CN104628863A

CN104628863A - 一种双靶点双弹头抗肿瘤融合蛋白、其编码基因和用途

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Publication number: CN104628863A
Application number: CN201310566310.5A
Authority: CN
Inventors: 朱大强; 陈淑珍; 王晓飞; 商悦; 李毅; 李良
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-11-14
Also published as: CN104628863B

Abstract

本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：EGFR特异性靶向寡肽-连接肽-力达霉素辅基蛋白-连接肽-TRAIL功能肽段；其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述力达霉素辅基蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述TRAIL功能肽段具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。该融合蛋白为靶向EGFR和DR4/DR5的双特异性融合蛋白，其含有靶向EGFR的配体寡肽，通过拮抗EGFR信号通路来增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，逆转肿瘤细胞对TRAIL的天然耐药性。本发明还提供了该融合蛋白的编码基因、与力达霉素发色团组装的强化融合蛋白以及它们的制药用途。

Description

一种双靶点双弹头抗肿瘤融合蛋白、其编码基因和用途

技术领域

本发明属于药用蛋白技术领域。具体来讲，本发明涉及一种抗肿瘤融合蛋白、其编码基因、以该融合蛋白为活性成分的药物以及其制药用途。

背景技术

TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体）是机体自身合成的一种细胞因子，其生理功能主要是调节机体的免疫反应。TRAIL主要通过细胞外凋亡途径诱导细胞凋亡，但在后期也有线粒体通路的参与。TRAIL信号传导通路是指以TRAIL为配体，通过与死亡受体结合而启动凋亡信号，最终诱导细胞凋亡。研究表明，TRAIL及靶向TRAIL受体的激动剂型抗体能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而正常组织并不敏感。

TRAIL对肿瘤细胞具有选择性作用，目前已经发展到Ⅱ期临床试验阶段，并且预示了很好的临床应用前景。大量研究已经表明，TRAIL能诱导各种肿瘤细胞凋亡，如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、中枢神经系统肿瘤、胸腺肿瘤、白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、骨肉瘤等。尽管早期的临床实验是很令人鼓舞的，但是人重组表达的TRAIL（Humanrecombinant TRAIL，hrTRAIL）仅仅局限于携带TRAIL敏感肿瘤的患者，即使同一组织来源的肿瘤，对TRAIL的敏感性也有差异。因此，不同肿瘤组织对TRAIL的不敏感性使TRAIL应用于临床受到限制。然而，研究发现，TRAIL与小分子药物联用后，不但可以克服肿瘤对TRAIL的耐药性，同时还可以增加疗效。

表皮生长因子受体（EGFR）异常表达是多种上皮来源的肿瘤细胞的重要特性，因此EGFR已成为肿瘤靶向性治疗的理想靶点。EGFR过度表达能够拮抗死亡配体TRAIL和CD95L诱导的肿瘤细胞凋亡。如果采用针对EGFR的配体片段融合蛋白拮抗EGFR介导的信号通路，那么就能增强TRAIL的抗肿瘤作用，并能在一定程度上克服肿瘤细胞对TRAIL的耐药性。

力达霉素（LDM）是由1个辅基蛋白（Lidamycin apoprotein，LDP）和1个发色团（active enediyne chromophore,AE）组成的一种烯二炔类抗肿瘤抗生素，可以作为弹头药物。其中，辅基蛋白起保护发色团的作用，由110个氨基酸组成，分子量为10506Da，并且这两个部分可以拆分。研究发现，LDP本身在体内具有中等程度的抗肿瘤作用，并且由于其具有独特的分子结构，可以作为开发新型抗肿瘤药物的支架载体。

基于上述现有技术状况，可以考虑以力达霉素辅基蛋白为支架载体，通过基因工程的方法将TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素辅基蛋白形成融合蛋白。

发明内容

基于上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种以LDP为支架具有靶向EGFR和DR4/DR5的双特异性融合蛋白，该融合蛋白为具有抗肿瘤作用的小分子药用蛋白。

本发明的另一个目的是提供该融合蛋白的编码基因。

由于力达霉素具有可拆分和组装的特性，本发明还提供一种与发色团组装的强化融合蛋白。

本发明的还一个目的是提供以上述融合蛋白为活性成分的药物以及上述融合蛋白的制药用途。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

目前研究表明，TRAIL主要通过与靶细胞表面的特异性受体结合，激活细胞凋亡路径而发挥其诱导凋亡的作用。有研究表明该机制和EGFR通路在上皮来源的细胞中相互作用紧密。如果能够拮抗EGFR介导的信号通路，那么就能增强TRAIL的抗肿瘤作用，并且在一定程度上可逆转肿瘤细胞对TRAIL的耐药性。本研究的目标是构建一种靶向EGFR和DR4/DR5的双特异性融合蛋白，融合蛋白含有靶向EGFR的配体寡肽，通过拮抗EGFR信号通路来增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，逆转肿瘤细胞对TRAIL的天然耐药性。此外，因力达霉素具有可拆分和组装的特性，本发明人还成功组装了一种新的双靶点强化融和蛋白，该双特异性强化融合蛋白由三部分组成：两个分别靶向EGFR和DR4/DR5的寡肽配体作为导向分子，力达霉素作为“弹头”药物，旨在利用导向分子的特异性将力达霉素分子带入肿瘤细胞中，而且由于配体的靶向性和TRAIL的选择性作用而提高力达霉素对肿瘤细胞的选择性，从而降低力达霉素的副作用，同时，TRAIL具有靶向和“弹头”的双重作用，希望为抗肿瘤靶向药物的研制提供一种新的探索。

因此，一方面，本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：

EGFR特异性把向寡肽-连接肽-力达霉素辅基蛋白-连接肽-TRAIL功能肽段；

其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，共22个氨基酸；所述力达霉素辅基蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，共110个氨基酸；所述TRAIL功能肽段具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，共168个氨基酸。在本文中，将具有上述结构的融合蛋白命名为“Ec-LDP-TRAIL”。

在该融合蛋白中，连接肽优选为(GGGGS)₂。选择(GGGGS)₂作为连接肽的原因在于，一方面利于在工程菌如大肠杆菌中表达；另一方面，连接肽太短，刚性大，不利于蛋白分子伸展，容易造成蛋白分子构象相互遮掩，影响蛋白功能，并且力达辅基蛋白（LDP）支架分子共110个氨基酸，具有α螺旋和β折叠，结构复杂，分子量比较大，因此，选用(GGGGS)₂。

所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或者，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。

SEQ ID NO:4为本发明提供的一个融合蛋白的氨基酸序列，共320个氨基酸。从氨基端至羧基端，该融合蛋白包括：EGFR特异性靶向寡肽（Ec），共22个氨基酸；连接肽，为(GGGGS)₂柔性肽，共10个氨基酸；力达霉素辅基蛋白（LDP），共110个氨基酸；连接肽，为(GGGGS)₂柔性肽，共10个氨基酸；TRAIL功能肽段，共168个氨基酸。

SEQ ID NO:5为本发明提供的一个融合蛋白的氨基酸序列，共330个氨基酸。相比于SEQ ID NO:4，该融合蛋白在EGFR特异性靶向寡肽之前具有His和Met，在TRAIL功能肽段的C端具有Leu和Glu以及(His)₆标签。

另一方面，本发明提供上述融合蛋白的编码基因。

所述编码基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或者，所述编码基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。

再一方面，本发明提供一种抗肿瘤强化融合蛋白，所述强化融合蛋白为本发明的上述融合蛋白与力达霉素发色团组装而成，此强化融合蛋白具有TRAIL和力达霉素两个弹头。

根据本发明的具体实施方式，所述强化融合蛋白通过包括以下步骤的方法组装而成：将所述的融合蛋白与力达霉素发色团以1:5的摩尔比混合，于4℃下避光缓慢晃动反应12～16个小时。反应结束后，去除多余发色团，得到组装成功的强化融合蛋白。根据本发明的具体实施方式，将混合液用PD-10柱（商业化的Sephadex G-25柱，Pharmacia产品）层析分离，经280nm、343nm紫外监测后，弃去过量未反应的AE，收集强化融合蛋白。

另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述药物以本发明提供的上述融合蛋白和/或强化融合蛋白为活性成分。所述抗肿瘤药物用于治疗或预防哺乳动物的鳞状上皮细胞癌；优选地，所述哺乳动物是人。

又一方面，本发明还提供上述融合蛋白或强化融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。所述抗肿瘤药物用于治疗或预防哺乳动物的鳞状上皮细胞癌；优选地，所述哺乳动物是人。

综上，本发明应用基因工程的方法提供了一种新型的具有特异性、靶向性的融合蛋白。该融合蛋白以力达霉素辅基蛋白为支架载体，融合了TRAIL和EGFR配体寡肽，是靶向两种受体（EGFR，DR4/DR5）的双特异性融合蛋白。这种双特异性融合蛋白的导向分子为EGFR寡肽配体和DR4/DR5专一配体的可溶部分（sTRAIL），且寡肽配体和sTRAIL位于同一个分子上，使该融合蛋白具有较好的体内外抗肿瘤作用。

本发明的优点与积极效果在于，应用基因工程技术制备获得的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL，可特异地与肿瘤细胞表面的EGFR受体和DR4/DR5结合，并能抑制肿瘤细胞的增殖，在体内也能明显抑制裸鼠移植瘤的生长。此外，融合蛋白均具有较低的药物毒性，具有发展成肿瘤靶向性治疗药物的潜能。

本发明所提供的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL其制备方法包括以下步骤：

融合蛋白Ec-LDP-TRAIL重组表达质粒的构建；

融合蛋白Ec-LDP-TRAIL在大肠埃希氏菌BL21(DE3)star^TM中的诱导表达；

融合蛋白Ec-LDP-TRAIL的亲和层析纯化及复性；

强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE的制备分离。

本发明还提供了融合蛋白Ec-LDP-TRAIL及其强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE的生物学活性实验研究，包括：

融合蛋白Ec-LDP-TRAIL与肿瘤细胞的亲和活性分析；

MTT法检测融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对A431细胞、H460细胞和NIH/3T3细胞的细胞毒作用；

融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对人鳞状上皮细胞癌A431裸鼠移植瘤模型的生长抑制作用；

免疫组化分析融合蛋白对A431上皮鳞状细胞癌细胞增殖和肿瘤组织亲和力的影响；

融合蛋白Ec-LDP-TRAIL给药组裸鼠病理组织学检查；

MTT法检测强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对A431细胞、H460细胞和NIH/3T3细胞的细胞毒作用；

强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对细胞凋亡信号通路的影响；

强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对人鳞状上皮细胞癌A431裸鼠移植瘤模型的生长抑制作用；

强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE给药组裸鼠病理组织学检查。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1：pET30-Ec-ldp-TRAIL重组表达载体构建过程。

图2：PCR扩增Ec-ldp-TRAIL基因片段，其中：

1-DNA分子量标准Trans2000plus II：

2-pET30-Ec-ldp-TRAIL表达载体；

3-Ec-ldp-TRAIL基因。

图3：pET30-Ec-ldp-TRAIL重组表达载体的内切酶分析，其中：

1-DNA分子量标准Trans2000plus II；

2-大肠杆菌DH5α中提取的重组质粒pET30-Ec-ldp-TRAIL；

3-大肠杆菌BL21中提取的重组质粒pET30-Ec-ldp-TRAIL；

4-大肠杆菌DH5α中提取的重组质粒pET30-Ec-ldp-TRAIL+Nde I/Xho I；

5-大肠杆菌BL21中提取的重组质粒pET30-Ec-ldp-TRAIL+Nde I/Xho I。

图4：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL表达产物的SDS-PAGE分析，其中：

1-蛋白分子量标准Prostsined protein marker III(kDa)；

2-IPTG诱导前重组菌培养液上清蛋白；

3-IPTG诱导后重组菌培养液上清蛋白；

4-IPTG诱导前重组菌周质腔蛋白；

5-IPTG诱导后重组菌周质腔蛋白；

6-IPTG诱导前重组菌细胞质可溶组分；

7-IPTG诱导后重组菌细胞质可溶组分；

8-IPTG诱导前重组菌包涵体蛋白；

9-IPTG诱导后重组菌包涵体蛋白。

图5：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL纯化产物的SDS-PAGE分析，其中：

1-蛋白分子量标准Prostsined protein marker III(kDa)；

2-尿素溶解的重组菌包涵体未与Ni²⁺柱结合组分；

3-洗涤杂蛋白组分；

4-纯化的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL；

5-复性后的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL。

图6：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL的免疫印迹分析，其中：

1-蛋白分子量标准Prostsined protein marker III(kDa)；

2-纯化的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL；

3-抗His-tag抗体western blot分析；

4-抗LDP抗体western blot分析。

图7：Western Blot检测不同肿瘤细胞表面DR4/DR5的表达水平。

图8：ELISA法分析融合蛋白对A431的免疫反应性，其中：

◆-Ec-LDP-TRAIL；

■-Ec-LDP；

▲-LDP。

图9：ELISA法分析融合蛋白对H460的免疫反应性，其中：

◆-Ec-LDP-TRAIL；

■-Ec-LDP；

▲-LDP。

图10：ELISA法分析融合蛋白对NIH/3T3的免疫反应性，其中：

◆-Ec-LDP-TRAIL；

■-Ec-LDP；

▲-LDP。

图11：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对A431细胞的细胞毒作用，其中：

◆-Ec-LDP-TRAIL；

■-Ec-LDP。

图12：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对H460细胞的细胞毒作用，其中：

◆-Ec-LDP-TRAIL；

■-Ec-LDP。

图13：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对NIH/3T3细胞的细胞毒作用，其中：

◆-Ec-LDP-TRAIL；

■-Ec-LDP。

图14：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对人上皮鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用，其中：

◆-对照组；

■-Ec-LDP-TRAIL10mg/kg。

图15：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对裸鼠体重的影响，其中：

◆-对照组；

■-Ec-LDP-TRAIL10mg/kg。

图16：免疫组化分析融合蛋白对A431上皮鳞状细胞癌细胞增殖和肿瘤组织亲和力的影响。

图17：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL给药组裸鼠肝脏组织学检查。

图18：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL给药组裸鼠肺组织学检查。

图19：融合蛋白Ec-LDP-TRAIL给药组裸鼠小肠组织学检查。

图20：强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对A431细胞的细胞毒作用，其中：

◆-LDM；

■-Ec-LDP-TRAIL-AE。

图21：强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对H460细胞的细胞毒作用，其中：

◆-LDM；

■-Ec-LDP-TRAIL-AE。

图22：强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对NIH/3T3细胞的细胞毒作用，其中：

◆-LDM；

■-Ec-LDP-TRAIL-AE。

图23：强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对细胞凋亡信号通路的影响，其中：

1-1×10^-9mol/L LDM处理的A431细胞；

2-1×10^-9mol/L Ec-LDP-TRAIL-AE处理的A431细胞；

3-未加药处理的对照组细胞；

4-1×10^-10mol/L LDM处理的A431细胞；

5-1×10^-10mol/L Ec-LDP-TRAIL-AE处理的A431细胞；

图24：强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对人上皮鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用，其中：

◆-对照组；

■-LDM0.05mg/kg；

▲-Ec-LDP-TRAIL-AE0.16mg/kg。

图25：强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对裸鼠体重的影响，其中：

◆-对照组；

■-LDM0.05mg/kg；

▲-Ec-LDP-TRAIL-AE0.16mg/kg。

图26：强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE给药组裸鼠肝脏组织学检查。

图27：强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE给药组裸鼠肺组织学检查。

图28：强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE给药组裸鼠小肠组织学检查。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

<实施例1>融合蛋白Ec-LDP-TRAIL重组表达质粒pET30-Ec-LDP-TRAIL的构建

重组质粒pET30a(+)-Ec-ldp-Hr（郭晓芳等人，A bispecificenediyne-energized fusion protein containing ligand-based and antibody-basedoligopeptides against epidermal growth factor receptor and human epidermalgrowth factor receptor2shows potent antitumor activity.Clinical CancerResearch,2010,16.7:2085-2094）和pET30a(+)-TRAIL（杨杰，TRAIL与LDM联用和作用机制及TRAIL蛋白的表达.MS thesis.北京协和医学院,2010.）中分别带有Ec-LDP基因和TRAIL功能基因，由本实验室保存。通过重叠PCR技术引入NdeI、XhoI两个酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。

P1（SEQ ID NO:8）：5’-TATACATATGAACTGTGTGGTGGGCTATATTGG-3’（下划线为Nde I酶切位点，其后为Ec-ldp起始序列）

P2（SEQ ID NO:9）：5’-CTCACTGAACCGCCTCCACCTGAACCGCCT CCACCGCCGAAGGTCAGAGCCACGTG-3’（下划线为序列间的连接肽，其后为Ec-LDP结尾互补序列）

P3（SEQ ID NO:10）：5’-TCGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGC GGTTCAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3’（下划线为序列间的连接肽，其后为TRAIL起始序列）

P4（SEQ ID NO:11）：5’-GTGGTGCTCGAGGCCAACTAAAAAGGCCCCGA-3’（下划线为Xho I酶切位点，其后为TRAIL结尾互补序列）

重组表达质粒pET30-Ec-LDP-TRAIL的构建过程如图1所示。以本室保存的构建好的含有EGFR配体寡肽、力达霉素辅基蛋白和HER2配体寡肽的融合蛋白基因pET30a(+)-Ec-ldp-Hr为模板，分别以P1为5’端引物，P2为3’端引物，进行PCR扩增，获得含有酶切位点Nde I的、大约为500bp的含Ec-ldp基因的片段。同时，以本室保存的含有TRAIL基因的重组质粒pET30a(+)-TRAIL为模板，分别以P3为5’端引物，P4为3’端引物，进行PCR扩增，获得含有酶切位点Xho I的、大约为500bp的含TRAIL基因的片段。PCR反应体系为94℃变性5min后进行30个循环的扩增反应：94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，最后一个循环结束后在72℃保温10min。然后，PCR产物利用快速胶回收试剂盒（Omega生物技术有限公司产品）纯化回收后的两个片段混合作为模板，以引物P1和引物P4进行OverlapPCR反应，产物进行琼脂糖凝胶电泳回收990bp的片段（如图2），其含NdeI和Xho I限制性酶切位点，并且中间含有两个各编码-GGGGSGGGGS-10个氨基酸的连接肽基因。

将该片段克隆至pMD18-T载体，命名为pMD-Ec-ldp-TRAIL，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养后挑取单克隆，小量培养提取质粒进行Nde I和Xho I双酶切，与经过Nde I/Xho I双酶切的空载体pET30a(+)以3:1的比率16℃连接过夜，第二天转化E.coli DH5α，挑选出阳性克隆，提取质粒，经初步酶切鉴定后送上海英俊公司测序，测序正确，酶切图谱鉴定（图3），命名为pET30-ec-ldp-trail。该pET30-ec-ldp-trail含融合蛋白Ec-ldp-TRAIL基因（SEQ ID NO:7），其全长990bp，编码330个氨基酸，其中Nde I酶切位点（2个氨基酸），EGF C环基因（Ec）长66bp，编码22个氨基酸，之后依次是(GGGGS)₂连接肽基因（10个氨基酸）、力达霉素辅基蛋白基因（110个氨基酸）、(GGGGS)₂连接肽基因（10个氨基酸）TRAIL功能基因（168个氨基酸）、Xho I酶切位点（2个氨基酸）以及组氨酸标签基因（6个氨基酸），因此，最后得到的融合蛋白将共含有330个氨基酸残基。

<实施例2>融合蛋白Ec-LDP-TRAIL在大肠埃希氏菌BL21(DE3)star^TM中诱导表达

鉴定后的重组质粒pET30-ec-ldp-trail转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)star^TM（Invitrogen公司产品），挑取重组转化子（此菌株为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），已于2013年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），菌种保藏号CGMCCNO.8200）接种到3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。次日按照5%的比例接种，37℃震荡培养至OD600为0.8，加入IPTG至终浓度为0.2mM，诱导培养8h。取适量菌液，对培养基上清、细胞周质腔组分、可溶性胞质组分及包涵体组分进行表达产物定位分析。15%SDS-PAGE电泳显示，融合蛋白分子量约为35.1kDa以不可溶形式表达于包涵体中（图4）。

<实施例3>融合蛋白Ec-LDP-TRAIL亲和层析纯化及分离制备

3.1包涵体蛋白的提取

取经IPTG诱导的重组菌培养物10000g离心10min，尽量去除上清，收集菌体。每1L培养体积的菌体用20ml的20mM Tris-HCl进行重悬。超声波处理破碎细胞。4℃10000g离心15min，收集包涵体和细胞碎片蛋白，弃去上清。用40ml的不含尿素的1×结合缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5MNaCl，5mM咪唑，pH8.0）重悬沉淀。4℃10000g离心15min，弃去上清，收集沉淀。重复上述操作步骤，用50ml1×结合缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，8M尿素，pH8.0）重悬沉淀，冰浴1h完全溶解包涵体蛋白。4℃15000g离心30min，去除不可溶物质。收集上清，用0.45μm膜过滤后，储存于4℃以待亲和层析纯化。

3.2融合蛋白Ec-LDP-TRAIL亲和层析纯化

采用His-Trap^TM HP纯化柱（GE公司产品）纯化蛋白样品。经预处理亲和柱后，以6倍柱体积含1×Binding Buffer平衡层析柱，可溶蛋白样品上柱后，分别以10倍体积1×结合缓冲液和6倍体积1×洗涤缓冲液（40mMTris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，8M尿素，pH8.0）洗涤层析柱，最后以6倍体积1×洗脱缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，8M尿素，pH8.0）洗脱结合蛋白，收集洗脱组份，获得纯化后的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL（图5）。为了检验纯化出的蛋白是否为所需的目的蛋白，本实验采用了非还原性SDS-PAGE以及Western Blot方法对纯化的目的蛋白Ec-LDP-TRAIL进行鉴定，结果证实纯化出的蛋白为带有His-tag标签和LDP结构的目的蛋白（图6）。

3.3融合蛋白Ec-LDP-TRAIL的透析复性

将浸在EDTA（乙二胺四乙酸二钠）中的透析袋用蒸馏水清洗干净，装满水然后排出。将洗脱的蛋白用1×结合缓冲液稀释至15μM，加入2-巯基乙醇至终浓度为10mM，室温放置30min。将还原的蛋白用至少50倍样品体积的复性液（50mM Tris-HCl，1mM EDTA，200mM NaCl，6M尿素，pH8.0）4℃透析过夜，以除去还原剂。用尿素浓度依次递减的复性液（3M，2M，1M，0.5M，0M尿素）将样品进行分步透析。在尿素浓度为1.5M阶段，加入750μM的氧化型谷胱甘肽和400mM的L-精氨酸。将最后一步透析所得样品再用50倍体积的PBS（pH7.4）进行透析。每12h更换一次透析液，共2次。将透析后的样品4℃10000g离心30min，收集上清，即得到复性融合蛋白Ec-LDP-TRAIL。

<实施例4>ELISA法检测融合蛋白Ec-LDP-TRAIL与肿瘤细胞的亲和活性

4.1Western Blot检测不同肿瘤细胞表面DR4/DR5的表达水平

将对数生长期的A431、H460和NIH/3T3细胞用预冷的PBS洗涤3次，用细胞刮刀刮下细胞，加入适量细胞裂解液（50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，150mmol/L NaCl，0.02%叠氮钠，0.1%SDS，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，1μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮抑酶肽，1mmol/LPMSF，2mmol/L NaVO₄和50mmol/L NaF），冰上裂解30min。之后于4℃，12,000rpm离心20min，收集上清液。用BCA试剂盒进行蛋白定量，取50μg蛋白与适量5×上样缓冲液混合，沸水浴中变性5min，-70℃保存备用。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，灌制胶板。取50μg不同肿瘤细胞的总蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳分析。电泳完毕后进行转膜，将蛋白转移至PVDF膜上。所用的一抗为抗EGFR兔多克隆抗体（Santa Cruz公司，用1%BSA按照1：1000的比例进行稀释），抗DR4鼠源多克隆抗体和抗DR5兔源多克隆抗体（ProSci公司，用1%BSA按照1:1000的比例进行稀释），另一个内标一抗为抗肌动蛋白鼠单克隆抗体（Santa Cruz公司，用1%BSA按照1:1000的比例进行稀释）；二抗均为HRP标记的羊抗鼠/兔IgG（中杉金桥公司，用1%BSA按照1:5000的比例进行稀释）。结果表明，H460细胞表面高度表达DR4和DR5，A431中度表达DR5而基本不表达DR4，NIH/3T3低表达DR5，也不表达DR4，因此可作为阴性对照细胞（图7）。

4.2ELISA法分析融合蛋白对不同肿瘤细胞的免疫反应性

人表皮癌细胞A431、人大细胞肺癌H460和小鼠成纤维细胞NIH/3T3以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板（不同细胞的大小以及生长速度有差异，本数量是以H460细胞为例，其他的细胞以24h长满96孔板为原则），37℃培养24h后用PBS洗3次（3min/次），加入4℃预冷的0.05%戊二醛50μl/孔，于4℃固定细胞15min；固定好的细胞用PBS洗3次后，用1%BSA/PBS溶液以200μl/孔于4℃封闭过夜；用PBST缓冲液（PBS中含有0.05%的Tween-20）洗3次；将融合蛋白倍比稀释加入到96孔板中，50μl/孔，每个浓度设3个平行孔，37℃温育2h；用PBST洗3次后，加入抗His-tag单克隆抗体（1:2000稀释），50μl/孔，37℃温育2h；用PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体（1:2500稀释），50μl/孔，37℃温育2h；用PBST洗板5次，加入辣根过氧化物的底物反应液（邻苯二胺:0.1mol/L柠檬酸:H₂O₂=4mg:10ml:15μl），100μl/孔，室温避光反应10min。以2mol/L的硫酸100μl/孔终止反应，立即在酶标仪上测定492nm处的吸光值。根据酶标仪测定结果，扣除阴性对照值，然后以吸光值为纵坐标，以抗体浓度为横坐标作剂量反应曲线。ELISA检测结果表明（图8、图9、图10），三种蛋白Ec-LDP-TRAIL、Ec-LDP和LDP对高表达EGFR和/或DR4/DR5的肿瘤细胞，如A431和H460都有免疫结合活性，而对表达EGFR和死亡受体较低的小鼠成纤维细胞NIH/3T3的结合能力非常弱。在三种蛋白中，双靶点融合蛋白Ec-LDP-TRAIL蛋白与细胞亲和活性最强，只能靶向EGFR的融合蛋白Ec-LDP的结合活力次之，LDP蛋白与细胞的亲和活性最弱。

<实施例5>MTT法检测融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对肿瘤细胞的细胞毒作用

取对数生长期的A431、H460和NIH/3T3细胞，消化后计数，加入到96孔细胞培养板中，每孔铺细胞3000-5000个。37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。向96孔培养板中加入28.6μmol/L至0.22μmol/L连续2倍稀释的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL。37℃继续培养48h。每个药物浓度设3个平行孔，同时设立无药对照孔和无细胞对照孔。每孔加入5mg/ml MTT20μl，37℃继续培养4h。吸弃培养基，每孔加入DMSO150μl，室温下摇床振荡15min。用酶标仪测定570nm的吸光度值。各平行孔的吸光度值取平均值，计算细胞的存活率T/C(％)：T/C(％)=(加药组吸光度平均值.无细胞对照组吸光度平均值)/(无药对照组吸光度平均值.无细胞对照组吸光度平均值)。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为横坐标作浓度反应曲线，计算IC50值（如图11、图12、图13所示）。

结果显示（表1），在等摩尔蛋白浓度情况下，融合蛋白Ec-LDP-TRAIL比Ec-LDP对高表达EGFR或死亡受体DR4/DR5的A431细胞和H460细胞的增殖有更强的抑制作用，这可能是由于Ec-LDP-TRAIL中的TRAIL功能结构发挥促细胞凋亡的作用。而对于不表达EGFR并低表达死亡受体的NIH/3T3，细胞融合蛋白Ec-LDP-TRAIL和Ec-LDP基本未显示出杀伤作用；对于不同的肿瘤细胞系，融合蛋白的杀伤作用与该细胞EGFR和DR4/DR5的表达水平存在一定的相关性，EGFR或DR4/DR5高表达的细胞系，其对融合蛋白表现出更高的敏感性。

表1.融合蛋白Ec-LDP-TRAIL和Ec-LDP对各种细胞的IC50值

<实施例6>融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对人上皮鳞状细胞癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用

6.1融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对人上皮鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

融合蛋白的体内抗肿瘤活性分析采用了上皮鳞状细胞癌A431裸鼠移植瘤模型。取6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠，体重18～22g。将A431细胞消化成单细胞悬液后，用无菌生理盐水洗3次，计数。用生理盐水重悬5×10⁷细胞/ml，每鼠接种0.2ml于右侧腋窝皮下。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成2×2×2mm³的小块，用套管针将肿瘤移植到裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。在接种瘤块后第10天，将裸鼠分组，每组8只裸鼠，各组体重及瘤块大小均一。实验共设置2组，分别为对照组和Ec-LDP-TRAIL蛋白组。当肿瘤体积达到100mm³时，通过尾静脉给药，每只裸鼠注射200μl。Ec-LDP-TRAIL蛋白剂量为10mg/kg，第一次给药后的第8天，按照相同的剂量再次通过尾静脉给药一次。对照组不做任何处理。实验期间每4天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式V=ab²/2计算肿瘤体积（a：肿瘤长径，b：肿瘤短径），绘制肿瘤生长曲线（图14），观察体重变化。实验结果表明，融合蛋白Ec-LDP-TRAIL可显著地抑制人上皮鳞状细胞癌移植瘤的生长，抑瘤率为80.19%。在整个实验治疗期间，动物的体重下降不明显，可耐受所给的剂量，统计分析结果显示与对照组有显著性差异（表2）。表2.融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对人上皮鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

6.2融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对裸鼠体重的影响

在实验期间，各组动物的体重变化不明显（图15）。实验结束时，Ec-LDP-TRAIL10mg/kg剂量组与实验初期相比，体重上升了0.92g，因此可认为裸鼠对该融合蛋白具有良好的可耐受剂量，表明该双靶点融合蛋白可提高动物的耐受剂量，并提高抑瘤率。

<实施例7>免疫组化分析融合蛋白Ec-LDP-TRAIL对A431人上皮鳞状细胞癌细胞增殖和肿瘤组织亲和力的影响

将A431荷瘤裸鼠处死后，肿瘤组织经固定、脱水、包埋，制成5μm厚的石蜡切片。将石蜡切片脱腊入水，经过步骤：二甲苯I3-5min--二甲苯II3-5min--100%乙醇I3min--100%乙醇II3min--95%乙醇I3min--95%乙醇II3min--80%乙醇3min--自来水洗去乙醇--过蒸馏水。样品孵育：PBS冲洗3次各3min，然后浸泡于0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液在高压锅内煮10min，室温冷却PBS冲洗3次各3min，滴加正常山羊血清（或者5%牛血清白蛋白）室温封闭20min。滴加3%H₂O₂15min，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗，2min×3次。一抗孵育：分别滴加抗His-Tag或者检测肿瘤细胞核增殖的抗Ki-67单抗样品室温2h或4℃过夜。由一抗中取出切片，PBS冲洗3次各3min，采用中杉金桥PV-9004通用免疫组化试剂继续孵育，DAB显色。苏木素轻度复染10min，然后过蒸馏水。0.1%HCl酒精分化1-2min,1%氨水返蓝，再次过蒸馏水。依次70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇脱色2-3min，二甲苯透明后用中性树胶封片。显微镜下观察照相，并用Leica图像分析系统分析。

结果显示（图16），对照组有几乎全阳性的核抗原Ki-67染色，而融合蛋白Ec-LDP-TRAIL能显著抑制核增值抗原的表达，肿瘤组织有明显的坏死区域；同时Ec-LDP-TRAIL组的His-tag抗体显色也表明融合蛋白对A431上皮鳞状细胞癌肿瘤组织有着明显的亲和活性。这说明Ec-LDP-TRAIL融合蛋白能显著导致肿瘤组织坏死增加，细胞增殖减弱，并能靶向性结合EGFR高表达的A431上皮鳞癌肿瘤组织。

<实施例8>融合蛋白Ec-LDP-TRAIL给药组裸鼠病理组织学检查

A431荷瘤裸鼠处死后，分别将各组裸鼠的肝、肺和小肠组织经常规福尔马林固定，石蜡切片。HE染色，检查各组病理组织学变化。组织切片结果显示，Ec-LDP-TRAIL与对照组相比，肝脏、肺和小肠均未见明显的病理反应（见图17、图18、图19），表明融合蛋白Ec-LDP-TRAIL在实验剂量下对肝、肺、小肠无明显毒性。

<实施例9>强化融合蛋Ec-LDP-TRAIL-AE的制备

9.1活性发色团（AE）的制备

取高活性的LDM冻干品（专利号：ZL00121527.2，公开号：CN1284566）10mg，加5ml冷甲醇振摇5min，-20℃放置1h，中间振摇1次；0℃，12000rpm离心20min，上清中富含发色团AE，沉淀为肽链，重复提取2次。4℃，避光蒸发浓缩发色团，-70℃保存。

9.2强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE的制备分离

取5ml浓度为1mg/ml的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL溶于PBS（pH7.4）中，加入5倍摩尔数的AE甲醇溶液，混合振摇，4℃反应12h。将混合液用PD-10柱（商业化的Sephadex G-25柱，Pharmacia产品）层析分离，经280nm、343nm紫外监测后，弃去过量未反应的AE，收集强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE。

<实施例10>MTT法检测强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对肿瘤细胞的细胞毒作用

取对数生长期的A431、H460和NIH/3T3细胞，消化后计数，加入到96孔细胞培养板中，每孔铺细胞3000-5000个。37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。向96孔培养板中加入10^-8mol/L至10^-14mol/L连续10倍稀释的强化融合蛋白或力达霉素，37℃继续培养48h。每-个药物浓度设3个平行孔，同时设立无药对照孔和无细胞对照孔。每孔加入5mg/ml MTT20ul，37℃继续培养4h。吸弃培养基，每孔加入DMSO150ul，室温下摇床振荡15min。用酶标仪测定570nm的吸光度值。各平行孔的吸光度值取平均值，计算细胞的存活率T/C(％)：T/C(％)=(加药组吸光度平均值.无细胞对照组吸光度平均值)/(无药对照组吸光度平均值.无细胞对照组吸光度平均值)。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为横坐标作浓度反应曲线，计算IC50值。

MTT法测定结果表明，强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对A431、H460和NIH/3T3等细胞均有强烈的杀伤作用（图20、图21、图22）。双特异性强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对不同肿瘤细胞的IC50值均低于LDM，而对低表达EGFR和DR4/DR5的小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞，其IC50值则高于LDM（表3）。对于不同的肿瘤细胞系，强化融合蛋白的杀伤作用与该细胞EGFR和DR4/DR5的表达水平存在一定的相关性，EGFR或DR4/DR5高表达的细胞系，其对强化融合蛋白表现出更高的敏感性。以上结果表明双特异性强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE不仅完全保留了LDM的细胞毒作用，而且其对高表达EGFR和DR4/DR5的肿瘤细胞具有比LDM更强的杀伤能力，而对正常细胞的毒性则略有下降，这表明双特异性强化融合蛋白对肿瘤细胞具有更强的选择性作用。

表3.LDM和强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对各种细胞的IC50值

<实施例11>强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对细胞凋亡信号通路的影响

将A431细胞以1×10⁶/孔接种入6孔板，37℃孵育24h使之贴壁。然后分别加入终浓度10^-9mol/L和10^-10mol/L的强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE或LDM处理。24h后收集细胞用冰预冷的PBS洗2次，离心弃上清液，加入100μl细胞裂解液（2%SDS,10%甘油,625mmol/L Tris-HCl,pH6.8）冰上裂解15min。随后于4℃，12000rpm离心20min，收集上清液。用BCA试剂盒（Lot#171928）进行蛋白定量，取50μg蛋白与适量5×上样缓冲液混合，沸水浴中变性5min。配制12%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳分析。电泳完毕后进行转膜，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶室温封闭2h。所用的一抗为β-肌动蛋白（中杉金桥，稀释1:5,000），兔源抗PARP抗体（Cell Signalling Technology,MA,USA,稀释1:1,000），室温孵育2h，TBST洗膜3次。然后加入羊抗鼠/兔HRP标记的二抗（中杉金桥，稀释1:5,000），室温孵育2h，TBST洗膜3次。将Millipore公司的检测液A和B（Lot No.1118802）以1：1混合，对PVDF膜进行显色，凝胶成像系统拍照保存结果。Western blot检测细胞内PARP的切割水平，发现LDM和Ec-LDP-TRAIL-AE处理后，使PARP的切割明显增强（如图23），产生了凋亡诱导作用。

<实施例12>强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对人上皮鳞状细胞癌A431祼鼠移植瘤的生长抑制作用

12.1强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对人上皮鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

强化融合蛋白的体内抗肿瘤活性分析采用了人上皮鳞状细胞癌A431裸鼠移植瘤模型。取6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠，体重18～22g。将A431细胞消化成单细胞悬液后，用无菌生理盐水洗3次，计数。用生理盐水重悬5×10⁷细胞/ml，每鼠接种0.2ml于右侧腋窝皮下。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成2×2×2mm³的小块，用套管针将肿瘤移植到裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。在接种瘤块后第10天，将裸鼠分组，每组8只裸鼠，各组体重及瘤块大小均一。实验共设置3组，每组8只裸鼠，分别为对照组、LDM组和强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE组。当肿瘤体积达到100mm³时，通过尾静脉给药，每只裸鼠注射200μl。LDM的剂量选择耐受剂量0.05mg/kg，为了便于进行比较，强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE的剂量设置为相同的摩尔浓度，相当于0.16mg/kg的Ec-LDP-TRAIL-AE。LDM组和强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE组均给药一次。对照组不做任何处理。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式V=ab²/2计算肿瘤体积（a：肿瘤长径，b：肿瘤短径），绘制肿瘤生长曲线（图24），观察体重变化。实验结果表明，强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE同样表现出强烈的肿瘤生长抑制作用，抑瘤率为70.75%，同时高于等剂量LDM的66.98%，二者无显著性差异。在整个实验治疗期间，动物的体重下降不明显，可耐受所给的剂量，统计分析结果显示与对照组有显著性差异（表4）。

表4.强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对人上皮鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的生长抑制

12.2强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE对裸鼠体重的影响

在实验期间，各组动物的体重变化不明显（图25）。实验结束时，强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE处理组体重下降了1.31g，但均在10%的范围内，因此认为裸鼠可耐受该剂量。

<实施例13>强化融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE给药组裸鼠病理组织学检查

A431荷瘤裸鼠处死后，分别将各组裸鼠的肝、肺和小肠组织经常规福尔马林固定，石蜡切片。HE染色，检查各组病理组织学变化。组织切片结果显示，Ec-LDP-TRAIL-AE和LDM组与对照组相比，肝脏、肺和小肠均未见明显的病理反应（图26、图27、图28），表明该强化双特异性融合蛋白Ec-LDP-TRAIL-AE在实验剂量下对肝、肺、小肠无明显毒性。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims

1.一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：

EGFR特异性靶向寡肽-连接肽-力达霉素辅基蛋白-连接肽-TRAIL功能肽段；

其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述力达霉素辅基蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述TRAIL功能肽段具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为(GGGGS)₂。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

或者，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白的编码基因。

5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

或者，所述编码基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

6.一种抗肿瘤强化融合蛋白，其特征在于，所述强化融合蛋白为根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白与力达霉素发色团组装而成。

7.根据权利要求6所述的强化融合蛋白，其特征在于，所述强化融合蛋白通过包括以下步骤的方法组装而成：将所述的融合蛋白与力达霉素发色团以1:5的摩尔比混合，于4℃下避光缓慢晃动反应12～16个小时。

8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物以根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白和/或根据权利要求6或7所述的强化融合蛋白为活性成分。

9.根据权利要求8所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防哺乳动物的上皮鳞状细胞癌；

优选地，所述哺乳动物是人。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求6或7所述的强化融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防哺乳动物的上皮鳞状细胞癌；

优选地，所述哺乳动物是人。