JP2018529385A - 皮膚細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質及びこれを有効成分として含む皮膚しわの改善及び皮膚弾力の維持のための化粧料組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなる皮膚細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質、大腸菌コドンに最適化した配列番号１の塩基配列からなるヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子、前記遺伝子を含む組換えベクター、前記組換えベクターに形質組み替えされた宿主細胞、前記組換えベクターで宿主細胞を形質組み替えさせてヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を生産する方法及びヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として含む皮膚しわの改善及び皮膚弾力の維持のための化粧料組成物に係り、本発明の化粧料組成物は熱安定性に優れ、皮膚しわの改善及び皮膚弾力維持効果を増進させられるため、今後機能性化粧品分野または美容整形分野に有用に使われうる。

Description

本発明は、皮膚細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質及びこれを有効成分として含む皮膚しわの改善及び皮膚弾力の維持のための化粧料組成物に関する。

皮膚は表皮、真皮、皮下組職からなっている。皮膚は外部から流れ込む菌の浸透を防ぐと同時に体内の水分保持及び体温の維持に重要な役割を行っている。表皮は、皮膚の保護と体温調節及び水分保持の機能を行い、かつ皮膚の弾力性及び柔軟性に関与する細胞外基質からなっている。真皮は皮膚の老化と直接的な関係がある。

ヒト上皮細胞成長因子（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ｈＥＧＦ）は、細胞表面に存在する上皮細胞成長因子受容体と結合して上皮細胞成長因子受容体の二量化反応を誘導する。二量体の上皮細胞成長因子受容体は、受容体内に存在するチロシンキナーゼを活性化させて細胞内の信号伝逹システムを誘導し、このような過程を通じて細胞内では解糖作用及びタンパク質合成が促進されて最終的に細胞の成長が進む。

皮膚再生の重要な役割を行う上皮細胞成長因子は老化が進行するほど低減するが、上皮細胞成長因子の低減は皮膚細胞の増殖及び移動の低減を引き起こして皮膚の老化、しわ増加、弾力低下などの現象を示す。

クロドクシボグモ（Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ）のクモ毒のうち一つであるＰｎＴｘ２−６は、複数のグルタミン酸とシグナルペプチドとで構成された４０３個のヌクレオチドからなっている。ＰｎＴｘ２−６はナトリウム・イオンチャネルのフローに影響を与え、麻酔させた鼠の勃起を誘導すると知られている。

クロドクシボグモのクモ毒は３，５００〜９，０００Ｄａサイズのポリペプチドであって１００種以上が知られており、ＴＴＸ（テトロドトキシン）に敏感な方法でアセチルコリン及びグルタミン酸の分泌を誘導して皮質シナプトソーム内へのナトリウムイオンの流れ込みを増大させることでナトリウムチャネルの不活性化を邪魔する。これにより持続勃起症の現象が起きる。

持続勃起症の現象を誘導するクロドクシボグモのクモ毒の一つであるＰｎＴｘ２−６は、２０１０年以来、世界中でバイアグラを置き換えられる天然タンパク質として研究が続いている。しかし、現在まで正確なＰｎＴｘ２−６の細胞内作用メカニズムは知られず、バイアグラを置き換える天然タンパク質として使用するための量産に関する研究もほとんど知られていない。

一方、韓国登録特許第１６１３３０２号明細書には「ＳＶ８２ポリペプチド及びこれを有効成分として含む皮膚しわの改善及び皮膚弾力の維持のための化粧料組成物」が開示されており、韓国公開特許第２０１５−００５６０２２号明細書には「上皮細胞成長因子の融合タンパク質を含む皮膚改善のための化粧料組成物」が開示されているが、本発明の細胞増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質及びこれを有効成分として含む皮膚しわの改善及び弾力維持のための化粧料組成物については記載されていない。

本発明は、前記のような要求に応じて導出されたものであり、本発明者はクモ毒タンパク質にヒト上皮細胞成長因子を融合して新規細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を生産した。前記ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質は皮膚細胞の増殖を促進させるだけではなく熱安定性に非常に優れ、これを有効成分として多様な化粧品（スキン、エッセンス、ローション及びクリーム）剤型を製造した後で皮膚テストを行った結果、被験者の皮膚しわの改善及び弾力維持効果を確認した上で本発明を完成した。

前記課題を解決するために、本発明は配列番号２のアミノ酸配列からなる皮膚細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を提供する。

また、本発明は前記融合タンパク質をコードする遺伝子を提供する。

また、本発明は前記遺伝子を含む組換えベクターを提供する。

また、本発明は前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。

また、本発明は前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換させてヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を過発現させるステップを含む、宿主細胞でのヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の生産方法を提供する。

また、本発明は配列番号２のアミノ酸配列からなるヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として含む皮膚しわの改善及び皮膚弾力の維持のための化粧料組成物を提供する。

本発明の大腸菌コドンに最適化したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質のコーディング遺伝子を用いた大腸菌での生産方法は、大腸菌内でタンパク質が凝集体状に発現して生産工程を簡素化し、かつタンパク質の大量生産を可能にし、前記方法によって生産されたヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質は熱安定性を持ち、皮膚しわの改善及び皮膚弾力の維持機能に優れて機能性化粧料の原料として有用に使われる。

ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質（ＥＳＶ）の暗号遺伝子を含む組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＥＳＶ）の製作過程及び大腸菌への形質転換に関する模式図である。 大腸菌でのヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質（クモ毒タンパク質のアミノ末端にヒト上皮細胞成長因子が融合されたヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質、ＥＳＶ）の発現如何を分離確認した結果を示すものである。Ａは、発現如何を確認するためにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳働を行った結果である。１は大きさマーカー、２〜４は発現誘導前の細胞粗溶解物、５〜７は発現誘導後の細胞粗溶解物、８は発現誘導後の総水溶性タンパク質、９は発現誘導後の総不溶性（封入体）タンパク質、矢印は予想ＥＳＶである。Ｂは、ニッケルアガロースカラムを使って最終的に分離したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳働を行った結果であり、Ｃは、最終的に分離したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質のヒト上皮細胞成長因子ドメインを確認するためにＥＧＦ検出キットを使ってヒト上皮細胞成長因子ドメインを確認した結果である。ＣはＥＧＦ対照群、Ｔはテスト試料である。 ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質（ＥＳＶ）を皮膚線維芽細胞で処理した後、皮膚線維芽細胞の細胞増殖効果をクリスタルバイオレット染色を通じて確認した写真である。 タンパク質の熱安定性を検証するために、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質（ＥＳＶ）をそれぞれガンマ滅菌または高圧滅菌した後で皮膚線維芽細胞で処理し、各タンパク質処理による皮膚線維芽細胞の細胞増殖如何をクリスタルバイオレット染色を通じて確認した写真である。 ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質（ＥＳＶ）をＨａＣａＴ細胞で処理した後、ＨａＣａＴ細胞の増殖効果を確認した結果を示すものである。 ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質（ＥＳＶ）をＨａＣａＴ細胞で処理した後、ＨａＣａＴ細胞の傷治癒効果を観察した細胞の写真である。 ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質（ＥＳＶ）をコーティングしたマルチウェルをＨａＣａＴ細胞で処理して、ＨａＣａＴ細胞とヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質との接合効果を確認した結果を示すものである。

本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなる皮膚細胞の増殖効果の増大したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を提供する。

本発明によるヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の範囲は、配列番号２のアミノ酸配列を持つタンパク質及び前記タンパク質の機能的同等物を含む。「機能的同等物」とは、アミノ酸の付加、置換または欠失の結果、前記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、もっと望ましくは９５％以上の配列相同性を持つものであって、配列番号２で表示されるタンパク質と実質的に同質の活性を示すタンパク質をいう。「実質的に同質の活性」とは、皮膚しわの改善及び皮膚弾力維持の活性を意味する。本発明はまた、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の断片、誘導体及び類似体を含む。本願に使われた用語「断片」、「誘導体」及び「類似体」とは、本発明のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質と実質的に同じ生物学的機能または活性を持つポリペプチドをいう。

本発明のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質は、望ましくは配列番号２の１０３個のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のうち１番目ないし５３番目のアミノ酸配列からなるヒト上皮細胞成長因子タンパク質と、５４番目ないし１０３番目のアミノ酸配列からなるクモ毒タンパク質とを融合させて製作した新規タンパク質でありうる。

本発明はまた、前記皮膚細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子を提供する。前記遺伝子は大腸菌コドンに最適化した配列番号１の塩基配列からなりうるが、これに制限されるものではない。

本発明による前記皮膚細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列を含むことができる。また、前記塩基配列の相同体が本発明の範囲内に含まれる。具体的には、前記遺伝子は配列番号１の塩基配列からなる群から選択される塩基配列とそれぞれ７０％以上、さらに望ましくは８０％以上、もっと望ましくは９０％以上、一番望ましくは９５％以上の配列相同性を持つ塩基配列を含む。ポリヌクレオチドについての「配列相同性の％」は最適に配列された二つの配列と比較領域とを比べることで確認され、比較領域でのポリヌクレオチド配列の一部は二つの配列の最適の配列についての参照配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。

「コドンに最適化」は、コードされたタンパク質が有機体でさらに効率的に発現するように特定有機体で優先的に使われることでタンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを変化させることを意味する。ほとんどのアミノ酸が「同義語」または「同意」コドンという、いくつかのコドンによって表示されるという点で、遺伝子コードが縮退的であるが、特定有機体によるコドン用法は任意的ではなく特定コドントリプレットに偏向的である。このようなコドン用法偏向性は、所定遺伝子、共通機能または先祖起源の遺伝子、高度に発現するタンパク質に比べて低い複製数のタンパク質、及び有機体ゲノムの集合的タンパク質コーディング領域に関してさらに高い。本発明の前記配列番号１の塩基配列は、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子が大腸菌内で発現するように大腸菌のコドンに最適化した配列である。

本発明はまた、前記遺伝子を含む組換えベクター及び前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。

用語「組換え」とは、細胞が異種の核酸を複製するか、前記核酸を発現するか、またはペプチド、異種のペプチドまたは異種の核酸によって暗号化されたタンパク質を発現する細胞を称する。組換え細胞は、前記細胞の天然形態では見つけられない遺伝子または遺伝子の切片をセンスまたはアンチセンス形態のうち一つで発現できる。また組換え細胞は、天然状態の細胞で見つけられる遺伝子を発現できるものの、前記遺伝子は変形されたものであって、人為的な手段によって細胞内に再導入されたものである。

本発明で、前記ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子は組換え発現ベクター内に挿入され得る。用語「組換え発現ベクター」とは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、または他のベクターを意味する。大体、任意のプラスミド及びベクターは宿主内で複製及び安定化できるものであれば使われうる。前記発現ベクターの重要な特性は、複製原点、プロモーター、マーカー遺伝子及び翻訳調節要素を持つことである。

ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子配列及び適当な転写／翻訳調節信号を含む発現ベクターは当業者に周知の方法によって構築される。前記方法は、試験管内の組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術及び生体内の組換え技術などを含む。前記ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を導くために発現ベクター内の適当なプロモーターに効果的に連結されうる。また発現ベクターは翻訳開始部位として、リボソーム結合部位及び転写ターミネータを含む。

本発明の一具現例による組換えベクターは、ｐＥＴ２２ｂベクターに合成したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）を５’末端（ＮｄｅＩ制限酵素サイト）及び３’末端（ＸｈｏＩ制限酵素サイト）にインフレームに融合して製造し、前記遺伝子をｌａｃプロモーター及びｌａｃＩリプレッサーによって効果的に発現させてヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を製造することを特徴とするベクターである。

本発明のベクターを原核細胞に安定して連続的にクローニング及び発現できる宿主細胞ならば当業者に公知のいかなる宿主細胞も用いられ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンス及び多様なシュードモナス属のような腸内菌や菌株などがある。

また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株）及び植物細胞などが用いられる。

本発明の一具現例による組換えベクターに形質転換された宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌でありうるが、これに制限されるものではない。

本発明のベクターを宿主細胞内で運ぶ方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ_２方法、ハナハン方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９８３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０）及び電気穿孔方法などによって施される。また、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムポスフェート沈澱法、電気穿孔法、リポソーム媒介形質感染法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、及び遺伝子衝撃などによってベクターを宿主細胞内に注入できる。

本発明はまた、前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換させてヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子を過発現させるステップを含む、宿主細胞でのヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の生産方法を提供する。

本発明の一具現例による方法で、前記宿主細胞は望ましくは大腸菌であり、さらに望ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌であるが、これに制限されるものではない。

本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として含む皮膚しわの改善及び皮膚弾力の維持のための化粧料組成物を提供する。

本発明の一具現例による化粧料組成物で前記ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の含量は、化粧料組成物の総重量対比０．０００００１ないし０．０２重量％で含まれうるが、これに制限されるものではない。

本発明の化粧料組成物には前記有効成分以外に化粧品組成物に通常に用いられる成分を含むが、例えば、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤とキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤剤、エッセンシャル・オイル、染料、顔料、親水性または親油性の活性剤、脂質小胞のような通常の補助剤、そして担体を含む。

本発明の組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤型にも製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどに剤型化できるが、これに限定されるものではない。さらに詳細には、スキン、皮膚軟化剤、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、アイクリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレンジングフォーム、クレンジングウォータ、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、石鹸及びパウダーの化粧品剤型に製造できる。

本発明の化粧料組成物の剤型がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられる。

本発明の化粧料組成物の剤型がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーである場合には、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体をさらに含む。

本発明の化粧料組成物の剤型が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解剤または油濁剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

本発明の化粧料組成物の剤型が懸濁液である場合には、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラカントなどが用いられる。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものであるだけであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の生産のための組換え発現ベクター及び形質転換組換え微生物の製造
ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする最適化した遺伝子、組換え発現ベクター及び形質転換組換え微生物は、次の方法で製作した。

クモ毒タンパク質とパートナータンパク質として使われるヒト上皮細胞成長因子タンパク質とをコードする遺伝子を鋳型として使って宿主微生物内で発現されるように最適化した、１０３個のアミノ酸からなるヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）断片を製作及び合成した。

ヒト上皮細胞成長因子のカルボキシル末端（Ｃ−末端）にクモ毒タンパク質が結合されたヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質（配列番号２）をコードする遺伝子を合成するために、フォワードプライマー１（５’−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＣ−３’、配列番号３）及びリバースプライマー１（５’−ＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＣＧＣＡＡＣＴＣ−３’、配列番号４）を用いて大腸菌に好適に最適化したヒト上皮細胞成長因子をコードする１５９個のヌクレオチド（配列番号１の１〜１５９番目の塩基配列）を合成し、フォワードプライマー２（５’−ＧＡＧＴＴＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＧＣＴ−３’、配列番号５）及びリバースプライマー２（５’−ＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＴＧＣＡ−３’、配列番号６）を使って大腸菌に好適に最適化したクモ毒タンパク質をコードする１５０個のヌクレオチド（配列番号１の１６０〜３０９番目の塩基配列）を合成した。前記の方法で合成したそれぞれのヒト上皮細胞成長因子タンパク質及びクモ毒をコードする遺伝子を鋳型としてフォワードプライマー１（配列番号３）及びリバースプライマー２（配列番号６）を使って、最終的にヒト上皮細胞成長因子のＣ−末端にクモ毒タンパク質が結合された融合タンパク質をコードする３０９個のヌクレオチドからなる遺伝子を、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて合成した。

前記遺伝子断片及び組換えプラスミドを同じ制限酵素（５’末端ＮｄｅＩ及び３’末端ＸｈｏＩ）で切断して挿入し、図１に示す組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＥＳＶ）を製作した。製造された組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０に形質転換させて宿主微生物から大量の遺伝子コンストラクトを得た。

次いで、製造された組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）に形質転換させて、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質生産のための組換え微生物を製作した。

＜実施例２＞ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の発現誘導、分離及び精製
実施例１で製造したＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをそれぞれ１ＬのＬＢ培地（１０％トリプトファン、１０％塩化ナトリウム及び５％酵母抽出物）あるいはＢＳＢ培地（１％トリプトファン、０．５％酵母抽出物、１％グルコース及び０．１％ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、（株）ネクスジェンバイオテク社製）を使って回分培養する時にＯＤ_６００＝０．６〜０．８になるまで、または２０Ｌの発酵器を使って連続培養する時にはＯＤ_６００＝１５〜２０になるまで培養した。次いで、細胞培養培地にそれぞれ最終１〜５ｍＭ ＩＰＴＧまたは２％ラクトースを加えて組換え大腸菌の遺伝子発現を誘導した。遺伝子発現の誘導後に３〜４時間さらに培養して細胞を遠心分離方法を用いて回収した。この細胞を緩衝溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、８ｇの塩化ナトリウム、０．２ｇの塩化カリウム、１．４４ｇのリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、０．２４ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）／Ｌ、ｐＨ７．４）に完全に懸濁させた後、超音波破砕機を使って細胞を破壊して細胞内タンパク質を含む溶液を分離した。

前記分離された溶液を試料として１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動でタンパク質の発現如何を確認した。その結果、ＩＰＴＧまたはラクトースを通じて発現を誘導した細胞粗溶解物でヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の発現を確認することができた（図２Ａ）。

発現の確認されたヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を分離及び精製するために凝集体を可溶化緩衝溶液（５Ｍ尿素、ｐＨ１１）に可溶化した後、超微細ろ過方法（０．４５μｍの精密ろ過膜と１Ｋ超微細ろ過膜）を用いてリフォールディング過程を行い、保存用緩衝溶液（ＰＢＳ）を使って最終的にヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を分離した。

前記融合タンパク質を完全に精製するために分離した融合タンパク質をニッケル・アガロースカラムに１〜３ｍＬ／分の速度で通過させた。次いで、バインディング緩衝溶液でカラムを数回洗浄した後、５０、１０００及び２５０ｍＭのイミダゾール溶液（ｐＨ７．４）をカラムに適用してヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をカラムで１ｍＬずつ分画、溶出させた後、１０ｍＭのリン酸カリウムバッファを使ってバッファ内のイミダゾールを除去して最終的に融合タンパク質を純粋に精製し、その結果を調べるために１５％ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳働を行った。その結果、最終精製された融合タンパク質を予測されたサイズの近く（約１４〜１６ｋＤａ、ヒスタグを含む）で確認することができた（図２Ｂ）。最終的にＥＧＦ検出キットを使ってヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質内のＥＧＦドメインを確認した（図２Ｃ）。

＜実施例３＞ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の活性測定−皮膚線維芽細胞の細胞増殖効果
実施例２で分離及び精製したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の存在が確認された試料を選んでヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の活性を測定した。

皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｄｕｌｔ、ＨＤＦａ ｃｅｌｌ）を培養した後、細胞にそれぞれ０、０．０２ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ濃度の融合タンパク質を処理した後、３日間３７℃で培養した。次いで、クリスタルバイオレット染色法で皮膚線維芽細胞の増殖如何を確認した。

その結果、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の濃度（０．０２〜０．２ｐｐｍ）を増加させるほど無処理対照群（０ｐｐｍ）に比べて皮膚線維芽細胞の増殖効果が優秀であるということが分かった（図３）。また、それぞれの単一タンパク質処理群（ＥＧＦ、ＳＶ）に比べてヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質（ＥＳＶ）の細胞増殖効果がさらに高く観察された。これは、融合タンパク質内のＥＧＦ及びＳＶが、それぞれの全長タンパク質ではなくヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の製造に用いられたそれぞれの活性ドメインに該当し、同じ濃度（例えば、０．０２ｐｐｍ）の各タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を処理した場合に、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質のモル数はそれぞれのＥＧＦ及びＳＶに比べて約１／２になる。よって、同じ濃度について類似した皮膚線維芽細胞増殖効果が現れれば、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質はそれぞれのＥＧＦ及びＳＶに比べて約２倍の皮膚線維芽細胞の増殖効果を持つということになる。図３から分かるように、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を処理した場合がそれぞれのＥＧＦ及びＳＶの場合に比べて皮膚線維芽細胞の数がさらに多いため、少なくとも２倍以上の皮膚線維芽細胞の増殖効果を持つということが分かる。前記結果を通じて、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質は皮膚細胞の増殖効果が増大したということを類推することができた。

＜実施例４＞ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の熱安定性の分析
実施例２で分離及び精製したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の存在が確認された試料を選んで熱安定性を実験した。熱安定性実験は皮膚線維芽細胞にガンマ滅菌（３５ｋｇｒａｙの照射）または高圧滅菌（１２１℃で１５分間処理）したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をそれぞれ０．０２〜０．２ｐｐｍ濃度で処理し、３日間３７℃で培養した後、クリスタルバイオレット染色を通じてタンパク質処理による細胞増殖度を比べて分析した。

その結果、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質はガンマ滅菌または高圧滅菌処理した試験群でいかなる熱処理もしていない群と同様なレベルの細胞増殖を確認することができた（図４）。

前記の結果を通じて、本発明のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質が熱処理によってもタンパク質の活性を失わないということが分かり、皮膚細胞の増殖効果の増大した本発明のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質は、特に熱処理方法を用いた無防腐剤化粧品の製造に非常に有用に使われるということが分かった。

＜実施例５＞ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の活性測定−ＨａＣａＴ細胞の細胞増殖、傷治癒及び細胞接合の効果
実施例２で分離及び精製したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の存在が確認された試料を選んでヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の活性を測定した。融合タンパク質の活性の測定はＨａＣａＴ細胞を培養し、培養された細胞に融合タンパク質を０、０．０２ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ、２ｐｐｍ及び２０ｐｐｍ濃度で処理して培養細胞の細胞増殖、傷治癒及び細胞接合を分析して評価した。

先ず、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ^ＴＭ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、アメリカ）を使って細胞増殖を分析した時、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の処理によるＨａＣａＴ細胞の細胞増殖効果を確認することができ、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の濃度を増加させるほど（０．０２〜２０ｐｐｍ）優秀な細胞増殖効果を観察した（図５）。

ＨａＣａＴ細胞を培養した後でウェルにヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を０、０．０２ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ、２ｐｐｍ及び２０ｐｐｍ濃度で処理した後、６時間ごとに顕微鏡（オリンパスＣＫ４０、オリンパス社製、日本）で細胞を観察してＨａＣａＴ細胞の傷治癒効果を観察した。ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を処理したＨａＣａＴ細胞は、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の無処理対照群に比べて傷治癒効果を現わし、特にヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の濃度が増加するほど（０．０２〜２０ｐｐｍ）その効果が明らかなことを確認することができた（図６）。

最後に、０、０．０２ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ、２ｐｐｍ及び２０ｐｐｍ濃度のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を９６ウェル・プレートにコーティングした後でＨａＣａＴ細胞を処理し、１日間３７℃で培養した。次いで、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ^ＴＭ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬を使って細胞とヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質との接合効果を分析した。その結果、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を処理したＨａＣａＴ細胞はＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を処理した陰性対照群に比べて優れた接合効果を現わし、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の皮膚細胞との接合効果を確認した（図７）。

＜実験例１＞皮膚しわの改善、皮膚弾力維持効果及び皮膚刺激の官能試験
前記実施例２で分離及び精製したヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として、製造例１、２、３及び４と比較例１、２、３及び４の化粧料組成物を製造して官能試験を施した。

具体的には、しわ改善事項を確認するために３０才以上６０才未満の女性および男性の合計３０人（３０代の１０人、４０代の１０人、５〜６０代の１０人）を対象として、しわが多く分布する顔面の左側目元あるいは左側唇の周りには比較例（対照群）を、顔面の右側目元あるいは右側唇の周りには製造例（試験群）を１日１回２週間持続的に使うようにした。そして目や唇の周りの部分のシワが広がる程度を評価した。また、前記機能項目の一つである皮膚弾力維持効果についても同じ方法で皮膚弾力維持度を評価した。皮膚刺激項目についても同じ方法で皮膚のかゆみ、痛み及び紅斑現象などに関して官能試験を施した。評価基準は、非常に優秀（５点）、優秀（４点）、普通（３点）、悪い（２点）、非常に悪い（１点）の五点法基準とした。

＜製造例１及び比較例１＞
ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として添加し、下記の表１に記載の成分及び含量で製造例１のスキンを製造した。

また、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として添加せずに、下記の表１に記載の成分及び含量で比較例１のスキンを製造した。

前記製造例１及び比較例１の官能試験結果は、下記の表２の通りである。

＜製造例２及び比較例２＞
ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として添加し、下記の表３に記載の成分及び含量で製造例２のエッセンスを製造した。

また、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として添加せずに、下記の表３に記載の成分及び含量で比較例２のエッセンスを製造した。

前記製造例２及び比較例２の官能試験結果は、下記の表４の通りである。

＜製造例３及び比較例３＞
ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として添加し、下記の表５に記載の成分及び含量で製造例３のローションを製造した。また、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として添加せずに、下記の表５に記載の成分及び含量で比較例３のローションを製造した。

前記製造例３及び比較例３の皮膚しわの改善効果及び皮膚弾力維持効果に関する官能試験結果は、下記の表６の通りである。

＜製造例４及び比較例４＞
ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として添加し、下記の表７に記載の成分及び含量で製造例４のクリームを製造した。また、ヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として添加せずに、下記の表７に記載の成分及び含量で比較例４のクリームを製造した。

前記製造例４及び比較例４の官能試験結果は、下記の表８の通りである。

前記の官能試験結果を通じて、本発明のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として含む製造例１、２、３及び４が該比較例に比べて皮膚しわの改善及び皮膚弾力維持に効果があるということが分かった。

Claims (8)

1. 配列番号２のアミノ酸配列からなる皮膚細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質。
2. 請求項１に記載の皮膚細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子。
3. 前記遺伝子は大腸菌コドンに最適化した配列番号１の塩基配列からなることを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子。
4. 請求項２または３に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
5. 請求項４に記載の組換えベクターに形質転換された宿主細胞。
6. 請求項４に記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換させてヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質をコードする遺伝子を過発現させるステップを含む、宿主細胞でのヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の生産方法。
7. 前記宿主細胞は大腸菌であることを特徴とする、請求項６に記載のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質の生産方法。
8. 配列番号２のアミノ酸配列からなる皮膚細胞の増殖効果の増大した熱安定性のヒト上皮細胞成長因子−クモ毒の融合タンパク質を有効成分として含む、皮膚しわの改善及び皮膚弾力の維持のための化粧料組成物。