KR102581377B1 - 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 4 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 4 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 인간의 콜라겐 타입 4 알파 1 체인 유래 펩타이드 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환된 숙주세포, 상기 펩타이드를 제조하는 방법, 상기 펩타이드를 이용하여 콜라겐을 제조하는 방법 및 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시키는 활성이 뛰어나며, 이를 활용하여 콜라겐을 대량 생산하는 방법은 기존의 인간 콜라겐 타입 4형을 추출하는 방식과 비교하여 세균이나 바이러스 등의 오염이나 인체 내 면역반응을 회피할 수 있고, 보다 경제적이고 효율적으로 기능성 콜라겐을 대량 생산할 수 있다.

Description

콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 4 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법{Collagen type 4 small-molecular peptide having collagen synthesis promoting activity and method using the same}
본 발명은 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 인간의 콜라겐 타입 4 알파 1 체인 유래 펩타이드 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포, 상기 형질전환된 세포에서 상기 펩타이드를 수득하는 단계; 를 포함하는 상기 펩타이드를 제조하는 방법, 그리고 상기 펩타이드를 이용하여 콜라겐을 제조하는 방법에 대한 것이다.
피부는 표피, 진피, 피하 조직으로 구성되어 이 중 표피는 체온조절 및 외부 환경으로부터 신체 내부를 보호하는 물리적 보호막 기능을 하고, 진피는 표피와 피하지방층 사이에 있는 결합 조직으로 피부에 유연성, 탄력성 및 장력을 제공하며 표피를 구조적으로 지지한다.
피부는 인체의 일차 방어막으로 체내의 제기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부 환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온 조절 등의 생체 항상성 유지에도 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 외부로부터 받는 과도한 물리화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍 등은 피부의 정상적인 기능을 저하시키고, 탄력손실, 각질화, 주름 생성 등의 피부 노화 현상을 촉진시키게 된다.
피부 노화는 일반적인 피부과적 문제이며, 내인성 및 외인성 과정의 영향을 받는다. 내인성 피부 노화는 유전적, 호르몬적 요인에 의해 시간적으로 영향을 받는 생리학적 변화인 반면, 외인성 피부 노화는 만성적 빛이나 화학 물질에의 노출과 같은 환경 및 생활 습관 요인에 의해 영향을 받는다. 이러한 요인들에는 자외선(UV) 노출 후 피부 모양의 변화와 같은 각 피부층의 조직병리학적 및 면역조직화학적 변화가 포함된다. 또한, 내인성 및 외인성 요인 모두 섬유아세포(fibroblasts)에서 엘라스틴 및 콜라겐 합성 수준을 감소시키고, 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 증가시킨다.
콜라겐과 엘라스틴은 피부의 탄력성과 견고성을 모두 유지하는 피부의 구조 단백질이다. 특히, 섬유질 단백질 콜라겐은 피부의 대부분을 구성하고, 조직의 기계적 강도를 유지하는데 기여한다. 콜라겐 분자는 단단한 삼중 나선으로 함께 감긴 3개의 사슬로 구성되어 있다. 모든 세번째 아미노산은 나선 내부에 완벽하게 맞는 글라이신(glycine)이다. 삼중 나선은 주로 글라이신(glycine), 프롤린(proline), 알라닌(alanine)으로 구성된다.
콜라겐은 인체에서 가장 흔하게 발견되는 단백질로 포유류에서 가장 많은 단백질이어서 전체 단백질의 약 25-35%를 차지한다. 특히 뼈, 힘줄, 인대를 구성하는 주요한 성분이며, 주로 장기의 구조를 유지하는 역할을 한다. 그러나, 콜라겐의 체내 생성량은 연령에 따라 감소하게 되는데, 20대에 콜라겐 생성량이 최대이며, 40대는 70% 수준으로 생성되고 이후 급격히 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 노화가 진행될수록 식품 등으로부터 섭취 및 흡수를 통한 콜라겐 보충이 필요하다.
콜라겐 타입 4형은 피부의 표피층과 진피층을 연결하는 역할을 하는 콜라겐으로, 주로 기저막에 존재하며, 섬유 아세포 또는 간질 세포 외에도 상피 세포 및 내피 세포와 같은 다양한 세포들로부터 분비된다. 분비된 콜라겐 타입 4형은 다른 것들과 연결되어 그물 구조를 갖는 기저막 골격을 구성하는 것으로 알려져 있다. 정상 조직의 기저막은 상피 조직과 간질 조직 사이의 경계, 내피 조직과 간질 조직 사이의 경계 등에 존재하여 조직 형태 및 기능을 조절한다(KR 10-1013-0135869 A 참조).
본 발명자들은 인간의 콜라겐 타입 4 알파 1 체인(human collagen type 1 alpha 1 chain, hCOL4A1) 단백질의 특정한 단편이 콜라겐 합성을 촉진하는 활성이 뛰어날 뿐 아니라, 엘라스틴 생성 및 세포 이동성 촉진의 활성이 있는 것을 확인하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
(1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 배양된 형질전환된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
(1) 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 배양된 형질전환된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 인간의 콜라겐 타입 4 알파 1 체인 (human collagen type 4, alpha 1 chain, hCOL4A1) 단백질의 특정한 단편이 콜라겐 합성을 촉진하는 활성이 있음을 발견하였다. 인간의 콜라겐 타입 4 알파 1 체인 (human collagen type 4, alpha 1 chain, hCOL4A1) 단백질을 임의로 나눈 N(188-598 aa) 및 C(1020-1459 aa) 단편을 제조하여, 콜라겐을 합성하는 세포인 인간 피부섬유아세포에 처리한 결과, N 및 C 단편이 모두 전장 hCOL4A1 단백질보다 우수하게 콜라겐 합성을 촉진하는 것을 확인하였다.
또한, N 단편에 대해서 동일한 분석을 실시한 결과, N 단편을 다시 임의로 구분하여 특정한 NN(hCOL4A1의 188-325 aa), NM(hCOL4A1의 326-460 aa), NC(hCOL4A1의 461-597 aa)의 3개 단편이 모두 음성대조군에 비하여 우수하게 콜라겐 합성을 촉진함을 확인하였다. 구체적으로, 상기 N 단편 중 NN 단편이 음성대조군과 전장 hCOL4A1 단백질에 비하여 우수하게 콜라겐 합성을 촉진함을 확인하였다. 상기 NN 단편, NM 단편 및 NC 단편은 본 명세서에서 각각 NN 단편, N2 단편 및 N3 단편과 혼용될 수 있다.
또한, C 단편에 대해서 동일한 분석을 실시한 결과, C 단편을 다시 임의로 구분하여 특정한 C1(hCOL4A1의 1019-1156 aa)및 C4(COL4A1의 1304-1439 aa)의 단편이 모두 음성대조군과 전장 hCOL4A1 단백질에 비하여 우수하게 콜라겐 합성을 촉진함을 확인하였다. 일반적으로 단백질 전장을 이용하는 것에 비하여 짧은 서열로 이루어진 동일 효과 이상을 갖는 단편을 이용할 경우, 합성이 용이하여 대량 생산이 가능하여 단백질 의약품으로서의 유용성이 우수하다. 이러한 짧은 서열로 이루어진 COL4A1 단백질의 단편의 콜라겐 합성 촉진 활성은 의약품과 기능성 식품, 화장품 등 다양한 분야에서 원료로 널리 사용되는 콜라겐을 대량 생산하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 본 명세서에서 “콜라겐 타입 4 알파 1 체인(collagen type 4 alpha 1 chain, COL4A1) 단백질”은 특히, 인간에서 유래된 것을 의미하는 것으로서, 본 명세서에서는 hCOL4A1로 표기하며, 인간 유전자 COL4A1에 암호화되어 있
는 단백질을 의미한다. 상기 “콜라겐 타입 4 알파 1 체인(collagen type 4 alpha 1 chain, COL4A1) 단백질”은 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다. 본 발명자들이 밝힌 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드는 콜라겐 합성을 향상시키는 새로운 기능을 발휘한다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하면서 추가로 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 11의 아미노산 서열 내의 연속하는 133개 내지 1258개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열 내의 연속하는 133개 내지 425개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 서열번호 5 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 9의 아미노산 서열 내의 연속하는 135개 내지 409개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 12의 아미노산 서열 내의 연속하는 134개 내지 1668개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 11의 아미노산 서열 내의 연속하는 134개 내지 1258개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
상기 펩타이드는 C1 단편(COL4A1-C1, 서열번호 1) 또는 C4 단편(COL4A1-C4, 서열번호 4)을 포함하는 C 단편의 서열인 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 또는 NN(hCOL4A1의 188-325 aa) 단편을 포함하는 N 단편의 서열인 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
상기 펩타이드는 서열번호 1 (C1 단편; COL4A1-C1), 서열번호 4 (C4 단편; COL4A1-C4) 및 서열번호 5 (NN 단편; COL4A1의 188-325 aa)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
상기 서열번호 1, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 전장 hCOL4A1 단백질에 비하여 우수하게 콜라겐 합성을 촉진하는 효과가 있다. 일반적으로 단백질 전장을 이용하는 것에 비하여 짧은 서열로 이루어진 동일 효과 이상을 갖는 단편을 이용할 경우, 합성이 용이하여 대량 생산이 가능하여 단백질 의약품으로서의 유용성이 우수하다.
본 명세서에 기재된 서열목록의 아미노산 서열은 별도의 표시가 없더라도 아미노 말단(N-terminal)으로부터 카르복시 말단(C-terminal)의 방향으로 기재된 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드는 콜라겐 합성 촉진 활성뿐 아니라, 세포 성장 및 세포 이동을 촉진하는 활성도 있다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드를 대장균에서 과발현하여 제조하고, 분리정제하여 인간 피부섬유아세포에 처리하면, 세포생존률이 증가함을 확인하여 세포 성장이 촉진되는 것을 MTT 어세이를 이용하여 확인하였다. 나아가, 상기 펩타이드를 처리한 인간 각질형성세포(keratinocyte)인 HaCaT 세포의 세포 이동이 증가되는 것을 트랜스웰 이동 분석으로 확인하였으며, 상기 펩타이드를 처리한 인간 각질형성세포와 인간 피부섬유아세포의 세포 이동이 증가하는 것을 상처 회복 분석(wound-healing assay)으로 확인하였다.
이른바, 본 발명에 따른 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시킬 뿐 아니라, 세포 성장인자로서 그리고 세포 이동성 증가 인자로서의 활성도 가지는 등 다양한 세포 내 기능을 촉진시키는 활성을 갖는 것이다.
이에 따라, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환되거나, 분리정제된 펩타이드를 처리한 인간 피부섬유아세포에서는 콜라겐 합성 수준이 음성대조군(아무 처리하지 않은 피부섬유아세포)과 비교하여 콜라겐 합성 수준이 증가한 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 조성물은 세포 내 콜라겐을 효과적으로 촉진하는 용도로 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
상기 조성물이란, 순수하게 본 발명에 따른 펩타이드만을 버퍼 등의 용매에 포함하는 용액일 수도 있고, 펩타이드를 안정화하기 위한 다른 첨가물이나, 유사한 활성을 갖는 인자, 보조 인자 등을 추가로 포함한 것일 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현하는 세포를 용해시킨 세포 용해물일 수도 있다.
또한, 본 발명의 조성물에 따라 합성이 촉진되는 콜라겐은 인간 유래의 콜라겐, 특히 콜라겐 타입 4인 것이 바람직하지만, 본 발명의 목적인 합성 수준의 촉진이라는 목적이 달성되는 한, 여기 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는 본 발명의 실시예에서는 인간 섬유아세포의 배양 상층액에서 콜라겐 타입 4의 프로콜라겐 C-펩타이드를 표적으로 하여 콜라겐 합성 수준을 측정하였다.
또한, 상기 세포란 콜라겐을 합성할 수 있는 능력을 가진 세포로서, 자연적으로 콜라겐을 합성할 수 있는 섬유아세포, 골아세포(osteoblast), 조연골아세포(chondroblast) 등의 세포일 수도 있고, 일반적으로 콜라겐을 합성하지는 않지만, 유전공학적으로 콜라겐을 합성하도록 형질전환된 세포일 수도 있다.
본 명세서에서 콜라겐의 합성이란, 콜라겐 유전자의 전사, 단백질로의 발현뿐 아니라, 콜라겐 섬유로서 기능적인 구조 및 아미노산의 변형을 거치는 성숙 단계를 모두 포함하는 의미이다. 본 명세서에서 “콜라겐의 합성”의 정도는 콜라겐 1형 C-펩타이드(PICP, Procollagen type I C-peptide)를 측정하여 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13 내지 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것으로서, 상기 서열번호의 염기서열은 서열번호 1 내지 서열번호 7의 아미노산 서열, 더 구체적으로는 본 발명자들이 특정한 hCOL4A1 단백질의 C1 단편(COL4A1-C1, 서열번호 1), C2 단편(COL4A1-C2, 서열번호 2), C3 단편(COL4A1-C3, 서열번호 3), C4 단편(COL4A1-C4, 서열번호 4), NN 단편(COL4A1-NN, 서열번호 5), NM 단편(COL4A1-NM, 서열번호 6) 또는 NC 단편(COL4A1-NC, 서열번호 7)의 아미노산 서열을 암호화하는 것이다. 본 명세서에 기재된 서열목록의 염기서열은 별도의 표시가 없더라도 5’ 말단으로부터 3’ 말단의 방향으로 기재된 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 재조합(recombinant)은 유전자 조작(genetic manipulation)과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.
본 발명에서 발현(expression)은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에서 재조합 발현 벡터란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 작동가능하게 연결된(operably linked)이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 발현조절서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(pPICZ, YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, pcDNA3.1 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 pET-28(+) 벡터를 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다. 바람직하게 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 서열번호 13 내지 서열번호 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명에 다른 숙주 세포는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫(rat) 세포, 마우스 (mouse) 세포, 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
가장 바람직하게는 콜라겐을 합성할 수 있는 진핵세포이거나, 일반적으로 단백질을 과발현하도록 형질전환하여 사용되는 대장균 등의 원핵세포일 수 있다. 상기 콜라겐을 합성할 수 있는 세포는 앞서 설명한 바와 같다. 나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드가 발현되는지 여부를 인간 피부섬유아세포에서 분석하였고, 대량 생산 및 분리정제하기 위하여 대장균에서 과발현을 유도하였는데, 이 때 특히 Escherichia coli Rosetta2 (DE3) 대장균을 사용하였다.
본 발명에 따른 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현 또는 대량으로 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 배양된 형질전환된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 제1항의 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 (1) 단계는 본 발명에 따른 펩타이드를 생산하기 위한 숙주세포를 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계이다. 재조합 발현 벡터는 앞서 설명한 바와 같으며, 바람직하게는 pET-28a(+) 벡터를 이용할 수 있다.
선택가능한 숙주세포로는 앞서 설명한 바와 같으며, 통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 적절한 형질전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 숙주세포는 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 제한없이 선택할 수 있지만, 본 발명을 실시하게 위해서는 상기 숙주세포는 콜라겐을 생성하는 섬유아세포 또는 단백질 과발현을 위한 대장균이 바람직하다.
포유동물 세포주, 곤충 세포주, 형질전환 동물 등의 경우에는 생산량이 낮고 특정 세포 유형의 제약을 받거나 일시적으로만 재조합 콜라겐 단백질이 생산되고, 형질전환 동물(예를 들어 누에 또는 쥐) 및 형질전환 식물(예를 들어 담뱃잎)은 콜라겐 산물이 과도하게 교차 결합하여 회수 자체나 분리정제가 어려울 수 있다. 따라서 대장균(Escherichia coli, E. coli)을 이용할 경우에는 인간 탯줄 유래나 포유 동물 세포 등에 비해서 높은 생산량을 보이면서 기존 동물성 콜라겐에 세균이나 바이러스와 같은 오염을 유발 및 면역반응이 없는 장점이 있다.
나아가, 대장균을 숙주세포로 사용하면 동물세포를 숙주세포로 사용할 경우 발생할 수 있는 세균이나 바이러스 등 병원체에 의한 오염, 인체 내 면역반응 유발 등의 문제점을 피할 수 있으며, 높은 생산 비용을 절감하는 효과도 있다.
상기 (2) 단계는 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 본 발명에 따른 펩타이드가 과발현 또는 생산되도록 하는 단계이다. 통상의 기술자는 선택한 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등을 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포에서 생산되는 펩타이드는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화(targeted) 되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 펩타이드가 구조 등 성질을 유지하거나 향상시키도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩(refolding)시키고 기능성 구조(conformation)를 갖도록 할 수 있다.
상기 (3) 단계는 숙주세포에서 생산된 펩타이드를 수득하는 단계이다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩타이드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 펩타이드는 숙주세포를 배양한 배지(상등액)를 수득하고, 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 펩타이드를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 펩타이드를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 펩타이드의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 펩타이드는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현하는 숙주세포의 파쇄물 또는 용해물을 원심분리하여 얻어지는 상등액을 취하는 방법으로 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 (1) 단계는 본 발명에 따른 펩타이드로 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계이다. 상기 단계는 본 발명에 따른 펩타이드의 순수하게 분리정제된 형태로 사용할 수도 있고, 적절한 용매 및 보조인자를 포함하는 용액 형태로 사용할 수 있으며, 나아가 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현하는 세포의 용해물일 수도 있다. 이와 같이 다양한 상태 또는 형태의 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포의 외부에 처리하여 상기 펩타이드가 세포의 외부에 접촉하도록 할 수도 있고, 또는 펩타이드가 세포의 내부로 도입되도록 할 수도 있다. 통상의 기술자는 세포 내 펩타이드를 전달하기 위하여 당해 기술분야에서 널리 이용되는 방법, 예를 들어, 미세관을 이용한 주입이나 펩타이드 형질전환(peptide transfection) 등을 제한없이 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 나아가, 콜라겐 합성능을 갖는 세포가 직접 본 발명에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 재조합 발현 벡터로 콜라겐 합성능을 갖는 세포를 형질전환할 수 있다.
본 명세서의 실시예에 설명된 바와 같이, 피부섬유아세포는 본 발명에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환되거나, 본 발명에 따른 펩타이드를 분리정제하여 세포 외부에 처리한 경우 모두 콜라겐 합성 수준이 크게 향상된다는 발견에 기반한 것이다.
콜라겐 합성능을 갖는 세포에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 콜라겐 합성능을 갖는 세포가 본 발명에 따른 펩타이드의 자극을 받으면 세포 내 콜라겐 합성이 크게 촉진되는 효과가 있다. 상기 접촉은 일시적이거나, 몇 시간 동안 지속되는 것일 수도 있고, 또는 펩타이드를 수득하는 (3) 단계에 이르기까지 계속되는 것일 수도 있다. 통상의 기술자라면 적절한 시간과 농도를 선택하여 실시할 수 있다.
상기 (2) 단계는 본 발명에 따른 펩타이드와 접촉한 세포가 콜라겐을 합성할
수 있도록 배양하는 단계이다. 콜라겐의 유전자가 전사되고, 단백질로 발현되어 삼중 나선 구조 형태의 콜라겐 섬유로 성숙하는 시간을 주는 것이다.
상기 (3) 단계는 세포에서 합성된 콜라겐을 수득하는 방법이다. 세포에서 펩타이드를 수득하는 방법에 대하여서는 앞서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시킬 뿐 아니라, 세포 성장인자로서 그리고 세포 이동성 증가 인자로서의 활성도 가지는 등 다양한 세포 내 기능을 촉진시키는 활성을 가짐으로써 피부 재생 및 노화 방지 효과가 뛰어나며, 이를 함유한 화장료 조성물은 우수한 보습 효과와 피부진정 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물은 피부 상태 개선 용도를 가진다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 피부보호용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코 시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 피부 상태 개선 효과는 항산화 활성, 세포 활성 증진 효과, 콜라겐 합성 효과, 콜라겐분해효소 활성 억제 효과, 피부 노화 방지, 피부 보습, 피부 탄력 증진, 주름 개선, 주름 방지 또는 피부 진정 효과를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 인간의 콜라겐 타입 4 알파 1 체인 유래 펩타이드 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환된 숙주세포, 상기 펩타이드를 제조하는 방법, 상기 펩타이드를 이용하여 콜라겐을 제조하는 방법 및 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시키는 활성이 뛰어나며, 이를 활용하여 콜라겐을 대량 생산하는 방법은 기존의 인간 콜라겐 타입 4형을 추출하는 방식과 비교하여 세균이나 바이러스 등의 오염이나 인체 내 면역반응을 회피할 수 있고, 보다 경제적이고 효율적으로 기능성 콜라겐을 대량 생산할 수 있다.
도 1은 콜라겐 생성 촉진 평가를 위한 전장 hCOL4A1 단백질, COL4A1 사슬 단백질 및 hCOL4A1 사슬 단백질 단편인 COL4A1-N 도메인, COL4A1-M 도메인 및 COL4A1-C 도메인의 모식도를 나타낸 도이다. 각 단편의 이름 및 해당 아미노산 서열 부위는 도면에 표시된 바와 같다.
도 2는 대장균(Escherichia coli Rosetta2)에서의 COL4A1 사슬 단백질의 N 단편, M 단편 및 C 단편의 단백질 발현 양상을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 COL4A1 사슬 단백질의 N 도메인 단편인 COL4A1-NN 도메인, COL4A1-NM 도메인 및 COL4A1-NC 도메인의 모식도를 나타낸 도이다. 각 단편의 이름 및 해당 아미노산 서열 부위는 도면에 표시된 바와 같다.
도 4는 대장균(Escherichia coli Rosetta2)에서의 COL4A1 사슬 단백질의 N 도메인 단편인 NN 단편, NM 단편 및 NC 단편의 단백질 발현 양상을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 COL4A1 사슬 단백질의 C 도메인 단편인 COL4A1-C1 단편, COL4A1-C2 단편, COL4A1-C3 단편 및 COL4A1-C4 단편의 모식도를 나타낸 도이다. 각 단편의 이름 및 해당 아미노산 서열 부위는 도면에 표시된 바와 같다.
도 6은 대장균(Escherichia coli Rosetta2)에서의 COL4A1 사슬 단백질의 C 도메인 단편인 COL4A1-C1 단편, COL4A1-C2 단편, COL4A1-C3 단편 및 COL4A1-C4 단편의 단백질 발현 양상을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 각각의 플라스미드로 형질전환된 인간 섬유아세포에서 전장 hCOL4A1 사슬 단백질, hCOL4A1사슬 단백질의 NN 단편, C1 단편 및 C4 단편 단백질 발현을 확인한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 hCOL4A1 단백질의 NN 단편, C1 단편 및 C4 단편을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 피부섬유아세포의 콜라겐 타입 1형 합성량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 다양한 농도의 hCOL4A1 단백질의 NN 단편, C1 단편 및 C4 단편을 처리한 후, 피부섬유아세포의 콜라겐 타입 1형 C-펩타이드 합성량을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 전장 hCOL4A1 사슬 단백질 및 hCOL4A1 사슬 단백질 내 도메인 단편 플라스미드 발현 벡터의 제조
인간의 hCOL4A1 사슬 단백질 내에 존재하는 특정 도메인(단편)에 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 효과가 있는지, 나아가 콜라겐 촉진 정도가 단편에 따라 다른지 여부를 확인하기 위하여, hCOL4A1 사슬 단백질 내 도메인(단편)을 특정하고, 이를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하여 각각의 단편을 제조하였다. 본 실시예에서 특정하고 재조합 발현 벡터에 삽입한 단편은 도 1, 도 3 및 도 5에 도시된 바와 같다.
먼저 에피토프 매핑(epitope mapping) 및 시험관 내 전사/번역(in vitro transcription/translation) 실험을 위한 플라스미드 DNA 클로닝(plasmid DNA cloning)을 수행하였다.
구체적으로, 각각의 hCOL4A1 플라스미드 DNA 벡터를 주형(template)으로 하여, Pfu DNA 중합효소로 PCR을 수행하였다(PCR 사이클: 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 55초의 반응을 30회 반복). hCOL4A1 사슬 단백질(Chain, 188-1459 aa, aa는 amino acids의 약자), hCOL4A1 N-말단 단편(N, 188-598 aa), hCOL4A1 중간 단편(M, 599-1019 aa), hCOL4A1 C-말단 단편(C, 1020-1459 aa), hCOL4A1 N 도메인의 N-말단 단편(NN, 188-325 aa), hCOL4A1 N 도메인의 중간 단편(NM, 326-460 aa), hCOL4A1 N 도메인의 C-말단 단편(NC, 461-597 aa), hCOL4A1 C 도메인의 첫번째 단편(C1, 1019-1156 aa), hCOL4A1 C 도메인의 두번째 단편(C2, 1114-1252 aa), hCOL4A1 C 도메인의 세번째 단편(C3, 1209-1345 aa) 및 hCOL4A1 C 도메인의 네번째 단편(C4, 1304-1439 aa)을 PCT 타겟(Target)으로 하였다. 각각 증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 정제 키트(geneall, 한국)를 이용하여 정제 분리하였다. 그런 다음, pET-28a(+) 벡터(Novagen)와 PCR 산물을 제한효소 Hind III과 Not I으로 절단 후, 연결하고(ligation), 형질전환(transformation)한 후, kanamycin LB agar 플레이트에 스프레딩(spreading)하였다. 단일 클론(single clone)에서 DNA를 추출하고 시퀀싱(sequencing)을 수행하여, 목적한 플라스미드 DNA 벡터가 맞는지 확인하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열은 다음의 표 1에 나타낸 바와 같다.
PCR Target 프라이머 방향 염기 서열(5' → 3') 서열 번호
Chain forward CAGAAGCTTgcggactgccagggcttc 25
reverse GTCGCGGCCGCGCCGTGATCAACAGAT 26
N forward CAGAAGCTTgcggactgccagggcttc 25
reverse GTGGCGGCCGCACTGCCTGGGAATCCA 27
M forward TCCAAGCTTgccgtggtgacaccggcc 28
reverse TCTGCGGCCGCTCCTGGCAAGCCCATT 29
C
　		 forward GCTAAGCTTgcacacctggagagaaag 30
reverse GTCGCGGCCGCGCCGTGATCAACAGAT 31
NN forward CAGAAGCTTgcggactgccagggctt 25
reverse CCAGCGGCCGCTGCTTCACCCTTTTCT 32
NM
　		 forward AGGAAGCTTGCggtcctcctggcccac 33
reverse CCTGCGGCCGCTTTCTCTCCAATTTCG 34
NC
　		 forward TTGAAGCTTGCggtcaaaaaggagaga 35
reverse CCGGCGGCCGCACGACTGCCTGGGAAT 36
C1
　		 forward TGGAAGCTTGCggaacacctggagaga 37
reverse CCCGCGGCCGCATCACTGCCTGGCTCC 38
C2
　		 forward AAGAAGCTTGCggcctcccaggattgg 39
reverse CCTGCGGCCGCCATGGGTCCCGGAAGT 40
C3 forward AAGAAGCTTGCggattcatgggtcctc 41
reverse CCTGCGGCCGCAGGAGGACCCGGGAGA 42
C4
　		 forward CAGAAGCTTGCggtgatatggggcctc 43
reverse TGAGCGGCCGCTGGGGTGCCTGGGGGC 44
실시예 2: hCOL4A1 사슬 단백질 유래 각 단편의 발현 확인
<2-1> hCOL4A1 사슬 단백질의 N, M 및 C 단편의 단백질 발현 확인
실시예 1에서 제작한 pET-28a(+)-hCOL4A1 N, pET-28a(+)-hCOL4A1 M 및 pET-28a(+)-hCOL4A1 C 단편을 대장균에서 대량으로 발현시키고, 순수한 재조합 단백질로 분리하였다.
구체적으로, pET-28a(+)-hCOL4A1-N(188-598 aa), pET-28a(+)-hCOL4A1-M(599-1019 aa) 및 pET-28a(+)-hCOL4A1-C(1020-1459 aa) 벡터를 E. coli Rosetta2(DE3)에 형질감염시킨 후, 50 μg/ml의 카나마이신을 포함하는 배지에서 37℃, OD값이 0.6이 될 때까지 배양하고, IPTG를 최종 1 mM이 되도록 첨가하여, hCOL4A1의 단백질을 유도한 후에, 37℃에서 6시간 동안 추가로 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여(12,000 rpm, 10 min, 4℃) 균체를 수득한 후에, 상기 균체를 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)에 현탁시킨 후에, 초음파 분쇄기로 균체를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 균체 현탁액을 원심분리하여(12,000 rpm, 40 min, 4℃) 펠렛(pellet)을 버리고 상등액(supernatant)을 얻었다. 상기 얻은 상등액으로부터 His-binding 칼럼(GE healthcare)을 이용하여 재조합 콜라겐 타입 4형 (hCOL4A1) 단백질을 정제하였으며, 8% SDS-PAGE로 정제된 단백질을 확인하였다.
상기 재조합 단백질 샘플의 8% SDS-PAGE 결과는 도 2에 도시한 바와 같다. 약 50 kDa 크기의 재조합 hCOL4A1-N 단편과 hCOL4A1-C 단편이 대장균 E. coli Rosetta2(DE3) 균주 내에서 효과적으로 과발현되었으며(도 2의 화살표), 정제 단계를 거치면서 순수한 재조합 단백질로 수득한 것을 확인할 수 있다.
<2-2> hCOL4A1-THR N 단편의 NN, NM 및 NC 단편의 단백질 발현 확인
상기 실시예 2-1에서 발현이 확인된 hCOL4A1-N 단편과 hCOL4A1-C 단편 보다 크기는 작으면서 단백질의 활성을 유지하는 활성 단편을 확인하기 위하여, hCOL4A1-N 단편을 N-말단 단편, 중간 단편, C-말단 단편으로 나누어 실시예 2-1에 기재된 방법과 12% SDS-PAGE를 사용한 것 외에는 모두 동일한 방법으로 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, N 단편의 3개의 작은 단편들이 모두 단백질로 발현되었음을 확인하였다.
<2-3> hCOL4A1-C 단편의 C1, C2, C3 및 C4 단편의 단백질 발현 확인
상기 실시예 2-1에서 발현이 확인된 hCOL4A1-C 단편 보다 크기는 작으면서 단백질의 활성을 유지하는 활성 단편을 확인하기 위하여, hCOL4A1-C 단편을 C1, C2, C3 및 C4의 4개 부분으로 나누어 실시예 2-1에 기재된 방법과 15% SDS-PAGE를 사용한 것 외에는 모두 동일한 방법으로 단백질 발현 여부를 확인하였다. hCOL1A1-C1 단편, hCOL1A1-C2 단편, hCOL1A1-C3 단편 및 hCOL1A1-C4 단편은 133 내지 137 아미노산 길이의 펩타이드로, 약 20 kDa 정도 크기이다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 약 21 kDa 크기의 재조합 hCOL4A1-C1 단편 내지 hCOL4A1-C4 단편이 모두 대장균 E. coli Rosetta2(DE3) 균주 내에서 단백질로 발현되었으며, 그 중에서도 특히 C1 및 C4 단편이 효과적으로 과발현됨을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해, hCOL4A1 사슬 단백질에 포함된 도메인인 N, M 및 C 단편이 모두 효과적으로 발현되는 것은 아니며, N 단편 및 C 단편이 효과적으로 발현됨을 확인하였다. 또한, N 단편 및 C 단편 보다 작은 펩타이드인 NN, NM, NC, C1, C2, C3 및 C4 단편이 효과적으로 단백질로 발현됨을 확인하였는 바, 상기 단편들은 크기는 작으면서 단백질의 활성을 유지하는 가장 작은 활성 단편임을 예측할 수 있다.
실시예 3: hCOL4A1 사슬 단백질의 NN, C1 및 C4 단편의 콜라겐 생성 촉진 효과 확인
상기 실시예 2-2와 실시예 2-3에서 확인한 단백질 활성을 유지하는 가장 작은 활성 단편으로 확인된 hCOL4A1 단백질 단편 중 NN 단편, C1 단편과 C4 단편의 인간 피부섬유아세포에서의 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인하였다.
<3-1> 인간 피부섬유아세포의 형질전환
인간 피부섬유아세포(human dermal fibroblast; HDF, ATCC, USA)를 10%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, ThermoFisher), 2 mM의 L-글루타민(L-glutamine, Sigma), 100 IU/mL의 페니실린(penicillin) 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin, Sigma)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 배양하였다. 인간 피부섬유아세포를 웰 플레이트(well plate)에 접종(seeding)한 후, 세포 부착과 환경 적응을 위해 24시간 동안 인큐베이터(incubator)(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 다음 날, 각각 pET-28a(+) (음성대조군), pET-28a(+)-COL4A1 chain(188-1459 aa), pET-28a(+)-NN(188-325 aa), pET-28a(+)-C1(1019-1156 aa) 및 pET-28a(+)-C4(1304-1439 aa)의 플라스미드 2 ug을 TurboFect transfection Reagent (Thermo Scientific)를 이용하여 형질전환(transfection)을 진행하였다.
<3-2> 형질전환된 피부섬유아세포에서의 hCOL4A1 단백질의 NN, C1 및 C4 단편의 발현 확인
상기 실시예 3-1에서 형질전환된 피부섬유아세포의 각 단백질 발현 여부를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯을 다음과 같이 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시에 3-1의 pET-28a(+)-COL4A1 chain(188-1459 aa), pET-28a(+)-NN(188-325 aa), pET-28a(+)-C1(1019-1156 aa) 및 pET-28a(+)-C4(1304-1439 aa) 각각의 플라스미드로 형질전환된 세포를 형질전환 48시간 후 수확하고, 핵 추출 완충액(20mM HEPES [pH 7.6], 20% 글리세롤, 250mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 1mM PMSF, 1mM DTT, 및 단백질 억제제 칵테일 [Roche])에 4℃ 상태로 풀어 놓고 원심분리하여 상층액을 단백질 추출액으로 준비하였다. 단백질 양은 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 표준으로 하여 Bradford assay(BioRad)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 6 내지 15% Gradient SDS-PAGE 젤을 만들어서 섬유아세포 30 ug을 로딩한 후 PVDF membrane에 transfer를 진행하였다. 1XPBST+5% skin milk buffer로 1시간 동안 blocking을 진행하였다. α-Tubulin (B-7)(sc-52861; Santa Cruz) 및 HA-HRP(F-7)(sc-7392; Santa Cruz) 1차 항체는 5% skim milk, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS에 희석시켜서 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 15분씩 3차례 세척하였다. Blocking solution으로 1：5,000배로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-IgG 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 3차례 세척하고 발색은 ECL hyperfilm으로 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 전장 hCOL4A1 사슬 단백질, hCOL4A1사슬 단백질의 NN 단편, C1 단편 및 C4 단편 단백질 모두 인간의 피부섬유아세포에서 잘 발현된 것을 확인하였다.
<3-3> hCOL4A1 단백질의 NN, C1 및 C4 단편을 발현하는 피부섬유아세포의 콜라겐타입 1형 합성량 확인
형질전환된 피부섬유아세포에서 hCOL4A1 단백질 내 NN, C1 및 C4 도메인 단편의 콜라겐 생성 촉진 효과를 전장 hCOL4A1 단백질과 비교하기 위하여 실시예 3-1의 각각의 형질전환된 인간 피부섬유아세포를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3-1의 pET-28a(+) (음성대조군), pET-28a(+)-COL4A1 chain(188-1459 aa), pET-28a(+)-NN(188-325 aa), pET-28a(+)-C1(1019-1156 aa) 및 pET-28a(+)-C4(1304-1439 aa) 각각의 플라스미드로 형질전환된 세포를 48시간 동안 배양한 후, 세포 배양 배지를 수집하고, 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 후 배지의 상층액을 취하여 합성된 콜라겐 타입 1형 C-펩타이드(PICP)를 정량하였다. 콜라겐 타입 1형 C-펩타이드의 정량은 ELISA 키트(Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 사용하여 제조사의 권장 프로토콜에 따라 측정하였으며, 측정된 결과를 도 8에 나타내었다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 각각의 형질전환된 피부섬유아세포를 배양한 배지 상층액에서 합성된 콜라겐 타입 1형 C-펩타이드를 정량한 결과, 음성 대조군(Con)과 비교하여 모든 실험군에서 콜라겐 타입 1형의 합성량이 증가하였으며, 특히 COL4A1 NN 단편, COL4A1 C1 단편 및 COL4A1 C4 단편을 발현하는 플라스미드로 형질전환된 인간 피부섬유아세포의 콜라겐 타입 1형의 합성량이 전장 COL4A1 단백질을 발현하는 플라스미드로 형질전환된 인간 피부섬유아세포의 콜라겐 타입 1형의 합성량 보다 현저히 높음을 확인하였다.
<3-4> hCOL4A1 단백질의 NN, C1 및 C4 단편의 콜라겐 타입 1형 합성 촉진 효과 확인
분리정제한 재조합 hCOL4A1 단백질의 NN, C1 및 C4 단편 단백질의 콜라겐 생성 촉진 활성을 전장 hCOL4A1 단백질과 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 인간 피부섬유아세포(human dermal fibroblast; HDF, ATCC, USA)를 플레이트(well plate)에 6x104 cells(per 1 well)의 밀도로 접종(seeding)한 후, 5%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, ThermoFisher)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 배양하였다. 그런 다음, 배지를 0.1% 소태아혈청을 함유하는 새로운 검정 배지로 교체하고, 1, 10 및 100 μg/ml의 다양한 농도의 COL4A1 NN 단편, COL4A1 C1 단편 또는 COL4A1 C4 단편 단백질을 각각 배지에 용해하여 처리하였다. 각 시료를 처리한 인간 피부섬유아세포를 48시간 동안 배양한 후 세포 배양 배지를 수집하여 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 배지의 상층액을 취하여 합성된 콜라겐 타입 1형 C-펩타이드(PICP)를 정량하였다. 콜라겐 타입 1형 C-펩타이드의 정량은 ELISA 키트(Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 사용하여 제조사의 권장 프로토콜에 따라 측정하였으며, 측정된 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 피부섬유아세포에 COL4A1 NN 단편, COL4A1 C1 단편 또는 COL4A1 C4 단편 단백질을 처리한 경우, 음성 대조군에 비해 우수한 콜라겐 합성 촉진 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (21)

  1. 서열번호 1, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 촉진하는 것인, 펩타이드.
  6. 삭제
  7. 제1항의 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물.
  8. 제1항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  11. 제10항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  12. (1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
    (2) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (3) 상기 배양된 형질전환된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
    를 포함하는 제1항의 펩타이드를 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 숙주세포는 섬유아세포 또는 대장균인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 펩타이드는 숙주세포 파쇄물 또는 용해물을 원심분리한 상등액으로 수득하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 pET-28a(+)인 것인, 방법.
  16. (1) 제1항의 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
    (2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계; 및
    (3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
    를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 콜라겐 합성능을 갖는 세포는 섬유아세포인 것인, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 도입은 콜라겐 합성능을 갖는 세포를 상기 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항의 펩타이드를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 조성물은 세포 내 콜라겐 합성을 촉진하는 것인, 화장료 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 피부 상태 개선용은 피부 노화 방지용, 피부주름 방지용, 또는 피부 보습용인 것인, 화장료 조성물.
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WO2022204372A1 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 University Of Massachusetts Adipose-derived hydrogel compositions and methods of use

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