CN108864283B - 一种脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程抗体技术及细胞生物学技术领域，具体涉及一种脑部靶向转铁蛋白受体（TfR）的单链抗体。体外实验证明本发明所述靶向转铁蛋白受体的单链抗体可特异性与转铁蛋白受体相结合，可作为诊断、治疗中枢神经系统疾病的小分子运载体，应用于偶联脑部治疗性药物，通过转包吞作用将药物或诊断剂转运至脑部，对中枢神经系统疾病药物的开发和研究具有十分重要的价值。

Description

一种脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体及应用

技术领域

本发明属于基因工程、细胞生物学技术领域，具体涉及一种可与人脑内皮细胞上转铁蛋白受体高特异性结合的脑部靶向单链抗体，具有特异性将药物运输至脑部的作用，是一种可用于人类神经系统疾病治疗的基因工程抗体。

背景技术

中枢神经系统（CNS）紊乱性疾病已经在全球范围内影响了超过10亿人的健康，已超过了心脑血管疾病及癌症对人类的影响，其治疗负担已占据了全球公共健康负担的13%。由于血脑屏障（BBB）的存在使得药物无法进入到脑内发挥作用，而这正是影响中枢神经系统疾病治疗效果的最主要原因。血脑屏障由血管内皮细胞，周细胞，星形胶质细胞，神经元等神经血管单元（NVU）组成，与其他组织器官相比，脑毛细血管内皮细胞的紧密连接，胞饮作用的减弱极大的限制了药物通过血液进入脑组织，且循环系统中的抗体仅约有0.1-0.2%可以以稳定的浓度进入到脑内。血脑屏障不仅限制抗体，免疫介质，免疫细胞的渗透，同时其自身也缺乏淋巴管及树突状细胞，因此一旦患病，脑内无法立即做出有效的免疫应答。

近些年中，针对如何使药物进入血脑屏障已投入了大量研究，但一些试图增加血脑屏障渗透性或化学扰乱方法的效果不理想，利用血脑屏障自身的转运系统才是最安全的选择，血脑屏障上的转运方式可以分为三种1）载体介导的转运（CMT），2）主动外排机制（AET），3）受体介导的转包吞作用（RMT），其中前两种均为血液和脑组织之间运输如葡萄糖，氨基酸等小分子物质的途径，而第三种则是通过与脑内腔表面特定受体结合通过转胞吞作用来转运大分子，如胰岛素，转铁蛋白（TfR）等。在这些受体中，转铁蛋白受体是最值得关注及研究的受体，它高表达于脑内皮细胞，主要通过内吞作用摄取与转铁蛋白结合的铁离子来维持脑内铁离子的稳定，而此靶点较为重要的一点是，抗体与转铁蛋白受体结合的表位与转铁蛋白不同，因此并不影响转铁蛋白对铁的转运。

目前没有脑部靶向抗体获FDA批准上市，因此脑部靶向TfR抗体有巨大的开发潜力成为治疗脑部疾病的功能性抗体。脑部靶向TfR抗体通过与脑内皮细胞上受体相应靶点结合，在不破坏脑部组织完整性的前提下通过受体介导的转包吞作用将抗体转运至脑内发挥作用。有研究表明非靶向性抗体在脑内的含量并不受神经病理影响，即中枢神经系统疾病进程的增加并不会引起血脑屏障的损伤及渗漏，因此非靶向性治疗抗体通过渗透进入脑内的含量也不会增加，但无论患病与否，TfR受体在血脑屏障中含量保持不变，由此看来，靶向TfR抗体具有巨大的研究前景及价值，也是研究药物传递和中枢神经系统疾病的重中之重。

抗体药物的研究趋势要求抗体可实现靶向性强，分子量小等特点。其中单链抗体是由一条连接肽（linker）将重链可变区VH和轻链可变区VL首尾相连形成具有抗原结合功能的最小功能结构单位，相比于全抗来讲，具有分子量小，免疫原性低等特点。在体外研究中，抗TfR全抗已证实具有细胞毒性，且抗体化合价越高，毒性越大，如五价IgM，二价IgA 等细胞毒性均大于IgG，且当将IgG改型为仅保留其Fab段抗体分子时，未检测出抗TfR抗体具有细胞毒性，同时不会引起受体内化而干扰转铁蛋白的转运。因此小分子抗TfR抗体具有非常大的临床前研究价值，抗TfR单链抗体由于分子量只有全长抗体的1/6，因此可以作为小分子基因工程抗体，与放射性同位素，细胞因子等效应分子构建成多种双功能性抗体，同时作为转运工具，与前体药物，神经营养因子相连，靶向脑部用于治疗CNS疾病。因此与完整的单克隆抗体相比，单链抗体既可以发挥与脑部受体高特异性的结合活性，又可利用其转运优势发挥其生物学活性，在脑部靶向治疗方面显示出巨大潜力。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有潜在医学和药学价值的脑部靶向转铁蛋白受体（TfR）的单链抗体及其应用。本发明单链抗体的特征为具有在体外特异性结合人脑部TfR并可作为运载工具的小分子基因工程抗体。

本发明所得到的脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体基因重链和轻链基因通过对含有全抗杂交瘤细胞总RNA进行提取后，采用RT-PCR方法逆转录出cDNA文库，设计抗体轻重链Fab段可变区上下游引物，最后通过PCR法扩增得到。

本发明所述的脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体质粒是通过PCR扩增，克隆到pet-28a(+)质粒构建而成。

本发明具体技术方案如下：

一种脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链CDR1、CDR2和CDR3域，所述重链CDR1域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述轻链可变区包含轻链CDR1、CDR2和CDR3域，所述轻链CDR1域的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，轻链CDR2域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，轻链CDR3域的氨基酸序列如SEQID NO.9所示。

进一步的，上述单链抗体的重链可变区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；轻链可变区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。进一步的，所述重链可变区和轻链可变区可通过柔性肽连接，优选柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的优选方案，所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体全长个氨基酸714个核苷酸，预期有233个氨基酸。具有108个氨基酸的重链可变区（SEQ ID NO：1）和109个氨基酸的轻链可变区（SEQ ID NO：2），通过15个氨基酸的柔性肽（SEQ ID NO：3）连接。

本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体方法。

本发明将重组质粒转化到具有大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子的Transetta(DE3)表达感受态细胞中，通过IPTG诱导表达得到包涵体，通过对包涵体变性以及复性，经G75纯化得到抗转铁蛋白受体抗体。

表达本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体的表达载体和/或宿主细胞均属于本发明的保护范围。扩增本发明单链抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明用流式细胞术法测定了脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体具有与TfR特异性结合的能力。

本发明用免疫荧光法证实了脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体具有与TfR特异性结合的能力。

本发明的另一目的在于提供本发明所述的脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用，所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体可以作为小分子运载靶向工具将治疗性药物或诊断剂转运入脑内。

本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：

现有技术下虽然已有转铁蛋白受体（TfR）的单克隆抗体的报道，但这些抗体与抗原结合亲和力大小参差不齐，2015年发表至《cell》子刊中的一篇文章综述了有关脑靶向抗体的研究趋势，文中分别列举了Kd值为1.7nM,6.9nM,65nM,111nM的四种通过突变而得到的靶向TfR的抗体，此文献中指出，高亲和力抗体与受体结合时，会加快抗原抗体复合物被清除的速率，并且亲和力太高会使得抗体不能和TfR分离因此大量存留在官腔内壁，引发不良反应，而低亲和力抗体虽然在脑部的聚集浓度要高于高亲和力的抗体，但其同时也会抑制抗体的结合。在2017年发表至《Theranostics》杂志的文献公开了一种多功能抗体RmAb158-scFv8D3，其亲和力Kd值为8nM，其脑内聚集的含量约为Kd值为0.8nM的全抗的80倍，且其生物学活性要优于全抗，而本发明所述的抗转铁蛋白受体抗体为文献所报道的适中亲和力5.85nM，明显高于已报道杂交瘤融合单克隆抗体所制备的单链抗体的亲和力（Kd=15nM），且亲和力接近于最新报道的具有良好活性的多功能抗体，并且所构建的双特异性抗体目的即为使得抗体与TfR抗原进行单价结合，因此与报道的多功能抗体构建复杂，产量较低相比，本发明所述单链抗体不需修饰即可与抗原单价结合，制备简单，可在原核系统中大量表达，产量高。因此本发明所述抗体具有优于全抗以及其他改型抗体靶向进入脑内的亲和力优势，在亲和力方面可替代已有抗体进行靶向脑内治疗。

本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体基因序列通过从杂交瘤细胞中调取技术获得，是全新序列。体外实验证明本发明得到的脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体与体外高表达TfR细胞HEPG2表面的TfR具有高于已报道抗TfR单链抗体的亲和力，且亲和力适中，具有与TfR特异性结合能力Kd=5.85nM。本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体对于以TfR受体介导的转包吞作用为目标，为治疗中枢神经系统疾病提供了基于抗体靶向运输药物的疗法。

附图说明

图1是本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体的采用MOE2009模拟的抗体分子结构示意图。

图2是本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体重组载体的酶切图谱（M：DNAMarker；lane1-3：质粒双酶切产物。DNA大小以bp为单位）。

图3是本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体SDS-PAGE蛋白质电泳图鉴定结果。（M；Marker；1：抗-TfR蛋白）

图4是本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体与高表达TfR表面抗原的HepG2细胞特异性结合的免疫荧光图（Negative control：阴性对照； DAPI：细胞核染色；FITC：细胞膜蛋白染色；Merged：将细胞核与细胞膜重叠）。

图 5利用生物膜干涉技术检测本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体与转铁蛋白受体蛋白的结合情况：四条曲线分别表示四个传感器与四个抗体浓度，6000nM/L，1200nM/L，240nM/L，48nM/L横坐标为结合或解离时间，纵坐标为发生光位移情况。

图6是本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体流式细胞结合图，其中图6-1为不表达转铁蛋白受体CHO细胞对照组，图6-2为CHO细胞孵育抗体组；6-3为HepG2细胞对照组，图6-4 为HepG2细胞孵育抗体组。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法

本发明实施例中涉及的百分比，其中固定试剂为重量体积百分比，液体试剂为体积百分比。

实施例1 本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体重链基因及轻链基因的提取，扩增及初步鉴定

提取总RNA：收集对数期杂交瘤细胞，采用酚-氯仿抽提法提取总RNA,溶于20-50μlDEPC水中，-80℃保存。

RT-PCR合成cDNA第一链：以总RNA为模板逆转录合成cDNA第一链，试剂盒购于北京全式今生物技术有限公司，反应按产品说明书进行。

PCR扩增轻重链可变区基因：聚合酶为TransStart FastPfu DNA Polymerase高保真聚合酶。所用引物为根据文献（Jian Yi Li, Keijiro Sugimura, Ruben J.Boadoet.al. Genetically engineered brain drug delivery vectors: cloning,expression and in vivo application of an anti-transferrin receptor singlechain antibody-streptavidin fusion gene and protein[J] .ProteinEngineering.1999;12(9):787-796）中抗体重链及轻链可变区上游及下游基因序列所设计的简并引物，其中重链VH F（上游引物）和VH R（下游引物）以及轻链VL F（上游引物）和VL R（下游引物）序列为：

VHF:ggr sct gmr ytg gtg atg cct gg ，SEQ ID NO.10。

VHS:gga gac dgt gas mrk rgt scc ttg gc，SEQ ID NO.11。

VLF：gay att gtg mts acm car wct mca，SEQ ID NO.12。

VLR：gga tac agt tgg tgc agc atc，SEQ ID NO.13。

（简并密码子说明：r = a, g; y = c, t; m = a, c; s = c, g; w = a, t ;d=g,a,t;k=g,t）。

反应体系50μl，反应条件为：94℃ 1min；94℃ 20s，63℃（重链）/54.3℃（轻链）20s，72℃ 30s循环35次；72℃ 5min。取5μl 终产物在1.5%，30ml琼脂糖凝胶电泳中进行鉴定。PCR扩增获得330bp左右重轻链基因。用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，测序。

重链核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。相应的，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链CDR1域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链CDR1域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链CDR2域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，轻链CDR3域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

实施例2 本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体的扩增

通过Overlap PCR将重链基因和轻链基因通过15个氨基酸组成的柔性肽段连接（其序列见SEQ ID NO:3）在一起。

实施例3 本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体表达载体构建

以脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体基因为模板，设计含酶切位点引物进PCR 扩增。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。PCR扩增终产物及质粒pet-28a用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接。连接后转化大肠杆菌Transetta(DE3) Chemically Competent cell感受态细胞中，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定。酶切结果如图2所示，已初步进行菌液PCR验证的阳性克隆经双酶切后含有长度约为5000bp和700bp左右的两条带，说明脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体基因片段成功插入到pEP-28a表达载体中。

实施例4本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体蛋白的包涵体表达鉴定

挑取测序正确单克隆培养至OD₆₀₀=0.4-0.6之间时，以150rpm，16℃摇菌16h收集0.4mmol/L IPTG浓度诱导的菌液，将菌体以12000rpm/min，30min离心，弃去上清，用40ml破菌缓冲液溶解菌体沉淀。置于冰浴中采用超声探头进行超声波间歇破碎30min（超声5s，间隔5s，共180个循环），12000rpm/min，30min离心，弃细胞上清收集包涵体沉淀。将收集到的沉淀用洗涤缓冲液在冰浴中溶解搅拌30min，12000rpm/min，离心30min，弃上清收集包涵体。所得包涵体加入尿素梯度为0.5mol/L,1mol/L,2mol/L的40ml梯度缓冲液中，冰水浴中溶解搅拌30min，12000rpm/min，离心30min，弃上清收集包涵体。将上述包涵体以10ml/g加入变性液，冰水浴中溶解搅拌2h，12000rpm/min，离心30min，弃沉淀得上清。

包涵体在4℃下以6M/4M/2M/1M/0M透析液尿素梯度进行复性，其中2M/1M/0M尿素中加入0.5M的精氨酸以促进蛋白质正确折叠防止非活性中间体絮状沉淀产生，每个梯度复性8h-12h，最后用Tris透析12h。采用12%SDS-PAGE 蛋白胶检测收集的样品，所得胶图如图3，从图3中可以看出复性后的蛋白在32kD有表达，且表达量较高，可继续用于活性的检测。

实施例5本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体的特异性结合免疫荧光检测

将生长至对数期的HepG2细胞消化下来后分到6孔板中，每孔1×10⁵个细胞。将所铺好的6孔板从培养箱中取出，倾去培养液，用1×PBS润洗5次。

用4%多聚甲醛室温固定细胞20-40min，用1×PBS润洗5次。加封闭液，1ml/孔。每孔加入100ug/ml anti-TfR-scfv抗体1ml室温孵育2h，用1×PBS润洗5次。

每孔1:200加入Anti-6×His antibody抗体800μl，室温孵育1h，用1×PBS润洗5次。每孔1:200加入FITC标记的Goat anti-Mouse IgG 抗体800μl，避光室温孵育1h，用1×PBS润洗5次。加入DAPI染料进行核染色，避光室温孵育5min，用1×PBS润洗5次。使用荧光显微镜观察。结果图如4，可见空白对照组在FITC通道下未见荧光，而实验组在FITC通道下观察在脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体可以与两种细胞膜表面的转铁蛋白受体结合。证明本研究所制备的单链抗体可以与转铁蛋白受体的发生特异性靶向结合作用，可进行进一步的靶向研究。

实施例6生物膜干涉技术检测本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体亲和力常数

将100 μL浓度为1.1mg/mL的抗原蛋白与0.5 μg/L的生物素以等摩尔比例进行孵育1小时。孵育过后，利用脱盐柱将多余的生物素洗掉后，蛋白生物素化处理结束。利用PBS将抗体配置成不同浓度的溶液，6000nM/L，1200nM/L，240nM/L，48nM/L 四个浓度以备检测使用。

将带有超级链霉亲和素的光纤传感器浸入PBS缓冲液10 min。将传感器调节到含有生物素蛋白的96孔中，孵育5 min，通过传感器上的链霉亲和素与生物素的特异性结合，使得抗原蛋白结合到传感器上。传感器调节到PBS缓冲液中，稳定抗原蛋白与传感器的结合。

将传感器调节到含有不同浓度抗体的PBS溶液中，通过检测光位移，即可得到看到脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体与抗原蛋白的结合情况。随后将传感器调节到PBS缓冲液中，此时抗体会与抗原发生解离，即可得到二者蛋白解离的情况。

处理数据，得到二者的结合动力学分析，获得亲和力常数如图5，从图5的拟合数据得到抗原与脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体的结合常数KD为5.85nM。通过信号可以看见有较好的浓度依赖关系，数据可信。通过该方法可以看到抗原可以与目的融合蛋白迅速发生结合，但是解离速度较慢，侧面说明了转铁蛋白受体可以和脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体以较高的亲和力结合。

实施例7流式细胞术检测本发明所述脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体与HEPG2细胞表面抗原的结合能力

HepG2细胞长至汇合度80～90%，胰酶消化并用PBS重悬，将细胞浓度调整10⁶个/ml，取250μl已稀释好的细胞与400μl用2%FBS+PBS稀释的Anti-TfR单链抗体4℃孵育1h，2%FBS+PBS洗两次，加入1:200加入Anti-6×His antibody抗体4℃孵育1h，2%FBS+PBS洗两次。加入已稀释好的FITC标记的Goat anti-Mouse IgG 抗体400μl，4℃避光孵育1h，流式检测，选用不表达转铁蛋白受体的CHO细胞作为阴性对照，步骤同上。结果图如6，图6-1为不表达转铁蛋白受体的CHO细胞，孵育抗体组图6-2与对照组图6-1相比，FITC⁺细胞比例由1.01%增加至2.53%，数据分析没有显著性差异；而HepG2细胞孵育抗体组6-4与对照组6-3相比，FITC⁺细胞比例由1.06%增加到了85.0%，具有显著性差异（p<0.01），说明脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体可以与高表达转铁蛋白受体的活细胞HepG2结合，与TfR⁺细胞的结合具有特异性。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体及应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> mouse sapiens

<400> 1

Met Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys

1 5 10 15

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys

20 25 30

Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly

35 40 45

Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu

50 55 60

Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu

65 70 75 80

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Gly Thr

85 90 95

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Leu Thr Val Ser

100 105

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> mouse sapiens

<400> 2

Met Ile Val Leu Thr His Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Thr Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Lys Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Thr

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Ser Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> mouse sapiens

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> mouse sapiens

<400> 5

Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> mouse sapiens

<400> 6

Thr Arg Gly Gly Gly Thr Gly Tyr

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> mouse sapiens

<400> 7

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 3

<212> PRT

<213> mouse sapiens

<400> 8

Leu Val Ser

1

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> mouse sapiens

<400> 9

Gln His Ile Thr Glu Leu Thr Arg

1 5

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<222> (3,4,8,9,10)

<223> r = a, g; y = c, t; m = a, c; s = c, g

<400> 10

ggrsctgmry tggtgatgcc tgg 23

<210> 11

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<222> (7,12,13,14,15,16,19)

<223> r = a, g; m = a, c; s = c, g; d=g,a,t;k=g,t

<400> 11

ggagacdgtg asmrkrgtsc cttggc 26

<210> 12

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<222> (3,10,12,15,18,19,22)

<223> r = a, g;m = a, c; s = c, g; w = a, t

<400> 12

gayattgtgm tsacmcarwc tmca 24

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggatacagtt ggtgcagcat c 21

<210> 14

<211> 324

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgggggctg cattggtgaa gcctggagct tcagtgaagc tgtcctgcaa ggcttctggc 60

tacacattca ccagctactg gatgcactgg gtgaagcaga ggcctggaca aggccttgag 120

tggattggaa atatttatcc tggtagtggt agtactaact acgatgagaa gttcaagagc 180

aaggccacac tgactgtaga cacatcctcc agcacagcct acatgcagct cagcagcctg 240

acatctgagg actctgcggt ctattactgt acaagagggg gtgggacagg ctactggggc 300

caaggcactc cgctcaccgt ctcc 324

<210> 15

<211> 330

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgattgtgc tgactcactc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccacactc ctcatctatc ttgtatccaa cctaaaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattacgga gcttacacgt 300

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Claims (5)

1.一种脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体，其特征在于包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链CDR1、CDR2和CDR3域，所述重链CDR1域的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述轻链可变区包含轻链CDR1、CDR2和CDR3域，所述轻链CDR1域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链CDR2域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，轻链CDR3域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.如权利要求1所述的脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体，其特征在于所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；轻链可变区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如权利要求1所述的脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体，其特征在于所述重链可变区和轻链可变区通过柔性肽连接，所述柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.一种含有如权利要求1-3任一项所述的脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体的编码基因的载体。

5.一种表达脑部靶向转铁蛋白受体的单链抗体的宿主细胞，其特征在于表达如权利要求1-3任一项所述的靶向转铁蛋白受体的单链抗体。

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