CN113817071B

CN113817071B - 一种egfr靶向的trail融合蛋白及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113817071B
Application number: CN202111086698.XA
Authority: CN
Inventors: 贾殿隆; 袁风娇; 王菲菲; 李军
Original assignee: Liaocheng University
Current assignee: Liaocheng University
Priority date: 2021-09-16
Filing date: 2021-09-16
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2041-09-16
Also published as: CN113817071A

Abstract

本发明公开一种EGFR靶向的TRAIL融合蛋白，其特征在于，它由一种识别EGFR的亲合体（Affibody）与TRAIL融合而成；识别EGFR的亲合体融合连接在TRAIL的N末端，中间添加柔性连接子。由于亲合体分子结构简单稳定，与靶点亲和力高且溶解性好，该融合蛋白可高效靶向EGFR肿瘤细胞，体内外杀伤活性相较TRAIL得到大幅提升，并且可由大肠杆菌可溶性表达，生产纯化工艺简单，产量可观。

Description

一种EGFR靶向的TRAIL融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体为一种EGFR靶向的TRAIL融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体(Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-inducing Ligand，TRAIL)是肿瘤坏死因子家族成员之一，属于II型跨膜蛋白。其C末端为胞外段，可经蛋白酶水解释放，形成可溶性TRAIL(Soluble TRAIL,sTRAIL)。TRAIL可特异性地与肿瘤细胞表面高表达的死亡受体(DR4和DR5)结合，向下游传导信号，诱导肿瘤细胞凋亡。而正常细胞高表达诱骗受体(DcR1和DcR2)，其不含胞内结构域或胞内结构域不完整，与TRAIL结合后不能传递死亡信号，正常细胞得以存活。因此，TRAIL具有选择性杀伤肿瘤细胞的特性，有望被开发成为新型抗肿瘤药物。

研究表明，基因工程重组表达的可溶性TRAIL在体外条件下对多种肿瘤细胞具有极强的杀伤活性，但在体内却效果欠佳，临床疗效远低于预期。其中一个重要原因是由于正常组织细胞普遍表达诱骗受体，当TRAIL进入体内后被其大量消耗，导致肿瘤组织中TRAIL有效浓度不足。将识别肿瘤的导向分子与TRAIL连接，可赋予TRAIL对肿瘤组织的靶向性，从而提高其体内抗肿瘤效果。

表皮生长因子受体1(Epithelial Growth Factor Receptor 1，EGFR)属于I型酪氨酸激酶受体，在非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、头颈部癌、乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌等多种癌组织细胞表面过表达。其过表达与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，是肿瘤诊断和治疗极为重要的靶标分子。采用能特异性结合EGFR的单链抗体(Single Chain AntibodyFragment，scFv)或者纳米抗体(Nanobody)与TRAIL蛋白融合表达，可增强TRAIL对EGFR阳性肿瘤细胞的靶向力，有效提高其体内外抗肿瘤效果(Wahl et al.Hepatology.2013,57:625-636,Zhu et al.Sci Rep.2017,7:2602.)。然而，由于scFv和Nanobody结构相对复杂，它们与TRAIL的融合蛋白用大肠杆菌等原核系统常无法表达，或形成无活性的包含体。

Roland E Kontermann等利用特异性结合EGFR的scFv(克隆号：hu225)，构建了一系列与TRAIL的融合蛋白，这些蛋白在体内外表现出对EGFR阳性肿瘤更强的杀伤治疗效果(Wahl,Siegemund et al.Hepatology.2013,57:625-636,Siegemund et al.MAbs.2016,8:879-891,Hutt et al.Mol Cancer Ther.2017,16:2792-2802.)。但它们均采用哺乳动物细胞(HEK293T)进行表达，发酵工艺复杂，生产成本较高，产量较低。

Adel Badran等将另一种识别EGFR的scFv(克隆号：528)与TRAIL融合，在大肠杆菌中实现表达。但该融合蛋白以包含体形式沉积在胞质中，需对其进行复性操作才可恢复具有生物活性的可溶性形式(Badran et al.International Journal of Oncology.2010,36:1229-1234.)。而包含体复性工艺繁琐，复性得率低并常造成蛋白生物活性的损失。

发明内容

针对以上不足，本发明提供了一种新型的靶向EGFR的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)融合蛋白，它由一种识别EGFR的亲合体(Affibody)与TRAIL融合而成。由于亲合体分子结构简单稳定，与靶点亲和力高且溶解性好，该融合蛋白可高效靶向EGFR肿瘤细胞，体内外杀伤活性相较TRAIL得到大幅提升，并且可由大肠杆菌可溶性表达，生产纯化工艺简单，产量可观。

一种EGFR靶向的TRAIL融合蛋白，它由一种识别EGFR的亲合体(Affibody)与TRAIL融合而成；识别EGFR的亲合体融合连接在TRAIL的N末端，中间添加(G4S)₃连接子。

更进一步的，所述TRAIL是截取的人TRAIL的胞外段蛋白序列(114-281氨基酸)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1：

VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

更进一步的，所述(G4S)₃连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：3：GGGGSGGGGSGGGGS

更进一步的，所述亲合体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

SEQ ID NO：5：

VDNKFNKEMWAAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK

更进一步的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

SEQ ID NO：7：

VDNKFNKEMWAAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSGGGGSGGGGSVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

本申请还提供了上述融合蛋白的核苷酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

SEQ ID NO：8：

gttgacaacaaatttaacaaagaaatgtgggcagcctgggaagaaattcgtaatcttccgaacctgaatggttggcaaatgacagcattcattgcaagcttagtagatgatccgagccagagcgcaaacctgctggcagaggcaaaaaaactgaatgatgcacaggcaccgaaaggtggtggtggtagcggtggtggtggtagcggtggtggtggatccgttcgtgaacgtggtccgcagcgtgttgcagcacatattaccggtacccgtggtcgtagcaataccctgagcagcccgaatagcaaaaatgaaaaagcactgggtcgtaaaattaatagctgggaaagcagccgtagcggtcatagctttctgagcaatctgcatctgcgtaatggtgaactggttattcatgaaaaaggtttttattatatttatagccagacctattttcgttttcaggaagaaattaaagaaaataccaaaaatgataaacagatggttcagtatatttataaatataccagctatccggaccctattctgctgatgaaaagcgcacgtaatagctgttggagcaaagatgcagaatatggtctgtatagcatttatcagggtggtatttttgaactgaaagaaaatgatcgtatttttgttagcgttaccaatgaacatctgattgatatggatcatgaagcaagcttttttggtgcatttctggttggt

本申请还提供了上述融合蛋白的制备方法，步骤如下：

用上述核苷酸序列构建表达载体，并将其在宿主细胞中诱导表达纯化；其中，所述表达载体为pQE30重组载体，所述宿主细胞为大肠杆菌M15，所述纯化方法为镍离子螯合亲和层析法。

本发明还提供了上述融合蛋白、核苷酸序列在制备抗肿瘤药物中的应用。

更进一步的，所述肿瘤为人皮肤鳞状癌、结肠癌、卵巢癌或非小细胞肺癌。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

本发明构建的融合蛋白可经大肠杆菌表达，其主要以可溶性状态表达于胞质中，经破菌后可直接纯化，无需进行包含体复性，纯化工艺简单，生产成本低廉。经研究，融合蛋白相比对照蛋白TRAIL，在体外对EGFR阳性肿瘤细胞靶向性更强，大幅提高了对多种肿瘤细胞的杀伤活性；在体内融合可更多地在EGFR阳性肿瘤中累积并杀伤肿瘤组织细胞。无论是对EGFR高表达的A431移植瘤还是中低表达的COLO205移植瘤，融合蛋白均展现了更强的治疗效果，有望应用于EGFR阳性肿瘤的临床治疗。

附图说明

图1为Z-TRAIL融合蛋白结构示意图。

图2为Z-TRAIL融合蛋白制备过程的电泳鉴定。

A.Z-TRAIL表达纯化过程样品SDS-PAGE电泳。M：蛋白质标准；1：诱导前菌体总蛋白；2：IPTG诱导后菌体总蛋白；3：破碎菌体上清液；4：破碎菌体沉淀；5：经镍柱纯化所得蛋白。B.Z-TRAIL与TRAIL蛋白SDS-PAGE电泳比较。1：TRAIL；M：蛋白质标准；2：Z-TRAIL。

图3为Z-TRAIL、TRAIL和BSA凝胶过滤层析。

图4为Z-TRAIL体外靶向性分析。

A.流式分析A431细胞EGFR表达水平。B.流式分析比较Z-TRAIL和TRAIL蛋白对A431细胞的结合效率。封闭组为10μM游离亲合体Z_EGFR蛋白预封闭A431细胞，再行测试Z-TRAIL的结合。

图5为Z-TRAIL与TRAIL对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤活性比较。

图6为Z-TRAIL体内肿瘤靶向性分析。

A.荧光活体成像显示Z-TRAIL和TRAIL在肿瘤组织(白色箭头所指)的累积。B.Z-TRAIL和TRAIL在各组织中的分布。C.Z-TRAIL和TRAIL在各组织中的含量与肌肉中含量之比。D.TUNEL染色法比较Z-TRAIL和TRAIL在体内对肿瘤组织的杀伤。

图7为Z-TRAIL和TRAIL对A431移植瘤的治疗效果比较。

A.A431肿瘤体积生长曲线。对A431荷瘤鼠分别尾静脉注射Z-TRAIL和TRAIL蛋白进行治疗(箭头所示为给药时机)，每天测量肿瘤体积。B.观察结束时肿瘤拍照。C.观察结束时肿瘤平均重量统计。D.小鼠体重变化曲线。

图8为Z-TRAIL和TRAIL对COLO205移植瘤的治疗效果比较

A.流式分析COLO205细胞为EGFR中低水平表达。B.COLO205肿瘤生长曲线。对COLO205荷瘤鼠尾静脉注射Z-TRAIL和TRAIL蛋白(箭头所示为给药时机)，每天测量肿瘤体积。C.观察结合时肿瘤拍照。D.肿瘤平均重量统计。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如无特别说明，下述所用各成分的含量为重量百分比含量。

实施例1融合蛋白Z-TRAIL的制备

1)Z-TRAIL的分子设计

本发明的TRAIL是截取的人TRAIL的胞外段蛋白序列(114-281氨基酸，见表1)。识别EGFR的亲合体Z_EGFR由58个氨基酸构成(表1)。由于TRAIL与其受体结合的区域靠近C末端，为避免空间位阻效应对其活性的影响，本发明设计将Z_EGFR连接在TRAIL的N末端，并在两个片段之间加入柔性连接子(G4S)₃(图1所示)。该融合蛋白简称为Z-TRAIL。

2)Z-TRAIL重组表达载体的构建

利用核酸分析软件，将Z-TRAIL氨基酸序列逆向翻译为核酸序列，并进行密码子优化，获得Z-TRAIL的编码基因，提交青岛擎科生物技术公司进行基因合成。本实例中，以pQE30(购买自Qiagen)作为表达载体为例。为方便将该基因克隆至pQE30载体，基因合成时分别在基因5’和3’末端添加限制性核酸内切酶BamH I和Sal I。按照常规分子生物学方法，目的基因片段经双酶切和连接作用克隆至pQE30表达载体，并对该重组质粒进行测序验证，命名为pQE30-Z-TRAIL。对照蛋白TRAIL的重组表达质粒的构建采用相同的方法。

表1本发明所涉及的核苷酸和氨基酸序列

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3)Z-TRAIL融合蛋白的表达和纯化

采用常规分子生物学技术，将重组表达质粒pQE30-Z-TRAIL转化大肠杆菌M15(购买自Qiagen)菌株，用含氨苄西林(0.1mg/ml)和卡那霉素(0.03mg/ml)双抗生素的LB固体培养基筛选得到单克隆菌落。接种单菌落至含双抗生素的LB液体培养基扩大培养，待其生长至对数生长期，加入1mM异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactoside，IPTG)，28℃诱导过夜。采用离心法收集菌体，用裂解液(50mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0，200mM NaCl，20mM咪唑，10％甘油)重悬菌体。采用超声法破菌，释放可溶性蛋白，离心去除菌体不溶组分。上清液中的重组蛋白经Ni-NTA凝胶(购自金斯瑞)进行亲和层析纯化。Z-TRAIL诱导表达和纯化过程中各样品用凝胶电泳进行检测。

如图2A所示，与诱导前(泳道1)相比，经IPTG诱导后的菌体(泳道2)明显过量表达一大小约为28kDa蛋白。破菌后，超过三分之二的该蛋白可溶解于上清液中(泳道3)，只有不足三分之一的该蛋白位于破菌沉淀中(泳道4)，表明该蛋白主要为可溶性表达。经镍离子螯合柱Ni-NTA纯化后，获得Z-TRAIL蛋白，纯度大于90％(泳道5)，1L培养菌液约可纯化获得20mg重组Z-TRAIL蛋白。对照蛋白TRAIL采用相同的方法进行表达和纯化，将两者同时电泳，如图2B所示，TRAIL分子量约为20kDa，Z-TRAIL分子量约为28kDa，与预期相符。由此可见，本发明成功制备了Z-TRAIL融合蛋白。

4)Z-TRAIL聚合形式鉴定

已知TRAIL的活性形式为非共价键形成的同源三聚体，其单体生物活性较差。采用凝胶过滤层析分析Z-TRAIL分子在生理条件下的聚合状态。用AKTA pure层析系统(GEHealthcare)进行测试，选择PBS溶液(137mM NaCl，2.68mM KCl，2mM KHPO₄，pH 7.4)作为流动相，凝胶过滤柱为Superdex 75(GE Healthcare)，流速设定为1ml/min，上样量为100μl，上样TRAIL和牛血清白蛋白(BSA)作为对照。如图3所示，三种蛋白洗脱峰均为较对称的单峰且保留体积相近，其中BSA保留体积介于Z-TRAIL和TRAIL之间，已知BSA分子量约为67kDa。这表明Z-TRAIL和TRAIL形成了均一的三聚体，本发明制备的Z-TRAIL蛋白聚合状态符合预期。

实施例2 Z-TRAIL在体外对肿瘤细胞的靶向和杀伤作用

1)Z-TRAIL对EGFR阳性肿瘤细胞的靶向性分析

据报道人皮肤鳞状癌细胞A431高表达EGFR。用FITC标记的EGFR抗体孵育A431细胞，通过流式细胞仪检测，证实A431为EGFR高表达细胞(图4A)，其阳性表达率大于95％。因此本发明选择该细胞作为Z-TRAIL体内外靶向性研究的对象。

用6-羧基荧光素(6-FAM)分别标记TRAIL和Z-TRAIL蛋白，将200nM的两种蛋白分别加入A431细胞，37℃孵育30分钟，PBS洗涤后用流式细胞仪检测细胞荧光信号。如图4B所示，Z-TRAIL孵育组荧光强度显著高于TRAIL组，表明Z-TRAIL可更多地与A431细胞结合，相比于TRAIL，其对EGFR阳性细胞的靶向性得到增强。为进一步证明Z-TRAIL与肿瘤细胞结合的特异性，用过量的亲合体Z_EGFR蛋白(10μM)预孵育A431细胞20min，以封闭细胞表面的EGFR结合位点，再加入6-FAM标记的Z-TRAIL检测其结合。发现细胞荧光强度较未封闭组显著降低(图4B)，这表明Z-TRAIL靶向性的增强依赖于其分子中Z_EGFR片段对EGFR的特异性结合。

2)Z-TRAIL对肿瘤细胞的选择性杀伤作用

选择不同类型的肿瘤细胞和正常细胞，测试Z-TRAIL对它们的杀伤活性。按照ATCC推荐的培养条件培养各细胞。将1-2万个细胞接种于96孔细胞培养板培养过夜，分别加入用培养基梯度稀释的Z-TRAIL和TRAIL蛋白作用24h，再用CCK8试剂盒测试细胞存活率。以未加蛋白组作为100％计算各蛋白作用组细胞存活率。结果如图5所示，Z-TRAIL对人皮肤鳞状癌(A431)、结肠癌(HCT-116、COLO205)、卵巢癌(SKOV-3)和非小细胞肺癌(A549)细胞均具有较强的杀伤作用，且活性显著强于TRAIL。统计计算IC50值(表2)可知，Z-TRAIL杀伤肿瘤细胞的活性是TRAIL的5-20倍。

Z-TRAIL对正常细胞人脐静脉内皮细胞(HUVEC)杀伤活性极弱(图5)，IC50大于100nM(表2)，并且与TRAIL相比没有明显区别，这说明本发明制备的Z-TRAIL相比TRAIL选择性地增强对肿瘤细胞的杀伤活性，而不提高对正常细胞的毒性。

表2 Z-TRAIL和TRAIL对不同细胞杀伤IC50值统计

实施例3 Z-TRAIL在体内对肿瘤的靶向和杀伤作用

1)Z-TRAIL体内肿瘤靶向性分析

将A431肿瘤细胞(1×10⁶/只)注射于BALB/c nude裸鼠背部皮下，待肿瘤体积生长至100-200mm³，得到小鼠移植瘤模型。用近红外荧光染料Sulfo-Cy7NHS ester(购自西安瑞禧生物)分别标记TRAIL和Z-TRAIL蛋白，将实施例1制备的两种蛋白溶液加入1M的NaHCO₃溶液调pH至8.0，按蛋白与染料摩尔比为1:10加入Sulfo-Cy7 NHS ester染料，室温反应2h，再用PBS透析清除未反应染料。将100μg标记的两种蛋白通过尾静脉注射入荷瘤小鼠体内，用

Spectrum小动物活体成像系统(Perkin Elmer)扫描小鼠荧光信号(激发波长745nm)。注射5h后，处死小鼠，剥离主要组织进行离体扫描，以分析两种蛋白在体内的分布情况。

结果如图6A所示，两种蛋白注射1h后均在肿瘤部位(箭头所示)观察到荧光信号，3h时TRAIL组荧光信号有所减弱，而Z-TRAIL组荧光信号继续增强。5h时，Z-TRAIL组荧光信号显著高于TRAIL组，说明Z-TRAIL可更多地在肿瘤部位富集。对组织进行离体扫描(图6B)，并统计各组织荧光强度与肌肉组织的比值(图6C)，发现两组蛋白荧光信号均主要分布在肝脏、肾脏和肿瘤。肝肾是机体主要的代谢器官，Z-TRAIL和TRAIL在它们中的累积量区别不大。而Z-TRAIL组荧光信号在肿瘤组织中的累积显著高于TRAIL，与肌肉的荧光比值约是TRAIL组的2倍。这表明，在体内，本发明制备的Z-TRAIL相比于TRAIL对EGFR阳性肿瘤具有更强的靶向性。

2)Z-TRAIL体内对肿瘤组织的杀伤作用分析

TRAIL杀伤肿瘤细胞主要通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的，凋亡细胞可用TUNEL染色法进行检测。建立A431细胞移植瘤模型，待肿瘤生长至100-200mm³，分别静脉注射PBS、TRAIL和Z-TRAIL蛋白(剂量为5mg/kg)，24h后处死小鼠剥取肿瘤组织进行冰冻切片，用TUNEL试剂盒(购自凯基生物)按照说明书进行染色。其可将凋亡细胞核染上绿色荧光，再用DAPI复染细胞核，最后用荧光显微镜观察。

如图6D所示，TRAIL组只观察到少量的绿色荧光，而Z-TRAIL组可见大量的绿色荧光信号，并且该荧光可与蓝色DAPI荧光重合，这表明Z-TRAIL组的肿瘤组织中有大量的凋亡细胞存在。这些结果显示，本发明构建的Z-TRAIL相比于TRAIL，在体内可更多地诱导肿瘤细胞发生凋亡，更有效的杀伤肿瘤组织。

实施例4 Z-TRAIL体内抗肿瘤作用

1)Z-TRAIL对A431细胞移植瘤的治疗效果

A431为EGFR高表达细胞，本发明首先评估了Z-TRAIL蛋白对A431细胞移植瘤的体内抗肿瘤药效。在6周龄BALB/c nude裸鼠背部皮下接种1×10⁶个A431肿瘤细胞，建立小鼠A431移植瘤模型。每天测量肿瘤长和宽，肿瘤大小按体积＝长×宽²计算。接种后第6天，肿瘤体积生长至约30mm³时，将小鼠随机分为三组，每组5只。每组分别尾静脉注射5mg/kg的TRAIL和Z-TRAIL蛋白进行治疗，并注射等体积的PBS作为对照组。在接种后第11天追加给药一次。绘制肿瘤生长曲线，监测小鼠体重变化和健康状况。

结果如图7A所示，TRAIL治疗组与PBS对照组肿瘤生长曲线接近重合，肿瘤平均大小在观察期内没有显著性差异，接种第15天肿瘤平均体积分别为571.6±69.5和614.9±76.3mm³，表明TRAIL在该剂量下对A431移植瘤不产生治疗效果。而Z-TRAIL治疗组肿瘤生长明显受到抑制，在初次给药第3天后(接种第9天)肿瘤平均体积开始显著小于TRAIL和PBS组(P<0.05)。Z-TRAIL组第15天肿瘤平均体积为285.7±70.7mm³，显著小于TRAIL组(P<0.01)，甚至不足其肿瘤平均大小的50％。接种后第15天处死小鼠，剥取肿瘤进行拍照和称重。由图7B可见，Z-TRAIL组肿瘤外观大小明显小于TRAIL和PBS组。PBS、TRAIL和Z-TRAIL组肿瘤平均重量分别为0.56±0.04g，0.45±0.03g和0.22±0.02g，Z-TRAIL组肿瘤重量显著小于TRAIL组(P<0.01)。整个观察期内小鼠生长活动状态良好，每日的平均体重三组之间没有明显差异(图7D)，说明Z-TRAIL对小鼠没有明显毒性。以上结果表明，本发明制备的Z-TRAIL蛋白相比于TRAIL可更有效的抑制A431移植瘤的生长，可能在临床上对EGFR高表达的肿瘤具有较大的治疗潜力。

2)Z-TRAIL对COLO205细胞移植瘤的治疗效果

据文献报道，结肠癌细胞COLO205为EGFR中低等表达细胞系。我们用FITC标记的EGFR抗体染色COLO205细胞，流式分析发现其EGFR阳性表达率为35.1％(图8A)，明显低于A431细胞(实例2，图4A)。因此，本发明选择该细胞建立移植瘤模型，测试Z-TRAIL的抑瘤效果，以评估Z-TRAIL对EGFR中低表达肿瘤的抗肿瘤药效。将1×10⁶个COLO205细胞接种于6周龄BALB/c nude裸鼠背部皮下，建立小鼠移植瘤模型。将小鼠随机分为三组，每组5只，于接种后第6和11天分别尾静脉给予PBS、TRAIL和Z-TRAIL蛋白(剂量为5mg/kg)进行治疗，每天监测肿瘤生长，绘制肿瘤生长曲线。

如图8B所示，TRAIL和Z-TRAIL蛋白治疗均能抑制COLO205移植瘤的生长，其中Z-TRAIL的抑瘤效果明显优于TRAIL。观察期末(接种第24天)，PBS、TRAIL和Z-TRAIL组肿瘤平均体积分别为889.9±71.4，534.1±165.8和166.8±36.9mm³。处死小鼠剥取肿瘤组织拍照(图8C)和称重(图8D)，三组肿瘤平均重量分别为0.71±0.07，0.37±0.05和0.10±0.03g，Z-TRAIL治疗组肿瘤大小和重量均显著小于TRAIL组(P<0.001)。以上结果表明，本发明制备的Z-TRAIL相比TRAIL对COLO205移植瘤具有更强的治疗效果，其可能在临床上对EGFR中低表达的肿瘤同样具备更优的治疗潜力。

当然，本发明的上述实施例仅为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述举例的基础上还可以做其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以详细举例。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 聊城大学

<120> 一种EGFR靶向的TRAIL融合蛋白及其制备方法和用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 168

<212> PRT

<213> TRAIL114-281氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 1

Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr

1 5 10 15

Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys

20 25 30

Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His

35 40 45

Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His

50 55 60

Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln

65 70 75 80

Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr

85 90 95

Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser

100 105 110

Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser

115 120 125

Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe

130 135 140

Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser

145 150 155 160

Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

165

<210> 2

<211> 504

<212> DNA

<213> TRAIL114-281核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 2

gttcgtgaac gtggtccgca gcgtgttgca gcacatatta ccggtacccg tggtcgtagc 60

aataccctga gcagcccgaa tagcaaaaat gaaaaagcac tgggtcgtaa aattaatagc 120

tgggaaagca gccgtagcgg tcatagcttt ctgagcaatc tgcatctgcg taatggtgaa 180

ctggttattc atgaaaaagg tttttattat atttatagcc agacctattt tcgttttcag 240

gaagaaatta aagaaaatac caaaaatgat aaacagatgg ttcagtatat ttataaatat 300

accagctatc cggaccctat tctgctgatg aaaagcgcac gtaatagctg ttggagcaaa 360

gatgcagaat atggtctgta tagcatttat cagggtggta tttttgaact gaaagaaaat 420

gatcgtattt ttgttagcgt taccaatgaa catctgattg atatggatca tgaagcaagc 480

ttttttggtg catttctggt tggt 504

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> （G4S）3连接子氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> （G4S）3连接子核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 4

gtggtggtgg tagcggtggt ggtggtagcg gtggtggtgg atcc 44

<210> 5

<211> 58

<212> PRT

<213> ZEGFR亲合体氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 5

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Trp Ala Ala Trp Glu Glu Ile

1 5 10 15

Arg Asn Leu Pro Asn Leu Asn Gly Trp Gln Met Thr Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 6

<211> 174

<212> DNA

<213> ZEGFR亲合体核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 6

gttgacaaca aatttaacaa agaaatgtgg gcagcctggg aagaaattcg taatcttccg 60

aacctgaatg gttggcaaat gacagcattc attgcaagct tagtagatga tccgagccag 120

agcgcaaacc tgctggcaga ggcaaaaaaa ctgaatgatg cacaggcacc gaaa 174

<210> 7

<211> 241

<212> PRT

<213> Z-TRAIL氨基酸序列(2Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 7

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Trp Ala Ala Trp Glu Glu Ile

1 5 10 15

Arg Asn Leu Pro Asn Leu Asn Gly Trp Gln Met Thr Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln

65 70 75 80

Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn

100 105 110

Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His

115 120 125

Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile

130 135 140

Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr

145 150 155 160

Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr

165 170 175

Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser

180 185 190

Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe

195 200 205

Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His

210 215 220

Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val

225 230 235 240

Gly

<210> 8

<211> 723

<212> DNA

<213> Z-TRAIL核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 8

gttgacaaca aatttaacaa agaaatgtgg gcagcctggg aagaaattcg taatcttccg 60

aacctgaatg gttggcaaat gacagcattc attgcaagct tagtagatga tccgagccag 120

agcgcaaacc tgctggcaga ggcaaaaaaa ctgaatgatg cacaggcacc gaaaggtggt 180

ggtggtagcg gtggtggtgg tagcggtggt ggtggatccg ttcgtgaacg tggtccgcag 240

cgtgttgcag cacatattac cggtacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 300

agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgtaaa attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 360

catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggttattca tgaaaaaggt 420

ttttattata tttatagcca gacctatttt cgttttcagg aagaaattaa agaaaatacc 480

aaaaatgata aacagatggt tcagtatatt tataaatata ccagctatcc ggaccctatt 540

ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggtctgtat 600

agcatttatc agggtggtat ttttgaactg aaagaaaatg atcgtatttt tgttagcgtt 660

accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagcaagct tttttggtgc atttctggtt 720

ggt 723

Claims

1.一种EGFR靶向的TRAIL融合蛋白，其特征在于，其由识别EGFR的亲合体（Affibody）与TRAIL融合而成；识别EGFR的亲合体融合连接在TRAIL的N末端，中间添加柔性连接子；

所述TRAIL是截取的人TRAIL的胞外段蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述柔性连接子为（G4S）₃连接子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述亲合体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

2.如权利要求1所述的EGFR靶向的TRAIL融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

3.编码权利要求1-2任一所述融合蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4.一种制备权利要求1-2任一所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤如下：

用权利要求3所述的核酸分子构建表达载体，并将其在宿主细胞中诱导表达纯化；其中，所述表达载体为pQE30，所述宿主细胞为大肠杆菌M15，所述纯化为镍离子螯合亲和层析法。

5.权利要求1-2任一项所述的融合蛋白、权利要求3所述的核酸分子在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为人皮肤鳞状癌、结肠癌、卵巢癌或非小细胞肺癌。

6.一种抗肿瘤药物，其特征在于，其是以权利要求1-2任一项所述的融合蛋白、权利要求3所述的核酸分子为活性成分，加入其它辅料制备而成。