KR101196799B1 - 스태빌린-2의 ｅｇｆ-유사 도메인의 반복부위 단편을포함하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 포스파티딜세린검출용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
스태빌린-2의 ｅｇｆ-유사 도메인의 반복부위 단편을포함하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 포스파티딜세린검출용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101196799B1 KR101196799B1 KR1020080016943A KR20080016943A KR101196799B1 KR 101196799 B1 KR101196799 B1 KR 101196799B1 KR 1020080016943 A KR1020080016943 A KR 1020080016943A KR 20080016943 A KR20080016943 A KR 20080016943A KR 101196799 B1 KR101196799 B1 KR 101196799B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cys
- gly
- thr
- asn
- ser
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6812—Assays for specific amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
본 발명은 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복부위 단편을 포함하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 포스파티딜세린 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드가 포스파티딜세린과 특이적으로 결합한다는 점을 이용하여 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 포스파티딜세린 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein, EGFrp)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드는 세포 표면의 포스파티딜세린과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린의 검출, 더 나아가 포스파티딜세린을 세포 표면으로 발현하는 사멸세포 및 종양세포의 검출 또는 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.
스태빌린-2, EGFrp, 포스파티딜세린, 사멸세포, 종양성질환
Description
본 발명은 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복부위 단편을 포함하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 포스파티딜세린 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드가 포스파티딜세린과 특이적으로 결합한다는 점을 이용하여 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 포스파티딜세린 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)은 대식세포가 사멸세포를 인식하여 제거하는 중요한 표지자이다(Schlegel, R.A. et al., Cell Death and Differentiation, 2001, 8:551-563; Lauber, K. et al., Mol Cell 2004, 14: 277- 287 Henson, P.M. et al., Curr Biol 2001, 11: R795-805 Grimsley, C. et al.,Trends Cell Biol. 2003, 13: 648-656). 정상적으로 포스파티딜세린은 세포막의 내부에 존재하나 세포가 사멸신호를 받거나 적혈구가 노화되면 세포막의 외부로 노출되며(Fadeel, B. et al., Cell Mol Life Sci, 2003, 60:2575-2585), 이것을 대식세포가 세포표면의 수용체를 통해서 인식하여 탐식작용을 일으킨다(Fadok, V.A. et al., J immunol 1992, 148:2207-2216; Fadok, V. A. et al., Nature 2000, 405:85-90; Park, S.Y.et. al., Cell Death and Differentiation, in press).
사멸세포 이외에도 포스파티딜세린은 또한 여러 가지 병적인 상황에서도 세포막의 외부로 노출된다(Zwaal, R.F.A. et al., Cell. Mol. Life Sci 2005, 62:971-988). 그 예로 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalassemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia) 등이 있다. 특히, 많은 종양세포들이 세포막의 외부로 포스파티딜세린의 발현 증가를 나타나며(Utsugi, T. et al., Cancer Res. 1991, 15:3062-3066; Rao, L. et al., Thromb Res. 1992, 67:517-531; Sigimura, M. et al., Fibrinolysis. 1994, 5:365-373; Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Woehlecke, H. et al., Biochem J. 2003, 376:489-495), 이것은 미분화성 발암성 세포(undifferentiated tumorigenic cell)에서 더욱 저명하게 나타난다. 종양조직은 또한 포스파티딜세린을 세포막의 외부로 노출하는 소혈관을 방출한다(Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Zwaal, R.F.A. et al., Blood. 1997, 89:1121-1132).
더욱이, 포스파티딜세린은 여러 가지 세포 내 생리학적 과정 중에서 비사멸세포에서도 또한 관찰된다. 그러한 예로는 혈소판의 활성화 과정, 근육세포의 융합과정, 합포체성 영양세포(syncytiotrophoblast)의 형성, 비만세포(mast cells)의 이뮤노글로불린 의존성 자극, 및 T 세포의 이동 등이 있다 (Fadeel, B. et al., Cell Death Differ 2006, 13:360-2 Ran, S. et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002, 54:1479-84 Schlegel, R. A. et al., Cell Death Differ 2001, 8:551-63.). 그 중에 특히 혈소판의 활성화 과정에서 발현되는 포스파티딜세린을 차단함은 동맥경화에 의해 형성될 수 있는 혈전형성(thrombosis)과정을 억제함으로써 그 치료효과를 나타낼 수도 있다(Cederholm, A. and Frosteg, J., Ann N Y Acad Sci. 2007, 1108:96-103 Cederholm, A. and Frosteg, J., Drug News Perspect. 2007 20(5):321-6). 따라서, 이러한 포스파티딜리세린의 역할들로 인해 특히 종양성 및 염증성 질환을 비롯한 여러 상황에서 포스파티딜세린은 진단, 치료, 및 치료추적을 위한 표적 물질로 제시되고 있다.
또한, 포스파티딜세린의 인식의 억제는 조사된 림프종(irradiated lymphoma) 에서 세포의 면역성(immunogenicity)을 증가시킨다고 보고되었다(Bondanza, A. et al., J Exp Med 2004, 200:1157-65). 따라서, 포스파티딜세린에 효과적으로 결합할 수 있는 단백질은 사멸세포의 포스파티딜세린의 인식과 면역억제성 제거를 방해함으로써 아폽토틱 세포-기반 백신(apoptotic cell-based vaccines)의 효과를 증대시키는데도 사용될 수 있을 것이다.
이에 본 발명자들은 포스파티딜세린을 표적화할 수 있는 새로운 단백질 또는 그 단편을 탐색하고자 연구한 결과, 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGFrp)가 사멸세포의 표면에 발현되는 포스파티딜세린에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 포스파티딜세린에 특이적으로 결합하는 스태빌린-2의 EGFrp 단편 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)의 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 시료와 혼합한 후, 미결합 또는 비특이적인 결합된 폴리펩티드를 제거한 다음 상기 폴리펩티드와 시료와의 결합 여부 및 위치를 확인하는 포스파티딜세린의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포(apoptotic cell) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드가 세포 표면에 노출되는 포스파티딜세린과 특이적으로 결합한다는 점에 착안하여 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 조합되어 연결된 새로운 서열의 폴리펩티드와 이의 용도로서 상기 폴리펩티드를 포함하는 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 검출용 조성물 등을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 스태빌린-2(stabilin-2, Genbank Accession No. MN_017564)는 랫트(rat)의 정맥동 내피세포(sinusoidal endothelial cells)에서 하이알루로난(hyaluronan) 수용체로서 기능을 통해 최초로 보고되었으며(McCourt, P.A. et al., Hepatology. 1999, 30:1276-1286; Politz, O. et al., Biochem J. 2002, 362:155-164; Zhou, B. et al., J Biol Chem. 2000, 275:37733-37741), 그 후 변형 LDL(modified LDL)과 글리케이션 엔드 프로덕트(glycation end products)의 탐식에 관여하며, Gram(-)와 Gram(+)박테리아에 대한 결합능을 가진다고 보고되었 다(Adachi, H. et al., J Biol Chem. 2002, 277:34264-34270; Tamura, Y. et al., J Biol Chem. 2003, 278:12613-126). 더욱이 최근에 본 발명자들은 스태빌린-2가 사멸세포 및 노화된 적혈구의 탐식에 중요한 수용체임을 규명하였다(Park, S.Y. et al., Cell Death Differ. 2008, 15:192-201). 스태빌린-2의 세포외 부분은 7개의 FAS1 도메인과 4개의 EGF-유사 도메인의 반복부위(23개의 EGF-유사 도메인) 및 1개의 Link 도메인으로 구성되어 있으며, 그 중, EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)는 5개 혹은 6개의 EGF-유사 도메인으로 구성되어 있다. EGF-유사 도메인은 그 기능이 정확하게 알려져 있지는 않지만 많은 세포막 수용체 단백질의 세포외 부분에서 반복부위로 존재하며 리간드-수용체 간의 상호작용에 관여한다고 알려져 있으며(Campbell, I.D. and Bork, P. Curr Opin Struc Biol. 1993, 3:385-39), 그 길이와 구조에 따라 (1) 표준 EGF-유사도메인, (2) 칼슘 결합 EGF-유사 도메인, (3) 라미닌-타입 EGF-유사 도메인, 및 (4) 비정형 EGF-유사 도메인으로 분류될 수 있다.
본 발명에서의 폴리펩티드는 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGF-like domain repeat protein, EGFrp) 중 두번째 비정형 EGF-유사 도메인 및3개 이상의 EGF-유사 도메인을 순차적으로 연결된 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 펩티드 단편은 모든 종류의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 펩티드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함하며, 종양 세포 등의 세포의 표면에서 발현되는 포스파티딜세린에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 갖는 것을 말한다. 본 발명의 폴리펩티드 가 유래되는 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위는 포유동물로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간, 랫트(rat) 및 마우스(mouse)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGF-like domain repeat protein, EGFrp) 중 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인은 공지된 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위의 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인이라면 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 84, 서열번호 90, 서열번호 96 또는 서열번호 102로 이루어진 아미노산 서열을 가질 수 있다.
아울러, 본 발명의 폴리펩티드에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인을 제외한 3개 이상의 EGF-유사 도메인을 이루는 EGF-유사 도메인은 공지된 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위의 EGF-유사 도메인이라면 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 표준 EGF-유사 도메인(standard EGF-like domain) 또는 비정형 EGF-유사 도메인(atypical EGF-like domain)일 수 있다. 표준 EGF-유사 도메인은 바람직하게는 서열번호 85 내지 서열번호 88, 서열번호 91 내지 서열번호 94, 서열번호 97 내지 서열번호 100 및 서열번호 103 내지 서열번호 105로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 비정형 EGF-유사 도메인은 바람직하게는 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 101 및 서열번호 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 포함되는 상기 EGF-유사 도메인은 3개 이상, 바람직하게는 3개 내지 10개, 더 바람직하게는 3개 내지 5개의 EGF-유사 도메인을 포함할 수 있으며, 각각의 EGF-유사 도메인은 동일한 서열이 반복되어 조합, 예를 들어 서열번호 96의 아미노산 서열만으로도 이루어 질 수 있다. 아울러, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인이 본 발명의 폴리펩티드의 N말단, C말단 또는 가운데 어느 부위에도 위치하도록 조합될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 75 내지 서열번호 82 및 서열번호 106 내지 서열번호 116으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드일 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 33 내지 서열번호 40 및 서열번호 64 내지 서열번호 73으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 가질 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 가지는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)를 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스( Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 상기 EGFrp의 기능을 확인하고자 다양한 실험을 수행한 결과, 상기 EGFrp가 노화된 세포 및 사멸 세포의 표면에서 발현되는 포스파티딜세린을 특이적으로 인식함으로써 상기 세포의 부착 및 탐식을 매개한다는 사실을 스태빌린-2 유전자로 형질전환된 섬유아세포(L/Stab-2세포)를 이용하여 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 대식세포에 의한 노화된 세포 및 사멸 세포의 탐식도 역시 in vitro와 in vivo에서 EGFrp 단백질에 의해 저해됨을 확인하였다. 또한, 스태빌린-2 매개 탐식작용과 EGFrp에 의한 포스파티딜세린의 인식에 칼슘이 필요함을 확인하였다. 나아가, 본 발명자들은 EGFrp의 C-말단 및 N-말단 결손 단백질을 제작하여 EGFrp가 포스파티딜세린을 인식하기 위해서는 4개 이상의 EGF-유사 도메인이 필요로 하며, EGFrp내에 두 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 칼슘 의존성 포스파티딜세린의 인식에 중요함을 확인하였다. 이로부터 본 발명자들은 상기 EGFrp가 포스파티딜세린의 신규한 결합단백질임을 규명하였다. 따라서, 스태빌린-2의 EGFrp를 포스파티딜세린의 검출용 조성물로 이용할 수 있음을 알 수 있었으며, 더 나아가 종양조직 내에 포스파티딜세린을 인식하는 진단 또는 치료추적용 제제, 또는 별도의 종양 치료용 제제와 더불어 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 스태빌린-2 단백질의 세포외 부분을 4개의 소단위로 나눈 후 이에 해당하는 재조합 단백질을 제조한 다음(실시예 1 참조), 이를 탐식능을 가지는 스태빌린-2가 과발현되는 마우스 섬유아세포인 L 세포(L/Stab-2 세포)에 전처치한 후 상기 세포의 노화된 세포의 탐식에 이들 단백 질의 효과를 조사하였다(실시예 2 참조). 그 결과, L/Stab-2에 의한 노화된 적혈구의 탐식이 4개의 소단위에 해당하는 재조합단백질에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 2 및 도 3 참조). 따라서, 세포 탐식에 관여하는 모티프가 네 개의 소단위에 모두 존재한다는 것을 확인하였다. 나아가, 본 발명은 세포 탐식에 관여하는 도메인을 더 자세히 동정하기 위해 세번째 소단위를 구성하는 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp, E3)와 FAS1 도메인(F5)에 대한 재조합 단백질을 제조하여(실시예 1 참조) 실험한 결과 EGF-유사 도메인의 반복 부위에 해당하는 단백질의 전 처치에 의해도 노화된 적혈구 및 사멸세포의 탐식이 억제됨을 확인할 수 있었다(도 4 및 도 5 참조). 또한 다른 소단위에 존재하는 4개의 EGF-유사 도메인의 반복부위들도 역시 노화된 적혈구의 탐식을 억제하였다(도 6 참조). 따라서 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein, EGFrp)가 포스파티딜세린의 인식을 담당하는 부분임을 알 수 있었다.
나아가, 본 발명자들은 EGFrp 단백질과 포스파티딜세린이 직접적으로 결합하는지를 조사한 결과(실시예 2-2 참조), EGFrp 단백질은 포스파티딜세린과 직접적으로 결합을 하며, 포스파티딜세린이외의 포스포지질, 즉 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜에탄올아민과는 결합하지 않음을 알 수 있었다(도 7 및 도 8 참조). 따라서, EGFrp 단백질이 특이적으로 포스파티딜세린과 직접적 결합을 하는 신규한 단백질임을 규명할 수 있었다.
한편, 노화된 세포 및 자연사멸세포의 탐식을 위한 포스파티딜세린의 인식은 주로 대식세포에 표면에 존재하는 수용체에 의해 이루어지기 때문에 세포의 표면에 EGFrp만을 발현시키기 위해 스태빌린-2단백질의 세포외 부분을 EGFrp로 치환시킨 단백질(도 9 참조)을 만들기 위한 발현벡터를 제작하였다(실시예 3 참조). 그 후 섬유아세포를 형질전환하여 EGFrp가 세포표면에 발현되는 세포주(L/EGF3세포)를 제작하였다(도 10 참조). 상기의 세포를 이용하여 세포표면에 존재하는 EGFrp가 포스파티딜세린과 결합하는지를 조사하였다(실시예 4 참조). 그 결과, EGFrp가 발현되는 세포는 포스파티딜세린 리포좀에 결합하였고(도 11 참조), 포스파티딜세린이 코팅된 플레이트에 잘 부착하였다(도 12 참조). 또한, EGFrp가 발현되는 세포는 노화된 적혈구의 부착을 매개하였으며(도 13 및 도 14 참조), 적혈구의 부착은 스태빌린-2 단클론 항체와 포스파티딜세린 리포좀에 의해 특이적으로 저해되었다(도 15 참조).
또한, EGFrp가 대식세포에 의한 탐식작용을 저해하는지 알아보기 위해 인간 단핵구 유래 대식세포를 분리하여 실험한 결과 EGFrp에 의해 노화된 적혈구의 탐식이 저해되었다(도 16 참조). 더욱이 in vivo 에서도 EGFrp 단백질이 탐식작용을 저해할 수 있는지 알아 보기 위해 쥐의 복강내에 대식세포를 유도한 동물모델을 이용하였다(실시예 5 참조). 그 결과, EGFrp 단백질은 쥐 복강 내에서 대식세포의 사멸세포 탐식을 저해하였다(도 17 및 도 18 참조).
한편, 세포내에 포스파티딜세린과 결합하는 단백질들은 칼슘 이온에 의존성 결합을 한다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 스태빌린-2가 발현되는 세포(L/Stab-2 세포)를 이용하여 노화된 적혈구의 탐식에 칼슘의 효과를 조사하였다(실시예 6-1 참조). 그 결과, 혈청과 칼슘을 제거한 배지에서 거의 최소한의 노화적혈구의 탐식만이 관찰되었다. 그러나 칼슘이 추가됨에 따라 노화된 적혈구의 탐식은 증가되었다(도 19 참조). 따라서, 스태빌린-2에 의해 매개되는 탐식과정에 칼슘이 필요함을 알 수 있었다. 또한, EGFrp에 의한 포스파티딜세린의 인식에도 칼슘이 필요한지를 NBD형광의 소멸효과를 이용하여 조사하였다(실시예 6-2 참조). 그 결과, EGFrp는 PS 리포좀에 잘 부착하였으며, 이러한 부착은 칼슘 킬레이터에 의해서 저해되었다(도 20 참조). 따라서, EGFrp에 의한 포스파티딜세린의 인식과정에도 칼슘이온이 관여됨을 알 수 있었다.
본 발명자들은 EGFrp단백질의 C-말단 및 N-말단 결손 단백질들(도 21 참조)을 제조하여 사멸세포의 포스파티딜세린을 인식하는 모티프를 조사하였다(실시예 7 참조). C-말단 결실 단백질을 사용한 실험에서 EGFrp가 포스파티딜세린을 인식하기 위해서는 4개 이상의 EGF-유사 도메인이 필요함을 알 수 있었으며(도 22 참조), N-말단 결실 단백질을 사용한 실험을 통하여 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 중요함을 알 수 있었다(도 23 참조). 상기의 결과는 L/Stab-2 세포를 이용한 탐식 저해 실험에서도 유사한 결과를 나타냈다(도 24 및 도 25 참조). 따라서, EGFrp가 포스파티딜세린을 인식하기 위해서는 비정형(atypical) EGF-유사 도메인을 포함하는 4개 이상의 EGF-유사 도메인으로 구성되어야 함을 알 수 있었다.
더욱이, 본 발명자들은 EGFrp내의 2개의 비정형(atypical) EGF-유사 도메인중에서 어느 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 중요한가를 조사하기 위해 각각의 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 결실된 단백질을 제조하였다(도 26 및 실시예 7 참조). 상기의 단백질에 대해서 포스파티딜세린에 대한 부착정도를 NBD형광의 소멸효과를 이용하여 조사한 결과 두번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 칼슘 의존성 포스파티딜세린의 인식에 중요함을 알 수 있었다(도 27 및 도 28 참조). 노화된 적혈구의 탐식에도 역시 두번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 중요한 역할을 함을 알 수 있었다(도 29 참조).
결론적으로, 스태빌린-2의 EGFrp-유사 도메인 반복부위, 특히 스태빌린-2의 EGFrp-유사 도메인 반복 부위 중 두번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인 및 3개의 EGF-유사 도메인이 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하여 생체내에서 사멸세포 및 노화된 적혈구의 인식과 탐식에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 즉 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 검출용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하므로 본 발명은
(a) 본 발명의 폴리펩티드, 즉 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드를 시료와 혼합하는 단계;
(b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩티드를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 폴리펩티드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 포스파티딜세린의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드의 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 폴리펩티드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: 125I, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein) 및 YFP(Yellow Fluorescent Protein)))일 수 있다.
표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 폴리펩티드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩티드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린을 세포 표면으로 노출하는 세 포와 특이적으로 결합할 수 있으며, 사멸세포(apoptotic cell)에서 포스파티딜세린이 세포막으로 노출되므로 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포(apoptotic cell) 검출용 조성물을 제공한다. 상기에서 사멸세포의 검출은 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어, 상기 포스파티딜세린의 검출시의 방법을 이용할 수 있으며, 상기에서 기재한 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드의 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 폴리펩티드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.
또한 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린을 세포 표면으로 노출하는 세포와 특이적으로 결합할 수 있으므로 약물을 상기 세포에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드, 즉 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
상기한 바와 같이, 세포막의 외부로 포스파티딜세린의 발현 증가는 흑색종 및 대장암 세포(Utsugi, T. et al., Cancer Res. 1991, 15:3062-3066), 난소암 세포(Rao, L. et al., Thromb Res. 1992, 67:517-531), 위암 및 간암 세포(Sugimura, M. et al., Blood Coagul. Fibrinolysis. 1994, 5:365-373; Woehlecke, H. et al., Biochem J. 2003, 376:489-495), 암조직의 내피세포(Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140) 등 여러 종양세포에서 나타나며, 이것은 미분화성 발암성 세포(undifferentiated tumorigenic cell)에서 더욱 저명하게 나타난다. 종양조직은 또한 포스파티딜세린을 세포막의 외부로 노출하는 소혈관을 방출한다(Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Zwaal, R.F.A. et al., Blood. 1997, 89:1121-1132).
따라서, 상기 약물 전달용 조성물은 종양성 질환에 특이적일 수 있다. 종양성 질환이란 악성 종양에 의해 병리적 증상을 보이는 질환으로서, 그 예로는 이에 한정되지는 않으나, 대장암, 폐암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 피부암, 간암, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 복합 골수종(multiple myeloma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 신경아종(neuroblastoma), 재생불량성 빈혈일 수 있다.
본 발명의 약물 전달용 조성물에 포함되는 본 발명의 폴리펩티드를 종래 항-종양성 질환 제제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 폴리펩티드에 의해 상기 제제가 종양 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 연결될 수 있는 항-종양성 질환 제제는 종래 종양 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea) 등이 있다. 상기 제제와 본 발명의 폴리펩티드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩티드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩티드의 양은 결합되는 항암제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 즉 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 종양성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이 때, 상기 약학적 조성물에서 항-종양성 질환 제제, 결합 방법 및 종양성 질환에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 폴리펩티드의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로 부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질 병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.
아울러, 본 발명의 폴리펩티드, 즉 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드는 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하므로 종양성 질환의 발병 부위의 영상화에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환의 영상화용 조성물을 제공한다. 상기 폴리펩티드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.
또한, 포스파티딜세린은 상기 종양성 질환 이외에도 여러 가지 병적인 상황에서도 세포막의 외부로 노출된다(Zwaal, R.F.A. et al., Cell. Mol. Life Sci. 2005, 62:971-988). 그 예로 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalathemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia) 등이 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 즉 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는, 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalathemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia)으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
한편, 본 발명에 기재된 스태빌린-2 내의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 관한 서열(서열번호 33 내지 서열번호 116)은 하기 표 1에 기재된 바와 같다. 아울러, 본 발명의 단편의 명칭은 EGFrp 및 EGF-유사 도메인의 위치에 따라 명명된 것으로, 예를 들어, 본 발명의 단편 E1-14는 스태빌린-2 내의 첫 번째 EGFrp의 첫 번째 EGF-유사 도메인부터 네 번째 EGF-유사 도메인까지의 아미노산 서열로 이루어진 단편을 의미하고, 본 발명의 단편 E3-25는 스태빌린-2 내의 세 번째 EGFrp의 두 번 째 EGF-유사 도메인부터 다섯 번째 EGF-유사 도메인까지의 아미노산 서열로 이루어진 단편을 의미하는 것이다. 본 발명에서 소단위(Stab-U1 등), EGFrp 및 EGF-유사 도메인의 순서는 모두 N 말단에서의 위치에 따라 순서를 정한 것이다.
| 서열번호 | 서열의 명칭/내용 |
| 33 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 소단위(Stab-U1)의 염기서열 |
| 34 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 소단위(Stab-U2)의 염기서열 |
| 35 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 소단위(Stab-U3)의 염기서열 |
| 36 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 소단위(Stab-U4)의 염기서열 |
| 37 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp의 염기서열 |
| 38 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 염기서열 |
| 39 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 염기서열 |
| 40 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 염기서열 |
| 41 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 첫 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 42 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 두 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 43 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 세 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 44 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 네 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 45 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 다섯 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 46 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 여섯 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 47 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 첫 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 48 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 두 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 49 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 세 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 50 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 네 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 51 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 다섯 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 52 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 여섯 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 53 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 첫 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 54 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 두 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 55 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 세 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 56 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 네 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 57 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 다섯 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 58 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 여섯 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 59 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 첫 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 60 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 두 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 61 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 세 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 62 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 네 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 63 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 다섯 번째 EGF-유사 도메인의 염기서열 |
| 64 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E1-14 단편의 염기서열 |
| 65 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E1-15 단편의 염기서열 |
| 66 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E1-25 단편의 염기서열 |
| 67 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E2-14 단편의 염기서열 |
| 68 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E2-15 단편의 염기서열 |
| 69 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E2-25 단편의 염기서열 |
| 70 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E3-14 단편의 염기서열 |
| 71 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E3-15 단편의 염기서열 |
| 72 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E3-25 단편의 염기서열 |
| 73 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E4-14 단편의 염기서열 |
| 74 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E4-25 단편의 염기서열 |
| 75 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 소단위(Stab-U1)의 아미노산 서열 |
| 76 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 소단위(Stab-U1)의 아미노산 서열 |
| 77 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 소단위(Stab-U1)의 아미노산 서열 |
| 78 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 소단위(Stab-U1)의 아미노산 서열 |
| 79 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp의 아미노산 서열 |
| 80 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 아미노산 서열 |
| 81 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 아미노산 서열 |
| 82 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 아미노산 서열 |
| 83 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 첫 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 84 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 두 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 85 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 세 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 86 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 네 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 87 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 다섯 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 88 | 인간 스태빌린-2의 첫 번째 EGFrp 내의 여섯 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 89 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 첫 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 90 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 두 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 91 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 세 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 92 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 네 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 93 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 다섯 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 94 | 인간 스태빌린-2의 두 번째 EGFrp의 내의 여섯 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 95 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 첫 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 96 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 두 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 97 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 세 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 98 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 네 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 99 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 다섯 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 100 | 인간 스태빌린-2의 세 번째 EGFrp의 내의 여섯 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 101 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 첫 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 102 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 두 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 103 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 세 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 104 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 네 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 105 | 인간 스태빌린-2의 네 번째 EGFrp의 내의 다섯 번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열 |
| 106 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E1-14 단편의 아미노산 서열 |
| 107 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E1-15 단편의 아미노산 서열 |
| 108 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E1-25 단편의 아미노산 서열 |
| 109 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E2-14 단편의 아미노산 서열 |
| 110 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E2-15 단편의 아미노산 서열 |
| 111 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E2-25 단편의 아미노산 서열 |
| 112 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E3-14 단편의 아미노산 서열 |
| 113 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E3-15 단편의 아미노산 서열 |
| 114 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E3-25 단편의 아미노산 서열 |
| 115 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E4-14 단편의 아미노산 서열 |
| 116 | 인간 스태빌린-2에서 본 발명의 E4-25 단편의 아미노산 서열 |
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드는 세포 표면의 포스파티딜세린과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린의 검출, 더 나아가 포스파티딜세린을 세포 표면으로 발현하는 사멸세포 및 종양세포의 검출 또는 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
스태빌린
-2(
stabilin
-2)를 이용한 재조합 단백질의 제조
<1-1> 발현 벡터의 제조
스태빌린-2의 세포외 부분을 4개의 소단위로 구분하였으며, 이 때 상기 각 소단위는 1개의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp, EGF-like domain repeat protein)와 2개의 FAS-1 도메인을 포함하도록 하였다(도 1 참조).
먼저 상기 소단위(Stab-U1, Stab-U2, Stab-U3 및 Stab-U4)를 각각 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하기 위하여, 인간 스태빌린-2 cDNA 서열(Genbank Accession No. NM_017564)을 기초로 하여 4쌍의 프라이머(서열번호 1 내지 서열번호 8)를 디자인하였다(표 2 참조). 상기에서 디자인된 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 인간 스태빌린-2의 cDNA를 포함하고 있는 발현벡터(Park, S.Y. et al., Cell Death Differ. 2008, 15:192-201)를 주형으로 해서 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 구체적으로 상기에서 PCR 반응은 Pfu DNA 중합효소(Promega)를 사용하여 95℃에서 2분 동안 반응시킨 후, 94℃에서 1분, 55℃ 에서 30초, 72℃에서 2분 동안의 반응을 35회 반복하여 수행하였다. 그 결과 4개의 소단위에 해당하는 각각의 cDNA를 수득하였다. 상기 수득된 증폭 산물 중 Stab-U1, Stab-U2, Stab-U3을 제한효소 BamHI 및 XhoI(TaKaRa)로, Stab-U4를 제한효소 BamHI 및 EcoRI으로 각각 절단한 후, pET43.1(Novagen) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pET-Stab-U1', ‘pET-Stab-U2', ‘pET-Stab-U3', 및 ‘pET-Stab-U4'를 각각 제조하였다. pET43.1(Novagen) 벡터는 재조합 단백질의 용해성(solubility)을 높이기 위해 N-말단에 Nus tag에 대한 코딩 서열을 포함하고 있다.
또한 상기 스태빌린-2의 각 소단위에 존재하는 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp; E1, E2, E3 및 E4)를 각각 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하기 위하여, 인간 스태빌린-2 cDNA 서열을 기초로 하여 4쌍의 프라이머(서열번호 1, 3, 5, 7 및 서열번호 9 내지 서열번호 12)를 디자인하였다(표 2 참조). 상기에서 디자인된 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 상기 스태빌린-2 cDNA를 포함하는 상기 발현벡터를 주형으로 해서 상기와 동일한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 그 결과 수득된 증폭 산물을 BamHI 및 XhoI(TaKaRa)로 절단한 후, pET43.1(Novagen) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pET-E1', ‘pET-E2', ‘pET-E3', 및 ‘pET-E4'를 제조하였다.
한편 상기 스태빌린-2의 세 번째 소단위(Stab-U3)에 존재하는 FAS-1 도메인(F5)을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하기 위하여, 인간 스태빌린-2 cDNA 서열을 기초로 하여 1쌍의 프라이머(서열번호 13 내지 서열번호 14)를 디자인하였다(표 2 참조). 상기에서 디자인된 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 상기 스태빌린-2 cDNA를 포함하는 상기 발현벡터를 주형으로 해서 상기와 동일한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 구체적으로 상기에서 PCR 반응은 Pfu DNA 중합효소(Promega)을 사용하여 95℃에서 2분간 반응시킨 후 94℃에서 1 분, 55℃에서 30초, 72℃에서 1 분 동안의 반응을 35회 반복하여 수행하였다. 그 결과 수득된 증폭 산물을 BamHI 및 XhoI(TaKaRa)로 절단한 후, pET43.1(Novagen) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터‘pET-F5'를 제조하였다.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| Stab-U1 센스 | 5’-AAAAGGATCCGTAGGGGTTCGAGATTG-3’ | 1 |
| Stab-U1 안티센스 | 5’-AAAACTCGAGTCAGGGAGGAATGAGAAC-3’ | 2 |
| Stab-U2 센스 | 5’-AAAAGGATCCAACTCTGAGCCCACAG-3’ | 3 |
| Stab-U2 안티센스 | 5’-AAAACTCGAGTCACTGAATTTCCAG-3’ | 4 |
| Stab-U3 센스 | 5’-AAAAGGATCCGAGAAGAGGAGATGC-3’ | 5 |
| Stab-U3 안티센스 | 5’-AAAACTCGAGTCAATCAATCAGCAGAC-3’ | 6 |
| Stab-U4 센스 | 5’-AAAAGGATCCAGGTGGAGTAAACCAAAG-3’ | 7 |
| Stab-U4 안티센스 | 5’-AAAACTCGAGTCAGGGTGCTTTTAAAGGC-3’ | 8 |
| E1 안티센스 | 5’-AAAAACTCGAGTCAATAACACGTTAAGCC-3’ | 9 |
| E2 안티센스 | 5’-AAAAACTCGAGTCAATAGCACAGAAAGCC-3’ | 10 |
| E3 안티센스 | 5’-AAAAACTCGAGTCAGCGGCAGGTAAATCC-3’ | 11 |
| E4 안티센스 | 5’-AAAAACTCGAGTCACTCACAGTTCAGCCC-3’ | 12 |
| F5 센스 | 5’-AAAAGGATCCACTGTTTTTGCACC-3’ | 13 |
| F5 안티센스 | 5’-AAAACTCGAGTCATTTGGGAGATAGCAA-3’ | 14 |
<1-2>
스태빌린
-2(
stabilin
-2)를 이용한 재조합 단백질의 제조
상기 <실시예 1-1>에서 제조된 각각의 발현 벡터를 사용하여 대장균 BL21(DE3)을 형질전환하였다. 상기 형질전환된 대장균을 50㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 배지에서 배양한 다음, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.5~0.6이 되었을 때 1mM의 IPTG (isopropyl-D-(-)-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 추가로 배양하였다.
상기 배양 후 발현된 재조합 단백질을 공지의 방법에 따라 정제하였다(Kim, J.-E. et al., J. Cell . Biochem., 77:169-187, 2000). 구체적으로 상기 형질전환된 대장균의 배양액을 원심 분리하여 세포를 수득한 후, 용해 완충용액(50mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 1mM PMSF, 0.5mM DTT)에 재현탁하였다. 상기 세포 현탁액을 초음파로 분쇄한 후, 원심 분리하여 상층액을 Ni-NTA수지(resin, Qiagen)를 이용하여 재조합 단백질을 정제하였다. 상기 재조합 단백질을 200mM 이미다졸(imidazole) 용액에서 용리한 다음, SDS-PAGE에 의하여 재조합 단백질을 확인하였다(결과 미도시).
그 결과 상기 스태빌린-2의 소단위를 각각 포함하는‘Stab-U1', ‘Stab-U2', ‘Stab-U3' 및 ‘Stab-U4'로 명명된 재조합 단백질을 제조하였고, 상기 스태빌린-2의 각 소단위에 존재하는 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)만을 각각 포함하는 'E1', ‘E2', ‘E3', ‘E4'로 명명된 재조합 단백질을 제조하였으며, 상기 스태빌린-2의 세 번째 소단위(Stab-U3)에 존재하는 FAS-1 도메인(F5)만을 포함하는 ‘F5' 로 명명되는 재조합 단백질을 제조하였다.
<실시예 2>
스태빌린-2 내에 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)의 인식 부위 동정
<2-1> 스태빌린-2의 소단위를 포함하는 재조합 단백질에 의한 탐식 억제 효과
상기 <실시예 1-2>에서 스태빌린-2(stabilin-2)를 이용하여 제조된 재조합 단백질(Stab-U1, Stab-U2, Stab-U3 및 Stab-U4)이 탐식 활성이 있는 L/Stab-2 세포(Park, S.Y. et al., Cell Death Differ. 2008, 15:192-201)에 의한 노화된 적혈구의 탐식을 억제하는지 여부를 조사하였다(Park, S.Y. et al., Cell Death Differ. 2008, 15:192-201).
구체적으로, 먼저 정상 성인에서 채혈한 정상 적혈구를 헤마토크릿 20%가 되도록 인산완충용액(PBS, phosphate buffered saline)으로 희석한 후 37℃에서 4일간 배양함으로써 노화된 적혈구 세포를 제조하고, 상기 <실시예 1-2>에서 제조된 각각의 재조합 단백질(Stab-U1, Stab-U2, Stab-U3 및 Stab-U4)을 헤마토크릿 1%의 상기 노화된 적혈구와 37℃에서 1시간 동안 전배양하였다. 이때 대조군으로 pET43.1벡터에 의해 만들어지는 Nus단백질을 상기 노화된 적혈구와 상기와 같이 전배양한 것을 사용하였다. 상기 전배양 후 L/Stab-2 세포를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 추가 배양하였다. 상기 배양이 완료된 후 L/Stab-2 세포와 결합하지 않은 적혈구를 제거하고, 인산완충용액으로 세포를 5회 세척한 후 물로 10초간 처리하여 탐식되지 않고 결합되어 있는 적혈구를 모두 용해시켰다. 상기 용해시킨 후 L/Stab-2 세포를 디프 퀵 염색용 킷트(Diff quick staining kit, IMEM Ins., San Marcos, CA, 미국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 염색하여 관찰한 사진을 도 3에 게재하였으며, 임의로 선택한 5군데에서 적혈구를 탐식한 세포의 수를 계수한 다음, 전체 L/Stab-2 세포 중에서 상기 적혈구를 탐식한 세포의 수를 백분율로 나타내어 탐식지표(%)를 계산하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, L/Stab-2 세포를 상기 스태빌린-2의 4개의 소단위로 구성된 재조합 단백질과 전배양한 경우, 노화된 적혈구의 탐식이 크게 저해됨을 알 수 있었으며, 이에 비해 대조군인 Nus단백질과 전배양한 경우는 전배양을 하지 않은 것과 마찬가지로 노화된 적혈구의 탐식에 큰 영향을 주지 않음을 알 수 있었다. 상기 결과로부터, 노화된 적혈구의 포스파티딜세린과 상호 작용하여 탐식에 관여하는 모티프는 네 개의 소단위에 모두 존재한다는 것을 확인하였다.
<2-2> 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)를 포함하는 재조합 단백질에 의한 탐식 억제 효과
상기 <실시예 2-1>과 같이 스태빌린-2에서 포스파티딜세린과 상호 작용하는 모티프를 좀 더 구체적으로 동정하기 위하여, 상기 <실시예 1-2>에서 스태빌린-2를 이용하여 제조된 재조합 단백질 중 세 번째 소단위에 대한 재조합 단백질(Stab-U3) 및 결실 재조합 단백질(E3, F5)이 탐식 활성이 있는지 여부를 추가 확인하였다.
구체적으로 각각의 재조합 단백질(Stab-U3, E3, F5)을 각각 0.1, 1 및 10㎍의 농도로 하여 사멸 세포와 전배양한 후, 상기 재조합 단백질이 L/Stab-2 세포에 의한 사멸 세포의 탐식을 억제하는지 여부를 확인하였다. 이 때 상기 사멸 세포는 RPM-I1640 배지(10% 소 태아 혈청이 함유)에서 배양된 인간 백혈병 Jurkat T 세포(한국 세포주 은행)를 항-Fas 항체(CH-11) 100ng/㎎가 첨가된 배지에 접종하여 6시간 동안 배양함으로써 사멸을 유도하여 제조된 세포를 말하며(Oka, K. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:9535-40, 1998), L/Stab-2 세포를 염색하기 위하여 아넥신-V 아폽토시스 디텍션 키트(Annexin V Apoptosis detection kit, Santa Cruz)를 사용하였으며, 그 외 상기 실험 방법은 상기 <실시예 2-1>과 동일하게 진행한 후 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
그 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 포함된 Stab-U3과 E3 단백질이 사멸세포의 탐식을 농도 의존적으로 저해함을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 사멸세포의 포스파티딜세린과 상호 작용하여 탐식에 관여하는 모티프는 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)에 존재한다는 것을 확인하였다.
한편 다른 소단위에서의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)도 같은 효과를 보이는지 확인하기 위해, 상기 <실시예 1-2>에서 제조된 재조합 단백질(E1, E2 및 E4)에 대해서도 상기 <실시예 2-1>와 동일한 실험을 수행하고 그 결과를 도 6에 기재하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)만을 포함하는 재조합 단백질들(E1, E2, E3 및 E4)이 모두 노화된 적혈구의 탐식을 농도 의존적으로 저해하는 것을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 결국 노화된 적혈구 또는 사멸세포의 포스파티딜세린과 상호 작용하여 탐식에 관여하는 모티프는 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)에 존재한다는 것을 확인하였다. 즉 노화된 적혈구 및 사멸세포의 탐식은 재조합 단백질의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)에 의해 경쟁적으로 억제됨을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 스태빌린-2의 세포외 부분에 존재하는 EGF-유사 도메인의 반복 부위들이 노화된 적혈구 및 사멸세포의 인식을 매개한다는 사실을 알 수 있었다.
<2-3> 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)를 포함하는 재조합 단백질과 포스파티딜세린과의 직접적 결합 확인
상기 <실시예 1-2>에서 제조된 재조합 단백질이 포스파티딜세린과 직접적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, 포스파티딜세린을 메탄올에 녹여서 3㎍/㎖의 농도로 만든 다음, ELISA 플레이트에 첨가한 후 공기 중으로 메탄올이 증발할 때까지 실온에 놓아두었다. 이 후 비특이적인 결합을 억제하기 위해 2% BSA(bovine serum albumin)를 각 웰에 추가하여 1시간 동안 실온에서 배양한 다음, 상기 <실시예 1-2>에서 제조된 Stab-U3, E3 및 F5, 그리고 대조군으로 Nus 단백질을 추가하여 1시간 동안 실온에서 추가 배양하였다. 상기 배양이 끝난 후 결합하지 않은 단백질을 인산완충용액으로 제거하고, 웰에 있는 포스파티딜세린에 결합한 단백질은 페록시다아제(peroxidase)가 붙어 있는 항-His 항체를 첨가하여 1시간동안 둔 후 과산화수소수와 o-페닐렌디아민(o-phenylenediamine)이 들어있는 발색시약을 첨가함으로써 <실시예 1-2>에서 제조된 재조합 단백질과 포스파티딜세린의 결합정도를 확인하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 2-2>의 실험결과와 동일하게 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 포함되어 있는 Stab-U3 및 E3 단백질이 포스파티딜세린과 직접적으로 결합함을 알 수 있었다.
한편, 스태빌린-2에 존재하는 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 선택적으로 포스파티딜세린과 직접적으로 결합하는지를 알아보기 위하여, 상기와 동일한 ELISA 플레이트에 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜에탄올라민(PE)를 코팅한 후에 상기 <실시예 1-2>에서 제조된 E3 단배질을 추가하여 상기와 동일한 실험을 진행하고 그 결과를 도 8에 기재하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 선택적으로 포스파티딜세린과 직접적으로 결합함을 알 수 있었다.
<실시예 3>
스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위만을 포함하는 재조합 단백질의 cDNA의 클로닝
<3-1> 발현벡터의 제조
EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 실제로 세포 표면에서 사멸세포의 표면에 존재하는 포스파티딜세린을 인식하는지를 알아보기 위해 먼저 스태빌린-2의 세포외 부분을 세 번째 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)로 치환시킨 단백질(도 9 참조)을 발현시키기 위한 발현벡터를 제조하였다.
우선 스태빌린-2의 신호 펩티드 부위에 해당하는 cDNA를 얻기 위해서, 스태빌린-2 cDNA를 포함하는 발현벡터를 주형으로 하고 하기 표 3에 나타난 프라이머(서열번호 15 및 서열번호 16)를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 구체적으로 상기 PCR 반응은 Pfu DNA 중합효소(Promega)를 사용하여 95℃에서 2분간 반응시킨 후 94℃에서 1 분, 55℃에서 30초, 72℃에서 1 분 동안의 반응을 35회 반복하여 수행하였다. 상기 PCR 결과 증폭된 산물을 NheI 및 XhoI(TaKaRa) 제한효소로 절단한 다음, pcDNA3.1/Myc-His(Invitrogen) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pcDNA-S'를 제조하였다.
한편, 스태빌린-2의 막횡단부위와 세포내부위를 포함하는 cDNA를 얻기 위해서 스태빌린-2의 발현벡터를 주형으로 하고 하기 표 3에 나타난 프라이머(서열번호 17 및 서열번호 18)를 사용하여 상기와 동일한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 상기 PCR 결과 증폭된 산물을 BamHI 및 HindIII(TaKaRa) 제한효소로 절단한 다음, 상기 pcDNA-S 벡터의 상기 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터‘pcDNA-S-TMC'을 제조하였다.
또한 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)에 해당하는 cDNA를 얻기 위해서 스태빌린-2의 발현벡터를 주형으로 하고 하기 표 3에 나타난 프라이머(서열번호 19 내지 서열번호 20)를 사용하여 상기 <실시예 1-1>와 동일한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 상기 PCR 결과 증폭된 산물을 XhoI 및 BamHI(TaKaRa) 제한효소로 절단한 다음, 상기의 pcDNA-S-TMC 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 스태빌린-2의 세포외 부분을 세 번째 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)로 치환시킨 재조합 벡터를 완성하였으며, 이를 ‘pcDNA-EGF3'라 명명하였다.
상기에서 제조된 플라스미드를 염기서열 분석기(Applied Biosystems AB13700)에서 분석하여 올바르게 클로닝이 되었는지를 확인하였다(결과미도시).
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| Signal 센스 | 5’-AAAATGCTAGCTCAGCCTGACAGGTGC-3’ | 15 |
| Signal 안티센스 | 5’-AAAATCTCGAGTCTTGCCTGCCCTGTG-3’ | 16 |
| TMC 센스 | 5’-AAAAAGGATCCACCCACACTGGCTTG-3’ | 17 |
| TMC 안티센스 | 5’-CCCGTCCAAGCTTGCACAGTGTCCT-3’ | 18 |
| EGF3 센스 | 5’-AAAACCTCGAGAGATGTGATAATAATGAC-3’ | 19 |
| EGF3 안티센스 | 5’-AAAAAGGATCCGCGGCAGGTAAATCC-3’ | 20 |
<3-2> L 세포의 형질전환
상기 <실시예 3-1>에서 제조된 발현 벡터 pcDNA-EGF3로 마우스 섬유아세포인 L 세포(ATCC CCL-1, 동경대학의 생물물리학과 다케치 박사로부터 제공받음)를 형질전환하였다. 구체적으로 상기 L 세포를 10% 열불활성화 FBS(fetal bovine serum), 페니실린G 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양하고 상기에서 선택된 L 세포를 재조합 벡터 pcDNA-EGF3로 형질전환하기 위하여 리포펙타민(Lipofectamine)을 사용하였으며 제조자가 지시하는 방법에 따라 형질전환하였다. 상기 형질전환한 후 36시간에 G418(400㎍/㎖)을 처리하여 10 내지 12일 동안 배양하면서 저항성을 나타내는 각각의 콜로니를 분리하였다. 상기와 같은 방법으로 형질전환된 세포를 ‘L/EGF3’로 명명하였으며, 음성 대조군으로는 EGF3 유전자가 포함되지 않은 벡터인 pcDNA3.1(-)/Myc-His로 형질전환된 세포를 사용하였으며 이를 ‘L/Mock’으로 명명하였다.
<3-3> 세포 표면에서
EGF3
의 발현 여부 확인
상기 실시예 <3-2>에 제조된 L/EGF3 세포 표면에서 EGF3이 발현되는지를 확인하기 위하여, EGF3을 인식하는 단클론 항체(5G3)를 이용하여 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다.
구체적으로 상기 L/EGF3 세포를 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지가 포함된 플레이트에서 완전히 배양(confluent)한 다음, 상기 플레이트에 0.25% 트립신과 0.05% EDTA를 함유하는 인산완충용액을 처리하여 플레이트 표면으로부터 세포를 분리하였다. 상기 분리된 세포를 인산완충용액으로 2회 세척한 후 다시 인산완충용액에 재현탁한 후, 스태빌린-2 단클론 항체(5G3)를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 배양물에 10㎍/㎖의 FITC(fluorescein isothiocyanate)와 결합된 이차 항-마우스 면역글로불린 G(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 추가 배양하였다. 상기 배양한 후, 5-와트 레이저가 장착된 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 488nm에서 분석하였으며 이때 대조군으로는 스태빌린-2 단클론 항체 대신 이와 아형이 일치하는 마우스 면역글로불린(IgG1)을 사용하였으며 그 결과를 도 10에 나타내었다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, L/EGF3 세포의 표면에 EGF3가 발현됨을 확인할 수 있었으며, 반면 L/Mock 세포의 표면에는 EGF3가 발현되지 않음을 알 수 있었다. 또한 스태빌린-2 단클론 항체 대신 마우스 면역글로불린을 사용한 경우에도 EGF3의 발현은 검출되지 않았다.
<
실시예
4>
스태빌린
-2의
EGF
-유사 도메인의 반복 부위의
포스파티딜세린의
인식 및 이로 인한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식
<4-1> L/
EGF3
세포에 의한
포스파티딜세린의
인식
L/EGF3 세포가 포스파티딜세린을 인식하는지 여부를 확인하기 위하여, 포스파티딜콜린 리포좀과 포스파티딜세린 리포좀에 대한 L/EGF3 세포의 부착 활성을 조사하였다.
구체적으로 포스파티딜콜린(phosphatidlycholine, PC) 또는 포스파티딜세린(phosphatidlyserine, PS)을 포함하는 리포좀을 공지된 방법을 이용하여 제조하였다(Oka, K. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 95:9535-9540, 1998; Fadok, V. A. et al., Nature 405:85-90, 2000). 보다 구체적으로 포스파티딜세린:포스파티딜콜린을 각각 50:50의 몰 비율로 혼합하여 리포좀(이하 ‘포스파티딜세린 리포좀’이라 함)을 제조하고, 포스파티딜콜린만을 포함하는 리포좀(이하 ‘포스파티딜콜린 리포좀’이라 함)을 제조하였다. 상기 제조된 리포좀 혼합물을 클로로포름과 혼합하고 질소 기체 하에서 건조시킨 다음 최종 농도가 5mM이 되도록 인산완충용액에 재현탁하여 얼음 위에서 10분간 초음파 처리하였다. 또한 상기 리포좀 제조시 총 인지질에 대해 1% 농도의 N-(lissamin rhodamine B sulfonyl)-L-α-포스파티딜에탄올아민(Avanti Polar Lipids)을 첨가하여 형광 표지된 인지질 리포좀을 제조하였다.
상기 <실시예 3-2>에 제조된 L/EGF3 세포를 DMEM 배지에서 완전히 배양한 후, 상기 제조된 여러 종류의 인지질 리포좀을 각각 0, 10, 100μM씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 인산완충용액으로 충분히 세척하고 L/EGF3에 대한 인지질 리포좀의 부착 정도를 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 11에 나타내었다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, L/EGF3 세포는 포스파티딜세린 리포좀을 더 많이 첨가함에 따라 포스파티딜세린 리포좀과의 결합은 증가하였지만, 포스파티딜콜린 리포좀과는 고농도에서도 결합을 하지 않음을 알 수 있었다.
<4-2>
스태빌린
-2의
EGF
-유사 도메인의 반복 부위에 의한
포스파티딜세린의
인식
스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 포스파티딜세린을 인식하는지를 알아보기 위해 하기와 같은 세포부착실험을 시행하였다.
구체적으로 ELISA 플레이트에 포스파티딜세린과 대조군으로 포스파티딜콜린을 0.1, 1, 10, 100μM의 농도로 상기 <실시예2-3>와 동일한 방법으로 코팅하고, L/stab-2 및 상기 <실시예 3-2>에서 제조된 L/EGF3, 및 L/Mock 세포를 각 웰에 104개를 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. 배양한 후, 인산완충액을 이용하여 플레이트 표면에 코팅된 포스포지질과 결합하지 않은 세포들을 제거한 후에 90㎕의 반응 완충액을 첨가하여 1시간동안 추가 배양하였다. 상기 추가 배양한 후, 60㎕의 중지 완충액을 첨가하여 발색반응을 중지시킨 다음 마이크로 플레이트 리더(BioRad)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 존재하는 L/EGF3 세포 및 L/Stab-2 세포는 포스파티딜세린에 잘 부착되었으나, 대조군으로 사용된 L/Mock 세포는 포스파티딜세린에 부착되지 않았다. 한편 포스파티딜콜린에는 어떤 세포도 부착되지 않았다. 상기 결과로부터 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 포스파티딜세린을 인식한다는 사실을 확인 할 수 있었다.
<4-3> L/
EGF3
세포에 의한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식
상기 <실시예 3-2>에서 제조된 L/EGF3 세포에서 노화된 적혈구가 부착 및 탐식되는지 여부를 대조군인 L/Mock 세포와 비교하여 실험하였다.
구체적으로 상기 <실시예2-1>과 동일한 방법으로 노화된 적혈구를 제조한 후, 상기 <실시예 3-2>에서 제조된 L/EGF3 세포와 L/Mock 세포를 각각 DMEM 배지가 포함된 6-웰 플레이트에서 완전히 배양한 후 노화된 적혈구를 최종 헤마토크릿 1%가 되도록 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 추가 배양하였다. 상기 추가 배양 후, 배양액을 인산완충용액으로 5회 세척하고 광학현미경으로 노화된 적혈구 및 정상 적혈구의 부착 정도를 관찰하여 그 결과를 도 13에 나타내었다.
또한 상기 실험 결과 임의로 선택한 100개의 L/EGF3 세포에 부착된 적혈구의 수를 계수하여 평균값을 구하고 탐식 분석을 위하여 상기 세포를 인산완충용액으로 세척한 다음 물로 10초간 처리하여 탐식되지 않은 세포를 모두 용해시킨 후, L/EGF3 세포를 디프 퀵 염색용 킷트(Diff quick staining kit, IMEM Ins., San Marcos, CA, USA)를 사용하여 염색하고, 임의로 선택한 5 군데에서 적혈구를 탐식한 세포의 수를 계수하였다. 상기 계수 결과를 토대로 부착 및 탐식지표(%)는 전체 L/EGF3 세포 중에서 적혈구를 부착 및 탐식한 세포의 수를 백분율로 나타내어 계산하고 그 결과를 도 14에 나타내었다.
그 결과, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 노화된 적혈구가 L/EGF3 세포에 부착되지만 L/EGF3세포에 의해서 노화된 적혈구의 탐식은 일어나지 않음을 알 수 있었으며 대조군인 L/Mock 세포에는 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 어느 것도 일어나지 않음을 알 수 있었다.
<4-4>
스태빌린
-2의
EGF
-유사 도메인의 반복 부위에 의한 노화된 적혈구의 부착
상기 <실시예 4-3>에서 L/EGF3 세포에 의한 노화된 적혈구의 부착이 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)에 의한 것임을 확인하기 위하여 추가 실험을 진행하였다.
구체적으로 L/EGF3 세포를 포스파티딜세린 리포좀 또는 포스파티딜콜린 리포좀 100μM, 스태빌린-2 단클론 항체(5G3) 및 마우스 면역글로불린(IgG) 100㎍/㎖ 씩을 각각 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 노화된 적혈구를 추가 첨가한 후 상기 <실시예 4-3>과 동일한 방법으로 부착정도를 조사하여 그 결과를 도 15에 나타내었다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, L/EGF3세포에 의한 노화된 적혈구의 부착은 포스파티딜세린 리포좀(PC)과 스태빌린-2 단클론 항체(mAb 5G3)에 의해 저해됨을 알 수 있었으며, 상기 결과로부터 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 세포표면에 발현되는 상황에서 노화된 적혈구의 선택적인 부착을 매개함을 알 수 있었다.
<
실시예
5>
스태빌린
-2의
EGF
-유사 도메인의 반복 부위에 의한 사멸세포 탐식 억제 효과
<5-1> 생체 외(
in
vitro
)에서
EGF
-유사 도메인의 반복 부위에 의한 노화된 적혈구의 탐식 억제 효과
스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 생체 외에서 노화된 적혈구의 탐식을 저해할 수 있는지 여부를 알아보기 위하여, 먼저 정상 성인의 자발적 공여자로부터 혈액을 채취하고 상기 혈액에서 단핵세포를 분리한 다음 10% 사람 혈청이 포함된 X-비보 10(Bio Whitaker)에서 7일 정도 배양하여 대식세포로 분화시킴으로써 인간 단핵세포에서 유래한 대식세포(human monocyte-derived macrophage, HMDM)를 제조하였다. 상기 제조 후, 상기 <실시예 1-2>에서 제조된 재조합단백질 Stab-U3, E3 및 F5 그리고 상기 <실시예 4-1>에서 제조된 포스파티딜세린 리포좀 100μM을 각각 첨가하여 전배양하였다. 상기 전배양한 후, 노화된 적혈구를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 추가로 배양하고 배양이 완료된 다음 인산완충용액으로 5회 세척하여 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 탐식지표(%)를 구하였으며 그 결과를 도 16에 나타내었다.
그 결과, 상기 도 16에 나타낸 바와 같이, 상기 대식세포에 의한 노화된 적혈구의 탐식은 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 포함되어 있는 Stab-U3 및 E3 단백질에 의해서 저해되었으며, 상기의 저해효과는 포스파티딜세린 리포좀에 의한 것과 유사한 결과를 나타냄을 알 수 있었다.
<5-2>
생체 내(
in
vivo
)에서
EGF
-유사 도메인의 반복 부위에 의한 사멸세포 탐식 억제 효과
스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 생체 내에서 자연사멸세포의 탐식을 저해할 수 있는지 여부를 알아보기 위하여, 다음과 같이 실시하였다. 먼저 쥐의 복강에 대식세포를 공지된 방법을 이용하여 유도하였으며(Taylor, P.R. et al., J Exp Med . 192: 359-366, 2000), 구체적으로 실험 4일 전에 쥐의 복강 내로 3% 티오글리콜레이트 4㎖을 주사하여 대식세포를 유도하였다.
한편 사멸세포로 사용될 쥐의 흉선세포를 분리하기 위해 쥐의 흉선을 분리하여 가위와 포셉을 가지고 RPMI-1640 배지가 들어있는 플레이트 위에서 잘게 자른 다음, 하루가 경과한 후 세포 여과체(cell strainer, BD Falcon)로 조직을 여과하였다. 상기 여과 후 1500rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 세포를 가라앉힌 다음, 인산완충용액을 사용하여 세포를 여러 번 씻어 주었다. 상기와 같이 분리된 흉선세포를 배지 100㎕에 1× 106개의 세포가 들어가게 준비한 다음, 형광시약인 CFSE(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, Invitrogen)을 3㎕을 넣고 30분간 37℃에서 배양하여 염색하였다. 상기 염색 후, 흉선세포의 사멸을 유도하기 위해 1× 107개의 세포가 들어있는 10㎖의 배지(혈청이 첨가되어 있지 않음)에 1μM의 덱사메타손(dexamethasone)을 넣고 4시간 동안 37℃에서 배양하여 세포의 사멸을 유도하였다.
상기 사멸이 유도된 흉선세포를 상기 <실시예 1-2>에서 제조된 E3 재조합 단백질 5μM과 30분 동안 상온에서 전배양 한 후, 세포와 결합하지 않은 단백질은 인산완충용액으로 제거하고 쥐의 복강 내로 주사기를 이용해서 상기 배양물을 주입하였다. 이 때 대조군으로는 Nus 단백질을 같은 시간 동안 전배양한 것을 사용하였다. 상기 주입 후 5, 15, 30분에 다시 복강에 인산완충용액 5 ㎖을 주입한 후 즉시 세척액(lavage)을 이용하여 복강 내의 세포를 분리한다. 상기 분리된 세포를 1500rpm에서 10분간 원심 분리하여 인산완충용액으로 여러 번 씻은 후 이를 다시 인산완충용액에 재현탁하였다. 상기 세포 현탁액에 Cy5.5가 결합되어 있는 항 Mac-1 항체를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 배양한 후 5-와트 레이저가 장착된 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 분석하여 그 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 스태빌린-2의 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 포함된 E3 재조합 단백질로 전처치한 군의 경우 사멸세포 주입 후 5분에서 쥐 복강 내에 사멸세포를 탐식한 대식세포의 비율이 감소되었으며, 그 효과는 30분 동안 지속됨을 알 수 있었다. 또한 도 18에 나타낸 바와 같이, 탐식되지 않은 사멸세포의 비율 역시 E3 재조합 단백질로 전처리한 군의 경우 증가되었음을 알 수 있었다.
상기 결과로부터 생체 내 및 외에서 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)에 의하여 대식세포의 노화된 적혈구 또는 사멸세포에 대한 탐식을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.
<
실시예
6>
EGF
-유사 도메인의 반복 부위에 의한
포스파티딜세린을
인식하는 과정에서 칼슘의 효과
<6-1>
스태빌린
-2에 의한 노화된 적혈구의 탐식 과정에서 칼슘의 효과
세포내에 포스파티딜세린과 결합하는 단백질들은 칼슘 이온에 의존성 결합을 한다고 알려져 있어(Swairjo, M. A. et al., Nat Struct Biol, 2:968-74, 1995; Verdaguer, N. et al., Embo J, 18:6329-38, 1999), 이에 본 발명자들은 스태빌린-2에 의해 매개되는 탐식과정에서 칼슘의 효과를 조사하기 위하여 배지에 각각 칼슘을 0, 2, 5 및 10mM로 포함되도록 하여 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법을 이용하여 노화된 적혈구에 대한 탐식 정도를 측정하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 칼슘이 포함되지 않은 배지에서는 노화된 적혈구의 탐식은 거의 일어나지 않았으나, 칼슘이 2, 5 및 10mM로 포함되었을 때 탐식은 농도 의존적으로 증가하였다. 따라서 상기의 결과로부터 스태빌린-2에 의한 탐식과정은 칼슘 의존성 반응임을 알 수 있었다.
<6-2>
EGF
-유사 도메인의 반복 부위에 의한
포스파티딜세린을
인식하는 과정에서 칼슘의 효과
상기 <실시예 6-1>을 기초로 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)에 의한 포스파티딜세린을 인식하는 과정에서 칼슘이 관여하는지를 조사하였다.
구체적으로 클로로포름에 녹아있는 500㎍의 포스파티딜콜린과 포스파티딜콜린/포스파티딜세린(80/20)에 NBD-포스파티딜콜린과 NBD-포스파티딜세린(배합비:0.5mol%)을 혼합한 후, 클로로포름을 스피드백 건조기(Speed-Vac)를 사용하여 제거한 다음 300㎕의 인산완충용액에 현탁하고 초음파 분쇄기(10/50 duration cycle)로 3분 동안 분쇄하여 형광 리포좀을 제조하였다.
또한, Nus-tag이 포함되지 않은 EGF-유사 도메인의 반복 부위에 대한 재조합 단백질을 제조하기 위해 상기 실시예 <1-1>에서 사용된 스태빌린-2 cDNA를 포함하는 발현벡터를 주형으로 하고 하기 <표 4>의 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머쌍을 이용하여 상기 실시예 <1-1>과 동일한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 상기 수행결과, 증폭된 각각의 산물을 제한효소 BamHI 및 XhoI(TaKaRa)로 절단한 후, pET28a(Novagen) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pET-E3-16'를 제조하였다. 그 후, 상기 스태빌린-2의 세 번째 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)만을 각각 포함하는 ‘E3-16'으로 명명된 재조합 단백질을 제조하였다.
상기 제조 후, E3-16 단백질을 0.0, 0.156, 0.032, 0.064, 0.126, 0.25, 0.5, 1μM의 농도로 500㎕의 반응액(50mM Hepes(pH 7.4), 100mM NaCl, 25mM KCl, 2.5mM CaCl2)에 넣고 2㎕의 상기 제조된 리포좀 용액을 혼합하여 형광 분광분석기(Perkin Elmer L55, excitation wavelength:460nm, excitation slits:5nm, emission slits:10nm)로 460nm에서 600nm까지 방출스펙트럼(emission spectrum)을 측정하고 그 결과를 도 20에 나타내었다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 상기 EGF-유사 도메인의 반복 부위만을 포함하는 E3 재조합 단백질은 포스파티딜콜린 리포좀 보다는 포스파티딜세린 리포좀에 상당히 많이 결합하는 것을 알 수 있었으며, 또한 반응액 내에 칼슘 킬레이터인 EGTA가 포함된 경우에는 포스파티딜세린 리포좀에 대한 결합이 저해되는 것을 알 수 있었다. 따라서 EGF-유사 도메인의 반복 부위에 의한 포스파티딜세린의 인식은 칼슘 의존성 반응임을 또한 알 수 있었다.
<
실시예
7>
EGF
-유사 도메인의 반복
부위내에
포스파티딜세린과
결합을 매개하는 모티프의 동정
<7-1>
EGF
-유사 도메인의 반복 부위를 이용한 C-말단 혹은 N-말단 결실 재조합 단백질의 제조
EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)내에 사멸세포의 포스파티딜세린과 결합하는 모티프를 구체적으로 동정하기 위하여, 각 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 6개의 EGF-유사 도메인으로 이루어진 것을 알고(단, 네 번째 EGF-유사 도메인의 반복 부위는 5개의 EGF-유사 도메인으로 이루어짐.) EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)를 이용하여 N-말단 혹은 C-말단이 결실된 재조합 단백질을 제조하였다. 구체적으로, 세 번째 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)에 존재하는 6개의 EGF-유사 도메인을 이용하여, 6개에서 1개까지 EGF-유사 도메인으로 구성된 C-말단 결실 재조합 단백질 또는 N-말단 결실 재조합 단백질을 다음과 같이 제조하였다(도 21 참조).
먼저 5개에서 1개까지 EGF-유사 도메인으로 구성된 C-말단 결실 재조합 단백질을 위한 발현벡터를 제조하기 위해, 상기 실시예 <6-2>에서 사용된 pET-E3-16 발현벡터를 주형으로 하고 하기 서열번호 21 및 서열번호 23의 프라이머쌍(E3-15), 서열번호 21 및 서열번호 24의 프라이머쌍(E3-14), 서열번호 21 및 서열번호 25의 프라이머쌍(E3-13), 서열번호 21 및 서열번호 26의 프라이머쌍(E3-12) 및 서열번호 21 및 서열번호 27의 프라이머쌍(E3-1)(표 4 참조)을 이용하여 상기 <실시예 1-1>과 동일한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 상기 수행결과, 증폭된 각각의 산물을 제한효소 BamHI 및 XhoI(TaKaRa)로 절단한 후, pET28a(Novagen) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pET-E3-15, ‘pET-E3-14', ‘pET-E3-13', ‘pET-E3-12', 및 ‘pET-E3-1'를 제조하였다.
또한, 5개에서 1개까지 EGF-유사 도메인으로 구성된 N-말단 결실 재조합 단백질을 위한 발현벡터를 제조하기 위해, 서열번호 28 및 서열번호 22의 프라이머쌍(E3-26), 서열번호 29 및 서열번호 22의 프라이머쌍(E3-36), 서열번호 30 및 서열번호 22의 프라이머쌍(E3-46), 서열번호 31 및 서열번호 22의 프라이머쌍(E3-56) 및 서열번호 32 및 서열번호 22의 프라이머쌍(E3-6)(표 4 참조)를 이용하여 상기와 동일한 방법을 이용하였으며 그 결과 재조합 벡터 ‘pET-E3-26, ‘pET-E3-36', ‘pET-E3-46', ‘pET-E3-56', 및 ‘pET-E3-6'를 제조하였다.
상기의 발현벡터들을 이용하여 C-말단 결실 재조합 단백질 또는 N-말단 결실 재조합 단백질을 만들기 위하여, 상기 <실시예 1-2>와 동일한 방법을 이용하여 재조합 단백질을 분리 및 정제하였다. 상기와 같이 제조된 C-말단 결실 재조합 단백질들을 각각 ‘E3-15’, ‘E3-14’, ‘E3-13’, ‘E3-12’, ‘E3-1’로 명명하였으며, N-말단 단백질들을 각각 ‘E3-26’, ‘E3-36’, ‘E3-46’, ‘E3-56’, ‘E3-6’으로 명명하였다.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| E3-16 센스 | 5’-AAAAAGGATCCACGAGAGAATGCTGTGCC-3’ | 21 |
| E3-16 안티센스 | 5’-AAAACTCGAGTCAGCGGCAGGTAAATCCATC-3’ | 22 |
| E3-15 안티센스 | 5’-GATCTCGAGTTATGTGCAGACCTTTCCATC-3’ | 23 |
| E3-14 안티센스 | 5’-GATCTCGAGTTACAGGCACACAATGCC-3’ | 24 |
| E3-13 안티센스 | 5’-GATCTCGAGTTATGTGCAGATGGTCCC-3’ | 25 |
| E3-12 안티센스 | 5’-GATCTCGAGTTAGGTTGCATTGTCAC-3’ | 26 |
| E3-1 안티센스 | 5’-GATCTCGAGTTAGCAGGCTGTGCCGC-3’ | 27 |
| E3-26 센스 | 5’-AAAAAGGATCCGAGACCTGCACCGAG -3’ | 28 |
| E3-36 센스 | 5’-AAAAGGATCCACAGAAGACAACTGCAATG-3’ | 29 |
| E3-46 센스 | 5’-AAAAGGATCCGCAATCAATGCCTGTGAG-3’ | 30 |
| E3-56 센스 | 5’-AAAAGGATCCGGAATCAACCCGTGTTTG-3’ | 31 |
| E3-6 센스 | 5’-AAAAGGATCCCTCATCAATGTCTGCTTAAC-3’ | 32 |
<7-2>
EGF
-유사 도메인의 반복 부위 내에
포스파티딜세린과
결합을 매개하는 모티프의 동정
상기 실시예 <6-2>에서 제조된 E6-16 및 실시예 <7-1>에서 제조된 결실 재조합단백질과 포스파티딜세린과의 결합을 알아보기 위해, 상기 실시예 <6-2>에서처럼 NBD-포스파티딜콜린 및 NBD-포스파티딜세린을 이용한 형광의 소멸효과를 관찰하여 그 결과를 도 22 및 도 23에 나타내었다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, C-말단 결실 단백질들을 사용한 실험에서는 야생형(wild-type)인 E3-16을 비롯하여 E3-15, E3-14 재조합 단백질이 포스파티딜세린과 잘 결합함을 알 수 있었다. 따라서 포스파티딜세린에 잘 결합하기 위해서는 4개 이상의 EGF-유사 도메인이 필요함을 알 수 있었다.
또한, 도 23에 나타낸 바와 같이, N-말단 결실 단백질들을 사용한 실험에서는 야생형(wild-type)인 E3-16과 E-26 재조합 단백질만이 포스파티딜세린과 잘 결합함을 알 수 있었다. 따라서 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 포스파티딜세린과의 결합에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
한편, 상기 <실시예7-1>에서 제조된 결실 재조합단백질을 이용하여 상기 <실시예2-1>과 동일한 방법으로 노화된 적혈구에 대한 탐식 실험을 수행하고 그 결과를 도 24 및 도 25에 나타내었다.
그 결과, 도 24에 나타낸 바와 같이, C-말단 결실 재조합단백질 중에서는 4개 이상의 EGF-유사 도메인을 가지고 있는 E-16, E-15, E-14 재조합 단백질이 노화된 적혈구의 탐식을 억제하는 것으로 나타났으며, 또한 도 25에 나타낸 바와 같이, N-말단 결실 재조합단백질 중에서는 비정형(atypical) EGF-유사 도메인을 가지고 있는 E3-16과 E3-26 재조합 단백질만이 노화된 적혈구의 탐식을 억제하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 실험결과를 토대로 비정형(atypical) EGF-유사 도메인을 가지면서 4개 이상의 EGF-유사 도메인을 가지는 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)가 포스파티딜세린의 인식에 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다.
<7-3> 비정형(
atypical
)
EGF
-유사 도메인이 결핍된 결실 재조합 단백질의 제조
EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)내에 어느 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 포스파티딜세린과의 상호작용에 중요하는지를 동정하기 위하여 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 결핍된 결실 재조합 단백질을 제조하였다.
구체적으로 우선 세 번째 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)내에 첫 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 결실되어 있으면서 4개의 EGF-유사 도메인으로 구성된 재조합 단백질(도 26의 E3-25)을 제조하기 위한 발현 벡터를 제조하기 위해, 상기 표 4에 기재된 프라이머(서열번호 28 및 서열번호 23)를 사용하고 상기 <실시예 7-1>과 동일한 방법을 이용하여 재조합 벡터 ‘pET-E3-25'를 제조하였다.
또한 두 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 결실되어 있으면서 4개의 EGF-유사 도메인으로 구성된 재조합 단백질(도 26의 E3-15Δ2)을 제조하기 위한 발현 벡터를 제조하기 위해, 상기 표 4에 기재된 서열번호 21 및 서열번호 27의 프라이머쌍(첫 번째 EGF-유사 도메인을 증폭) 및 서열번호 23 및 서열번호 29의 프라이머쌍(세 번째 내지 다섯 번째 EGF-유사 도메인을 증폭)을 사용하여 각각 상기 <실시예 1-1>과 동일한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 상기 수행결과, 증폭된 산물 중 첫 번째 EGF-유사 도메인을 제한효소 BamHI 및 EcoRI(TaKaRa)로 절단한 후, pET28a(Novagen) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입한 다음, 증폭된 산물 중 세 번째 내지 다섯 번째 EGF-유사 도메인을 제한효소 EcoRI(TaKaRa) 및 XhoI(TaKaRa)로 절단한 후, pET28a(Novagen) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pET-E3-15△2'를 제조하였다.
상기의 발현벡터들을 이용하여 상기 <실시예1-2>와 동일한 방법을 이용하여 재조합 단백질을 분리 및 정제하여, 세 번째 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)내에 첫 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 결실된 재조합 단백질인 ‘E3-25’를 제조하였으며 두 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 결실된 재조합 단백질인 ‘E3-15△2'를 제조하였다.
<7-4> 비정형(
atypical
)
EGF
-유사 도메인 중
포스파티딜세린과
결합을 매개하는 모티프의 동정
EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)내에 어떤 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 포스파티딜세린과의 결합에 중요한 역할을 하는지를 알아보기 위하여 C-말단 결실 단백질인 E3-14와 N-말단 결실 단백질인 E3-36과 더불어 실시예<7-3>에서 제조한 재조합 단백질인 E3-25 및 E3-15△2를 이용하여 포스파티딜세린과의 결합을 조사하여 비교하였다. 이 때 재조합 단백질의 크기에 의해 생기는 오류를 방지하기 위해 상기 4가지 단백질은 모두 EGF-유사 도메인이 4개로 구성된 것을 사용하였다(도 26 참조).
먼저 상기 재조합 단백질에 대해 상기 <실시예 6-2>와 동일한 방법을 이용하여 NBD-포스파티딜콜린 및 NBD-포스파티딜세린을 사용한 형광의 감쇄효과를 관찰하고 그 결과를 도 27에 나타내었다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이 두 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 결실된 E3-15△2에서 포스파티딜세린에 대한 결합이 현저하게 감소됨을 알 수 있었다.
또한, 두 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 칼슘-의존성 반응에 관여하는지 알아보기 위해, NBD-포스파티딜세린을 사용한 형광의 감쇄효과를 관찰한 실험을 칼슘 킬레이터인 EGTA의 존재하에서 시행하였으며 그 결과를 Stern-Volmer law Fo/(Fo-F)=1/fa+1/(faK[Mt])에 따라 다이나믹 퀀칭 컨스턴트(dynamic quenching constant(K))로 도시하였다. 그 결과 EGTA가 첨가되었을때 PS와 함에 의한 반응성이 현저히 감소하는 것을 관찰하였다.
그 결과, 도 28에 나타낸 바와 같이 두 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 포스파티딜세린과의 결합과 그것의 칼슘 의존성에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
또한 상기 재조합단백질을 이용하여 상기 <실시예2-1>과 동일한 방법으로 노화된 적혈구에 대한 탐식 실험을 수행하고 그 결과를 도 29에 나타내었다. 상기 도 29에 나타낸 바와 같이 두 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 결실된 E3-15△2에서 노화된 적혈구의 탐식에 대한 억제 효과가 현저하게 감소됨을 알 수 있었다.
상기의 결과를 통하여 EGF-유사 도메인의 반복 부위(EGFrp)내에 두 번째 비정형(atypical) EGF-유사 도메인이 포스파티딜세린과의 결합에 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 스태빌린-2(stabilin-2)의 EGF-유사 도메인의 반복부위(EGF-like domain repeat protein)에서 두 번째 비정형 EGF-유사 도 메인 및 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결된 폴리펩티드는 세포 표면의 포스파티딜세린과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린의 검출, 더 나아가 포스파티딜세린을 세포 표면으로 발현하는 사멸세포 및 종양세포의 검출 또는 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 스태빌린(stabilin-2) 단백질의 각 도메인과 스태빌린-2 단백질에서 유래한 의 재조합단백질의 구조를 도시화한 모식도이다.
(Stab-U1, Stab-U2, Stab-U3, Stab-U4: 스태빌린-2 단백질의 각각의 세포외 부분에 대한 재조합 단백질;
E1, E2, E3, E4: 스태빌린-2 단백질의 EGF-유사 도메인의 반복 부분(EGFrp)에 대한 재조합 단백질;
F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7: 스태빌린-2 단백질의 FAS1 도메인에 대한 재조합 단백질;
짙게 채워진 오각형 : 비정형 EGFrp, 옅게 채워진 오각형 : 표준 EGFrp, 사각형 : FAS1 도메인)
도 2는 Stab-U1, Stab-U2, Stab-U3, Stab-U4이 가지는 노화된 적혈구의 탐식에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
(None: 미처리군; Nus: Nus 단백질만 있는 것(대조군))
도 3은 L/Stab-2 세포에서 Stab-U1, Stab-U2, Stab-U3, Stab-U4의 존재 하에서의 자연 사멸세포(apoptotic cell)의 탐식 정도를 관찰한 사진이다.
도 4는 세 번째 소단위(Stab-U3) 및 이들의 단편(E3, F5)의 양을 달리하여(0.1, 1, 10 μg) 전처치한 경우 노화된 적혈구의 탐식에 대해 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 세 번째 소단위(Stab-U3) 및 이들의 단편(E3, F5)의 사멸세포의 탐식 에 대한 효과를 나타낸 사진이다.
도 6은 노화된 적혈구의 탐식에 대한 스태빌린-2 단백질 내의 4개의 EGF-유사 도메인의 반복 부분들(EGFrp; E1, E2, E3, E4)의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 포스파티딜세린과 세 번째 소단위(Stab-U3) 및 이들의 단편(E3, F5)의 결합력을 조사한 그래프이다.
도 8은 여러 종류의 인지질과 E3 단편간의 결합력을 조사한 그래프이다.(PS: 포스파티딜세린; PC: 포스파티딜콜린; PE: 포스파티딜에탄올아민; PI: 포스파티딜이노시톨)
도 9는 인간 스태빌린-2 단백질의 세번째 EGF-유사도메인의 반복 부분이 세포표면에 발현되는 막 단백질(Stab-EGF3)의 구조를 도시화한 모식도이다.
도 10은 L/EGF3 세포에서 Stab-EGF3 단백질의 발현 여부를 스태빌린-2 단클론 항체를 이용하여 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 11은 L/EGF3 세포가 포스파티딜세린(PS) 리포좀에 결합하는 정도를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 12는 L/Stab-2 세포, L/EGF3세포, 및 L/Mock세포들이 포스파티딜세린에 대한 부착 정도를 나타낸 그래프이다.
도 13은 L/EGF3 세포에 의한 노화된 적혈구의 부착 정도를 L/Mock세포와 비교한 사진이다.
도 14는 L/EGF3 세포에 의한 노화된 적혈구의 부착 및 탐식 정도를 L/Mock세포와 비교한 그래프이다.
도 15는 포스파티딜세린 또는 스태빌린-2 단클론 항체 및 PS리포좀에 의한 L/EGF3 세포의 노화된 적혈구의 부착억제 정도를 나타낸 그래프이다.
(None: 아무것도 처리하지 않음; PS: 포스파티딜세린 리포좀; PC: 포스파티딜콜린 리포좀; mAb 5G3: 스태빌린-2 단클론 항체; Isotype cont Ab: 아형이 일치하는 마우스 면역글로불린)
도 16은 인간 단핵구에서 유래한 대식세포에 의한 노화된 적혈구의 탐식에 Stab-U3, E3, F5 단백질 및 포스파티딜세린 리포좀의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 동물모델에서 쥐 복강내의 대식세포에 의한 탐식작용에 E3 단편의 효과를 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 18은 동물모델에서 쥐 복강내의 사멸세포의 제거에 E3 단편의 효과를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 19는 L/Stab-2 세포에 의한 노화된 적혈구의 탐식에 대한 칼슘의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 E3 단편과 포스파티딜세린과의 결합에 대한 칼슘의 영향을 NBD형광의 소멸을 이용해서 나타낸 그래프이다.
도 21은 E3 단편의 N-말단 및 C-말단의 결손 단백질의 구조를 도시화한 모식도이다.
도 22는 E3 단편의 C-말단의 결손 단백질의 포스파티딜세린 리포좀에 대한 결합정도를 NBD형광의 소멸을 통해서 나타낸 그래프이다.
도 23은 E3 단편의 N-말단의 결손 단백질의 포스파티딜세린 리포좀에 대한 결합 정도를 NBD형광소멸을 통해서 나타낸 그래프이다.
도 24는 L/Stab-2 세포에 의한 노화된 적혈구의 탐식에 대한 E3 단편의 C-말단 결손 단백질들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 L/Stab-2 세포에 의한 노화된 적혈구의 탐식에 대한 E3 단편의 N-말단 결손 단백질들의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 4개의 EGF-유사 도메인으로 이루어진 EGFrp로서 비정형 EGF-유사 도메인이 결손된 재조합단백질의 구조를 도시화한 모식도이다.
도 27은 비정형 EGF-유사 도메인이 결손된 EGFrp 단백질들의 포스파티딜세린 리포좀에 대한 결합 정도를 NBD형광의 소멸을 통해서 나타낸 그래프이다.
도 28은 비정형 EGF-유사 도메인이 결손된 EGFrp 단백질에 의한 NBD 형광의 소멸정도를 형광의 감소 비율[Fo/(Fo-F)]과 비례하는 K상수(dynamic quenching constant)로 나타낸 그래프이다.(K : K(dynamic quenching constant))
도 29는 L/Stab-2 세포에 의한 노화된 적혈구의 탐식에 비정형 EGF-유사 도메인이 결손된 EGFrp 단백질의 효과를 나타낸 그래프이다.
<110> Kyungpook national university industry-academic cooperation foundation
<120> Polypeptide of EGF-like domain repeat protein of stabilin-2,
composition for detecting phosphatidylserine comprising the
polypeptide and use thereof
<130> NP07-0158
<160> 116
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stab-U1 sense
<400> 1
aaaaggatcc gtaggggttc gagattg 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stab-U1 antisense
<400> 2
aaaactcgag tcagggagga atgagaac 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stab-U2 sense
<400> 3
aaaaggatcc aactctgagc ccacag 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stab-U2 antisense
<400> 4
aaaactcgag tcactgaatt tccag 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stab-U3 sense
<400> 5
aaaaggatcc gagaagagga gatgc 25
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stab-U3 antisense
<400> 6
aaaactcgag tcaatcaatc agcagac 27
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stab-U4 sense
<400> 7
aaaaggatcc aggtggagta aaccaaag 28
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stab-U4 antisense
<400> 8
aaaactcgag tcagggtgct tttaaaggc 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E1 antisense
<400> 9
aaaaactcga gtcaataaca cgttaagcc 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2 antisense
<400> 10
aaaaactcga gtcaatagca cagaaagcc 29
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3 antisense
<400> 11
aaaaactcga gtcagcggca ggtaaatcc 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E4 antisense
<400> 12
aaaaactcga gtcactcaca gttcagccc 29
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F5 sense
<400> 13
aaaaggatcc actgtttttg cacc 24
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F5 antisense
<400> 14
aaaactcgag tcatttggga gatagcaa 28
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal sense
<400> 15
aaaatgctag ctcagcctga caggtgc 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal antisense
<400> 16
aaaatctcga gtcttgcctg ccctgtg 27
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMC sense
<400> 17
aaaaaggatc cacccacact ggcttg 26
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMC antisense
<400> 18
cccgtccaag cttgcacagt gtcct 25
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGF3 sense
<400> 19
aaaacctcga gagatgtgat aataatgac 29
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGF3 antisense
<400> 20
aaaaaggatc cgcggcaggt aaatcc 26
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-16 sense
<400> 21
aaaaaggatc cacgagagaa tgctgtgcc 29
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-16 antisense
<400> 22
aaaactcgag tcagcggcag gtaaatccat c 31
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-15 antisense
<400> 23
gatctcgagt tatgtgcaga cctttccatc 30
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-14 antisense
<400> 24
gatctcgagt tacaggcaca caatgcc 27
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-13 antisense
<400> 25
gatctcgagt tatgtgcaga tggtccc 27
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-12 antisense
<400> 26
gatctcgagt taggttgcat tgtcac 26
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-1 antisense
<400> 27
gatctcgagt tagcaggctg tgccgc 26
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-26 sense
<400> 28
aaaaaggatc cgagacctgc accgag 26
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-36 sense
<400> 29
aaaaggatcc acagaagaca actgcaatg 29
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-46 sense
<400> 30
aaaaggatcc gcaatcaatg cctgtgag 28
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-56 sense
<400> 31
aaaaggatcc ggaatcaacc cgtgtttg 28
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3-6 sense
<400> 32
aaaaggatcc ctcatcaatg tctgcttaac 30
<210> 33
<211> 1770
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
gtaggggttc gagattgcag gtacaccttt gaggtcagaa catactctct gtctctcccc 60
ggatgccgcc atatttgtag gaaggactat ctccaacctc ggtgttgtcc tggccgctgg 120
ggcccagact gtatagagtg cccaggtgga gcggggtcac cctgcaatgg cagaggcagt 180
tgtgctgaag gcatggaagg aaatggaacc tgctcctgcc aagaagggtt tggtggaaca 240
gcctgtgaaa cctgtgctga cgacaactta tttggaccca gctgttcatc agtgtgcaac 300
tgtgtgcatg gggtgtgcaa cagtggacta gatggcgatg gaacctgtga gtgctactct 360
gcgtacactg gccccaagtg tgacaagccc atccctgaat gtgcagcctt gctctgccca 420
gaaaattcca gatgttcgcc ttccactgaa gatgaaaaca aactggaatg caaatgcctt 480
cccaattacc gaggcgatgg caaatactgc gaccccatca atccatgttt acgaaaaatc 540
tgccaccctc atgctcattg tacgtacctg ggaccaaatc ggcacagttg tacatgccaa 600
gaaggctacc gtggggatgg ccaagtgtgc ttgcctgtgg acccctgcca aattaacttt 660
ggaaactgcc ctacaaagtc tacagtgtgc aaatatgatg ggcctggaca gtctcactgc 720
gagtgtaagg agcattacca gaatttcgta cctggagtgg ggtgcagtat gactgatata 780
tgtaaatcag ataacccgtg tcataggaat gcaaattgca ccaccgtcgc accaggccga 840
actgaatgca tttgccagaa aggttacgtg ggtgatggct taacgtgtta tggaaacatt 900
atggagcgac tcagagaatt aaatactgaa cccagaggaa aatggcaagg aaggctgacc 960
tctttcatct cactcctaga caaagcttat gcctggccac tgagtaagct gggacccttc 1020
acggtgctgt tacctacaga caagggactg aaaggattca atgtaaatga gcttttggtg 1080
gataataaag ctgctcaata ctttgtgaaa ctccacataa ttgctggtca gatgaacatc 1140
gaatatatga ataacacaga catgttctac accttgactg gaaagtcggg ggaaatcttc 1200
aacagcgata aggacaatca aataaagctt aaactccatg gaggcaaaaa gaaggtaaaa 1260
attatacaag gggacatcat tgcttccaat gggcttctgc acatccttga cagagccatg 1320
gacaagttag aacccacatt tgagagcaac aatgagcaaa ccataatgac aatgctacaa 1380
ccaaggtaca gcaagttcag atctttgtta gaggaaacca atttgggaca tgccttagat 1440
gaggatggag ttggtggacc atacaccatt tttgttccaa ataatgaagc attgaataac 1500
atgaaggacg gcactctcga ttacctcctt tctccagagg gatctcggaa gcttctggaa 1560
ctcgtcagat accacattgt cccatttacc cagcttgaag tggccactct catctccacc 1620
cctcacatca ggagcatggc caaccagctc atacagttca acaccaccga caatggacag 1680
attctggcaa atgatgtggc aatggaagaa attgagatca ctgccaaaaa tggccgaatt 1740
tacacactga caggagttct cattcctccc 1770
<210> 34
<211> 1734
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
aactctgagc ccacagcact cttcacacac agatgtgtct acagtggcag gtttgggagc 60
ctgaagagcg gctgtgcccg gtactgcaat gccactgtga agattccaaa gtgctgcaaa 120
ggcttctatg gacctgactg caaccagtgt ccaggaggct tctcaaatcc atgctcagga 180
aatggacagt gtgcagatag cctcggcggc aacgggacat gcatttgtga ggagggcttc 240
caaggctccc agtgtcagtt ctgctctgat cccaataaat acggacctcg gtgtaacaaa 300
aaatgcctgt gcgttcacgg aacatgcaat aacaggatag acagcgatgg ggcctgcctc 360
actggcacat gcagagacgg ctctgccggg agactctgtg ataagcagac ctcagcctgt 420
gggccctacg tgcagttctg tcacatccac gccacctgtg aatacagcaa tgggacagcc 480
agttgtattt gcaaagcagg atatgaagga gatggaactc tgtgttctga gatggaccct 540
tgcacaggac taactccagg aggctgtagc cgcaatgcag aatgcatcaa aactggcacg 600
ggcacccaca cctgcgtgtg tcagcagggt tggacaggga atgggagaga ctgctcggag 660
atcaacaact gcctgctgcc cagtgcaggc ggctgccacg acaacgcatc ctgtttgtat 720
gtgggtcccg ggcagaatga gtgtgagtgc aagaaaggat ttcgaggaaa tgggattgac 780
tgtgaaccaa taacttcatg cttggaacaa accgggaaat gtcatccatt ggcaagctgt 840
caatctactt cgtctggtgt ctggagctgt gtttgtcaag agggctatga aggagatggc 900
tttctgtgct atggaaacgc agcagtggaa ttgtcatttc tctccgaagc agctatattt 960
aaccgatgga taaataatgc ttctctacaa cccacactgt cagccacctc aaacctcact 1020
gtcctcgtgc cttcccaaca agctactgag gacatggacc aggatgagaa aagcttctgg 1080
ttgtcacaga gcaatattcc agccctaata aagtaccata tgctactagg cacatacaga 1140
gtggcagatc tgcagaccct gtcttcttct gacatgttgg caacatcttt gcagggcaac 1200
ttccttcact tggcaaaggt ggatgggaat atcacaattg aaggggcctc cattgtcgat 1260
ggggacaacg cagccacaaa tggagtgata cacatcatca acaaggtgct ggtcccacaa 1320
agacgtctaa ctggctcctt accaaacctg ctcatgcggc tggaacagat gcctgactat 1380
tccatcttcc ggggctacat cattcaatat aatctggcga atgcaattga ggctgccgat 1440
gcctacacag tgtttgctcc aaacaacaat gccatcgaga attacatcag ggagaagaaa 1500
gtcttgtctc tagaggagga cgtcctccgg tatcatgtgg tcctggagga gaaactcctg 1560
aagaatgacc tgcacaatgg catgcatcgt gagaccatgc tgggtttctc ctatttcctt 1620
agcttctttc tccataatga ccagctctat gtaaatgagg ctccaataaa ctacaccaat 1680
gtagccactg ataagggagt gatccatggc ttgggaaaag ttctggaaat tcag 1734
<210> 35
<211> 1743
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
gagaagagga gatgcatcta tacctcctat ttcatgggaa gacgaaccct gtttattggg 60
tgccagccaa aatgtgtgag aaccgtcatt acgagagaat gctgtgccgg cttctttggc 120
ccccaatgcc agccctgccc agggaatgcc cagaatgtct gctttggtaa tggcatctgt 180
ttggatggag tgaatggcac aggtgtgtgt gagtgtgggg agggcttcag cggcacagcc 240
tgcgagacct gcaccgaggg caagtacggc atccactgtg accaagcatg ttcttgtgtc 300
catgggagat gcaaccaagg acccttggga gatggctcct gtgactgtga tgttggctgg 360
cgaggagtgc attgtgacaa tgcaaccaca gaagacaact gcaatgggac atgccatacc 420
agcgccaact gcctcaccaa ctcagatggt acagcttcat gcaagtgtgc agcaggattc 480
caaggaaacg ggaccatctg cacagcaatc aatgcctgtg agatcagcaa tggaggttgc 540
tctgccaagg ctgactgtaa gagaaccacc ccaggaaggc gagtgtgcac gtgcaaagca 600
ggctacacgg gtgatggcat tgtgtgcctg gaaatcaacc cgtgtttgga gaaccatggt 660
ggctgtgaca agaatgcgga gtgcacacag acaggaccca accaggctgc ctgtaactgt 720
ttgccagcat acactggaga tggaaaggtc tgcacactca tcaatgtctg cttaactaaa 780
aatggcggct gtagtgaatt tgccatctgc aaccacactg ggcaagtaga aaggacttgt 840
acttgcaagc caaactacat tggagatgga tttacctgcc gcggcagcat ttatcaggag 900
cttcccaaga acccgaaaac ttcccagtat ttcttccagt tgcaggagca tttcgtgaaa 960
gatctggtcg gcccaggccc cttcactgtt tttgcacctt tatctgcagc ctttgatgag 1020
gaagctcggg ttaaagactg ggacaaatac ggtttaatgc cccaggttct tcggtaccat 1080
gtggtcgcct gccaccagct gcttctggaa aacctgaaat tgatctcaaa tgctacttcc 1140
ctccaaggag agccaatagt catctccgtc tctcagagca cggtgtatat aaacaataag 1200
gctaagatca tatccagtga tatcatcagt actaatggga ttgttcatat catagacaaa 1260
ttgctatctc ccaaaaattt gcttatcact cccaaagaca actctggaag aattctgcaa 1320
aatcttacga ctttggcaac aaacaatggc tacatcaaat ttagcaactt aatacaggac 1380
tcaggtttgc tgagtgtcat caccgatccc atccacaccc cagtcactct cttctggccc 1440
accgaccaag ccctccatgc cctacctgct gaacaacagg acttcctgtt caaccaagac 1500
aacaaggaca agctgaagga gtatttgaag tttcatgtga tacgagatgc caaggtttta 1560
gctgtggatc ttcccacatc cactgcctgg aagaccctgc aaggttcaga gctgagtgtg 1620
aaatgtggag ctggcaggga catcggtgac ctctttctga atggccaaac ctgcagaatt 1680
gtgcagcggg agctcttgtt tgacctgggt gtggcctacg gcattgactg tctgctgatt 1740
gat 1743
<210> 36
<211> 1611
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
aggtggagta aaccaaaggg tgtgaagcag aagtgtctct acaacctgcc cttcaagagg 60
aacctggaag gctgccggga gcggtgcagc ctggtgatac agatccccag gtgctgcaag 120
ggctacttcg ggcgagactg tcaggcctgc cctggaggac cagatgcccc gtgtaataac 180
cggggtgtct gccttgatca gtactcggcc accggagagt gtaaatgcaa caccggcttc 240
aatgggacgg cgtgtgagat gtgctggccg gggagattcg ggcctgattg tctgccctgt 300
ggctgctcag accacggaca gtgcgatgat ggcatcacgg gctccgggca gtgcctctgt 360
gaaacggggt ggacaggccc ctcgtgtgac actcaggcag ttttgcctgc agtgtgtacg 420
cctccttgtt ctgctcatgc cacctgtaag gagaacaaca cgtgtgagtg taacctggat 480
tatgaaggtg acggaatcac atgcacagtt gtggatttct gcaaacagga caacgggggc 540
tgtgcaaagg tggccagatg ctcccagaag ggcacgaagg tctcctgcag ctgccagaag 600
ggatacaaag gggacgggca cagctgcaca gagatagacc cctgtgcaga cggccttaac 660
ggagggtgtc acgagcacgc cacctgtaag atgacaggcc cgggcaagca caagtgtgag 720
tgtaaaagtc actatgtcgg agatgggctg aactgtgagc cggagcagct gcccattgac 780
cgctgcttac aggacaatgg gcagtgccat gcagacgcca aatgtgtcga cctccacttc 840
caggatacca ctgttggggt gttccatcta cgctccccac tgggccagta taagctgacc 900
tttgacaaag ccagagaggc ctgtgccaac gaagctgcga ccatggcaac ctacaaccag 960
ctctcctatg cccagaaggc caagtaccac ctgtgctcag caggctggct ggagaccggg 1020
cgggttgcct accccacagc cttcgcctcc cagaactgtg gctctggtgt ggttgggata 1080
gtggactatg gacctagacc caacaagagt gaaatgtggg atgtcttctg ctatcggatg 1140
aaagatgtga actgcacctg caaggtgggc tatgtgggag atggcttctc atgcagtggg 1200
aacctgctgc aggtcctgat gtccttcccc tcactcacaa acttcctgac ggaagtgctg 1260
gcctattcca acagctcagc tcgaggccgt gcatttctag aacacctgac tgacctgtcc 1320
atccgcggca ccctctttgt gccacagaac agtgggctgg gggagaatga gaccttgtct 1380
gggcgggaca tcgagcacca cctcgccaat gtcagcatgt ttttctacaa tgaccttgtc 1440
aatggcacca ccctgcaaac gaggctggga agcaagctgc tcatcactgc cagccaggac 1500
ccactccaac cgacggagac caggtttgtt gatggaagag ccattctgca gtgggacatc 1560
tttgcctcca atgggatcat tcatgtcatt tccaggcctt taaaagcacc c 1611
<210> 37
<211> 891
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
gtaggggttc gagattgcag gtacaccttt gaggtcagaa catactctct gtctctcccc 60
ggatgccgcc atatttgtag gaaggactat ctccaacctc ggtgttgtcc tggccgctgg 120
ggcccagact gtatagagtg cccaggtgga gcggggtcac cctgcaatgg cagaggcagt 180
tgtgctgaag gcatggaagg aaatggaacc tgctcctgcc aagaagggtt tggtggaaca 240
gcctgtgaaa cctgtgctga cgacaactta tttggaccca gctgttcatc agtgtgcaac 300
tgtgtgcatg gggtgtgcaa cagtggacta gatggcgatg gaacctgtga gtgctactct 360
gcgtacactg gccccaagtg tgacaagccc atccctgaat gtgcagcctt gctctgccca 420
gaaaattcca gatgttcgcc ttccactgaa gatgaaaaca aactggaatg caaatgcctt 480
cccaattacc gaggcgatgg caaatactgc gaccccatca atccatgttt acgaaaaatc 540
tgccaccctc atgctcattg tacgtacctg ggaccaaatc ggcacagttg tacatgccaa 600
gaaggctacc gtggggatgg ccaagtgtgc ttgcctgtgg acccctgcca aattaacttt 660
ggaaactgcc ctacaaagtc tacagtgtgc aaatatgatg ggcctggaca gtctcactgc 720
gagtgtaagg agcattacca gaatttcgta cctggagtgg ggtgcagtat gactgatata 780
tgtaaatcag ataacccgtg tcataggaat gcaaattgca ccaccgtcgc accaggccga 840
actgaatgca tttgccagaa aggttacgtg ggtgatggct taacgtgtta t 891
<210> 38
<211> 912
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
aactctgagc ccacagcact cttcacacac agatgtgtct acagtggcag gtttgggagc 60
ctgaagagcg gctgtgcccg gtactgcaat gccactgtga agattccaaa gtgctgcaaa 120
ggcttctatg gacctgactg caaccagtgt ccaggaggct tctcaaatcc atgctcagga 180
aatggacagt gtgcagatag cctcggcggc aacgggacat gcatttgtga ggagggcttc 240
caaggctccc agtgtcagtt ctgctctgat cccaataaat acggacctcg gtgtaacaaa 300
aaatgcctgt gcgttcacgg aacatgcaat aacaggatag acagcgatgg ggcctgcctc 360
actggcacat gcagagacgg ctctgccggg agactctgtg ataagcagac ctcagcctgt 420
gggccctacg tgcagttctg tcacatccac gccacctgtg aatacagcaa tgggacagcc 480
agttgtattt gcaaagcagg atatgaagga gatggaactc tgtgttctga gatggaccct 540
tgcacaggac taactccagg aggctgtagc cgcaatgcag aatgcatcaa aactggcacg 600
ggcacccaca cctgcgtgtg tcagcagggt tggacaggga atgggagaga ctgctcggag 660
atcaacaact gcctgctgcc cagtgcaggc ggctgccacg acaacgcatc ctgtttgtat 720
gtgggtcccg ggcagaatga gtgtgagtgc aagaaaggat ttcgaggaaa tgggattgac 780
tgtgaaccaa taacttcatg cttggaacaa accgggaaat gtcatccatt ggcaagctgt 840
caatctactt cgtctggtgt ctggagctgt gtttgtcaag agggctatga aggagatggc 900
tttctgtgct at 912
<210> 39
<211> 882
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
gagaagagga gatgcatcta tacctcctat ttcatgggaa gacgaaccct gtttattggg 60
tgccagccaa aatgtgtgag aaccgtcatt acgagagaat gctgtgccgg cttctttggc 120
ccccaatgcc agccctgccc agggaatgcc cagaatgtct gctttggtaa tggcatctgt 180
ttggatggag tgaatggcac aggtgtgtgt gagtgtgggg agggcttcag cggcacagcc 240
tgcgagacct gcaccgaggg caagtacggc atccactgtg accaagcatg ttcttgtgtc 300
catgggagat gcaaccaagg acccttggga gatggctcct gtgactgtga tgttggctgg 360
cgaggagtgc attgtgacaa tgcaaccaca gaagacaact gcaatgggac atgccatacc 420
agcgccaact gcctcaccaa ctcagatggt acagcttcat gcaagtgtgc agcaggattc 480
caaggaaacg ggaccatctg cacagcaatc aatgcctgtg agatcagcaa tggaggttgc 540
tctgccaagg ctgactgtaa gagaaccacc ccaggaaggc gagtgtgcac gtgcaaagca 600
ggctacacgg gtgatggcat tgtgtgcctg gaaatcaacc cgtgtttgga gaaccatggt 660
ggctgtgaca agaatgcgga gtgcacacag acaggaccca accaggctgc ctgtaactgt 720
ttgccagcat acactggaga tggaaaggtc tgcacactca tcaatgtctg cttaactaaa 780
aatggcggct gtagtgaatt tgccatctgc aaccacactg ggcaagtaga aaggacttgt 840
acttgcaagc caaactacat tggagatgga tttacctgcc gc 882
<210> 40
<211> 759
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
aggtggagta aaccaaaggg tgtgaagcag aagtgtctct acaacctgcc cttcaagagg 60
aacctggaag gctgccggga gcggtgcagc ctggtgatac agatccccag gtgctgcaag 120
ggctacttcg ggcgagactg tcaggcctgc cctggaggac cagatgcccc gtgtaataac 180
cggggtgtct gccttgatca gtactcggcc accggagagt gtaaatgcaa caccggcttc 240
aatgggacgg cgtgtgagat gtgctggccg gggagattcg ggcctgattg tctgccctgt 300
ggctgctcag accacggaca gtgcgatgat ggcatcacgg gctccgggca gtgcctctgt 360
gaaacggggt ggacaggccc ctcgtgtgac actcaggcag ttttgcctgc agtgtgtacg 420
cctccttgtt ctgctcatgc cacctgtaag gagaacaaca cgtgtgagtg taacctggat 480
tatgaaggtg acggaatcac atgcacagtt gtggatttct gcaaacagga caacgggggc 540
tgtgcaaagg tggccagatg ctcccagaag ggcacgaagg tctcctgcag ctgccagaag 600
ggatacaaag gggacgggca cagctgcaca gagatagacc cctgtgcaga cggccttaac 660
ggagggtgtc acgagcacgc cacctgtaag atgacaggcc cgggcaagca caagtgtgag 720
tgtaaaagtc actatgtcgg agatgggctg aactgtgag 759
<210> 41
<211> 153
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
caacctcggt gttgtcctgg ccgctggggc ccagactgta tagagtgccc aggtggagcg 60
gggtcaccct gcaatggcag aggcagttgt gctgaaggca tggaaggaaa tggaacctgc 120
tcctgccaag aagggtttgg tggaacagcc tgt 153
<210> 42
<211> 141
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
gaaacctgtg ctgacgacaa cttatttgga cccagctgtt catcagtgtg caactgtgtg 60
catggggtgt gcaacagtgg actagatggc gatggaacct gtgagtgcta ctctgcgtac 120
actggcccca agtgtgacaa g 141
<210> 43
<211> 126
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
cccatccctg aatgtgcagc cttgctctgc ccagaaaatt ccagatgttc gccttccact 60
gaagatgaaa acaaactgga atgcaaatgc cttcccaatt accgaggcga tggcaaatac 120
tgcgac 126
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
cccatcaatc catgtttacg aaaaatctgc caccctcatg ctcattgtac gtacctggga 60
ccaaatcggc acagttgtac atgccaagaa ggctaccgtg gggatggcca agtgtgcttg 120
120
<210> 45
<211> 135
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
cctgtggacc cctgccaaat taactttgga aactgcccta caaagtctac agtgtgcaaa 60
tatgatgggc ctggacagtc tcactgcgag tgtaaggagc attaccagaa tttcgtacct 120
ggagtggggt gcagt 135
<210> 46
<211> 123
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
atgactgata tatgtaaatc agataacccg tgtcatagga atgcaaattg caccaccgtc 60
gcaccaggcc gaactgaatg catttgccag aaaggttacg tgggtgatgg cttaacgtgt 120
tat 123
<210> 47
<211> 153
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
attccaaagt gctgcaaagg cttctatgga cctgactgca accagtgtcc aggaggcttc 60
tcaaatccat gctcaggaaa tggacagtgt gcagatagcc tcggcggcaa cgggacatgc 120
atttgtgagg agggcttcca aggctcccag tgt 153
<210> 48
<211> 150
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
cagttctgct ctgatcccaa taaatacgga cctcggtgta acaaaaaatg cctgtgcgtt 60
cacggaacat gcaataacag gatagacagc gatggggcct gcctcactgg cacatgcaga 120
gacggctctg ccgggagact ctgtgataag 150
<210> 49
<211> 123
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
cagacctcag cctgtgggcc ctacgtgcag ttctgtcaca tccacgccac ctgtgaatac 60
agcaatggga cagccagttg tatttgcaaa gcaggatatg aaggagatgg aactctgtgt 120
tct 123
<210> 50
<211> 129
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
gagatggacc cttgcacagg actaactcca ggaggctgta gccgcaatgc agaatgcatc 60
aaaactggca cgggcaccca cacctgcgtg tgtcagcagg gttggacagg gaatgggaga 120
gactgctcg 129
<210> 51
<211> 129
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
gagatcaaca actgcctgct gcccagtgca ggcggctgcc acgacaacgc atcctgtttg 60
tatgtgggtc ccgggcagaa tgagtgtgag tgcaagaaag gatttcgagg aaatgggatt 120
gactgtgaa 129
<210> 52
<211> 126
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
ccaataactt catgcttgga acaaaccggg aaatgtcatc cattggcaag ctgtcaatct 60
acttcgtctg gtgtctggag ctgtgtttgt caagagggct atgaaggaga tggctttctg 120
tgctat 126
<210> 53
<211> 153
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
acgagagaat gctgtgccgg cttctttggc ccccaatgcc agccctgccc agggaatgcc 60
cagaatgtct gctttggtaa tggcatctgt ttggatggag tgaatggcac aggtgtgtgt 120
gagtgtgggg agggcttcag cggcacagcc tgc 153
<210> 54
<211> 144
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
gagacctgca ccgagggcaa gtacggcatc cactgtgacc aagcatgttc ttgtgtccat 60
gggagatgca accaaggacc cttgggagat ggctcctgtg actgtgatgt tggctggcga 120
ggagtgcatt gtgacaatgc aacc 144
<210> 55
<211> 117
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
acagaagaca actgcaatgg gacatgccat accagcgcca actgcctcac caactcagat 60
ggtacagctt catgcaagtg tgcagcagga ttccaaggaa acgggaccat ctgcaca 117
<210> 56
<211> 126
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
gcaatcaatg cctgtgagat cagcaatgga ggttgctctg ccaaggctga ctgtaagaga 60
accaccccag gaaggcgagt gtgcacgtgc aaagcaggct acacgggtga tggcattgtg 120
tgcctg 126
<210> 57
<211> 126
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
gaaatcaacc cgtgtttgga gaaccatggt ggctgtgaca agaatgcgga gtgcacacag 60
acaggaccca accaggctgc ctgtaactgt ttgccagcat acactggaga tggaaaggtc 120
tgcaca 126
<210> 58
<211> 126
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
ctcatcaatg tctgcttaac taaaaatggc ggctgtagtg aatttgccat ctgcaaccac 60
actgggcaag tagaaaggac ttgtacttgc aagccaaact acattggaga tggatttacc 120
tgccgc 126
<210> 59
<211> 153
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
atccccaggt gctgcaaggg ctacttcggg cgagactgtc aggcctgccc tggaggacca 60
gatgccccgt gtaataaccg gggtgtctgc cttgatcagt actcggccac cggagagtgt 120
aaatgcaaca ccggcttcaa tgggacggcg tgt 153
<210> 60
<211> 147
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
gagatgtgct ggccggggag attcgggcct gattgtctgc cctgtggctg ctcagaccac 60
ggacagtgcg atgatggcat cacgggctcc gggcagtgcc tctgtgaaac ggggtggaca 120
ggcccctcgt gtgacactca ggcagtt 147
<210> 61
<211> 105
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
ttgcctgcag tgtgtacgcc tccttgttct gctcatgcca cctgtaagga gaacaacacg 60
tgtgagtgta acctggatta tgaaggtgac ggaatcacat gcaca 105
<210> 62
<211> 123
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 62
gttgtggatt tctgcaaaca ggacaacggg ggctgtgcaa aggtggccag atgctcccag 60
aagggcacga aggtctcctg cagctgccag aagggataca aaggggacgg gcacagctgc 120
aca 123
<210> 63
<211> 129
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
gagatagacc cctgtgcaga cggccttaac ggagggtgtc acgagcacgc cacctgtaag 60
atgacaggcc cgggcaagca caagtgtgag tgtaaaagtc actatgtcgg agatgggctg 120
aactgtgag 129
<210> 64
<211> 540
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 64
caacctcggt gttgtcctgg ccgctggggc ccagactgta tagagtgccc aggtggagcg 60
gggtcaccct gcaatggcag aggcagttgt gctgaaggca tggaaggaaa tggaacctgc 120
tcctgccaag aagggtttgg tggaacagcc tgtgaaacct gtgctgacga caacttattt 180
ggacccagct gttcatcagt gtgcaactgt gtgcatgggg tgtgcaacag tggactagat 240
ggcgatggaa cctgtgagtg ctactctgcg tacactggcc ccaagtgtga caagcccatc 300
cctgaatgtg cagccttgct ctgcccagaa aattccagat gttcgccttc cactgaagat 360
gaaaacaaac tggaatgcaa atgccttccc aattaccgag gcgatggcaa atactgcgac 420
cccatcaatc catgtttacg aaaaatctgc caccctcatg ctcattgtac gtacctggga 480
ccaaatcggc acagttgtac atgccaagaa ggctaccgtg gggatggcca agtgtgcttg 540
540
<210> 65
<211> 675
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
caacctcggt gttgtcctgg ccgctggggc ccagactgta tagagtgccc aggtggagcg 60
gggtcaccct gcaatggcag aggcagttgt gctgaaggca tggaaggaaa tggaacctgc 120
tcctgccaag aagggtttgg tggaacagcc tgtgaaacct gtgctgacga caacttattt 180
ggacccagct gttcatcagt gtgcaactgt gtgcatgggg tgtgcaacag tggactagat 240
ggcgatggaa cctgtgagtg ctactctgcg tacactggcc ccaagtgtga caagcccatc 300
cctgaatgtg cagccttgct ctgcccagaa aattccagat gttcgccttc cactgaagat 360
gaaaacaaac tggaatgcaa atgccttccc aattaccgag gcgatggcaa atactgcgac 420
cccatcaatc catgtttacg aaaaatctgc caccctcatg ctcattgtac gtacctggga 480
ccaaatcggc acagttgtac atgccaagaa ggctaccgtg gggatggcca agtgtgcttg 540
cctgtggacc cctgccaaat taactttgga aactgcccta caaagtctac agtgtgcaaa 600
tatgatgggc ctggacagtc tcactgcgag tgtaaggagc attaccagaa tttcgtacct 660
ggagtggggt gcagt 675
<210> 66
<211> 522
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
gaaacctgtg ctgacgacaa cttatttgga cccagctgtt catcagtgtg caactgtgtg 60
catggggtgt gcaacagtgg actagatggc gatggaacct gtgagtgcta ctctgcgtac 120
actggcccca agtgtgacaa gcccatccct gaatgtgcag ccttgctctg cccagaaaat 180
tccagatgtt cgccttccac tgaagatgaa aacaaactgg aatgcaaatg ccttcccaat 240
taccgaggcg atggcaaata ctgcgacccc atcaatccat gtttacgaaa aatctgccac 300
cctcatgctc attgtacgta cctgggacca aatcggcaca gttgtacatg ccaagaaggc 360
taccgtgggg atggccaagt gtgcttgcct gtggacccct gccaaattaa ctttggaaac 420
tgccctacaa agtctacagt gtgcaaatat gatgggcctg gacagtctca ctgcgagtgt 480
aaggagcatt accagaattt cgtacctgga gtggggtgca gt 522
<210> 67
<211> 555
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 67
attccaaagt gctgcaaagg cttctatgga cctgactgca accagtgtcc aggaggcttc 60
tcaaatccat gctcaggaaa tggacagtgt gcagatagcc tcggcggcaa cgggacatgc 120
atttgtgagg agggcttcca aggctcccag tgtcagttct gctctgatcc caataaatac 180
ggacctcggt gtaacaaaaa atgcctgtgc gttcacggaa catgcaataa caggatagac 240
agcgatgggg cctgcctcac tggcacatgc agagacggct ctgccgggag actctgtgat 300
aagcagacct cagcctgtgg gccctacgtg cagttctgtc acatccacgc cacctgtgaa 360
tacagcaatg ggacagccag ttgtatttgc aaagcaggat atgaaggaga tggaactctg 420
tgttctgaga tggacccttg cacaggacta actccaggag gctgtagccg caatgcagaa 480
tgcatcaaaa ctggcacggg cacccacacc tgcgtgtgtc agcagggttg gacagggaat 540
gggagagact gctcg 555
<210> 68
<211> 684
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 68
attccaaagt gctgcaaagg cttctatgga cctgactgca accagtgtcc aggaggcttc 60
tcaaatccat gctcaggaaa tggacagtgt gcagatagcc tcggcggcaa cgggacatgc 120
atttgtgagg agggcttcca aggctcccag tgtcagttct gctctgatcc caataaatac 180
ggacctcggt gtaacaaaaa atgcctgtgc gttcacggaa catgcaataa caggatagac 240
agcgatgggg cctgcctcac tggcacatgc agagacggct ctgccgggag actctgtgat 300
aagcagacct cagcctgtgg gccctacgtg cagttctgtc acatccacgc cacctgtgaa 360
tacagcaatg ggacagccag ttgtatttgc aaagcaggat atgaaggaga tggaactctg 420
tgttctgaga tggacccttg cacaggacta actccaggag gctgtagccg caatgcagaa 480
tgcatcaaaa ctggcacggg cacccacacc tgcgtgtgtc agcagggttg gacagggaat 540
gggagagact gctcggagat caacaactgc ctgctgccca gtgcaggcgg ctgccacgac 600
aacgcatcct gtttgtatgt gggtcccggg cagaatgagt gtgagtgcaa gaaaggattt 660
cgaggaaatg ggattgactg tgaa 684
<210> 69
<211> 531
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 69
cagttctgct ctgatcccaa taaatacgga cctcggtgta acaaaaaatg cctgtgcgtt 60
cacggaacat gcaataacag gatagacagc gatggggcct gcctcactgg cacatgcaga 120
gacggctctg ccgggagact ctgtgataag cagacctcag cctgtgggcc ctacgtgcag 180
ttctgtcaca tccacgccac ctgtgaatac agcaatggga cagccagttg tatttgcaaa 240
gcaggatatg aaggagatgg aactctgtgt tctgagatgg acccttgcac aggactaact 300
ccaggaggct gtagccgcaa tgcagaatgc atcaaaactg gcacgggcac ccacacctgc 360
gtgtgtcagc agggttggac agggaatggg agagactgct cggagatcaa caactgcctg 420
ctgcccagtg caggcggctg ccacgacaac gcatcctgtt tgtatgtggg tcccgggcag 480
aatgagtgtg agtgcaagaa aggatttcga ggaaatggga ttgactgtga a 531
<210> 70
<211> 540
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 70
acgagagaat gctgtgccgg cttctttggc ccccaatgcc agccctgccc agggaatgcc 60
cagaatgtct gctttggtaa tggcatctgt ttggatggag tgaatggcac aggtgtgtgt 120
gagtgtgggg agggcttcag cggcacagcc tgcgagacct gcaccgaggg caagtacggc 180
atccactgtg accaagcatg ttcttgtgtc catgggagat gcaaccaagg acccttggga 240
gatggctcct gtgactgtga tgttggctgg cgaggagtgc attgtgacaa tgcaaccaca 300
gaagacaact gcaatgggac atgccatacc agcgccaact gcctcaccaa ctcagatggt 360
acagcttcat gcaagtgtgc agcaggattc caaggaaacg ggaccatctg cacagcaatc 420
aatgcctgtg agatcagcaa tggaggttgc tctgccaagg ctgactgtaa gagaaccacc 480
ccaggaaggc gagtgtgcac gtgcaaagca ggctacacgg gtgatggcat tgtgtgcctg 540
540
<210> 71
<211> 666
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 71
acgagagaat gctgtgccgg cttctttggc ccccaatgcc agccctgccc agggaatgcc 60
cagaatgtct gctttggtaa tggcatctgt ttggatggag tgaatggcac aggtgtgtgt 120
gagtgtgggg agggcttcag cggcacagcc tgcgagacct gcaccgaggg caagtacggc 180
atccactgtg accaagcatg ttcttgtgtc catgggagat gcaaccaagg acccttggga 240
gatggctcct gtgactgtga tgttggctgg cgaggagtgc attgtgacaa tgcaaccaca 300
gaagacaact gcaatgggac atgccatacc agcgccaact gcctcaccaa ctcagatggt 360
acagcttcat gcaagtgtgc agcaggattc caaggaaacg ggaccatctg cacagcaatc 420
aatgcctgtg agatcagcaa tggaggttgc tctgccaagg ctgactgtaa gagaaccacc 480
ccaggaaggc gagtgtgcac gtgcaaagca ggctacacgg gtgatggcat tgtgtgcctg 540
gaaatcaacc cgtgtttgga gaaccatggt ggctgtgaca agaatgcgga gtgcacacag 600
acaggaccca accaggctgc ctgtaactgt ttgccagcat acactggaga tggaaaggtc 660
tgcaca 666
<210> 72
<211> 513
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 72
gagacctgca ccgagggcaa gtacggcatc cactgtgacc aagcatgttc ttgtgtccat 60
gggagatgca accaaggacc cttgggagat ggctcctgtg actgtgatgt tggctggcga 120
ggagtgcatt gtgacaatgc aaccacagaa gacaactgca atgggacatg ccataccagc 180
gccaactgcc tcaccaactc agatggtaca gcttcatgca agtgtgcagc aggattccaa 240
ggaaacggga ccatctgcac agcaatcaat gcctgtgaga tcagcaatgg aggttgctct 300
gccaaggctg actgtaagag aaccacccca ggaaggcgag tgtgcacgtg caaagcaggc 360
tacacgggtg atggcattgt gtgcctggaa atcaacccgt gtttggagaa ccatggtggc 420
tgtgacaaga atgcggagtg cacacagaca ggacccaacc aggctgcctg taactgtttg 480
ccagcataca ctggagatgg aaaggtctgc aca 513
<210> 73
<211> 528
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 73
atccccaggt gctgcaaggg ctacttcggg cgagactgtc aggcctgccc tggaggacca 60
gatgccccgt gtaataaccg gggtgtctgc cttgatcagt actcggccac cggagagtgt 120
aaatgcaaca ccggcttcaa tgggacggcg tgtgagatgt gctggccggg gagattcggg 180
cctgattgtc tgccctgtgg ctgctcagac cacggacagt gcgatgatgg catcacgggc 240
tccgggcagt gcctctgtga aacggggtgg acaggcccct cgtgtgacac tcaggcagtt 300
ttgcctgcag tgtgtacgcc tccttgttct gctcatgcca cctgtaagga gaacaacacg 360
tgtgagtgta acctggatta tgaaggtgac ggaatcacat gcacagttgt ggatttctgc 420
aaacaggaca acgggggctg tgcaaaggtg gccagatgct cccagaaggg cacgaaggtc 480
tcctgcagct gccagaaggg atacaaaggg gacgggcaca gctgcaca 528
<210> 74
<211> 504
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 74
gagatgtgct ggccggggag attcgggcct gattgtctgc cctgtggctg ctcagaccac 60
ggacagtgcg atgatggcat cacgggctcc gggcagtgcc tctgtgaaac ggggtggaca 120
ggcccctcgt gtgacactca ggcagttttg cctgcagtgt gtacgcctcc ttgttctgct 180
catgccacct gtaaggagaa caacacgtgt gagtgtaacc tggattatga aggtgacgga 240
atcacatgca cagttgtgga tttctgcaaa caggacaacg ggggctgtgc aaaggtggcc 300
agatgctccc agaagggcac gaaggtctcc tgcagctgcc agaagggata caaaggggac 360
gggcacagct gcacagagat agacccctgt gcagacggcc ttaacggagg gtgtcacgag 420
cacgccacct gtaagatgac aggcccgggc aagcacaagt gtgagtgtaa aagtcactat 480
gtcggagatg ggctgaactg tgag 504
<210> 75
<211> 590
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Val Gly Val Arg Asp Cys Arg Tyr Thr Phe Glu Val Arg Thr Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Gly Cys Arg His Ile Cys Arg Lys Asp Tyr Leu Gln
20 25 30
Pro Arg Cys Cys Pro Gly Arg Trp Gly Pro Asp Cys Ile Glu Cys Pro
35 40 45
Gly Gly Ala Gly Ser Pro Cys Asn Gly Arg Gly Ser Cys Ala Glu Gly
50 55 60
Met Glu Gly Asn Gly Thr Cys Ser Cys Gln Glu Gly Phe Gly Gly Thr
65 70 75 80
Ala Cys Glu Thr Cys Ala Asp Asp Asn Leu Phe Gly Pro Ser Cys Ser
85 90 95
Ser Val Cys Asn Cys Val His Gly Val Cys Asn Ser Gly Leu Asp Gly
100 105 110
Asp Gly Thr Cys Glu Cys Tyr Ser Ala Tyr Thr Gly Pro Lys Cys Asp
115 120 125
Lys Pro Ile Pro Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Pro Glu Asn Ser Arg
130 135 140
Cys Ser Pro Ser Thr Glu Asp Glu Asn Lys Leu Glu Cys Lys Cys Leu
145 150 155 160
Pro Asn Tyr Arg Gly Asp Gly Lys Tyr Cys Asp Pro Ile Asn Pro Cys
165 170 175
Leu Arg Lys Ile Cys His Pro His Ala His Cys Thr Tyr Leu Gly Pro
180 185 190
Asn Arg His Ser Cys Thr Cys Gln Glu Gly Tyr Arg Gly Asp Gly Gln
195 200 205
Val Cys Leu Pro Val Asp Pro Cys Gln Ile Asn Phe Gly Asn Cys Pro
210 215 220
Thr Lys Ser Thr Val Cys Lys Tyr Asp Gly Pro Gly Gln Ser His Cys
225 230 235 240
Glu Cys Lys Glu His Tyr Gln Asn Phe Val Pro Gly Val Gly Cys Ser
245 250 255
Met Thr Asp Ile Cys Lys Ser Asp Asn Pro Cys His Arg Asn Ala Asn
260 265 270
Cys Thr Thr Val Ala Pro Gly Arg Thr Glu Cys Ile Cys Gln Lys Gly
275 280 285
Tyr Val Gly Asp Gly Leu Thr Cys Tyr Gly Asn Ile Met Glu Arg Leu
290 295 300
Arg Glu Leu Asn Thr Glu Pro Arg Gly Lys Trp Gln Gly Arg Leu Thr
305 310 315 320
Ser Phe Ile Ser Leu Leu Asp Lys Ala Tyr Ala Trp Pro Leu Ser Lys
325 330 335
Leu Gly Pro Phe Thr Val Leu Leu Pro Thr Asp Lys Gly Leu Lys Gly
340 345 350
Phe Asn Val Asn Glu Leu Leu Val Asp Asn Lys Ala Ala Gln Tyr Phe
355 360 365
Val Lys Leu His Ile Ile Ala Gly Gln Met Asn Ile Glu Tyr Met Asn
370 375 380
Asn Thr Asp Met Phe Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Ser Gly Glu Ile Phe
385 390 395 400
Asn Ser Asp Lys Asp Asn Gln Ile Lys Leu Lys Leu His Gly Gly Lys
405 410 415
Lys Lys Val Lys Ile Ile Gln Gly Asp Ile Ile Ala Ser Asn Gly Leu
420 425 430
Leu His Ile Leu Asp Arg Ala Met Asp Lys Leu Glu Pro Thr Phe Glu
435 440 445
Ser Asn Asn Glu Gln Thr Ile Met Thr Met Leu Gln Pro Arg Tyr Ser
450 455 460
Lys Phe Arg Ser Leu Leu Glu Glu Thr Asn Leu Gly His Ala Leu Asp
465 470 475 480
Glu Asp Gly Val Gly Gly Pro Tyr Thr Ile Phe Val Pro Asn Asn Glu
485 490 495
Ala Leu Asn Asn Met Lys Asp Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Leu Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Ser Arg Lys Leu Leu Glu Leu Val Arg Tyr His Ile Val Pro
515 520 525
Phe Thr Gln Leu Glu Val Ala Thr Leu Ile Ser Thr Pro His Ile Arg
530 535 540
Ser Met Ala Asn Gln Leu Ile Gln Phe Asn Thr Thr Asp Asn Gly Gln
545 550 555 560
Ile Leu Ala Asn Asp Val Ala Met Glu Glu Ile Glu Ile Thr Ala Lys
565 570 575
Asn Gly Arg Ile Tyr Thr Leu Thr Gly Val Leu Ile Pro Pro
580 585 590
<210> 76
<211> 578
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Asn Ser Glu Pro Thr Ala Leu Phe Thr His Arg Cys Val Tyr Ser Gly
1 5 10 15
Arg Phe Gly Ser Leu Lys Ser Gly Cys Ala Arg Tyr Cys Asn Ala Thr
20 25 30
Val Lys Ile Pro Lys Cys Cys Lys Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Asn
35 40 45
Gln Cys Pro Gly Gly Phe Ser Asn Pro Cys Ser Gly Asn Gly Gln Cys
50 55 60
Ala Asp Ser Leu Gly Gly Asn Gly Thr Cys Ile Cys Glu Glu Gly Phe
65 70 75 80
Gln Gly Ser Gln Cys Gln Phe Cys Ser Asp Pro Asn Lys Tyr Gly Pro
85 90 95
Arg Cys Asn Lys Lys Cys Leu Cys Val His Gly Thr Cys Asn Asn Arg
100 105 110
Ile Asp Ser Asp Gly Ala Cys Leu Thr Gly Thr Cys Arg Asp Gly Ser
115 120 125
Ala Gly Arg Leu Cys Asp Lys Gln Thr Ser Ala Cys Gly Pro Tyr Val
130 135 140
Gln Phe Cys His Ile His Ala Thr Cys Glu Tyr Ser Asn Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ser Cys Ile Cys Lys Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Thr Leu Cys Ser
165 170 175
Glu Met Asp Pro Cys Thr Gly Leu Thr Pro Gly Gly Cys Ser Arg Asn
180 185 190
Ala Glu Cys Ile Lys Thr Gly Thr Gly Thr His Thr Cys Val Cys Gln
195 200 205
Gln Gly Trp Thr Gly Asn Gly Arg Asp Cys Ser Glu Ile Asn Asn Cys
210 215 220
Leu Leu Pro Ser Ala Gly Gly Cys His Asp Asn Ala Ser Cys Leu Tyr
225 230 235 240
Val Gly Pro Gly Gln Asn Glu Cys Glu Cys Lys Lys Gly Phe Arg Gly
245 250 255
Asn Gly Ile Asp Cys Glu Pro Ile Thr Ser Cys Leu Glu Gln Thr Gly
260 265 270
Lys Cys His Pro Leu Ala Ser Cys Gln Ser Thr Ser Ser Gly Val Trp
275 280 285
Ser Cys Val Cys Gln Glu Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Phe Leu Cys Tyr
290 295 300
Gly Asn Ala Ala Val Glu Leu Ser Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ile Phe
305 310 315 320
Asn Arg Trp Ile Asn Asn Ala Ser Leu Gln Pro Thr Leu Ser Ala Thr
325 330 335
Ser Asn Leu Thr Val Leu Val Pro Ser Gln Gln Ala Thr Glu Asp Met
340 345 350
Asp Gln Asp Glu Lys Ser Phe Trp Leu Ser Gln Ser Asn Ile Pro Ala
355 360 365
Leu Ile Lys Tyr His Met Leu Leu Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asp Leu
370 375 380
Gln Thr Leu Ser Ser Ser Asp Met Leu Ala Thr Ser Leu Gln Gly Asn
385 390 395 400
Phe Leu His Leu Ala Lys Val Asp Gly Asn Ile Thr Ile Glu Gly Ala
405 410 415
Ser Ile Val Asp Gly Asp Asn Ala Ala Thr Asn Gly Val Ile His Ile
420 425 430
Ile Asn Lys Val Leu Val Pro Gln Arg Arg Leu Thr Gly Ser Leu Pro
435 440 445
Asn Leu Leu Met Arg Leu Glu Gln Met Pro Asp Tyr Ser Ile Phe Arg
450 455 460
Gly Tyr Ile Ile Gln Tyr Asn Leu Ala Asn Ala Ile Glu Ala Ala Asp
465 470 475 480
Ala Tyr Thr Val Phe Ala Pro Asn Asn Asn Ala Ile Glu Asn Tyr Ile
485 490 495
Arg Glu Lys Lys Val Leu Ser Leu Glu Glu Asp Val Leu Arg Tyr His
500 505 510
Val Val Leu Glu Glu Lys Leu Leu Lys Asn Asp Leu His Asn Gly Met
515 520 525
His Arg Glu Thr Met Leu Gly Phe Ser Tyr Phe Leu Ser Phe Phe Leu
530 535 540
His Asn Asp Gln Leu Tyr Val Asn Glu Ala Pro Ile Asn Tyr Thr Asn
545 550 555 560
Val Ala Thr Asp Lys Gly Val Ile His Gly Leu Gly Lys Val Leu Glu
565 570 575
Ile Gln
<210> 77
<211> 581
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Glu Lys Arg Arg Cys Ile Tyr Thr Ser Tyr Phe Met Gly Arg Arg Thr
1 5 10 15
Leu Phe Ile Gly Cys Gln Pro Lys Cys Val Arg Thr Val Ile Thr Arg
20 25 30
Glu Cys Cys Ala Gly Phe Phe Gly Pro Gln Cys Gln Pro Cys Pro Gly
35 40 45
Asn Ala Gln Asn Val Cys Phe Gly Asn Gly Ile Cys Leu Asp Gly Val
50 55 60
Asn Gly Thr Gly Val Cys Glu Cys Gly Glu Gly Phe Ser Gly Thr Ala
65 70 75 80
Cys Glu Thr Cys Thr Glu Gly Lys Tyr Gly Ile His Cys Asp Gln Ala
85 90 95
Cys Ser Cys Val His Gly Arg Cys Asn Gln Gly Pro Leu Gly Asp Gly
100 105 110
Ser Cys Asp Cys Asp Val Gly Trp Arg Gly Val His Cys Asp Asn Ala
115 120 125
Thr Thr Glu Asp Asn Cys Asn Gly Thr Cys His Thr Ser Ala Asn Cys
130 135 140
Leu Thr Asn Ser Asp Gly Thr Ala Ser Cys Lys Cys Ala Ala Gly Phe
145 150 155 160
Gln Gly Asn Gly Thr Ile Cys Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu Ile Ser
165 170 175
Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys Ala Asp Cys Lys Arg Thr Thr Pro Gly
180 185 190
Arg Arg Val Cys Thr Cys Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Asp Gly Ile Val
195 200 205
Cys Leu Glu Ile Asn Pro Cys Leu Glu Asn His Gly Gly Cys Asp Lys
210 215 220
Asn Ala Glu Cys Thr Gln Thr Gly Pro Asn Gln Ala Ala Cys Asn Cys
225 230 235 240
Leu Pro Ala Tyr Thr Gly Asp Gly Lys Val Cys Thr Leu Ile Asn Val
245 250 255
Cys Leu Thr Lys Asn Gly Gly Cys Ser Glu Phe Ala Ile Cys Asn His
260 265 270
Thr Gly Gln Val Glu Arg Thr Cys Thr Cys Lys Pro Asn Tyr Ile Gly
275 280 285
Asp Gly Phe Thr Cys Arg Gly Ser Ile Tyr Gln Glu Leu Pro Lys Asn
290 295 300
Pro Lys Thr Ser Gln Tyr Phe Phe Gln Leu Gln Glu His Phe Val Lys
305 310 315 320
Asp Leu Val Gly Pro Gly Pro Phe Thr Val Phe Ala Pro Leu Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Asp Glu Glu Ala Arg Val Lys Asp Trp Asp Lys Tyr Gly Leu
340 345 350
Met Pro Gln Val Leu Arg Tyr His Val Val Ala Cys His Gln Leu Leu
355 360 365
Leu Glu Asn Leu Lys Leu Ile Ser Asn Ala Thr Ser Leu Gln Gly Glu
370 375 380
Pro Ile Val Ile Ser Val Ser Gln Ser Thr Val Tyr Ile Asn Asn Lys
385 390 395 400
Ala Lys Ile Ile Ser Ser Asp Ile Ile Ser Thr Asn Gly Ile Val His
405 410 415
Ile Ile Asp Lys Leu Leu Ser Pro Lys Asn Leu Leu Ile Thr Pro Lys
420 425 430
Asp Asn Ser Gly Arg Ile Leu Gln Asn Leu Thr Thr Leu Ala Thr Asn
435 440 445
Asn Gly Tyr Ile Lys Phe Ser Asn Leu Ile Gln Asp Ser Gly Leu Leu
450 455 460
Ser Val Ile Thr Asp Pro Ile His Thr Pro Val Thr Leu Phe Trp Pro
465 470 475 480
Thr Asp Gln Ala Leu His Ala Leu Pro Ala Glu Gln Gln Asp Phe Leu
485 490 495
Phe Asn Gln Asp Asn Lys Asp Lys Leu Lys Glu Tyr Leu Lys Phe His
500 505 510
Val Ile Arg Asp Ala Lys Val Leu Ala Val Asp Leu Pro Thr Ser Thr
515 520 525
Ala Trp Lys Thr Leu Gln Gly Ser Glu Leu Ser Val Lys Cys Gly Ala
530 535 540
Gly Arg Asp Ile Gly Asp Leu Phe Leu Asn Gly Gln Thr Cys Arg Ile
545 550 555 560
Val Gln Arg Glu Leu Leu Phe Asp Leu Gly Val Ala Tyr Gly Ile Asp
565 570 575
Cys Leu Leu Ile Asp
580
<210> 78
<211> 537
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Arg Trp Ser Lys Pro Lys Gly Val Lys Gln Lys Cys Leu Tyr Asn Leu
1 5 10 15
Pro Phe Lys Arg Asn Leu Glu Gly Cys Arg Glu Arg Cys Ser Leu Val
20 25 30
Ile Gln Ile Pro Arg Cys Cys Lys Gly Tyr Phe Gly Arg Asp Cys Gln
35 40 45
Ala Cys Pro Gly Gly Pro Asp Ala Pro Cys Asn Asn Arg Gly Val Cys
50 55 60
Leu Asp Gln Tyr Ser Ala Thr Gly Glu Cys Lys Cys Asn Thr Gly Phe
65 70 75 80
Asn Gly Thr Ala Cys Glu Met Cys Trp Pro Gly Arg Phe Gly Pro Asp
85 90 95
Cys Leu Pro Cys Gly Cys Ser Asp His Gly Gln Cys Asp Asp Gly Ile
100 105 110
Thr Gly Ser Gly Gln Cys Leu Cys Glu Thr Gly Trp Thr Gly Pro Ser
115 120 125
Cys Asp Thr Gln Ala Val Leu Pro Ala Val Cys Thr Pro Pro Cys Ser
130 135 140
Ala His Ala Thr Cys Lys Glu Asn Asn Thr Cys Glu Cys Asn Leu Asp
145 150 155 160
Tyr Glu Gly Asp Gly Ile Thr Cys Thr Val Val Asp Phe Cys Lys Gln
165 170 175
Asp Asn Gly Gly Cys Ala Lys Val Ala Arg Cys Ser Gln Lys Gly Thr
180 185 190
Lys Val Ser Cys Ser Cys Gln Lys Gly Tyr Lys Gly Asp Gly His Ser
195 200 205
Cys Thr Glu Ile Asp Pro Cys Ala Asp Gly Leu Asn Gly Gly Cys His
210 215 220
Glu His Ala Thr Cys Lys Met Thr Gly Pro Gly Lys His Lys Cys Glu
225 230 235 240
Cys Lys Ser His Tyr Val Gly Asp Gly Leu Asn Cys Glu Pro Glu Gln
245 250 255
Leu Pro Ile Asp Arg Cys Leu Gln Asp Asn Gly Gln Cys His Ala Asp
260 265 270
Ala Lys Cys Val Asp Leu His Phe Gln Asp Thr Thr Val Gly Val Phe
275 280 285
His Leu Arg Ser Pro Leu Gly Gln Tyr Lys Leu Thr Phe Asp Lys Ala
290 295 300
Arg Glu Ala Cys Ala Asn Glu Ala Ala Thr Met Ala Thr Tyr Asn Gln
305 310 315 320
Leu Ser Tyr Ala Gln Lys Ala Lys Tyr His Leu Cys Ser Ala Gly Trp
325 330 335
Leu Glu Thr Gly Arg Val Ala Tyr Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gln Asn
340 345 350
Cys Gly Ser Gly Val Val Gly Ile Val Asp Tyr Gly Pro Arg Pro Asn
355 360 365
Lys Ser Glu Met Trp Asp Val Phe Cys Tyr Arg Met Lys Asp Val Asn
370 375 380
Cys Thr Cys Lys Val Gly Tyr Val Gly Asp Gly Phe Ser Cys Ser Gly
385 390 395 400
Asn Leu Leu Gln Val Leu Met Ser Phe Pro Ser Leu Thr Asn Phe Leu
405 410 415
Thr Glu Val Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Arg Gly Arg Ala Phe
420 425 430
Leu Glu His Leu Thr Asp Leu Ser Ile Arg Gly Thr Leu Phe Val Pro
435 440 445
Gln Asn Ser Gly Leu Gly Glu Asn Glu Thr Leu Ser Gly Arg Asp Ile
450 455 460
Glu His His Leu Ala Asn Val Ser Met Phe Phe Tyr Asn Asp Leu Val
465 470 475 480
Asn Gly Thr Thr Leu Gln Thr Arg Leu Gly Ser Lys Leu Leu Ile Thr
485 490 495
Ala Ser Gln Asp Pro Leu Gln Pro Thr Glu Thr Arg Phe Val Asp Gly
500 505 510
Arg Ala Ile Leu Gln Trp Asp Ile Phe Ala Ser Asn Gly Ile Ile His
515 520 525
Val Ile Ser Arg Pro Leu Lys Ala Pro
530 535
<210> 79
<211> 266
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Gln Pro Arg Cys Cys Pro Gly Arg Trp Gly Pro Asp Cys Ile Glu Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ala Gly Ser Pro Cys Asn Gly Arg Gly Ser Cys Ala Glu
20 25 30
Gly Met Glu Gly Asn Gly Thr Cys Ser Cys Gln Glu Gly Phe Gly Gly
35 40 45
Thr Ala Cys Glu Thr Cys Ala Asp Asp Asn Leu Phe Gly Pro Ser Cys
50 55 60
Ser Ser Val Cys Asn Cys Val His Gly Val Cys Asn Ser Gly Leu Asp
65 70 75 80
Gly Asp Gly Thr Cys Glu Cys Tyr Ser Ala Tyr Thr Gly Pro Lys Cys
85 90 95
Asp Lys Pro Ile Pro Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Pro Glu Asn Ser
100 105 110
Arg Cys Ser Pro Ser Thr Glu Asp Glu Asn Lys Leu Glu Cys Lys Cys
115 120 125
Leu Pro Asn Tyr Arg Gly Asp Gly Lys Tyr Cys Asp Pro Ile Asn Pro
130 135 140
Cys Leu Arg Lys Ile Cys His Pro His Ala His Cys Thr Tyr Leu Gly
145 150 155 160
Pro Asn Arg His Ser Cys Thr Cys Gln Glu Gly Tyr Arg Gly Asp Gly
165 170 175
Gln Val Cys Leu Pro Val Asp Pro Cys Gln Ile Asn Phe Gly Asn Cys
180 185 190
Pro Thr Lys Ser Thr Val Cys Lys Tyr Asp Gly Pro Gly Gln Ser His
195 200 205
Cys Glu Cys Lys Glu His Tyr Gln Asn Phe Val Pro Gly Val Gly Cys
210 215 220
Ser Met Thr Asp Ile Cys Lys Ser Asp Asn Pro Cys His Arg Asn Ala
225 230 235 240
Asn Cys Thr Thr Val Ala Pro Gly Arg Thr Glu Cys Ile Cys Gln Lys
245 250 255
Gly Tyr Val Gly Asp Gly Leu Thr Cys Tyr
260 265
<210> 80
<211> 270
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Ile Pro Lys Cys Cys Lys Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Phe Ser Asn Pro Cys Ser Gly Asn Gly Gln Cys Ala Asp
20 25 30
Ser Leu Gly Gly Asn Gly Thr Cys Ile Cys Glu Glu Gly Phe Gln Gly
35 40 45
Ser Gln Cys Gln Phe Cys Ser Asp Pro Asn Lys Tyr Gly Pro Arg Cys
50 55 60
Asn Lys Lys Cys Leu Cys Val His Gly Thr Cys Asn Asn Arg Ile Asp
65 70 75 80
Ser Asp Gly Ala Cys Leu Thr Gly Thr Cys Arg Asp Gly Ser Ala Gly
85 90 95
Arg Leu Cys Asp Lys Gln Thr Ser Ala Cys Gly Pro Tyr Val Gln Phe
100 105 110
Cys His Ile His Ala Thr Cys Glu Tyr Ser Asn Gly Thr Ala Ser Cys
115 120 125
Ile Cys Lys Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Thr Leu Cys Ser Glu Met
130 135 140
Asp Pro Cys Thr Gly Leu Thr Pro Gly Gly Cys Ser Arg Asn Ala Glu
145 150 155 160
Cys Ile Lys Thr Gly Thr Gly Thr His Thr Cys Val Cys Gln Gln Gly
165 170 175
Trp Thr Gly Asn Gly Arg Asp Cys Ser Glu Ile Asn Asn Cys Leu Leu
180 185 190
Pro Ser Ala Gly Gly Cys His Asp Asn Ala Ser Cys Leu Tyr Val Gly
195 200 205
Pro Gly Gln Asn Glu Cys Glu Cys Lys Lys Gly Phe Arg Gly Asn Gly
210 215 220
Ile Asp Cys Glu Pro Ile Thr Ser Cys Leu Glu Gln Thr Gly Lys Cys
225 230 235 240
His Pro Leu Ala Ser Cys Gln Ser Thr Ser Ser Gly Val Trp Ser Cys
245 250 255
Val Cys Gln Glu Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Phe Leu Cys Tyr
260 265 270
<210> 81
<211> 264
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
Thr Arg Glu Cys Cys Ala Gly Phe Phe Gly Pro Gln Cys Gln Pro Cys
1 5 10 15
Pro Gly Asn Ala Gln Asn Val Cys Phe Gly Asn Gly Ile Cys Leu Asp
20 25 30
Gly Val Asn Gly Thr Gly Val Cys Glu Cys Gly Glu Gly Phe Ser Gly
35 40 45
Thr Ala Cys Glu Thr Cys Thr Glu Gly Lys Tyr Gly Ile His Cys Asp
50 55 60
Gln Ala Cys Ser Cys Val His Gly Arg Cys Asn Gln Gly Pro Leu Gly
65 70 75 80
Asp Gly Ser Cys Asp Cys Asp Val Gly Trp Arg Gly Val His Cys Asp
85 90 95
Asn Ala Thr Thr Glu Asp Asn Cys Asn Gly Thr Cys His Thr Ser Ala
100 105 110
Asn Cys Leu Thr Asn Ser Asp Gly Thr Ala Ser Cys Lys Cys Ala Ala
115 120 125
Gly Phe Gln Gly Asn Gly Thr Ile Cys Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu
130 135 140
Ile Ser Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys Ala Asp Cys Lys Arg Thr Thr
145 150 155 160
Pro Gly Arg Arg Val Cys Thr Cys Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Asp Gly
165 170 175
Ile Val Cys Leu Glu Ile Asn Pro Cys Leu Glu Asn His Gly Gly Cys
180 185 190
Asp Lys Asn Ala Glu Cys Thr Gln Thr Gly Pro Asn Gln Ala Ala Cys
195 200 205
Asn Cys Leu Pro Ala Tyr Thr Gly Asp Gly Lys Val Cys Thr Leu Ile
210 215 220
Asn Val Cys Leu Thr Lys Asn Gly Gly Cys Ser Glu Phe Ala Ile Cys
225 230 235 240
Asn His Thr Gly Gln Val Glu Arg Thr Cys Thr Cys Lys Pro Asn Tyr
245 250 255
Ile Gly Asp Gly Phe Thr Cys Arg
260
<210> 82
<211> 219
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Ile Pro Arg Cys Cys Lys Gly Tyr Phe Gly Arg Asp Cys Gln Ala Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Pro Asp Ala Pro Cys Asn Asn Arg Gly Val Cys Leu Asp
20 25 30
Gln Tyr Ser Ala Thr Gly Glu Cys Lys Cys Asn Thr Gly Phe Asn Gly
35 40 45
Thr Ala Cys Glu Met Cys Trp Pro Gly Arg Phe Gly Pro Asp Cys Leu
50 55 60
Pro Cys Gly Cys Ser Asp His Gly Gln Cys Asp Asp Gly Ile Thr Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gln Cys Leu Cys Glu Thr Gly Trp Thr Gly Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Thr Gln Ala Val Leu Pro Ala Val Cys Thr Pro Pro Cys Ser Ala His
100 105 110
Ala Thr Cys Lys Glu Asn Asn Thr Cys Glu Cys Asn Leu Asp Tyr Glu
115 120 125
Gly Asp Gly Ile Thr Cys Thr Val Val Asp Phe Cys Lys Gln Asp Asn
130 135 140
Gly Gly Cys Ala Lys Val Ala Arg Cys Ser Gln Lys Gly Thr Lys Val
145 150 155 160
Ser Cys Ser Cys Gln Lys Gly Tyr Lys Gly Asp Gly His Ser Cys Thr
165 170 175
Glu Ile Asp Pro Cys Ala Asp Gly Leu Asn Gly Gly Cys His Glu His
180 185 190
Ala Thr Cys Lys Met Thr Gly Pro Gly Lys His Lys Cys Glu Cys Lys
195 200 205
Ser His Tyr Val Gly Asp Gly Leu Asn Cys Glu
210 215
<210> 83
<211> 51
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Gln Pro Arg Cys Cys Pro Gly Arg Trp Gly Pro Asp Cys Ile Glu Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ala Gly Ser Pro Cys Asn Gly Arg Gly Ser Cys Ala Glu
20 25 30
Gly Met Glu Gly Asn Gly Thr Cys Ser Cys Gln Glu Gly Phe Gly Gly
35 40 45
Thr Ala Cys
50
<210> 84
<211> 47
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Glu Thr Cys Ala Asp Asp Asn Leu Phe Gly Pro Ser Cys Ser Ser Val
1 5 10 15
Cys Asn Cys Val His Gly Val Cys Asn Ser Gly Leu Asp Gly Asp Gly
20 25 30
Thr Cys Glu Cys Tyr Ser Ala Tyr Thr Gly Pro Lys Cys Asp Lys
35 40 45
<210> 85
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Pro Ile Pro Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Pro Glu Asn Ser Arg Cys
1 5 10 15
Ser Pro Ser Thr Glu Asp Glu Asn Lys Leu Glu Cys Lys Cys Leu Pro
20 25 30
Asn Tyr Arg Gly Asp Gly Lys Tyr Cys Asp
35 40
<210> 86
<211> 40
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Pro Ile Asn Pro Cys Leu Arg Lys Ile Cys His Pro His Ala His Cys
1 5 10 15
Thr Tyr Leu Gly Pro Asn Arg His Ser Cys Thr Cys Gln Glu Gly Tyr
20 25 30
Arg Gly Asp Gly Gln Val Cys Leu
35 40
<210> 87
<211> 45
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Pro Val Asp Pro Cys Gln Ile Asn Phe Gly Asn Cys Pro Thr Lys Ser
1 5 10 15
Thr Val Cys Lys Tyr Asp Gly Pro Gly Gln Ser His Cys Glu Cys Lys
20 25 30
Glu His Tyr Gln Asn Phe Val Pro Gly Val Gly Cys Ser
35 40 45
<210> 88
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Met Thr Asp Ile Cys Lys Ser Asp Asn Pro Cys His Arg Asn Ala Asn
1 5 10 15
Cys Thr Thr Val Ala Pro Gly Arg Thr Glu Cys Ile Cys Gln Lys Gly
20 25 30
Tyr Val Gly Asp Gly Leu Thr Cys Tyr
35 40
<210> 89
<211> 51
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Ile Pro Lys Cys Cys Lys Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Phe Ser Asn Pro Cys Ser Gly Asn Gly Gln Cys Ala Asp
20 25 30
Ser Leu Gly Gly Asn Gly Thr Cys Ile Cys Glu Glu Gly Phe Gln Gly
35 40 45
Ser Gln Cys
50
<210> 90
<211> 50
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Gln Phe Cys Ser Asp Pro Asn Lys Tyr Gly Pro Arg Cys Asn Lys Lys
1 5 10 15
Cys Leu Cys Val His Gly Thr Cys Asn Asn Arg Ile Asp Ser Asp Gly
20 25 30
Ala Cys Leu Thr Gly Thr Cys Arg Asp Gly Ser Ala Gly Arg Leu Cys
35 40 45
Asp Lys
50
<210> 91
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Gln Thr Ser Ala Cys Gly Pro Tyr Val Gln Phe Cys His Ile His Ala
1 5 10 15
Thr Cys Glu Tyr Ser Asn Gly Thr Ala Ser Cys Ile Cys Lys Ala Gly
20 25 30
Tyr Glu Gly Asp Gly Thr Leu Cys Ser
35 40
<210> 92
<211> 43
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Glu Met Asp Pro Cys Thr Gly Leu Thr Pro Gly Gly Cys Ser Arg Asn
1 5 10 15
Ala Glu Cys Ile Lys Thr Gly Thr Gly Thr His Thr Cys Val Cys Gln
20 25 30
Gln Gly Trp Thr Gly Asn Gly Arg Asp Cys Ser
35 40
<210> 93
<211> 43
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Glu Ile Asn Asn Cys Leu Leu Pro Ser Ala Gly Gly Cys His Asp Asn
1 5 10 15
Ala Ser Cys Leu Tyr Val Gly Pro Gly Gln Asn Glu Cys Glu Cys Lys
20 25 30
Lys Gly Phe Arg Gly Asn Gly Ile Asp Cys Glu
35 40
<210> 94
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Pro Ile Thr Ser Cys Leu Glu Gln Thr Gly Lys Cys His Pro Leu Ala
1 5 10 15
Ser Cys Gln Ser Thr Ser Ser Gly Val Trp Ser Cys Val Cys Gln Glu
20 25 30
Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Phe Leu Cys Tyr
35 40
<210> 95
<211> 51
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
Thr Arg Glu Cys Cys Ala Gly Phe Phe Gly Pro Gln Cys Gln Pro Cys
1 5 10 15
Pro Gly Asn Ala Gln Asn Val Cys Phe Gly Asn Gly Ile Cys Leu Asp
20 25 30
Gly Val Asn Gly Thr Gly Val Cys Glu Cys Gly Glu Gly Phe Ser Gly
35 40 45
Thr Ala Cys
50
<210> 96
<211> 48
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Glu Thr Cys Thr Glu Gly Lys Tyr Gly Ile His Cys Asp Gln Ala Cys
1 5 10 15
Ser Cys Val His Gly Arg Cys Asn Gln Gly Pro Leu Gly Asp Gly Ser
20 25 30
Cys Asp Cys Asp Val Gly Trp Arg Gly Val His Cys Asp Asn Ala Thr
35 40 45
<210> 97
<211> 39
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Thr Glu Asp Asn Cys Asn Gly Thr Cys His Thr Ser Ala Asn Cys Leu
1 5 10 15
Thr Asn Ser Asp Gly Thr Ala Ser Cys Lys Cys Ala Ala Gly Phe Gln
20 25 30
Gly Asn Gly Thr Ile Cys Thr
35
<210> 98
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Ala Ile Asn Ala Cys Glu Ile Ser Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys Ala
1 5 10 15
Asp Cys Lys Arg Thr Thr Pro Gly Arg Arg Val Cys Thr Cys Lys Ala
20 25 30
Gly Tyr Thr Gly Asp Gly Ile Val Cys Leu
35 40
<210> 99
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Glu Ile Asn Pro Cys Leu Glu Asn His Gly Gly Cys Asp Lys Asn Ala
1 5 10 15
Glu Cys Thr Gln Thr Gly Pro Asn Gln Ala Ala Cys Asn Cys Leu Pro
20 25 30
Ala Tyr Thr Gly Asp Gly Lys Val Cys Thr
35 40
<210> 100
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Leu Ile Asn Val Cys Leu Thr Lys Asn Gly Gly Cys Ser Glu Phe Ala
1 5 10 15
Ile Cys Asn His Thr Gly Gln Val Glu Arg Thr Cys Thr Cys Lys Pro
20 25 30
Asn Tyr Ile Gly Asp Gly Phe Thr Cys Arg
35 40
<210> 101
<211> 51
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Ile Pro Arg Cys Cys Lys Gly Tyr Phe Gly Arg Asp Cys Gln Ala Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Pro Asp Ala Pro Cys Asn Asn Arg Gly Val Cys Leu Asp
20 25 30
Gln Tyr Ser Ala Thr Gly Glu Cys Lys Cys Asn Thr Gly Phe Asn Gly
35 40 45
Thr Ala Cys
50
<210> 102
<211> 49
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Glu Met Cys Trp Pro Gly Arg Phe Gly Pro Asp Cys Leu Pro Cys Gly
1 5 10 15
Cys Ser Asp His Gly Gln Cys Asp Asp Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gln
20 25 30
Cys Leu Cys Glu Thr Gly Trp Thr Gly Pro Ser Cys Asp Thr Gln Ala
35 40 45
Val
<210> 103
<211> 35
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Leu Pro Ala Val Cys Thr Pro Pro Cys Ser Ala His Ala Thr Cys Lys
1 5 10 15
Glu Asn Asn Thr Cys Glu Cys Asn Leu Asp Tyr Glu Gly Asp Gly Ile
20 25 30
Thr Cys Thr
35
<210> 104
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Val Val Asp Phe Cys Lys Gln Asp Asn Gly Gly Cys Ala Lys Val Ala
1 5 10 15
Arg Cys Ser Gln Lys Gly Thr Lys Val Ser Cys Ser Cys Gln Lys Gly
20 25 30
Tyr Lys Gly Asp Gly His Ser Cys Thr
35 40
<210> 105
<211> 43
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Glu Ile Asp Pro Cys Ala Asp Gly Leu Asn Gly Gly Cys His Glu His
1 5 10 15
Ala Thr Cys Lys Met Thr Gly Pro Gly Lys His Lys Cys Glu Cys Lys
20 25 30
Ser His Tyr Val Gly Asp Gly Leu Asn Cys Glu
35 40
<210> 106
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Gln Pro Arg Cys Cys Pro Gly Arg Trp Gly Pro Asp Cys Ile Glu Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ala Gly Ser Pro Cys Asn Gly Arg Gly Ser Cys Ala Glu
20 25 30
Gly Met Glu Gly Asn Gly Thr Cys Ser Cys Gln Glu Gly Phe Gly Gly
35 40 45
Thr Ala Cys Glu Thr Cys Ala Asp Asp Asn Leu Phe Gly Pro Ser Cys
50 55 60
Ser Ser Val Cys Asn Cys Val His Gly Val Cys Asn Ser Gly Leu Asp
65 70 75 80
Gly Asp Gly Thr Cys Glu Cys Tyr Ser Ala Tyr Thr Gly Pro Lys Cys
85 90 95
Asp Lys Pro Ile Pro Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Pro Glu Asn Ser
100 105 110
Arg Cys Ser Pro Ser Thr Glu Asp Glu Asn Lys Leu Glu Cys Lys Cys
115 120 125
Leu Pro Asn Tyr Arg Gly Asp Gly Lys Tyr Cys Asp Pro Ile Asn Pro
130 135 140
Cys Leu Arg Lys Ile Cys His Pro His Ala His Cys Thr Tyr Leu Gly
145 150 155 160
Pro Asn Arg His Ser Cys Thr Cys Gln Glu Gly Tyr Arg Gly Asp Gly
165 170 175
Gln Val Cys Leu
180
<210> 107
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Gln Pro Arg Cys Cys Pro Gly Arg Trp Gly Pro Asp Cys Ile Glu Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ala Gly Ser Pro Cys Asn Gly Arg Gly Ser Cys Ala Glu
20 25 30
Gly Met Glu Gly Asn Gly Thr Cys Ser Cys Gln Glu Gly Phe Gly Gly
35 40 45
Thr Ala Cys Glu Thr Cys Ala Asp Asp Asn Leu Phe Gly Pro Ser Cys
50 55 60
Ser Ser Val Cys Asn Cys Val His Gly Val Cys Asn Ser Gly Leu Asp
65 70 75 80
Gly Asp Gly Thr Cys Glu Cys Tyr Ser Ala Tyr Thr Gly Pro Lys Cys
85 90 95
Asp Lys Pro Ile Pro Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Pro Glu Asn Ser
100 105 110
Arg Cys Ser Pro Ser Thr Glu Asp Glu Asn Lys Leu Glu Cys Lys Cys
115 120 125
Leu Pro Asn Tyr Arg Gly Asp Gly Lys Tyr Cys Asp Pro Ile Asn Pro
130 135 140
Cys Leu Arg Lys Ile Cys His Pro His Ala His Cys Thr Tyr Leu Gly
145 150 155 160
Pro Asn Arg His Ser Cys Thr Cys Gln Glu Gly Tyr Arg Gly Asp Gly
165 170 175
Gln Val Cys Leu Pro Val Asp Pro Cys Gln Ile Asn Phe Gly Asn Cys
180 185 190
Pro Thr Lys Ser Thr Val Cys Lys Tyr Asp Gly Pro Gly Gln Ser His
195 200 205
Cys Glu Cys Lys Glu His Tyr Gln Asn Phe Val Pro Gly Val Gly Cys
210 215 220
Ser
225
<210> 108
<211> 174
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Glu Thr Cys Ala Asp Asp Asn Leu Phe Gly Pro Ser Cys Ser Ser Val
1 5 10 15
Cys Asn Cys Val His Gly Val Cys Asn Ser Gly Leu Asp Gly Asp Gly
20 25 30
Thr Cys Glu Cys Tyr Ser Ala Tyr Thr Gly Pro Lys Cys Asp Lys Pro
35 40 45
Ile Pro Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Pro Glu Asn Ser Arg Cys Ser
50 55 60
Pro Ser Thr Glu Asp Glu Asn Lys Leu Glu Cys Lys Cys Leu Pro Asn
65 70 75 80
Tyr Arg Gly Asp Gly Lys Tyr Cys Asp Pro Ile Asn Pro Cys Leu Arg
85 90 95
Lys Ile Cys His Pro His Ala His Cys Thr Tyr Leu Gly Pro Asn Arg
100 105 110
His Ser Cys Thr Cys Gln Glu Gly Tyr Arg Gly Asp Gly Gln Val Cys
115 120 125
Leu Pro Val Asp Pro Cys Gln Ile Asn Phe Gly Asn Cys Pro Thr Lys
130 135 140
Ser Thr Val Cys Lys Tyr Asp Gly Pro Gly Gln Ser His Cys Glu Cys
145 150 155 160
Lys Glu His Tyr Gln Asn Phe Val Pro Gly Val Gly Cys Ser
165 170
<210> 109
<211> 185
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Ile Pro Lys Cys Cys Lys Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Phe Ser Asn Pro Cys Ser Gly Asn Gly Gln Cys Ala Asp
20 25 30
Ser Leu Gly Gly Asn Gly Thr Cys Ile Cys Glu Glu Gly Phe Gln Gly
35 40 45
Ser Gln Cys Gln Phe Cys Ser Asp Pro Asn Lys Tyr Gly Pro Arg Cys
50 55 60
Asn Lys Lys Cys Leu Cys Val His Gly Thr Cys Asn Asn Arg Ile Asp
65 70 75 80
Ser Asp Gly Ala Cys Leu Thr Gly Thr Cys Arg Asp Gly Ser Ala Gly
85 90 95
Arg Leu Cys Asp Lys Gln Thr Ser Ala Cys Gly Pro Tyr Val Gln Phe
100 105 110
Cys His Ile His Ala Thr Cys Glu Tyr Ser Asn Gly Thr Ala Ser Cys
115 120 125
Ile Cys Lys Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Thr Leu Cys Ser Glu Met
130 135 140
Asp Pro Cys Thr Gly Leu Thr Pro Gly Gly Cys Ser Arg Asn Ala Glu
145 150 155 160
Cys Ile Lys Thr Gly Thr Gly Thr His Thr Cys Val Cys Gln Gln Gly
165 170 175
Trp Thr Gly Asn Gly Arg Asp Cys Ser
180 185
<210> 110
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Ile Pro Lys Cys Cys Lys Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Phe Ser Asn Pro Cys Ser Gly Asn Gly Gln Cys Ala Asp
20 25 30
Ser Leu Gly Gly Asn Gly Thr Cys Ile Cys Glu Glu Gly Phe Gln Gly
35 40 45
Ser Gln Cys Gln Phe Cys Ser Asp Pro Asn Lys Tyr Gly Pro Arg Cys
50 55 60
Asn Lys Lys Cys Leu Cys Val His Gly Thr Cys Asn Asn Arg Ile Asp
65 70 75 80
Ser Asp Gly Ala Cys Leu Thr Gly Thr Cys Arg Asp Gly Ser Ala Gly
85 90 95
Arg Leu Cys Asp Lys Gln Thr Ser Ala Cys Gly Pro Tyr Val Gln Phe
100 105 110
Cys His Ile His Ala Thr Cys Glu Tyr Ser Asn Gly Thr Ala Ser Cys
115 120 125
Ile Cys Lys Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Thr Leu Cys Ser Glu Met
130 135 140
Asp Pro Cys Thr Gly Leu Thr Pro Gly Gly Cys Ser Arg Asn Ala Glu
145 150 155 160
Cys Ile Lys Thr Gly Thr Gly Thr His Thr Cys Val Cys Gln Gln Gly
165 170 175
Trp Thr Gly Asn Gly Arg Asp Cys Ser Glu Ile Asn Asn Cys Leu Leu
180 185 190
Pro Ser Ala Gly Gly Cys His Asp Asn Ala Ser Cys Leu Tyr Val Gly
195 200 205
Pro Gly Gln Asn Glu Cys Glu Cys Lys Lys Gly Phe Arg Gly Asn Gly
210 215 220
Ile Asp Cys Glu
225
<210> 111
<211> 177
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Gln Phe Cys Ser Asp Pro Asn Lys Tyr Gly Pro Arg Cys Asn Lys Lys
1 5 10 15
Cys Leu Cys Val His Gly Thr Cys Asn Asn Arg Ile Asp Ser Asp Gly
20 25 30
Ala Cys Leu Thr Gly Thr Cys Arg Asp Gly Ser Ala Gly Arg Leu Cys
35 40 45
Asp Lys Gln Thr Ser Ala Cys Gly Pro Tyr Val Gln Phe Cys His Ile
50 55 60
His Ala Thr Cys Glu Tyr Ser Asn Gly Thr Ala Ser Cys Ile Cys Lys
65 70 75 80
Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Thr Leu Cys Ser Glu Met Asp Pro Cys
85 90 95
Thr Gly Leu Thr Pro Gly Gly Cys Ser Arg Asn Ala Glu Cys Ile Lys
100 105 110
Thr Gly Thr Gly Thr His Thr Cys Val Cys Gln Gln Gly Trp Thr Gly
115 120 125
Asn Gly Arg Asp Cys Ser Glu Ile Asn Asn Cys Leu Leu Pro Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Cys His Asp Asn Ala Ser Cys Leu Tyr Val Gly Pro Gly Gln
145 150 155 160
Asn Glu Cys Glu Cys Lys Lys Gly Phe Arg Gly Asn Gly Ile Asp Cys
165 170 175
Glu
<210> 112
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Thr Arg Glu Cys Cys Ala Gly Phe Phe Gly Pro Gln Cys Gln Pro Cys
1 5 10 15
Pro Gly Asn Ala Gln Asn Val Cys Phe Gly Asn Gly Ile Cys Leu Asp
20 25 30
Gly Val Asn Gly Thr Gly Val Cys Glu Cys Gly Glu Gly Phe Ser Gly
35 40 45
Thr Ala Cys Glu Thr Cys Thr Glu Gly Lys Tyr Gly Ile His Cys Asp
50 55 60
Gln Ala Cys Ser Cys Val His Gly Arg Cys Asn Gln Gly Pro Leu Gly
65 70 75 80
Asp Gly Ser Cys Asp Cys Asp Val Gly Trp Arg Gly Val His Cys Asp
85 90 95
Asn Ala Thr Thr Glu Asp Asn Cys Asn Gly Thr Cys His Thr Ser Ala
100 105 110
Asn Cys Leu Thr Asn Ser Asp Gly Thr Ala Ser Cys Lys Cys Ala Ala
115 120 125
Gly Phe Gln Gly Asn Gly Thr Ile Cys Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu
130 135 140
Ile Ser Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys Ala Asp Cys Lys Arg Thr Thr
145 150 155 160
Pro Gly Arg Arg Val Cys Thr Cys Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Asp Gly
165 170 175
Ile Val Cys Leu
180
<210> 113
<211> 222
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Thr Arg Glu Cys Cys Ala Gly Phe Phe Gly Pro Gln Cys Gln Pro Cys
1 5 10 15
Pro Gly Asn Ala Gln Asn Val Cys Phe Gly Asn Gly Ile Cys Leu Asp
20 25 30
Gly Val Asn Gly Thr Gly Val Cys Glu Cys Gly Glu Gly Phe Ser Gly
35 40 45
Thr Ala Cys Glu Thr Cys Thr Glu Gly Lys Tyr Gly Ile His Cys Asp
50 55 60
Gln Ala Cys Ser Cys Val His Gly Arg Cys Asn Gln Gly Pro Leu Gly
65 70 75 80
Asp Gly Ser Cys Asp Cys Asp Val Gly Trp Arg Gly Val His Cys Asp
85 90 95
Asn Ala Thr Thr Glu Asp Asn Cys Asn Gly Thr Cys His Thr Ser Ala
100 105 110
Asn Cys Leu Thr Asn Ser Asp Gly Thr Ala Ser Cys Lys Cys Ala Ala
115 120 125
Gly Phe Gln Gly Asn Gly Thr Ile Cys Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu
130 135 140
Ile Ser Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys Ala Asp Cys Lys Arg Thr Thr
145 150 155 160
Pro Gly Arg Arg Val Cys Thr Cys Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Asp Gly
165 170 175
Ile Val Cys Leu Glu Ile Asn Pro Cys Leu Glu Asn His Gly Gly Cys
180 185 190
Asp Lys Asn Ala Glu Cys Thr Gln Thr Gly Pro Asn Gln Ala Ala Cys
195 200 205
Asn Cys Leu Pro Ala Tyr Thr Gly Asp Gly Lys Val Cys Thr
210 215 220
<210> 114
<211> 171
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Glu Thr Cys Thr Glu Gly Lys Tyr Gly Ile His Cys Asp Gln Ala Cys
1 5 10 15
Ser Cys Val His Gly Arg Cys Asn Gln Gly Pro Leu Gly Asp Gly Ser
20 25 30
Cys Asp Cys Asp Val Gly Trp Arg Gly Val His Cys Asp Asn Ala Thr
35 40 45
Thr Glu Asp Asn Cys Asn Gly Thr Cys His Thr Ser Ala Asn Cys Leu
50 55 60
Thr Asn Ser Asp Gly Thr Ala Ser Cys Lys Cys Ala Ala Gly Phe Gln
65 70 75 80
Gly Asn Gly Thr Ile Cys Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu Ile Ser Asn
85 90 95
Gly Gly Cys Ser Ala Lys Ala Asp Cys Lys Arg Thr Thr Pro Gly Arg
100 105 110
Arg Val Cys Thr Cys Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Asp Gly Ile Val Cys
115 120 125
Leu Glu Ile Asn Pro Cys Leu Glu Asn His Gly Gly Cys Asp Lys Asn
130 135 140
Ala Glu Cys Thr Gln Thr Gly Pro Asn Gln Ala Ala Cys Asn Cys Leu
145 150 155 160
Pro Ala Tyr Thr Gly Asp Gly Lys Val Cys Thr
165 170
<210> 115
<211> 176
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Ile Pro Arg Cys Cys Lys Gly Tyr Phe Gly Arg Asp Cys Gln Ala Cys
1 5 10 15
Pro Gly Gly Pro Asp Ala Pro Cys Asn Asn Arg Gly Val Cys Leu Asp
20 25 30
Gln Tyr Ser Ala Thr Gly Glu Cys Lys Cys Asn Thr Gly Phe Asn Gly
35 40 45
Thr Ala Cys Glu Met Cys Trp Pro Gly Arg Phe Gly Pro Asp Cys Leu
50 55 60
Pro Cys Gly Cys Ser Asp His Gly Gln Cys Asp Asp Gly Ile Thr Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gln Cys Leu Cys Glu Thr Gly Trp Thr Gly Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Thr Gln Ala Val Leu Pro Ala Val Cys Thr Pro Pro Cys Ser Ala His
100 105 110
Ala Thr Cys Lys Glu Asn Asn Thr Cys Glu Cys Asn Leu Asp Tyr Glu
115 120 125
Gly Asp Gly Ile Thr Cys Thr Val Val Asp Phe Cys Lys Gln Asp Asn
130 135 140
Gly Gly Cys Ala Lys Val Ala Arg Cys Ser Gln Lys Gly Thr Lys Val
145 150 155 160
Ser Cys Ser Cys Gln Lys Gly Tyr Lys Gly Asp Gly His Ser Cys Thr
165 170 175
<210> 116
<211> 168
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Glu Met Cys Trp Pro Gly Arg Phe Gly Pro Asp Cys Leu Pro Cys Gly
1 5 10 15
Cys Ser Asp His Gly Gln Cys Asp Asp Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gln
20 25 30
Cys Leu Cys Glu Thr Gly Trp Thr Gly Pro Ser Cys Asp Thr Gln Ala
35 40 45
Val Leu Pro Ala Val Cys Thr Pro Pro Cys Ser Ala His Ala Thr Cys
50 55 60
Lys Glu Asn Asn Thr Cys Glu Cys Asn Leu Asp Tyr Glu Gly Asp Gly
65 70 75 80
Ile Thr Cys Thr Val Val Asp Phe Cys Lys Gln Asp Asn Gly Gly Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ala Arg Cys Ser Gln Lys Gly Thr Lys Val Ser Cys Ser
100 105 110
Cys Gln Lys Gly Tyr Lys Gly Asp Gly His Ser Cys Thr Glu Ile Asp
115 120 125
Pro Cys Ala Asp Gly Leu Asn Gly Gly Cys His Glu His Ala Thr Cys
130 135 140
Lys Met Thr Gly Pro Gly Lys His Lys Cys Glu Cys Lys Ser His Tyr
145 150 155 160
Val Gly Asp Gly Leu Asn Cys Glu
165
Claims (18)
- 서열번호 84, 서열번호 90, 서열번호 96 및 서열번호 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 두 번째 비정형 EGF-유사 도메인 및 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 86 내지 서열번호 90, 서열번호 92 내지 서열번호 96, 서열번호 98 내지 서열번호 102, 서열번호 104 및 서열번호 105로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 3개 이상의 EGF-유사도메인이 순차적으로 연결되어 포스파티딜세린과 결합하는 폴리펩티드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 삭제
- 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제9항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
- 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 검출용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- (a) 제1항의 폴리펩티드를 시료와 혼합하는 단계;(b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩티드를 제거하는 단계; 및(c) 상기 폴리펩티드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 포스파티딜세린의 검출 방법.
- 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포(apoptotic cell) 검출용 조성물.
- 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질 및 형광물질(fluorescer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalathemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia)으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 진단용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080016943A KR101196799B1 (ko) | 2008-02-25 | 2008-02-25 | 스태빌린-2의 ｅｇｆ-유사 도메인의 반복부위 단편을포함하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 포스파티딜세린검출용 조성물 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080016943A KR101196799B1 (ko) | 2008-02-25 | 2008-02-25 | 스태빌린-2의 ｅｇｆ-유사 도메인의 반복부위 단편을포함하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 포스파티딜세린검출용 조성물 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090091588A KR20090091588A (ko) | 2009-08-28 |
| KR101196799B1 true KR101196799B1 (ko) | 2012-11-05 |
Family
ID=41208965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080016943A KR101196799B1 (ko) | 2008-02-25 | 2008-02-25 | 스태빌린-2의 ｅｇｆ-유사 도메인의 반복부위 단편을포함하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 포스파티딜세린검출용 조성물 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101196799B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220043985A (ko) | 2020-09-28 | 2022-04-06 | 주식회사 바이오빛 | 홍합 접착 단백질 유래의 재조합 폴리펩티드 및 그의 용도 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101818759B1 (ko) * | 2011-04-18 | 2018-01-16 | 경북대학교 산학협력단 | 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 및 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격 모듈 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5939267A (en) | 1998-08-31 | 1999-08-17 | Wayne State University | Methods for the temporal analysis of programmed cell death in living cells |
| US7179616B1 (en) | 2002-10-07 | 2007-02-20 | University Of Notre Dame Du Lac | Method for detecting phosphatidylserine on the surface of cells |
| US20070249734A1 (en) | 2003-06-30 | 2007-10-25 | The Brigham & Women's Hospital, Inc. | Method, Composition and Kit for Detecting Phosphatidylserine (Ps) on Cell Membranes |
-
2008
- 2008-02-25 KR KR1020080016943A patent/KR101196799B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5939267A (en) | 1998-08-31 | 1999-08-17 | Wayne State University | Methods for the temporal analysis of programmed cell death in living cells |
| US7179616B1 (en) | 2002-10-07 | 2007-02-20 | University Of Notre Dame Du Lac | Method for detecting phosphatidylserine on the surface of cells |
| US20070249734A1 (en) | 2003-06-30 | 2007-10-25 | The Brigham & Women's Hospital, Inc. | Method, Composition and Kit for Detecting Phosphatidylserine (Ps) on Cell Membranes |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220043985A (ko) | 2020-09-28 | 2022-04-06 | 주식회사 바이오빛 | 홍합 접착 단백질 유래의 재조합 폴리펩티드 및 그의 용도 |
| KR20230110455A (ko) | 2020-09-28 | 2023-07-24 | 주식회사 바이오빛 | 홍합 접착 단백질 유래의 재조합 폴리펩티드 및 그의용도 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20090091588A (ko) | 2009-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5443967A (en) | DNA encoding the cancer associated SCM recognition factor | |
| KR101801454B1 (ko) | 환형의 수용체-연관된 단백질(ｒａｐ) 펩티드 | |
| CA2436281A1 (en) | Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (ptpc) | |
| CA2505250A1 (en) | Acetylated hmgb1 protein | |
| US11046739B2 (en) | BH4 stabilized peptides and uses thereof | |
| KR102150419B1 (ko) | Pd-l1에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 | |
| JP2005537254A (ja) | アミロイド結合タンパク質を含んでなる交差−β構造、および交差−β構造の検出方法、交差−β構造フィブリル形成の調節方法、および交差−β構造によって伝達される毒性の調節方法 | |
| KR101196799B1 (ko) | 스태빌린-2의 ｅｇｆ-유사 도메인의 반복부위 단편을포함하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 포스파티딜세린검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| US8648045B2 (en) | VDAC1 compositions and methods of use thereof for regulating apoptosis | |
| WO2008134445A2 (en) | Platelet activation receptor clec-2: compositions and uses thereof | |
| US9447157B2 (en) | Nitration shielding peptides and methods of use thereof | |
| KR100968839B1 (ko) | 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의용도 | |
| WO2001093897A9 (en) | Angiostatin and endostatin binding proteins and methods of use | |
| KR100968838B1 (ko) | 스태빌린-2의 ｅｇｆ-유사 도메인의 반복부위 단편을유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물 및 이의 용도 | |
| KR20050086676A (ko) | 간질성 방광염을 치료하는 세포 조절 펩티드 | |
| EP3419994B1 (en) | Peptide inhibitors of calcium channels | |
| JP4143716B2 (ja) | Ａｇｅ−ｒａｇｅ拮抗剤 | |
| US7767417B2 (en) | Prenyl-electrostatic switch, and methods of use | |
| CA2131623A1 (en) | Prevention of suppression of immune defence against cancer caused by the cancer-associated scm-recognition peptides | |
| EP2368906A1 (en) | Fas associated factor 1 | |
| KR20090042105A (ko) | Ｓｉｒｔ１활성조절용 조성물 | |
| JP4869685B2 (ja) | Ｒａｂ２７Ａ不活性化剤 | |
| US20070196354A1 (en) | Method of treating diabetes by inhibiting degradation of at least one of crebl1, atf6, and hnf-4 alpha by htra | |
| WO2023104822A1 (en) | Chimeric adiponectin polypeptides, extracellular vesicle comprising the same, and uses thereof | |
| KR20230104243A (ko) | 인체 미토콘드리아 분열 단백질 1의 펩타이드 억제제 및 그 사용 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150924 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170922 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180920 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190917 Year of fee payment: 8 |