, 테스트 시료(각 융합단백질).
도 5는 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 피부섬유아세포에 대한 세포 증식 효과를 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 확인한 사진이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 거미 실크 단백질(spider silk protein)을 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 인간 상피세포재생인자(human epidermal growth factor) 단백질의 아미노 말단 또는 카복실 말단에 융합시켜 제작된 신규의 단백질이다.

본 발명에 따른 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 범위는 서열번호 3(거미 실크 단백질이 인간 상피세포재생인자의 아미노 말단에 융합) 또는 서열번호 4(거미 실크 단백질이 인간 상피세포재생인자의 카복실 말단에 융합)의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 세포 증식 효과를 가지면서 피부 주름 및 탄력 개선 활성을 의미한다.

본 발명은 또한, 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질 코딩 유전자는 서열번호 5(거미 실크 단백질이 인간 상피세포재생인자의 아미노 말단에 융합된 단백질의 코딩 유전자) 또는 서열번호 6(거미 실크 단백질이 인간 상피세포재생인자의 카복실 말단에 융합된 단백질의 코딩 유전자)의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로는, 상기 유전자는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

"코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 본 발명의 상기 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열은 거미 유래 실크 단백질 및 인간 유래 상피세포재생인자 단백질 코딩 유전자가 대장균 내에서 발현될 수 있도록 대장균의 코돈에 최적화된 서열이다.

본 발명은 또한, 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질 코딩 유전자는 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터는, pET22b 벡터에 합성한 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 5 또는 서열번호 6)를 5' 말단(NdeI 제한효소 사이트)과 3' 말단 (XhoI 제한효소 사이트)에 인프레임(in frame)으로 융합하여 제조하였고, 상기 유전자를 lac 프로모터(lac promoter)와 lac I 리프레서(lac I repressor)에 의하여 효과적으로 발현시켜 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는 벡터이다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Rosetta, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 생산 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 인간 상피세포재생인자 융합단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 세포 증식 효과가 증가된 단백질로, 인간 상피세포재생인자에 의해 피부 주름 개선의 효과를, 거미 실크 단백질로 인해 피부 탄력 증진 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서, 상기 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 함량은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000001 내지 0.0001 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 단백질의 함량이 0.000001 중량% 미만인 경우에는 주름 개선 및 피부 탄력 유지 효과가 미비하며, 0.0001 중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물의 제조

신규 인간 상피세포재생인자(Human Epidermal Growth Factor, hEGF)의 융합단백질을 코딩하는 최적화된 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물은 아래의 방법으로 제작하였다.

인간 상피세포재생인자와 파트너 단백질로 사용되는 거미 실크 단백질(spider silk protein, SSP)을 코딩하는 유전자를 주형으로 사용하여 숙주 미생물 내에서 발현될 수 있도록 최적화된, 159개의 아미노산으로 이루어진 인간 상피세포재생인자의 융합단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 5 및 서열번호 6) 단편들을 제작, 합성하였다.

인간 상피세포재생인자의 아미노 말단(N-말단)에 수용성 거미 실크 단백질이 결합된 융합단백질을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 정방향 프라이머(1)(5'-AAGGAGATATACATATGCAAGGTGCTGGTGCTGCCG-3', 서열번호 7)과 역방향 프라이머(1)(5'-GCACTCAGAGTCTGAGTTTGCGCCTGCTCCCTGTCC-3', 서열번호 8)을 사용하여 대장균에 적합하도록 최적화된 수용성 거미 실크 단백질을 코딩하는 315개의 뉴클레오티드를 합성하였으며, 정방향 프라이머(2)(5'-GGACAGGGAGCAGGCGCAAACTCAGACTCTGAGTGC-3', 서열번호 9)와 역방향 프라이머(2)(5'-GGTGGTGGTGCTCGAGGCGCAACTCCCACCATTTTAAG-3', 서열번호 10)를 사용하여 대장균에 적합하도록 최적화된 인간 상피세포재생인자를 코딩하는 159개의 뉴클레오티드를 합성하였다. 상기의 방법으로 합성한 각각의 수용성 거미 실크 단백질과 인간 상피세포재생인자를 코딩하는 유전자를 주형으로 하여 정방향 프라이머(1)과 역방향 프라이머(2)를 사용하여 최종적으로 인간 상피세포재생인자의 N-말단에 수용성 거미 실크 단백질이 결합된 융합단백질을 코딩하는 474개의 뉴클레오티드로 구성된 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 합성하였다.

인간 상피세포재생인자의 카복실 말단(C-말단)에 수용성 거미 실크 단백질이 결합된 융합단백질을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 정방향 프라이머(3)(5'-AAGGAGATATACATATGAACTCAGACTCTGAGTGC-3', 서열번호 11)과 역방향 프라이머(3)(5'-CGGCAGCACCAGCACCTTGGCGCAACTCCCACCATTTTAAG-3', 서열번호 12), 정방향 프라이머(4)(5'-CTTAAAATGGTGGGAGTTGCGCCAAGGTGCTGGTGCTGCCG-3', 서열번호 13)와 역방향 프라이머(4)(5'-GGTGGTGGTGCTCGAGTGCGCCTGCTCCCTGTCC-3', 서열번호 14)를 사용하여 인간 상피세포재생인자의 N-말단에 수용성 거미 실크 단백질이 결합된 융합단백질을 코딩하는 유전자를 합성하는 방법과 동일하게 인간 상피세포재생인자의 C-말단에 수용성 거미 실크 단백질이 결합된 융합단백질을 코딩하는 474개의 뉴클레오티드로 구성된 유전자를 합성하였다.

상기 유전자 단편과 재조합 플라스미드를 동일한 제한효소(5'-말단 NdeI 제한효소 사이트와 3'-말단 XhoI 제한효소 사이트)로 절단하고 삽입하여, 도 1에 나타낸 재조합 플라스미드(pET22b::EGFSSP 및 pET22b::SSPEGF)를 제작하였다. 제조된 재조합 플라스미드를 E. coli TOP10에 각각 형질전환시켜서, 숙주 미생물로부터 유전자 컨스트럭트를 대량 얻었다. 또한, 상기 재조합 플라스미드를 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS에 각각 형질전환시켜서, 숙주 미생물에 유전자 컨스트럭트가 삽입되어 있는, 인간 상피세포재생인자의 융합단백질 생산을 위한 재조합 미생물을 제작하였다.

실시예 2. 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 발현 유도 및 분리, 정제

실시예 1에서 제조한 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS를 각각 1ℓ LB 혹은 BSB 배지에서 회분 배양(batch culture) 시 OD₆₀₀=0.6~0.8이 될 때까지 혹은, 20ℓ 발효기를 사용하여 연속 배양 시 OD₆₀₀=15~20이 될 때까지 배양하였다. 이후, 세포 배양 배지에 각각 최종 1~5mM IPTG 또는 2% 락토오즈를 가하여 재조합 대장균의 유전자 발현을 유도하였다. 유전자 발현 유도 후 3~4시간 더 배양하고 세포들을 원심분리방법으로 회수하였다. 이 세포들을 완충용액(Phosphate buffered saline, NaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄ 1.44g, KH₂PO₄ 0.24g/L, pH 7.4)에 완전히 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기를 사용하여 세포를 파괴하고 세포 내 단백질 포함 용액을 분리하였다.

상기 분리된 용액들을 시료로 하여 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 단백질 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, IPTG 또는 락토오즈를 통해 발현 유도를 한 세포 조용해물에서 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 2). 또한, 전기영동 결과를 통해, 인간 상피세포재생인자 융합단백질은 응집체의 형태로 과량 발현된 것을 확인할 수 있었다(도 2B).

발현 확인된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 분리, 정제하기 위해서 응집체(inclusion body)를 가용화 완충용액(5M 요소(urea), pH 11)으로 가용화한 후 초미세 여과방법(0.45㎛ 정밀여과막과 1K 초미세여과막)을 이용하여 재접힘(refolding, 5mM Cysteine in Phosphate buffer(pH 9~10) 사용) 과정을 수행하였으며, 저장용 완충용액(Phosphate buffered saline, pH 7~8)을 사용하여 최종적으로 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 분리하였다. 도 3은 융합단백질의 정제 과정을 모식도로 나타낸 것이다.

상기 융합단백질을 완전히 분리, 정제하기 위해 분리한 융합단백질을 니켈-아가로즈 컬럼에 2~4㎖/분의 속도로 통과시켰다. 이어서 바인딩 완충용액(300mM NaCl in phosphate buffer, pH 7.4)으로 레진 부피의 10~20배의 볼륨으로 컬럼을 수 회 세척한 후 50, 80 및 300mM 이미다졸 용액(pH 7.4)을 컬럼에 적용하여 인간 상피세포재생인자의 융합단백질을 컬럼에서 50㎖씩 분획, 용출시킨 후 10mM 인산칼륨(potassium phosphate) 버퍼를 사용하여 버퍼 내 이미다졸을 제거하여 최종적으로 융합단백질을 순수하게 정제하였다.

최종 분리한 인간 상피세포재생인자의 융합단백질을 확인하기 위해서, 15% SDS-아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 최종 정제된 융합단백질을 예측된 크기 근처(약 15.5kDa)에서 확인할 수 있었다(도 4A). 도 4B는 최종 분리한 인간 상피세포재생인자의 융합단백질을 EGF 검출 키트를 사용하여 융합단백질 내 EGF 함유 여부를 확인한 결과이다.

실시예 3. 인간 상피세포재생인자의 융합단백질의 활성 측정-피부섬유아세포의 세포 증식 효과

실시예 2에서 분리, 정제된 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 존재가 확인된 시료를 택하여 융합단백질의 활성을 측정하였다.

피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cell)를 배양한 후 세포에 0, 0.02ppm 및 0.2ppm 농도의 융합단백질 및 인간 상피세포재생인자 단백질을 처리하고, 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 크리스털 바이올렛 염색법으로 피부섬유아세포의 증식 여부를 확인하였다.

그 결과 거미 실크 단백질을 융합한 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 농도가 증가할수록 무처리 대조군과 비교하여 피부섬유아세포의 증식 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(도 5). 또한, 거미 실크 단백질을 융합하지 않은 인간 상피세포재생인자 단백질 처리군에 비해서 융합단백질의 세포 증식 효과가 더 높게 관찰되었다. 상기 결과를 통해, 거미 실크 단백질을 융합한 인간 상피세포재생인자 융합단백질은 세포 증식 효과가 증가되었음을 유추할 수 있었다.

실험예 1. 피부 재생 및 피부 탄력 유지 효과에 관한 피부자극관능시험

상기 실시예 2에서 최종 분리, 정제된 인간 상피세포재생인자의 융합단백질을 유효성분으로 하여 제조예 1, 2, 3 및 4와 비교예 1, 2, 3 및 4의 화장료 조성물을 제조하여 관능시험을 실시하였다.

구체적으로는, 주름 개선과 미백 관련 피부 재생 효과와 피부 탄력 유지 항목을 확인하기 위해 30세 이상 60세 미만의 여성과 남성 총 30명(30대 10명, 40대 10명, 50~60대 10명)을 대상으로 하여, 주름이 많이 분포하는 안면 왼쪽 눈가 부분 혹은 왼쪽 입술 주변에는 비교예(대조군)를, 안면 오른쪽 눈가 부분 혹은 오른쪽 입술 주변에는 제조예(시험군)를 1일 1회 2주간 지속적으로 사용하게 하였다. 평가는 눈 혹은 입술 주위 부분의 주름 펴짐 현상과 미백 관련(피부색 톤의 변화 정도) 항목을 평가하였다. 또한, 상기 기능 항목 중 하나인 피부 탄력 유지 효과에 대해서도 동일한 방법으로 피부 탄력 유지 일수에 대한 만족도를 평가하였다. 피부 자극 항목에 대해서도 동일한 방법으로 피부의 가려움, 따가움 및 홍반 현상 등에 관하여 관능시험을 실시하였다. 평가 기준은 매우 우수(5점), 우수(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였다.

<제조예 1 및 비교예 1>

인간 상피세포재생인자-거미 실크 단백질의 융합단백질(EGF-SSP)을 첨가 또는 무첨가하여 하기 표 1에 기재된 성분과 함량으로 스킨을 제조하였다.

스킨 화장료 조성물

성분	제조예 1 (중량 %)	비교예 1 (중량 %)
EGF-SSP	0.00002	-
아미노산 스탁	0.1	0.1
미네랄 혼합물	0.0007	0.0007
정제수	잔량	잔량

상기의 제조예 1 및 비교예 1의 관능시험 결과는 하기 표 2와 같다.

<제조예 2 및 비교예 2>

인간 상피세포재생인자-거미 실크 단백질의 융합단백질(EGF-SSP)을 첨가 또는 무첨가하여 하기 표 3에 기재된 성분과 함량으로 에센스를 제조하였다.

에센스 화장료 조성물

성분	제조예 2 (중량 %)	비교예 2 (중량 %)
EGF-SSP	0.00002	-
아미노산 스탁	0.05	0.05
미네랄 혼합물	0.0007	0.0007
글리세롤	5	5
1,3-부틸렌글리콜	10	10
카보폴 940	0.3	0.3
정제수	잔량	잔량

상기의 제조예 2 및 비교예 2의 관능시험 결과는 하기 표 4와 같다.

<제조예 3 및 비교예 3>

인간 상피세포재생인자-거미 실크 단백질의 융합단백질(EGF-SSP)을 첨가 또는 무첨가하여 하기 표 5에 기재된 성분과 함량으로 로션을 제조하였다.

로션 화장료 조성물

성분	제조예 3 (중량 %)	비교예 3 (중량 %)
EGF-SSP	0.00002	-
아미노산 스탁	0.05	0.05
미네랄 혼합물	0.0007	0.0007
글리세롤	3	3
1,3-부틸렌글리콜	10	10
미네랄 오일	5	5
세틸알코올	2	2
잔탄검	0.5	0.5
정제수	잔량	잔량

상기 제조예 3 및 비교예 3의 관능시험 결과는 하기 표 6과 같다.

<제조예 4 및 비교예 4>

인간 상피세포재생인자-거미 실크 단백질의 융합단백질(EGF-SSP)을 첨가 또는 무첨가하여 하기 표 7에 기재된 성분과 함량으로 크림을 제조하였다.

크림 화장료 조성물

성분	제조예 4 (중량 %)	비교예 4 (중량%)
EGF-SSP	0.00002	-
아미노산 스탁	0.05	0.05
미네랄 혼합물	0.0007	0.0007
글리세롤	2	2
미네랄 오일	10	10
올르브유화 왁스	3	3
세틸알코올	2	2
정제수	잔량	잔량

상기의 제조예 4 및 비교예 4의 관능시험 결과는 하기 표 8과 같다.

<110> Nexgen Biotechnologies, Inc. <120> Human epidermal growth factor fusion protein with increased cell proliferation effect and cosmetic composition for improving wrinkle and elasticity of skin comprising the same as effective component <130> PN15462 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spider silk protein <400> 1 Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly 20 25 30 Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Leu 50 55 60 Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala 85 90 95 Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala 100 105 <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1 5 10 15 Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn 20 25 30 Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys 35 40 45 Trp Trp Glu Leu Arg 50 <210> 3 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SSP-EGF <400> 3 Met Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln 1 5 10 15 Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr 20 25 30 Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly 50 55 60 Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly 85 90 95 Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Asn Ser Asp Ser Glu Cys 100 105 110 Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr 115 120 125 Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile 130 135 140 Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg 145 150 155 <210> 4 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF-SSP <400> 4 Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu 1 5 10 15 His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys 20 25 30 Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu 35 40 45 Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala 65 70 75 80 Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly 85 90 95 Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly 100 105 110 Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly 115 120 125 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly 130 135 140 Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala 145 150 155 <210> 5 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSP-EGF <400> 5 atgcaaggtg ctggtgctgc cgcagccgca gcaggtggtg ctggtcaagg gggctatggt 60 ggactaggtg gacaaggtgc cggccaggga ggctatggtg gtcttggtag tcaaggagca 120 ggacgtggag gtcttggtgg acaaggggct ggcgccgcag ccgccgctgc cggtggagca 180 ggtcaaggag gacttggagg acagggtgcc ggtcaaggag ctggcgctgc cgctgctgct 240 gccgggggtg ctgggcaggg aggatacggg ggtctaggat cccaaggcgc aggtcgtgga 300 ggacagggag caggcgcaaa ctcagactct gagtgcccac tgtctcacga cggctactgc 360 cttcacgacg gagtctgcat gtacatcgag gctttggata agtacgcttg taattgcgtc 420 gttggttaca ttggagagcg ctgccaatac cgtgacttaa aatggtggga gttgcgc 477 <210> 6 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF-SSP <400> 6 atgaactcag actctgagtg cccactgtct cacgacggct actgccttca cgacggagtc 60 tgcatgtaca tcgaggcttt ggataagtac gcttgtaatt gcgtcgttgg ttacattgga 120 gagcgctgcc aataccgtga cttaaaatgg tgggagttgc gccaaggtgc tggtgctgcc 180 gcagccgcag caggtggtgc tggtcaaggg ggctatggtg gactaggtgg acaaggtgcc 240 ggccagggag gctatggtgg tcttggtagt caaggagcag gacgtggagg tcttggtgga 300 caaggggctg gcgccgcagc cgccgctgcc ggtggagcag gtcaaggagg acttggagga 360 cagggtgccg gtcaaggagc tggcgctgcc gctgctgctg ccgggggtgc tgggcaggga 420 ggatacgggg gtctaggatc ccaaggcgca ggtcgtggag gacagggagc aggcgca 477 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aaggagatat acatatgcaa ggtgctggtg ctgccg 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcactcagag tctgagtttg cgcctgctcc ctgtcc 36 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggacagggag caggcgcaaa ctcagactct gagtgc 36 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggtggtggtg ctcgaggcgc aactcccacc attttaag 38 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aaggagatat acatatgaac tcagactctg agtgc 35 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cggcagcacc agcaccttgg cgcaactccc accattttaa g 41 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cttaaaatgg tgggagttgc gccaaggtgc tggtgctgcc g 41 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggtggtggtg ctcgagtgcg cctgctccct gtcc 34

Claims (10)

1. 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질.
2. 제1항의 피부 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제4항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 생산 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 인간 상피세포재생인자 융합단백질의 생산 방법.
8. 제6항의 방법에 의해 생산된 인간 상피세포재생인자 융합단백질.
9. 제1항의 인간 상피세포재생인자 융합단백질 또는 제8항의 인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물.
10. 삭제

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