KR101953299B1

KR101953299B1 - EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101953299B1
Application number: KR1020180090497A
Authority: KR
Inventors: 최경주; 김주항
Original assignee: 의료법인 성광의료재단
Priority date: 2018-08-02
Filing date: 2018-08-02
Publication date: 2019-02-28

Abstract

EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법, 상기 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물, 암 진단용 조성물 및 키트, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체, 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전적으로 변형된 면역 세포, 및 상기 면역 세포를 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따른 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EGFR 야생형 (EGFRwt)과 교차 반응하지 않고 EGFRvIII에만 특이적으로 결합하므로, EGFRvIII의 발현 또는 과발현에 의해 유발되는 다양한 질병의 치료 또는 진단에 사용될 수 있다.

Description

EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 이용 {Antibody against epidermal growth factor receptor variant III and uses thereof}

EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법, 상기 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물, 암 진단용 조성물 및 키트, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체, 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전적으로 변형된 면역 세포, 및 상기 면역 세포를 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

EGFR (ErbB-1; HER1)은 세포외 단백질 리간드의 상피 성장 인자 패밀리의 구성원에 대한 수용체인 막 관통 단백질이다. EGFR 과발현(상향 조절 또는 증폭)을 일으키는 돌연변이는 다양한 암, 예를 들어, 폐의 편평 상피암의 약 80%, 항문암, 아교모세포종의 약 50%, 두경부 상피암의 약 80~100%와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. EGFR 또는 그 패밀리 구성원의 돌연변이, 과발현 또는 잘못된 조절은 모든 상피 암의 약 30%에 관여하는 것으로 알려져 있다.

EGFRvIII은 EGFR의 세포외 도메인에서 267개 아미노산 인-프레임(in-frame) 결실이 있는 돌연변이체로서, 인간 암에서 가장 통상적으로 발생하는 상피 성장 인자(EGF)의 변이체이다. 리간드(Ligand)와 결합부분이 소실되었음에도 불구하고 세포내 다양한 신호가 항상 활성화 되어있어 암의 전이, 증식, 재발 및 항암제 내성에 관여한다. 정상 세포에서는 발견되지 않는다. EGFRvIII의 과발현은 교모세포종(비특허문헌 1 내지 6), 유방암세포(비특허문헌 7 내지 12), 폐암(비특허문헌 13 내지 17), 폐선암종(비특허문헌 18), 자궁암(비특허문헌 19 및 20), 전립선암(비특허문헌 21 및 22), 갑상선암(비특허문헌 23) 등에서 관찰되었다.

이러한 이유로 EGFR 또는 EGFRvIII에 대한 항체를 개발하기 위한 연구가 계속되고 있다. 그러나, 기존의 EGFR 표적 치료제인 세툭시맙(cetuximab)은 EGFR에 대한 특이성이 낮으며 EGFRvIII에 의한 암종에 대해서는 효과가 없다는 문제점이 있었다. 따라서, EGFRvIII을 과발현하는 암을 치료하기 위하여, EGFRvIII에 대한 특이적 항체 개발이 필요하다.

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이에, 본 발명자들은 EGFR에 교차반응 하지 않고, EGFRvIII에만 특이적으로 결합하는 신규 항-EGFRvIII 항체를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIII의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

다른 양상은 면역 세포에 발현되는 상기 일 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체가 순차적으로 연결된 상기 일 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 세포막 관통 영역 및 세포 내 신호 영역을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체를 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전적으로 변형된 면역 세포를 제공한다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물를 제공한다.

용어 "EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)", "ErbB-1", "HER1"은 상호교환적으로 사용되며, 세포외 단백질 리간드의 EGF (epidermal growth factor) 패밀리의 구성원에 대한 수용체인 막관통 단백질이다. EGFR의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 변이는 많은 종류의 암을 유발하는 것으로 알려져 있다.

용어 "EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)"는 EGFR의 세포외 도메인에서 267 아미노산이 결실되어 있는 EGFR의 결실 돌연변이체로서, EGFRvIII은 암 또는 종양 형성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. EGFRvIII의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예시적으로, EGFRvIII의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열일 수 있고, EGFRvIII의 아미노산 서열은 서열번호 13의 아미노산 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EGFR에 교차반응(cross reaction)하지 않는 것일 수 있다.

본 발명자들은 EGFR 야생형에 교차반응하지 않으면서 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체를 제작하고자, 서열번호 1의 EGFRvIII 펩티드를 항원으로 사용하여 항체를 제작하였다. 따라서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIII의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 그러므로, 상기 일 양상에 따른 항체는 "항-EGFRvIII 항체"이다.

용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원분자 내의 특정한 입체분자구조를 의미한다.

용어 "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 범위에는 전체 항체 형태뿐만 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함한다.

전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 디설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.

상기 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체(예: 인간화 뮤린 항체), 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드-결합 Fvs(sdFV) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 항체는 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함할 수 있다.

용어 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있다. 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩티드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.

면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역 (complementarity-determining region: CDR)이라 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낼 수 있다.

상기 일 양상에 따른 항체는 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체로서, EGFRvIII에 대한 우수한 친화도 및 특이도를 나타낼 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 8의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 9의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

상기 일 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EGFRvIII 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIII의 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항-EGFRvIII 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 90%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.

상기 항-EGFRvIII 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

상기 항-EGFRvIII 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

따라서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 또는 추가로 발현시킨다.

상기 "핵산"은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미이며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

상기 핵산은 상기 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현을 위하여 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산을 표준 분자 생물학 기술(예: PCR 증폭, 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, 핵산이 전사 및 번역 제어 서열에 작동되도록 결합되어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 상기 "작동되도록 결합"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된다는 것을 의미할 수 있다.

용어 "발현 벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 등을 포함한다.

상기 벡터 성분에는 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 신호 서열, 복제 기점, 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열은 당해 기술분야에 공지된 것이라면 그 종류를 제한하지 않고 사용할 수 있다.

본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용되는 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진행생물 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 핵산 또는 상기 벡터는 형질감염(transfection)될 수 있다. "형질감염(transfection)"시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 포유류 세포에의 적용 가능성을 고려하여, 진핵세포, 바람직하게는 포유류 숙주세포에서 발현될 수 있다. 상기 항체의 발현에 적합한 포유류 숙주세포는 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포 (예를 들어 DHFR 선발 가능한 마커와 함께 사용되는 dhfr-CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 또는 SP2 세포 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 세포는 배지에서 배양할 수 있으며, 시판용 배지 등을 종류에 제한 없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 공지된 기타 필수 보충물이 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 세포에 대해 이미 공지되어 있으며, 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 통해 정제할 수 있다. 추가의 정제 기술, 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.

상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(Herpes Simplex Virus: HSV), 예를 들어, HSV-1, 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 재조합 바이러스 벡터는 암살상바이러스(oncolytic virus)일 수 있다. 용어 "암살상바이러스"는 "암용해바이러스", "항암 바이러스"와 상호교환적으로 사용된다. 상기 암살상바이러스는 암세포 또는 종양세포를 특이적으로 사멸시킴으로써 암세포의 항원을 노출시켜 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 암살상바이러스는 그 자체로 항암 용도로 사용할 수 있으며, 다른 항암제와 병용하여 항암 효과를 증진시킬 수도 있다. 또한, 암살상바이러스 벡터에 본 발명의 항-EGFRvIII 항체 또는 그의 항원 결합 단편이나 다양한 치료 유전자를 삽입하여 항암 효과를 증진시킬 수 있다.

또한, 상기 바이러스 벡터는 EGFRvIII를 발현하거나 EGFR을 과발현하는 암 또는 종양 세포를 표적하는 유전적으로 변형된 면역 세포를 제조하기 위한 것일 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 바와 같다.

상기 "암 또는 종양"은 본 발명의 항-EGFRvIII 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 의하여 치료될 수 있는 암 또는 종양의 종류라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 EGFRvIII의 과발현에 의한 암 또는 종양일 수 있다. 상기 EGFRvIII의 과발현에 의한 암 또는 종양은, 예를 들어, 폐암, 폐선암종, 자궁암, 갑상선암, 대장암, 위암, 신장암, 전립선암, 유방암, 교모세포종, 또는 난소암일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 기존의 암 치료 물질(예: 항암제)과 병용되어 암의 치료 효능을 향상시킬 수 있다. 상기 항암제는 대사길항제, 알킬화제, 토포아이소머라제 길항제, 미세소관 길항제, 항암 항생제, 식물유래 알칼로이드, 항체 항암제 또는 분자표적 항암제일 수 있고, 보다 구체적으로, 탁솔, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라실, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다라빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페플로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 로무스틴 및 카르무스틴일, 이매티닙, 게피티닙, 에르토티닙, 트리스투주맙, 로실레티닙, 네시투무맙, 에버롤리무스, 라무시루맙, 다코미티닙, 포레티닙, 팸브롤리주맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 다브라페닙, 벨리파립, 세리티닙, 카무스틴, 시클로포스파미드, 이포스파마이드, 익사베필론, 멜팔란, 메르캅토푸린, 미토산트론, 또는 티에스원일일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 상기 담체 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예를 들면, 식염수 및 멸균수), 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 링거액, 완충제, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 덱스트란, 알부민, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제를 더 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 당업자에게 알려진 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 용매 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있고, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 수성 용매는 생리식염수 또는 PBS를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여 형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상적으로 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량(유효량)은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 국소 (경피 포함), 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.

다른 양상은 개체에 상기 일 양상에 따른 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 종양의 치료 방법을 제공한다.

용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 유효성분을 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.

본 발명의 항-EGFRvIII 항체를 통해 샘플에서의 EGFRvIII 발현 수준을 측정함으로써 암을 진단할 수 있다. 발현 수준은 통상적인 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있으며, 상기 항-EGFRvIII 항체를 이용한 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter), 웨스턴 블랏(western blot), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 단백질이 고발현 되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예: 정상 위조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 진단된다.

상기 키트는 본 발명의 항-EGFRvIII 항체를 포함하고, 시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널을 분석하여 암을 진단할 수 있다. 암 진단을 위해 사용되는 시그널의 측정은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있고, 이를 통해 EGFRvIII 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.

상기 키트는 EGFRvIII 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석하기 위해 사용할 수 있는 다양한 추가 성분이나 구성을 더 포함할 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체 또는 도메인 항체일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 키메라 항원 수용체는 본 발명의 항-EGFRvIII 항체의 항원 결합 단편, 예를 들어, scFV를 포함할 수 있다.

상기 면역 세포는 T세포, NK세포 또는 NKT세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 키메라 항원 수용체에 포함되는 세포막 관통 영역 및 세포 내 신호 영역은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.

일 구체예에서, 상기 세포막 관통 영역은 CD8 또는 CD28의 막 관통 영역을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 상기 세포 내 신호 영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD27, CD28, CD137, 또는 CD134의 세포 내 신호 영역 서열일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 면역 세포는 T세포, NK세포 또는 NKT세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 상기 면역 세포는 키메라 항원 수용체-T 세포(CAR-T)일 수 있다.

상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전적으로 변형된 면역 세포에 대해서는 당해 기술분야에 공지되어 있다.

다른 양상은 상기 일 양상에 따른 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 면역 세포는 EGFRvIII를 발현하거나 EGFR을 과발현하는 암 또는 종양 세포를 표적하므로, 암 또는 종양 치료 용도로 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EGFR 야생형 (EGFRwt)과 교차 반응하지 않고 EGFRvIII에만 특이적으로 결합하므로, EGFRvIII의 발현 또는 과발현에 의해 유발되는 다양한 질병의 치료 또는 진단에 사용될 수 있다.

도 1은 EGFRvIII에 대한 특이적 단클론 항체를 제작하기 위한 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 EGFRvIII에 대한 특이적 펩티드의 소수성 확인 실험 결과이다.
도 3은 EGFRvIII에 대한 특이적 펩티드의 면역원성 확인 실험 결과이다.
도 4는 ELISA를 통해 선별된 6개의 클론 6B5, 2A6, 1B4, 2F2, 2A8, 1H10과 상업적으로 판매 중인 EGFRvIII 항체의 EGFRvIII에 대한 특이성을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.도 5는 Gli36-wt, Gli36-vIII, A431 세포주에 6B5 항체, 항-EGFR 항체 또는 세툭시맙을 처리하였을 때, 항체 농도에 따른 반응성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 Gli36-wt와 Gli36-vIII 세포주에 대한 6B5 항체 처리군 및 6B4 항체+EGFRvII 펩티드 처리군의 웨스턴 블랏 결과이다.
도 7은 Gli36-vIII 세포주에서 EGFRvIII 펩티드, EGFRvIII 단백질, EGFR 단백질에 대한 6B5 항체의 특이적 결합을 나타낸 그래프이다.
도 8은 Gli36-wt와 Gli36-vIII 세포주에 6B5 항체를 처리하였을 때의 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 항- EGFRvIII 항체의 제조

도 1은 EGFRvIII에 대한 특이적 단클론 항체를 제작하기 위한 과정을 나타낸 모식도이다.

구체적으로, EGFRvIII에 대한 특이적인 펩티드를 제작한 후, 마우스에 면역화(immunization) 후 블리딩 시험(bleeding test)을 통해 항체 생성을 확인하였다. 항체가 생성된 것을 확인한 후, 마우스 혈장 세포와 골수종(myeloma) 세포를 융합시켜 하이브리도마(hybridoma)를 제작하였다. 제작한 하이브리도마를 96-웰 플레이트에서 ELISA 방식을 통해 EGFRvIII에 대한 특이적 클론을 선별하였다. 선별된 클론은 다시 한 번 96-웰 플레이트에서 선별하여 고순도의 단일 클론을 확보하였다. 하기에서 더욱 자세히 설명하였다.

1-1. EGFRvIII에 대한 특이적 펩티드의 제작

마우스에 투여할 펩티드 제작을 위해 EGFRvIII에 대한 펩티드 예측(peptide prediction)을 수행하였다. 구체적으로, 영인프런티어(주) 항체 전문회사에서 사용하는 펩티드 예측 알고리듬을 사용하여, 소수성 특징이 낮은 동시에 면역원성이 높으며, EGFRvIII에 대한 특이적 항원이라는 3가지 조건을 만족하는 최적의 펩티드 서열을 도출하였다. 그 결과 최적의 펩티드 서열(서열번호 1: EEKKGNYVVC)을 확정하였다.

도 2는 EGFRvIII에 대한 특이적 펩티드의 소수성 확인 실험 결과이다.

도 3은 EGFRvIII에 대한 특이적 펩티드의 면역원성 확인 실험 결과이다.

도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 상기 제작된 펩티드는 소수성이 낮으며, 면역원성이 높은 부위임을 확인하였다.

1-2. 면역화 및 하이브리도마의 제작

상기 실시예 1-1에서 제작된 펩티드 서열을 사용하여 마우스에 면역화 후, 마우스 혈장 세포와 골수종(myeloma) 세포를 융합시켜 하이브리도마(hybridoma)를 제작하였다. 상기 면역화 및 하이브리도마 제작은 영인프런티어(주)에서 수행하였으며, 본 발명자들은 영인프런티어(주)로부터 제작된 하이브리도마를 제공받아 사용하였다.

1-3. EGFRvIII에 대한 특이적 클론의 선별

상기 실시예 1-2에서 제작된 하이브리도마 중 EGFRvIII에 특이성이 높은 클론을 ELISA를 통해 선별하였다. 그 결과, 총 6개의 클론, 6B5, 2A6, 1B4, 2F2, 2A8, 1H10가 선별되었다. 이 중 EGFRvIII에 대한 특이적 항체를 선별하기 위해 EGFRvIII가 과발현된 세포(Gli36-vIII)를 이용하여 웨스턴 블랏(western blot)을 수행하였다. 대조군으로 EGFRvIII를 발현하지 않는 세포주(Gli36-wt)를 사용하였다.

도 4는 ELISA를 통해 선별된 6개의 클론 6B5, 2A6, 1B4, 2F2, 2A8, 1H10과 상업적으로 판매 중인 EGFRvIII 항체의 EGFRvIII에 대한 특이성을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 선별된 총 6개의 클론 중 6B5가 140 kDa의 EGFRvIII을 특이적으로 검출하는 것을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 또한, 6B5와 현재 상업적으로 판매 중인 NewEast 회사의 EGFRvIII 항체와 비교한 결과 6B5가 EGFRvIII에 대해 더 높은 민감도와 특이성을 가짐을 확인하였다.

1-4. 6B5의 시퀀싱

상기 선별된 6B5 항체의 아미노산 서열을 확인하기 위해 하이브리도마 시퀀싱을 수행하였다.

하기 표 1에 6B5 항체의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR에 대한 아미노산 서열을 나타내었다.

	CDR1	CDR2	CDR3
중쇄 가변영역(V_H)	GFSLSTSGMG(서열번호 2)	IYWDDDK (서열번호 3)	ARNWGFDY (서열번호 4)
경쇄 가변영역(V_L)	QSLVHSNGNTY(서열번호 5)	KVS (서열번호 6)	SQSTHVPYT (서열번호 7)

하기 표 2에 6B5 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 나타내었다.

	아미노산 서열
중쇄 가변영역(V_H)	QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARNWGFDYWGQGTTLTVSS (서열번호 8)
중쇄 가변영역(V_H)	DVLMTQTPLSLPLSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQKPGQSPKLLIYKVSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIK (서열번호 9)

하기 표 3에 6B5 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내었다.

	뉴클레오티드 서열
중쇄 가변영역(V_H)	CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAATCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAATCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAAATTGGGGCTTTGACTATTGGGGCCAGGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (서열번호 10)
경쇄 가변영역(V_L)	GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTCTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTAAATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAGCCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (서열번호 11)

실험예 1: 6B5 항체의 EGFRvIII에 대한 특이성 및 EGFR에 대한 교차반응 평가

6B5의 EGFRvIII에 대한 특이성과 EGFR에 대한 교차반응을 검증하기 위하여 FACS 분석을 수행하였다.

구체적으로, Gli36-wt (Gli36-EGFR 야생형을 발현하는 세포주), Gli36-vIII (Gli36-EGFRvIII을 과발현하는 세포주), A431 (EGFR 야생형을 과발현하는 세포주) 각각에 6B5 항체, 항-EGFR 항체 또는 세툭시맙(Cetuximab)을 처리한 후, PE가 컨쥬게이션(conjugation) 되어 있는 항체(Ab)를 처리한 후 FACS 분석을 수행하였다. 비교군으로 사용한 세툭시맙(Cetuximab)은 EGFRvIII과 EGFR에 모두 결합하는 항체로 알려져 있다.

도 5는 Gli36-wt, Gli36-vIII, A431 세포주에 6B5 항체, 항-EGFR 항체 또는 세툭시맙을 처리하였을 때, 항체 농도에 따른 반응성을 나타낸 그래프이다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 세툭시맙은 EGFRvIII와 EGFR를 발현하는 세포주 모두에서 항체의 농도와 상관없이 높은 반응성을 나타냄을 확인하였다. 항-EGFR 항체는 Gli36-wt와 EGFR이 과발현된 A431 세포주에서 항체 농도 의존적으로 반응성이 증가함을 알 수 있었다. 반면, 6B5 항체는 EGFRvIII이 과발현된 Gli36-vIII 세포주에서 항체 농도 의존적으로 반응성이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 6B5는 EGFR에 대한 교차반응이 없으며, EGFRvIII에 대한 높은 반응성을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 2: EGFRvIII 펩티드 특이성을 평가하기 위한 경쟁 결합 분석

EGFRvIII의 펩티드(서열번호 1) 및 EGFRvIII 단백질에 대한 6B5의 특이성을 검증하기 위해 경쟁 결합 분석을 수행하였다.

구체적으로, Gli36-wt와 Gli36-vIII 세포주에 대해 6B5 항체를 처리하거나, 6B5 항체와 함께 EGFRvIII 펩티드 2.5 μg을 함께 처리하였다.

도 6은 Gli36-wt와 Gli36-vIII 세포주에 대한 6B5 항체 처리군 및 6B4 항체+EGFRvII 펩티드 처리군의 웨스턴 블랏 결과이다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 6B5에 EGFRvIII 펩티드를 처리하지 않은 경우 EGFRvIII에 대한 특이적 밴드를 확인하였다. 반면, EGFRvIII 펩티드와 6B5 항체를 함께 처리한 경우 EGFRvIII에 대한 특이적 밴드가 모두 소실됨을 확인하였다. 이를 통해 6B5 항체가 EGFRvIII 펩티드 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.

도 7은 Gli36-vIII 세포주에서 EGFRvIII 펩티드, EGFRvIII 단백질, EGFR 단백질에 대한 6B5 항체의 특이적 결합을 나타낸 그래프이다.

도 7에 나타낸 바와 같이, EGFRvIII 펩티드 농도가 증가할수록 Gli36-vIII에 대한 억제 반응성이 증가하였으며, EGFVIII 단백질의 농도가 증가할수록 Gli36-vIII에 대한 억제 반응성이 증가하였다. 반면, EGFR 단백질의 경우, 단백질의 농도가 증가해도 Gli36-vIII에 대한 억제 반응성에 변화가 없음을 확인하였다.

실험예 3: 6B5 항체를 사용한 면역조직화학 염색

Gli36-wt와 Gli36-vIII 세포주에 대하여 파라핀 슬라이드를 제작하였다. 자일렌(Xylene) 및 에탄올 농도 구배된 유기용매에 상기 슬라이드를 침전시켜 파라핀을 제거하였다. 파라핀이 제거된 슬라이드에 6B5 항체를 4℃에서 3시간 처리 후, 염소 항-마우스IgG-HRP 항체를 상온에서 2시간 처리하였다. 디아미노벤지딘(diamino-benzidine: DAB) 처리 후, 갈색의 스팟이 관찰되면 반응을 멈추고, 에탄올 농도 구배 유기 용매에 침전한 후, 커버 슬라이드를 덮어 광학현미경 하에 DAB의 염색 정도를 관찰하였다.

도 8은 Gli36-wt와 Gli36-vIII 세포주에 6B5 항체를 처리하였을 때의 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 6B5 항체는 Gli36-vIII 세포주에 특이적인 디아미노벤지딘(DAB) 반응을 나타냄을 확인하였다.

<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> Antibody against epidermal growth factor receptor variant III and uses thereof <130> PN122408 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII epitope <400> 1 Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of 6B5 antibody <400> 2 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of 6B5 antibody <400> 3 Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of 6B5 antibody <400> 4 Ala Arg Asn Trp Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 of 6B5 antibody <400> 5 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 of 6B5 antibody <400> 6 Lys Val Ser 1 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of 6B5 antibody <400> 7 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of 6B5 antibody <400> 8 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asn Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of 6B5 antibody <400> 9 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of 6B5 antibody <400> 10 caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120 cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180 tataatccat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccag aaatcaggta 240 ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaaat 300 tggggctttg actattgggg ccagggcacc actctcacag tctcctca 348 <210> 11 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of 6B5 antibody <400> 11 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctctca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttaaattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc cagccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 12 <211> 2832 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII <400> 12 atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60 gcgagtcggg ctctggagga aaagaaaggt aattatgtgg tgacagatca cggctcgtgc 120 gtccgagcct gtggggccga cagctatgag atggaggaag acggcgtccg caagtgtaag 180 aagtgcgaag ggccttgccg caaagtgtgt aacggaatag gtattggtga atttaaagac 240 tcactctcca taaatgctac gaatattaaa cacttcaaaa actgcacctc catcagtggc 300 gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg ggtgactcct tcacacatac tcctcctctg 360 gatccacagg aactggatat tctgaaaacc gtaaaggaaa tcacagggtt tttgctgatt 420 caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc catgcctttg agaacctaga aatcatacgc 480 ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct cttgcagtcg tcagcctgaa cataacatcc 540 ttgggattac gctccctcaa ggagataagt gatggagatg tgataatttc aggaaacaaa 600 aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg aaaaaactgt ttgggacctc cggtcagaaa 660 accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac agctgcaagg ccacaggcca ggtctgccat 720 gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc ccggagccca gggactgcgt ctcttgccgg 780 aatgtcagcc gaggcaggga atgcgtggac aagtgcaacc ttctggaggg tgagccaagg 840 gagtttgtgg agaactctga gtgcatacag tgccacccag agtgcctgcc tcaggccatg 900 aacatcacct gcacaggacg gggaccagac aactgtatcc agtgtgccca ctacattgac 960 ggcccccact gcgtcaagac ctgcccggca ggagtcatgg gagaaaacaa caccctggtc 1020 tggaagtacg cagacgccgg ccatgtgtgc cacctgtgcc atccaaactg cacctacgga 1080 tgcactgggc caggtcttga aggctgtcca acgaatgggc ctaagatccc gtccatcgcc 1140 actgggatgg tgggggccct cctcttgctg ctggtggtgg ccctggggat cggcctcttc 1200 atgcgaaggc gccacatcgt tcggaagcgc acgctgcgga ggctgctgca ggagagggag 1260 cttgtggagc ctcttacacc cagtggagaa gctcccaacc aagctctctt gaggatcttg 1320 aaggaaactg aattcaaaaa gatcaaagtg ctgggctccg gtgcgttcgg cacggtgtat 1380 aagggactct ggatcccaga aggtgagaaa gttaaaattc ccgtcgctat caaggaatta 1440 agagaagcaa catctccgaa agccaacaag gaaatcctcg atgaagccta cgtgatggcc 1500 agcgtggaca acccccacgt gtgccgcctg ctgggcatct gcctcacctc caccgtgcag 1560 ctcatcacgc agctcatgcc cttcggctgc ctcctggact atgtccggga acacaaagac 1620 aatattggct cccagtacct gctcaactgg tgtgtgcaga tcgcaaaggg catgaactac 1680 ttggaggacc gtcgcttggt gcaccgcgac ctggcagcca ggaacgtact ggtgaaaaca 1740 ccgcagcatg tcaagatcac agattttggg ctggccaaac tgctgggtgc ggaagagaaa 1800 gaataccatg cagaaggagg caaagtgcct atcaagtgga tggcattgga atcaatttta 1860 cacagaatct atacccacca gagtgatgtc tggagctacg gggtgaccgt ttgggagttg 1920 atgacctttg gatccaagcc atatgacgga atccctgcca gcgagatctc ctccatcctg 1980 gagaaaggag aacgcctccc tcagccaccc atatgtacca tcgatgtcta catgatcatg 2040 gtcaagtgct ggatgataga cgcagatagt cgcccaaagt tccgtgagtt gatcatcgaa 2100 ttctccaaaa tggcccgaga cccccagcgc taccttgtca ttcaggggga tgaaagaatg 2160 catttgccaa gtcctacaga ctccaacttc taccgtgccc tgatggatga agaagacatg 2220 gacgacgtgg tggatgccga cgagtacctc atcccacagc agggcttctt cagcagcccc 2280 tccacgtcac ggactcccct cctgagctct ctgagtgcaa ccagcaacaa ttccaccgtg 2340 gcttgcattg atagaaatgg gctgcaaagc tgtcccatca aggaagacag cttcttgcag 2400 cgatacagct cagaccccac aggcgccttg actgaggaca gcatagacga caccttcctc 2460 ccagtgcctg aatacataaa ccagtccgtt cccaaaaggc ccgctggctc tgtgcagaat 2520 cctgtctatc acaatcagcc tctgaacccc gcgcccagca gagacccaca ctaccaggac 2580 ccccacagca ctgcagtggg caaccccgag tatctcaaca ctgtccagcc cacctgtgtc 2640 aacagcacat tcgacagccc tgcccactgg gcccagaaag gcagccacca aattagcctg 2700 gacaaccctg actaccagca ggacttcttt cccaaggaag ccaagccaaa tggcatcttt 2760 aagggctcca cagctgaaaa tgcagaatac ctaagggtcg cgccacaaag cagtgaattt 2820 attggagcat ga 2832 <210> 13 <211> 943 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII <400> 13 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr 20 25 30 Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser 35 40 45 Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly 50 55 60 Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp 65 70 75 80 Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr 85 90 95 Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp 100 105 110 Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu 115 120 125 Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro 130 135 140 Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg 145 150 155 160 Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu 165 170 175 Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly 180 185 190 Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile 195 200 205 Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile 210 215 220 Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His 225 230 235 240 Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys 245 250 255 Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys 260 265 270 Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys 275 280 285 Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys 290 295 300 Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp 305 310 315 320 Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn 325 330 335 Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu 340 345 350 Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly 355 360 365 Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val 370 375 380 Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe 385 390 395 400 Met Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu 405 410 415 Gln Glu Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro 420 425 430 Asn Gln Ala Leu Leu Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile 435 440 445 Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp 450 455 460 Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu 465 470 475 480 Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala 485 490 495 Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly 500 505 510 Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe 515 520 525 Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser 530 535 540 Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr 545 550 555 560 Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val 565 570 575 Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala 580 585 590 Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys 595 600 605 Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr 610 615 620 Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu 625 630 635 640 Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile 645 650 655 Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys 660 665 670 Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala 675 680 685 Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met 690 695 700 Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met 705 710 715 720 His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp 725 730 735 Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro 740 745 750 Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu 755 760 765 Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp 770 775 780 Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln 785 790 795 800 Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 805 810 815 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys 820 825 830 Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu 835 840 845 Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr 850 855 860 Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val 865 870 875 880 Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His 885 890 895 Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys 900 905 910 Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala 915 920 925 Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 930 935 940

Claims

EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIII의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
청구항 1에 있어서, EGFR에 교차반응(cross reaction) 하지 않는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
삭제
청구항 1에 있어서, 서열번호 8의 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
청구항 1에 있어서, 서열번호 9의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
청구항 1, 2, 4 및 5 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
청구항 6의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
청구항 7의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
청구항 8의 세포를 배양하는 단계; 및
상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
청구항 6의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터.
청구항 1, 2, 4 및 5 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 암은 폐암, 폐선암종, 자궁암, 갑상선암, 대장암, 위암, 신장암, 전립선암, 유방암, 교모세포종, 또는 난소암인 것인 약학적 조성물.
청구항 1, 2, 4 및 5 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
청구항 13의 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
면역 세포에 발현되는 청구항 1, 2, 4 및 5 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체가 순차적으로 연결된 청구항 1, 2, 4 및 5 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 세포막 관통 영역 및 세포 내 신호 영역을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체.
청구항 15에 있어서, 상기 면역 세포는 T세포, NK세포 또는 NKT세포인 것인 키메라 항원 수용체.
청구항 15의 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전적으로 변형된 면역 세포.
청구항 17의 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물.