CN111647074A - 一种her3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用 - Google Patents

一种her3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111647074A
CN111647074A CN202010484456.5A CN202010484456A CN111647074A CN 111647074 A CN111647074 A CN 111647074A CN 202010484456 A CN202010484456 A CN 202010484456A CN 111647074 A CN111647074 A CN 111647074A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
her3
seq
mvf
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010484456.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111647074B (zh
Inventor
朱磊
孙金琳
张叶明
沈学彬
章圣朋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wannan Medical College
Original Assignee
Wannan Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wannan Medical College filed Critical Wannan Medical College
Priority to CN202010484456.5A priority Critical patent/CN111647074B/zh
Publication of CN111647074A publication Critical patent/CN111647074A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111647074B publication Critical patent/CN111647074B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种HER3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用，与现有技术相比，本发明抗原肽是基于HER3结构功能选取的，在阻断HER3信号传导功能上更具有针对性。本发明的抗原肽位于非HER3配体结合区的二聚化界面区，而现有的抗体多靶向配体结合区或靶向在配体结合后构象改变的区域，靶向二聚化界面区可以避免和配体竞争结合部位；本发明的抗原肽为线性B细胞表位抗原肽，不会受HER3构象变化而造成脱靶效应。本发明在制备防治HER3过表达肿瘤和逆转靶向EGFR、HER2药物耐药中应用，主要用于制备治疗性疫苗，治疗成本远比抗体低，副作用比需大剂量使用的抗体低。

Description

一种HER3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用
技术领域
本发明多肽及药物载体制备领域，具体涉及一种HER3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用。
背景技术
人类表皮生长因子受体3(HER3，human epidermal growth factor receptor 3)和人类表皮生长因子受体(EGFR/HER1,human epidermal growth factor receptor)、人类表皮生长因子受体2(HER2，human epidermal growth factor receptor 2)同属于表皮生长因子受体家族成员，该受体家族在胚胎和正常组织的生长发育过程中起重要调控作用。但EGFR和HER2表达上调或激活突变可分别见于结直肠癌、肺癌和部分乳腺癌，与肿瘤的增殖、转移和抗凋亡等密切相关，是明确的肿瘤治疗靶分子。
针对EGFR和HER2这两个靶，现有上市的药物有靶向EGFR胞外域治疗结肠癌的单克隆抗体Cetuximab、Panituzumab，靶向HER2胞外域治疗乳腺癌的单克隆抗体Trastuzumab、Pertuzumab等。除此外，还有靶向胞内酪氨酸激酶活性区的小分子抑制剂，这两类药物均能明显提高敏感病人的生存期，使这类癌症的治疗局面得到改善。但在EGFR、HER2阳性肿瘤患者的起始治疗后出现的较高比例的耐药性降低了这两类药物的预期治疗效果。并有复发肿瘤出现了单抗和酪氨酸激酶抑制剂双重耐药，使后续治疗面临无有效药物可用的局面。尽管原因复杂多样，但越来越多的研究表明，HER3表达上调及其信号通路的异常活化常可见于靶向EGFR、HER2单克隆抗体及一、二、三代酪氨酸激酶抑制剂治疗后耐药的非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌和转移性结肠癌，提示HER3与靶向EGFR、HER2药物耐药性的产生相关。
结构完整的HER家族受体由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，胞内区含有酪氨酸激酶活区性和多个可磷酸化氨基酸残基，胞外区按其功能有可分为Ⅰ-Ⅳ四个亚区，其中Ⅰ区和Ⅲ区位于分子的表面，两者间可组成一个可变空间结构，用于配体的识别与结合；Ⅱ区为结构高度保守区，主要参与受体二聚化的形成，Ⅳ区主要在配体未结合时通过与Ⅱ区的相互作用将其埋于胞外域内部使其处于一种自我抑制的静息状态。当他们的配体，如表皮生长因子(Epidermal growth factor EGF)、神经调节素1β(Neuregulin-1β，NRG1β)与其结合后，Ⅳ区与Ⅱ区解离，二聚化界面暴露，两个受体之间或与家族其他受体成员间形成同源或异源二聚体后激活细胞内酪氨酸激酶，进而激活与肿瘤细胞增殖、转移和抗凋亡等密切相关的PI3K/Akt、Ras/MEK/ERK等信号通路。配体促使受体二聚化界面的暴露及二聚体的形成，是该类受体将胞外信号传递到胞内的共有关键步骤，且二聚化界面区氨基酸序列在多个物种间保守。
尽管HER3胞内区没有胞内酪氨酸激酶区，但具有可磷酸化氨基酸残基，在耐药的肿瘤细胞和组织中，表达上调的HER3可与具有酪氨酸激酶活性的同家族受体或其他受体，如肝细胞生长因子受体MET、胰岛素样生长因子-1受体IGF-1R形成HER3/MET异源二聚体或HER2/HER3/IGF-1R三聚体而被磷酸化，进而激活驱动肿瘤细胞增殖、转移、抗凋亡和耐药的PI3K/Akt等信号通路。因此HER3是克服现有靶向EGFR及HER2药物耐药的关键分子靶。
目前报道的靶向HER3的药物开发主要以抗体为主，按其结合区域分主要有两类，一类是和配体竞争结合HER3配体结合区以阻断其信号通路；另外一类抗体，如LJM716在HER3没有结合配体时，通过结合由Ⅱ、Ⅳ区形成的构象表位，以阻止HER3二聚化所必须的构象的形成，进而阻断其信号通路。尽管这两类抗体在体外对HER3高表达和EGFR/HER2靶向药物耐药细胞株均表现出较好的抑制作用，但在临床试验中和对照相比，不能使相关患者的生存期得到改善。有研究表明，在靶向EGFR及HER2药物耐药和HER3高表达肿瘤患者体内NRG等HER3配体存在高水平的自分泌和旁分泌表达，而且配体比抗体分子小很多，造成抗体在与其竞争结合受体上存在劣势。同时HER3在结合配体后，空间构象改变，可能造成结合构象表位的LJM716类抗体脱靶。
另外，抗体类药物虽然在临床上表现了较好的疗效，但由于抗体给药属于被动免疫治疗，需要长期重复给药，且给药剂量大，因此增大了毒副反应风险，同时单抗因生产成本高、价格昂贵，给患者带来了沉重的经济负担。治疗性疫苗属于主动免疫，给药剂量小，仅需少数几次免疫接种，因此，比抗体类产品更具顺应性。恶性肿瘤治疗性多肽疫苗以肿瘤抗原肽为活性组分，可利用基因工程或化学合成手段低成本生产，具有较好的产业发展前景。
因此在HER3分子上找到合适靶点开发不受配体影响且具有阻断其信号通路功能的治疗性疫苗及高效抗体具有重要意义。
研究表明肿瘤组织会表达一些异于正常组织，称之为肿瘤相关抗原(TAA)的分子，如高表达或突变的HER3。尽管可以刺激患者产生低水平的免疫反应，但由于自身MHCⅡ类分子的限制，这种免疫反应十分微弱，需通过与适当的载体蛋白偶联而刺激机体对TAA产生强烈的免疫反应。
美国科学家Kaumaya实验室分析得到了一系列已上市靶向HER2抗体的线性B细胞表位，包括结合于HER2二聚化臂的Pertuzumab抗体的B细胞表位。他们将这些表位肽和该实验室分离鉴定的一种来自于麻疹融合蛋白的通用Th细胞表位肽MVF(measles virusfusion protein amino acids 288-302)相连制备了一系列融合肽。在一期临床试验中，这些融合肽可刺激HER2高表达乳腺癌患者产生高滴度的类似于上市单抗的功能抗体，产生了较好的治疗效果。
基于相同思路，李黄金等发明者在比较了EGFR二聚化臂区和位于HER2二聚化臂区的Pertuzumab抗体结合表位(线性B细胞表位)后，发现该区域在HER受体家族成员间保守，主要位点氨基酸相同，认为该区域也存在线性B细胞表位，并将其和MVF相连构建抗EGFR二聚化融合抗原肽。该融合抗原肽可在动物模型上刺激产生靶向EGFR二聚化界面的抗体。
另外古巴科学家将EGFR配体EGF和由他们发现的一种来自奈瑟氏脑膜炎球菌、由593个氨基酸残基组成的外膜蛋白P64k进行化学偶联，制得一类针对EGF过表达型治疗性疫苗CIMAvax-EGF(B细胞表位疫苗)，临床前和各期临床实验表明该疫苗可刺激人体产生可综合过量EGF的中和性抗体，且对人体具有良好的安全性。
以上案例和科学研究表明，来自人体自身的分子或是分子的一部分在正常情况下因MHCⅡ类分子的限制，不会刺激自身产生免疫反应，但当和适当载体，如P64k、MVF连接后，免疫原性可得到显现和提高，刺激机体产生针对性的免疫反应。
现有肿瘤治疗性B细胞表位疫苗的免疫原选择多是选取整个分子或是基于已上市抗体的结合表位。前者可能因免疫原分子较大造成潜在有效靶表位的遮蔽，难以激发机体产生有效免疫反应；后者激发机体产生的抗体的结合部位基本和上市抗体相同，难以避免上市抗体竞争结合劣势或脱靶的弊端，都具有局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HER3二聚化界面抗原肽，选取了多个位于HER3二聚化界面区的肽段，运用在线B细胞表位预测工具预测并选取了多个抗原特征较为明显的目前没有报道的线性B细胞表位抗原肽。
本发明另一目的在于提供一种上述抗原肽与MVF融合构建的重组抗原肽。
本发明另一个目的在于通过一种重组抗原肽的编码基因。
本发明最后一个目的在于提供一种抗原肽或重组抗原肽主要应用于HER3过表达肿瘤的治疗。
本发明具体技术方案如下：
一种HER3二聚化界面抗原肽，含有以下任一种氨基酸序列：
1)、HER3 183-227aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.1；
2)、SEQ ID No.1的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加使之具有抗HER3二聚化活性的抗原肽；
3)、HER3 236-308aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.2；
4)、SEQ ID No.2的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加使之具有抗HER3二聚化活性的抗原肽；
5)、HER3 559-591aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.3；
6)、SEQ ID No.3的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加使之具有抗HER3二聚化活性的抗原肽。
一种重组抗原肽，将上述HER3二聚化界面抗原肽用GPSL四聚肽接头分别和MVF融合构建的重组抗原肽；
具体为：
上述抗原肽HER3 183-227aa与MVF融合构建的重组抗原肽为MVF-GPSL-HER3183-227aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.4；
上述抗原肽HER3 236-308aa与MVF融合构建的重组抗原肽为MVF-GPSL-HER3236-308aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.5；
上述抗原肽HER3 559-591aa与MVF融合构建的重组抗原肽为MVF-GPSL-HER3559-591aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.6。
MVF-GPSL-HER3 183-227aa的基因序列如SEQ ID No.7所示。
MVF-GPSL-HER3 236-308aa的基因序列如SEQ ID No.8所示。
MVF-GPSL-HER3 559-591aa的基因序列如SEQ ID No.9所示。
引物具体如下：
MVF-GPSL-HER3 183-227aa的基因引物：
F:GGAGCCATGGGTAAACTTCTTAGCCTTATCAAAGGTGTTATCG，如SEQ ID No.10；
Nco Ⅰ酶切位点
R:ATCCAAGCTTTTAGCACGCAAAGCAGTCGGTG，如SEQ ID No.11；
HindⅢ酶切位点
MVF-GPSL-HER3 236-308aa的基因引物：
F:GGAGCATATGAAACTTCTTAGCCTTATCAAAGGTGTTATCGTTCACC，如SEQ ID No.12；
NdeⅠ酶切位点
R:ATCCCTCGAGGCATAAACCACCGCACGGCTC，如SEQ ID No.13；
Xhol Ⅰ酶切位点
MVF-GPSL-HER3 559-591aa的基因引物：
F:GGAGCCATGGGTAAACTTCTTAGCCTTATCAAAGGTGTTATCG，如SEQ ID No.14；
Nco Ⅰ酶切位点
R:ATCCAAGCTTTTAGCATTCGTTCTGAACGTCCGG，如SEQ ID No.15。
HindⅢ酶切位点
带核酸内切酶酶切位点的MVF-GPSL-HER3 183-227aa编码基因的合成方法：
以序列SEQ ID No.7为模板，以序列SEQ ID No.10和序列SEQ ID No.11为引物，以95℃5min，95℃30s、53℃30s和72℃30s 4个循环，95℃30s、60℃30s和72℃30s 26个循环，72℃7min为PCR扩增条件，扩增得到编码基因。
带核酸内切酶酶切位点的MVF-GPSL-HER3 236-308aa编码基因的合成方法：
以序列SEQ ID No.8为模板，以序列SEQ ID No.12和序列SEQ ID No.13为引物，以95℃5min，95℃30s、54℃30s和72℃30s 4个循环，95℃30s、60℃30s和72℃30s 26个循环、72℃7min为PCR扩增条件，扩增得到编码基因。
带核酸内切酶酶切位点的MVF-GPSL-HER3 559-591aa编码基因的合成方法：
以序列SEQ ID No.9为模板，以序列SEQ ID No.14和序列SEQ ID No.15为引物，以95℃5min，95℃30s、52℃30s和72℃30s 4个循环，95℃30s、60℃30s和72℃30s 26个循环、72℃7min为PCR扩增条件，扩增得到编码基因。
上述三种多肽委托商业公司进行化学合成。三种重组肽的基因采用化学合成，带核酸内切酶酶切位点的三种重组肽的基因采用PCR法扩增，利用大肠杆菌原核表达体系表达三种重组肽基因，采用亲和层析法纯化三种重组肽。
上述HER3二聚化界面抗原肽或重组抗原肽在制备防治HER3过表达的肿瘤的药物中的应用，或在靶向EGFR、HER2药物治疗后出现因HER3高表达所致对靶向EGFR、HER2药物耐药的肿瘤治疗中的应用。上述肿瘤包括：乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、头颈癌或前列腺癌。
还包括作为治疗性多肽疫苗的有效成分或作为抗原制备抗体，抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或者连接上述抗原肽的活性片段。
本发明利用所述重组肽制备终浓度为2mg/L的混悬液作为抗原刺激动物模型产生不同滴度的抗体，三种重组肽的混悬液免疫动物后产生的抗体滴度均较相应溶液型重组肽免疫后产生的滴度高。
本发明HER3二聚化抗原肽的选取策略：
HER3二聚化界面是指其与其他受体形成二聚体时相互接触的分子表面，依赖于二聚体的形成，HER3胞内酪氨酸残基被与其形成二聚体的受体分子的胞内酪氨酸激酶磷酸化，进而将胞外信号传递到胞内。因此二聚体的形成是HER3参与的信号转导的关键步骤。本发明基于HER3参与信号传导的二聚化关键步骤，选取所有位于HER3二聚化界面区的肽段，并运用多种B细胞表位预测工具分析锁定B细胞表位。以此策略选取B细胞表位抗原肽的优点有三个：一是可以激发机体产生靶向结合于HER3二聚化界面的抗体，进而在空间上阻滞HER3二聚体的形成；二是该策略选取的是短肽，可避免因免疫原分子较大造成潜在有效靶表位的遮蔽，难以激发机体产生有效免疫反应；三是避免了使用已知的单克隆抗体结合表位作为疫苗激发机体产生和单抗相同的竞争结合劣势或脱靶抗体的弊端。
本发明的HER3二聚化抗原肽作用机制：
HER3受体由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，胞内区含有无活性的酪氨酸激酶活区性和多个可磷酸化氨基酸残基，胞外区按其功能有可分为Ⅰ-Ⅳ四个亚区，其中Ⅰ区和Ⅲ区位于分子的表面，两者间可组成一个可变空间结构，用于配体的识别与结合；Ⅱ区为结构高度保守区，主要参与受体二聚化的形成，Ⅳ区主要在配体未结合时通过与Ⅱ区的相互作用将其埋于胞外域内部使其处于一种自我抑制的静息状态。当他们的配体，如神经调节素1β(Neuregulin-1β，NRG1β)与其结合后，Ⅳ区与Ⅱ区解离，二聚化界面暴露，两个受体之间或与家族其他受体成员间形成同源或异源二聚体后激活细胞内酪氨酸激酶，进而激活与肿瘤细胞增殖、转移和抗凋亡等密切相关的PI3K/Akt、Ras/MEK/ERK等信号通路。本发明构建的三种重组肽的B细胞表位均位于HER3二聚化界面区，无论配体结合与否都暴露于HER3胞外域表面，保证重组肽免疫机体产生的抗体在理论上不受配体影响，靶向二聚化界面区，进而阻断HER3参与的二聚体的形成。阻断其参与的与肿瘤细胞增殖、转移和抗凋亡等密切相关的信号通路，从而达到控制肿瘤细胞增殖，逆转靶向EGFR、HER2药物耐药的作用。目前尚无靶向这些表位的治疗性疫苗和抗体的相关研究。
与现有技术相比，本发明抗原肽是基于HER3功能结构选取的，在阻断HER3信号传导功能上更具有针对性。本发明的抗原肽位于非HER3配体结合区的二聚化界面区，而现有的抗体多靶向配体结合区或靶向在配体结合后构象改变的区域，靶向二聚化界面区可以避免和配体竞争结合部位；本发明的抗原肽为线性B细胞表位抗原肽，不会受HER3构象变化而造成脱靶效应。本发明在制备防治HER3过表达肿瘤和逆转靶向EGFR、HER2药物耐药中应用，主要用于制备治疗性疫苗，治疗成本远比抗体低，副作用比需要大剂量使用的抗体低。本发明使用重组抗原肽混悬液作为抗原较重组抗原肽溶液作为抗原可刺激动物模型产生更高滴度抗体的方法。比较了相同量重组肽的混悬液和溶液分别作为抗原刺激同种动物模型产生不同滴度的抗体，三种重组肽的混悬液免疫动物后产生的抗体滴度均较相应溶液型重组肽免疫后产生的滴度高，本发明制备的混悬型重组肽颗粒能够缓慢释放重组肽，可有效持久的刺激实验动物产生相关免疫反应。
附图说明
图1为188-236aa肽段；
图2为234-312aa肽段；
图3为474-591aa肽段；
图4为选取的HER3二聚化界面B细胞表位肽段；
图5构建的重组抗HER3二聚化界面B细胞表位肽；
图6为重组质粒pET32a-MVF-GPSL-HER3 183-227aa、pET21b-MVF-GPSL-HER3236-308aa和pET32a-MVF-GPSL-HER3 559-591aa的双酶切鉴定；
A中M:DNA marker；1:pET32a-MVF-GPSL-HER3 183-227aa质粒酶切产物；
B中M:DNA marker；1:pET21b-MVF-GPSL-HER3 236-308aa质粒酶切产物；
C中M:DNA marker；1:pET32a-MVF-GPSL-HER3 559-591aa质粒酶切产物；
图7为重组HER3二聚化界面肽的原核融合表达；
图中A：M:蛋白marker；1-6:诱导后pET32a-MVF-GPSL-HER3 183-227aa阳性克隆菌体全菌裂解蛋白；
图中B：M:蛋白marker；1-8:诱导后pET21b-MVF-GPSL-HER3 236-308aa阳性克隆菌体全菌裂解蛋白；
图中C：M:蛋白marker；1-6:诱导后pET32a-MVF-GPSL-HER3 559-591aa阳性克隆菌体全菌裂解蛋白；
图8重组HER3二聚化界面肽的纯化；
图中A为MVF-GPSL-HER3 183-227aa的纯化:M-蛋白marker；1-未诱导前菌体蛋白；2-诱导后菌体蛋白；3-裂解沉淀；4-裂解上清；5-经30％硫酸铵沉淀的裂解上清蛋白；6-融合蛋白；7-硫氧还蛋白(Trx)和其他杂蛋白；8-MVF-GPSL-HER3 183-227aa；
图中B为MVF-GPSL-HER3 236-308aa的纯化:M-蛋白分子量；1-全菌蛋白；2-裂解上清；3-8M/L尿素溶解裂解沉淀；4-流穿液；5-纯化的MVF-GPSL-HER3 236-308aa；
图中C为MVF-GPSL-HER3 559-591aa的纯化:M-蛋白marker；1-未诱导前菌体蛋白；2-诱导后菌体蛋白；3-裂解沉淀；4-裂解上清；5-经30％硫酸铵沉淀的裂解上清蛋白；6-融合蛋白；7-Trx和其他杂蛋白；8-MVF-GPSL-HER3 559-591aa；
图9为抗重组HER3二聚化界面肽多克隆抗体效价分析；
图中A为抗MVF-GPSL-HER3 183-227aa抗体效价；
图中B为抗MVF-GPSL-HER3 236-308aa抗体效价；
图中C为抗MVF-GPSL-HER3 559-591aa抗体效价；
图10为抗重组HER3二聚化界面肽多克隆抗体的抗原特异性；
图中A为抗MVF-GPSL-HER3 183-227aa多克隆抗体的抗原特异性分析，图中1-0.8μgMVF-GPSL-HER3 183-227aa蛋白；2-0.4μg MVF-GPSL-HER3 183-227aa蛋白；3-0.2μgMVF-GPSL-HER3 183-227aa蛋白；
图中B为抗MVF-GPSL-HER3 236-308aa多克隆抗体的抗原特异性分析，图中1-0.8μgMVF-GPSL-HER3 236-308aa蛋白；2-0.4μg MVF-GPSL-HER3 236-308aa蛋白；3-0.2μgMVF-GPSL-HER3 236-308aa蛋白；
图中C为抗MVF-GPSL-HER3 559-591aa多克隆抗体的抗原特异性分析，图中1-0.8μgMVF-GPSL-HER3 559-591aa蛋白；2-0.4μg MVF-GPSL-HER3 559-591aa蛋白；3-0.2μgMVF-GPSL-HER3 559-591aa蛋白；
图11抗重组HER3二聚化界面肽多克隆抗体识别并沉淀来自MCF7细胞裂解液中非变性HER3；
图中A：1-MCF7全细胞裂解液；2-PBS免疫沉淀组；3-阴性血清免疫沉淀组；4-抗MVF-GPSL-ErbB3 183-227aa血清免疫沉淀组；
图中B：1-MCF7全细胞裂解液；2-PBS免疫沉淀组；3-阴性血清免疫沉淀组；4-抗MVF-GPSL-ErbB3 236-308aa血清免疫沉淀组；
图中C：1-MCF7全细胞裂解液；2-PBS免疫沉淀组；3-阴性血清免疫沉淀组；4-抗MVF-GPSL-ErbB3 559-591aa血清免疫沉淀组；
图12为抗重组HER3二聚化界面肽多克隆抗体可结合MCF7细胞膜上的HER3并靶向其二聚化界面；
图中A为抗MVF-GPSL-HER3 183-227aa多克隆抗体结合MCF7细胞；
图中B为抗MVF-GPSL-ErbB3 236-308aa多克隆抗体结合MCF7细胞；
图中C为抗MVF-GPSL-ErbB3 559-591aa多克隆抗体结合MCF7细胞；
图13为抗重组HER3二聚化界面肽多克隆抗体抑制MCF7细胞增殖；
图中A为三种抗重组HER3二聚化界面肽多克隆抗体抑制MCF7细胞增殖；
图中B为三种抗重组HER3二聚化界面肽多克隆抗体对NRG1β刺激的MCF7细胞增殖抑制作用。
具体实施方式
下述实施例中，HER3 183-227aa抗原肽氨基酸序列为SEQ ID No.1，HER3 236-308aa抗原肽氨基酸序列为SEQ ID No.2，HER3 559-591aa抗原肽氨基酸序列为SEQ IDNo.3，MVF-GPSL-HER3 183-227aa重组抗原肽氨基酸序列为SEQ ID No.4，MVF-GPSL-HER3236-308aa重组抗原肽氨基酸序列为SEQ ID No.5，MVF-GPSL-HER3 559-591aa重组抗原肽氨基酸序列为SEQ ID No.6。
实施例1
HER3 183-227aa、HER3 236-308aa、HER3 559-591aa二聚化B细胞表位的选取：
在NCBI数据库中检索HER3全长氨基酸序列，结合HER3 3D结构图，选取暴露于二聚化结构表面、易于接近的肽段(图1、图2和图3)，用在线B细胞表位预测工具，从预测B细胞表位常用的亲水性、可即性、转角和抗原特征等几个方面评价、选取各段中综合评分最高的肽段作为HER3二聚化B细胞表位肽段(图4)。
实施例2
制备MVF-GPSL-B细胞表位形式的抗原肽
重组B细胞表位肽MVF-GPSL-HER3 183-227aa、MVF-GPSL-HER3 236-308aa和MVF-GPSL-HER3 559-591aa中，MVF为“通用Th表位序列”，GPSL为柔性接头(图5)。这些重组肽既可以采用直接化学合成法也可以采用基因工程法生产。在本实施例中采用基因工程法生产重组肽，首先合成重组肽的基因，并将其克隆于原核或真核表达系统，诱导表达后，采用一定的方法分离纯化既得。因化学合成长肽的成本较高，且难以保证结构的正确性。本发明采用基于大肠杆菌表达系统的基因工程法生产。
1)目的基因的获取
根据设计的重组抗原肽氨基酸序列，参照大肠杆菌偏爱密码子写出重组抗原肽的基因序列，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。同时根据编码重组肽基因两端的核酸序列设计并合成含核酸内切酶酶切位点的上下游引物，以合成的重组肽基因为模板，PCR法扩增重组肽基因。
具体为：
a.重组肽MVF-GPSL-HER3 183-227aa基因的扩增
以合成的MVF-GPSL-HER3 183-227aa基因为模板，序列如SEQ ID No.7所示，用以下引物，以95℃5min,(95℃30s、53℃30s、72℃30s)4个循环,(95℃30s、60℃30s、72℃30s，)26个循环,、72℃7min为PCR扩增条件扩增含核酸内切酶酶切位点的重组肽MVF-GPSL-HER3183-227aa的基因。
引物：
F:5’-GGAGCCATGGGTAAACTTCTTAGCCTTATCAAAGGTGTTATCG-3’，如SEQ ID No.10；Nco Ⅰ酶切位点
R:5’-ATCCAAGCTTTTAGCACGCAAAGCAGTCGGTG-3’，如SEQ ID No.11；
Hind Ⅲ酶切位点
b.重组肽MVF-GPSL-HER3 236-308aa基因的扩增
以合成的MVF-GPSL-HER3 236-308aa基因为模板，序列如SEQ ID No.8所示，用以下引物，以95℃5min,(95℃30s、54℃30s、72℃30s)4个循环,(95℃30s、60℃30s、72℃30s，)26个循环，72℃7min为PCR扩增条件扩增含核酸内切酶酶切位点的重组肽MVF-GPSL-HER3236-308aa的基因。
引物：
F:5’-GGAGCATATGAAACTTCTTAGCCTTATCAAAGGTGTTATCGTTCACC-3’，如SEQ IDNo.12；Nde Ⅰ酶切位点
R:5’-ATCCCTCGAGGCATAAACCACCGCACGGCTC-3’，如SEQ ID No.13；
Xhol Ⅰ酶切位点
c.重组肽MVF-GPSL-HER3 559-591aa基因的扩增
以合成的MVF-GPSL-HER3 559-591aa基因为模板，序列如SEQ ID No.9所示，用以下序列引物，以95℃5min，(95℃30s、52℃30s、72℃30s)4个循环，(95℃30s、60℃30s、72℃30s，)26个循环，72℃7min为PCR扩增条件扩增含核酸内切酶酶切位点的重组肽MVF-GPSL-HER3 559-591aa的基因。
引物：
F:5’-GGAGCCATGGGTAAACTTCTTAGCCTTATCAAAGGTGTTATCG-3’，如SEQ ID No.14；Nco Ⅰ酶切位点
R:5’-ATCCAAGCTTTTAGCATTCGTTCTGAACGTCCGG-3’，如SEQ ID No.15。
Hind Ⅲ酶切位点
2)表达质粒的构建
pET21b和扩增的带有核酸内切酶酶切位点的重组抗原肽MVF-GPSL-HER3 236-308aa基因经购自宝日医生物技术(北京)有限公司的核酸内切酶Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切及T4DNA连接酶连接构建重组抗原肽表达质粒。带有酶切位点的重组抗原肽MVF-GPSL-HER3183-227aa和MVF-GPSL-HER3 559-591aa经Nco Ⅰ和HindⅢ双酶切后连接于同样用核酸内切酶Nco Ⅰ和HindⅢ双酶切、并自带硫氧环蛋白(Trx)基因片段的pET32a载体，构建融合表达质粒。重组质粒用和构建时使用的相同的DNA内切酶双酶切进行鉴定，酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如(图6)，构建的质粒经大肠杆菌DH5α宿主菌扩增后转化表达工程菌BL21(DE3)菌株，用1mM/L IPTG进行诱导表达，诱导表达后的菌体经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析筛选可表达重组肽的阳性克隆，结果如(图7)。
3)重组肽基因的诱导表达
将筛选的工程菌接种至液体LB培养基中，培养基中含有90mg/L氨苄青霉素，37℃培养至对数生长期后，加入IPTG至终浓度为1mM/L诱导融合蛋白表达6h。
4)重组肽的分离纯化
a.重组肽MVF-GPSL-HER3 183-227aa和MVF-GPSL-HER3 559-591aa的分离纯化
表达重组肽MVF-GPSL-HER3 183-227aa的菌株在37℃、1mM/L IPTG条件下诱导培养6h后，12000转每分钟离心5分钟收集菌体，再用PBS缓冲液重悬收集的菌体，然后用超声破碎机在条件为120W每间隔2秒工作2秒下超声破碎30分钟。超声后的混悬液经12000转每分钟离心10分钟取上清，加入研细的硫酸铵细粉至终浓度为30％(质量/体积，下述如无特殊说明百分含量均如此法表示)沉淀粗提融合蛋白。沉淀蛋白经平衡液(pH7.4、20mM/L磷酸盐、500mM/L NaCl、20mM/L咪唑)重溶和0.45微米滤膜过滤后进行镍离子亲和层析，用平衡液洗脱未结合杂蛋白，融合蛋白因含六聚组氨酸标签结合在层析柱上，可用洗脱液(pH7.4、20mM/L磷酸盐、500mM/L NaCl、500mM/L咪唑)将其洗脱下来既得纯化融合蛋白。利用融合蛋白序列上Trx和重组肽之间的肠激酶酶切位点，将纯化后的融合蛋白的缓冲液置换成肠激酶工作缓冲液(pH8.0、20mM/L Tris-HCl)后，根据肠激酶说明书加入肠激酶16℃恒温酶切18小时，将酶切产物溶液加入咪唑至终浓度为20mM/L上镍离子亲和层析柱，目的肽因不含六聚组氨酸标签而穿透，带六聚组氨酸标签的Trx蛋白保留在柱上，收集穿透液并将缓冲液置换成纯化水，真空冷冻干燥后得重组肽粉末。层析过程中及酶切前后均留样进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如(图8中A)。
重组肽MVF-GPSL-HER3 559-591aa的分离纯化过程同重组肽MVF-GPSL-HER3183-227aa。结果如(图8中C)
b.重组肽MVF-GPSL-HER3 236-308aa的分离纯化
表达重组肽MVF-GPSL-HER3 236-308aa的菌株在37℃、1mM/L IPTG条件下诱导培养6h后，用含2M/L尿素pH7.4、20mM/L的磷酸盐缓冲液重悬离心收集的菌体，然后用超声破碎机在条件为120W每间隔2秒工作2秒下超声破碎30分钟，离心取沉淀，再用含8M/L尿素pH7.4、20mM/L咪唑的20mM/L磷酸盐缓冲液溶解包涵体后经镍离子亲和层析，因重组肽末端含有六聚组氨酸标签结合于柱上，用含500mM/L咪唑的磷酸盐缓冲液将洗脱结合于柱上的重组肽MVF-GPSL-HER3 236-308aa，并用分子筛柱将纯化得到的重组肽缓冲液置换成纯化水后，用真空冷冻干燥机冻干。层析过程中留样进行120g/L SDS-PAGE分析，结果如(图8中B)。
实施例3
三种重组抗HER3二聚化抗原肽免疫原性分析及多克隆抗体的制备。用上述纯化的重组抗原肽作为抗原免疫大鼠，分析免疫原性及制备重组抗原肽抗血清。
1)重组抗HER3二聚化抗原肽免疫
将冻干得到的三种重组肽MVF-GPSL-HER3 183-227aa、MVF-GPSL-HER3 236-308aa和MVF-GPSL-HER3 559-591aa粉末称重，并按每2mg加入1ml生理盐水重溶，经多次轻柔吹打后发现三种重组肽粉末均不能完全溶解，呈混悬状态。取每种重组肽混悬液100微升，经18000转/分钟离心10分钟后，发现离心管底部有未溶解的多肽沉淀，取上清测得三种重组肽溶液浓度分别为：MVF-GPSL-HER3 183-227aa(0.45mg/ml)、MVF-GPSL-HER3 236-308aa(0.55mg/ml)和MVF-GPSL-HER3 559-591aa(0.5mg/ml)。将这三种重组肽分别制备成终浓度为2mg/ml的混悬液和终浓度为0.45mg/ml的溶液，每种肽的混悬液和溶液均按每只每次200μg重组肽的量免疫200克-250克范围内雄性SPF级昆明大鼠，每种重组抗原肽混悬态和溶液态均免疫4只大鼠，以比较同种重组肽的混悬态和溶液态刺激产生抗体水平的差异。首次免疫时，将等体积的弗氏完全佐剂和重组抗原肽混悬液或溶液混合乳化后，进行SD大鼠腹股沟皮下多点注射，重组抗原肽混悬液和溶液注射的次数和每次注射重组肽的量相同。首次免疫15天后，重组抗原肽混悬液或溶液与弗氏不完全佐剂充分乳化后进行腹部皮下注射进行第2次免疫。约两周后，于尾尖取少量全血制备血清，以ELISA法测定血清中抗重组肽抗体效价，具体操作如下。在二次免疫后，当抗血清效价达到1∶100 000以上时，则取大鼠全血并分离抗血清备用。
2)抗体效价的测定
按照现有技术进行抗肽多克隆抗体效价测定。首先将100μl用包被液溶解成5mg/L的HER3 183-227aa、HER3 236-308aa、HER3 559-591aa抗原肽溶液分别加入96孔酶标板的孔中，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉封闭2h，将倍比稀释的大鼠抗血清按100μL每孔(稀释比例从1:8 000到1:1 024 000，其中抗MVF-GPSL-HER3 559-591aa血清从1:8 000到1:512000)、浓度从低到高依次加入，每组3个复孔，免疫前血清稀释方法同实验组，37℃孵育1h。加入HRP标记的山羊抗大鼠IgG孵育1h。在抗原包被、封闭、孵一抗和孵二抗的操作之间均用PBST(含0.5％的吐温20的20mM/L的磷酸盐缓冲液)洗板，每个操作间隔震荡洗3次，每次2分钟。最后用TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色20分钟、2M/L硫酸终止显色后，用EPOCH牌全波长酶标仪测定450nm处吸光度值。S/N＝OD稀释抗血清/OD阴性对照组，当S/N≥2.5时判定为阳性，ELISA结果显示三种重组肽混悬液免疫产生的抗体滴度均可达1:512000以上，而含相同量相应重组肽溶液免疫所产生的抗体滴度不到1:128000(图9)。
实施例4
抗重组抗原肽多克隆抗体对重组肽和非变性HER3的特异性识别鉴定
(1)蛋白印迹法检测抗肽多克隆抗体抗原特异性鉴定
将上述三种纯化的重组抗原肽(0.2、0.4、0.8μg)用12％聚丙烯酰胺凝胶恒压100伏电泳1.5小时后，恒压150伏转印3小时至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜，转印后用含5％的脱脂奶粉的PBST(0.1％的吐温20的磷酸盐缓冲液)37℃封闭1小时后，用含3％牛血清白蛋白的PBST稀释的相应的三种大鼠抗肽多克隆抗体为一抗室温孵育2小时(抗体稀释比例1:1000)，PBST洗膜3次后，用HRP标记的山羊抗大鼠抗体为二抗室温孵育1小时，PBST洗膜4次后，用化学发光液显影及GE Amersham Imager600型号的自动化学发光凝胶成像系统拍照，检测抗肽多克隆抗体能否结合重组抗原肽，结果显示抗重组肽可以剂量依赖形式特异性结合各重组肽，结果如(图10)。
(2)免疫沉淀法检测抗肽多克隆抗体特异性识别非变性HER3
利用现有技术，将交联有蛋白A/G琼脂糖凝胶颗粒分别与免疫前大鼠血清和免疫后血清4℃孵育2小时，PBS洗三次后，沉淀与新鲜人乳腺癌MCF7细胞裂解液4℃孵育过夜，PBS洗4次，离心，沉淀加入适量蛋白凝胶电泳上样缓冲液煮沸变性，样品经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后转PVDF膜，用购自CST公司的商品化兔抗人HER3抗体为一抗、HRP标记的山羊抗兔抗体为二抗，分析抗重组肽抗体能否结合非变性HER3。若非变性HER3可被抗重组肽抗体沉淀，则商品化抗HER3抗体能将其识别。免疫沉淀结果显示，和阳性、无血清及阴性血清对照组相比，抗重组肽抗体可特异性沉淀非变性HER3，分子量大小与阳性对照组相同，结果如(图11)。
实施例5
流式细胞术分析抗重组肽多克隆抗体的HER3二聚化界面靶向性
用含10％胎牛血清的DMEM培养基体外人工培养HER3高表达人乳腺癌MCF7细胞，待细胞长满后，用1mM/L的EDTA将其从培养皿上消化下来，用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭0.5h，然后分为三组，第一组加入免疫前大鼠血清抗体、第二组加入抗重组肽抗体，终浓度均为50mg/L，第三组加入抗重组肽抗体至终浓度为50mg/L和ErbB3配体NRG1β至终浓度为10μg/L，室温孵育1h，PBS洗涤3次，以DyLight488标记山羊抗大鼠抗体为二抗，室温孵育30min，一抗和二抗均用含1％牛血清白蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液稀释，PBS洗涤3次，流式细胞仪分析抗体的细胞结合情况。三种抗重组肽多克隆抗体的HER3二聚化界面靶向性分析均依此法。流式结果表明，和免疫前大鼠血清抗体相比，三种抗肽抗体均可特异性结合MCF7细胞膜表面HER3，当加入NRG1β刺激暴露更多二聚化界面时，结合率进一步增大，表明抗重组肽抗体可特异性结合HER3二聚化界面，结果见(图12)。
实施例6
抗重组肽多克隆抗体对MCF7细胞的增殖抑制作用
用含10％胎牛血清的DMEM培养基在5％二氧化碳浓度下37℃恒温细胞培养箱中人工培养HER3高表达人乳腺癌MCF7细胞，待胰酶消化后1000转每分钟离心5分钟，将MCF7细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬按50000个/ml，100μl/孔种入96孔板中。细胞贴壁后分为八组，第一组加入100μl用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释的纯化的免疫前大鼠多克隆抗体作为阴性对照(免疫前多抗)，第二到第四组分别加入100μl用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释的三种纯化的大鼠抗重组肽多克隆抗体(抗MVF-HER3 183-227aa多抗、抗MVF-HER3 236-308aa多抗、抗MVF-HER3 559-591aa多抗)溶液，第五组加入100μl含10％胎牛血清和10μg/L NRG1β的DMEM培养基稀释的纯化的免疫前大鼠多克隆抗体作为阴性对照(免疫前多抗+NRG1β)，第六到第八组分别加入100μl用含10％胎牛血清和10μg/L NRG1β的DMEM培养基稀释的三种纯化的大鼠抗重组肽多克隆抗体(抗MVF-HER3183-227aa多抗+NRG1β、抗MVF-HER3 236-308aa多抗+NRG1β、抗MVF-HER3 559-591aa多抗+NRG1β)溶液，第一到第八组中抗体均按0、10、100、200和400mg/L五个浓度处理细胞，每个浓度三个重复孔，5％二氧化碳浓度下37℃恒温细胞培养箱中共同孵育72小时。72小时后，弃去培养基，板孔中细胞经10％三氯醋酸固定4℃固定1小时，去离子水洗5次后，用0.4％磺酰罗丹明B染液染色15分钟，再用0.1％(体积/体积)冰醋酸溶液洗涤5次、空气干燥后，每孔加入100μl 10mM/L Tris溶液溶解染料，用EPOCH牌全波长酶标仪在540nm波长处测定每孔吸光度值。溶液颜色浅，吸光度值低，则表示细胞数量少，结果用细胞存活数±标准偏差表示，见(图13中A图为1-4组，B图为5-6组)。
结果表明，由本发明公开的重组HER3二聚化B细胞表位抗原肽可诱导大鼠产生高滴度的抗体，抗重组肽抗体可特异性地与天然状态的HER3特异结合，具有良好的HER3二聚化界面靶向性。SRB实验表明，无论有无NRG的存在，抗重组HER3二聚化界面肽多克隆抗体对HER3高表达细胞MCF7都具有一定的增殖抑制作用。本发明所选取的三个肽段和大鼠对应相同结构肽段的氨基酸序列同源性均在94％以上，半胱氨酸等关键氨基酸位点100％同源见(表1)。
表1：本发明三个肽段和大鼠对应相同结构肽段的氨基酸序列同源性比较
Figure BDA0002518514900000101
因此可以推断上述三种抗原肽也可以在人体内诱导高滴度的靶向HER3二聚化界面的且具有抑制HER3过表达肿瘤细胞增殖功能的的抗体。
SEQUENCE LISTING
<110> 皖南医学院
<120> 一种HER3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用
<130> 1
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 45
<212> PRT
<213> HER3 183-227aa 氨基酸序列
<400> 1
Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His
1 5 10 15
Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly
20 25 30
Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys Phe Ala Cys
35 40 45
<210> 2
<211> 73
<212> PRT
<213> HER3 236-308aa 氨基酸序列
<400> 2
Cys Val Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe
1 5 10 15
Gln Leu Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys
20 25 30
Val Ala Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val
35 40 45
Arg Ala Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys
50 55 60
Met Cys Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys
65 70
<210> 3
<211> 33
<212> PRT
<213> HER3 559-591aa 氨基酸序列
<400> 3
His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val
1 5 10 15
Leu Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn Glu
20 25 30
Cys
<210> 4
<211> 67
<212> PRT
<213> MVF-GPSL-HER3 183-227aa 氨基酸序列
<400> 4
Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly
1 5 10 15
Val Glu Gly Pro Ser Leu Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala
20 25 30
Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys
35 40 45
His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys
50 55 60
Phe Ala Cys
65
<210> 5
<211> 96
<212> PRT
<213> MVF-GPSL-HER3 236-308aa 氨基酸序列
<400> 5
Met Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu
1 5 10 15
Gly Val Glu Gly Pro Ser Leu Cys Val Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu
20 25 30
Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn Pro His Thr Lys
35 40 45
Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro His Asn Phe Val
50 55 60
Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu
65 70 75 80
Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys
85 90 95
<210> 6
<211> 55
<212> PRT
<213> MVF-GPSL-HER3 559-591aa 氨基酸序列
<400> 6
Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly
1 5 10 15
Val Glu Gly Pro Ser Leu His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser
20 25 30
Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr
35 40 45
Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys
50 55
<210> 7
<211> 201
<212> DNA
<213> MVF-GPSL-HER3 183-227aa的基因序列
<400> 7
aaacttctta gccttatcaa aggtgttatc gttcaccgtc ttgaaggtgt tgaaggtccg 60
tctctttgcc agaccttaac caagaccatc tgcgcgccgc agtgcaatgg ccattgcttt 120
ggcccgaatc cgaatcagtg ctgccatgac gagtgcgcgg gcggctgcag cggcccgcag 180
gacaccgact gctttgcgtg c 201
<210> 8
<211> 291
<212> DNA
<213> MVF-GPSL-HER3 236-308aa的基因序列
<400> 8
aaacttctta gccttatcaa aggtgttatc gttcaccgtc ttgaaggtgt tgaaggtccg 60
tctctttgtg ttccgcgttg tccgcagccg cttgtttaca acaaacttac cttccagctt 120
gaaccgaacc cgcacaccaa ataccagtac ggtggtgttt gtgttgcaag ctgcccgcat 180
aacttcgttg ttgaccagac cagctgcgtc cgcgcatgcc cgccggacaa aatggaggtt 240
gacaagaacg gtttaaagat gtgcgagccg tgcggtggtt tatgcctcga g 291
<210> 9
<211> 165
<212> DNA
<213> MVF-GPSL-HER3 559-591aa的基因序列
<400> 9
aaacttctta gccttatcaa aggtgttatc gttcaccgtc ttgaaggtgt tgaaggtccg 60
tctcttcatt ttcgtgacgg tccgcattgc gttagcagct gcccgcatgg tgttttaggt 120
gccaagggtc cgatctataa gtatccggac gttcagaacg aatgc 165
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> MVF-GPSL-HER3 183-227aa的基因上游引物
<400> 10
ggagccatgg gtaaacttct tagccttatc aaaggtgtta tcg 43
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> MVF-GPSL-HER3 183-227aa的基因下游引物
<400> 11
atccaagctt ttagcacgca aagcagtcgg tg 32
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> MVF-GPSL-HER3 236-308aa的基因上游引物
<400> 12
ggagcatatg aaacttctta gccttatcaa aggtgttatc gttcacc 47
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> MVF-GPSL-HER3 236-308aa的基因下游引物
<400> 13
atccctcgag gcataaacca ccgcacggct c 31
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> MVF-GPSL-HER3 559-591aa的基因上游引物
<400> 14
ggagccatgg gtaaacttct tagccttatc aaaggtgtta tcg 43
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> MVF-GPSL-HER3 559-591aa的基因下游引物
<400> 15
atccaagctt ttagcattcg ttctgaacgt ccgg 34
<210> 16
<211> 45
<212> PRT
<213> 大鼠HER3 202-246aa氨基酸序列
<400> 16
Cys Gln Ile Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly Arg
1 5 10 15
Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly
20 25 30
Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys Phe Ala Cys
35 40 45
<210> 17
<211> 73
<212> PRT
<213> 大鼠HER3 255-327aa氨基酸序列
<400> 17
Cys Val Pro Arg Cys Pro Glu Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe
1 5 10 15
Gln Leu Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys
20 25 30
Val Ala Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Phe Cys Val
35 40 45
Arg Ala Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys His Gly Leu Lys
50 55 60
Met Cys Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys
65 70
<210> 18
<211> 33
<212> PRT
<213> 大鼠HER3 578-610aa氨基酸序列
<400> 18
His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Asn Ser Cys Pro His Gly Ile
1 5 10 15
Leu Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Ala Gln Asn Glu
20 25 30
Cys

Claims (10)

1.一种表皮生长因子受体3二聚化界面抗原肽，其特征在于，所述表皮生长因子受体3二聚化界面抗原肽含有以下任一种氨基酸序列：
1)、HER3 183-227aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.1；
2)、SEQ ID No.1的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加使之具有抗HER3二聚化活性的抗原肽；
3)、HER3 236-308aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.2；
4)、SEQ ID No.2的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加使之具有抗HER3二聚化活性的抗原肽；
5)、HER3 559-591aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.3；
6)、SEQ ID No.3的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加使之具有抗HER3二聚化活性的抗原肽。
2.一种重组抗原肽，其特征在于，将权利要求1表皮生长因子受体3二聚化界面抗原肽用GPSL四聚肽接头分别和MVF融合构建的重组抗原肽。
3.根据权利要求2所述的重组抗原肽，其特征在于，所述重组抗原肽为：
MVF-GPSL-HER3 183-227aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.4。
4.根据权利要求2所述的重组抗原肽，其特征在于，所述重组抗原肽为：
MVF-GPSL-HER3 236-308aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.5。
5.根据权利要求2所述的重组抗原肽，其特征在于，所述重组抗原肽为：
MVF-GPSL-HER3 559-591aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.6。
6.权利要求3所述的重组抗原肽的编码基因，其特征在于，所述编码基因合成方法：
以序列SEQ ID No.7为模板，以序列SEQ ID No.10和序列SEQ ID No.11为引物，以95℃5min，95℃30s、53℃30s和72℃30s 4个循环，95℃30s、60℃30s和72℃30s 26个循环，72℃7min为PCR扩增条件，扩增得到编码基因。
7.权利要求4所述的重组抗原肽的编码基因，其特征在于，所述编码基因合成方法：以序列SEQ ID No.8为模板，以序列SEQ ID No.12和序列SEQ ID No.13为引物，以95℃5min，95℃30s、54℃30s和72℃30s 4个循环，95℃30s、60℃30s和72℃30s 26个循环、72℃7min为PCR扩增条件，扩增得到编码基因。
8.权利要求5所述的重组抗原肽的编码基因，其特征在于，所述编码基因合成方法：以序列SEQ ID No.9为模板，以序列SEQ ID No.14和序列SEQ ID No.15为引物，以95℃5min，95℃30s、52℃30s和72℃30s 4个循环，95℃30s、60℃30s和72℃30s 26个循环、72℃7min为PCR扩增条件，扩增得到编码基因。
9.权利要求1所述表皮生长因子受体3二聚化界面抗原肽的应用，其特征在于，所述应用为：在制备防治HER3过表达的肿瘤的药物中的应用；
或在靶向EGFR、HER2药物治疗后出现因HER3高表达所致对靶向EGFR、HER2药物耐药的肿瘤治疗中的应用；
或作为治疗性多肽疫苗的有效成分或作为抗原制备抗体的应用。
10.权利要求2-5任一项所述重组抗原肽的应用，其特征在于，所述应用为：在制备防治HER3过表达的肿瘤的药物中的应用；
或在靶向EGFR、HER2药物治疗后出现因HER3高表达所致对靶向EGFR、HER2药物耐药的肿瘤治疗中的应用；
或作为治疗性多肽疫苗的有效成分或作为抗原制备抗体的应用。
CN202010484456.5A 2020-06-01 2020-06-01 一种her3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用 Active CN111647074B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010484456.5A CN111647074B (zh) 2020-06-01 2020-06-01 一种her3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010484456.5A CN111647074B (zh) 2020-06-01 2020-06-01 一种her3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111647074A true CN111647074A (zh) 2020-09-11
CN111647074B CN111647074B (zh) 2023-12-19

Family

ID=72351128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010484456.5A Active CN111647074B (zh) 2020-06-01 2020-06-01 一种her3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111647074B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115413625A (zh) * 2022-08-22 2022-12-02 郑咏秋 一种类风湿性冠心病动物模型及其构建方法和应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050255555A1 (en) * 2004-02-20 2005-11-17 Johns Terrance G EGF receptor epitope peptides and uses thereof
WO2008033495A2 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Life Science Pharmaceuticals Method for detecting and treating skin disorders
WO2009023266A1 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 Ludwig Institute For Cancer Research Generation of antibodies to cell-surface receptors and cancer-associated proteins including egfr family members
CN102153644A (zh) * 2010-12-31 2011-08-17 广东药学院 一种表皮生长因子受体二聚化抗原肽
WO2013023043A2 (en) * 2011-08-10 2013-02-14 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Treatment of advanced solid tumors using combination of anti-erbb3 immunotherapy and selected chemotherapy
US20140017259A1 (en) * 2010-11-02 2014-01-16 Takis S.R.L. Immunotherapy against erbb-3 receptor
US20160002313A1 (en) * 2013-02-25 2016-01-07 Ohio State Innovation Foundation Her-1, her-3 and igf-1r compositions and uses thereof
US20170096487A1 (en) * 2013-10-04 2017-04-06 Roche Diagnostics Operations, Inc. Antibodies specifically binding to her3
US20190300624A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Her3 antigen-binding molecules

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050255555A1 (en) * 2004-02-20 2005-11-17 Johns Terrance G EGF receptor epitope peptides and uses thereof
WO2008033495A2 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Life Science Pharmaceuticals Method for detecting and treating skin disorders
WO2009023266A1 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 Ludwig Institute For Cancer Research Generation of antibodies to cell-surface receptors and cancer-associated proteins including egfr family members
US20140017259A1 (en) * 2010-11-02 2014-01-16 Takis S.R.L. Immunotherapy against erbb-3 receptor
CN102153644A (zh) * 2010-12-31 2011-08-17 广东药学院 一种表皮生长因子受体二聚化抗原肽
WO2013023043A2 (en) * 2011-08-10 2013-02-14 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Treatment of advanced solid tumors using combination of anti-erbb3 immunotherapy and selected chemotherapy
US20160002313A1 (en) * 2013-02-25 2016-01-07 Ohio State Innovation Foundation Her-1, her-3 and igf-1r compositions and uses thereof
US20170096487A1 (en) * 2013-10-04 2017-04-06 Roche Diagnostics Operations, Inc. Antibodies specifically binding to her3
US20190300624A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Her3 antigen-binding molecules

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUM L. YIP等: "Identification of Epitope Regions Recognized by Tumor Inhibitory and Stimulatory Anti-ErbB-2 Monoclonal Antibodies: Implications for Vaccine Design", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
YUM L. YIP等: "Identification of Epitope Regions Recognized by Tumor Inhibitory and Stimulatory Anti-ErbB-2 Monoclonal Antibodies: Implications for Vaccine Design", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》, vol. 166, 31 December 2001 (2001-12-31), pages 5271 - 5278, XP002609270 *
朱磊等: "大鼠抗人表皮生长因子受体3( ErbB3) 二聚化界面区多克隆抗体的制备与鉴定", 《细胞与分子免疫学杂志》 *
朱磊等: "大鼠抗人表皮生长因子受体3( ErbB3) 二聚化界面区多克隆抗体的制备与鉴定", 《细胞与分子免疫学杂志》, vol. 37, no. 6, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 551 - 556 *
朱磊等: "重组人HER3 胞外域Ⅰ区183-227aa 的原核表达及大鼠多克隆抗体的制备与鉴定", 《J SOUTH MED UNIV》 *
朱磊等: "重组人HER3 胞外域Ⅰ区183-227aa 的原核表达及大鼠多克隆抗体的制备与鉴定", 《J SOUTH MED UNIV》, vol. 40, no. 6, 31 December 2020 (2020-12-31), pages 806 - 813 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115413625A (zh) * 2022-08-22 2022-12-02 郑咏秋 一种类风湿性冠心病动物模型及其构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111647074B (zh) 2023-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11292841B2 (en) Anti-PD-1 nano-antibody and application thereof
CN106687479B (zh) 抗ctla4的单克隆抗体或其抗原结合片段、药物组合物及用途
US20220002418A1 (en) Anti-pd-l1/vegf bifunctional antibody and use thereof
US20240043567A1 (en) Bispecific antibody and application thereof
CN100424175C (zh) ErbB-3 用于肿瘤治疗的方法和组合物
CN105693865B (zh) 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白
CN111378043B (zh) 一种具有中和作用的人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG及其制备方法和应用
WO2018233574A1 (zh) 一种抗pd-l1人源化纳米抗体及其应用
CN103965363A (zh) 与pd-1和vegf高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途
US20210070875A1 (en) Anti-c5ar antibody and preparation method and use thereof
CN110938144B (zh) 一种抗angptl3单克隆抗体及其在制备治疗肾病综合征药物中的用途
CN107840889A (zh) 高亲和力的抗cd123抗体及其应用
CN111018990A (zh) 一种新型的重组抗表皮生长因子受体单克隆抗体及其应用
CN111647074B (zh) 一种her3二聚化界面抗原肽、重组抗原肽、编码基因及其应用
WO2019100777A1 (zh) 一种抑制肿瘤血管新生的peptibody多表位疫苗及其应用
CN104193828B (zh) 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白
CN108727488B (zh) 抗诺如病毒gii.17单克隆抗体的制备和应用
CN112851794A (zh) 一种基于cd271的新型抗原表位及其应用
CN101015689A (zh) 基于血管紧张素ⅱ的肿瘤多肽疫苗
CN116732078A (zh) 以pET28a作为载体制备肿瘤相关抗原NY-ESO-1的方法及应用
CN103360497A (zh) 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
RU2650770C2 (ru) Эпитопы поверхностного антигена рецептора эпидермального фактора роста и их применение
CN113896805B (zh) 一种vegf-crm197重组融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
WO2022174451A1 (zh) 一种具有抗癌活性的多结构域融合蛋白
CN114685670A (zh) Cldn18.2抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant