CN101538331A - 靶向EGFR的单链抗体-力达霉素融合蛋白ER(Fv-LDP) - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白ER(Fv－LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv－LDP－AE)，融合蛋白是由抗EGFR单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾组成的，基因全长1089bp，编码363个氨基酸；强化融合蛋白是由融合蛋白ER(scFv－LDP)(分子量约为38kDa)和活化型烯二炔发色团AE(分子量为843Da)构成的；体内、外实验结果证明，融合蛋白及其强化融合蛋白对EGFR高表达肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，动物体内试验有显著疗效，可望开发成为临床上高效、小型化抗体靶向药物。

Description

靶向EGFR的单链抗体-力达霉素融合蛋白ER(Fv-LDP)

技术领域：

本发明涉及一种融合蛋白ER(Fv-LDP)，具体来讲，所说融合蛋白含有抗EGFR的单链抗体和力达霉素辅基蛋白的氨基酸序列；

本发明还涉及一种可以经过分子强化制备含有烯二炔类发色团(AE)的强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)；

本发明还涉及所说融合蛋白及其强化融合蛋白在肿瘤靶向治疗中的应用。

背景技术：

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种存在于细胞膜上的多功能糖蛋白，又称HER1或ErbB-1。EGFR及其配体是细胞信号传导系统的一部分，其信号传导网络在肿瘤的形成和发展过程中占了重要的地位。EGFR在包括头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、肺癌、成胶质细胞瘤、膀胱癌、直肠癌、卵巢癌和前列腺癌等多种类型的人类肿瘤中都存在着过度表达的情况。EGFR基因拷贝数增加或者过度表达，均能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移，因此EGFR是肿瘤治疗中一个很有前景的靶分子。

以EGFR为靶点的肿瘤治疗策略包括：干扰受体信号的单克隆抗体(monoclonalantibodies，MAbs)；将MAbs做为放射性核素、毒素或前药的载体；低分子量酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)干扰受体信号；反义寡核苷酸或核酶阻断受体的翻译；细胞内单链抗体阻止受体向细胞表面的转运；靶向EGFR的DNA疫苗等。在这些策略中，MAbs和TKIs目前已经有相应的药物应用于肿瘤的临床治疗。Cetuximab(西妥昔单抗)和Nimotuzumab(尼妥珠单抗)均为针对EGFR的单克隆抗体药物，其分子构成均为完整的免疫球蛋白。

scFv是近年来备受关注的一种基因工程小分子抗体。scFv只包含抗体分子中与抗原结合部分，由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)经过一个弹性linker连接而成，其相对分子量仅为完整抗体的1/6。与完整抗体及Fab段相比，scFv具有对实体瘤组织穿透能力强、在非靶向组织中滞留时间短、血液清除快等优点。更重要的是，scFv可在细菌中表达，易于基因操作和基因工程大量生产，并可利用基因工程方法构建与其他效应分子连接形成融合蛋白。目前，以抗EGFR单抗为基础，构建的融合蛋白有EGFR/CD3双特异性抗体、单链抗体-绿脓杆菌外毒素等。但是，将抗EGFR的单链抗体与力达霉素连接成为抗肿瘤导向药物的融合蛋白ER(Fv-LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)，迄今为止尚未见有国内外的相关报道。

作为高活性的“弹头”药物力达霉素(lidamycin，LDM，又称C1027)，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株球孢链霉菌Streptiomyces globisporus C1027(2007年4月3日保藏于CGMCC，菌种保藏号为：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，体外实验显示出强烈的肿瘤细胞杀伤作用，它的分子由烯二炔发色团和辅基蛋白两部分构成。发色团有强烈活性，但不稳定，由110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP)，对发色团的稳定性起保护作用。力达霉素具有独特的可拆分的分子结构特点，便于DNA重组以及分子强化；另一方面，LDP分子量只有10.5kDa，LDP与单链抗体制备的融合蛋白分子量只有40kDa左右，低于其它已知的基于抗体的融合蛋白。

本发明采用噬菌体抗体库技术筛选EGFR高亲和力scFv，从免疫小鼠的脾细胞中获取抗体基因。由于scFv分子小，所以作为异种蛋白的免疫原性较小；用于肿瘤治疗时，因组织穿透能力强，较易进入实体瘤内部。本发明所说融合蛋白及其强化融合蛋白中的单链抗体靶点，是鳞状上皮癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤高表达的EGFR胞外段蛋白，不同于本实验室先前以EGFR为靶点构建的多肽。单链抗体的亲和力更高，靶向性更好。

本发明的目的之一是，在筛选EGFR高亲和力单链抗体的基础上，构建单链抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白ER(Fv-LDP)；

本发明的目的之二是，进一步用具有高活性的活化型烯二炔(AE)进行分子强化，构建强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)；

本发明的目的之三是，以力达霉素为“弹头药物”，scFv为导向载体，制备可用于EGFR高表达肿瘤治疗的高效、小型化抗体靶向药物。

发明内容：

本发明所提供的融合蛋白ER(Fv-LDP)是由抗EGFR单链抗体scFv和力达霉素辅基蛋白LDP构成的，基因全长1089bp，编码363个氨基酸；其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)是由融合蛋白以及活化型烯二炔发色团AE组装而成，其制备方法为：

本发明利用噬菌体展示技术筛选EGFR高亲和力单链抗体，与力达霉素构建具有靶向EGFR高表达肿瘤的融合蛋白及其强化融合蛋白，用于鳞状上皮癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤的导向治疗。

本发明所提供的融合蛋白ER(Fv-LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)，其制备方法包括以下步骤：

噬菌体单链抗体库的构建；

抗EGFR噬菌体抗体的富集筛选鉴定；

抗EGFR单链抗体scFv基因的扩增；

融合蛋白ER(Fv-LDP)重组表达质粒的构建；

融合蛋白ER(Fv-LDP)在大肠杆菌BL21star^TM(DE3)中的诱导表达；

融合蛋白ER(Fv-LDP)的亲和层析纯化及复性；

强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)的制备分离。

本发明还提供了融合蛋白ER(Fv-LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)的生物学活性试验，包括：

融合蛋白ER(Fv-LDP)的免疫学活性测定；

融合蛋白ER(Fv-LDP)与不同EGFR表达量肿瘤细胞结合的免疫荧光分析；

A431细胞对融合蛋白ER(Fv-LDP)内化作用测定

融合蛋白ER(Fv-LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对A431细胞周期的影响；

强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)诱导肿瘤细胞凋亡的作用；

MTT法检测融合蛋白ER(Fv-LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对肿瘤细胞的细胞毒作用；

融合蛋白ER(Fv-LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用。

发明效果：

本发明的优点与积极效果在于，采用噬菌体抗体库技术筛选获得EGFR高亲和力单链抗体scFv，应用基因工程技术和分子强化技术路线制备获得的融合蛋白ER(Fv-LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)，是以EGFR为靶点的高效小型化靶向融合蛋白药物，基本保留了完整单抗的抗原结合活性，同时能够促进肿瘤细胞调亡，在体内抑制肿瘤生长，具有良好的临床应用前景。

附图说明：

图1：RT-PCR扩增出VH、VL，SOE-PCR得到scFv

其中1-DNA分子量标准DL2000；

    2-VH；

    3-VL；

    4-scFv。

图2：pCANTAB5E-scFv重组克隆载体的内切酶分析

其中1-DNA分子量标准DL15000；

    2-重组克隆pCANTAB5E-scFv；

    3-重组克隆pCANTAB5E-scFv/Sfi I；

    4-重组克隆pCANTAB5E-scFv/Not I；

    5-重组克隆pCANTAB5E-scFv/SfiI+NotI。

图3：ER(Fv-LDP)重组克隆载体限制性内切酶分析

其中1-DNA Marker DL15000；

    2-重组质粒pET-30a(+)-ER(Fv-LDP)；

    3-重组质粒pET-30a(+)-ER(Fv-LDP)/XhoI+EcoRI；

    4-重组质粒pET-30a(+)-ER(Fv-LDP)/EcoRI+NdeI；

    5-重组质粒pET-30a(+)-ER(Fv-LDP)/XhoI+NdeI。

图4：融合蛋白ER(Fv-LDP)表达产物的SDS-PAGE分析

其中1-蛋白分子量标准；

2-IPTG诱导后重组菌菌液上清；

3-IPTG诱导后重组菌全细胞蛋白；

4-IPTG诱导后重组菌周质腔蛋白；

5-IPTG诱导后重组菌胞内可溶性蛋白；

6-IPTG诱导后重组菌包涵体沉淀。

图5：融合蛋白ER(Fv-LDP)纯化产物的SDS-PAGE分析

其中1-蛋白分子量标准；

    2-IPTG诱导后重组菌全细胞蛋白；

    3-经尿素溶解的重组菌包涵体；

    4~6-纯化的融合蛋白ER(Fv-LDP)。

图6：ELISA分析融合蛋白ER(Fv-LDP)与EGFR蛋白亲和力

其中EGFR蛋白浓度分别为

    ◆-5μg/ml；

    ■-2.5μg/ml。

图7：ELISA分析融合蛋白ER(Fv-LDP)与不同EGFR表达水平肿瘤细胞的亲和力

其中

-A431细胞；

    

-A549细胞；

    

-MCF-7细胞；

   

-HEK293细胞。

图8：融合蛋白ER(Fv-LDP)与不同EGFR表达水平肿瘤细胞的结合免疫荧光分析

其中1-EGFR高表达的A431细胞；

    2-EGFR高表达的A549细胞；

    3-EGFR中度表达的MCF-7细胞；

    4-EGFR低表达的HEK293细胞。

图9：A431细胞对融合蛋白ER(Fv-LDP)内化作用测定

其中◆-荧光强度。

图10：融合蛋白ER(Fv-LDP)对A431细胞周期的影响

其中1-正常A431细胞

    G1：54.59％；  G2/M：1.80％；  S：43.61％；

    2-0.01μM ER(Fv-LDP)处理A431细胞

    G1：50.50％；  G2/M：5.32％；  S：44.18％；

    3-0.1μM ER(Fv-LDP)处理A431细胞

    G1：16.74％；  G2/M：53.09％； S：30.17％；

    4-1μM ER(Fv-LDP)处理A431细胞

    G1：0.70％；  G2/M：56.09％；  S：43.21％。

图11：强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对A431细胞周期的影响

其中1-正常A431细胞

    G1：63.54％；  G2/M：2.96％；  S：33.50％；

    2-0.01nM ER(Fv-LDP-AE)处理A431细胞

    G1：50.81％；  G2/M：17.48％；  S：31.71％；

    3-0.1nM ER(Fv-LDP-AE)处理A431细胞

    G1：17.61％；  G2/M：44.94％；  S：35.44％；

    4-1nM ER(Fv-LDP-AE)处理A431细胞

    G1：13.66％；  G2/M：71.58％；  S：14.76％。

图12：强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)诱导细胞凋亡形态变化

其中1-正常A431细胞；

    2-1nM ER(Fv-LDP-AE)处理A431细胞；

    3-正常A549细胞；

    4-1nM ER(Fv-LDP-AE)处理A549细胞；

    5-正常MCF-7；

    6-1nM ER(Fv-LDP-AE)处理MCF-7细胞。

图13：融合蛋白ER(Fv-LDP)对不同EGFR表达水平肿瘤细胞的杀伤活性

其中◆-EGFR高表达的A431细胞；

    ■-EGFR高表达的A549细胞；

    ▲-EGFR低表达的HEK293细胞。

图14：强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对A431细胞的杀伤活性

其中-ER(Fv-LDP-AE)；

    ■-LDM。

图15：强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对A549细胞的杀伤活性

其中◆-ER(Fv-LDP-AE)；

    ■-LDM。

图16：强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对MCF-7细胞的杀伤活性

其中◆-ER(Fv-LDP-AE)；

    ■-LDM。

图17：融合蛋白ER(Fv-LDP)处理的人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤的生长曲线

其中◆-Control；

    ■-LDP(5mg/kg)；

    ▲-ER(Fv-LDP)(0.5mg/kg)；

    ●-ER(Fv-LDP)(5mg/kg)。

图18：强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)处理的人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤的生长曲线

其中◆-Control；

    ■-ER(Fv-LDP)(0.5mg/kg)；

    ●-LDM(0.05mg/kg)；

    ▲-ER(Fv-LDP-AE)(0.2mg/kg)；

    △-ER(Fv-LDP-AE)(0.3mg/kg)。

实施方案：

以下实施例，可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>.EGFR噬菌体抗体库的构建筛选鉴定

1.1小鼠免疫

收集培养的A431细胞，每只小鼠腹腔注射细胞1×10⁷个。2周后加强免疫1次。于末次免疫后第7天，取小鼠眼静脉血ELISA测定效价，取效价达10⁵以上的小鼠脾脏待用。

1.2噬菌体抗体库构建筛选鉴定

参照Pharmacia公司产品Expression Module/Recombinant Phage Antibody system试剂盒说明书，进行噬菌体库构建及抗EGFR抗体的筛选。简要步骤如下：

上述免疫小鼠脾脏RNA提取→mRNA纯化+OligdT→cDNA合成+建库引物混合物→VH，VL→scFv→scFv+pCANTAB 5E(噬菌粒Pharmacia产品)→M13K07辅助噬菌体超感染→EGFR抗原进行富集筛选→吸附、洗涤、洗脱、扩增(重复5次)→筛选出高亲和力scFv(图1)。每经过1轮富集，噬菌体的回收率逐渐增加，第5轮的回收率是第1轮的133倍，说明特异性噬菌体抗体得到有效富集(表1)。挑取阳性克隆培养，小量提取质粒，用SfiI和NotI酶分别进行单酶切和双酶切(图2)。酶切鉴定正确的阳性克隆，以pCANTAB 5E-S1，S6为引物，进行双向测序。测序(序列1)结果显示：scFv基因长度为768bp，编码256个氨基酸。VH基因长345bp，编码115个氨基酸；VL基因长321bp，编码107个氨基酸；两者之间的柔性肽基因长45bp，编码15个氨基酸；羧基端的E-tag基因长39bp，编码13个氨基酸；终止密码子3bp。经核苷酸序列Blast分析：VH和VL的同源序列均为小鼠Ig可变区基因，VH属于重链，VL属于κ型轻链，同源性均达在70％以上。免疫球蛋白序列Blast显示，VH和VL均具有3个抗原互补决定区和4个框架区。

表1EGFR抗原对噬菌体抗体库的富集筛选

<实施例2>.融合蛋白ER(Fv-LDP)重组表达质粒的构建

重组质粒pET-30a(+)-LDP中带有LDP基因，由本实验室保存。重组噬菌粒pCANTAB 5E中含有scFv基因，通过PCR引入NdeI、EcoRI两个酶切位点，(引物由Invitrogen公司合成)。

scFv 5′端引物(PH1)：5′GGAATTCCATATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG 3′

                            Nde I

scFv 3′端引物(PL2)：5′CGGAATTC GGATCCGCCACCGCCCCGTTTTATTTCCAAC

TTTGT 3′                EcoR I              spacer

以重组噬菌粒pCANTAB 5E-scFv为模板，PH1为5′端引物，PL2为3′端引物，进行PCR扩增，获得C端带有一段小肽spacer的单链抗体基因片段。PCR反应体系为94℃预变性2min，然后进行30轮PCR循环：94℃变性1min，58℃退火2min，72℃延伸2min，最后一个循环后72℃保温10min。PCR产物利用玻璃奶回收试剂盒(BioDev公司产品)纯化回收后，用NdeI、EcoRI进行双酶切。回收酶切片段，克隆至经同样双酶切的pET-30a(+)-LDP中，得到重组质粒pET-30a(+)-Fv-LDP。用NdeI、EcoRI和XhoI酶分别进行双酶切鉴定(图3)。测序(序列2)结果显示：融合蛋白ER(Fv-LDP)基因全长1089bp，编码363个氨基酸；scFv基因全长711bp，编码237个氨基酸；LDP基因全长342bp，编码114个氨基酸；两者之间的柔性肽基因长15bp，编码5个氨基酸；羧基端的组氨酸六聚体尾基因长18bp，编码6个氨基酸；终止密码子3bp。

<实施例3>.融合蛋白ER(Fv-LDP)在大肠杆菌BL21(DE3)star^TM中诱导表达

鉴定后的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)star^TM(Invitrogen公司产品)，随机挑取重组转化子接种到3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。次日按照1∶50的比例接种，37℃震荡培养至OD600为0.8，加入IPTG至终浓度为0.8mM，诱导培养4-6h。取适量菌液，对全菌、培养基上清、细胞周质腔组分、可溶性胞质组分及包涵体进行表达产物定位分析。10％SDS-PAGE电泳分析外源蛋白表达情况融合蛋白以不可溶形式表达于包涵体中(图4)。凝胶成像系统定量分析显示，以最佳条件诱导表达所得的融合蛋白表达量占菌体总蛋白8％左右。将含有重组质粒pET-Fv-LDP，能够表达融合蛋白ER(Fv-LDP)的转化菌株命名为CAMS/EGFRFL，于2009年3月送交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号：(CGMCCNO.2977)。

<实施例4>.融合蛋白ER(Fv-LDP)亲和层析纯化及分离制备

4.1包涵体蛋白的提取

取经IPTG诱导的重组菌培养物10000g离心10min，尽量去除上清，收集菌体。每1L培养体积的菌体用100ml的20mM Tris-HCl进行重悬。超声波处理破碎细胞。4℃5000g离心15min，收集包涵体和细胞碎片蛋白，弃去上清。用100ml的不含尿素的1×Binding Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.9)重悬沉淀。4℃5000g离心15min，弃去上清，收集沉淀。重复上述操作步骤，用50ml 1×Binding Buffer(20mM Tris-HCl唑，0.5M NaCl，5mM咪，8M尿素，pH7.9)重悬沉淀，冰浴1h完全溶解包涵体蛋白。4℃15000g离心30min，去除不可溶物质。收集上清，用0.45μm膜过滤后，储存于4℃以待亲和层析纯化。

4.2融合蛋白ER(Fv-LDP)亲和层析纯化

采用His-Trap^TMHP纯化柱(Amersham公司产品)纯化蛋白样品。经预处理亲和柱后，以3倍体积含1×Binding Buffer平衡层析柱，可溶蛋白样品上柱后，以6倍体积1×WashingBuffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，8M尿素，pH7.9)洗涤层析柱，最后以6倍体积1×Elute Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑，8M尿素，pH7.9)洗脱结合蛋白，收集洗脱组份，获得纯化后的融合蛋白ER(Fv-LDP)(图5)。

4.3融合蛋白ER(Fv-LDP)的透析复性

将浸在EDTA(乙二胺四乙酸二钠)中的透析袋用蒸馏水清洗干净，装满水然后排出。将洗脱的蛋白用1×Binding Buffer稀释至15μM，加入2-巯基乙醇至终浓度为10mM，室温放置30min。将还原的蛋白用至少50倍样品体积的复性液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，200mMNaCl，6M尿素，pH8.0)4℃透析过夜，以除去还原剂。用尿素浓度依次递减的复性液(3M，2M，1M，0.5M，0M尿素)将样品进行分步透析。在尿素浓度为1M阶段，加入750μM的氧化型谷胱甘肽和400mM的L-精氨酸。将最后一步透析所得的样品再用50倍体积的PBS(pH7.4)进行透析。每12h更换一次透析液，共2次。将透析后的样品4℃10000g离心30min，收集上清，即得到复性融合蛋白ER(Fv-LDP)。

<实施例5>.强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)的制备

5.1活性发色团(AE)的制备

取高活性的LDM冻干品(专利申请号：001215272，公开号：1284566)10mg，加5ml冷甲醇振摇5min，-20℃放置1h，中间振摇1次；0℃，12000rpm离心20min，上清中富含发色团AE，沉淀为肽链，重复提取2次。4℃，避光蒸发浓缩发色团，-70℃保存。

5.2强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)的制备分离

取一定体积和浓度的融合蛋白ER(Fv-LDP)溶于PBS(pH7.4)中，加入3倍摩尔数的AE甲醇溶液，混合振摇，室温反应12h。将混合液用PD-10柱(商业化的Sephadex G-25柱，Pharmacia产品)层析分离，经280nm、343nm紫外监测后，弃过量未反应AE，收集强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)。

<实施例6>.融合蛋白ER(Fv-LDP)的免疫学活性测定

6.1ELISA分析融合蛋白ER(Fv-LDP)与EGFR抗原亲和力

取EGFR原液，用PBS稀释至5μg/ml和2.5μg/ml两个浓度。将EGFR稀释液加入到96孔板中，50μl/孔，4℃包被过夜。用PBS洗板3次，每次都需要将洗液倒尽。每孔加入封闭液(PBS：2％BSA)250μl，37℃孵育1h。用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗板3次后，取复性后的融合蛋白ER(scFv-LDP)，用PBS将起始浓度调整为15μM。向96孔板中，每孔加入100μl用PBS连续5倍稀释的融合蛋白。每个样品平行做两份，PBS为阴性对照，抗EGFR单抗作为阳性对照。37℃孵育2h后，用PBST洗板3次。每孔加入用封闭液1∶2000倍稀释的抗His tag单抗100μl，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，每孔加入用封闭液1∶5000倍稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗小鼠IgG 100μl，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，蒸馏水洗2次，每孔加入新鲜配制的TMB底物溶液(使用前取9.9ml TMB底物缓冲液，加入0.1ml 1％TMB溶液，再加入10μl 30％H₂O₂)100μl，37℃孵育10min，显示蓝色。每孔加入50μL终止液(2M H₂SO₄)，颜色变黄。用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。根据酶标仪测定结果，扣除阴性对照值，然后以吸光值为纵坐标，以抗体浓度为横坐标作剂量反应曲线(图6)，计算每个抗原浓度下最大吸光值一半时对应的抗体浓度，即为抗体的相对亲和力。根据公式计算亲和常数Ka。Ka＝(n-1)÷[2(nAb-Ab’)]，其中Ab、Ab’分别为包被抗原浓度为Ag、Ag’时，最大吸光值一半所对应的抗体浓度。n＝Ag/Ag’，n一般取2。经计算融合蛋白ER(Fv-LDP)与纯EGFR抗原的相对亲和力为8.0×10^-9M，亲和常数Ka＝1.4×10⁸M^-1。

6.2ELISA分析融合蛋白ER(Fv-LDP)与不同EGFR表达水平肿瘤细胞的亲和力

分别收集EGFR高表达的A431细胞、A549细胞，中度表达的MCF-7细胞和低表达的293细胞，用培养基将细胞浓度调整为5×10⁵细胞/ml。将细胞悬液以每孔100μl的量加入到96孔培养板中，37℃孵育过夜。用PBS洗板两次后，每孔加入10％的福尔马林125μl，室温固定15分钟，再用PBS洗板3次。ELISA操作步骤同6.1。根据酶标仪测定结果，扣除阴性对照值，然后以吸光值为纵坐标，以抗体浓度为横坐标作柱状图(图7)，比较融合蛋白与不同细胞的亲和力。结果显示，融合蛋白ER(Fv-LDP)与4种细胞的亲和力依次为：A431＞A549＞MCF-7＞HEK293

6.3融合蛋白ER(Fv-LDP)与不同EGFR表达水平肿瘤细胞结合的免疫荧光分析

将灭菌处理的盖玻片置于六孔板中，每孔分别加入A431细胞、A549细胞、MCF-7细胞和HEK293细胞5×10⁵个。加入甲醇，置于摇床摇10min，吸弃甲醇。再次加入甲醇，置于-20℃固定10min，吸弃甲醇，用PBS洗3次。滴加融合蛋白ER(Fv-LDP)20μg/ml(一抗)，室温孵育1h。用PBS洗3次，加入用PBS稀释得抗His Tag单抗(二抗)，室温孵育1h。用PBS洗3次，加入用PBS稀释得FITC标记羊抗小鼠IgG(三抗)，室温避光反应30min。用PBS洗3次，荧光显微镜观察并照相。在荧光倒置显微镜下观察到(图8)，融合蛋白ER(Fv-LDP)可以与高表达EGFR的A431和A549以及中度表达EGFR的MCF-7细胞表面结合，呈现较强的绿色荧光；与低表达EGFR的HEK293细胞结合较少，细胞表面无明显的荧光反应。表明融合蛋白ER(scFv-LDP)能够特异性地识别细胞表面的EGFR并与之发生结合。

<实施例7>.A431细胞对融合蛋白ER(Fv-LDP)内化作用测定

7.1FITC标记融合蛋白ER(Fv-LDP)

将融合蛋白ER(Fv-LDP)用碳酸盐缓冲液(Na₂CO₃ 0.16mol/L，NaHCO₃ 0.33mol/L，pH 9.5)透析过夜。称取FITC(异硫氰酸盐)，溶于DMSO(二甲基亚砜)中，终浓度为1mg/ml。将透析过的ER(Fv-LDP)溶液置于小瓶中，按50ug FITC/mg蛋白的比例，边滴加边混匀FITC溶液。于4℃避光混匀12-18h。用PBS透析去除未结合的FITC。计算荧光素与蛋白的结合比率F/P∶F/P＝3.1×A495/(A280-0.31×A495)，该值应介于2.5-6.5之间。经计算荧光素与蛋白的结合比率F/P为5.3，标记蛋白的浓度为2.13mg/ml。

7.2A431细胞对融合蛋白ER(Fv-LDP)内化作用测定

收集5×10⁵个A431细胞，用100ul预冷的FITC标记融合蛋白ER(Fv-LDP)重悬，置于4℃孵育1h，以防止发生内吞作用。用预冷的FACS缓冲液(含2％FBS的PBS)洗3次，离心除去未结合的蛋白。用FACS缓冲液重悬沉淀，置于37℃孵育，分别于0.25、0.5、1、2、3、4、5h后取样。4℃离心后，用4％台盼蓝溶液重悬细胞团，用FACS机器检测荧光强度。内吞蛋白荧光强度＝不同时间孵育后样品的荧光强度-台盼蓝预处理细胞的荧光强度。然后以荧光强度为纵坐标，以取样时间为横坐标作时间反应曲线(图9)。

<实施例8>.融合蛋白ER(Fv-LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对A431细胞周期的影响

将A431细胞接种于6孔板中，待细胞长至75％左右，更换为含融合蛋白ER(Fv-LDP)(浓度分别为0.01μM、0.1μM、1μM)或强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)(浓度分别为0.01nM、0.1nM、1nM)的培养基，分别作用48h。胰酶消化，收集细胞，用PSB洗2次。70％冰乙醇固定30min，PBS洗细胞2次，并调细胞浓度为1×10³细胞/ml。每份样品加入400μl含RNaseA(核酸酶A)(100μg/ml)的PI(碘化丙锭)(25μg/ml)，室温避光染色30min，流式细胞仪检测细胞周期。Cell Quest及Motif软件分析(图10、图11)，结果显示，融合蛋白和强化融合蛋白都可以将细胞周期阻滞于G2/M期。

<实施例9>.强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)诱导肿瘤细胞凋亡的作用

将A431、A549和MCF-7细胞接种至有无菌盖玻片的6孔培养板中，37℃培养24h。待细胞长至50％-80％时，更换培养基，同时加入强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)，终浓度为1nM。同时设立不加药空白对照组。作用48h后，吸出培养基，用PBS洗2次，加入Hoechst(5μg/ml)，37℃避光染15min。吸弃染液，PBS洗2次。每孔加入400μl含60％甘油的PBS封片，倒置荧光显微镜下观察、照相。经强化融合蛋白处理的实验孔中可以观察到典型的凋亡细胞，细胞核出现染色质凝聚及核碎裂(图12)。

<实施例10>.MTT法检测融合蛋白ER(Fv-LDP)及其强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对肿瘤细胞的细胞毒作用

取对数生长期的A431、A549、MCF-7和HEK293细胞消化、计数，4000个/孔铺于96孔板。37℃5％CO₂培养24h后，加入10μM至40nM连续2倍稀释的融合蛋白或100nM至10^-7nM连续10倍稀释的强化融合蛋白/力达霉素，每个药物浓度设3个平行孔。培养48h后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃继续培养4h。吸弃培养基，加入150μl DMSO，摇床振荡10min，酶标仪测定A570值。计算细胞存活率及IC₅₀值。细胞存活率T/C(％)＝(加药组A570值-无细胞对照组A570值)/(无药对照组A570值-无细胞对照组A570值)×100％。然后以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为横坐标作浓度反应曲线(图13、图14、图15、图16)。

结果显示，融合蛋白ER(Fv-LDP)作用于A431、A549和HEK293细胞的IC₅₀分别为：1.3×10^-7、8.4×10^-8、7.0×10^-6，其对EGFR高表达细胞的细胞毒作用明显强于低表达细胞。强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)作用于A431、A549和MCF-7细胞的IC₅₀分别为：1.4×10^-11M、9.5×10^-13M和9.2×10^-10M；LDM作用于A431、A549和MCF-7细胞的IC₅₀分别为：9.0×10^-11M、9.3×10^-12M和5.5×10^-9M。强化融合蛋白细胞毒作用强于力达霉素，对高中度表达EGFR的A431、A549和MCF-7细胞的IC₅₀值分别是力达霉素的1/7、1/10和1/6。

<实施例11>.融合蛋白ER(Fv-LDP)对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用

取6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠24只，体重18~22g。将A431细胞消化成单细胞悬液后，用无菌生理盐水洗3次，计数。用生理盐水重悬5×10⁷细胞/ml，每鼠接种0.2ml于右侧腋窝皮下。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成2×2×2mm³的小块，用套管针将肿瘤移植到裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。在接种瘤块后第10天，将裸鼠分组，每组6只裸鼠，各组体重及瘤块大小均一。分别在接种瘤块后第10天和第17天尾静脉注射给药。融合蛋白ER(Fv-LDP)2个剂量组，分别为0.5mg/kg和5mg/kg；力达霉素辅基蛋白LDP1个剂量组，5mg/kg。实验期间每隔3天测量一次肿瘤长、短径和裸鼠体重，根据公式V＝ab²/2计算肿瘤体积。实验结果(图17，表2)表明，ER(Fv-LDP)对人鳞状上皮癌A431细胞形成的实体瘤有明显的抑制作用，35天时2个剂量组抑瘤率分别为67.5％和51.4％，与对照组或LDP组相比有显著差异(P＜0.01)。

表2融合蛋白ER(Fv-LDP)对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用

其中^*P＜0.01vs Control，^△P＜0.01vs LDP

<实施例12>.强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用

取6-8周的雌性Balb/c裸鼠30只，体重18~22g。将A431细胞消化成单细胞悬液后，用无菌生理盐水洗3次，计数。用生理盐水重悬5×10⁷细胞/ml，每鼠接种0.2ml于右侧腋窝皮下。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成2×2×2mm³的小块，用套管针将肿瘤移植到裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。在接种瘤块后第7天，将裸鼠分组，每组6只裸鼠，各组体重及瘤块大小均一。分别在接种瘤块后第7天和第14天尾静脉注射给药。LDM 1个剂量组，其剂量为0.05mg/kg；融合蛋白ER(Fv-LDP)1个剂量组，0.5mg/kg；强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)2个剂量组，分别为0.2mg/kg和0.3mg/kg。实验期间每隔3~4天测量一次肿瘤长、短径和裸鼠体重，根据公式V＝ab²/2计算瘤体积。实验结果(图18，表3)表明，ER(Fv-LDP-AE)对人鳞状上皮癌A431细胞形成的实体瘤有明显的抑制作用，30天时2个剂量组抑瘤率分别为75.4％和81.3％，比力达霉素具有更显著的治疗效果，其显著差异为P＜0.01。

表3强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用

其中^*P＜0.01 vs Control，^△P＜0.01 vs LDM

序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>靶向EGFR的单链抗体-力达霉素融合蛋白ER(Fv-LDP)

<160>2

<210>1

<211>768

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggcccagg tccagctgca gaagtctggg gcagaacttg tgaagccagg ggcctcagtc  60

aagttgtcct gcacaggttc tggcttcaac attaaagaca cctatttaca ctgggtgaag  120

cagaggcctg aacagggcct ggagtggatt ggaaggattg atcctgcgaa tggtaatatt  180

atctatgacc cgaagttcca gggcaaggcc actataacag ttgacacata ttccaataca  240

gcctacctcc agctcagcag cctgacatct gaggacactg ccgtctatta ctgtgctacg  300

gctacgcact actggggcca aggcactacg gtcatcgtct cctcaggtgg aggcggttca  360

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacatcgagc tcactcagtc tccagcaatc  420

atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc atgacctgca gtgccagctc aagggttgtt  480

tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc acctccccca aaagatggat ttatgacaca  540

tccaaactgg cttctggagt ccctactcgc ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac  600

tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg  660

agtactaacc cacccacgtt cggctcgggg acaaagttgg aaataaaacg ggcggccgca  720

ggtgcgccgg tgccgtatcc ggatccgctg gaaccgcgtg ccgcatag               768

<210>2

<211>1089

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

atggcccagg tccagctgca gaagtctggg gcagaacttg tgaagccagg ggcctcagtc    60

aagttgtcct gcacaggttc tggcttcaac attaaagaca cctatttaca ctgggtgaag    120

cagaggcctg aacagggcct ggagtggatt ggaaggattg atcctgcgaa tggtaatatt    180

atatatgacc cgaagttcca gggcaaggcc actataacag ttgacacata ttccaataca    240

gcctacctcc agctcagcag cctgacatct gaggacactg ccgtctatta ctgtgctacg    300

gctacgcact actggggcca aggcactacg gtcatcgtct cctcaggtgg aggcggttca    360

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacatcgagc tcactcagtc tccagcaatc    420

atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc atgacctgca gtgccagctc aagggttgtt    480

tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc acctccccca aaagatggat ttatgacaca    540

tccaaactgg cttctggagt ccctactcgc ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac    600

tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg    660

agtactaacc cacccacgtt cggctcgggg acaaagttgg aaataaaacg gggcggtggc    720

ggatccgaat tcgcgcccgc cttctccgtc agtcccgcct cgggtctgag tgacggacag    780

agcgtgtcgg tgtcggtcag cggtgccgcc gccggcgaga cctactacat cgcccagtgc    840

gctccggtcg gtggccagga cgcgtgcaac ccggcgaccg cgacgtcctt caccacggac    900

gcgtccggag cggcgtcgtt cagcttcgtc gtgcgcaagt cgtacacggg ctccacgccc    960

gaaggcacgc cggtcggcag cgtcgactgc gccacggccg cctgtaacct cggcgccggc    1020

aactccgggc tcgacctcgg ccacgtggct ctgaccttcg gcctcgagca ccaccaccac    1080

caccactga                                                            1089

Claims (13)

1、一种融合蛋白ER(Fv-LDP)，其特征是所说融合蛋白由抗EGFR单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾组成，基因全长1089bp，编码363个氨基酸。

2、一种强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)，其特征是所说强化融合蛋白由分子量为38kDa的融合蛋白ER(Fv-LDP)和分子量为843Da的活化型烯二炔发色团AE构成。

3、如权利要求1所述的融合蛋白ER(Fv-LDP)，其特征是其中scFv基因全长711bp，编码237个氨基酸，LDP基因全长342bp，编码114个氨基酸，二者之间的柔性肽基因长15bp，编码5个氨基酸，羧基端的组氨酸六聚体尾基因长18bp，编码6个氨基酸，终止密码子3bp。

4、制备如权利要求1所述融合蛋白ER(Fv-LDP)的方法，其特征是所说方法主要采用噬菌体抗体库筛选、DNA重组两条技术路线，具体步骤如下：

A.噬菌体单链抗体库的构建；

B.抗EGFR噬菌体抗体的富集筛选及鉴定；

C.抗EGFR单链抗体scFv基因的扩增；

D.融合蛋白大肠杆茵重组表达质粒pET-Fv-LDP的构建；

E.融合蛋白ER(Fv-LDP)在保藏编号为CGMCC No.2977的大肠杆菌中的诱导表达；

F.融合蛋白ER(Fv-LDP)的亲和层析纯化及分离。

5、如权利要求4所述的制备方法，其特征是运用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来，用柔性肽基因将VH和VL基因拼装成scFv基因；将scFv基因连接到噬菌粒pCANTAB 5E中，电击转化大肠杆菌，再用辅助噬菌体M13K07感染，获得噬菌体单链抗体库。

6、如权利要求4或5所述的制备方法，其特征是用纯化的EGFR为靶抗原对噬菌体单链抗体库进行5轮富集筛选得到次级抗体库，并鉴定阳性克隆。

7、如权利要求4或6所述的制备方法，其特征是运用聚合酶链式反应扩增得到在羧基端含有一段柔性小肽的抗EGFR单链抗体scFv基因，同时引入特异性酶切位点。

8、如权利要求4或7所述的制备方法，其特征是将所得到的抗EGFR单链抗体scFv基因克隆至重组质粒pET-LDP中，构建重组表达质粒pET-Fv-LDP。

9、如权利要求4或8所述的制备方法，其特征是将pET-Fv-LDP转化至大肠杆菌宿主菌中，经IPTG诱导表达，获得以包涵体形式表达的融合蛋白ER(Fv-LDP)，并进行条件优化获得最佳表达。

10、如权利要求4或9所述的制备方法，其特征是通过亲和层析纯化融合蛋白ER(Fv-LDP)，浓缩冻干，制备功能性融合蛋白。

11、制备如权利要求2所述强化融合蛋白的方法，其特征是将纯化分离得到的融合蛋白ER(Fv-LDP)与经甲醇提取制备的力达霉素活性型烯二炔发色团AE，按1∶3分子比进行分子强化，获得强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)。

12、权利要求1所述融合蛋白ER(Fv-LDP)在制备抗EGFR高表达肿瘤新型抗体靶向药物中的应用。

13、权利要求2所述强化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)在制备抗EGFR高表达肿瘤新型抗体靶向药物中的应用。

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