JP6261673B2

JP6261673B2 - 皮膚しわの改善及び弾力維持のための化粧料組成物

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Publication number: JP6261673B2
Application number: JP2016140761A
Authority: JP
Inventors: 宣教李; 悌根兪; 星蘭李; 漢鳳柳; 泰元崔; 鐘南崔; 兌ヒョン金
Original assignee: Nexgen Biotechnologies Inc
Current assignee: Nexgen Biotechnologies Inc
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2018-01-17
Anticipated expiration: 2036-07-15
Also published as: CN107033231A; JP2017118863A; EP3187167A1; US20170190747A1; KR101613302B1; US9879060B2

Description

本発明は、ＳＶ８２ポリペプチド、その遺伝子、組み換えベクター、形質転換された大腸菌、その生産方法、及びこれを有効成分として含む皮膚しわの改善及び弾力維持のための化粧料組成物に係り、より詳しくは、皮膚しわの改善及び弾力維持のためのＳＶ８２ポリペプチド、その遺伝子、組み換えベクター、形質転換された大腸菌、その生産方法、及びこれを有効成分として含む皮膚しわの改善及び弾力維持のための化粧料組成物に関する。

ブラジルドクシボグモ（Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ）のクモ毒のうち一つであるＰｎＴｘ２−６は、複数のグルタミン酸塩と信号ペプチドとで構成された４０３個のヌクレオチドからなっている。ＰｎＴｘ２−６は、ナトリウムチャネルの流れに影響を与え、麻酔させたネズミの勃起を誘導すると知られている。

ブラジルドクシボグモのクモ毒は、３，５００〜９，０００Ｄａサイズのポリペプチドであって１００種以上知られており、ＴＴＸ（ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ）の刺激的でない方法（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｗａｙ）でアセチコリンとグルタミン酸塩との分泌を誘導して皮質シナプトソーム内へのナトリウムイオンの流入を増多させることでナトリウムチャネルの不活性化を邪魔する。これにより、持続勃起現象を引き起こす。

持続勃起現象を誘導するブラジルドクシボグモのクモ毒のうち一つであるＰｎＴｘ２−６は、２０１０年以降に全世界的にバイアグラを代替できる天然タンパク質として研究が続いている。しかし、現在まで正確なＰｎＴｘ２−６の細胞内作用メカニズムは知られておらず、バイアグラを代替できる天然タンパク質として使うための大量生産に関する研究もほとんど知られていない。

ブラジルドクシボグモのＰｎＴｘ２−６は、８２個アミノ酸で構成され、かつ１０個のシステインで構成された約９ｋＤａのポリペプチドである。
ＰｎＴｘ２−６ポリペプチドがナトリウムイオンチャネルを通じて持続勃起現象を誘導する物質であると知られるにつれて、本発明者らはクモ毒ＳＶ８２（ｓｐｉｄｅｒｖｅｎｏｍ８２）ポリペプチドを今まで適用されていない美容整形及び化粧品組成物として用いようとしている。

しかし、ブラジルドクシボグモから天然のＰｎＴｘ２−６ポリペプチドを抽出できる方法は今まで知られておらず、クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを抽出できる方法も知られていない。したがって、遺伝工学的技法を用いたクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドの生産が不可欠であった。

前記のように、ＰｎＴｘ２−６ポリペプチドは、１０個のシステインが互いにシステイン・ノット構造を形成しているため、化学的な合成方法、酵母を用いた細胞外分離方法、及び固有の３次構造を維持しているペプチドを得るためのフュージョンパートナーのタンパク質使用は、大量生産を制限する（ＴｏｒｒｅｓＦＡｅｔａｌ．，２０１０，Ｔｏｘｉｃｏｎ．５６：１１７２−１１８０）。したがって、大腸菌を用いた細胞内生産及び大腸菌培養時に考慮すべき内毒素問題を解決するために、本発明者らは封入体を用いてクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドの大量生産及び内毒素問題を解決しようとした。

一方、特許文献１には、ホロレナ・カルタ種のクモ毒から分離したポリペプチドが開示されており、大韓民国公開特許第２０１３−０１０２６９８号明細書には雀蜂毒の抽出方法及びこれを用いた機能性化粧料組成物が開示されているが、本発明のＳＶ８２ポリペプチド及びこれを有効成分として含む皮膚しわの改善及び弾力維持のための化粧料組成物については記載していない。

韓国公開特許第１９９０−０００９６９５号公報

本発明は、前記の要求に応じてなされたものであり、本発明者らは、ＰｎＴｘ２−６遺伝子から由来するＳＶ８２遺伝子を大腸菌のコドンに最適化し、かつ前記最適化されたＳＶ８２遺伝子を用いた組み換えベクターを製造し、これを大腸菌に形質転換させてＳＶ８２ポリペプチドを生産した。また、前記生産されたＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として多様な化粧品（化粧水、エッセンス、ローション及びクリーム）剤型を製造した後、皮膚テストを行って被験者の皮膚しわの改善及び弾力維持効果を確認することで本発明を完成した。

前記の技術的課題を解決するために本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＶ８２（ｓｐｉｄｅｒｖｅｎｏｍ８２）ポリペプチドを提供する。
また、本発明は、大腸菌コドン最適化された配列番号１の塩基配列からなるＳＶ８２ポリペプチドコーディング遺伝子を提供する。

また、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。
また、本発明は、前記組み換えベクターに形質転換された大腸菌を提供する。
また、本発明は、前記組み換えベクターで宿主細胞を形質転換させ、宿主細胞でＳＶ８２ポリペプチドを生産する方法を提供する。
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として含む皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持のための化粧料組成物を提供する。

本発明の大腸菌コドン最適化されたＳＶ８２ポリペプチドコーディング遺伝子を用いた大腸菌での生産方法は、ＳＶ８２ポリペプチドの大量生産を可能にし、かつＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として含む皮膚しわの改善及び弾力維持のための化粧料組成物は、皮膚に少量塗布して皮膚内末梢神経の刺激を通じて細胞の持続勃起を誘導して、皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持効果を増進させるので、今後機能性化粧品分野または美容整形分野に有効に使われる。

本発明で使われたクモ毒ＳＶ８２ポリペプチド遺伝子を含む組み換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＳＶ８２）の製作過程及び大腸菌への形質転換に関する模式図である。大腸菌でＳＶ８２ポリペプチドの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動させて確認した結果を示す図面である。Ａは、１Ｌのバッチ培養による結果であり、Ｂは、２０Ｌの連続培養による結果である。凡例：Ｍ、サイズマーカー；ＢＩ、発現誘導前の細胞粗溶解物；ＡＩ、発現誘導後の細胞粗溶解物；Ｓ、発現誘導後の総水溶性タンパク質；ＩＢ、発現誘導後の総不溶性（封入体）タンパク質；矢印、予想ＳＶ８２ポリペプチド。本発明のＳＶ８２ポリペプチドを分離精製するための模式図である。分離精製したＳＶ８２ポリペプチドの電気泳動結果を示す図面である。Ａは、再折畳み過程及びバッファ交換過程中のＳＶ８２ポリペプチドの分離度を確認した結果であり、Ｂは、ニッケル−アガロースカラムを通じて分離した最終ＳＶ８２ポリペプチドの電気泳動結果である。凡例：Ｍ、サイズマーカー；１、可溶化させたＳＶ８２ポリペプチドのＩＢ試料；２、ろ過後の試料；３、濃縮させた試料；４、再折畳み試料（残余分）；５、再折畳み試料（浸透物）；６、バッファ交換試料（残余分）；７、バッファ交換試料（浸透物）；８及びＢＳ、最終試料；ＵＰ、結合されていないタンパク質；Ｗ、洗浄試料；Ｅ、カラム溶出試料。ＳＶ８２ポリペプチドのヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ、ＨｕｍａｎＤｅｒｍａｌＦｉｂｒｏｂｌａｓｔａｄｕｌｔ）に対する細胞増殖効果を確認したクリスタル・バイオレット染色結果を示す図面である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の課題を解決するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＶ８２（ｓｐｉｄｅｒｖｅｎｏｍ８２）ポリペプチドを提供する。
本発明によるＳＶ８２ポリペプチドの範囲は、配列番号２のアミノ酸配列を持つタンパク質及び前記タンパク質の機能的同等物を含む。

「機能的同等物」とは、アミノ酸の付加、置き換えまたは欠失の結果、前記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を持つものであり、配列番号２と表示されるタンパク質と実質的に同質の活性を示すタンパク質をいう。

「実質的に同質の活性」とは、皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持活性を意味する。本発明はまた、ＳＶ８２ポリペプチドの断片、誘導体及び類似体を含む。本願に使われた用語「断片」、「誘導体」及び「類似体」は、本発明のＳＶ８２ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を持つポリペプチドをいう。

本発明はまた、大腸菌コドン最適化された配列番号１の塩基配列からなる、ＳＶ８２ポリペプチドコーディング遺伝子を提供する。
本発明による前記ＳＶ８２ポリペプチドコーディング遺伝子は、配列番号１の塩基配列を含むことができる。また、前記塩基配列の相同体が本発明の範囲内に含まれる。具体的には、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列からなる群から選択される塩基配列とそれぞれ７０％以上、望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を持つ塩基配列を含むことができる。

ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、２つの最適に配列された配列と比較領域とを比べることで確認され、比較領域でのポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参照配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。

「コドン最適化」は、コーディングされたタンパク質が有機体でさらに効率的に発現されるように特定有機体で優先的に使われることであって、タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドのコドンを変化させることを意味する。ほとんどのアミノ酸が「同義語」または「同意」コドンと呼ばれる複数のコドンによって表示されるという点で、遺伝子コードが蓄堆積するが、特定有機体によるコドン用法は任意的ではなく特定コドントリプレットに偏向している。

このようなコドン用法偏向性は、所定遺伝子、共通機能または先祖起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質対比低い複製数のタンパク質、及び有機体ゲノムの集合的タンパク質コーディング領域に関してさらに高い。本発明の前記配列番号１の塩基配列は、蜘蛛来由のＳＶ８２遺伝子が大腸菌内で発現するように大腸菌のコドンに最適化された配列である。

本発明はまた、前記ＳＶ８２ポリペプチドコーディング遺伝子を含む組み換えベクター及び前記組み換えベクターに形質転換された大腸菌を提供する。
用語「組み換え」は、細胞が異種核酸を複製するか、前記核酸を発現するか、またはペプチド、異種ペプチドまたは異種核酸によって暗号されたタンパク質を発現する細胞を称する。組み換え細胞は、前記細胞の天然形態では見つけられない遺伝子または遺伝子の切片を、センスまたはアンチセンス形態のうち一つに発現できる。また組み換え細胞は天然状態の細胞で見つけられる遺伝子を発現できるが、前記遺伝子は変形されたものであって、人為的な手段によって細胞内に再導入されたものである。

本発明で、前記ＳＶ８２ポリペプチドをコーディングする遺伝子は、組み換え発現ベクター内に挿入され得る。用語「組み換え発現ベクター」とは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、または他のベクターを意味する。大体、任意のプラスミド及びベクターは、宿主内で複製及び安定化できれば使われうる。前記発現ベクターの重要な特性は、複製原点、プロモータ、マーカー遺伝子及び翻訳調節要素を持つ。

ＳＶ８２ポリペプチドをコーディングする遺伝子配列及び適当な転写／翻訳調節信号を含む発現ベクターは、当業者に周知の方法によって構築される。前記方法は、試験管内の組み換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術及び生体内組み換え技術などを含む。前記ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を導くために発現ベクター内の適当なプロモータに効果的につながる。また発現ベクターは、翻訳開示部位であって、リボソーム結合部位及び転写ターミネータを含む。

本発明の一実施形態による組み換えベクターは、ｐＥＴ２２ｂベクターに合成したクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドをコーディングする遺伝子（配列番号１）を５’末端（ＮｃｏＩ制限酵素サイト）及び３’末端（ＸｈｏＩ制限酵素サイト）にインフレームで融合して製造し、前記遺伝子をｌａｃプロモータ及びｌａｃＩリプレッサによって効果的に発現させてクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを製造することを特徴とするベクターである。

本発明のベクターを原核細胞に安定させつつ連続的にクローニング及び発現させられる宿主細胞として、当業界に公知のいかなる宿主細胞も用いられ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａ、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０、バチルス・サブティリス、バチルス・チューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、そして、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセセンス及び多様なシュードモナス種のような腸内細菌及び菌株などがある。

また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙ）細胞株、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株）及び植物細胞などが用いられる。

本発明の一実施形態による組み換えベクターに形質転換された宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌であるが、これに制限されるものではない。

本発明のベクターを宿主細胞内に運ぶ方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ_２方法、ハナハン法（Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ．，１９８３Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０）及び電気穿孔法などによって施される。また、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈澱法、電気穿孔法、リポソーム媒介の形質感染法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、及び遺伝子ボムバードメント法などによってベクターを宿主細胞内に注入できる。

本発明はまた、本発明の組み換えベクターで宿主細胞を形質転換させて宿主細胞でＳＶ８２ポリペプチドを生産する方法を提供する。

本発明の一実施形態による方法で、前記宿主細胞は、望ましくは大腸菌であり、さらに望ましくはＥ．ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌であるが、これに制限されるものではない。

本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として含む皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持のための化粧料組成物を提供する。
本発明の前記化粧料組成物は、ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として含み、前記ＳＶ８２ポリペプチドが皮膚内末梢神経の刺激を通じて細胞の持続勃起を誘導して皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持効果を示すものである。

本発明の一具現例による化粧料組成物で前記ＳＶ８２ポリペプチドの含量は、化粧料組成物の総重量対比０．０００００１ないし０．０００１重量％で含まれることが望ましい。
前記ＳＶ８２ポリペプチドの含量が０．０００００１重量％未満の場合には、皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持効果が不備であり、０．０００１重量％以上の場合には剤型上の安全及び安定性に問題があり得る。

本発明の化粧料組成物は、前記有効成分以外に化粧品組成物に通常的に用いられる成分を含み、例えば、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質小胞のような通常的な補助剤、そして担体を含む。

本発明の組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤型でも製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどに剤型化され得るが、これに限定されるものではない。

さらに詳細には、化粧水、スキンソフトナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、保湿ローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、アイクリーム、保湿クリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレンジングフォーム、クレンジングウォータ、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、せっけん及びパウダーの化粧品剤型に製造され得る。

本発明の化粧料組成物の剤型がペースト、クリームまたはゲルの場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられる。

本発明の化粧料組成物の剤型がパウダーまたはスプレーの場合には、担体成分としてラックトス、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーの場合には、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。

本発明の化粧料組成物の剤型が溶液または乳濁液の場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤または乳濁剤が用いられ、例えば、水、エチルアルコール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコール油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

本発明の化粧料組成物の剤型が懸濁液の場合には、担体成分として水、エチルアルコールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、アガロースまたはトラカントなどが用いられる。

以下、本発明を、実施例をあげて詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するだけであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞クモ毒ＳＶ８２ポリペプチド生産のための大腸菌発現用の組み換え発現ベクター及び形質転換組み換え微生物の製造

クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドをコーディングする大腸菌に最適化された遺伝子、組み換え発現ベクター及び形質転換組み換え微生物は、次の方法で製作した。
クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドをコーディングする遺伝子を鋳型として使って大腸菌内で発現されるように最適化された、７９個のアミノ酸を暗号化したクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドをコーディングする遺伝子（配列番号１）の断片を製作及び合成した。合成に使ったプライマーは下記の通りである。

正方向プライマー：５´−ＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＣＧＴＧ−３´（下線、ＮｃｏI制限酵素のところ；配列番号３）
逆方向プライマー：５´−ＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＴＧＣＡＧ−３´（下線、ＸｈｏI制限酵素のところ；配列番号４）

前記遺伝子断片と組み換えプラスミドとを同じ制限酵素（５´末端ＮｃｏI及び´末端ＸｈｏI）で切断して挿入し、組み換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＳＶ８２）を製作した（図１）。製造された組み換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０に形質転換させ、宿主微生物から大量の遺伝子構築物を得た。
次いで、製造された組み換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）に形質転換させ、クモ毒ＳＶ８２ポリペプチド生産のための組み換え微生物を製作した。

＜実施例２＞クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドの大量生産及び分離
実施例１で製造したＥ．ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをそれぞれ１ＬＬＢ培地（１０％トリプトファン、１０％塩化ナトリウム及び５％酵母抽出物）あるいはＢＳＢ培地（１％トリプトファン、０．５％酵母抽出物、１％グルコース、０．１％ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、株式会社ネクスゼンバイオテクノロジー、韓国）を使って、バッチ培養時にはＯＤ_６００＝０．６〜０．８になるまで、２０Ｌの発酵器を使って連続培養時にはＯＤ_６００＝２０〜２５になるまで培養した。次いで、これらをそれぞれ最終的に、１〜５ｍＭＩＰＴＧまたは２〜３％ラクトースを加えてクローン内の遺伝子の発現を誘導した。

遺伝子発現誘導後に、更に３〜４時間大腸菌を培養した後、細胞を遠心分離して回収した。この細胞を緩衝溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ、８ｇの塩化ナトリウム、０．２ｇの塩化カリウム、１．４４ｇの第２リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、０．２４ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）／Ｌ、ｐＨ７．４）に完全に懸濁させた後、超音波破砕機を使って細胞を破壊し、細胞内タンパク質を含む溶液を分離した。

発現誘導によるＳＶ８２ポリペプチドの発現度を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を通じて確認した。その結果、１Ｌのバッチ培養（図２Ａ）と２０Ｌの連続培養（図２Ｂ）両方でクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドが封入体の形態に多く発現したことが分かった。

前記培養を通じて発現されたＳＶ８２ポリペプチドを精製するために、ＳＶ８２ポリペプチドを含む封入体を可溶化緩衝溶液（５Ｍ尿素、ｐＨ１１）に可溶化した後、超微細ろ過方法（０．４５μｍの精密ろ過膜と１Ｋの超微細ろ過膜）を用いて再折畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）過程を行い、保存用緩衝溶液（ＰＢＳ）を使って最終的にクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを分離、精製した。次いで、分離精製したＳＶ８２ポリペプチドをニッケル−ア

ガロースカラムに３〜５ｍＬ／分の速度で通過させた。
次いで、バインディング用の緩衝溶液でカラムを数回洗浄した後、５０、８０及び３００ｍＭのイミダゾール溶液（ｐＨ７．４）をカラムに適用してＳＶ８２ポリペプチドをカラムで２０ｍＬずつ分画溶出させた後、１０ｍＭのリン酸カリウムバッファを使ってバッファ内のイミダゾールをとり除き、最終的にＳＶ８２ポリペプチドを純粋に分離及び精製した。図３は、クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを精製する過程を模式図として示したものである。

クモ毒ＳＶ８２ポリペプチド分離過程中にタンパク質の分離度を確認するために１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。その結果、最終的にニッケル−アガロースカラムを通じてクモ毒ＳＶ８２ポリペプチド（配列番号２）が精製されたことが分かった（図４）。

＜実施例３＞クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドの活性測定
実施例２で分離、精製されたクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドの活性測定のために培養したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａｃｅｌｌ、ＨｕｍａｎＤｅｒｍａｌＦｉｂｒｏｂｌａｓｔａｄｕｌｔｃｅｌｌ）にそれぞれ０、０．０２ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ濃度のＳＶ８２ポリペプチドを処理した後、３日間３７℃で培養した。次いで、クリスタル・バイオレット染色法で細胞を染色して細胞増殖状態を確認した。
その結果、図５に示すように、対照群に比べてクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドの処理濃度（０．０２〜０．２ｐｐｍ）が増加するほどヒト皮膚線維芽細胞の細胞増殖が早いということが分かった。

＜実験例１＞皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持効果に関する皮膚刺激の官能試験
前記で分離、精製したクモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として製造例１〜４、及び比較例１〜４の化粧料組成物を製造して官能試験を実施した。
具体的には、しわ改善及び弾力事項を確認するために、３０才以上６０歳未満の女性と男性合計３０人（内訳：３０代１０人、４０代１０人、５〜６０代１０人）を対象として、しわが多く分布する顔の左目周囲又は唇の左側周辺には比較例（対照群）を、顔の右目周囲あるいは唇の右側周辺には製造例（試験群）を１日１回２週間持続的に使うようにした。

評価は、目あるいは唇の周りのしわ伸び現象を基準として評価した。また、前記機能項目のうち一つである皮膚の弾力維持効果についても、同じ方法で皮膚の弾力維持日数を評価した。皮膚刺激項目についても同じ方法で皮膚のかゆみ、痛み及び紅斑現象などに関して官能試験を実施した。評価基準は、非常に優秀（５点）、優秀（４点）、普通（３点）、悪い（２点）及び非常に悪い（１点）の５点法基準に基づいて行った。

＜製造例１及び比較例１＞
クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として添加し、下記の表１に記載した成分及び含有量で製造例１の化粧水を製造した。また、クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として添加せずに、下記の表１に記載している成分及び含量で比較例１の化粧水を製造した。

前記製造例１及び比較例１の皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持効果に関する皮膚刺激の官能試験結果は、下記の表２の通りである。

＜製造例２及び比較例２＞
クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として添加し、下記の表３に記載した成分及び含量で製造例２のエッセンスを製造した。また、クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として添加せずに、下記の表３に記載した成分及び含量で比較例２のエッセンスを製造した。

前記製造例２及び比較例２の皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持効果に関する皮膚刺激の官能試験結果は、下記の表４の通りである。

＜製造例３及び比較例３＞
クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として添加し、下記の表５に記載した成分及び含量で製造例３のローションを製造した。また、クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として添加せずに、下記の表５に記載した成分及び含量で比較例３のローションを製造した。

前記製造例３及び比較例３の皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持効果に関する皮膚刺激の官能試験結果は、下記の表６の通りである。

＜製造例４及び比較例４＞
クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として添加し、下記の表７に記載した成分及び含量で製造例４のクリームを製造した。また、クモ毒ＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として添加せずに、下記の表７に記載した成分及び含量で比較例４のクリームを製造した。

前記製造例４及び比較例４の皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持効果に関する皮膚刺激の官能試験結果は、下記の表８の通りである。

前記の官能試験結果たちを通じて、本発明のＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として含む製造例１ないし４が比較例に比べて皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持に効果があるということが分かった。

Claims

配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＶ８２ポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持のための化粧料組成物。
前記ＳＶ８２ポリペプチドは、化粧料組成物の総重量を１００重量％とした場合に、０．０００００１乃至０．０００１重量％含まれることを特徴とする請求項１に記載の皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持のための化粧料組成物。
前記化粧料組成物は、化粧水、スキンソフトナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、保湿ローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、アイクリーム、保湿クリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレンジングフォーム、クレンジングウォータ、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、石鹸、及びパウダーからなる群から選択される何れか一つの剤型を持つことを特徴とする請求項１に記載の皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持のための化粧料組成物。
前記化粧料組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質小胞のうちから選択された一つ以上の補助剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の皮膚しわの改善及び皮膚の弾力維持のための化粧料組成物。