KR20230110455A - 홍합 접착 단백질 유래의 재조합 폴리펩티드 및 그의용도 - Google Patents

홍합 접착 단백질 유래의 재조합 폴리펩티드 및 그의용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍합 접착 단백질 유래의 EGF-유사 폴리펩티드에 기능성 펩티드가 융합된 재조합 폴리펩티드, 상기 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환한 형질전환체, 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 일상용품 뿐만 아니라 화장품, 더 나아가서는 의약품 및 의약소재로 활용할 수 있고, 기존에 생체적합 접착소재로만 활용되었던 홍합 접착 단백질을 세포재생, 상처치유, 피부개선, 염증, 아토피, 및 감염문제 해결 등의 분야에도 유용하게 사용할 수 있다.

Description

홍합 접착 단백질 유래의 재조합 폴리펩티드 및 그의 용도{Recombinant Polypeptide from Mussel Adhesive Protein and Use Thereof}
본 발명은 홍합 접착 단백질 유래의 재조합 폴리펩티드 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍합 접착 단백질에서 유래된 EGF(Epidermal Growth Factor)-유사 도메인(EGF-like domain) 반복 부위 단편을 포함하는 생체적합 폴리펩티드, 이를 포함하는 기능성 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 세포 및 조직재생 특성과 항균 및 항바이러스, 항염증, 항아토피 특성이 복합적으로 필요한 곳에 유용하게 사용될 수 있다.
최근 조직 재생 연구가 활발해지면서 세포의 유지, 성장 및 분화에 필수적인 단백질로 알려진 성장 인자에 대한 조직 재생 효과가 많이 연구되고 있다. 그 중 상피세포 성장 인자라고 불리는 EGF는 노벨 생리학·의학상을 수상한 미국 생물학자 스탠리코헨(Stanley Cohen) 박사가 1962년 흰쥐 턱밑샘 추출액 속 증식을 촉진하는 물질에서 발견한 펩티드성 세포증식 인자이다.
EGF는 세포의 분열을 유도하여 표피세포의 성장 및 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 증식을 촉진시키는 성분일 뿐만 아니라, 세포 호르몬의 일종으로서 다양한 세포의 증식과 분화를 유도하여 피부세포의 주요 구성 물질들의 생성을 촉진한다. 또한 EGF는 상피세포와 섬유아세포에 있는 EGF 수용체와 결합하여 혈소판, 대식세포, 단핵세포 등의 활성화에 관여하여 상처가 치료되도록 유도하며, 이로써 상피세포의 증식, 분화와 신생혈관형성, 및 많은 세포주에서 DNA, RNA, 단백질 합성과 같은 다양한 생물학적 현상들을 일으켜 상처회복 과정을 향상시킨다. 이는 이전의 다양한 결과들을 토대로 확인되었다. 이와 같이 EGF는 세포 성장을 위한 용도 뿐만 아니라 상처 및 당뇨성 족부궤양 치료제로서도 많이 사용되고 있다(비특허문헌 1).
한편, 홍합이나 따개비가 분비하는 접착제는 단백질로 구성되어 있는 생체 접착제로서, 내수성을 띄고 있으며, 고유의 생분해성 특성으로 인해 미생물이나 효소 작용에 의해 생분해되는 환경친화형 접착제이다. 그 중 홍합의 족사에서 분비되는 홍합 접착 단백질은 생명체 유래의 바이오 기반 소재로서 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등의 의료분야에 응용 가능성이 큰 바이오 소재로 주목을 받아왔다(특허문헌 1, 특허문헌 2). 실제로 홍합 접착 단백질을 생체적합 소재로 활용하기 위하여 생체 특성을 확인한 바 있다. 홍합 접착 단백질의 접촉 및 투여가 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 동물실험을 통해 장기에 미치는 독성과 면역반응에 대한 연구를 수행하였으며, 그 결과 장기마다 독성에 의한 별다른 특이 소견이 발견되지 않았고, 조직의 괴사나 급성염증 반응 등이 확인되지 않았다(비특허문헌 2).
홍합 접착 단백질에 대한 연구는 다양한 홍합 단백질들의 개발 및 유전자 재조합 기술을 이용한 대량 생산으로 나뉘어 진행되고 있으며, 주로 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 및 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 유래의 홍합 접착 단백질에 대해서 알려져 있다. 홍합 접착 단백질의 메커니즘을 밝히기 위하여 족사 단백질의 종류 및 그 아미노산 서열이 오랫동안 연구되어왔으며, 약 12종류 이상의 단백질로 구성되어 있음이 밝혀졌다.
다양한 홍합 접착 단백질 중에서 MGFP-2(Mytilus galloprovincilalis foot protein-2)라고 명명된 단백질은 특이적으로 EGF-유사 도메인 구간을 많이 갖고 있다. EGF-유사 도메인은 주로 동물 기원의 다양한 단백질에서 나타나며, 반복적으로 자주 관찰된다. EGF-유사 도메인은 전형적으로 이황화 결합을 형성하는 6개의 시스테인 잔기를 함유하고 있고, 시스테인 사이의 하위 도메인 길이는 광범위하게 나타난다. 일부 EGF-유사 도메인은 칼슘에 결합하는 능력을 가지며, 칼슘과 결합시 보다 단단하고, 단백질 분해효소 저항성 구조를 형성한다. 또한 일부 EGF-유사 도메인은 EGF 수용체에 결합할 수 있다.
EGF-유사 도메인을 함유하는 단백질은 혈액 응고, 보체 활성화와 같은 다양한 생물학적 과정에서 기능하는 것으로 나타났으며, 이들 중 다수는 생물학적 기능을 위해 칼슘을 필요로 한다. 또한, 여러 성장인자 뿐만 아니라 세포의 매트릭스 형성, 세포 부착 등 상처 치유에 관여하는 다수의 세포외 단백질에서 발견된다(특허문헌 3, 비특허문헌 3, 비특허문헌 4).
그러나, 홍합 접착 단백질은 주로 화학합성 접착제와 비교하여 강력한 자연 접착제로만 알려져 있어, 주로 접착 단백질을 유효성분으로 함유하는 코팅제 개발로만 적용되어 왔으며, EGF-유사 도메인 부위를 활용한 세포재생에 도움을 주는 생체적합성 접착소재로는 인식되지 않고 있다.
한편, 항균 펩티드는 자연 면역 체계의 일원으로서, 생체적합성이 뛰어난 가장 안전한 항균물질이며, 직접적인 살균작용 뿐만 아니라 숙주의 방어기능을 조절한다고 알려져 있다. 기존 항생물질과 다른 작용 기전으로 작용하여, 항생제 내성을 지닌 세균은 물론 진균에까지 이르는 광범위하고도 강력한 사멸 활성을 나타낼 수 있으며, 병원성 미생물을 제어하는 작용시간 또한 매우 빠르다고 알려져 있다(특허문헌 4).
이에, 본 발명자들은 홍합 접착 단백질 유래의 EGF-유사 도메인 부위와 다양한 종류의 항균 펩티드가 융합된 재조합 폴리펩티드를 개발하였고, 상기 재조합 폴리펩티드를 이용하여 보다 효과적으로 세포재생 효과와 항균 효과를 나타낼 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허공보 제10-1578522호 대한민국 등록특허공보 제10-1631704호 대한민국 등록특허공보 제10-1196799호 대한민국 등록특허공보 제10-1652263호
S. Yang, et al., The international journal of lower extremity wounds 15, 120-125, 2016 J. Dove, et al., Journal of American Dental Association 112, 879, 1986 T. J. Deming, et al., Curremt Opinion in Chemical Biology 3, 100-105, 1999 M Selander-Sunnerhagen, et al., J Biol Chem. 25, 19642-9, 1992
본 발명은 상술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 홍합 접착 단백질 유래의 EGF-유사 폴리펩티드에 기능성 펩티드가 융합된 재조합 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 재조합 폴리펩티드를 포함하는 세포의 재생 또는 항염용 약학적 조성물 또는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 홍합 접착 단백질 유래의 EGF-유사 폴리펩티드에 기능성 펩티드가 융합된 재조합 폴리펩티드를 제공한다.
한 구현예에서, 상기 홍합은 미틸러스 에둘리스, 미틸러스 갈로프로빈시얼리스, 또는 미틸러스 코루스커스일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 기능성 펩티드는 세포외 기질(Extracellular Matrix) 단백질, 성장 인자, 또는 항균 펩티드일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 상기 세포외 기질 단백질은 콜라겐(Collagen), 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin), 또는 비트로넥틴(Vitronectin)일 수 있고, 상기 성장 인자는 표피 성장 인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 또는 혈관 내피세포 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 항균 펩티드는 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 12), AKRHHGYKRKFH(서열번호 13), ILRWPWWPWRRK(서열번호 14), LKKLAKLALAF(서열번호 15), KLLLKLLKKLLKLLKKK(서열번호 16), THRPPMWSPVWP(서열번호 17), GWLKKIGKWKIFKK(서열번호 18), ILPWKWPWWPWRR(서열번호 19), RRWWCRC(서열번호 20), 또는 KLAKLAKKLAKLAK(서열번호 21)의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 기능성 펩티드는 상기 홍합 접착 단백질의 C-말단, N-말단, 또는 양쪽 말단 모두에 융합될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 FP-1, FP-2, FP-3, FP-4, FP-5, FP-6, 및 그의 단편일 있고, 바람직하게는 FP-2 또는 FP-2의 단편일 수 있고, 보다 바람직하게는 MGFP-2 또는 MGFP-2의 단편일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 상기 FP-2의 단편은 서열번호 2 내지 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환한 형질전환체를 제공한다.
한 구현예에서, 상기 유전자는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있고, 바람직하게는 대장균 세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
(a) 상기 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환한 형질전환체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;를 포함하는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 폴리펩티드의 제조 방법은 (d) 상기 재조합 폴리펩티드를 분리 및 정제하는 단계;를 추가로 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 폴리펩티드를 포함하는 세포의 재생 또는 항염용 약학적 조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 홍합 접착 단백질 유래의 EGF-유사 폴리펩티드에 기능성 펩티드가 융합된 재조합 폴리펩티드는 인체에 안전하고, 뛰어난 세포재생 능력을 가지며, 다양한 제품에 적용하기 용이한 가공성을 갖고, 특정 조건 하에서 생분해되며, 코팅이나 접착시 추가적인 용매를 사용하지 않는 우수한 친환경성을 제공하므로, 일상용품 뿐만 아니라 화장품, 더 나아가서는 의약품 및 의약소재로 활용할 수 있고, 기존에 생체적합 접착소재로만 활용되었던 홍합 접착 단백질을 세포재생, 상처치유, 피부개선, 염증, 아토피, 및 감염문제 해결 등의 분야에도 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 기술된 특징들과 또 다른 특징 및 장점들은 예시적인 목적으로 제공되는 하기 구현 예들과 도면들을 함께 고려할 때 분명할 것이다.
도 1은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현을 위한 벡터 구성도를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 3가지 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 염기서열 분석 결과를 나타내는 것으로서, 각각 실시예 1의 1번째, 4번째, 및 5번째 모델을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 생산 공정도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 분리 및 정제 공정을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 보여주는 사진으로서, 폴리펩티드 발현 전후 및 최종 분리 정제 후의 폴리펩티드를 보여준다.
도 5은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 분리 및 정제한 후 동결건조한 사진을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 세포재생 특성을 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 항균 특성을 보여주는 사진이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 홍합 접착 단백질 유래의 EGF-유사 폴리펩티드에 기능성 펩티드가 융합된 재조합 폴리펩티드를 제공한다.
한 구현예에서, 상기 홍합은 미틸러스 에둘리스, 미틸러스 갈로프로빈시얼리스, 및 미틸러스 코루스커스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 미틸러스 갈로프로빈시얼리스일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 기능성 펩티드는 세포외 기질, 성장 인자, 및 항균 펩티드로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있고, 바람직하게는 항균 펩티드로부터 유래될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 세포외 기질 단백질은 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 및 비트로넥틴으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 성장 인자는 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 및 혈관 내피세포 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질 유래의 EGF-유사 폴리펩티드와 기능성 펩티드는 직접 결합되거나, 링커(Linker)를 통해 결합될 수 있다. 상기 링커는 펩티드성 링커 또는 비-펩티드성일 수 있다.
상기 링커가 펩티드성 링커일 때, 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 예컨대 1개부터 10개, 바람직하게는 2 내지 6개, 예컨대 2개의 아미노산을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 상기 링커는 KL의 디펩티드일 수 있다.
상기 링커가 비-펩티드성 링커일 때, 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체가 사용될 수 있다. 상기 반복 단위는 펩티드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 상기 비-펩티드성 링커는 지방산, 다당류, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드에 사용되는 항균 펩티드는 자연에서 유래하거나 인공적으로 합성되는 임의의 펩티드를 제한없이 사용할 수 있다. 상기 항균 펩티드는 미생물의 세포막을 파괴하거나 세포막을 투과하여 대사 기능을 저해하는 기작을 통해 항균 효과를 발휘할 수 있고, 미생물의 세포막을 파괴하는 기작을 통해 항균 효과를 발휘하는 임의의 항균 펩티드가 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 접착 단백질에 융합될 항균 펩티드는 그램 양성균은 물론 그램 음성균에 효과가 있는 항균 펩티드 중에서 임의로 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 항균 펩티드는 KLWKKWAKKWLKLWKA(서열번호 12), AKRHHGYKRKFH(서열번호 13), ILRWPWWPWRRK(서열번호 14), LKKLAKLALAF(서열번호 15), KLLLKLLKKLLKLLKKK(서열번호 16), THRPPMWSPVWP(서열번호 17), GWLKKIGKWKIFKK(서열번호 18), ILPWKWPWWPWRR(서열번호 19), RRWWCRC(서열번호 20), 및 KLAKLAKKLAKLAK(서열번호 21)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 구현예에서, 상기 항균 펩티드는 FALALKALKKL(서열번호 22), KWKLFKKIGAVLKVL(서열번호 23), LVKLVAGIKKFLKWK(서열번호 24), IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(서열번호 25), GTNNWWQSPSIQN(서열번호 26)에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 구현예에서, 상기 항균 펩티드는 아프리카 개구리 제노퍼스 래비스(Xenopus laevis)의 피부로부터 분리된 α-나선형 23개 아미노산 펩티드인 마가이닌(Magainin)이나 더마셉틴(Dermaseptin), 인간 디펜신(human defensin), 카세리시딘(cathelicidin) LL-37, 히스타틴(Histatin) 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 상기 기능성 펩티드는 상기 홍합 접착 단백질의 C-말단, N-말단, 또는 양쪽 말단 모두에 융합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래된 접착 단백질로서, 재조합 홍합 접착 단백질 또는 홍합 접착 단백질의 변이체(Mutnat)인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 국제공개번호 제WO2006/107183A1호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 임의의 홍합 접착 단백질을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 홍합 접착 단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단(C-말단)이나 아미노 말단(N-말단)에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 생리기능성 펩티드, 예를 들어 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%, 보다 바람직하게는 50 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.
한 구현예에서, 상기 홍합 접착 단백질은 FP-1, FP-2, FP-3, FP-4, FP-5, FP-6, 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 FP-2 또는 FP-2의 단편일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 FP-2의 단편은 서열번호 2 내지 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 중에서 티로신 잔기는 화학적 수정을 통하여 DOPA, 그리고 더 나아가 DOPA 퀴논으로 바뀔 수 있고, 이렇게 수정된 DOPA 및 DOPA 퀴논은 표면에 대한 접착에 있어서 매우 중요한 역할을 할 수 있다. 한 구현예에서, 이러한 화학적 수정을 매개할 수 있는, 예컨대, 버섯 유래의 티로시나아제(Tyrosinase) 효소를 이용하여 재조합 폴리펩티드의 화학적 수정을 수행할 수 있다. 화학적 수정을 거친 재조합 폴리펩티드는 금속, 플라스틱, 유리 등의 다양한 소재에 부착될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환한 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서의 상기 홍합 접착 단백질은 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주 세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본 발명에 포함된다.
한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있고, 바람직하게는 대장균 세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 "유전자"는 폴리펩티드, 전구체, 또는 RNA(예컨대, rRNA, tRNA)를 생산하는데 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산(예컨대, DNA) 서열을 제한없이 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA와 게놈 형태 모두를 포함한다. 게놈 형태 또는 유전자의 클론은 "인트론" 또는 "삽입 영역" 또는 "삽입 서열"로 불리는 비-코딩 서열에 의해 방해되는 코딩 영역을 포함한다. 폴리펩티드는 완전한 길이의 코딩 서열에 의해 코딩되거나, 완전한 길이 또는 단편의 목적하는 활성 또는 기능적 특성(예컨대 효소적 활성, 리간드 결합, 시그널 도입, 면역원성 등)이 유지되는 한, 코딩 서열의 일부분에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 용어는 구조 유전자의 코딩 영역 및 상기 유전자가 완전-길이의 mRNA의 길이에 상응하도록 말단에서 약 1 kb 이상의 거리로 5' 및 3' 말단의 코딩 영역에 인접하게 위치된 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 유전자는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 효율적인 발현을 위해 발현 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, "발현 벡터"란 적당한 숙주 세포에서 목적 펩티드를 발현할 수 있는 재조합 벡터를 나타내는 것으로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현 벡터는 적합한 발현 벡터가 일반적으로 갖고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현조절 요소들을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터는 세포 배양액으로부터 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩티드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시 코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
본 발명의 벡터는 통상의 모든 발현 벡터를 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pUC18, pIDTSAMRT-AMP 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pET-22b(+), pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 리트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주 세포를 선택하여 사용하면 된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터로는 pET22b(+) 벡터가 사용될 수 있다. 상기 pET22b(+) 벡터는 단백질 발현용 벡터이며, pET22b(+) 벡터의 Nde I/Hind III 제한효소 자리에 재조합 MGFP-2 돌연변이체가 삽입되어 있고, pET22b(+) 벡터의 Hind III/Xho I 제한효소 자리에 항균 펩티드가 삽입되어 있다. 상기 pET22b(+) 벡터는 T7 프로모터를 포함하고 있어 IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside)를 이용하여 발현을 유도할 수 있으며, 친화 크로마토그래피를 이용한 단백질 분리 정제를 위한 친화성 리간드(예컨대, hexahisitidine) 유전자 서열이 Xho I 제한효소 자리 뒤에 존재한다.
본 발명의 형질전환체는 본 발명의 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입함으로써 얻을 수 있다. 숙주의 종류로는 에셰리키아(Esherichia) 속(Genus), 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 랄스토니아(Ralstonia) 속, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속, 코마모나스(Comamonas) 속, 버크홀데리아(Burkholderia) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 플라보박테리움(Flabobacterium) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 리조비움(Rhizobium) 속, 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 모라셀라(Moraxella) 속, 니트로조모나스(Nitrosomonas) 속, 아에로모나스(Aeromonas) 속, 파라코커스(Paracoccus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아르트로박터(Arthrobacter) 속, 아크로모박터(Achromobacter) 속, 미크로코커스(Micrococcus) 속, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 노카르디아(Nocardia) 속, 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 칸디다(Candida) 속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우, 본 발명의 재조합 벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율 복제가능 한 동시에, 프로모터, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 갖는 것이 바람직하다. 세균으로의 재조합 DNA의 도입 방법으로서는, 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등이 이용가능하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a) 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환한 형질전환체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;를 포함하는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 (d) 상기 재조합 폴리펩티드를 분리 및 정제하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다. 또 배양 방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 임의의 방법을 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체의 배지로는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB 배지, M9 배지 등을 들 수 있다. 또, 배양 온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 균체 내에 축적시키고, 회수할 수 있다.
탄소원은 미생물의 증식에 필요하며, 예를 들면 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 말토오스, 갈락토오스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올류; 글리세롤 등의 다가 알코올류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.
질소원으로는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모 추출물, 맥아 추출물, 카제인 분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물 유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로는, 예를 들면 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.
또 프로모터가 유도성의 발현 벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우에는 프로모터의 종류에 적합한 유도 물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 취득 및 정제는 얻게 되는 배양물 중으로부터 균체 또는 상등액을 원심 회수하고, 균체파쇄, 추출, 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한 구현예에서, 본 발명의 형질전환체는 통상의 LB 배지에서 배양할 수 있고, 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도하기 위하여 IPTG를 첨가할 수 있다. 바람직한 재조합 폴리펩티드의 발현 방법은 본 발명의 형질전환체를 LB(5 g/리터 효모 추출물, 10 g/리터 트립톤, 10 g/리터 NaCl) 배지에 배양하고, 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.6 내지 0.8 일 때 IPTG를 0.5 mM 내지 4 mM 첨가하여 3시간 배양할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 방법으로 발현시킨 재조합 폴리펩티드는 봉입체(Inclusion Body) 형태로 생산되며, 상기 봉입체를 가용화시켜 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 분리 및 정제할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 세포의 재생 또는 항염용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 약학적 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 또는 0.01 내지 5 중량%, 또는 0.01 내지 3 중량%, 또는 0.1 내지 2 중량%, 또는 0.5 내지 1.5 중량% 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 재조합 폴리펩티드 외에 본 발명이 목적으로 하는 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 상기 재조합 폴리펩티드의 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 또는 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함되고, 예컨대 도포에 의한 국부투여(topical application) 방식으로 적용될 수 있다. 상기 비경구는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 병소내 주사 또는 주입기술을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 세포의 재생 또는 항염 작용을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 인간뿐만 아니라 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 인간이 아닌 동물, 조류 및 어류 등 어느 것에 사용가능하다.
상기 약학적 조성물은 본 발명의 재조합 폴리펩티드에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 투여시간, 투여 경로, 배출률, 약물 배합 및 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 성인 기준으로 1 내지 20,000 ㎎/㎏, 예컨대 1 내지 10,000 ㎎/㎏, 1 내지 1,000 ㎎/㎏, 또는 1 내지 200 ㎎/㎏ 범위 내의 투여량으로 투여될 수 있고, 상기 약학적 조성물이 외용제인 경우에는 성인기준으로 (1.0 내지 3.0 ㎖)의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 좋으나, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 상기 약학적 조성물 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 세포의 재생 또는 항염용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는, 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로션제 등의 형태를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 방부제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 기능성을 추가 또는 증진하고자, 주름 개선 화장료, 미백용 화장료, 자외선 차단제, 광산란제 등을 추가로 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 본 기술분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 세포의 재생 또는 항염용 화장료 조성물은 통상적인 사용 방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명은 예시의 목적으로만 제공되는 하기 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 기능적으로 동일한 제품, 조성물 및 방법은 본 발명의 범위에 포함되는 것이 자명하다.
실시예 1. 재조합 MGFP-2 유전자의 클로닝
단백질 서열을 패밀리로 분류하고 기능적으로 중요한 도메인 및 부위의 존재를 예측하는 프로그램인 InterPro 데이터베이스(http://www.ebi.ac.uk/interpro/) 와 UniProt으로 MGFP-2 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과 서열번호 1로 기재되는 총 473개의 아미노산 중 신호 펩티드(1-17), DOPA(18-44), EGF-유사 도메인(45-81, 82-117, 118-154, 155-191, 192-228, 229-265, 266-301, 302-340, 342-378, 383-420, 425-461), 라미닌(34-82, 84-120, 121-157, 158-194, 195-231, 232-267, 268-304, 305-344, 345-380, 381-423, 424-462)으로 구성되어 있다. 이를 바탕으로 MGFP-2 재조합 폴리펩티드 모델을 하기 5가지 아미노산 서열로 구성하였고, 상기 5가지 모델 중에서 1, 4, 5번의 3가지를 선택하여 재조합 MGFP-2 유전자를 클로닝하였다(도 2 참조).
1. 아미노산 1-117 (서열번호 2)
MLFSFFLLLT CTQLCLGTNR PDYNDDEEDD YKPPVYKPSP SKYRPVNPCL
KKPCKYNGVC KPRGGSYKCF CKGGYYGYNC NLKNACKPNQ CKNKSRCVPV
GKTFKCVCRN GNFGRLC
2. 18-117 (서열번호 3)
TNR PDYNDDEEDD YKPPVYKPSP SKYRPVNPCL
KKPCKYNGVC KPRGGSYKCF CKGGYYGYNC NLKNACKPNQ CKNKSRCVPV
GKTFKCVCRN GNFGRLC
3. 18-154 (서열번호 4)
TNR PDYNDDEEDD YKPPVYKPSP SKYRPVNPCL
KKPCKYNGVC KPRGGSYKCF CKGGYYGYNC NLKNACKPNQ CKNKSRCVPV
GKTFKCVCRN GNFGRLCEKN VCSPNPCKNN GKCSPLGKTG YKCTCSGGYT
GPRC
4. 18-191 (서열번호 5)
TNR PDYNDDEEDD YKPPVYKPSP SKYRPVNPCL
KKPCKYNGVC KPRGGSYKCF CKGGYYGYNC NLKNACKPNQ CKNKSRCVPV
GKTFKCVCRN GNFGRLCEKN VCSPNPCKNN GKCSPLGKTG YKCTCSGGYT
GPRCEVHACK PNPCKNKGRC FPDGKTGYKC RCVDGYSGPT C
5. 18-44, 45-117, 18-44 (서열번호 6)
TNR PDYNDDEEDD YKPPVYKPSP SKYRPVNPCL
KKPCKYNGVC KPRGGSYKCF CKGGYYGYNC NLKNACKPNQ CKNKSRCVPV
GKTFKCVCRN GNFGRLCTNR PDYNDDEEDD YKPPVYKPSP SKYR
실시예 2. 재조합 MGFP-2 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 클로닝
주형(template) DNA를 합성(코스모진텍, 한국)한 후, 전방 프라이머(forward primer)(aggagatata catatg ACCAATCGGCCCGATTAC, 서열번호 7) 및 후방 프라이머(reverse primer)(ggtggtggtgctcgag ATGGAACTTTCTCTTGTATCCATG, 서열번호 8)를 이용해 PCR을 진행하여 상기 3종의 재조합 mgfp-2 유전자 중 4번째 모델의 유전자를 증폭한 후, 이를 최종 pET22b(+) 벡터(Cat. No. 69744-3, Novagen) 내로 삽입하였다. 삽입된 벡터는 pET22b(+) 벡터에 MGFP-2/히스타틴의 유전자가 삽입된 형태이다. 상기 pET22b(+) 벡터는 단백질 발현용 벡터로서, pET22b(+) 벡터의 Nde I/Hind III 제한효소 자리에 상기 합성된 재조합 mgfp-2 유전자가 삽입되어 있고, pET22b(+) 벡터의 Hind III/Xho I 제한효소 자리에 히스타틴의 유전자가 삽입되어 있다(도 1). 상기 pET22b(+) 벡터는 T7 프로모터를 포함하고 있고, 이에 따라 IPTG를 이용하여 발현을 유도할 수 있다. 상기 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 이를 암호화하는 유전자는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 3. MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 생산하는 형질전환체의 제조 및 배양
클로닝용 대장균(E. coli) DH5α 세포 및 단백질 발현용으로 사용된 대장균 BL21(DE3)을 CaCl2 버퍼를 사용하여 컴피턴트(Competent) 세포를 만든 후, 열충격(42℃에서 1분간 방치) 방법에 의해 상기 제조된 pET22b(+) Mgfp2/히스타틴 벡터를 형질전환하였다. 앰피실린(ampcillin, Gold bio)을 사용하여 형질전환된 콜로니의 선별을 수행하여 대장균 Dh5α pET22b(+) MGFP-2/히스타틴 및 대장균 BL21(DE3) mgfp2/히스타틴 형질전환체를 수득하였다.
실시예 4: MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 생산
(1) 대장균 BL21/pET22b(+)로부터 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 발현
대장균 BL21/pET22b(+)는 LB(5 g/리터 효모 추출물, 10 g/리터 트립톤, 10 g/리터 NaCl) 배지에 배양하였고, 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.7 정도가 되었을 때 IPTG를 첨가하여 재조합 MGFP-2 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 항균 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도하였다. 이때 50 ㎖ 멸균된 튜브에 10 ㎖의 LB 배지를 넣고(500 ㎍의 앰피실린 첨가) 12시간 키운 배양액을 100 ㎖의 LB 배지가 들어있는 500 ㎖ 플라스크에 넣어 접종하였다.
(2) MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 발현 양상 측정
MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 발현을 분석하기 위하여, IPTG 첨가 후 시간에 따른 배양액을 수집한 후, 이에 대해 SDS-PAGE을 실시하였다.
이를 위하여, 매시간 마다 배양액으로부터 얻은 1 ㎖의 시료를 4℃, 10,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 제거한 전세포 시료를 -80℃에서 보관 후 분석 시 사용하였다. 전세포 시료는 SDS-PAGE용 완충액(0.5 M TrisHCl, pH 6.8, 10% 글리세롤, 5% SDS, 5% β-머캅토에탄올, 0.25% 브로모페놀 블루) 100 ㎕에 희석하고, 100℃에서 5분간 끓여 변성시켰다. SDS-PAGE의 경우 시료를 12% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후, 쿠마시블루(Coomasie blue) 염색을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
도 4은 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도한 후 시간에 따른 발현 양상을 나타낸 전기영동사진이다. MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드는 대장균의 다른 단백질들에 비하여 약 23 kDa 크기의 진한 밴드로 발현되었다. MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드는 발현 유도 후 발현이 증가되었고, 약 3 시간 되었을 때 최대를 나타내었으며, 그 후 단백질 분해효소에 의해 분해되어 약 6시간 경과 후에는 줄어드는 것으로 확인되었다.
(3) MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 발현 형태 분석
MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 발현 형태를 확인하기 위하여, 전세포 시료의 세포를 파쇄(초음파 방법의 이용) 후 세포 파쇄물과 상등액으로 나누어 각각 SDS-PAGE를 수행하였다.
대장균 BL21/pET22b 배양액으로부터 분리한 세포 상등액 및 세포 파쇄물을 SDS-PAGE로 확인한 결과, MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 3가지 모델 중 4번 모델 1가지만 발현되었고 나머지는 발현이 되지 않았다. 발현된 4번 모델의 경우 세포 파쇄물에서 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 밴드가 진하게 검출된 반면, 세포 상등액의 경우에는 매우 미미한 양만이 검출됨으로써, MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드는 대장균에서 불용성 형태의 봉입체로 발현됨을 알 수 있었다.
실시예 5. MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 분리 및 정제
대장균 BL21/pET22b에서 불용성 형태로 발현되는 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 분리 및 정제하기 위하여 봉입체를 녹였다.
이를 위하여, 실시예 3과 동일한 방법으로 대장균 BL21/pET22b를 배양한 후, MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도하였고, 배양한 대장균 세포를 원심분리 후, 파쇄용 버퍼(50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH8.0)에 넣어 약 50배 정도 농축하였으며, 이 후 1 ㎎/㎖ 라이소자임(lysozyme, Bio Basic Inc., 캐나다)을 첨가하고, 4℃에서 20분간 반응시켰다.
이후 초음파 파쇄기(sonicator)를 이용하여 얼음 위에서 200 W로 2초간 파쇄하고, 2초 냉각하는 공정을 30회 반복하여 세포 파쇄를 완료하였다. 봉입체의 수율을 높이기 위하여, MGFP-2 폴리펩티드의 pI 값이 9.4이기 때문에, 이에 해당하는 NaOH를 넣어 상등액에 존재하는 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 5분간 불용화시켰다. 이 후, 시료를 14,000 rpm에서 약 2∼30분간 원심분리하여 세포 상등액을 제거하였고, 봉입체만을 분리하여 분리 및 정제를 위한 시료로 이용하였다.
봉입체를 분리 및 정제하기 위하여, 봉입체 무게의 2∼4배의 부피가 되도록 추출 용액을 제조하였다. 25% 아세트산, 15% n-프로필 알코올을 넣고, 나머지는 60% 증류수로 채웠다. 약 30분간 교반하여 봉입체를 용해시킨 후, 14,000rpm에서 약 2∼30분간 원심분리하여 용해되지 않은 봉입체를 제거하였고, 세포 상등액을 아세톤침전법을 위한 시료로 이용하였다.
아세톤 침전법은 단백질 이외의 불순물을 제거하는 방법으로서, 먼저 상등액의 2∼3배 부피의 아세톤을 첨가한 후, 약 30분간 교반하여 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 응집시켰다. 이후, 14,000rpm에서 약 2∼30분간 원심분리하여 상등액을 제거하였고, 펠렛(Pellet)을 증류수에 녹인 후, pH를 약산 상태로 맞춰 MGFP-2 돌연변이체를 녹여내었고, 녹지 않은 단백질을 제거함으로써 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 수득하였다.
실시예 6. MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석
MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 아미노산 분석기(Hewlette Packard, 미국)로 분석하였다. 이를 위하여, MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 염산(HCl)과 고온으로 처리하여 각 아미노산들로 분해한 시료를 얻었다. 기준 아미노산 혼합물의 스펙트럼으로부터 각 아미노산들의 잔여시간(retension time)과 정량화 기준을 얻은 후, MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 말단으로부터 순차적으로 분리된 아미노산의 스펙트럼을 통하여 아미노산 서열을 분석하였다. 분석 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
아미노산의 예측 조성 및 실험 조성(±30%)
아미노산 예측 조성(개) 실험 조성(%) 아미노산 예측 조성(개) 실험 조성(%)
Ala (A) 3 1.6% Lys (K) 29 15.4%
Arg (R) 11 5.9% Met (M) 0 0.0%
Asn (N) 17 9.0% Phe (F) 5 2.7%
Asp (D) 7 3.7% Pro (P) 19 10.1%
Cys (C) 24 12.8% Ser (S) 8 4.3%
Gln (Q) 1 0.5% Thr (T) 7 3.7%
Glu (E) 4 2.1% Trp (W) 0 0.0%
Gly (G) 21 11.2% Tyr (Y) 14 7.4%
His (H) 4 2.1% Val (V) 9 4.8%
Ile (I) 0 0.0% Pyl (O) 0 0.0%
Leu (L) 5 2.7% Sec (U) 0 0.0%
일반적으로 아미노산 조성 분석의 경우 단백질 분해 과정에서의 아미노산의 손실 등이 나타나기 때문에 약 30% 정도의 오차가 생기는 것으로 알려져 있으므로, 분석을 통하여 나타난 상기 아미노산 잔기들의 조성 및 비율은 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드 유전자의 염기서열로부터 코드화되어 계산된 아미노산 잔기들의 조성 및 비율과 거의 일치하는 결과를 보였다. 이로부터 대장균 BL21/pET22b로부터 발현 및 분리된 단백질은 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드임을 확인할 수 있었다.
실시예 7. MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 세포재생 능력 측정
본 발명의 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 세포재생 능력을 측정하기 위하여, 각질세포(keratonocyte)에 대한 세포 재생력 평가를 진행하였다.
이를 위하여, 실험에 사용된 세포는 인간의 각질 형성 세포주인 HaCaT 세포주(ATCC)를 사용하였으며, HaCaT 세포주의 생육 배지로는 10% 우태혈청(fetal bovine serum(FBS), Gibco)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco)를 사용하였고, 모든 세포주는 5% CO2 배양기에서 37℃ 유지하며 배양하였다. MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 HaCaT 세포 재생력을 평가하기 위하여, 세포 배양용 6-웰 플레이트 한쪽에 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 10∼0.002 ㎎/㎖ 농도로 코팅하였고, MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드가 코팅된 부분을 샘플, 코팅하지 않은 부분을 대조군으로 정의하였다. 위 세포 배양용 6-웰 플레이트의 샘플과 대조군 부분에 HaCaT 세포를 각 웰당 2×104 세포의 분량으로 분주한 후, 72시간을 배양하여 세포 재생력을 비교하였다. 이 때 HaCaT 세포주의 세포 생존률은 트리판 블루 배제법(Trypan blue exclusion assay)을 사용하여 측정하였다.
그 결과, 배양 72시간 후에 대조군 대비 본 발명의 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드가 코팅된 샘플에서 약 150% 세포 재생력이 증가함을 확인하였다.
실시예 8. MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드의 항균력 측정
먼저 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드를 농도별로 준비하였다. 항균력 시험을 위한 농도는 10∼0.002 ㎎/㎖로 PBS(phosphate buffered saline) 버퍼 용액을 사용하여 준비하였다. 항균력 시험 균주로는 대표 그람 음성균인 대장균(E. coli)과 대표 그람 양성균(S. aureus)을 사용하였으며, 각 시험균을 LB 배지에서 37℃, 150 rpm에서 흡광도 1.0까지 진탕배양하였다. 흡광도 1.0에서 시험균 배양액을 104 CFU/㎖이 되도록 PBS로 희석한 후, 미리 준비된 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드와 9:1의 비율로 멸균된 튜브에서 혼합한 후, 항온 항습기에서 37℃ 온도에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 후, 각 튜브로부터 시험균액을 100 ㎕씩 분취하여 한천 배지에 도말한 후, 24시간 동안 동일한 조건에서 배양하였다.
그 결과, 본 발명의 MGFP-2 유래 폴리펩티드와 항균 펩티드가 결합된 재조합 폴리펩티드는 대조군과 비교하여 대표 그람 음성균인 대장균(E. coli)과 대표 그람 양성균(S. aureus) 모두에서 99.9%의 항균 효과를 갖는 것으로 나타났다(도 7).
<110> Biovit Co., Ltd. <120> Recombinant Polypeptide from Mussel Adhesive Protein and Use Thereof <130> 2023-DPA-5379D <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 473 <212> PRT <213> Mytilus galloprovincialis <400> 1 Met Leu Phe Ser Phe Phe Leu Leu Leu Thr Cys Thr Gln Leu Cys Leu 1 5 10 15 Gly Thr Asn Arg Pro Asp Tyr Asn Asp Asp Glu Glu Asp Asp Tyr Lys 20 25 30 Pro Pro Val Tyr Lys Pro Ser Pro Ser Lys Tyr Arg Pro Val Asn Pro 35 40 45 Cys Leu Lys Lys Pro Cys Lys Tyr Asn Gly Val Cys Lys Pro Arg Gly 50 55 60 Gly Ser Tyr Lys Cys Phe Cys Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Cys 65 70 75 80 Asn Leu Lys Asn Ala Cys Lys Pro Asn Gln Cys Lys Asn Lys Ser Arg 85 90 95 Cys Val Pro Val Gly Lys Thr Phe Lys Cys Val Cys Arg Asn Gly Asn 100 105 110 Phe Gly Arg Leu Cys Glu Lys Asn Val Cys Ser Pro Asn Pro Cys Lys 115 120 125 Asn Asn Gly Lys Cys Ser Pro Leu Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Thr 130 135 140 Cys Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Val His Ala Cys Lys 145 150 155 160 Pro Asn Pro Cys Lys Asn Lys Gly Arg Cys Phe Pro Asp Gly Lys Thr 165 170 175 Gly Tyr Lys Cys Arg Cys Val Asp Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gln 180 185 190 Glu Asn Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Ser 195 200 205 Ala Asp Lys Phe Gly Asp Tyr Ser Cys Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Phe 210 215 220 Gly Pro Glu Cys Glu Arg Tyr Val Cys Ala Pro Asn Pro Cys Lys Asn 225 230 235 240 Gly Gly Ile Cys Ser Ser Asp Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Cys Arg Cys 245 250 255 Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Lys Val Asn Val Cys Lys Pro 260 265 270 Thr Pro Cys Lys Asn Ser Gly Arg Cys Val Asn Lys Gly Ser Ser Tyr 275 280 285 Asn Cys Ile Cys Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gly Glu Asn 290 295 300 Val Cys Lys Pro Asn Pro Cys Gln Asn Arg Gly Arg Cys Tyr Pro Asp 305 310 315 320 Asn Ser Asp Asp Gly Phe Lys Cys Arg Cys Val Gly Gly Tyr Lys Gly 325 330 335 Pro Thr Cys Glu Asp Lys Pro Asn Pro Cys Asn Thr Lys Pro Cys Lys 340 345 350 Asn Gly Gly Lys Cys Asn Tyr Asn Gly Lys Ile Tyr Thr Cys Lys Cys 355 360 365 Ala Tyr Gly Trp Arg Gly Arg His Cys Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Pro 370 375 380 Asn Pro Cys Val Val Ser Lys Pro Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Ile 385 390 395 400 Trp Asn Gly Lys Ala Tyr Arg Cys Lys Cys Ala Tyr Gly Tyr Gly Gly 405 410 415 Arg His Cys Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Lys Asn Pro Cys Ala Ser Arg 420 425 430 Pro Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Thr Asp Lys Gly Asn Gly Tyr Val 435 440 445 Cys Lys Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Gly Arg Tyr Cys Ser Leu Lys Ser 450 455 460 Pro Pro Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Tyr 465 470 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant MGFP-2 (1) <400> 2 Met Leu Phe Ser Phe Phe Leu Leu Leu Thr Cys Thr Gln Leu Cys Leu 1 5 10 15 Gly Thr Asn Arg Pro Asp Tyr Asn Asp Asp Glu Glu Asp Asp Tyr Lys 20 25 30 Pro Pro Val Tyr Lys Pro Ser Pro Ser Lys Tyr Arg Pro Val Asn Pro 35 40 45 Cys Leu Lys Lys Pro Cys Lys Tyr Asn Gly Val Cys Lys Pro Arg Gly 50 55 60 Gly Ser Tyr Lys Cys Phe Cys Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Cys 65 70 75 80 Asn Leu Lys Asn Ala Cys Lys Pro Asn Gln Cys Lys Asn Lys Ser Arg 85 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(8) <400> 19 Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antimicrobial polypeptide (9) <400> 20 Arg Arg Trp Trp Cys Arg Cys 1 5 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antimicrobial polypeptide (10) <400> 21 Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antimicrobial polypeptide (11) <400> 22 Phe Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antimicrobial polypeptide (12) <400> 23 Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antimicrobial polypeptide (13) <400> 24 Leu Val Lys Leu Val Ala Gly Ile Lys Lys Phe Leu Lys Trp Lys 1 5 10 15 <210> 25 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antimicrobial polypeptide (14) <400> 25 Ile Trp 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Claims (1)

  1. 홍합 접착 단백질 유래의 EGF-유사 폴리펩티드에 기능성 펩티드가 융합된 재조합 폴리펩티드.
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