CN103910799B - 一种基于抗egfr单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用 - Google Patents
一种基于抗egfr单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用，包括通过连接肽相连接的重链可变区和轻链可变区，轻链可变区的末端连接有精氨酸九聚体；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。本发明采用经过筛选的连接肽连接单链的EGFR抗体的重链可变区和轻链可变区，既保留了抗体与EGFR结合的特异性和亲和力，保证了所构建的融合蛋白对EGFR的靶向性；而且降低了融合蛋白的大小，一方面既方便其构建、表达和纯化，实现了其低成本的获取，另一方面保证了其对EGFR结合、尤其是内化入细胞对分子大小、抗体活性的要求，确保了其对EGFR结合、靶向肿瘤细胞内化的可行性和准确性。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用。
背景技术
表皮生长因子受体（EGFR）家族是一类跨膜蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，通过调节下游信号转导，在肿瘤细胞的发生、发展和转移中发挥重要作用。胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。EGFR的高表达对一些恶性肿瘤细胞的增殖、细胞周期、侵袭及新生血管形成等方面起关键作用（MendelsohnJ,JClinOncol,2003,21(14):2787-2799），EGFR成为抗肿瘤药物或者疫苗的重要靶点。
EGFR在肿瘤中高表达以及其在肿瘤生长分化中起的重要作用，使其成为肿瘤诊断、抗肿瘤治疗的重要靶点。目前，研发抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物已成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。然而，在EGFR抑制剂研发中，虽有吉非替尼、西妥昔单抗等已被应用于临床，但疗效并非理想，其它一些生物抑制剂仍处于基础研究和临床研究阶段。同时，以EGFR作为靶点，寻找抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物是研发抗肿瘤新药或类似化合物的重要途径之一。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用，达到对肿瘤细胞起到特异性的杀伤作用，且毒副作用小。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，包括通过连接肽相连接的重链可变区和轻链可变区，轻链可变区的末端连接有精氨酸九聚体；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。
一种编码基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白的制备方法，包括以下操作：
1）将如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸克隆入pGEX4T-1表达载体，构建重组质粒；
2）将所构建的重组质粒转染大肠杆菌，并在含氨苄青霉素的YTA培养基中培养，培养至OD600为0.4～0.6时，添加IPTG诱导表达，收集诱导后的菌液离心，收集细菌后破菌、离心，收集上清；
3）使用GST亲和层析柱纯化分离上清中的融合蛋白，得到基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白。
一种抗EGFR单链抗体，包括通过连接肽相连接的重链可变区和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
一种编码抗EGFR单链抗体的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断试剂中的应用。
所述的融合蛋白在制备靶向EGFR的药用载体、携带载体中的应用。
所述的应用，包括所述的融合蛋白在携带siRNA、microRNA、脂质体中的一种或几种进入肿瘤细胞内部并释放的应用。
所述的核苷酸在构建表达载体，以及制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，采用经过筛选的连接肽连接单链的EGFR抗体的重链可变区和轻链可变区，既保留了抗体与EGFR结合的特异性和亲和力，保证了所构建的融合蛋白对EGFR的靶向性；而且降低了融合蛋白的大小，一方面既方便其构建、表达和纯化，实现了其低成本的获取，另一方面保证了其对EGFR结合、尤其是内化入细胞对分子大小、抗体活性的要求，确保了其对EGFR结合、靶向肿瘤细胞内化的可行性和准确性。
进一步的，精氨酸九聚体是一种连续的由9个精氨酸构成的短肽，作为内化工具可以使多肽、多聚核苷酸、脂质体等极小微粒进入细胞。通过与单链抗体融合表达，可以将抗肿瘤的物质靶向输送到肿瘤所在部位，并内化入肿瘤细胞，发挥抗肿瘤的治疗作用。实验结果表明其具有免疫原性和靶向性，而且内化性效果良好。
本发明提供的在大肠杆菌中表达的基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，可以利用单链抗体对肿瘤细胞的靶向性和精氨酸九聚体的内化作用，协同其他抗肿瘤分子，实现对肿瘤细胞起到特异性的杀伤作用，效果明显，且毒副作用小，制备简单方便，有良好的应用前景，为肿瘤的治疗提供了一种新的选择。
本发明提供的基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，可应用于制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断试剂；可应用于靶向EGFR的药用载体、携带载体，包括所述的融合蛋白在携带siRNA、microRNA、脂质体中的一种或几种进入肿瘤细胞内部并释放；而其相对应的编码核苷酸，则可以参与载体的构建，或者进行表达。
附图说明
图1为表达载体酶切鉴定结果。
图2为scFv（anti-EGFR）、scFv-9R进行表达鉴定。
图3为ELISA实验检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的抗原结合活性。
图4a～图4c为免疫荧光检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R靶向结合能力。
图5a～图5c为流式细胞术检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R靶向结合能力。
图6为凝胶阻滞实验检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R携带核酸能力。
图7a～图7c为scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的靶向性携带核酸内化能力。
图8a～图8c为scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的体内靶向性结合能力。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、抗EGFR单链抗体、融合蛋白的构建和制备
（1）序列的构建
为了提高抗EGFR抗体所能够发挥的作用，本发明利用重组抗体单链来降低抗体蛋白的大小，在发挥其特异性结合的基础上便于重组蛋白的表达、内化。所构建的EGFR单链抗体由连接肽连接重链可变区和轻链可变区而构成，所述的重链可变区、轻链可变区和连接肽均经过大量的筛选，尤其是以融合表达之后的活性作为重要依据。
本发明所构建的抗EGFR单链抗体的氨基酸序列如下（SEQ.ID.NO.1）所示：
LQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQI
该单链抗体具有244个氨基酸残基，其中第1到第119aa为重链可变区，第120到第135aa为连接肽，第136到第244aa为轻链可变区。
从抑制抗肿瘤抗体氨基酸序列反向设计核酸表达序列，合成单链抗体及其与精氨酸九聚体融合蛋白的融合基因，之后进行大肠杆菌表达。
在单链抗体的基础上，反向设计基因表达序列并进行密码子优化，所得的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
将SEQ.ID.NO.2所示的核苷酸序列克隆入pGEX4T-1表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ位点之间，构建重组质粒。
为使抗EGFR单链抗体具有携带siRNA、microRNA、脂质体、示踪剂等的作用，本发明采用精氨酸九聚体对其进行修饰，修饰后的氨基酸序列如下（SEQ.ID.NO.3）所示：
LQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQIRRRRRRRRR；
该融合蛋白具有253个氨基酸残基，其中第1到第244aa单链抗体段scFv（anti-EGFR），第245到第253aa为精氨酸九聚体段。
精氨酸九聚体是一种连续的由9个精氨酸构成的短肽，作为内化工具可以使多肽、多聚核苷酸、脂质体等极小微粒进入细胞。
本发明通过精氨酸九聚体与单链抗体融合表达，可以将上述物质靶向输送到肿瘤所在部位，并内化入肿瘤细胞，发挥抗肿瘤的治疗作用。
同样将反向设计基因表达序列并进行密码子优化，所得的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.4所示。并分别在核苷酸序列C端加入6×His.tag序列后克隆入pEGX4T-1表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ位点之间，构建重组质粒。
（2）重组大肠杆菌的构建
为了便于融合蛋白的表达，本发明采用原核表达载体进行表达，并进行提取。
将所构建的重组质粒分别转化DH5α大肠杆菌，大肠杆菌扩增后提取质粒，酶切鉴定并测序；酶切鉴定结果见图1，其中泳道1为maker，泳道2、3分别为scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的重组载体，可以清晰的看到两条泳带，表明表达序列已连接入pGEX4T-1载体。
将测序正确的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的表达质粒分别转化BL21（DE3）感受态细胞，从而获得重组基因scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的表达工程菌。
（3）scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的表达及表达产物鉴定。
挑选scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的单克隆工程菌接种于2×YTA培养基（含氨苄青霉素,Amp），37℃培养至OD600约为0.4-0.6时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1mM诱导表达，收集诱导后的菌液离心，沉淀重悬于破菌缓冲液（PBSPH7.4），超声破菌、离心，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测出重组蛋白的表达形式为可溶性蛋白。
对于上清使用GST亲和层析柱纯化:(1)用10倍介质体积缓冲液A(10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，调节pH值至8.0)过柱，平衡介质；(2)上样；(3)用10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中残余上样液并重新平衡介质；(4)用10倍介质体积缓冲液B(10mMGlutathione，50mMTris-HCl，调节pH值至8.0)洗脱，收集洗脱液。（5）经Millipore超滤管超滤浓缩后，使用Bradford绘制标准曲线并测定蛋白质浓度。（6）使用NovagenThrombinkit去除融合蛋白标签，每1mg融合蛋白加入4U凝血酶，20℃酶切8小时，之后再次经GST亲和层析柱纯化收集穿透液，得到C端具有6×His.tag的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R单链抗体融合蛋白。
2、对scFv（anti-EGFR）、scFv-9R单链抗体融合蛋白进行鉴定及功能验证
（1）对制备的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R进行鉴定：
将纯化之后的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R利用westernblot的方法进行鉴定，一抗为抗6×His.tag抗体，二抗为Dylight488标记抗小鼠二抗：样品进行SDS-PAGE凝胶电泳后，100V80分钟转膜。转膜完成后封闭1小时。之后与一抗孵育2小时、二抗孵育1小时。扫膜仪扫膜之后，结果如图2所示，样品呈阳性结果，表明单链抗体融合蛋白表达成功。
（2）scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的EGFR抗原特异性结合活性及细胞内靶向性内化能力：
通过ELISA实验及针对A549细胞进行免疫荧光、流式细胞术，检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的靶向性及内化能力。
ELISA检测单链抗体融合蛋白抗原结合活性：
（1）ELISA板中每孔加入100μL用pH9.6碳酸盐包被缓冲液稀释的重组人EGFR蛋白(10mg/L)4℃过夜；（2）每孔加入羊血清封闭液200μL，37℃封闭1h；（3）每孔加入不同浓度的蛋白稀释样品，37℃孵育2h同时设3个复孔及阴性对照孔；（4）每孔加入按照1:1000比例稀释的抗6×His一抗37℃孵育1h，每孔加入按照1:5000稀释的HRP标记羊抗小鼠的二抗37℃孵育1h；（5）每孔加入100μLTMB显色液，避光20min明显显色后，加入终止液50μL终止反应；（6）酶标仪测定各孔波长为450nm的吸光值。
如图3所示，结果表明：随着蛋白稀释度的增加，scFv、scFv-9R融合蛋白与EGFR抗原的结合也相应减少，与阴性对照BSA及阳性对照scFv相比较，融合蛋白scFv-9R也能与细胞表面HER2抗原特异性结合，因此9R片段的融合对scFv与EGFR抗原的结合无明显影响。
免疫荧光检测靶向结合能力：
将胰酶消化的A549细胞接种于6孔板内盖玻片之上。37℃，5%CO2培养箱中过夜；将scFv（anti-EGFR）、scFv-9R、BSA用PBS（PH7.4）稀释至10μg/ml，取出6孔板，将上述试剂分别与A549细胞共孵育4小时；PBS洗涤细胞3次；将稀释好的抗6×His一抗（1：2000）加入6孔板中与细胞共孵育2小时；PBS洗涤细胞后，用稀释好的cy3标记的抗小鼠二抗（1：200）与细胞共孵育1小时；PBS洗涤细胞3次，加入1：10000比例稀释的DAPI染液复染细胞核；PBS洗涤后激光共聚焦显微镜观察。
结果表明：相对于BSA（图4a所示，几乎没有结合）孵育的细胞之后，scFv（anti-EGFR）（图4b所示，与细胞EGFR结合并内化入细胞内）、scFv-9R（图4c所示，与细胞EGFR进行结合并内化入细胞内）能够特异性的结合于EGFR高表达的A549细胞株，并内化入细胞浆及细胞核内，因此后两者具有明显的肿瘤细胞靶向性。
流式细胞术检测靶向性结果：
收集对数生长期A549细胞，接种于6孔板，37℃，5%CO2培养箱中过夜；将用PBS（PH7.4）稀释至10μg/ml的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R、BSA加入细胞培养液中，与细胞共孵育4小时后收取细胞至EP管，预冷的PBS洗涤。将稀释好的抗6×His一抗（1：2000）加入管中混匀，冰上放置2小时。预冷的PBS洗涤后，用稀释好的FITC标记的抗小鼠二抗（1：200）与细胞冰上共孵育1小时，PBS洗涤之后重悬送检。
检测结果表明：与BSA（图5a所示，基本都落在了M1区）孵育细胞相比，scFv（anti-EGFR）（图5b所示，基本都落在了M2区）、scFv-9R（图5c所示，大部分都落在了M2区）均能够与A549细胞特异性结合，表现出对肿瘤细胞的靶向性、高亲和力。
3、scFv（anti-EGFR）、scFv-9R靶向携带核酸及内化能力
通过对凝胶阻滞实验、免疫荧光、流式细胞术检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R携带核酸及内化能力。
（1）凝胶阻滞实验检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R携带核酸能力：
各取1μg非特异性的PCR产物，分别与1μg，4μg，10μg纯化的单链抗体、融合蛋白于0.2mol/LNaCl溶液中室温孵育30min后，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
结果详见图6：与BSA、scFv（anti-EGFR）相比，scFv-9R组随蛋白浓度增大核酸电泳速度逐渐减慢，表明其具有携带核酸能力。
（2）scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的靶向性携带核酸内化能力：
BSA、scFv（anti-EGFR）、scFv-9R各10μg分别与20nMFAM-siRNA（siRNA为非特异性）混合室温下放置30分钟后，加入预先接种于盖玻片之上的A549细胞中，4小时后取出盖玻片经多聚甲醛固定20分钟、DAPI复染细胞核。
激光共聚焦拍摄结果如图所示：与BSA（图7a所示，未见绿色荧光）、scFv（anti-EGFR）（图7b所示，未见绿色荧光）相比，scFv-9R（图7c所示，绿色荧光可见于胞膜表面、胞质内及细胞核）可携带绿色荧光的FAM-siRNA内化入A549细胞浆及细胞核。
4、scFv（anti-EGFR）、scFv-9R体内靶向结合能力
将scFv（anti-EGFR）及scFv-9R融合蛋白及BSA透析至硼酸钠溶液（PH值8.5），与Dylight800染料室温下结合1小时，再次透析至PBS溶液（PH值7.4）。经鼠尾静脉注射入已荷瘤一周的裸鼠体内。经48小时后使用IVISLuminaⅡ系统拍照。
结果表明：与注射了BSA的裸鼠（如图8a所示，未见红色荧光）相比，scFv（anti-EGFR）（如图8b所示，可见红色荧光）及scFv-9R（如图8c所示，可见红色荧光且亮度较高）均可靶向结合于裸鼠背部荷瘤。证明两种单链抗体融合蛋白具有良好的体内靶向亲和能力。
鉴于EGFR单链抗体scFv（anti-EGFR）、单链抗体与精氨酸九聚体融合蛋白scFv-9R对EGFR的靶向性、高亲和力，并可内化入目标细胞；因此scFv（anti-EGFR）、scFv-9R可以进行以下应用：
在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物、肿瘤诊断试剂中的应用。
具体的，抗EGFR单链抗体可与示踪剂交联，发挥肿瘤示踪诊断功能。
EGFR与精氨酸九聚体融合蛋白可携带正电荷小分子物质，如siRNA、microRNA、脂质体等进入肿瘤细胞内部并释放，发挥抑制、杀伤肿瘤细胞作用。
Claims (7)
1.一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，其特征在于，包括通过连接肽相连接的重链可变区和轻链可变区，轻链可变区的末端连接有精氨酸九聚体；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。
2.一种编码基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白的核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
3.一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下操作：
1)将如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸克隆入pGEX4T-1表达载体，构建重组质粒；
2)将所构建的重组质粒转染大肠杆菌，并在含氨苄青霉素的YTA培养基中培养，培养至OD600为0.4～0.6时，添加IPTG诱导表达，收集诱导后的菌液离心，收集细菌后破菌、离心，收集上清；
3)使用GST亲和层析柱纯化分离上清中的融合蛋白，超滤浓缩后经凝血酶酶切，得到基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白。
4.权利要求1所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断试剂中的应用。
5.权利要求1所述的融合蛋白在制备靶向EGFR的药用载体、携带载体中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括所述的融合蛋白在携带siRNA、microRNA、脂质体中的一种或几种进入肿瘤细胞内部并释放的应用。
7.权利要求2所述的核苷酸在制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断试剂中的应用。
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