CN111018990A - 一种新型的重组抗表皮生长因子受体单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种新型的重组抗表皮生长因子受体单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了鼠源抗表皮生长因子与其受体单克隆抗体的结合表位，所述结合表位包括为表皮生长因子受体（Epithelial Growth Factor Receptor，EGFR）胞外域的Ser196，Ser222，Lys269，Ser282四个氨基酸。本发明还公开了该单克隆抗体的制备方法以及用途。本发明的抗体通过关键结合氨基酸与EGFR结合并引起EGFR发生剧烈内化进入肿瘤细胞。

Description

一种新型的重组抗表皮生长因子受体单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种新型表皮生长因子受体的特异性抗原表位及其单克隆抗体。另外，本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法以及用途。
背景技术
癌症是紧跟心脏病之后的人类第二大主要死亡因素，目前治疗这种致命性疾病的新疗法已取得了重大进展。正产细胞的增殖是通过各自的配体严格激活其生长因子受体来控制的，比如生长因子受体酪氨酸激酶。癌细胞也是在生长因子受体的激活下增殖的，但失去了正常增殖的严格控制。这种失控可能是由很多因素引起，比如生长因子的过度表达或生长因子受体的过度表达，以及由生长因子调控的生化途径的自发性激活。参与致癌的受体包括表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR），来源于血小板的生长因子受体（PDGFR），类胰岛素生长因子受体（IGFG），神经生长因子受体（NGFR）和成纤维生长因子受体（FGF）等。
表皮生长因子受体（EGFR）广泛分布于哺乳动物的上皮细胞，是一种总相对分子量为170kDa的跨膜糖蛋白。EGFR是ErbB（ErbB 1~4）家族的一员，又称作ErbB1。EGFR由细胞外的配体结合区，疏水跨膜结构域和细胞内的激酶区3个部分组成。其胞内结构包含1个酪氨酸激酶域（tyrosine kinase domain）和具有多个自身磷酸化位点的羧基末端尾，属于受体酪氨酸激酶家族（receptor tyrosine kinase，RTKs）；膜外区域由配体结合位点和2个富含半胱氨酸区域所构成，能结合具有激动功能的多种配体，主要有表皮生长因子（epidermalgrowth factor，EGF）和转化生长因子（transforming growth factor a，TGFa）。EGF或TGFa与EGFR结合后，形成二聚体，结合1个ATP分子，激活EGFR自身酪氨酸激酶活性，使胞内激酶区的数个酪氨酸位点发生自身磷酸化。EGFR二聚体化和磷酸化后，激活下游的ras/raf/MAPK（mitogen activated protein kinase）级联系统和磷酸肌醇激酶（phosphoinositolkinase）系统，成为下游信号转导的亲和位点，与多种参与有丝分裂信号从细胞外传递到细胞内，从而有效调节细胞对外界刺激的反应、细胞增生、存活、黏附、迁移和分化、细胞存活以及生长情况等。最后EGFR与配体的复合物通过胞饮作用进入细胞，被降解或再循环到细胞表面，完成信号转导。因此，一旦这种酪氨酸激酶的功能受阻，将会导致各种疾病产生。
酪氨酸蛋白激酶过度表达时，会阻碍细胞程序死亡，使细胞的生长调控失控，始终处于增生状态，发展成为恶性肿瘤。临床研究表明，许多类型的实质性肿瘤如神经胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、宫颈癌、食管癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌等有高水平的EGFR表达。主要机制可能为
Figure 863080DEST_PATH_IMAGE001
EGFR发生突变，一般发生在胞外区，极少发生在跨膜区和酪氨酸激酶区，出现配体非依赖性的酪氨酸激酶活化，如非小细胞肺癌（non smalllung cancer，NSCLC）、前列腺癌、乳腺癌、胃癌；
Figure 531958DEST_PATH_IMAGE002
多种肿瘤通过自分泌和旁分泌的方式产生过度的EGF和TGFa表达，从而使EGFR信号转导系统过度活化；
Figure 587639DEST_PATH_IMAGE003
EGFR自身出现过度表达。EGFR的高度表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、黏附、侵袭和转移、抑制肿瘤细胞的凋亡、导致肿瘤患者存活率低，预后差，疗效差，肿瘤转移可能性大，容易引起肿瘤细胞对各种细胞毒性药物的耐药性。
EGFR在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存，新生血管生成、侵袭和转移中具有重要的作用，同时在相当一部分的人类肿瘤中都有表达。在很多恶性肿瘤中，EGFR的表达往往与较差的预后和较低额生存率相关。因此可知，如果有药物能阻断EGFR的活性，那将会抑制其磷酸化和信号转导，从而起到多重途径的抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。在一些研究中，EGFR抑制剂与多种化疗药物和放疗药物联合作用于一些肿瘤细胞株时，表现出累加和协同作用。
针对EGFR表达过量后，其经由配体激活引发了癌细胞增殖分化这一现象特点，目前已上市的小分子和抗体药物是针对靶向EGFR胞外部分的EGF结合位点或胞内部分的酪氨酸激酶活性位点。EGFR抑制剂主要包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、免疫毒素偶联物，以及反义核苷酸和EGFR配体主导的疫苗等。目前，一方面小分子酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼能够阻断EGFR的自磷酸化，抑制下游信号的传导。另一方面，单克隆抗体，靶向EGFR的胞外部分，阻断配体结合并由此抑制下游通路的激活如细胞增殖。一些体内和体外实验显示抗EGFR抗体成功的抑制了表达EGFR的肿瘤细胞株的生长。在实体瘤的治疗中，一些抗EGFR单克隆抗体单独应用或与传统治疗方法合并应用的治疗结果令人鼓舞。
之前的技术中已经描述了多种小鼠的抗EGFR单克隆抗体，可与EGFR高度特异的结合，这些抗体大致可以分为两类，一类是可与受体结合但不抑制EGF结合的抗体，另一类是可与受体结合并且还抑制EGF结合的抗体。但是抗体与EGFR结合的关键氨基酸残基却缺少深入研究，从而限制了开发高效、新型的抗体。本发明提供一种全鼠源的单克隆抗体，通过采用EGFR高效结合蛋白LZ8竞争性筛选出EGFR单克隆抗体，且发现了抗体与EGFR结合的关键氨基酸残基。
发明内容
为实现上述目的，本发明一方面提供了一段新的鼠源抗表皮生长因子与其受体单克隆抗体的结合表位，其特征在于，所述结合表位包含Ser196，Ser222，Lys269，Ser282四个氨基酸。该氨基酸序列位于EGFR的II结构域（氨基酸Ser196-Cys287），与EGFR结合并引起EGFR发生剧烈内化。
另一方面，本发明还提供了3个单克隆抗体（1Z4，4B1，6F2）的重链可变区和轻链可变区编码序列，如表3所示。
另一方面，本发明还提供了影响1Z4与EGFR结合的关键氨基酸残基，由于1Z4抗体与LZ8竞争性结合EGFR, 从而暗示1Z4可能同样识别LZ8与EGFR的结合界面，因此1Z4也与S222，K269，S282，S196结合。
本发明的其它目的和优点可通过下面的详细描述得知。
附图说明
图1 转染5天后的细胞上清液蛋白电泳以及Western blot（泳道1: 还原条件， 泳道2:非还原条件, 泳道P:人 源IgG1 作为阳性对照）。
图2 EGFR胞外域和LZ8等温量热滴定实验（ITC）。
图3 使用SDS-PAGE分离EGFR胞外域与LZ8复合体。
图4 利用化学交联偶联质谱法确定EGFR与LZ8的相互作用界面，参与互作的氨基酸残基用球形表示。
图5 EGFR胞外域与LZ8对接最优形态，关键氨基酸残基柱状标注D20，K41分别与S222，K269，S282，S196作用。
图6. Alexa Fluor 568 NHS Ester结构式。
图7. 1Z4-AF568偶联物的纯化。
图8. 1Z4-AF568偶联物内化，左边图中椭圆形为细胞核，偶联物形成的囊泡结构如右边所示。
图9. 流式细胞仪分析1Z4与EGFR阳性、阴性细胞的结合。其中92.8和99.2对应的细胞为MD-MB-453,9660和17420对应的细胞为MD-MB-468.
图10. 1Z4抗体与Cetuximab和mAb806的内化强度对比分析，椭圆形状为细胞核。
实施例1.EGFR单克隆抗体的制备和筛选
准备材料如表1。
表1 免疫进程表
抗原名称 提供方 数量 目的
人EGFR蛋白 GenScirpt 3mg, (>85% purity, >0.5mg/ml） 免疫/筛选
LZ8 本实验室 1mg, (>85% purity, >0.5mg/ml） 筛选（竞争）
采用人EGFR蛋白对Balb/C, C57BL/6 小鼠进行免疫。具体方法如下：
1.动物免疫：EGFR抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫小鼠，五组动物 (Balb/C 小鼠) 将按照表2所示进行免疫。免疫后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
表2 免疫进程表
流程 时间 免疫途径 免疫剂量
免疫前采血 T= -4天
初疫 T= 0天 s.c.注射 每只动物50ìgA蛋白
第一次加免 T= 14天s i.p.注射 每只动物25ìgA蛋白
测试血清 1 T= 21天s
第二次加免 T= 28天s s.c.注射 每只动物25ìgA蛋白
测试血清 2 T= 35天s
终免 T= 56±7天 i.p.注射 每只动物25ìgA蛋白
融合 T= 终免+4天
2.细胞融合和筛选
骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37°C的50%PEG（PH 8.0）1 ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃去上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50 ml，分装到3.5 cm培养皿中，放于湿盒中，置于37°C，5% CO2 恒温培养箱中进行培养。
3.筛选和竞争性筛选
细胞融合7-10天内挑选细胞克隆，针对人EGFR蛋白对所有母克隆进行ELISA测试，挑取OD450阳性值较高的120个单克隆孔。将上述单克隆进行一步第一轮亚克隆，进行有限稀释，并针对LZ8和抗体做竞争性ELISA筛选，进而得到12个亚克隆可以阻断LZ8与EGFR结合。将上述亚克隆进行第二轮亚克隆，并再次进行针对LZ8和EGFR抗体竞争性ELISA筛选，最后根据12个亚克隆的阳性值以及上清中抗体的含量分析，得到3个阳性值较高的稳定的单克隆，对应融合板细胞株为UMAB1Z4，UMAB4B1，UMAB6F2。
4.细胞上清单抗的制备与纯化
将上述3个细胞株用含15%血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中，培养至4 ´ 107 小时，800 rpm离心5min，弃去上清并将细胞转移到2L瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3 ´ 105 个/ml。继续培养1~2周，当细胞死亡率达到60%-70%时，收取细胞悬液6000 rpm高速离心20min，取上清，亲和柱层析法进行上清纯化，根据抗体压型选择相应柱料，单抗UMAB1Z4，UMAB4B1，UMAB6F2亚型为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装（100ml/管，浓度为1mg/ml，保存在4-8°C）。
实施例2.EGFR单克隆抗体基因的序列确定
对上述细胞株UMAB1Z4（后简称为1Z4）， UMAB4B1（后简称为4B1），UMAB6F2（后简称为6F2）的抗EGFR单克隆细胞株进行测序。从获得的杂交瘤细胞中提取总RNA，用鼠源抗体可变区通用引物，逆转录成cDNA，进行PCR扩增，获得的轻链和重链可变区委托Genscript公司进行测序。
结果显示在下表3中。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别是本发明获得的高活性高单克隆抗体1Z4的重链可变区和轻链可变区的核苷酸编码序列；SEQID NO：3和SEQ ID NO：4分别是根据上述核苷酸编码序列推测的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6分别是4B1的重链可变区和轻链可变区的核苷酸编码序列；SEQID NO：7和SEQ ID NO：8分别是根据上述核苷酸编码序列推测的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别是本发明获得的高活性高单克隆抗体6F2的重链可变区和轻链可变区的核苷酸编码序列；SEQID NO：11和SEQ ID NO：12分别是根据上述核苷酸编码序列推测的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
实施例3.单克隆抗体表达载体的纯化
因1Z4活性最高，选用实施例2中1Z4的抗体做进步一的分析，通过PCR扩增，将1Z4抗体重链和轻链可变区分别插入到表达载体pcDNA3.1(+)EcoRI和HindIII位点中，构建成鼠源抗EGFR单克隆抗体基因的表达载体。
本实施例采用HiTrapTm MabSelect SuRe蛋白柱技术，纯化表达在Expi293FTM细胞的抗体，以获得浓度在0.5mg/ml，纯度在90%以上的抗体。具体步骤如下：
Expi293FTM细胞在无血清Expi293TM表达培养基(Thermo Fisher Science)中培养。随后将细胞保存在Erlenmeyer培养瓶中，放置于37°C，8%二氧化碳的培养箱中。当细胞浓度达到2.0×106个/mL后，将DNA与ExpiFectamineTM293按1:2.7加入到转染的细胞培养瓶中。
将编码抗体1Z4重链和轻链的重组质粒共同转染到悬浮培养的Expi293F细胞中。转染约17h后，将ExpiFectamineTM293转染增强剂1和ExpiFectamineTM293转染增强剂2加入培养瓶中。转染后第5天测定细胞密度和细胞活力，收集约1mL细胞培养上清液用于抗体表达评价。取第6天收获的细胞培养上清进行纯化。
将第6天收集细胞培养上清液进行抗体纯化。用过滤后的上清液以3ml/min加载到HiTrapTM MabSelect Sure 5ml(GE，目录号11-0034-95)上。用4柱体积的PBS缓冲液(pH7.2)洗脱，用50 mM柠檬酸(pH3.0)洗脱。在洗脱过程中，每1mL组分立即用124mol/L 1MTris-HCl缓冲液(pH9.0)中和。将部分峰混合在一起，然后将缓冲液交换到PBS缓冲液(pH7.2)。用SDS-PAGE和Western blot分析其分子量、蛋白产量和纯度。样品浓度用A280法测定，消光系数为1.505。
实施例4. LZ8与EGFR结合位点测定
（1）EGFR胞外域和LZ8的化学交联
为定位LZ8与EGFR结合的表位，将EGFR胞外区与单克隆抗体在磷酸缓冲液中孵化，并采用DSS／BS3交联剂按照比例（1:4）室温交联1h之后，SDS-PAGE凝胶分离交联物并储存在10%醋酸溶液中。
（2）液质串联质谱分析
蛋白中的半胱氨酸残基分别用Tris-（carboxyethyl） phosphine hydrochloride（TCEP）试剂和chloroacetamide （CAA）试剂进行还原和烷基化，分别在56°C反应60分钟以及在室温下反应45分钟。随后用胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific）在37°C条件下酶切过夜，经过C18柱脱盐后上样到液质联用串联质谱中；
肽段经过纳升流液相系统Nano1200，流速为300 nL/min，洗脱梯度为: 5 to 60% B（60 min）, 60–70% B （20 min）, and 70% B （10 min）。其中A液为0.1% formic acid inwater，B液为95% Acetonitrile, 0.1% formic acid in water；
质谱数据采集在Orbitrap Fusion Lumos串联质谱上进行（Thermo FisherScientific），一级谱采集的质荷比的范围是400–2000，分辨率为70,000 （m/z 400）。二级谱的数据采集方式为数据依赖型，对一级谱中信号最强的前10个肽段进一步进行二级谱的数据采集，分辨率为35,000 （m/z 400），最后通过SIM-XL对交联肽段进行鉴定。
（3）等温量热滴定（ITC）实验
等温量热滴定实验用MicroCal VP-ITC （GE Healthcare）仪器进行。将400 ìM LZ8依次滴入到含有20 ìM EGFR胞外域的样品池中，每滴3ml，总共19滴，反应的缓冲液为20 mm磷酸缓冲液，150 mm NaCl （pH 8.0），温度为20°C。将获得的ITC数据用MicroCal Origin软件进行分析，求出ÄH，K，n以及解离常数值。
结果表明，EGFR的胞外域与LZ8形成复合体时的摩尔比为1:2，这暗示EGFR的胞外域以单体的形式与LZ8的二聚体互作。结果如图2所示。
随后我们将经过交联形成的EGFR胞外域与LZ8复合体用SDS-PAGE分离后用胰蛋白酶处理，结果如图3所示，然后进行了串联质谱的分析。
我们总共检测到26条交联肽段，其中有3条具有高置信度的交联肽段是由EGFR的胞外域与LZ8之间的交联形成的，能够反映EGFR与LZ8互作的界面信息。为清楚起见，我们将EGFR与LZ8之间发生交联的位点分别标记在LZ8和EGFR胞外域的三维结构上（图4）。从图4中可以看出，EGFR胞外域与LZ8的作用界面包括丝氨酸169位，丝氨酸222位以及赖氨酸269位，这三个位点与EGFR的胞外域的二聚体化有关。LZ8蛋白上参与互作的氨基酸为41位赖氨酸，这个残基在LZ8蛋白的环 BC上的，而先前的报道表明这个环与蛋白互作有关。此外，我们也利用了“零长度”的交联剂NHS/EDC对EGFR/ LZ8复合体进行了化学交联，来进一步验证利用BS3/DSS获得的交联结果。我们检测到了在LZ8的第20位的天冬氨酸和EGFR的第282位丝氨酸之间形成的交联肽段，而这两个氨基酸残基恰好在上面鉴定到的EGFR/ LZ8作用界面的附近，进一步验证了我们的交联结果的可靠性。
结果显示，LZ8与EGFR结合表位位于EGFR的II结构域（氨基酸Ser196-Cys287）。
实施例5. 结合计算机模拟推测LZ8与EGFR结合关键位点
根据LZ8的结构（PDB：3F3H.pdb），在Discovery Studio 4.0中进行prepare ligand,EGFR的结构在PDB bank中下载，PDB ID:4kro.pdb，在Discovery Studio 4.0中进行去水，加氢再进行prepare protein,然后将配体与EGFR靶点进行CDOCKER对接，参数设置如下：Top Hits=10, RandomConformations=10, Orientations to Refine=10, Force field=CHARMm, Use Full Potential=False,其他参数选择默认设置。
经过对接后，确定LZ8和EGFR在氨基酸Ser196-Cys287形成结合界面，其中4个氨基酸残基位点（Ser196，Ser222，Lys269，Ser282）与EGFR有较强的键合作用力，表明其为单抗与EGFR作用的关键氨基酸残基。实验结果如图5所示
实施例6. 1Z4单克隆抗体可携载小分子化合物内化进入肿瘤细胞
本实施例将Alexa Fluor 568 NHS Ester（AF568）偶联到1Z4抗体，以检测1Z4抗体在小分子化合物修饰后的内化能力。AF568是分子量为791.8的小分子化合物，其结构如图6所示。AF568可与蛋白质氨基酸残基中伯胺基团（R-NH2）发生反应，从而偶联形成复合物。
本实施例首先将10 mg的1Z4抗体溶于1 mL的0.1 M碳酸氢钠缓冲液中，5 mgAF568溶解在0.5 mL DMSO中，然后在涡旋搅拌1Z4抗体溶液的同时，缓慢加入100 ìL AF568DMSO溶液，并于室温下搅拌1小时，使其充分反应。反应结束后，使用Sephadex™ G-25凝胶过滤层析柱进行纯化，如图7所示，收集第一个峰的产物即为1Z4-AF568偶联物，第二个峰为过量未偶联的AF568。
将40 nM 1Z4-AF568偶联物在4°C与HeLa细胞孵育30分钟后使其与细胞表面受体结合，然后转移到 37°C细胞培养箱中继续孵育1小时。采用OMX超高分辨率显微镜观察1Z4-AF568偶联物内化情况。结果表明，1Z4-AF568偶联物可以囊泡形式内化进入肿瘤细胞中，囊泡直径1微米左右（图8）。
实施例7. 1Z4抗体可结合细胞膜上的EGFR并引发高强度内化
以EGFR单克隆抗体Cetuximab为对照，采用流式细胞术检测了1Z4单克隆抗体与EGFR阳性细胞系MD-MB-468和EGFR阴性细胞系MD-MB-453细胞表面EGFR的结合情况。将AlexaFluor 647 NHS Ester修饰的抗体（修饰方法同实施例6）在4°C分别与两种细胞孵育30分钟，再用预冷PBS溶液洗去未结合抗体后进行流式检测。结果表明1Z4单克隆抗体可特异性的结合于EGFR阳性细胞系MD-MB-468，而不与EGFR阴性细胞系MD-MB-453结合（图9）。
以Cetuximab和mAb806为对照，采用高内涵成像系统分析了1Z4抗体的内化强度。分别将小分子化合物Alexa Fluor 568 NHS Ester修饰后的40 nM Cetuximab、mAb806和1Z4抗体（修饰方法同实施例6）在4°C与HeLa细胞孵育30分钟，然后在37°C继续孵育1小时使其内化。结果表明1Z4的内化强度远远高于Cetuximab和mAb806（图10）。
具体实施方案
如上所述，本发明首先提供了一鼠源抗表皮生长因子受体单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：7，SEQID NO：11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，没有被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性-即从基本均一的抗体群中获得的，而不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特性的蛋白，其由两个相同的轻链（L）和两个相同的重链（H）组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一段有可变区（VH），其后是多个恒定去。每条轻链的一端有可变区（VL），另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本文所用的术语“可变”标识抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区（CDR）或超变区的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区（FR）。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈b折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体-抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为ê和ë)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为á、ä、å、ã、和ì。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
本发明还提供了编码本发明鼠源抗表皮生长因子受体单克隆抗体中重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO：1所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ IDNO：2所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> Changchun Intellicrown Pharmaceutical Co.LTD
张, 喜田
孙, 非
张, 欣
<120> 一种新型的重组抗表皮生长因子受体单克隆抗体及其应用
<130> 20200210
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1389
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
atggctgtcc tggcgctact cctctgcctg gtgactttcc caagctgtgc cctgtcccag 60
gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcaca 120
tgcactgtct ctgggttctc attaaccagc tatgctataa actgggttcg ccagccacca 180
ggaaagggtc tggagtggct tggagtaata tggactggtg gaggcacaaa ttataattca 240
gctctcaaat ccagactgag catcagcaaa gacaactcca agagtcaagt tttcttaaaa 300
atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc aggtactact gtgccaggtc ctactatact 360
aacccttggt acttcgatgt ctggggcaca gggaccacgg tcaccgtctc ctcagccaaa 420
acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 480
gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 540
tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 600
actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagccagac cgtcacctgc 660
aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 720
ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 780
aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 840
atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 900
acagctcaga cgaaaccccg ggaggagcag atcaacagca ctttccgttc agtcagtgaa 960
cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 1020
gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1080
ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1140
acctgcatga taacaaactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200
cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1260
gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1320
tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1380
ggtaaatga 1389
<210> 2
<211> 705
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 60
aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120
ttgagctgca aggccagtga gaatgtgggt aattatgtat cctggtatca acagaaagca 180
gaccagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 240
cgcttcacag gcagtggatt tgaaacagat ttcattctga ccatcgccag tgtgcaggct 300
gaagaccttg cagattatca ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg 360
gggacaaagt tgaaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
<210> 3
<211> 462
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ala Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Ser Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Thr Asn Pro Trp Tyr Phe Asp Val Trp
115 120 125
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
145 150 155 160
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
210 215 220
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
225 230 235 240
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
245 250 255
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
260 265 270
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
275 280 285
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
290 295 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
305 310 315 320
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
325 330 335
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
355 360 365
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
370 375 380
Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
385 390 395 400
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
405 410 415
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
420 425 430
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
435 440 445
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr
1 5 10 15
Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser
20 25 30
Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Val Gly Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Asp Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Glu Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ala
85 90 95
Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr
100 105 110
Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Lys Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230
<210> 5
<211> 1398
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 5
atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttactt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60
gtgcaggtgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcgc tttcagtaac tatgacatgt cttgggttcg acagactccg 180
gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtagtagtac ccactatcga 240
gacattgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300
caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acataagagg 360
gccaactggg acctcgatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420
tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 480
aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 540
acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600
gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 660
gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 720
agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 780
ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840
gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 900
gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960
gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1020
gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1080
ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1140
gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1200
tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1260
tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1320
ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1380
cactctcctg gtaaatga 1398
<210> 6
<211> 717
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 6
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc tagcagtgat 60
gttttgctga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagaa cattgtacat agtaatggag acacctattt agaatggtac 180
ctgctgaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caggatcagc 300
agagtggagg ctgaagatct gggagtttat tactgctttc aaagttcaca tgttccgtgg 360
acgttcggtg gaggcaccac gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480
aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540
aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600
agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660
actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
<210> 7
<211> 465
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Lys Cys Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr His Tyr Arg
65 70 75 80
Asp Ile Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Arg His Lys Arg Ala Asn Trp Asp Leu Asp Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr
130 135 140
Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr
145 150 155 160
Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn
210 215 220
Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro
225 230 235 240
Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser
245 250 255
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
260 265 270
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp
275 280 285
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr
290 295 300
Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser
305 310 315 320
Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln
385 390 395 400
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met
405 410 415
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys
420 425 430
Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu
435 440 445
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
450 455 460
Lys
465
<210> 8
<211> 238
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Phe Gln Ser Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
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<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 9
atgggatgga gctggatctt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60
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ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt aatcctaaca atggtggtac taactacaac 240
cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctccatg 300
gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agggatttac 360
tacggtagtg gagcctggtt tgcttgctgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420
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tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 540
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gtgcacacag ctcagacgaa accccgggag gagcagatca acagcacttt ccgttcagtc 960
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agtctgacct gcatgataac aaacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 1200
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 1260
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 1320
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 1380
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<210> 10
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atgaagtcac agacccaggt cttcgtattt ctactgctct gtgtgtctgg tgctcatggg 60
agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 120
ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 180
gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 240
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gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 360
ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420
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tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
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<211> 464
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 11
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Ala Trp Phe Ala
115 120 125
Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr
130 135 140
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn
145 150 155 160
Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val
210 215 220
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
225 230 235 240
Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser
245 250 255
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu
260 265 270
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro
275 280 285
Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala
290 295 300
Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val
305 310 315 320
Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
325 330 335
Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile
355 360 365
Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp
405 410 415
Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser
420 425 430
Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly
435 440 445
Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 12
<211> 234
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser
1 5 10 15
Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu
20 25 30
Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr
100 105 110
Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230

Claims (14)

1.一种鼠源抗表皮生长因子的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体可结合于细胞膜上的EGFR并引起抗原抗体复合物剧烈内化进入肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述单克隆抗体，可特异与EGFR的II结构域（氨基酸Ser196-Cys287）结合，引起抗原抗体复合物内化。
3.如权利要求2所述单克隆抗体，至少可特异性结合EGFR的II结构域上如下氨基酸，Ser196，Ser222，Lys269，Ser282。
4.如权利要求2所述单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO：3, SEQ ID NO：7, SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的重链可变区，其特征在于，该重链可变区含有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的轻链可变区，其特征在于，该轻链可变区含有SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
7.如权利要求2所述单克隆抗体，可与LZ-8竞争性结合于EGFR。
8.如权利要求2所述单克隆抗体，可由经人EGFR蛋白免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合所获得的杂交瘤细胞进行制备。
9.如权利要求8所述的杂交瘤细胞，其特征在于，可稳定分泌如权利要求2所述的的单克隆抗体。
10.如权利要求9所述的杂交瘤细胞，可通过与LZ-8竞争性结合EGFR进行筛选获得。
11.如权利要求10所述的杂交瘤细胞的筛选方式，包括但不限于通过LZ-8的竞争性ELISA筛选。
12.如权利要求2所述单克隆抗体，可与小分子化合物偶联形成抗体-小分子化合物偶联物。
13.如权利要求12所述抗体-小分子化合物偶联物，其偶联方式包括但不限于此抗体上氨基酸残基的伯胺基团。
14.如权利要求12所述抗体-小分子化合物偶联物，可内化进入肿瘤细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023172981A1 (en) * 2022-03-09 2023-09-14 Erasca, Inc. Antibodies against egfr and their uses
CN116462754B (zh) * 2023-06-12 2023-09-12 北京纳百生物科技有限公司 一种识别犬瘟热病毒n蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ556286A (en) * 2005-02-07 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
US20070009972A1 (en) * 2005-02-16 2007-01-11 Ginger Chao Epidermal growth factor receptor polypeptides and antibodies
WO2008104183A2 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Symphogen A/S Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions
CN103910799B (zh) * 2014-03-06 2016-03-23 中国人民解放军第四军医大学 一种基于抗egfr单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用
CN111018990A (zh) * 2020-02-10 2020-04-17 张喜田 一种新型的重组抗表皮生长因子受体单克隆抗体及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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