KR101818759B1 - 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 및 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격 모듈 - Google Patents

활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 및 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격 모듈 Download PDF

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Abstract

본 발명은 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 신규한 단백질 골격 모듈에 관한것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 골격 모듈 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 골격 모듈은 내장된 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키므로 질병의 진단 및 치료에 효과적이다.

Description

활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 및 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격 모듈{Development and application of Designed Modular Immunodiagnostics}
본 발명은 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 신규한 단백질 골격 모듈에 관한것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 골격 모듈 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
단백질의 아미노산 서열과 2차, 3차 구조를 분석하면 많은 단백질들이 독립적인 도메인 (domain, 또는 module)으로 구성되어 있다. 도메인은 구조적 기능적 독립적인 단위이다. 동일한 도메인은 여러 단백질에 하나 이상으로 분포될 수 있으며, 하나의 단백질은 여러 도메인으로 구성될 수 있다. 도메인의 구체적인 정보는 Prosite (Hulo N 등, Nucleic Acids Res, 36:D245-249, 2008; Website: http://kr.expasy.org/prosite/), SMART(Letunic I 등, Nucleic Acids Res, 34:D257-D260, 2006; Website: http://smart.embl-heidelberg.de/)등의 생물정보학 웹사이트에서 탐색할 수 있다.
생체분자간 상호작용 (예, 단백질-단백질, 단백질-핵산, 등)은 세포의 생장, 분화, 발달, 세포간/내에서의 신호 전달, 물질이동 등 다양한 생명현상을 일으키는 중요한 기능을 한다. 기존에 표적분자에 특이적으로 결합하여 생물학적 활성을 조절하는 분자로서, 항체 (전체 또는 절편)가 주도적으로 개발되어져 왔다. 하지만, 항체의 문제점은 발현 양이 적고, 용해도가 낮으며, 동물세포 발현 세포주을 써야하고, 정제비용이 비싸고, 환원적 세포내 환경에서 안정성이 떨어지는 여러 문제 등이 있다. 따라서, 항체의 문제점을 극복하면서 항체처럼 표적분자 (targeted molecules)에 특이적으로 결합하는 특성을 지닌 항체외 단백질 개발이 시급한 실정이다.
암이나 동맥경화의 진단 및 치료에 사용하기 위하여 페이지 디스플레이등의 방법으로 발굴된 펩타이드는 낮은 결합력, 비안정성, 고면역성 등의 한계가 있다. 이러한 문제점을 극복하고 활성 펩타이드를 인체내에서 결합력과 안정성을 높이면서 면역성을 낮출 수 있는 새로운 기술의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 인체유래 단백질 중 일부분을 선택, 최적 변형하고, 활성 펩티드를 삽입 하는 경우 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성이 증강되는 등 기존의 펩티드 제제 및 항체 제제를 대체할 수 있는 우수한 성질을 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 다른 목적은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
b) 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 및
c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
b) 서열번호 3으로 표시되는 AP-1(activator protein 1)의 아미노산 서열를 포함하는 폴리펩타이드 및
c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 29번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
b) 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 및
c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
b) 서열번호 3으로 표시되는 AP-1(activator protein 1)의 아미노산 서열를 포함하는 폴리펩타이드 및
c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; b) 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 및 c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈 및 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 단백질 골격 모듈은 내장되는 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 특징이 있다.
활성 폴리펩타이드는 대상 protein과의 접촉을 통하여 신호전달, 대상 protein의 activation, deactivation, phosphorylation 등 여러 작용을 하는 폴리펩타이드를 말한다. 본 발명의 단백질 골격 모듈은 내장되는 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증가시키는 방법으로 활성 폴리펩타이드의 활성을 증가시킨다.
결합 친화력(binding affinity)은 생체 분자간 결합하려는 성질의 강도를 말한다.
결합 특이성(binding specificity)은 특정 생체 분자가 결합 대상 분자와만 특이적으로 결합하려는 성질을 말한다.
본 발명의 단백질 골격 모듈은 생체내 면역 체계에 영향을 미치지 아니하며 활성 폴리펩타이드를 내장할 수 있는 단백질 구조체를 말한다. 본 발명의 단백질 골격 모듈은 분자량이 작아 생체내 활동성이 우수하고, 내장되는 활성 폴리펩타이드의 활성에 영향을 미치지 아니하며, 생체 내 면역 체계에 영향을 미치지 아니하며, 생체 내에 풍부하게 존재하는 단백질에서 유래하여 개체별 효과의 차이나 개체 특이적 효과의 발생이 없어야 한다. 활성 폴리펩타이드를 내장하여 활성 폴리펩타이드의 안정성 및 특성을 향상시키는 단백질 골격 모듈은 본 발명자들에 의하여 최초로 개발된 것이며, DMID(Designed Modular Immunodiagnostics)라고 명명하였다.
본 발명의 단백질 골격 모듈은 바람직하게는 Stabilin-2 유래 폴리펩타이드 단편을 기초로 디자인 될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 골격에 영향을 미치지 않는 부분에 활성 폴리펩타이드가 치환 또는 삽입 된 단백질 골격 모듈일 수 있다.
본 발명의 일실시예의 단백질 골격 모듈은 인간에 풍부하게 존재하는 Stabilin-2 유래 폴리펩타이드 단편을 기초로 디자인 되었다. Stabilin-2는 transmembrane 리셉터로 림브구 유도, 세포 부착, 리셉터 스카벤징, 혈관 생성에 관여한다. 이 단백질은 7 fasciclin, 16 epidermal growth factor (EGF)-like, 2 laminin-type EGF-like domains, a C-type lectin-like hyaluronan-binding Link module 등의 다양한 도메인을 가지고 있다.
한편 본 발명은 상기 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 특징이 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상의 상동성(homology)이 있는 아미노산 서열을 갖는 단백질 골격 모듈을 암호화하는 물질을 말하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 DNA일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 발현벡터는 당업자들이 당업계에 알려진 어떠한 방법에 따라 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 벡터내로 삽입하여 적절한 전사/해독 조절서열을 이용하여 본 발명의 단백질 골격 모듈을 발현하도록 제조된 발현벡터를 말한다.
본 발명의 "발현 벡터"라는 용어는 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
상기 본 발명의 단백질 골격 모듈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 발현 벡터로는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pET30a, pET30c 및 pGEX-GST), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등이 있고, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 및 식물 바이러스가 사용될 수 있으며, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있다. 당업자라면 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 도입시키는데 적합한 벡터를 선택할 수 있으며, 본 발명에서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다. 그러나 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터인 pET32a 벡터를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
상기 형질전환된 숙주세포는 당업자들이 당업계에 공지된 방법에 따라 본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 형질전환시킨 미생물일 수 있으며, 상기 미생물은 이에 한정되지는 않지만 바람직하게는 대장균(E.coli)일 수 있으며 가장 바람직하게는 대장균 BL21 또는 대장균 MC 1061일 수 있다.
상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 활용하여 본 발명의 단백질 골격 모듈을 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 목적하는 코딩 서열을 생성시키고 이후 정제할 수 있는 비히클과, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질 전환 또는 형질감염시, 본 발명의 단백질 골격 모듈을 발생 부위에서(in situ) 발현시킬 수 있는 세포를 의미한다. 이러한 시스템에는 이에 제한되는 것은 아니고, 미생물, 예컨대 본 발명의 단백질 골격 모듈 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예를 들어, 이.콜라이 및 비.서브 틸리스); 단백질 골격 모듈 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 감염된 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)); 단백질 골격 모듈 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 단백질 골격 모듈 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환되거나 또는 재조합 발현 벡터(예를 들어, 칼리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈에서 유래한 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스에서 유래한 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구성체를 보유하는 포유동물세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, NS0 및 3T3 세포)을 포함한다.
본 발명의 단백질 골격 모듈은 내장된 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 특징이 있으며, 이러한 활성 폴리펩타이드의 내장은 상기 단백질 골격 모듈에 내장시킬 활성 폴리펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드의 특정 부위에 활성 폴리펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시켜 발현하는 방법으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.
상기 발현 벡터 및 숙주세포는 전술한 바와 같다.
상기 숙주세포는 바람직하게는 E.coli일 수 있다.
한편 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의하면 결합 친화력 또는 결합 특이성이 증강된 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈이 효율적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈은 단백질 정제를 위해 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를들어, 크로마토그래피(예를 들어, 금속-킬레이트 크로마토그래피, 이온 교환, 친화성 및 크기 컬럼 크로마토그래피 등), 원심분리, 차등 가용성 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 방법으로 정제할 수 있다.
본 발명의 결합 친화력 또는 결합 특이성이 증강된 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈은 활성 폴리펩타이드 단독일 때 보다 타겟 물질에 대한 결합 친화력 또는 결합 특이성이 높다.
한편 본 발명의 단백질 골격 모듈에는 공지의 검출방법에 사용되는 표지물질 등을 추가로 부착할 수 있다.
또한 본 발명의 단백질 골격 모듈에는 활성 폴리펩타이드의 결합 대상 타겟에 유효한 물질 등을 추가로 부착할 수 있다.
예를 들어 본 발명의 단백질 골격 모듈에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민(HSA), 항체의 Fc 영역, IgG 분자, 세포독성 약물, 방사성 동위원소, 조영제, His-태그, 비오틴, Flag-태그, 핵산, 또는 사이토카인 등이 추가로 부착될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 진단용 조성물은 본 발명의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 진단은 활성 폴리펩타이드의 타겟 물질의 유무, 분포, 양 등을 알아낼 수 있으며, 이를 바탕으로 관련된 질병의 유무, 진행 상태를 판단하는 것을 의미한다.
예를 들어, IL-4 receptor는 여러 가지 인간 암 (대장암, 폐암, 자궁암 및 유방암)에서 과발현한다. 본 발명의 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈의 경우 IL-4 receptor와 결합력을 가지므로 상기 암 진단 및 치료에 응용이 가능하다.
단백질의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 측정하는 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질의 존재여부와 그 양 및 /또는 패턴을 측정하기 위하여 통상 2차 항체에 연계된 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기 및 패턴을 검출함으로써 측정이 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 레독스 분자, 방사선 동위원소 등을 예로 들 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나, 이로 제한되지않는다.
검출 라벨로서 형광물이 사용되는 경우 이용 가능한 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 리간드가 사용되는 경우 이용 가능한 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 발광물이 사용되는 경우 이용 가능한 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 미소입자가 사용되는 경우 이용 가능한 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
검출 라벨로서 레독스 분자가 사용되는 경우 이용 가능한 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+ , [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
검출 라벨로서 방사성 동위원소가 사용되는 경우 이용 가능한 방사성 동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 진단용 조성물은 활성 폴리펩타이드의 타겟 물질의 유무, 분포, 양 등을 알아낼 수 있으며, 이와 관련된 질병의 유무, 진행 상태를 판단 할 수 있는 정보를 제공한다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 단백질 골격 모듈에 내장되지 아니한 활성 폴리펩타이드가 포함된 진단용 조성물에 비하여 진단의 감도, 정밀도, 정확도가 뛰어나 진단능력이 뛰어나다.
따라서 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트는 지지체, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질액 등을 더 포함할 수 있다. 상기 지지체는 니트로셀룰로오즈막, 폴리비닐수지로 합성된 96웰플레이트(96 well plate), 폴리스티렌수지로 합성된 96웰플레이트, 또는 유리로 된 슬라이드글라스 등일 수 있고, 상기 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 또는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등일 수 있으며, 상기 형광물질은 FITC, 또는 RITC 등일 수 있고, 상기 발색 기질액은 ABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzenzothiazoline-6-sulfonic acid)), OPD(o-Phenylenediamine), 또는 TMB(Tetramethyl Benzidine) 등일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 활성 폴리펩타이드의 결합 타겟에 유효한 치료물질, 세포독성 약물 등을 전달 할 수 있다.
약학적 조성물은 활성 폴리펩타이드의 종류에 따라 그 대상 질병이 달라질 수 있다. 예를 들어 본 발명의 활성 폴리펩타이드로서 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 하는 약학적 조성물의 경우 여러 가지 인간 암(대장암, 폐암, 자궁암 및 유방암)에서 과발현하는 IL-4 receptor에 결합하므로 이를 타겟으로 하는 치료물질 또는 세포독성 약물 등의 전달이 가능하다.
따라서 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
b) 서열번호 3으로 표시되는 AP-1(activator protein 1)의 아미노산 서열를 포함하는 폴리펩타이드 및
c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈. 및
상기 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
활성 폴리펩타이드는 대상 protein과의 접촉을 통하여 신호전달, 대상 protein의 activation, deactivation, phosphorylation 등 여러 작용을 하는 폴리펩타이드를 말한다. AP-1은 cytokine IL-4가 IL-4 receptor에 결합하는 아미노산 서열을 가지므로 자체적으로 IL-4 receptor에 결합력을 가진다. IL-4 receptor는 여러 가지 인간 암 (대장암, 폐암, 자궁암 및 유방암)에서 과발현함이 알려져 있으므로 IL-4 receptor에 선택적으로 결합하는 활성 폴리펩타이드의 개발은 암의 진단 및 치료에 응용될 수 있다. IL-4 는 세포부착을 증가시키는 cytokine으로 동맥경화를 유발시키는 작용을 하므로 AP-1 펩타이드는 동맥경화의 진단 및 치료제로 개발될 수 있다.
따라서 본 발명은 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물 및 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 kit를 제공한다.
상기 암은 그 발생, 진행, 퇴화 또는 소멸에 의해 AP-1이 친화력을 가지는 구조를 가진 생체 물질의 수준을 변화 시키는 암이면 어떤 암도 가능하며, 바람직하게는 대장암, 폐암, 자궁암 또는 유방암 일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 단백질 골격 모듈을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명 조성물의 단백질 골격 모듈의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명 조성물의 단백질 골격 모듈의 바람직한 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000mg, 가장 바람직하게는 0.1ug 내지 100mg일 수 있다. 그러나 상기 단백질 골격 모듈의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 단백질 골격 모듈을 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 이와 같은 효과는 본 발명 명세서의 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 실시예에서는 많은 modular 도메인 중 친화력이 높으며, 분자량 및 면역원성이 낮고, 사람에게 풍부하게 존재하며, 3차원 구조의 검증이 가능한 modular 도메인을 스크리닝 하여 가장 적합한 도메인으로 Stamiin-2의 EGFL 도메인을 선정하였다. 선정된 서열을 3차원 모델링을 하고 in silico 상에서 돌연변이를 유발하여 가장 적합한 모델을 확립하였다.
본 발명의 다른 일 실시예에서는 선정된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하고, 이를 발현가능한 발현 벡터에 도입한 후, 이를 이용하여 대장균을 형질전환 하였다. 형질전환 된 균주를 배양하여 본 발명의 단백질 골격 모듈을 발현시킨 후 이를 추출 정제 하였다.
본 발명의 다른 일 실시예에서는 표면플라즈몬 공명 분석에 의하여 본 발명의 활성 폴리펩타이드로서 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈의 결합 능력을 측정하였다. 측정 결과 본 발명의 단백질 골격 모듈에 AP-1이 내장되는 경우 친화력이 naked AP-1 펩타이드에 비하여 174배나 높아 지는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 실시예에서는 본 발명 단백질 골격 모듈에 의한 활성 폴리펩타이드의 detection 민감도 변화를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 단백질 골격 모듈에 AP-1이 내장되는 경우 naked AP-1 펩타이드에 비하여 10 배이상 IL-4의 활성을 잘 저해함을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈에 의한 진단 민감도를 측정하였다. Cellular imaging 또는 Animal imaging 실험 결과 본 발명의 단백질 골격 모듈에 AP-1이 내장되는 경우 naked AP-1 펩타이드에 비하여 종양 타켓팅 기능이 향상되었음을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 신규한 단백질 골격 모듈에 관한것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 골격 모듈 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 단백질 골격 모듈은 내장된 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키므로 질병의 진단 및 치료에 효과적이다.
도 1은 Stabilin-2의 도메인 배열 모식도 및 본 발명의 단백질 골격 모듈과 활성 펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈의 3차원 모델링 결과 사진이다.
도 2는 표면 플라즈마 공명 실험 결과 그래프 이다(DMID AP-1: 본 발명의 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈, Peptide AP-1: 단백질 골격 모듈이 결합하지 아니한 AP-1 펩타이드, Negative control: 음성대조군).
도 3은 표면 플라즈마 공명 실험 결과 측정된 결합 상수를 비교한 그래프이다(authentic control: IL-4의 결합상수, peptide control: 단백질 골격 모듈이 결합하지 아니한 AP-1 펩타이드의 결합 상수, Peptide-embeded DIMID: 본 발명의 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈의 결합 상수)
도 4는 AP-1이 내장된 본 발명의 단백질 골격 모듈의 IL-4 receptor의 신호전달을 억제하는 효과를 측정한 실험 결과 사진이다(IL4: 인터루킨 4, AP1: 단백질 골격 모듈에 결합하지 아니한 AP1, AP1-DIMID: 단백질 골격 모듈이 결합된 AP1, STAT6: STAT6의 수준, pSTAT6: 인산화 된 STAT6의 수준).
도 5는 AP-1이 내장된 본 발명의 단백질 골격 모듈의 detection 능력 향상을 측정한 cellular imaging 실험 결과 사진이다(DAPI: 세포핵을 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 염색한 사진, FITC: Fluorescein Isothiocyanate로 단백질 골격 모듈을 표지한 사진, MERGE: DAPI 및 FITC 사진을 합친 이미지, AP1-DIMID-FITC: FITC가 표지된 단백질 골격 모듈이 결합된 AP1, AP1-FITC: FITC가 표지된 AP-1, Control DMID-FITC: AP-1이 내장되지 않은 FITC가 표지된 단백질 골격 모듈, NSSSVDK서열의 펩타이드에 FITC 표지를 한 control peptide).
도 6은 AP-1이 내장된 본 발명의 단백질 골격 모듈의 detection 능력 향상을 측정한 Animal imaging 실험 결과 사진이다(Scafold control: AP-1이 내장되지 않은 단백질 골격 모듈을 주입한 생쥐, AP-1 Peptide: AP-1 펩타이드를 주입한 생쥐, DMID AP-1: DMID AP-1을 주입한 생쥐).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
DMID(Designed Modular Immunodiagnostics) 후보군 스크리닝 및 모델링
<1-1> 스크리닝
인간에서 발현되는 단백질 도메인 중 다량으로 존재하는 modular 도메인을 인간유전자 데이터 베이스를 비교분석하는 포스트 지노믹 스크리닝을 통해 20개의 후보군으로 선정 한 후 a) 높은 친화력(high affinity), b) 낮은 분자량, c) 낮은 면역원성(low immunogenicity), d) 사람에 풍부하게 존재, 및 e) 3차원 구조 검증 가능 의 조건을 기준으로 EGFL (EGF-like) 도메인을 선정하였다.
EGFL은 다수의 혈장 단백질에 존재하는 40개의 아미노산으로 이루어진 모듈로서 저분자, 고안전성, 저면역성의 특성을 가진다. 2개의 beta-sheet와 3개의 di-sullfide 결합으로 이루어진 단순한 구조로서 3차원 구조 검증이 가능하고 구조에 영향을 주지 않는 loop가 존재하여 활성 폴리펩타이드 삽입이 용이하므로 DMID 후보로서 적합하다.
<1-2> 3차원 모델링
EGFL 도메인의 3차원 모델링을 위하여 BLAST 와 AlignMaster프로그램이 사용되었다. 인간 EGFL 도메인의 구조는 Protein DataBank로부터 제공 받았다.
이론적 기반의 돌연변이(Knowledge based mutagenesis)와 이차원 모델링은 nnPredic((www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict.html) 및 jppred (http://www.compbio.dundee.ac.uk/~www-jpred/submit.html)를 이용하여 수행하였다. 이론적 기반의 3차원 모델링(Knowledge based 3-dimensional models)은 Swiss Model(http://www.expasy.ch/)에서 제공받았으며, 이를 추가로 in silico 돌연변이 유발 후 Chimera/Modeller 6으로 검증하였다. 마지막 DMID 모델은 PyMOL로 분석되고 시각화 하였다.
<실시예 2>
재조합 DMID-AP1 발현 및 정제
<2-1> 형질전환 균주 제작 - DMID-SalI-HindIII cassette의 제작
본 발명의 단백질 골격 모듈(DMID)을 제작하기 위하여 스태빌린 2 단백질의 존재하는 EGFL 도메인 (4621-4869)을 E-coli 발현벡터인 pET32a (Novagen)의 BamH1과 Xho1 site에 클로닝하여 발현 단백질을 제조하였다. EGFL 도메인의 GCTGAC (4639-4644)을 GTCGAC 로 유전자 변이를 일으켜 제한효소 Sal1 site를 제조하고 AAAGCA (4703-4708)을 AAGCTT로 변이를 일으켜 제한효소 HindIII site를 제조하여 활성 폴리펩타이드를 끼워넣을 수 있는 DMID-Sal1-HindIII cassette를 제조하였다.
<2-2> 형질전환 균주의 배양
형질전환 된 Origami strain을 50ug/ml의 Ampicillin과 25ug/ml의 Kanamycin이 포함된 20ml의 Tryptone phosphate (TP) broth (2% bacto-tryptone, 0.2% Na2HPO4, 0.1% KH2PO4, 0.8% NaCl, 1.5% yeast extract and 0.2%glucose)에 밤새 배양하였다. 배양액을 4000 X g 로 5분간 원심분리 하여 pellet을 회수 한 후 50ug/ml의 암피실린이 함유된 동일 부피의 TP에 재현탁시켰다. 이를 TP broth에 100배 희석하여 37℃에서 OD600 값이 0.5가 될 때까지 배양하였다. 배양이 끝난 배양액을 20℃로 냉각한 후 0.2mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactoside) 로 12시간 동안 단백질 발현을 유도한 후 배양 세포를 회수하여 사용시까지 -80℃에 보관하였다.
<2-3> 단백질 추출 및 분리정제
상기 보관된 세포를 1mM PMSF, 0.5mM DTT가 포함된 10ml of 2X PBS 에 재현탁한 후, Duty cycle : 30%, Output: 2.5 for 5 min의 조건으로 초음파 분쇄 하였다. 분쇄된 세포를 15,000g로 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다.
회수된 상등액을 2XPBS Buffer로 equilibrate한 Ni-NTN 컬럼(amersham pharmacia biotech AB, Vt=0.5ml)에 제조사의 매뉴얼에 따라 setting하여 로딩하였다. 6 (his) tag이 붙은 DMID는 30mM 아미다졸이 포함된 2X PBS에서는 컬럼에 붙어 있으므로 30mM 이미다졸이 포함된 2X PBS로 컬럼을 수세(컬럼 볼륨의 10배)한 후 250mM 이미다졸이 포함된 1X PBS 버퍼(일루션 버퍼)로 컬럼에 붙은 단백질을 회수하였다.
<실시예 3>
재조합 DMID-AP1 결합능력 향상 검증 - 표면 플라즈몬 공명 분석
본 발명의 AP1이 내장된 단백질 골격 모듈(DMID-AP1)의 결합능력을 알아보기 위하여 naked AP1와 DMID-AP1의 결합상수를 Biacore 2000를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석 방법으로 측정하였다. 곤충세포 (SF21) 에서 발현 및 정제한 인간 IL-4 receptor 의 ectodomain (IL-4Ra) 을 HBS buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, and 0.005% surfactant P20)에 희석한 후 Biacore CM5 chip 표면에 제조사(Biacore Inc.)의 방법에 따라 coating 하였다(2500 RU). 동일 buffer에 희석한 AP-1 펩타이드 혹은 DMID-AP1를 흘려 (50 ul/min) RU 값의 변화를 측정한 후, Biaevaluation 2.0 프로그램을 사용하여 결합상수를 구하였다.
[도 2] 및 [도 3]에서 보는 바와 같이, surface plasmon resonance analysis를 한 결과 peptide imbedded DMID가 naked peptide에 비하여 174배 높은 친화력을 보이는 것을 확인하였다.
<실시예 4>
재조합 DMID-API detection 능력 향상 검증 1 - IL-4에 의한 IL-4 receptor의 활성 저해도의 측정
5X105의 THP1(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NCI9949) 세포를 6-well plate에 seeding 후 100ng/ml의 Phorbol12-myristate13-acetate (PMA) (Sigma,P8139-1MG)을 3일 동안 처리하여 activate 시킨다. 18시간 serum이 없는 조건에서 세포를 배양한 후 0.67 nM (1X)의 IL-4 단독 혹은 다양한 농도 [10nX(0.67nM)] 의 AP-1 peptide 또는 재조합 DMID-AP1을 함께 처리하였다. IL-4와 IL-4 receptor간의 결합에 의해 유도된 Stat 단백질의 인산화는 Rabbit polyclonal antibody anti-STAT6 (Cell Signaling, # 9362)와 rabbit polyclonal antibody anti-pTyr641-STAT6 (Cell Signaling, # 9361)을 사용하여 Western blot 방법으로 측정하였다
그 결과 [도 4]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 DMID-AP1이 AP1에 비하여 Stat 단백질을 인산화하는 IL-4 활성을 10배 이상 잘 저해함을 확인하였다.
<실시예 5>
재조합 DMID - AP1 detection 능력 향상 검증 2 - cellular imaging , animal imaging
<5-1> Cellular imaging
본 발명의 AP1이 내장된 단백질 골격 모듈(DMID-AP1)의 세포에 발현된 IL-4 receptor와의 경쟁적 결합능력을 알아보기 위하여 H226 cell line 에서의 naked AP1와 DMID-AP1의 IL-4 receptor에 대한 결합능력을 형광표지된 단백질을 사용하여 측정하였다. AP-1 펩타이드 혹은 정제된 DMID-AP1를 투석완충액 (50mM Boric acid, 150mM NaCl, 1mM EDTA, pH 9.0)으로 4℃에서 투석한 후 형광물질 Fluorescein Isothiocyanate (FITC) (sigma)와 37℃에서 한 시간 동안 반응시켜 표지하였다. 50 mM Glycine을 37℃에서 5분간 넣어주어 반응을 중지한 후 투석완충액 (20 mM Tris HCl, pH 8.0)으로 4℃에서 투석하였다. H226 cell에 각각 동일한 양의 대조군 펩타이드, AP-1, DMID-Ap1을 첨가하여 결합, 세척한 후 4% paraformaldehyde (PFA)로 고정하고 세포핵은 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 염색한후 형광현미경 (Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하였다.
그 결과 [도 5]에서 보는 바와 같이, AP1-DMID-FITC가 다른 AP-1 혹은 대조군 펩타이드에 비하여 IL-4 receptor를 발현하는 세포표지능력이 우수함을 확인하였다.
<5-2> Animal Imaging
1X107 개의 H226 세포를 배양배지에 부유시킨 후, 5~6주령의 암컷 BALB/c nude 마우스의 오른쪽 대퇴부에 피하 주사하여 피하종양모델을 제조하였다. 약 3주후 종양의 크기가 0.1~1cm 되었을 때 실험에 사용하였다. 종양 이종이식 마우스를 마취시킨 후 형광물질이 결합된 AP-1 펩타이드와 DMID-AP1 150 ug을 꼬리부분의 정맥에 주사하였다. 형광표지된 펩타이드의 종양타겟팅 기능을 Optics을 이용하여 분석하였다.
그 결과 [도 6]에서 보는 바와 같이, AP-1에 비교하여 DMID-AP1의 종양 타겟팅 기능이 향상되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 신규한 단백질 골격 모듈에 관한것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 골격 모듈 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 단백질 골격 모듈은 내장된 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키므로 질병의 진단 및 치료에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 크다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Development and application of Designed Modular Immunodiagnostics <130> NP11-0017 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID(Designed Modular Immunodiagnostics) cassette <400> 1 Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu Ile Ser Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys 1 5 10 15 Val Asp Cys Lys Arg Thr Thr Pro Gly Arg Arg Val Cys Thr Cys Lys 20 25 30 Leu Gly Tyr Thr Gly Asp Gly Ile Val Cys Leu Glu Ile Asn Pro Cys 35 40 45 Leu Glu Asn His Gly Gly Cys Asp Lys Asn Ala Glu Cys Thr Gln Thr 50 55 60 Gly Pro Asn Gln Ala Ala Cys Asn Cys Leu Pro Ala Tyr Thr Gly Asp 65 70 75 80 Gly Lys Val Cys Thr Leu 85 <210> 2 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID(Designed Modular Immunodiagnostics) cassette <400> 2 acagcaatca atgcctgtga gatcagcaat ggaggttgct ctgccaaggt cgactgtaag 60 agaaccaccc caggaaggcg agtgtgcacg tgcaagcttg gctacacggg tgatggcatt 120 gtgtgcctgg aaatcaaccc gtgtttggag aaccatggtg gctgtgacaa gaatgcggag 180 tgcacacaga caggacccaa ccaggctgcc tgtaactgtt tgccagcata cactggagat 240 ggaaaggtct gcacactcta 260 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-1 <400> 3 Lys Arg Leu Asp Arg Asn 1 5 <210> 4 <211> 254 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID(Designed Modular Immunodiagnostics) cassette with AP-1 <400> 4 acagcaatca atgcctgtga gatcagcaat ggaggttgct ctgccaaggt cgactgtcgt 60 aaacggctcg acaggaactg cacgtgcaag cttggctaca cgggtgatgg cattgtgtgc 120 ctggaaatca acccgtgttt ggagaaccat ggtggctgtg acaagaatgc ggagtgcaca 180 cagacaggac ccaaccaggc tgcctgtaac tgtttgccag catacactgg agatggaaag 240 gtctgcacac tcta 254 <210> 5 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID(Designed Modular Immunodiagnostics) cassette with AP-1-6 <400> 5 acagcaatca atgcctgtga gatcagcaat ggaggttgct ctgccaaggt cgactgtaaa 60 cggctcgaca ggaacaggcg agtgtgcacg tgcaagcttg gctacacggg tgatggcatt 120 gtgtgcctgg aaatcaaccc gtgtttggag aaccatggtg gctgtgacaa gaatgcggag 180 tgcacacaga caggacccaa ccaggctgcc tgtaactgtt tgccagcata cactggagat 240 ggaaaggtct gcacactcta 260 <210> 6 <211> 287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID(Designed Modular Immunodiagnostics) cassette with AP-1-12 <400> 6 acagcaatca atgcctgtga gatcagcaat ggaggttgct ctgccaaggt cgactgtaag 60 agaacccgat tcctgaaacg gctcgacagg aacctctggg gcaggcgagt gtgcacgtgc 120 aagcttggct acacgggtga tggcattgtg tgcctggaaa tcaacccgtg tttggagaac 180 catggtggct gtgacaagaa tgcggagtgc acacagacag gacccaacca ggctgcctgt 240 aactgtttgc cagcatacac tggagatgga aaggtctgca cactcta 287

Claims (13)

  1. a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    b) 서열번호 3으로 표시되는 AP-1(activator protein 1)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및
    c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈.
  2. 상기 제1항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 상기 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  4. 상기 제3항의 발현 벡터로 형질전환 된 숙주세포.
  5. 상기 제4항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 제조하는 방법.
  6. 상기 제1항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물.
  7. 상기 제1항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 상기 제1항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 암또는 동맥경화 진단용 키트.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 삭제
  13. 삭제
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