CN101475643B

CN101475643B - 一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE及其制备方法和应用

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Publication number: CN101475643B
Application number: CN2009100003009A
Authority: CN
Inventors: 钟根深; 甄永苏; 张胜华; 苗庆芳; 吴淑英
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: CN101475643A

Abstract

本发明涉及一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE，它是由两个抗IV型胶原酶单抗3G11的单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和力达霉素活性发色团AE组成，分子量为67.1kDa，其融合蛋白dFv-LDP的基因编码序列为1905bp，由635个氨基酸组成；实验结果表明，它在体外具有强烈肿瘤细胞杀伤作用，在体内对小鼠移植性肝癌H22和裸鼠移植性人肝癌Bel-7402有十分显著的疗效，小动物活体成像亦显其有更好的肿瘤靶向效果，为开发肿瘤导向药物创造了有利条件。

Description

一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE及其制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及以连续两个单链抗体为载体的肿瘤导向融合蛋白及其制备方法和在抗肿瘤靶向治疗药物中的应用。

背景技术：

IV型胶原酶能够降解IV型胶原等细胞外基质组分，破坏基底膜及细胞外基质的完整性，与肿瘤生长、侵袭和转移有密切的关系。在人类前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等恶性程度较高的肿瘤细胞和组织中均存在IV型胶原酶的高表达，而抑制其活性，可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。scFv是抗体工程小型化过程中研究比较多的对象，它由一个重链可变区VH和一个轻链可变区VL，通过15个小分子氨基酸短肽连接而成，其分子量约为27kDa。本发明中所用的scFv是由本实验室开发出的一种抗IV型胶原酶单链抗体片段，其与力达蛋白LDP组成融合蛋白后的分子量为37kDa，与发色团组装后的免疫偶联物Fv-LDP-AE，在荷瘤小鼠中展现了较好的治疗效果(专利号：ZL 03 1 50240.7)。

高活性的‘弹头’力达霉素(LDM)，亦称为C-1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株由球孢链霉菌(Streptomyces globisporus，菌种保藏编号：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物实验表明，LDM对小鼠结肠癌26有非常显著的疗效，对移植裸鼠的人肝癌Bel-7402[World J Gastroenterol，2005，11(26)：3980-3984]和胰腺癌[Oncol Rep.，2007，17(6)：1445-51]等多种裸鼠移植人肿瘤均有较好疗效。力达霉素由两部分组成：一为烯二炔发色团(activeenediyne，AE)，具有细胞毒作用，是力达霉素的效应基团，但是不太稳定；另一部分为110个氨基酸组成的辅基蛋白(LDP)，其对发色团的稳定起到保护作用。发色团和辅基蛋白，两者通过非共价键结合，在有机溶剂中可以拆分为二，还可以重建。因此，力达霉素以其独特的分子结构，可以成为构建新型单抗导向药物的理想‘弹头’药物[中国医学科学院学报，2001，23(6)：563-567]。

小型化、高效化是解决当前抗体药物治疗所遇到问题的有效途径之一。然而，小型化却不可避免造成亲和力的降低和在体内停留时间的缩短，从而导致药物在肿瘤部位积累的相对比例下降。本发明所涉及的dFv-LDP-AE，是以连续的两个抗IV型胶原酶单抗3611的单链抗体scFv为载体，强效抗肿瘤抗生素力达霉素为‘弹头’，采用DNA重组和分子重建技术相结合而制备的肿瘤导向免疫融合蛋白。研究表明，dFv-LDP-AE在体外对肿瘤细胞有强烈的杀伤活性，体内实验对小鼠移植性肝癌22和裸鼠移植性人肝癌Bel-7402均有很显著的疗效，相对于先前构建的类似融合蛋白Fv-LDP-AE(专利号：ZL 03 1 50240.7)有更好的抑瘤效果。小鼠活体成像显示，dFv-LDP较Fv-LDP有更好的组织分布行为，在肿瘤部位能够快速、长时间富集。本发明所说的双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。

本发明的目的是，提供一种相对于单链抗体强化融合蛋白来讲，亲和力更高，体外肿瘤细胞杀伤活性更强，体内抗肿瘤治疗效果更好的双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE，为肿瘤靶向治疗实用化创造有利条件。

发明内容：

本发明涉及的双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE系由两个抗IV型胶原酶单抗3G11的单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和力达霉素活性发色团AE组成，分子量为67.1kDa，其融合蛋白dFv-LDP的基因编码序列为1905bp，由635个氨基酸组成。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1、重组表达质粒pET-dFv-LDP的构建：重组质粒pKFv1027含有scFv和LDP基因，由本实验室构建。大肠杆菌菌种E.coli.DH5α和大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)为本试验保存的Invitrogen公司的产品。PCR引物由北京英俊公司合成，分别引入相应的酶切位点。

单链抗体scFv两条5’端引物(Pa1和Pa2)：

Pa1：5’-GGAATTCCATATGCAGGTGAAGCTGCAG-3’(下划线为Nde I酶切位点)；

Pa2：5’-CCGGAATTCCAGGTGAAGCTGCAGCAGT-3’(下划线为EcoR I酶切位点)

单链抗体scFv两条3’端引物(Pb1和Pb2)：

Pb1：

5’-CCGGAATTCTGAACCGCCTCCACCACGTTTGATTTCCAGCTT-3’(下划线为EcoRI酶切位点)

Pb2：5’-CCCAAGCTTACGTTTGATTTCCAGCTT-3(下划线为Hind III酶切位点)LDP 5’端引物(Pc1)：

5’-CCCAAGCTTGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGCGCCCGCCTTCTCCGTCA-3’(下划线为Hind III酶切位点)

LDP 3’端引物(Pc2)：

5’-CCGCTCGAGTGAACCGCCTCCACCGCCGAAGGTCAGAGCCACGT-3’(下划线为Xho I酶切位点)

以重组质粒pKFv1027为模板，Pa1为5’端引物，Pa2为3’端引物；同时以Pb1为5’端引物，Pb2为3’端引物，进行PCR扩增，获得两个有不同酶切位点的scFv基因片段。与此同时，以重组质粒pKFv1027为模板，Pc1为5’端引物，Pc2为3’端引物，进行PCR扩增，获得LDP基因片段。PCR反应体系为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸45秒，进行28个循环的扩增反应，最后72℃延伸10分钟。

三种PCR产物scFv1、scFv2、LDP电泳后，利用博大泰克公司的DNA片段玻璃奶回收试剂盒切胶纯化回收，然后分别进行Nde I/EcoR I、EcoR I/Hind III、Hind III/Xho I双酶切，释放出具有不同粘末端的scFv1、scFv2、LDP片段，然后与采用NdeI/Xho I双酶切的载体pET-30(a+)进行连接，16℃连结过夜后转化大肠杆菌DH5α，筛选出重组克隆质粒，进行酶切鉴定并送北京英俊公司测序，质粒构建流程见(图1)。结果表明，融合基因重组表达质粒pET30a(+)/dFv-LDP的酶切结果和测序结果与预期完全一致，融合蛋白的基因编码序列为1905bp，由635个氨基酸组成，序列正确。

本发明在力达霉素辅基蛋白LDP基因3’端增引入了XhoI酶切位点，恰好可以利用质粒pET-30a(+)多克隆位点3’端6个连续的组氨酸标签肽(His6-Tag)的密码子，使得表达蛋白的C’末端融合有His₆-Tag，便于纯化和鉴定。

2、融合蛋白dFv-LDP在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLys中的诱导表达：本发明使用的大肠杆菌Rosetta(DE3)pLys为Novagen公司产品。以构建好的重组质粒pET-dFv-LDP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLys，得到重组转化菌。挑取单克隆接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日以1∶20接种，37℃培养到OD₆₀₀为0.7时，往培养基中加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导培养3小时，按pET系统操作手册(Novagen，第九版)分别制备全细胞蛋白组分、可溶性细胞质和不可溶性细胞质(包含体)组分，然后在变性条件下进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析外源蛋白表达情况。结果表明，经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白，表达量占全菌总蛋白25％以上，且表达产物主要以不可溶的包涵体存在。

本发明所述融合蛋白dFv-LDP的重组转化菌株被命名为CAMS/dFv-LDP，已于2008年12月31日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，(地址：北京朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.2847，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli)。

3、融合蛋白dFv-LDP的纯化和复性：采用Novagen公司的His-Bind纯化试剂盒于变性条件下纯化融合蛋白样品，按试剂盒说明书进行操作，对包涵体蛋白样品和亲和层析柱进行预处理后，样品上柱，依次以10倍柱床体积的含6M盐酸胍的结合缓冲液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH8.0)，6体积含有6M盐酸胍的洗涤缓冲液(50mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0)洗涤层析柱，最后以含有6 M盐酸胍的洗脱缓冲液(100mM EDTA，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH8.0)进行洗脱，收集洗脱组分获得纯化的融合蛋白dFv-LDP(图2)。融合蛋白dFv-LDP的理论分子量为67.1KD。

对纯化后的融合蛋白dFv-LDP进行复性：将纯化后的样品用含6M盐酸胍的洗脱缓冲液稀释至15μM/L，加入β-巯基乙醇至终浓度为10mM，室温放置30分钟，然后将样品放入处理好的透析袋，用至少50倍样品的复性液I(50mMTrsi-HCl，pH8.0，1mM EDTA，200mM NaCl，6M盐酸胍)透析过夜，再用与复性液I同样组分但盐酸胍浓度依次递减为3M、2M、1M、0.5M、0M的50倍体积的缓冲液进行分步透析，在盐酸胍浓度为1M的阶段加入750μM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和400mM的L-精氨酸。将最后一次透析所得样品用50倍体积磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)透析，每12小时更换一次透析液，共两次。以上透析操作均于4℃下进行，将透析后的样品以10,000×g，4℃离心30分钟，收集上清。将上清样品进行浓缩后，得到活性融合蛋白dFv-LDP，置于-80℃备用。4、融合蛋白dFv-LDP的免疫活性测定：以酶联免疫吸附分析方法(ELISA)进行测定。首先进行IV型胶原酶的包被或细胞的固定，即将IV型胶原酶以PBS配制成10μg/ml的溶液，以100μl/井包被96孔板，然后4℃过夜；将对数生长期的人肝癌HepG2细胞按10,000/井的密度接种于6孔培养板，培养过夜后PBS洗3次，加入4℃预冷的100％的甲醇固定30分钟。然后将包被好IV型胶原酶或固定好的细胞用PBS洗3次后，加入含有1％牛血清白蛋白(BSA)4℃封闭过夜，PBS洗3次后，加入倍比稀释的待测样品37℃温育2小时，再以含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗板3次，加入1∶1500倍稀释的抗His-Tag单克隆抗体37℃温育2小时，以同上的方法洗板3次，然后再加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG(或加入FITC标记的IgG，最后用荧光显微镜观察)，37℃温育1小时，最后再以PBST洗板6次，IV型胶原酶包被的96孔板加入50μl/井TMB(3，3”，5，5”-四甲基联苯胺盐酸盐)底物反应液，37℃度放置30分钟，以2M硫酸50μl/井终止反应，在酶标仪上测定450nm的吸光值。结果表明，和单抗3G11的单链抗体Fv-LDP融合蛋白类似，融合蛋白dFv-LDP对IV型胶原酶(图3A)、人肝癌HepG2细胞(图3C、D)的免疫反应均呈阳性。

流式细胞分析，是将FITC标记的20μg dFv-LDP蛋白与5×10⁵个/ml的HepG2细胞在4℃结合30分钟，然后200×g离心，去上清，用预冷的PBS洗涤两遍，PBS重悬后，将组分一加入4％台盼蓝20μl淬灭结合在细胞外的荧光；组分二于37℃放置1小时后，加入4％台盼蓝20μl淬灭结合在细胞外的荧光，两个组分均离心后，再用预冷的PBS重悬，上机检测dFv-LDP内化情况(图3B)。

5、强化融合蛋白dFv-LDP-AE的制备：取高活性的LDM冻干品(本实验室制备保存(专利公开号：1284566)10毫克，加入5ml冷甲醇振摇5分钟，-20℃放置1小时，中间振摇1次；将此混合物用凝胶柱Sephadex-G25分离蛋白部分和提取出来的发色团，用棕色小瓶收集发色团后于-80℃冻存备用。取复性后dFv-LDP融合蛋白溶于PBS中，加入5倍分子量的发色团溶液，于10℃缓慢摇动反应12小时，最后再将此混合液用PBS平衡好的凝胶层析柱Sephadex-G25分离，经A280nm波长检测后，收集强化融合蛋白dFv-LDP-AE组分。收集后的 dFv-LDP-AE经高效液相分析(图4)

6、强化融合蛋白dFv-LDP-AE对体外肿瘤细胞的细胞毒作用：采以噻唑兰(MTT)法进行测定。取对数生长期细胞消化、计数，2500/井铺于96孔板，在37℃含5％二氧化碳的培养箱中培养24小时后，加入不同浓度的药物，每个药物浓度设定3个平行孔，继续培养48小时。每孔加入20μl PBS溶解的MTT(5mg/ml)，37℃继续培养4小时后，吸去培养液，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，室温下摇床振摇15分钟，酶标仪上测定570nm的光吸收值。每次试验均设无药对照孔和无细胞对照孔个3孔，按公式：细胞存活率＝(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％，计算细胞的存活率及半数抑制浓度(IC50)值。强化融合蛋白dFv-LDP-AE对HT-1080细胞(图5)、人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞Bel-7402等均有强烈的杀伤作用，其IC50值均小于10^-9M(表1)。从IC50的数据可以看出，双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE较之力达霉素和单链抗体强化融合蛋白Fv-LDP-AE的体外杀伤能力得到一定的提高，这可能与提高了融合蛋白内化能力有关。

表1：LDM、Fv-LDP-AE和dFv-LDP-AE体外抗肿瘤效果

7、强化融合蛋白dFv-LDP-AE对小鼠移植性肝癌22肿瘤模型的治疗作用：取生长状态良好、体重为18-22克的昆明小鼠随机分组，每组10只。实验第0天，取小鼠肝癌22腹水，以生理盐水稀释成细胞数为7.5×10⁶/ml，按0.2ml/只接种于昆明小鼠腋窝皮下。实验第2天(48小时后)开始治疗，对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只，其余各组分别给予不同剂量的强化融合蛋白dFv-LDP-AE，0.06mg/kg的LDM，0.75mg/kg的Fv-LDP-AE，均为尾静脉注射，0.2ml/只。实验11天后处死小鼠，剥取肿瘤称重，并记录最后动物体重，计算抑瘤率。

强化融合蛋白dFv-LDP-AE的治疗结果表明，0.75mg/kg，1.0mg/kg， 1.25mg/kg三个剂量组的dFv-LDP-AE，均能明显抑制或延迟小鼠移植性肿瘤H22的生长，并且表现出比0.06mg/kg耐受剂量力达霉素更强的肿瘤生长抑制作用，显示dFv-LDP-AE提高了力达霉素的治疗效果(表2)、(图6)。在实验第11天结果显示，三个剂量组dFv-LDP-AE的抑瘤率分别为77.4％、85.2％和89.5％，均强于力达霉素的73.6％抑瘤率。在实验治疗期间，动物体重有所增加，一般状况良好，表明动物可耐受所给剂量。

表2、dFv-LDP-AE对小鼠移植性肝癌22的生长抑制作用

^*与力达霉素相比，P＜0.05；△与空白对照相比，P＜0.01.

8、强化融合蛋白dFv-LDP-AE对裸鼠移植性肝癌Bel-7402肿瘤模型的治疗作用：领取生长状态良好体重为17-20克的裸鼠随机分组，每组6只。实验第0天，用导管针取肝癌Bel-7402瘤块(约8mm³/块)接种于裸鼠腋窝皮下。实验第7天开始治疗，对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只，其余各组分别给予不同剂量的强化融合蛋白dFv-LDP-AE(0.4，0.6和0.8mg/kg)，0.05mg/kg的LDM，0.48mg/kg的Fv-LDP-AE(相当于dFv-LDP-AE 0.8mg/kg的剂量)。均为尾静脉注射，0.2ml/只。实验14天后第二次给药，共给药两次，其间每4天测一次瘤体积，在实验第30天处死小鼠，剥取肿瘤称重，并记录最后动物体重，计算抑瘤率。

强化融合蛋白dFv-LDP-AE的治疗结果表明，0.4mg/kg，0.6mg/kg，0.8mg/kg三个剂量组的dFv-LDP-AE，均能明显抑制或延迟裸鼠移植性肿瘤Bel-7402的生长，并且表现出比0.05mg/kg耐受剂量力达霉素更强的肿瘤生长抑制作用，显示 dFv-LDP-AE提高了力达霉素的治疗效果(表3)。在实验第30天结果显示，三个剂量组的dFv-LDP-AE的抑瘤率分别为64.2％、73.1％和87.3％，均强于力达霉素的63.4％抑瘤率。而0.48mg/kg的Fv-LDP-AE的抑瘤率为73.9％，小于等摩尔浓度下的(0.8mg/kg)dFv-LDP-AE的抑瘤效果(图7)，统计分析p＜0.05。说明通过增加一个Fv片段，明显提高了抑瘤效果。

表3、dFv-LDP-AE对裸鼠移植性肝癌Bel-7402的生长抑制作用

△与空白对照相比，P＜0.01；^*与力达霉素相比，P＜0.05；#与Fv-LDP-AE相比，P＜0.05.

9、小鼠活体成像观察dFv-LDP的体内靶向效果：dFv-LDP、Fv-LDP和LDP蛋白的FITC标记步骤如下：

(1)将待交联的蛋白(浓度4mg/ml)对交联反应液4℃下透析三次，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO₃，1.06g Na₂CO₃，7.36g NaCl，加水定容至1升。

(2)将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。

(3)按P∶F(蛋白质∶FITC)＝1mg∶150μg的比例，将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻晃动，使其与抗体混合均匀，至平面小摇床暗处4℃轻轻摇动反应12小时。

(4)加入5mol/L的NH₄Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2小时。

(5)将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。

(6)交联物的鉴定：蛋白浓度(mg/ml)＝[A280-0.31×A495]/1.4；

F/P比例：3.1×A495/[A280-0.31×A495]，该值应介于2.5~6.5之间。

根据上述步骤，采用FITC标记好的融合蛋白dFv-LDP、Fv-LDP、LDP，按上述公式定量蛋白浓度后，以等摩尔浓度(7μM/L)的剂量，通过尾静脉给药荷瘤裸鼠(腋下移植肝癌Bel-7402，n＝3)的方式，采用XENGOEN(美国Caliper公司)的小动物活体成像仪器，观测这三种蛋白在体内的靶向效果。

结果发现，dFv-LDP在体内有更好的肿瘤部位靶向趋向，更多的在肿瘤部位及其周围富集(图8A)，肿瘤：背景的比值明显高于Fv-LDP的比值(图8B)。Fv-LDP虽也有不错的靶向效果，但在其他非靶器官中也有比较明显的吸收，背景较高，组织分布特异性相对较差，而LDP蛋白基本上没有明显的肿瘤靶向能力，而且在8小时内就基本上被代谢了。dFv-LDP却在24小时后在肿瘤部位还有明显的富集，说明双价的ScFv形式相对于单价的ScFv来说，进一步提高了肿瘤靶向的效果，更好地改善了融合蛋白在体内的组织分布行为(图8)。

发明效果：

本发明的优点与积极效果在于：应用基因重组和分子重建相结合的方法，制备了抗IV型胶原酶单抗3G11的双单链抗体与抗肿瘤抗生素力达霉素的强化融合蛋白dFv-LDP-AE，不仅保留了完整抗体对IV型胶原酶的结合活性，还具有强烈的抗肿瘤细胞杀伤活性，在体内实验中也显示了良好的抗肿瘤疗效。相对于先前开发的Fv-LDP-AE来说，亲和力提高了4倍，在体内外的细胞杀伤活性提高，同时小动物活体肿瘤成像结果也表明dFv-LDP较Fv-LDP有更好的肿瘤靶向能力，更优良的组织分布行为，具有良好的应用前景。

图1：重组表达质粒pET-dFv-LDP的构建：

附图说明：

图2：双单链抗体融合蛋白dFv-LDP表达产物的SDS-PAGE

(A)：融合蛋白dFv-LDP经镍亲和纯化后的电泳图谱

其中：M-蛋白分子量标准；

1-超声上清；

2-超声后沉淀用1摩尔盐酸胍洗后上清；

3-重复步骤2后上清；

4和5-洗涤后的包含体用6摩尔盐酸胍溶解；

6，7，8，9-镍亲和纯化收集样品，箭头所示为目的蛋白条带。

(B)：纯后后的融合蛋白dFv-LDP经复性后的电泳和Western图谱

其中：M-蛋白分子量标准；

1-融合蛋白dFv-LDP经透析复性后变性电泳；

2-融合蛋白dFv-LDP经透析复性后非变性电泳；

3和4-1和2相应的免疫印迹实验。

图3：双单链抗体融合蛋白dFv-LDP的免疫学特点

其中：A-融合蛋白dFv-LDP、Fv-LDP和IV型胶原酶的亲和力实验；

■-dFv-LDP，亲和力为0.043微摩尔/升；

▲-Fv-LDP，亲和力为0.169微摩尔/升

B-流式细胞仪分析FITC标记后的融合蛋白dFv-LDP被HepG 2细胞内化；

C和D-免疫荧光分析融合蛋白dFv-LDP与肝癌HepG2细胞外周结合，C为可见光照片，D为C的荧光照片；

图4：双单链抗体融合蛋白dFv-LDP与发色团AE的组装

其中：a和b-分别为融合蛋白dFv-LDP在波长280和350nm的吸收；c和d-分别为融合蛋白dFv-LDP与发色团AE组装后在波长280和350nm的吸收。

图5：双单链强化融合蛋白dFv-LDP-AE对HT-1080纤维肉瘤细胞体外MTT测定

其中：□□-为dFv-LDP-AE；

▲-为LDM；

*-为dFv-LDP融合蛋白

图6：双单链强化融合蛋白dFv-LDP-AE对昆明小鼠腋下接种肝癌H22的抑瘤效果

其中：a-control；b-LDM(0.06mg/kg)；c-dFv-LDP(1.25mg/kg)；

d-dFv-LDP-AE(0.75mg/kg)；e-dFv-LDP-AE(1.0mg/kg)；

f-dFv-LDP-AE(1.25mg/kg)；g-Fv-LDP-AE(0.75mg/kg)。

图7：双单链强化融合蛋白dFv-LDP-AE对裸鼠移植人肝癌Bel-7402的抑瘤效果

其中：a-control；b-LDM(0.05mg/kg)；c-dFv-LDP(0.8mg/kg)；

d-dFv-LDP-AE(0.4mg/kg)；e-dFv-LDP-AE(0.6mg/kg)；

f-dFv-LDP-AE(0.8mg/kg)；g-Fv-LDP-AE(0.48mg/kg)。

图8：FITC标记的dFv-LDP、Fv-LDP、LDP在荷瘤裸鼠体内成像结果

其中：A-FITC标记的三种蛋白不同时间在裸鼠体内的成像结果，箭头所示为肿瘤部位；

a-FITC标记的dFv-LDP；

b-FITC标记的Fv-LDP；

c-FITC标记的LDP。

B-不同时间肿瘤部位的荧光强度与背景荧光强度的比值图谱(数据为平均值±标准偏差，n＝3)。

序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-aE及其制备方法和应用

<160>2

<210>1

<211>1905

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222>

<223>

<400>1

atgcaggtga agctgcagca gtctggaact gaagtggtaa agcctggggc ttcagtgaag 60

ttgtcctgca aggcttctgg ctacatcttc acaagttatg atatagactg ggtgaggcag 120

acgcctgaac agggacttga gtggattgga tggatttttc ctggagaggg gagtactgaa 180

tacaatgaga agttcaaggg cagggccaca ctgagtgtag acaagtcctc cagcacagcc 240

tatatggagc tcactaggct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgctagaggg 300

gactactata ggcgctactt tgacttgtgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat cgagctcact 420

cagtctccag cttctttggc tgtgtctcta gggcagaggg ccaccatatc ctgcagagcc 480

agtgaaagtg ttgatactta tggcgatact tttatgtact ggtaccagca gaaaccagga 540

cagccaccca aactcctcat ctatcttgca accaacctag gatctggggt ccctgccggg 600

ttcagtggca gtgggtctag gacaaacttc accctcacca ttgatcctgt ggaggctgat 660

gatgctgcaa cctattactg tcagcaaaat aatgaggatc cgtacacgtt cggagggggc 720

accaagctgg aaatcaaacg tggtggaggc ggttcagaat tccaggtgaa gctgcagcag 780

tctggaactg aagtggtaaa gcctggggct tcagtgaagt tgtcctgcaa ggcttctggc 840

tacatcttca caagttatga tatagactgg gtgaggcaga cgcctgaaca gggacttgag 900

tggattggat ggatttttcc tggagagggg agtactgaat acaatgagaa gttcaagggc 960

agggccacac tgagtgtaga caagtcctcc agcacagcct atatggagct cactaggctg 1020

acatctgagg actctgctgt ctatttctgt gctagagggg actactatag gcgctacttt 1080

gacttgtggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga 1140

ggtggctctg gcggtggcgg atcggacatc gagctcactc agtctccagc ttctttggct 1200

gtgtctctag ggcagagggc caccatatcc tgcagagcca gtgaaagtgt tgatacttat 1260

ggcgatactt ttatgtactg gtaccagcag aaaccaggac agccacccaa actcctcatc 1320

tatcttgcaa ccaacctagg atctggggtc cctgccgggt tcagtggcag tgggtctagg 1380

acaaacttca ccctcaccat tgatcctgtg gaggctgatg atgctgcaac ctattactgt 1440

cagcaaaata atgaggatcc gtacacgttc ggagggggca ccaagctgga aatcaaacgt 1500

ggtggaggcg gttcaaagct tggtggaggc ggttcagcgc ccgccttctc cgtcagtccc 1560

gcctcgggtc tgagtgacg gacagagcgt gtcggtgtcg gtcagcggtg ccgccgccggc 1620

gagacctact acatcgccca gtgcgctccg gtcggtggcc aggacgcgtg caacccggcg 1680

accgcgacgt ccttcaccac ggacgcgtcc ggagcggcgt cgttcagctt cgtcgtgcgc 1740

aagtcgtaca cgggctccac gcccgaaggc acgccggtcg gcagcgtcga ctgcgccacg 1800

gccgcctgta acctcggcgc cggcaactcc gggctcgacc tcggccacgt ggctctgacc 1860

ttcggcggtg gaggcggttc actcgagcac caccaccacc accac 1905

<210>2

<211>635

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly

5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser

20 25 30

Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys

50 55 60

Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala

130 135 140

Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Gly Asp Thr Phe Met Tyr Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Thr Asn

180 185 190

Leu Gly Ser Gly Val Pro Ala Gly Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr

195 200 205

Asn Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe Gln Val

245 250 255

Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val

260 265 270

Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Asp Ile

275 280 285

Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp

290 295 300

Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

305 310 315 320

Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu

325 330 335

Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

340 345 350

Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr

355 360 365

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

385 390 395 400

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

405 410 415

Val Asp Thr Tyr Gly Asp Thr Phe Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

420 425 430

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Thr Asn Leu Gly Ser

435 440 445

Gly Val Pro Ala Gly Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asn Phe Thr

450 455 460

Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

465 470 475 480

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

485 490 495

Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser

500 505 510

Ala Pro Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp Gly Gln

515 520 525

Ser Val Ser Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr Tyr Tyr

530 535 540

Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys Asn Pro Ala

545 550 555 560

Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala Ala Ser Phe Ser

565 570 575

Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Pro Glu Gly Thr Pro

580 585 590

Val Gly Ser Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala Cys Asn Leu Gly Ala Gly

595 600 605

Asn Ser Gly Leu Asp Leu Gly His Val Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly

610 615 620

Gly Gly Ser Leu Glu His His His His His His

625 630 635

Claims

1.一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE，其特征是所述dFv-LDP-AE融合蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1所示。

2.制备权利要求1强化融合蛋白dFv-LDP-AE的方法，其特征是所述方法包括以下步骤：

A)重组表达质粒pET-dFv-LDP的构建；

B)融合蛋白dFv-LDP在大肠杆菌中的诱导表达；

C)融合蛋白dFv-LDP的纯化及复性；

D)融合蛋白dFv-LDP的生物学活性测定；

E)强化融合蛋白dFv-LDP-AE的制备。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是运用基因工程技术分别克隆得到力达霉素辅基蛋白LDP基因和抗IV型胶原酶抗体单链抗体scFv基因，并将LDP基因亚克隆至大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)，构建重组质粒pET-LDP，再将scFv基因连入到pET-LDP中，构建融合基因重组表达质粒pET-Fv-LDP；最后再将另外一个scFv基因插入到表达载体pET-Fv-LDP中，生成融合基因表达质粒pET-dFv-LDP。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征是将pET-dFv-LDP转化到大肠杆菌宿主菌中，经IPTG诱导表达，获得主要以包涵体形式存在的融合蛋白dFv-LDP。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征是通过镍亲和层析纯化融合蛋白dFv-LDP，再通过分步透析复性、超滤浓缩，制备出活性融合蛋白dFv-LDP。

6.如权力要求2所述的制备方法，其特征是采用ELISA和免疫荧光法检测融合蛋白dFv-LDP对IV型胶原酶和肿瘤细胞的免疫反应性；并采用流式细胞仪分析肿瘤细胞表面结合后的融合蛋白dFv-LDP被内化的情况。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征是融合蛋白dFv-LDP与经甲醇提取法制备的力达霉素活性发色团AE进行分子组装，从而获得强化融合蛋白dFv-LDP-AE。

8.权利要求1所述强化融合蛋白dFv-LDP-AE在制备抗肝癌导向药物中的应用。