KR102135976B1 - 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 - Google Patents
콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102135976B1 KR102135976B1 KR1020190133000A KR20190133000A KR102135976B1 KR 102135976 B1 KR102135976 B1 KR 102135976B1 KR 1020190133000 A KR1020190133000 A KR 1020190133000A KR 20190133000 A KR20190133000 A KR 20190133000A KR 102135976 B1 KR102135976 B1 KR 102135976B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- peptide
- collagen
- gly
- cells
- pro
- Prior art date
Links
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 156
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 155
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 153
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 31
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 63
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 61
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 149
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 25
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 22
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 8
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 claims description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 75
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 63
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 48
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 29
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 13
- 108010014614 prolyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1 BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 11
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 11
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N Lys-Gly-Glu Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC([O-])=O LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 9
- 108010091092 arginyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 9
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 9
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 7
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 7
- MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- SCJJPCQUJYPHRZ-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Asn Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SCJJPCQUJYPHRZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 6
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 6
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 5
- GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 5
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 5
- BGWKULMLUIUPKY-BQBZGAKWSA-N Pro-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 BGWKULMLUIUPKY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 4
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 4
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- CAVKXZMMDNOZJU-UHFFFAOYSA-N Gly-Pro-Ala-Gly-Pro Natural products C1CCC(C(O)=O)N1C(=O)CNC(=O)C(C)NC(=O)C1CCCN1C(=O)CN CAVKXZMMDNOZJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- MVBZBRKNZVJEKK-DTWKUNHWSA-N Met-Gly-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N MVBZBRKNZVJEKK-DTWKUNHWSA-N 0.000 description 4
- KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N Pro-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- MSIYNSBKKVMGFO-BHNWBGBOSA-N Thr-Gly-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O MSIYNSBKKVMGFO-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 4
- 108010077465 Tropocollagen Proteins 0.000 description 4
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 4
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 3
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 3
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- NSORZJXKUQFEKL-JGVFFNPUSA-N Gln-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O NSORZJXKUQFEKL-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 3
- PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N Gly-Ala-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- WDXLKVQATNEAJQ-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Asp Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WDXLKVQATNEAJQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- GQKSJYINYYWPMR-NGZCFLSTSA-N Ile-Gly-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N GQKSJYINYYWPMR-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 3
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 3
- UUHXBJHVTVGSKM-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UUHXBJHVTVGSKM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- FKLSMYYLJHYPHH-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FKLSMYYLJHYPHH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- XQSREVQDGCPFRJ-STQMWFEESA-N Pro-Gly-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O XQSREVQDGCPFRJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N Ser-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- KDGARKCAKHBEDB-NKWVEPMBSA-N Ser-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O KDGARKCAKHBEDB-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 108010045383 histidyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 3
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- SCAKQYSGEIHPLV-IUCAKERBSA-N (4S)-4-[(2-aminoacetyl)amino]-5-[(2S)-2-(carboxymethylcarbamoyl)pyrrolidin-1-yl]-5-oxopentanoic acid Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O SCAKQYSGEIHPLV-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N Ala-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N Ala-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N Arg-Gly-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N Arg-Pro-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 235000011511 Diospyros Nutrition 0.000 description 2
- 244000236655 Diospyros kaki Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N Gln-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N Glu-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 2
- HQTDNEZTGZUWSY-XVKPBYJWSA-N Glu-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O HQTDNEZTGZUWSY-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 2
- QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N Gly-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN)C(=O)O XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- KQDMENMTYNBWMR-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KQDMENMTYNBWMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- STVHDEHTKFXBJQ-LAEOZQHASA-N Gly-Glu-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O STVHDEHTKFXBJQ-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N Gly-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- JSNNHGHYGYMVCK-XVKPBYJWSA-N Gly-Glu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSNNHGHYGYMVCK-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 2
- UTYGDAHJBBDPBA-BYULHYEWSA-N Gly-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN UTYGDAHJBBDPBA-BYULHYEWSA-N 0.000 description 2
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- LIXWIUAORXJNBH-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN LIXWIUAORXJNBH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N Gly-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N 0.000 description 2
- CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N Gly-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N Gly-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(=O)O WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N 0.000 description 2
- JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Arg Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ser Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- GJHWILMUOANXTG-WPRPVWTQSA-N Gly-Val-Arg Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GJHWILMUOANXTG-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N Leu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N Lys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N Phe-Pro-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=CC=C1 MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- BNBBNGZZKQUWCD-IUCAKERBSA-N Pro-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 BNBBNGZZKQUWCD-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N Pro-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- FUOGXAQMNJMBFG-WPRPVWTQSA-N Pro-Val-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FUOGXAQMNJMBFG-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N Ser-Pro-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N Val-Arg-Gly Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N Val-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N Val-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC([O-])=O AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 2
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 2
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 2
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 2
- 108010008237 glutamyl-valyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 2
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WGDNWOMKBUXFHR-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N WGDNWOMKBUXFHR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N Ala-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- SUHLZMHFRALVSY-YUMQZZPRSA-N Ala-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)NCC(O)=O SUHLZMHFRALVSY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- AQPVUEJJARLJHB-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N AQPVUEJJARLJHB-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010010777 Arg-Gly-Asp-Gly Proteins 0.000 description 1
- WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010051330 Arg-Pro-Gly-Pro Proteins 0.000 description 1
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- CTQIOCMSIJATNX-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CTQIOCMSIJATNX-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N Asn-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- NVWJMQNYLYWVNQ-BYULHYEWSA-N Asn-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O NVWJMQNYLYWVNQ-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- VHQOCWWKXIOAQI-WDSKDSINSA-N Asp-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VHQOCWWKXIOAQI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N Asp-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LBOVBQONZJRWPV-YUMQZZPRSA-N Asp-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LBOVBQONZJRWPV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010028690 Fish Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- ORYMMTRPKVTGSJ-XVKPBYJWSA-N Gln-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ORYMMTRPKVTGSJ-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N Gln-Pro-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PXHABOCPJVTGEK-BQBZGAKWSA-N Glu-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O PXHABOCPJVTGEK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CQAHWYDHKUWYIX-YUMQZZPRSA-N Glu-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O CQAHWYDHKUWYIX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GZUKEVBTYNNUQF-WDSKDSINSA-N Gly-Ala-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GZUKEVBTYNNUQF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BGVYNAQWHSTTSP-BYULHYEWSA-N Gly-Asn-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BGVYNAQWHSTTSP-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N Gly-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)O LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- HFXJIZNEXNIZIJ-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HFXJIZNEXNIZIJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N Gly-Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- IEGFSKKANYKBDU-QWHCGFSZSA-N Gly-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)CN)C(=O)O IEGFSKKANYKBDU-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 1
- SSFWXSNOKDZNHY-QXEWZRGKSA-N Gly-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN SSFWXSNOKDZNHY-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- GAAHQHNCMIAYEX-UWVGGRQHSA-N Gly-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GAAHQHNCMIAYEX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N Gly-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(=O)O ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- DCRODRAURLJOFY-XPUUQOCRSA-N His-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O DCRODRAURLJOFY-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- HAPWZEVRQYGLSG-IUCAKERBSA-N His-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HAPWZEVRQYGLSG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N Ile-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- BFVQTKQTUCQRPI-YYEZTRBPSA-N LPS with O-antigen Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O5)O)O4)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)O2)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)OC([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H]([C@@H](O)COC2[C@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]([C@@H](O)CO)O2)O)OC([C@H]1O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCCN)[C@@H]([C@@H](O)CO)OC([C@H]1O)O[C@H]1[C@H](O[C@]2(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@]3(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OCCN)C3)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C2)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C[C@](O[C@@H]1[C@@H](O)CO)(OC[C@H]1O[C@@H](OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O2)O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@H]([C@@H]1OP(O)(O)=O)OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O BFVQTKQTUCQRPI-YYEZTRBPSA-N 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CIIJWIAORKTXAH-FJXKBIBVSA-N Met-Thr-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O CIIJWIAORKTXAH-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPPVJIJMIKTERM-YUMQZZPRSA-N Pro-Gln-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZPPVJIJMIKTERM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ABSSTGUCBCDKMU-UWVGGRQHSA-N Pro-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ABSSTGUCBCDKMU-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 108010064622 Procollagen N-Endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000015339 Procollagen N-endopeptidase Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N Ser-Gly-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N Ser-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- XEYUMGGWQCIWAR-XVKPBYJWSA-N Val-Gln-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N XEYUMGGWQCIWAR-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- YTPLVNUZZOBFFC-SCZZXKLOSA-N Val-Gly-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O YTPLVNUZZOBFFC-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008571 general function Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010027668 glycyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002356 skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 108010011876 valyl-glycyl-valyl-alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2511/00—Cells for large scale production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환된 숙주세포, 그리고 이들을 활용한 상기 펩타이드를 제조하는 방법과 콜라겐을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시키는 활성이 뛰어나며, 이를 활용하여 콜라겐을 대량 생산하는 방법은 기존의 인간 콜라겐 타입 1형을 추출하는 방식과 비교하여 세균이나 바이러스 등의 오염이나 인체 내 면역반응을 회피할 수 있고, 보다 경제적이며 효율적으로 기능성 콜라겐을 대량 생산할 수 있어 효과적이다.
본 발명의 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시키는 활성이 뛰어나며, 이를 활용하여 콜라겐을 대량 생산하는 방법은 기존의 인간 콜라겐 타입 1형을 추출하는 방식과 비교하여 세균이나 바이러스 등의 오염이나 인체 내 면역반응을 회피할 수 있고, 보다 경제적이며 효율적으로 기능성 콜라겐을 대량 생산할 수 있어 효과적이다.
Description
본 발명은 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환된 숙주세포, 그리고 (1) 숙주세포를 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계; (2) 상기 숙주세포를 배양하는 단계; (3) 상기 배양된 숙주세포에서 상기 펩타이드를 수득하는 단계;를 포함하는 상기 펩타이드를 제조하는 방법, 그리고 (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계; (2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계; (3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법에 대한 것이다.
콜라겐은 인체에서 가장 흔하게 발견하는 단백질로 포유류에서 가장 많은 단백질이어서 전체 단백질의 약 25-35%를 차지한다. 특히 뼈, 힘줄, 인대를 구성하는 주요한 성분이며, 주로 장기의 구조를 유지하는 역할을 한다. 그러나 콜라겐의 체내 생성량은 연령에 따라 감소하게 되는데 20대에 콜라겐 생성량이 최대이며, 40대는 70% 수준으로 생성되고 이후 급격히 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서 노화가 진행될수록 콜라겐은 체내 생성되는 물질이 아니기에 식품 등으로부터 섭취 및 흡수를 통한 콜라겐 생성이 필요하다.
콜라겐은 인체 내 구성성분이기도 하지만 육류 및 어류에도 다량 존재한다. 특히 돼지 껍데기, 닭 날개, 도가니탕, 닭발 등에 많이 존재한다고 알려져 널리 섭취되고 있다. 일반적으로 동물성 식품 중 육류 제품을 통해 콜라겐을 섭취하고 있지만, 식물성 식품 내 콜라겐 함량도 소량이지만 존재한다. 주로 곶감, 두충차, 감잎차 등에 있는데, 이와 같은 식품의 섭취를 통해서는 콜라겐 효과를 기대하기 어려운 측면이 있다.
또한 기존 동물성 콜라겐의 경우 의약품 소재, 화장품 및 식품 등에 많이 사용되고 있으나, 추출 과정에서의 세균이나 바이러스와 같은 오염의 문제를 유발하고 일부의 경우 전염성 병원체(예를 들어, 광우병, 조류독감, 전염성 해면뇌종 등)에 노출되는 문제점을 가지고 있다. 또한 종래의 콜라겐의 경우, 돼지 피부 또는 소 유래 콜라겐 제품으로서, 일반적으로 3~5%에서 면역반응이 나타나기 때문에, 반드시 알러지 테스트를 수행한 후에 사용해야 하는 문제점이 있다. 추가적으로 조류나 어류에서 추출하는 콜라겐의 경우, 닭 및 어류 등에서 추출하므로 단백질이 미량 남아 있을 수 있어서 조류 및 어류 단백질에 과민반응이 있는 사람들에게는 사용해서는 안 되는 문제점을 가지고 있다.
종래의 인간 콜라겐 타입 1형의 경우에는 인간 탯줄 유래나 지방 유래 콜라겐을 주로 생산하였으나, 고비용의 생산 단가이거나 병원체의 감염 우려를 가지고 있는 문제점이 있다. 또한 포유동물 세포주의 발현계는 생산량이 낮고 특정 세포 유형의 제약을 받는다. 또한 현재 휴먼 콜라겐을 코딩하는 유전자를 가진 바큐로바이러스(baculovirus) 발현계가 이미 구축되어 있다(미국 특허 제5,077,214호 및 제5,593,859호). 그러나 형질감염을 거친 곤충 세포는 72시간 내에 사망하므로 일시적인 재조합 단백질 콜라겐만 생산된다. 그 외, 세포용해작용으로 인하여 재조합 콜라겐을 회수하거나 정제하기가 상당히 어렵다. 또한 배큘로바이러스의 소포체 또는 골지체에 대한 파괴는 콜라겐의 생산을 더욱 제한한다. 따라서 인간의 콜라겐 타입 1형을 보다 효과적으로 생산할 수 있는 방법의 개발이 매우 필요하다.
이에 본 발명자들은 인간의 콜라겐 타입 1 알파 2 체인 (human collagen type 1 alpha 2 chain, hCOL1A2) 단백질의 특정한 단편이 콜라겐 합성을 촉진하는 활성이 뛰어날 뿐 아니라, 세포 성장 및 세포 이동성 촉진의 활성이 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
(1) 숙주세포를 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 숙주세포를 배양하는 단계;
(3) 상기 배양된 숙주세포에서 상기 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계;
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 숙주세포를 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 숙주세포를 배양하는 단계;
(3) 상기 배양된 숙주세포에서 상기 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계;
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 인간의 콜라겐 타입 1 알파 2 체인(human collagen type 1, alpha 2 chain, hCOL1A2) 단백질의 특정한 단편인 SMM 단편에 콜라겐 합성을 촉진하는 활성이 있음을 발견하였다. hCOL1A2 단백질을 임의로 나눈 N(hCOL1A2의 80-603 aa; aa는 amino acid의 약자), M(344-863 aa), C(604-1119 aa)단편을 제조하여, 콜라겐을 합성하는 세포인 인간 피부섬유아세포에 처리한 결과, M 단편이 가장 높은 수준으로 콜라겐 합성을 촉진하는 것을 확인하였다. 나아가 M 단편에 대해서도 동일한 분석을 실시한 결과, M 단편을 다시 임의로 구분하여 특정한 SMN(344-478 aa), SMM(445-579 aa), SMC(549-683 aa) 등 세 단편 중에 SMM 단편이 콜라겐 합성을 촉진하는 효과가 가장 현저한 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명에서 서열번호 1의 아미노산 서열, 즉 SMM 단편의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에는 피부섬유아세포 등 콜라겐을 자연적으로 합성하는 세포에서 콜라겐 합성을 더욱 촉진하는 예상치 못한 활성이 존재하는 것을 밝힌 것이다. 이러한 콜라겐 합성 촉진 활성은 의약품과 기능성 식품, 화장품 등 다양한 분야에서 원료로 널리 사용되는 콜라겐을 대량 생산하는데 매우 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.
본 명세서에서 콜라겐 타입 1 알파 2 체인(collagen type 1 alpha 2 chain, COL1A2) 단백질이란, 특히 인간에서 유래된 것을 의미하는 것으로서, 본 명세서에서는 hCOL1A2로 표기하며, 인간 유전자 COL1A2에 암호화되어 있는 단백질을 의미한다. 콜라겐 타입 1 알파 1 체인(collagen type 1 alpha 1 chain, COL1A1)과 함께 인체에서 가장 높은 함유량을 보이는 삼중 나선 구조의 타입 1 콜라겐 (또는 제1형 콜라겐)을 구성한다. 타입 1 콜라겐은 콜라겐 섬유(collagen fiber)를 형성하며, 상처 치유 과정으로 생기는 흉터 조직에 존재하며, 인대, 힘줄, 골격, 치아 상아질 등의 주요 구성성분이다.
본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다. 본 발명자들이 밝힌 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드는 콜라겐 합성을 향상시키는 새로운 기능을 발휘한다. 또한 본 발명에 따른 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하면서 추가로 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로는 SMM 단편을 포함하는 M 단편의 서열인 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열목록의 아미노산 서열은 별도의 표시가 없더라도 아미노 말단(N-terminal)으로부터 카르복시 말단(C-terminal)의 방향으로 기재된 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드는 콜라겐 합성 촉진 활성 뿐 아니라, 세포 성장 및 세포 이동을 촉진하는 활성도 있음을 일실시예에서 확인한 바 있다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드를 대장균에서 과발현하여 제조하고, 분리정제하여 인간 피부섬유아세포에 처리하면, 펩타이드의 농도의존적으로 세포생존률이 증가하는 등 세포 성장이 촉진되는 것을 MTT 에세이를 이용하여 확인하였다. 나아가 상기 펩타이드를 처리한 인간 각질형성세포(keratinocyte)인 HaCaT 세포의 세포 이동이 증가하는 것을 wound healing assay를 이용하여 확인하였다.
이른바, 본 발명에 따른 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시킬 뿐 아니라, 세포성장인자로서 그리고 세포 이동성 증가 인자로서의 활성도 가지는 등 다양한 세포 내 기능을 촉진시키는 활성을 갖는 것이다.
이에 따라 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환되거나, 분리정제된 펩타이드를 처리한 인간 피부섬유아세포에서는 콜라겐 합성 수준이 음성대조군(아무 처리하지 않은 피부섬유아세포)과 비교하여 콜라겐 합성 수준이 3~5배 이상 증가한 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 조성물은 세포 내 콜라겐을 효과적으로 촉진하는 용도로 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
상기 조성물이란, 순수하게 본 발명에 따른 펩타이드만을 버퍼 등의 용매에 포함하는 용액일 수도 있고, 펩타이드를 안정화하기 위한 다른 첨가물이나, 유사한 활성을 갖는 인자, 보조 인자 등을 추가로 포함한 것일 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현하는 세포를 용해시킨 세포 용해물일 수도 있다.
또한 본 발명의 조성물에 따라 합성이 촉진되는 콜라겐은 인간 유래의 콜라겐, 특히 콜라겐 타입 1인 것이 바람직하지만, 본 발명의 목적인 합성 수준의 촉진이라는 목적이 달성되는 한, 여기 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는 본 발명의 실시예에서는 인간 섬유아세포의 배양 상층액에서 콜라겐 타입 1의 프로콜라겐 C-펩타이드를 표적으로하여 콜라겐 합성 수준을 측정하였다.
또한 상기 세포란 콜라겐을 합성할 수 있는 능력을 가진 세포로서, 자연적으로 콜라겐을 합성할 수 있는 섬유아세포, 골아세포(osteoblast), 조연골아세포(chondroblast) 등의 세포일 수도 있고, 일반적으로 콜라겐을 합성하지는 않지만, 유전공학적으로 콜라겐을 합성하도록 형질전환된 세포일 수도 있다.
본 명세서에서 콜라겐의 합성이란, 콜라겐 유전자의 전사, 단백질로의 발현 뿐 아니라, 콜라겐 섬유로서 기능적인 구조 및 아미노산의 변형을 거치는 성숙 단계를 모두 포함하는 의미이다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것으로서, 상기 서열번호의 염기서열은 서열번호 1의 아미노산 서열, 더 구체적으로는 본 발명자들이 특정한 hCOL1A2 단백질의 SMM 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 것이다. 본 명세서에 기재된 서열목록의 염기서열은 별도의 표시가 없더라도 5‘ 말단으로부터 3’ 말단의 방향으로 기재된 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 재조합(recombinant)은 유전자 조작(genetic manipulation)과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecμlar cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.
본 발명에서 발현(expression)은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에서 재조합 발현 벡터란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 작동가능하게 연결된(operably linked)이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 발현조절서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, pcDNA 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 pET-28a(+) 벡터를 사용할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다. 바람직하게 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명에 다른 숙주 세포는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫(rat) 세포, 마우스 (mouse) 세포, 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
가장 바람직하게는 콜라겐을 합성할 수 있는 진핵세포이거나, 일반적으로 단백질을 과발현하도록 형질전환하여 사용되는 대장균 등의 원핵세포일 수 있다. 상기 콜라겐을 합성할 수 있는 세포는 앞서 설명한 바와 같다. 나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드가 발현되는지 여부를 인간 피부섬유아세포에서 분석하였고, 대량 생산 및 분리정제하기 위하여 대장균에서 과발현을 유도하였는데, 이 때 특히 내독소 LPS를 제거한 ClearColi BL21(DE3) 대장균을 사용하였다.
본 발명에 따른 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현 또는 대량으로 생산할 수 있다.
또한 본 발명은
(1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 숙주세포를 배양하는 단계;
(3) 상기 배양된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 제1항의 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
(1) 단계는 본 발명에 따른 펩타이드를 생산하기 위한 숙주세포를 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계이다. 재조합 발현 벡터는 앞서 설명한 바와 같으며, 바람직하게는 pET-28a(+) 벡터를 이용할 수 있다.
선택가능한 숙주세포로는 앞서 설명한 바와 같으며, 통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 적절한 형질전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 숙주세포는 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 제한없이 선택할 수 있지만, 본 발명을 실시하게 위해서는 상기 숙주세포는 콜라겐을 생성하는 섬유아세포 또는 단백질 과발현을 위한 대장균이 바람직하며, 상기 대장균은 특히 LPS의 발현이 억제되어 안정성이 증진된 것일 수 있다.
포유동물 세포주, 곤충 세포주, 형질전환 동물 등의 경우에는 생산량이 낮고 특정 세포 유형의 제약을 받거나 일시적으로만 재조합 콜라겐 단백질이 생산되고, 형질전환 동물(예를 들어 누에 또는 쥐) 및 형질전환 식물(예를 들어 담뱃잎)은 콜라겐 산물이 과도하게 교차 결합하여 회수 자체나 분리정제가 어려울 수 있다. 따라서 대장균(Escherichia coli, E. coli)을 이용할 경우에는 인간 탯줄유래나 포유 동물 세포 등에 비해서 높은 생산량을 보이면서 기존 동물성 콜라겐에 세균이나 바이러스와 같은 오염을 유발 및 면역반응이 없는 장점이 있다.
또한 종래에 사용되던 대장균이 포함하는 LPS를 제거된 ClearColi BL21(DE3) 등의 대장균은 유전적으로 변형된 LPS를(Lipid Iva) 가지고 있어서 사이토카인을 유발하지 않고 내독소를 95% 이상 감소되어 있다(참고문헌: Microbial cell factories. 2015 Apr 16;14:57. & Applied microbiology and biotechnology 2014 Nov;98(22):9229-38). 본 실시예에서는 이를 이용해서 재조합 단백질을 생산하기 때문에 종래 대장균에서 생산된 단백질에 비해서 세포독성이 거의 없다.
나아가 대장균을 숙주세포로 사용하면 동물세포를 숙주세포로 사용할 경우 발생할 수 있는 세균이나 바이러스 등 병원체에 의한 오염, 인체 내 면역반응 유발 등의 문제점을 피할 수 있으며, 높은 생산 비용을 절감하는 효과도 있다.
(2) 단계는 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 본 발명에 따른 펩타이드가 과발현 또는 생산되도록 하는 단계이다. 통상의 기술자는 선택한 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등을 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포에서 생산되는 펩타이드는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화(targeted) 되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 펩타이드가 구조 등 성질을 유지하거나 향상시키도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩(refolding)시키고 기능성 구조(conformation)를 갖도록 할 수 있다.
(3) 단계는 숙주세포에서 생산된 펩타이드를 수득하는 단계이다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 펩타이드는 숙주세포를 배양한 배지(상등액)를 수득하고, 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 펩타이드를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 펩타이드를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 펩타이드의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 펩타이드는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.
보다 구체적으로는 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현하는 숙주세포의 파쇄물 또는 용해물을 원심분리하여 얻어지는 상등액을 취하는 방법으로 수득할 수 있다.
또한 본 발명은
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계;
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법을 제공한다.
(1) 단계는 본 발명에 따른 펩타이드로 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계이다. 상기 단계는 본 발명에 따른 펩타이드의 순수하게 분리정제된 형태로 사용할 수도 있고, 적절한 용매 및 보조인자를 포함하는 용액 형태로 사용할 수 있으며, 나아가 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현하는 세포의 용해물일 수도 있다. 이와 같이 다양한 상태 또는 형태의 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포의 외부에 처리하여 상기 펩타이드가 세포의 외부에 접촉하도록 할 수도 있고, 또는 펩타이드가 세포의 내부로 도입되도록 할 수도 있다. 통상의 기술자는 세포 내 펩타이드를 전달하기 위하여 당해 기술분야에서 널리 이용되는 방법, 예를 들어, 미세관을 이용한 주입이나 펩타이드 형질전환(peptide transfection) 등을 제한없이 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 나아가, 콜라겐 합성능을 갖는 세포가 직접 본 발명에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 재조합 발현 벡터로 콜라겐 합성능을 갖는 세포를 형질전환할 수 있다.
본 명세서의 실시예에 설명된 바와 같이, 피부섬유아세포는 본 발명에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환되거나, 본 발명에 따른 펩타이드를 분리정제하여 세포 외부에 처리한 경우 모두 콜라겐 합성 수준이 크게 향상된다는 발견에 기반한 것이다.
콜라겐 합성능을 갖는 세포에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 콜라겐 합성능을 갖는 세포가 본 발명에 따른 펩타이드의 자극을 받으면 세포 내 콜라겐 합성이 크게 촉진되는 효과가 있다. 상기 접촉은 일시적이거나, 몇 시간 동안 지속되는 것일 수도 있고, 또는 펩타이드를 수득하는 (3) 단계에 이르기까지 계속되는 것일 수도 있다. 통상의 기술자라면 적절한 시간과 농도를 선택하여 실시할 수 있다.
(2) 단계는 본 발명에 따른 펩타이드와 접촉한 세포가 콜라겐을 합성할 수 있도록 배양하는 단계이다. 콜라겐의 유전자가 전사되고, 단백질로 발현되어 삼중 나선 구조 형태의 콜라겐 섬유로 성숙하는 시간을 주는 것이다.
(3) 단계는 세포에서 합성된 콜라겐을 수득하는 방법이다. 세포에서 펩타이드를 수득하는 방법에 대하여서는 앞서 설명한 바와 같다.
따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환된 숙주세포, 그리고 이들을 활용한 상기 펩타이드를 제조하는 방법과 콜라겐을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시키는 활성이 뛰어나며, 세포분열 및 세포이동을 촉진하는 효과도 확인되었다. 재조합 단백질로 대장균에서 대량 생산되었을 때 콜라겐 삼중 나선 구조를 형성하는데 핵심적인 수산화 프롤린도 포함한다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드를 이용하여 콜라겐을 대량 생산하는 방법은 기존의 인간 콜라겐 타입 1형을 추출하는 방식과 비교하여 세균이나 바이러스 등의 오염이나 인체 내 면역반응을 회피할 수 있고, 보다 경제적이며 효율적으로 안전한 기능성 콜라겐을 대량 생산할 수 있어 효과적이다.
도 1은 콜라겐 생성 촉진 평가를 위한 hCOL1A2 chain의 각 도메인(단편)의 모식도 및 플라스미드 제작 과정을 나타낸 것이다. 각 단편의 이름 및 해당 아미노산 서열 부위는 도면에 표시된 바와 같다.
도 2는 hCOL1A2 chain의 각 도메인의 발현 정도 및 콜라겐 합성 촉진 정도를 비교한 실험을 나타낸다. 도 2의 A는 hCOL1A2 chain의 N, M, C 도메인의 발현을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 2의 B는 상기 도메인을 처리한 피부섬유아세포에서의 콜라겐 합성 정도를 비교한 바 그래프이다. NC는 음성대조군(pSG5-HA), N은 pSG5-HA-hCOL1A2(80-603 aa), M은 pSG5-HA-hCOL1A2(344-863 aa), C는 pSG5-HA-hCOL1A2(604-1119 aa)를 나타낸다. *는 p<0.05, **는 p<0.005를 나타낸다.
도 3은 hCOL1A2 chain의 M 도메인의 단편의 발현 정도 및 콜라겐 합성 촉진 정도를 비교한 실험을 나타낸다. 도 3의 A는 hCOL1A2 chain의 M 도메인의 단편인 SMN, SMM, SMC의 발현을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 3의 B는 상기 도메인을 처리한 피부섬유아세포에서의 콜라겐 합성 정도를 비교한 바 그래프이다. NC는 음성대조군(pSG5-HA), SMN은 pSG5-HA-hCOL1A2(344-478 aa), SMM은 pSG5-HA-hCOL1A2 (445-579 aa), SMC는 pSG5-HA-hCOL1A2(549-683 aa)를 나타낸다. *는 p<0.05, **는 p<0.005를 나타낸다.
도 4는 hCOL1A2 chain의 SMM 단편(445-579 aa)을 제조하기 위한 플라스미드 제작과 단백질 발현 실험을 나타낸다. 도 4의 A는 SMM 단편을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터(pET-28a(+)-hCOL1A2)의 모식도를 나타낸다. 도 4의 B는 대장균 (Clearcoli BL21)에서의 SMM 단편의 발현 양상을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. SM은 단백질 사이즈 마커, 1번 레인은 IPTG을 통해서 재조한 단백질을 유도하지 않은 전체 cell lysate, 2번 레인은 IPTG을 통해서 재조한 단백질을 유도한 전체 cell lysate, 3번 레인은 가용성 cell lysate, 4번 레인은 His-binding 칼럼 정제된 단백질, 5번 레인은 size-exclusion chromatography(sec)로 정제된 최종 재조합 단백질을 각각 로딩한 것이다.
도 5는 피부섬유아세포에서 SMM 단편에 의한 콜라겐 합성 촉진을 확인하는 실험을 나타낸다. 도 5의 A는 피부섬유아세포의 콜라겐 합성 정도를 평가하기 위한 키트의 표준 곡선(standard curve)를 나타낸다. 도 5의 B는 각각의 시료에 의한 피부섬유아세포의 콜라겐 합성량을 비교한 바 그래프이다. NC는 negative control(음성대조군), PC는 positive control(양성대조군; TGF-β, 10ng/ml), hCOL1A2는 각각 다른 농도의 SMM 단편(1, 10, 100ug/ml)을 나타낸다. *는 p<0.05, **는 p<0.005를 나타낸다.
도 6은 hCOL1A2 chain의 SMM 단편의 단백질 성장인자 활성을 분석하기 위한 피부섬유아세포에서의 MTT assay 결과를 나타낸다. NC는 negative control(음성대조군), PC는 positive control(양성대조군; TGF-β, 10ng/ml), hCOL1A2는 각각 다른 농도의 SMM 단편(1, 10, 100ug/ml)을 나타낸다. *는 p<0.05를 나타낸다.
도 7은 hCOL1A2 chain의 SMM 단편의 HaCaT 세포의 이동성(mobility)에 미치는 영향을 분석하기 위한 wound-healing assay 결과를 나타낸다. 도 7의 A는 단층으로 균일하게 자란 HaCaT 세포들이 20시간 동안 이동한 정도를 보여주는 현미경 사진이다. 도 7의 B는 세포가 이동한 정도를 비교하기 위한 바 그래프이다. NC는 negative control(음성대조군), PC는 positive control(양성대조군; TGF-β, 10ng/ml), hCOL1A2는 SMM 단편(100ug/ml)을 나타낸다. *는 p<0.05, **는 p<0.005를 나타낸다.
도 2는 hCOL1A2 chain의 각 도메인의 발현 정도 및 콜라겐 합성 촉진 정도를 비교한 실험을 나타낸다. 도 2의 A는 hCOL1A2 chain의 N, M, C 도메인의 발현을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 2의 B는 상기 도메인을 처리한 피부섬유아세포에서의 콜라겐 합성 정도를 비교한 바 그래프이다. NC는 음성대조군(pSG5-HA), N은 pSG5-HA-hCOL1A2(80-603 aa), M은 pSG5-HA-hCOL1A2(344-863 aa), C는 pSG5-HA-hCOL1A2(604-1119 aa)를 나타낸다. *는 p<0.05, **는 p<0.005를 나타낸다.
도 3은 hCOL1A2 chain의 M 도메인의 단편의 발현 정도 및 콜라겐 합성 촉진 정도를 비교한 실험을 나타낸다. 도 3의 A는 hCOL1A2 chain의 M 도메인의 단편인 SMN, SMM, SMC의 발현을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 3의 B는 상기 도메인을 처리한 피부섬유아세포에서의 콜라겐 합성 정도를 비교한 바 그래프이다. NC는 음성대조군(pSG5-HA), SMN은 pSG5-HA-hCOL1A2(344-478 aa), SMM은 pSG5-HA-hCOL1A2 (445-579 aa), SMC는 pSG5-HA-hCOL1A2(549-683 aa)를 나타낸다. *는 p<0.05, **는 p<0.005를 나타낸다.
도 4는 hCOL1A2 chain의 SMM 단편(445-579 aa)을 제조하기 위한 플라스미드 제작과 단백질 발현 실험을 나타낸다. 도 4의 A는 SMM 단편을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터(pET-28a(+)-hCOL1A2)의 모식도를 나타낸다. 도 4의 B는 대장균 (Clearcoli BL21)에서의 SMM 단편의 발현 양상을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. SM은 단백질 사이즈 마커, 1번 레인은 IPTG을 통해서 재조한 단백질을 유도하지 않은 전체 cell lysate, 2번 레인은 IPTG을 통해서 재조한 단백질을 유도한 전체 cell lysate, 3번 레인은 가용성 cell lysate, 4번 레인은 His-binding 칼럼 정제된 단백질, 5번 레인은 size-exclusion chromatography(sec)로 정제된 최종 재조합 단백질을 각각 로딩한 것이다.
도 5는 피부섬유아세포에서 SMM 단편에 의한 콜라겐 합성 촉진을 확인하는 실험을 나타낸다. 도 5의 A는 피부섬유아세포의 콜라겐 합성 정도를 평가하기 위한 키트의 표준 곡선(standard curve)를 나타낸다. 도 5의 B는 각각의 시료에 의한 피부섬유아세포의 콜라겐 합성량을 비교한 바 그래프이다. NC는 negative control(음성대조군), PC는 positive control(양성대조군; TGF-β, 10ng/ml), hCOL1A2는 각각 다른 농도의 SMM 단편(1, 10, 100ug/ml)을 나타낸다. *는 p<0.05, **는 p<0.005를 나타낸다.
도 6은 hCOL1A2 chain의 SMM 단편의 단백질 성장인자 활성을 분석하기 위한 피부섬유아세포에서의 MTT assay 결과를 나타낸다. NC는 negative control(음성대조군), PC는 positive control(양성대조군; TGF-β, 10ng/ml), hCOL1A2는 각각 다른 농도의 SMM 단편(1, 10, 100ug/ml)을 나타낸다. *는 p<0.05를 나타낸다.
도 7은 hCOL1A2 chain의 SMM 단편의 HaCaT 세포의 이동성(mobility)에 미치는 영향을 분석하기 위한 wound-healing assay 결과를 나타낸다. 도 7의 A는 단층으로 균일하게 자란 HaCaT 세포들이 20시간 동안 이동한 정도를 보여주는 현미경 사진이다. 도 7의 B는 세포가 이동한 정도를 비교하기 위한 바 그래프이다. NC는 negative control(음성대조군), PC는 positive control(양성대조군; TGF-β, 10ng/ml), hCOL1A2는 SMM 단편(100ug/ml)을 나타낸다. *는 p<0.05, **는 p<0.005를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : hCOL1A2 chain 단백질 내 도메인 단편 제조
인간의 hCOL1A2 chain 단백질 내에 존재하는 특정 도메인(단편)에 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 기능이 있는지, 나아가 콜라겐 촉진 정도가 단편에 따라 다른지 여부를 확인하기 위하여, hCOL1A2 chain 단백질 내 도메인(단편)을 특정하고, 이를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하여 각각의 단편을 제조하였다. 본 실시예에서 특정하고 재조합 발현 벡터에 삽입한 단편은 도 1에 도시된 바와 같다.
먼저 epitope mapping 및 in vitro transcription/translation을 위한 plasmid DNA cloning을 실시하였다. hCOL1A2 plasmid DNA vector를 template로 하여, pfu 중합효소로 PCR을 수행하였다(PCR 사이클: 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 55초의 반응을 30회 반복; PCR target: hCOL1A2 chain 단백질 내 단편 344-863 aa, 80-603 aa, 604-1119 aa, 344-478 aa, 445-579 aa, 549-683 aa; aa는 amino acids의 약자). 각각 증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 정제 키트(geneall, 한국)를 이용하여 정제 분리하였다. 이어서 pSG5-HA vector와 PCR 산물을 제한효소 Hind III과 Not I으로 절단 후, ligation하고 transformation한 후, ampicillin LB agar 플레이트에 spreading하였다. Single clone에서 DNA를 추출하고 sequencing을 수행하여, 목적한 plasmid DNA vector가 맞는지 확인하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열은 다음과 같다. 단편 N-terminal(N; 80-603 aa)의 증폭을 위한 COL1A2-80-HindIII-F(ACGAAGCTTCAGTATGATGGAAAAGGA; 서열번호 7)와 COL1A2-603-NotI-R(TCGAGCGGCCGCAGTAGGACCGGCAGCACC; 서열번호 8), 단편 Middle(M; 344-863 aa)를 증폭하기 위한 COL1A2-344-HindIII-F(ACGAAGCTTCTTGTTGGTGAGCCT GGT; 서열번호 9)와 COL1A2-863-NotI-R(TCGAGCGGCCGCAGGACCTGGAGTGCCAGG; 서열번호 10), 단편 C-terminal(C; 604-1119 aa)을 증폭하기 위한 COL1A2-604-HindIII-F(ACGAAGCTTGGTCCTATTGGAAGCCGA; 서열번호 11)와 COL1A2-1119-NotI-R(TCGAGCGGCCGCAGCCCTGTAGAAGTCTCC; 서열번호 12), 단편 small middle N-terminal(SMN; 344-478 aa)을 증폭하기 위한 COL1A2-344-HindIII-F(ACGAAGCTTCTTGTTGGTGAGCCTGGT; 서열번호 13)와 COL1A2-478-NotI-R(TCGAGCGGCCGCGCCAGGGAGGCCGACAGG; 서열번호 14), 단편
small middle middle(SMM; 445-579 aa)을 증폭하기 위한 COL1A2-445-HindIII-F(ACGAAGCTTGGTCTCATGGGACCCAGA; 서열번호 15)와 COL1A2-579-NotI-R(TCGAGCGGCCGCAAACTCACCATGGAGACC; 서열번호 16), 단편 small middle C-terminal(SMC; 549-683 aa)을 증폭하기 위한 COL1A2-549-HindIII-F(ACGAAGCTTCCTGGTCCTCCAGGCTTC; 서열번호 17)와 COL1A2-683-NotI-R(TCGAGCGGCCGCGGCACCTACAGCACCAGG; 서열번호 18).
실시예 2 : hCOL1A2 chain 단백질 내 도메인의 콜라겐 생성 촉진 능력 비교
<2-1>
hCOL1A2 chain 단백질 내 도메인의 콜라겐 생성 촉진 능력 비교
실시예 1에서 특정한 다양한 hCOL1A2 chain 단백질 단편들이 세포 내 콜라겐 합성을 촉진하는 기능이 있는지 확인하기 위하여, 먼저 콜라겐을 생성하는 세포인 인간 피부섬유아세포를 hCOL1A2 chain 단백질의 N, M, C 단편을 발현하는 플라스미드로 형질전환시키고, 형질전환으로 단편의 단백질을 발현하는 세포의 배지상층액을 취하여 콜라겐 합성에 미치는 영향을 알아보았다.
구체적으로, 인간 피부섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)를 10%(volume/volume) Fetal Bovine Serum(FBS)과 1%(volume/volume)의 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 Dulbeccos's Minimum Essential Medium(DMEM)에 배양하여 계대수(passage) 5 이하를 유지하며, 상기 실시예 또는 비교예 처리에 따른 콜라겐 합성량의 변화를 생체 외(in vitro 상)에서 측정하여, 인간 피부섬유아세포에 대한 콜라겐 합성 촉진 효과를 평가하였다. 시료 별로 인간 피부섬유아세포를 웰 플레이트(well plate)에 1x104 cells(per 12 well)의 밀도로 seeding한 후, 세포 부착과 환경 적응을 위해 24시간 동안 인큐베이터(incubator)(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 다음날 각각 pSG5-HA(음성대조군), pSG5-HA-hCOL1A2(80-603 aa), pSG5-HA-hCOL1A2(344-863 aa), pSG5-HA-hCOL1A2(604-1119 aa)의 플라스미드 2ug을 TurboFect transfection Reagent (Thermo Scientific)를 이용하여 transfection을 진행하였다. 그리고 다음날 배지를 제거한 후, 혈청(serum)이 첨가되지 않은 배지를 처리하여 8시간 동안 starvation시켰다. 형질전환된 인간 피부섬유아세포를 48시간 동안 배양하고 배지의 상층액을 취하여 합성된 콜라겐을 정량하였다. 콜라겐 정량은 타입 1 프로콜라겐 C-펩타이드 EIA 키트(Type I Procollagen C-Peptide EIA kit, Takara, Japan)를 사용하였다.
형질전환된 섬유아세포의 콜라겐 단편 단백질 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯은 다음과 같이 실시하였다. Transfection된 콜라겐 플라스미드의 단편의 단백질 발현을 보고자 Western blot을 수행하였다. 각각 NC(음성대조군, pSG5-HA), pSG5-HA-hCOL1A2(SMN, 344-478 aa), pSG5-HA-hCOL1A2(SMM, 445-579 aa), pSG5-HA-hCOL1A2(SMC, 549-683 aa)을 96시간 동안 처리한 세포를 RIPA buffer(20mM Tris-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 10mM NaPO, 10% glycerol, 100μM NaVO, 100μM ammonium molybdate, 1% NP-40, 0.1% SDS)에 4℃ 상태로 풀어놓고 원심 분리하여 상층액을 단백질 추출액으로 준비하였다. 단백질 양은 bovine serum albumin을 표준으로 하여 Bradford assay(BioRad)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 6~15% Gradient SDS-PAGE gel을 만들어서 섬유아세포 30ug을 loading 후 PVDF membrane에 transfer를 진행하였다. 1XPBST+5% skin milk buffer로 1시간동안 blocking을 진행하였다. α-Tubulin (B-7)(sc-52861; Santa Cruz) 및 HA-HRP(F-7)(sc-7392; Santa Cruz) 1차 항체는 5% skim milk, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS에 희석시켜서 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 15분씩 3차례 세척하였다. Blocking solution으로 1：5,000배로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-IgG 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 3차례 세척하고 발색은 ECL hyperfilm으로 확인하였다.
그 결과, 도 2의 A의 웨스턴 블롯 결과에 나타난 바와 같이, hCOL1A2의 N, M, C 단편 단백질 모두 인간의 피부섬유아세포에서 잘 발현된 것을 확인하였다. 한편, 도 2의 B의 그래프에서 확인할 수 있듯이, 인간 피부섬유아세포를 이들 단편이 발현되는 세포의 배지상층액을 취하여 합성된 콜라겐을 정량한 결과, 이들 세포에서 hCOL1A2의 N, M, C 단편이 잘 발현되었을 뿐 아니라 정상적으로 세포 외부로 분비되었다. 음성대조군(NC)와 비교하여 모든 실험군에서 섬유아세포의 콜라겐 합성을 촉진하였으며, 특히 중간 부분에 해당하는 M 단편이 다른 부분보다 콜라겐 생성을 월등하게 촉진하는 것을 확인하였다.
<2-2>
hCOL1A2 chain의 M 도메인 단편의 콜라겐 생성 촉진 능력 비교
실시예 2-1에서 콜라겐 합성 촉진 효과가 뛰어난 것으로 확인된 hCOL1A2 chain의 M 단편에 대하여, 콜라겐 합성 촉진 기능을 하는 펩타이드 부위를 더욱 특정하기 위하여 상기 실시예에서와 같은 방법으로 M 단편을 SMN(hCOL1A 단백질의 344-478 aa), SMM (445-579 aa), SMC (549-683 aa) 등으로 더욱 세분화하여 분석하였다.
구체적으로, 시료 별로 인간 피부섬유아세포를 웰 플레이트(well plate)에 1x104 cells(per 12 well)의 밀도로 seeding한 후 세포 부착과 환경 적응을 위해 24시간 동안 인큐베이터(incubator)(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 다음날 각각 NC(음성대조군, pSG5-HA), pSG5-HA-hCOL1A2(SMC, 344-478 aa), pSG5-HA-hCOL1A2(SMM, 445-579 aa), pSG5-HA-hCOL1A2(SMC, 549-683 aa)의 플라스미드 2ug을 TurboFect transfection Reagent(Thermo Scientific)를 이용하여 transfection을 진행하였다. 그리고 다음날 배지를 제거한 후, 혈청(serum)이 첨가되지 않은 배지를 처리하여 8시간 동안 starvation시켰다. 추가적으로 인간 피부섬유아세포를 48시간 동안 배양하고 배지의 상층액을 취하여 합성된 콜라겐을 정량하였다. 콜라겐 정량은 타입 1 프로콜라겐 C-펩타이드 EIA 키트(Type I Procollagen C-Peptide EIA kit, Takara, Japan)를 사용하였다.
Transfection된 콜라겐 플라스미드의 단편의 단백질 발현을 보고자 Western blot을 수행하였다. 각각 NC(음성대조군, pSG5-HA), pSG5-HA-hCOL1A2(SMN, 344-478aa), pSG5-HA-hCOL1A2(SMM, 445-579 aa), pSG5-HA-hCOL1A2(SMC, 549-683aa)을 96시간 동안 처리한 세포를 RIPA buffer(20mM Tris-HCl, pH 8, 150mM NaCl, 10mM NaPO, 10% glycerol, 100μM NaVO, 100μM ammonium molybdate, 1% NP-40, 0.1% SDS)에 4℃ 상태로 풀어놓고 원심분리하여 상층액을 단백질 추출액으로 준비하였다. 단백질 양은 bovine serum albumin을 표준으로 하여 Bradford assay(BioRad)를 이용하여 595nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 6~15% Gradient SDS-PAGE gel을 만들어서 섬유아세포 30ug을 loading 후 PVDF membrane에 transfer를 진행하였다. 1xPBST+5% skin milk buffer로 1시간 동안 blocking을 진행하였다. α-Tubulin (B-7)(sc-52861; Santa Cruz) 및 HA-HRP(F-7)(sc-7392; Santa Cruz) 1차 항체는 5% skim milk, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS에 희석시켜서 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 15분씩 3차례 세척하였다. Blocking solution으로 1：5,000배로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-IgG 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.1% Tween-20을 함유 한 PBS로 3차례 세척하고 발색은 ECL hyperfilm으로 확인하였다.
그 결과, 도 3의 A의 웨스턴 블롯 결과에 나타난 바와 같이, hCOL1A2의 SMN, SMM, SMC 단편 단백질 모두 인간의 피부섬유아세포에서 잘 발현된 것을 확인하였다. 한편, 도 3의 B에서 확인할 수 있듯이, 인간 피부섬유아세포를 이들 단편이 발현되는 세포의 배지상층액을 취하여 합성된 콜라겐을 정량한 결과, 음성 대조군(NC)와 비교하여 모든 단편이 섬유아세포의 콜라겐 합성을 크게 증가시켰으며, 이 중에서도 특히 중간 부분에 해당하는 SMM 단편이 다른 부분보다 콜라겐 생성을 더욱 현저하게 촉진하는 것을 확인하였다.
실시예 3 : hCOL1A2 chain SMM 단편의 제조
앞선 실시예에서 콜라겐 합성 촉진 효과가 가장 뛰어난 것으로 확인된 hCOL1A2 chain 단백질의 SMM 단편의 활성을 더욱 분석하기 위하여, 먼저 재조합 SMM 단편 단백질을 대량 생산하고, 정제 분리하였다.
<3-1>
hCOL1A2 chain SMM 단편의 재조합 발현 벡터 제조
hCOL1A2 chain 단백질의 SMM 단편은 COL1A2의 445-579 aa에 해당하는 135 aa 길이의 펩타이드로, 약 19.9kDa 정도 크기이다. SMM 단편의 재조합 단백질을 대량 생산하기 위한 hCOL1A2(445-579 aa) 플라스미드를 제작하기 위하여, hCOL1A2의 유전자 445-579 아미노산 위치를 PCR을 이용하여 증폭하여 pET-28a(+) vector에 삽입하여 pET-28a(+)-hCOL1A2를 제조하였다(도 4의 A).
구체적으로, hCOL1A2 단편을 hCOL1A2의 cDNA를 주형으로 하여, 제한효소인 BamHI 절단 부위를 가지는 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 제한효소 NotI 절단부위를 가지는 서열번호 20의 역방향 프라이머를 사용하여 증폭하였다(서열번호 19 : 5’-CGCGGATCCGGTCTCATGGGACCCAGA-3‘; 서열번호 20 : 3’-CCTTTCTCCTGGCTCGAGTGCGGCCGCAAACTC-5’). PCR 반응은 hCOL1A2의 cDNA를 template로 하여, pfu 중합효소로 PCR을 수행하였다(PCR 사이클: 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 55초의 반응을 30회 반복; PCR 타겟: hCOL1A2; 445-579 aa). 증폭된 PCR 산물은 1.2% agaros gel에서 전기영동하여 정제 키트(geneall)를 이용하여 정제 분리하고, pET-28a(+) vector(Novagen)와 정제 분리한 PCR 산물을 제한효소 BamHI 과 NotI으로 절단 후, ligation하고 transformation하여 kanamycin LB agar 플레이트에 spreading 하였다. Single clone에서 DNA를 추출하고 sequencing하여, 목적한 plasmid DNA vector가 맞는지 확인하였다.
<3-2>
재조합 hCOL1A2 chain SMM 단편의 제조
실시예 3-1에서 제작한 pET-28a(+)-hCOL1A2를 대장균에서 대량으로 발현시키고 순수한 재조합 단백질로 분리하였다.
먼저 pET-28a(+)-hCOL1A2를 E.coli Clearcoli BL21(LPS free)에 형질전환시킨 후, 50μg/ml의 카나마이신을 포함하는 배지에서 37℃, OD값이 0.6이 될 때까지 배양한 후, IPTG를 최종 1mM이 되도록 첨가하여, hCOL1A2의 단백질을 유도한 후에, 37℃에서 6시간 동안 추가로 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여(12,000rpm, 10min, 4℃) 균체를 수득한 후에, 상기 균체를 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)에 현탁시킨 후에, 초음파분쇄기로 균체를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 균체 현탁액을 원심분리하여(12,000rpm, 40min, 4℃) 펠렛(pellet)을 버리고 상등액(supernatant)을 얻었다. 상기 얻은 상등액을 이용하여 His-binding 칼럼(GE healthcare), size-exclusion chromatography(sec)(GE healthcare) 방법을 mannual에 따라서 재조합 휴먼 콜라겐 타입 I (hCOL1A2) 단백질을 정제하였으며, BCA assay로 단백질을 정량하였다.
상기 재조합 단백질의 정제 단계별 샘플의 15% SDS-PAGE 결과는 도 4의 B에 도시한 바와 같다. 약 19kDa 크기의 재조합 hCOL1A2 SMM 단편 단백질이 대장균 E.coli Clearcoli BL21(LPS free) 균주 내에서 효과적으로 과발현되었으며(레인 2), 정제 단계를 거치면서 순수한 재조합 단백질로 수득한 것을 확인할 수 있다(레인 5).
<3-3>
재조합 hCOL1A2 chain SMM 단편의 수산화 정도 분석
실시예 3-2에서 정제분리한 재조합 COL1A2 chain SMM 단편 단백질의 서열 및 콜라겐의 형성에 중요한 프롤린 수산화 정도를 질량 분석 방법으로 분석하였다. 세포 외부에서 아교원섬유는 전아교질펩타이드가수분해효소(procollagen peptidase)라고 하는 특수한 단백질분해효소의 작용에 의해 등록 펩타이드가 제거되는데, 이 변형된 단백질을 트로포콜라겐(tropocollagen)이라고 하며, 이들은 모여서 아교원섬유 중합체(polymeric collagen fibril)를 형성한다. 특히 수산화프롤린은 폴리펩타이드 사슬사이에 수소결합을 형성하여 트로포콜라겐의 삼중나선구조를 안정화시키는 역할을 한다.
구체적인 방법은 다음과 같다. 재조합 콜라젠 단벡질 SDS-PAGE 를 수행하였다. SDS-PAGE에서 분석하고 하는 band를 오려낸다. 40% acetonitrile을 가한 후 60 ℃에서 800rpm으로 5분간 shaking 하여 gel을 씻어낸 후, 100% acetonitrile을 가한 후 60 ℃에서 800rpm으로 5분간 shaking하여 gel을 탈수하였다. 50mM Ammonium bicarbonate 수용액에녹인 25mM Dithiothreitol 용액을 100μl 가하고 56℃에서 800rpm으로 20분간 shaking하여 펩타이드의 이황화결합을 끊고, 100mM Ammonium bicarbonate 수용액에 녹인 25mM Iodoacetamide용액을 100μl 가하고 빛을 차단한 뒤 상온(25℃)에서 800rpm으로 30분간 shaking하여 펩타이드가 재결합하지 않도록 alkylation하였다. HPLC grade의 water 100μl를 가하여 상온(25℃)에서 800rpm으로 1분간 shaking하여 gel을 씻어낸 후, 40% acetonitrile을 100μl 가하여 상온(25℃)에서 800rpm으로 15분간 shaking하여 gel을 씻어내었다. 100% acetonitrile을 100μl 가하여 상온(25℃)에서 800rpm으로 5분간 shaking하여 gel을 탈수한 후, 100μl의 50mM acetic acid에 Trypsin GOLD 100μg을 녹였다. 10% acetonitrile에 녹인 40mM ammonium bicarbonate 용액과 녹인 용액을 49:1의 비율로 혼합한 trypsin 반응액 50μl을 가한 후 37℃에서 12-16시간 동안 반응시켜 펩타이드를 조각내었다. 0.1% formic acid로 희석한 50% acetonitrile을 100μl 가하고 상온(25℃)에서 800rpm으로 5분간 shaking하여 단백질을 추출한 후, Lowbinding Tube를 준비하여 용액을 옮겼다. 0.1% formic acid로 희석한 99.9% acetonitrile을 100μl 가하고 상온(25℃)에서 800rpm으로 20분간 shaking하여 단백질을 추출한 후, 용액을 Lowbinding Tube로 옮겼다. 단백질이 추출된 용액이 들어있는 Lowbinding Tube를 Concentrator Plus를 이용하여 60℃ 진공 상태에서 2-3시간 정도 완전히 말린 후, 용액이 마르고 단백질이 남은 Lowbinding Tube에 0.1% formic acid를 70μl씩 가하여 vortexing 하였다. sonication한 후, Lowbind Tube의 용액을 HPLC용 vial로 옮겨 질량분석하였다. 시료 vial을 nano EASY-nLC II의 autosampler에 loading한 후, HPLC column은 trap column과 analytical column을 Easy nano LC II 에 장착하고, 전기스프레이 이온화(Electrospray ionization, ESI)를 위해 stainless steel emitter(내경 30μm) 를 장착하여, 질량 분석 장비인 LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer의 Tune 파일을 활성화 하고 분석을 개시하였다. 분당 300nl의 유속을 유지하며, 시간에 따라 이동상의 유기용매 농도를 변화하여 gradient를 적용하였다. 분석 해상도는 100,000이며, 질량 범위는 300-2,000m/z이다. 텐덤 매스 (Tandom MS/MS 분석) 시행 시, 첫 번째 full mass(MS) 후 두 번째 매스(MS/MS)는 CID(colision energy induced dissociation; 충돌에 의한 분리) 기법을 사용하였다.
분석 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다. LC/MS/MS 질량 분석에서 hCOL1A2 Peptide 서열 15종이 검출되었고, 폴리펩타이드 사슬 사이에 수소 결합을 형성하여 트로포콜라겐의 삼중나선구조를 안정화시키는 역할을 하는 수산화 프롤린(hydroxy proline)이 검출되었다. 이러한 결과는 화장품이나 식품 등에 사용될 수 있는 원재료 뿐 만 아니라 콜라겐의 수산화의 정도는 콜라겐 삼중 나선 또는 트로포콜라겐의 헐거움 또는 단단함 및 재조합 콜라겐에 의해 제조된 제품, 예컨대 생체조직으로 제조된 가죽의 기능적 및 심미적 특성에 가진 것에 이용될 가능성이 충분함을 알 수 있다.
[표 1]
대장균에서 발현된 재조합 hCOL1A2 chain SMM 단편의 LS/MS/MS 분석 결과
실시예 4 : hCOL1A2 chain SMM 단편의 콜라겐 생성 촉진 활성
실시예 3에서 분리정제된 재조합 hCOL1A2 chain SMM 단편 단백질의 콜라겐 생성 촉진 활성을 펩타이드 농도에 따라 확인하였다.
상기 실시예에서와 같은 방법으로 인간 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblast; HDF)를 10%(volume/volume) Fetal Bovine Serum(FBS)과 1%(volume/volume)의 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 Dulbeccos's Minimum Essential Medium (DMEM)에 배양하여 계대수(Passage) 5 이하를 유지하며, 재조합 hCOL1A2 chain SMM 단편 단백질 농도 구배에 따른 콜라겐 합성량의 변화를 생체 외(in vitro 상)에서 실험하여, 인간 피부섬유아세포의 콜라겐 합성 촉진 효과를 평가하였다. 시료 별로 인간 피부섬유아세포를 웰 플레이트(well plate)에 1x104 cells(per 12 well)의 밀도로 seeding한 후 세포 부착과 환경 적응을 위해 24시간 동안 인큐베이터(incubator)(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 그리고 배지를 제거한 후, 혈청(serum)이 첨가되지 않은 배지를 처리하여 8시간 동안 starvation시켰다. 상기 대조군, 실시예 및 비교예 조성물을 배지에 용해하여 시료별로 처리하였다. 시료 처리 후, 인간 피부섬유아세포를 72시간 동안 배양하고 배지의 상층액을 취하여 합성된 콜라겐을 정량하였다. 콜라겐 정량은 타입 1 프로콜라겐 C-펩타이드 EIA 키트(Type I Procollagen C-Peptide EIA kit, Takara, Japan)를 사용하였다.
콜라겐 정량에 사용된 키트(kit)의 표준 곡선은 도 5의 A에 도시된 바와 같으며, SMM 처리한 피부섬유화세포의 콜라겐 발현 수준의 결과는 사기 표준 곡선에 따라 정량화하여 표 2 및 도 5의 B에 나타낸 바와 같다. 즉, hCOL1A2 chain SMM 단편 단백질은 농도의존적으로 섬유아세포에서의 콜라겐 합성을 촉진하는 효과를 보였는데, 실험한 가장 낮은 농도인 1ug/ml에서도 음성대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
[표 2]
SMM 단편으로 처리한 인간 피부섬유아세포에서의 콜라겐 합성 수준
실시예 5 : hCOL1A2 chain SMM 단편의 성장인자 활성 분석
실시예 3에서 분리정제한 재조합 hCOL1A2 chain SMM 단편 단백질의 성장인자로서의 활성을 펩타이드 농도에 따라 확인하였다.
인간 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblast; HDF)를 37℃, 5% CO2 환경에서 10% FBS를 함유하는 DMEM에 배양하였다. 상기 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 96 well plate에 5x103 cells/well 농도로 seeding하여, 하룻밤 배양 후에, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 혈청이 포함되지 않은 DMEM배지 교환 후, TGF-β(10ug/ml) 및 0 내지 100(ug/ml)/well 농도로 재조합 hCOL1A2 chain의 SMM 단편 단백질을 각각 처리하였다. 2일 동안 배양 후에, MTT assay로 세포성장을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, TGF-β(10ug/ml 를 처리한 샘플의 경우에는 음성대조군(NC)와 비교하여 비슷한 세포성장을 보였다. 반면, 재조합 hCOL1A2 chain 단백질의 SMM 단편을 처리한 경우에는 처리 농도에 따라 세포성장이 증가하였다. 따라서 재조합 hCOL1A2 chain 단백질의 SMM 단편은 단순히 세포 내 콜라겐 합성을 촉진하는 외에, 세포분열을 촉진하는 성장인자로서의 활성도 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 6 : hCOL1A2 chain SMM 단편의 세포이동 촉진 활성 분석
hCOL1A2의 제조합 단백질이 피부각질형성세포의 이동 능력에 어떠한 영향을 미치는가에 대하여 알아보고자 wound-healing assay를 실시하였다.
인간 피부각질형성세포(HaCaT, ATCC, USA)를 37℃, 5% CO2 환경에서 10% FBS를 함유하는 DMEM에 배양하였다. 단층으로 균일하게 자란 HaCaT 세포에 멸균 Tip으로 긁은 후, 실선 안의 세포를 모두 제거하였다(도 7의 A 참고). 그 후, 20시간 동안 배양하여 세포가 제거된 실선 안의 영역으로 세포가 이주되는 정도를 실험 군 별로 비교 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 세포는 Tip으로 긁은 직후의 세포와 비교해 약간의 이동만 관찰할 수 있었던 반면, 양성대조군인 TGF-β (10ug/ml) 및 hCOL1A2의 SMM 단편(100ug/ml)을 처리한 세포에서는 세포이동이 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 특히, hCOL1A2의 SMM 단편을 처리한 세포에서 양성대조군보다도 현저한 세포 이동 능력이 관찰되었다(도 7의 b). 이러한 결과는 hCOL1A2의 SMM 단편은 HaCaT 세포의 이동 능력을 증가시키는 활성도 있음을 보여주는 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시키는 활성이 뛰어나며, 이를 활용하여 콜라겐을 대량 생산하는 방법은 기존의 인간 콜라겐 타입 1형을 추출하는 방식과 비교하여 세균이나 바이러스 등의 오염이나 인체 내 면역반응을 회피할 수 있고, 보다 경제적이며 효율적으로 안전한 기능성 콜라겐을 대량 생산하는 것이 가능하다. 따라서 본 발명은 콜라겐을 함유하는 치료용, 식품용, 화장품 제품 등을 개발하는데 효과적으로 이용될 수 있다.
<110> Abiotech Co.,Ltd.
<120> Peptide with collagen synthesis-promoting activity and methods
using the same
<130> NP19-0097
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 135
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMM fragment 445-579aa 01
<400> 1
Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Asn Ile Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile Asp Gly Arg
20 25 30
Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly Lys Asn Gly
50 55 60
Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Pro
65 70 75 80
Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Gln
85 90 95
Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly
100 105 110
Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys Pro Gly Glu
115 120 125
Arg Gly Leu His Gly Glu Phe
130 135
<210> 2
<211> 135
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMM fragment 344-478aa 02
<400> 2
Leu Val Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn
1 5 10 15
Lys Gly Glu Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser
20 25 30
Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly
35 40 45
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu
50 55 60
Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg
65 70 75 80
Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly
85 90 95
Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser
100 105 110
Pro Gly Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro
115 120 125
Gly Ile Asp Gly Arg Pro Gly
130 135
<210> 3
<211> 135
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMM fragment 549-683aa 03
<400> 3
Pro Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala
1 5 10 15
Gly Glu Val Gly Lys Pro Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly
20 25 30
Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu
35 40 45
Ser Gly Ala Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser
50 55 60
Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly
65 70 75 80
Ala Val Gly Thr Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Gly Ile Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro
100 105 110
Gly Leu Arg Gly Glu Ile Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly
115 120 125
Ala Pro Gly Ala Val Gly Ala
130 135
<210> 4
<211> 520
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M fragment 344-863aa 04
<400> 4
Leu Val Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn
1 5 10 15
Lys Gly Glu Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser
20 25 30
Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly
35 40 45
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu
50 55 60
Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg
65 70 75 80
Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly
85 90 95
Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser
100 105 110
Pro Gly Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro
115 120 125
Gly Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly
130 135 140
Glu Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp
145 150 155 160
Pro Gly Lys Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg
165 170 175
Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Gln Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Pro
195 200 205
Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val
210 215 220
Gly Lys Pro Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly
225 230 235 240
Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala
245 250 255
Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro
260 265 270
Gly Pro Asp Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Val Gly
275 280 285
Thr Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala
290 295 300
Ala Gly Ile Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg
305 310 315 320
Gly Glu Ile Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly
325 330 335
Ala Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu
340 345 350
Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro
355 360 365
Gly Glu Arg Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly
370 375 380
Pro Ala Gly Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Ala
385 390 395 400
Lys Gly Pro Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr Gly Pro Val
405 410 415
Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
420 425 430
Ser Arg Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala
435 440 445
Ala Gly Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro
450 455 460
Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly
465 470 475 480
Asp Gln Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala Val Gly Pro
485 490 495
Pro Gly Phe Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala
500 505 510
Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Pro
515 520
<210> 5
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMM fragment 1804-2208nt 05
<400> 5
ggtctcatgg gacccagagg tcttcctggt tcccctggaa atatcggccc cgctggaaaa 60
gaaggtcctg tcggcctccc tggcatcgac ggcaggcctg gcccaattgg cccagctgga 120
gcaagaggag agcctggcaa cattggattc cctggaccca aaggccccac tggtgatcct 180
ggcaaaaacg gtgataaagg tcatgctggt cttgctggtg ctcggggtgc tccaggtcct 240
gatggaaaca atggtgctca gggacctcct ggaccacagg gtgttcaagg tggaaaaggt 300
gaacagggtc cccctggtcc tccaggcttc cagggtctgc ctggcccctc aggtcccgct 360
ggtgaagttg gcaaaccagg agaaaggggt ctccatggtg agttt 405
<210> 6
<211> 1560
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M fragment 1501-3060nt 06
<400> 6
cttgttggtg agcctggtcc agctggctcc aaaggagaga gcggtaacaa gggtgagccc 60
ggctctgctg ggccccaagg tcctcctggt cccagtggtg aagaaggaaa gagaggccct 120
aatggggaag ctggatctgc cggccctcca ggacctcctg ggctgagagg tagtcctggt 180
tctcgtggtc ttcctggagc tgatggcaga gctggcgtca tgggccctcc tggtagtcgt 240
ggtgcaagtg gccctgctgg agtccgagga cctaatggag atgctggtcg ccctggggag 300
cctggtctca tgggacccag aggtcttcct ggttcccctg gaaatatcgg ccccgctgga 360
aaagaaggtc ctgtcggcct ccctggcatc gacggcaggc ctggcccaat tggcccagct 420
ggagcaagag gagagcctgg caacattgga ttccctggac ccaaaggccc cactggtgat 480
cctggcaaaa acggtgataa aggtcatgct ggtcttgctg gtgctcgggg tgctccaggt 540
cctgatggaa acaatggtgc tcagggacct cctggaccac agggtgttca aggtggaaaa 600
ggtgaacagg gtccccctgg tcctccaggc ttccagggtc tgcctggccc ctcaggtccc 660
gctggtgaag ttggcaaacc aggagaaagg ggtctccatg gtgagtttgg tctccctggt 720
cctgctggtc caagagggga acgcggtccc ccaggtgaga gtggtgctgc cggtcctact 780
ggtcctattg gaagccgagg tccttctgga cccccagggc ctgatggaaa caagggtgaa 840
cctggtgtgg ttggtgctgt gggcactgct ggtccatctg gtcctagtgg actcccagga 900
gagaggggtg ctgctggcat acctggaggc aagggagaaa agggtgaacc tggtctcaga 960
ggtgaaattg gtaaccctgg cagagatggt gctcgtggtg ctcctggtgc tgtaggtgcc 1020
cctggtcctg ctggagccac aggtgaccgg ggcgaagctg gggctgctgg tcctgctggt 1080
cctgctggtc ctcggggaag ccctggtgaa cgtggtgagg tcggtcctgc tggccccaat 1140
ggatttgctg gtcctgctgg tgctgctggt caacctggtg ctaaaggaga aagaggagcc 1200
aaagggccta agggtgaaaa cggtgttgtt ggtcccacag gccccgttgg agctgctggc 1260
ccagctggtc caaatggtcc ccccggtcct gctggaagtc gtggtgatgg aggcccccct 1320
ggtatgactg gtttccctgg tgctgctgga cggactggtc ccccaggacc ctctggtatt 1380
tctggccctc ctggtccccc tggtcctgct gggaaagaag ggcttcgtgg tcctcgtggt 1440
gaccaaggtc cagttggccg aactggagaa gtaggtgcag ttggtccccc tggcttcgct 1500
ggtgagaagg gtccctctgg agaggctggt actgctggac ctcctggcac tccaggtcct 1560
1560
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-80-HindIII-F 07
<400> 7
acgaagcttc agtatgatgg aaaagga 27
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rimer COL1A2-603-NotI-R 08
<400> 8
tcgagcggcc gcagtaggac cggcagcacc 30
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-344-HindIII-F 09
<400> 9
acgaagcttc ttgttggtga gcctggt 27
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-863-NotI-R 10
<400> 10
tcgagcggcc gcaggacctg gagtgccagg 30
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-604-HindIII-F 11
<400> 11
acgaagcttg gtcctattgg aagccga 27
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-1119-NotI-R 12
<400> 12
tcgagcggcc gcagccctgt agaagtctcc 30
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-344-HindIII-F 13
<400> 13
acgaagcttc ttgttggtga gcctggt 27
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-478-NotI-R 14
<400> 14
tcgagcggcc gcgccaggga ggccgacagg 30
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-445-HindIII-F 15
<400> 15
acgaagcttg gtctcatggg acccaga 27
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-579-NotI-R 16
<400> 16
tcgagcggcc gcaaactcac catggagacc 30
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-549-HindIII-F 17
<400> 17
acgaagcttc ctggtcctcc aggcttc 27
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer COL1A2-683-NotI-R 18
<400> 18
tcgagcggcc gcggcaccta cagcaccagg 30
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for pET-28a(+) vector 19
<400> 19
cgcggatccg gtctcatggg acccaga 27
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for pET-28a(+) vector 20
<400> 20
cctttctcct ggctcgagtg cggccgcaaa ctc 33
Claims (17)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
- 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
- 제3항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포 성장 또는 세포 이동을 촉진하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
- 제1항의 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물.
- 제1항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제8항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- (1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 숙주세포를 배양하는 단계;
(3) 상기 배양된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 제1항의 펩타이드를 제조하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 숙주세포는 섬유아세포 또는 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 대장균은 LPS의 생성이 억제된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 펩타이드는 숙주세포 파쇄물 또는 용해물을 원심분리한 상등액으로 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 pET-28a(+)인 것을 특징으로 하는 방법.
- (1) 제1항의 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계;
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 콜라겐 합성능을 갖는 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 도입은 콜라겐 합성능을 갖는 세포를 상기 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190133000A KR102135976B1 (ko) | 2019-10-24 | 2019-10-24 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190133000A KR102135976B1 (ko) | 2019-10-24 | 2019-10-24 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102135976B1 true KR102135976B1 (ko) | 2020-07-20 |
Family
ID=71831762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190133000A KR102135976B1 (ko) | 2019-10-24 | 2019-10-24 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102135976B1 (ko) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102581377B1 (ko) * | 2022-10-25 | 2023-09-22 | 주식회사 에이바이오테크 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 4 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
| KR102581376B1 (ko) * | 2022-10-25 | 2023-09-22 | 주식회사 에이바이오테크 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 3 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
| CN117143223A (zh) * | 2022-08-23 | 2023-12-01 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 |
| CN117402235A (zh) * | 2023-10-25 | 2024-01-16 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 生物合成人体结构性材料iv型胶原蛋白的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5593859A (en) * | 1991-10-23 | 1997-01-14 | Thomas Jefferson University | Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant DNA systems |
| JP3302017B2 (ja) * | 1991-10-23 | 2002-07-15 | トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ | 組み換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成 |
| KR20170072236A (ko) * | 2014-10-02 | 2017-06-26 | 나트레온 인코퍼레이티드 | 실라짓의 사용에 의한 근육 형성과 복구의 증진, 및 콜라겐 및 관련 단백질과 관련된 장애의 치료 |
-
2019
- 2019-10-24 KR KR1020190133000A patent/KR102135976B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5593859A (en) * | 1991-10-23 | 1997-01-14 | Thomas Jefferson University | Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant DNA systems |
| JP3302017B2 (ja) * | 1991-10-23 | 2002-07-15 | トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ | 組み換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成 |
| KR20170072236A (ko) * | 2014-10-02 | 2017-06-26 | 나트레온 인코퍼레이티드 | 실라짓의 사용에 의한 근육 형성과 복구의 증진, 및 콜라겐 및 관련 단백질과 관련된 장애의 치료 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GeneBank AAB69977.1 (2000. 2. 4.)* * |
| NCBI NM000089.4 (2019. 9. 16.) * |
| NCBI NM000089.4 (2019. 9. 16.)* |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117143223A (zh) * | 2022-08-23 | 2023-12-01 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 |
| CN117143223B (zh) * | 2022-08-23 | 2024-03-08 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 |
| KR102581377B1 (ko) * | 2022-10-25 | 2023-09-22 | 주식회사 에이바이오테크 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 4 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
| KR102581376B1 (ko) * | 2022-10-25 | 2023-09-22 | 주식회사 에이바이오테크 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 3 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
| CN117402235A (zh) * | 2023-10-25 | 2024-01-16 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 生物合成人体结构性材料iv型胶原蛋白的制备方法 |
| CN117402235B (zh) * | 2023-10-25 | 2024-06-11 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 生物合成人体结构性材料iv型胶原蛋白的制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102135976B1 (ko) | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 | |
| CN110845603B (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| KR101004745B1 (ko) | 홍합 접착제 | |
| CN113621052A (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 | |
| Haught et al. | Recombinant production and purification of novel antisense antimicrobial peptide in Escherichia coli | |
| AU2014234962B2 (en) | Purification of triple helical proteins | |
| CN109575126B (zh) | 多肽、其生产方法和用途 | |
| JP4423542B2 (ja) | 抗菌性ポリペプチド及びその利用 | |
| KR101094445B1 (ko) | 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 섬유아세포 성장인자의 재조합 단백질 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법 | |
| JPH04505259A (ja) | 副甲状腺ホルモンの製造のための組換えｄｎａ法 | |
| CN108165593A (zh) | 胶原蛋白7及相关方法 | |
| CN101698682B (zh) | 一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| Koganesawa et al. | Expression and purification of a small cytokine growth-blocking peptide from armyworm Pseudaletia separata by an optimized fermentation method using the methylotrophic yeast Pichia pastoris | |
| KR102106773B1 (ko) | 목적 단백질의 수용성 및 발현량 증가를 위한 융합 태그 및 이의 용도 | |
| Qi et al. | Production of human type II collagen using an efficient baculovirus-silkworm multigene expression system | |
| KR20230017804A (ko) | Rhfgf21 융합 단백질, rhfgf21 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, rhfgf21 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 rhfgf21 융합 단백질의 용도 | |
| KR20230110455A (ko) | 홍합 접착 단백질 유래의 재조합 폴리펩티드 및 그의용도 | |
| JP5093783B2 (ja) | Ｈｇｆ前駆体蛋白質改変体及びその活性型蛋白質 | |
| KR102581376B1 (ko) | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 3 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법 | |
| KR20230133672A (ko) | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 | |
| CN113980880B (zh) | 基因工程菌及其应用和以葡萄糖为原料生产阿洛酮糖的方法 | |
| JP4960454B2 (ja) | 細胞膜透過伝達ペプチド及びこれを含む生物製剤 | |
| CN113603792A (zh) | 一种重组骨形态发生蛋白-2及其制备方法和应用 | |
| CN109562144A (zh) | 胰高血糖素类似物及其使用方法 | |
| KR102581377B1 (ko) | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 4 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |