CN108129569B

CN108129569B - 一种基于抗体和巨胞饮的双靶向抗肿瘤重组蛋白的制备及用途

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Publication number: CN108129569B
Application number: CN201711390128.3A
Authority: CN
Inventors: 王晓飞; 盛唯瑾; 甄永苏; 李良; 王阳阳; 张胜华; 李毅; 刘秀均
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: CN108129569A

Abstract

本发明涉及一类基于抗体的靶向巨胞饮的双靶向作用重组蛋白及偶联化疗药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，研究表明，利用抗EGFR的单链抗体scFv，LDP及白蛋白D III介导的巨胞饮重组蛋白的双靶向作用，实现与化疗药物的偶联，可以将力达霉素等化疗药物靶向运输至肿瘤细胞，发挥更有效的抗肿瘤效果。本发明所述一类基于抗体及巨胞饮双靶向作用的抗肿瘤药物的制备及用途，迄今尚未有国内外的相关报道。

Description

一种基于抗体和巨胞饮的双靶向抗肿瘤重组蛋白的制备及用途

技术领域：

本发明属于生物工程药用蛋白技术领域，涉及一类基于抗体的靶向巨胞饮的双靶向作用抗肿瘤重组蛋白制备及其用途。

背景技术：

原癌基因Ras基因编码的Ras蛋白具有GTPase活性，Ras分子介导的信号通路在调控细胞增殖、分化中有着重要作用。在结直肠癌、肺癌和胰腺癌中K-Ras基因的突变频率高达30％-90％，K-Ras基因发生突变与患者预后差，总体生存率低具有直接的相关性。而目前没有靶向K-Ras的抗肿瘤药物应用于临床。研究发现相比于K-Ras野生型的胰腺癌细胞，发生K-Ras突变的肿瘤细胞可以快速的通过巨胞饮摄取胞外的白蛋白，且巨胞饮是白蛋白进入肿瘤细胞的主要途径。

巨胞饮(macropinocytosis)是真核细胞摄取胞外营养物质的高度保守的一种内吞形式，通过形成大小不等形状不规则的巨胞饮体，其直径通常为0.2-5μm，是细胞高效快速摄取胞外物质的有效途径。近年来研究发现，巨胞饮作用可以促进肿瘤的发生发展，当肿瘤细胞致癌基因K-Ras、Src等发生突变时，巨胞饮作用得到明显增强。肿瘤细胞通过巨胞饮途径可以有效的内化胞膜受体；通过巨胞饮摄取胞外的液体营养物质为肿瘤细胞增殖生长提供营养基础；通过巨胞饮摄取外泌体，调节肿瘤细胞增殖分化。因此利用肿瘤细胞这一特性可以有效将抗肿瘤药物运输至胞内。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)具有可生物降解、无毒无免疫原性、较好的生物相容性、超长的半衰期及可进行修饰等特点，是一种理想的药物载体。研究表明，白蛋白修饰的后的药物可以通过白蛋白的介导作用进行靶向运输，因此白蛋白可作为靶向巨胞饮运输抗肿瘤药物的载体。HSA由3个同源结构域组成DI(1-195)、DII(196-383)、DIII(384-585)，其中HSA的D III对于白蛋白半衰期的维持起到至关重要的作用，可以与HSA受体具有一定的亲和能力。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在许多肿瘤细胞中高表达，参与肿瘤的发生发展、侵袭转移及血管生成等过程。虽然目前已有多种针对EGFR高表达肿瘤的单克隆抗体上市，但研究发现当肿瘤细胞发生KRAS突变时，患者对抗EGFR单抗反应效果不佳。抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)可以利用抗体的靶向作用，将具有杀伤作用的弹头分子靶向运输至肿瘤部位，发挥抗肿瘤作用，但有研究指出，抗EGFR的ADC药物内吞效率低下，这是由于抗体与受体结合后需要通过网格蛋白的介导才能实现胞吞。因此若通过白蛋白巨胞饮靶向介导作用，以及抗体的靶向结合作用可以更为有效的发挥药物的抗肿瘤药效。

力达霉素是迄今发现的最强的抗肿瘤抗生素之一，其分子由辅基蛋白(LDP)和烯二炔发色团(Active enediyne chromophore,AE)两部分组成，具有独特的可拆分分子结构特点。辅基蛋白构成一个疏水性口袋，可以与疏水性化学小分子药物相偶联，通过对LDP相关基团的定点修饰，可以实现LDP与其他化疗药物如紫杉醇和平阳霉素等相偶联。

在实验研究的基础上，本发明利用制备一种新型的重组蛋白，该蛋白包括抗EGFR的单链抗体scFv，LDP及白蛋白的D III，其中scFv是通过噬菌体展示技术所获得的新型抗EGFR单链抗体。该蛋白通过抗体片段的靶向作用和白蛋白介导的巨胞饮靶向作用，从而实现将力达霉素靶向运输至肿瘤部位，并可以迅速进入肿瘤细胞，发挥更有效的抗肿瘤效果。本发明所述一类基于抗体及巨胞饮双靶向作用的抗肿瘤药物的制备及用途，迄今尚未有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明提供了一类巨胞饮介导的靶向抗肿瘤重组蛋白Fv-LDP-HSA(domain III)，以下统称为Fv-LDP-3D。

本发明提供了重组蛋白Fv-LDP-3D的编码基因及氨基酸序列。

本发明提供了重组蛋白Fv-LDP-3D的制备方法。

本发明提供了由重组蛋白及偶联化疗药物组成的抗肿瘤药物。

本发明提供了重组蛋白及偶联化疗药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明采用噬菌体抗体库技术筛选出与EGFR具有高亲和活性的scFv，由于单链抗体分子较小，其具有低免疫原性，组织穿透能力强等特点；连接力达霉素的辅基蛋白作为可组装的弹头分子；在重组蛋白的C末端引入HSA的第三个结构域，一方面保持重组蛋白较为理想的药代参数，同时维持重组蛋白具有巨胞饮靶向运输作用。利用基因工程技术构建该重组蛋白的表达载体，通过毕赤酵母分泌表达系统表达目的蛋白，经纯化获得一种多功能药用蛋白。

本发明所提供的一种靶向抗肿瘤重组蛋白，其结构为：scFv-连接肽(G₄S)₂-LDP-连接肽(G₄S)₂-3D，所述蛋白具有SEQ ID NO:1氨基酸序列，共578个氨基酸。

本发明提供所述重组蛋白的编码基因，其具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，共1734bp。

本发明采用基因工程技术获得上述靶向抗肿瘤重组蛋白表达载体，并提供了其制备方法。

本发明提供强化重组蛋白Fv-LDP-3D-AE在裸鼠移植瘤模型中的治疗作用。优选地，所述抗肿瘤药物应用于治疗人胰腺癌。

综上所述，本发明通过基因工程技术构建并于毕赤酵母分泌表达体系表达一种新型的重组蛋白，该重组蛋白不仅具有EGFR结合能力，并保持了HSA片段通过巨胞饮进入细胞的能力。目前尚未有此类双靶向作用机制的抗肿瘤重组蛋白的报道。

本发明的优点在于，利用毕赤酵母表达系统分泌表达了Fv-LDP-3D以及对照蛋白Fv-LDP和LDP-3D。所获得的重组蛋白，不仅可以高效结合EGFR及EGFR表达的肿瘤细胞表面，并能够通过巨胞饮途径大量进入肿瘤细胞。体内实验结果表明重组蛋白Fv-LDP-3D能够富集于肿瘤部位，并具有显著的AsPC-1裸鼠移植瘤治疗效果，表现出较好的应用前景。

附图说明：

图1—重组蛋白基因构建示意图、重组蛋白纯化及鉴定和重组蛋白与AE组装后鉴定

其中：图A为重组蛋白基因构建示意图；

图B为重组蛋白纯化结果(M：蛋白Marker，1：LDP-3D蛋白，2：Fv-LDP蛋白，3：Fv-LDP-3D蛋白)；

图C为重组蛋白Western blot鉴定结果(1：LDP-3D蛋白，2：Fv-LDP蛋白，3：Fv-LDP-3D蛋白)；

图2—重组蛋白与EGFR及肿瘤细胞亲和活性

其中：图A为ELISA法分析重组蛋白与EGFR及4种胰腺癌细胞的亲和活性；

图B为流式细胞术法分析重组蛋白与4中胰腺癌细胞的亲和活性；

图3—重组蛋白通过巨胞饮进入肿瘤细胞

其中：图A为Confocal检测BxPC-3、MIA和AsPC-1细胞对三种重组蛋白内吞差异；

图B为Confocal检测MIA和AsPC-1细胞通过巨胞饮摄取重组蛋白Fv-LDP-3D；

图C为FCM检测四种胰腺癌细胞对三种重组蛋白内吞差异。

图4—MTT法检测重组蛋白对四种胰腺癌细胞的增殖抑制作用

图5—强化后重组蛋白对肿瘤细胞凋亡诱导和周期阻滞作用

其中，图A为FCM检测强化后重组蛋白对MIA和AsPC-1细胞周期阻滞作用；

图B为FCM检测强化后重组蛋白对MIA和AsPC-1细胞凋亡诱导作用；

图C为Western blot检测强化后重组蛋白对MIA和AsPC-1细胞凋亡诱导作用。

图6—体内活体成像检测重组蛋白在AsPC-1裸鼠移植瘤体内分布情况

其中，图A为三种重组蛋白在不同时间点于裸鼠体内分布情况；

图B为Fv-LDP-3D重组蛋白组组织器官荧光分布情况。

图7—重组蛋白即强化后重组蛋白对AsPC-1裸鼠移植瘤抑制作用。

具体实施方式：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。《实施例1》重组表达载体pPIC9K-fv-ldp-3d的构建

重组蛋白Fv-LDP-3D的完整结构为scFv-连接肽(G₄S)₂-LDP-连接肽(G₄S)₂-3D，其全基因表达序列由金斯瑞公司根据毕赤酵母偏爱密码子优化合成，实验对照重组蛋白Fv-LDP和LDP-3D的基因序列通过设计引物利用分子生物学技术进行构建，引物由Invitrogen^TM公司合成，表达载体为pPIC9K购自Invitrogen公司，大肠杆菌感受态DH5α为Genstar公司产品。

P1：5’-TCTGTACGTAATGGCCCAGGTCCAGCTTC-3’(下划线为SnaB I酶切位点)

P2：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGG-3’(下划线为Not I酶切位点)

P3：5’-TCTGTACGTAGCTCCAGCTTTCTCTG-3’(下划线为SnaB I酶切位点)

P4：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCCGAAAGTCAAAGC-3’(下划线为Not I酶切位点)

1)以金斯瑞公司提供的pUC57-fv-ldp-3d质粒为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增反应，胶回收PCR产物，用SnaB I和Not I双酶切后，与经过双酶切的pPIC9K质粒载体进行连接，得到重组质粒pPIC9K-fv-ldp-3d；

2)以质粒pUC57-fv-ldp-3d为模板，引物P3和P2进行PCR扩增反应，胶回收PCR产物，用SnaB I和Not I双酶切后，与经过双酶切的pPIC9K质粒载体进行连接，得到重组质粒pPIC9K-ldp-3d，作为实验对照表达载体；

3)以质粒pUC57-fv-ldp-3d为模板，引物P1和P4进行PCR扩增反应，胶回收PCR产物，用SnaB I和Not I双酶切后，与经过双酶切的pPIC9K质粒载体进行连接，得到重组质粒pPIC9K-fv-ldp，作为实验对照表达载体。

Fv-LDP-3D基因序列包括三个部分(如图1A所示)，分别为Fv基因片段、LDP基因片段和HSA domain III片段；序列的N末端为SnaB I的酶切位点，C末端为Not I的酶切位点；片段与片段之间通过柔性肽(G4S)₂基因序列进行连接，并在终止密码子前加入(His)₆-tag基因表达序列，便于鉴定及纯化。

《实施例2》重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化

分别将pPIC9K-fv-ldp-3d及实验对照表达载体pPIC9K-ldp-3d及pPIC9K-fv-ldp转化至大肠杆菌DH5α中，挑选单克隆菌株，经PCR鉴定以及测序鉴定确定阳性载体菌株。提取表达质粒，利用Sal I酶切线性化，胶回收后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，挑取多个His⁺阳性菌落进行诱导表达，经过表达条件优化后，检测重组蛋白的表达产量，选取表达量较高的菌株作为表达菌。所述的菌株命名为GS115-FL3，于2017年11月7日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其编号为CGMCCNo.14867，分类命名：巴斯德毕赤酵母。

接种3种重组蛋白的表达工程菌株于BMGY生长培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，100mM pH 6.0磷酸钾缓冲液，1％甘油)中，220rpm，30℃培养36h，室温静置或离心收集菌体，将其转移至BMMY诱导培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，100mM pH 6.0磷酸钾缓冲液，1％甲醇)，250rpm，28℃诱导表达96-120h(每24h补加100％甲醇至终浓度为1％)。重组蛋白分泌表达于培养基上清中，离心收集上清，经0.45μm滤膜过滤后，用GE Healthcare公司产品HisTrap亲和层析柱进行纯化，详细操作按照说明书进行。图1B为三种蛋白纯化后SDS-PAGE分析，图1C利用抗His-tag单克隆抗体通过Western blot对重组蛋白进行鉴定。其中Fv-LDP-3D和Fv-LDP两种重组蛋白表达产量在15mg/L左右，LDP-3D为50mg/L左右。

《实施例3》重组蛋白与EGFR蛋白及肿瘤细胞亲和活性分析

1.ELISA检测重组蛋白对EGFR蛋白及胰腺癌细胞亲和活性

EGFR蛋白粉末用PBS溶解，将其稀释至5μg/ml，50μl/孔加入96孔板中，4℃包被过夜。PBS润洗3次，弃尽孔内液体备用；胰腺癌细胞BxPC-3，MIA PaCa-2，AsPC-1和PANC-1以1×10⁴个细胞/孔密度接种于96孔板，37℃培养24h，用PBS润洗2次，加入4℃预冷的0.05％戊二醛50μl/孔，放至4℃固定细胞20min，固定后的细胞用PBS润洗3次，甩干残留液体后备用。将EGFR包被后及细胞固定后的96孔板用5％脱脂牛奶溶液以200μl/孔在室温封闭2h；用PBST缓冲液(PBS中含有0.05％的Tween-20)润洗3次；将重组蛋白用PBS按照一定比例稀释后加入到96孔板中，每个浓度设3个平行孔，50μl/孔，37℃孵育2h；用PBST润洗3次，加入抗His-tag单克隆抗体(Abmart公司，1:2500稀释)，50μl/孔，37℃孵育2h；用PBST润洗3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:3000稀释)，50μl/孔，37℃孵育2h；用PBST润洗5次后，加入HRP的底物可溶型单组分TMB溶液(购自北京天根生化科技有限公司)每孔100μl，室温避光反应10-30min，根据显色程度，每孔加入2mol/L的硫酸100μl终止反应，立即测定450nm处的吸光值。

2.流式细胞术检测重组蛋白对胰腺癌细胞亲和活性

胰腺癌细胞BxPC-3，MIA PaCa-2，AsPC-1和PANC-1以5×10⁴个细胞/孔密度接种于24孔板，37℃培养24h，用PBS润洗2次，并于4℃条件下预冷15-30min，将FITC标记的重组蛋白用PBS按照一定比例进行稀释并加至24孔内，4℃继续孵育2h，然后用PBS润洗5次，胰酶消化细胞后用PBS重悬上机检测。

结果如图2-AB所示，重组蛋白Fv-LDP及Fv-LDP-3D与EGFR具有显著的亲和活性，表明重组蛋白的Fv片段能够正常发挥其靶向EGFR的活性；同时该两种重组蛋白与EGFR表达的肿瘤细胞呈现较强的亲和能力，两者亲和活性相近，相比之下LDP-3D与细胞的亲和能力较差，由于LDP不能与肿瘤细胞结合，故较弱的亲和活性由HSA domain III所介导。

《实施例4》重组蛋白通过巨胞饮作用进入肿瘤细胞

1.激光共聚焦法检测胰腺癌细胞对重组蛋白的巨胞饮作用

将处于对数生长期的胰腺癌细胞BxPC-3、MIA PaCa-2、AsPC-1以5-8×10⁴个细胞/孔密度接种于8孔腔室盖玻片中，37℃培养24h，将培养液弃尽，用无血清培养基润洗2次，加入由无血清培养基稀释的终浓度为5μM的3种FITC标记后的重组蛋白，37℃避光培养30min。巨胞饮验证实验则设置以下两组：一是提前60min用终浓度为50μM的巨胞饮特异性抑制剂EIPA进行预处理，加入重组蛋白的同时包含有50mM EIPA；二是重组蛋白与巨胞饮指示剂等浓度Dextran共孵育。重组蛋白作用30min后，用PBS润湿3次，4％多聚甲醛室温固定10min，再用PBS润洗5次，滴加含有DAPI染液的抗淬灭剂染色15min，油镜观察拍照。结果如图3A及3B，BxPC-3为KRAS野生型的胰腺癌细胞株，对重组蛋白的摄取量很低，而MIA和AsPC-1为KRAS突变型细胞株，从三种重组蛋白的摄取量相比BxPC-3高，这其中Fv-LDP-3D重组蛋白进入细胞的量最多，其次是Fv-LDP，Fv片段能够快速识别结合细胞表面的EGFR蛋白，所以含有该片段的重组蛋白内吞较多，而Fv-LDP-3D重组蛋白含有HSA的一个结构域，从结果分析该重组蛋白具有巨胞饮靶向作用，故进入细胞的量最多。此外，Fv-LDP-3D重组蛋白可以与巨胞饮指示剂Dextran共定位，并且加入巨胞饮抑制剂EIPA后，重组蛋白进入细胞的量明显降低，表明重组蛋白的确是通过巨胞饮途径进入肿瘤细胞内。

2.流式细胞术检测胰腺癌细胞对重组蛋白的巨胞饮作用

胰腺癌细胞BxPC-3，MIA PaCa-2，AsPC-1和PANC-1以5×10⁴个细胞/孔密度接种于24孔板，37℃培养24h，用无血清培养基润洗2次，加入由无血清培养基稀释的终浓度为5μM的3种FITC标记后的重组蛋白，37℃避光培养30min。用PBS润洗3次，加入浓度为0.1％台盼蓝淬灭结合在胞膜上的荧光，用PBS润洗3次，胰酶消化细胞后用PBS重悬上机检测。从图3C中可看出FCM结果与Confocal实验结果相一致，在KRAS突变的胰腺癌细胞中融和蛋白Fv-LDP-3D可以更有效的进入肿瘤细胞。

《实施例5》MTT法检测重组蛋白及强化后重组蛋白对4种胰腺癌细胞增殖抑制作用

处于对数生长期的胰腺癌细胞BxPC-3，MIA PaCa-2，AsPC-1和PANC-1经胰酶消化后，进行细胞计数，根据细胞的生长速度，每孔2500-5000个细胞，37℃培养24h使细胞贴壁；将3种重组蛋白或者强化后的重组蛋白用PBS进行倍比稀释后，每孔加入100μl，每个重组蛋白浓度设三个复孔，同时设立对照组和空白组，37℃培养48h，然后每孔加入20μl浓度为5mg/ml MTT，37℃培养4h，小心弃尽上清，每孔加入150μl DMSO，室温下低速振荡10min，酶标仪测定570nm处的吸光值。按照以下公式计算细胞的存活率：存活率＝(AT-AB)/(AC-AB)×100％，其中AB,AC,AT分别代表空白组、对照组、加重组蛋白组平均A570值。以细胞存活率为纵坐标，重组蛋白浓度为横坐标作浓度反应曲线，并利用SPSS软件计算IC50值。

从MTT结果(图4)可以看出，重组蛋白LDP-3D对肿瘤细胞并没有增殖抑制作用，而Fv-LDP和Fv-LDP-3D两种重组蛋白对四种胰腺癌细胞具有浓度依赖的增殖抑制效果，二者抑制作用相近，IC50在微摩尔水平，Fv-LDP-3D略强。从表1中可以看出，组装AE后的三种重组蛋白其对肿瘤细胞具有极强的杀伤效果，其活性与LDM相近。

表1.LDM、LDP-3D-AE、Fv-LDP-AE和Fv-LDP-3D-AE对各种胰腺癌细胞的IC50值

《实施例6》强化后重组蛋白对肿瘤细胞凋亡诱导、周期阻滞作用

1.强化后重组蛋白对MIA和AsPC-1细胞周期阻滞

将对数生长期的肿瘤细胞MIA和AsPC-1接种于6孔板，37℃培养24h使其贴壁，加入强化后重组蛋白使其终浓度分别为0.001nM、0.01nM及0.1nM，37℃继续培养24h。将细胞消化成细胞悬液，PBS润洗1次，用预冷的70％乙醇固定细胞2h或过夜固定，PBS润洗1次，每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴避光存放，染色完成后上机检测。从图5A结果中可以看出，强化后的重组蛋白均能够引起肿瘤细胞G2M期阻滞，其中MIA细胞对其更加敏感，而AsPC-1细胞相对不敏感。

2.强化后重组蛋白诱导MIA和AsPC-1细胞发生凋亡

将对数生长期的肿瘤细胞MIA和AsPC-1接种于6孔板，37℃培养24h使其贴壁，加入强化后重组蛋白使其终浓度分别为0.01nM、0.1nM及1nM，37℃继续培养24h。收集细胞，PBS润洗2次，加入100μl 1×Annexin V Binding Solution将细胞重悬；向细胞悬液中加入5μlAnnexin V,FITC结合物，加入5μl PI，室温下避光培养15min；加入400μl 1×Annexin VBinding Solution重悬细胞，流式细胞仪检测。结果如图5B，随着强化重组蛋白浓度的升高，细胞发生显著的凋亡，死亡的细胞比例逐渐升高。

将对数生长期的肿瘤细胞MIA和AsPC-1接种于6孔板，37℃培养24h使其贴壁，加入强化后重组蛋白使其终浓度分别为0.01nM、0.1nM及1nM，37℃继续培养24h。收集细胞，加入适量RIPA裂解液，冰上裂解并收集蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂牛奶室温下封闭1-2h，按相应比例稀释相关一抗，4℃孵育过夜；TBST润洗3次，加入与一抗相对应的二抗，继续孵育1-2h，TBST润洗5次，将Millipore公司发光检测液A和B按1:1混合后，加在PVDF膜上进行显色，凝胶成像系统拍照。结果如图5C，经过强化后重组蛋白处理之后，能够检测到凋亡相关蛋白包括PARP、P53、Capase-3、Bax和Bcl-2发生变化，表明肿瘤细胞发生凋亡。

《实施例7》体内活体成像检测重组蛋白在AsPC-1裸鼠移植瘤模型体内分布情况

重组蛋白的标记：DyLight 680Antibody Labeling Kit购于Thermo公司，用PBS调节重组蛋白浓度为2.0mg/mL，取0.5mL蛋白溶液加入0.67M的硼酸盐缓冲液40μL，混匀后将全部液体转移至DyLight 680试剂中，轻柔混匀并将液体快速离心至管底，室温下避光反应60min，取两个上下套管组装在一起，加入250μL纯化树脂溶液，1,000×g离心1min，更换新的收集管，将标记好的蛋白溶液250μL加入上套管，1,000×g离心1min，将收集管中标记好的蛋白合并，4℃避光保存。

将人胰腺癌细胞AsPC-1接种至裸鼠右侧腋下。约2-3周后，肿瘤体积长至300-500mm³，将DyLight 680标记的重组蛋白，分别进行尾静脉注射荷瘤裸鼠，剂量为20mg/kg，于不同的时间点利用XENGOEN(美国Caliper公司)的小动物活体成像仪进行观察拍照，当Fv-LDP-3D实验组432h后，瘤内荧光很弱时，将裸鼠的主要脏器进行剥离，在活体成像仪下进行拍照。从图6A中可以看出，Fv-LDP-3D重组蛋白能够快速富集于肿瘤部位，并且持续时间长达两周，在其他组织器官分布较微弱，而Fv-LDP组瘤内分布不明显，并且持续时间短，LDP-3D和LDP组在很短的时间内就被代谢。结果表明Fv-LDP-3D具有显著的肿瘤靶向作用。

《实施例8》重组蛋白及强化后重组蛋白对裸鼠移植瘤的生长抑制作用

将状态良好的AsPC-1细胞进行传代扩增，将肿瘤细胞进行消化，PBS润洗1次，再重悬于PBS缓冲液中，进行细胞计数，将其密度调整至2×10⁷个/ml。自斯贝福公司购买重量18g左右的雌性BALB/c裸鼠，于裸鼠腋窝皮下每只接种200μL细胞悬液。待瘤块长至约50-100mm³时，按照裸鼠体重和瘤体积进行分组，每组6只，共6组，分别为对照组、0.05mg/kgLDM组、0.25mg/kg Fv-LDP-3D-AE组、0.4mg/kg Fv-LDP-3D-AE组、20mg/kg Fv-LDP组和20mg/kg Fv-LDP-3D组。从接种细胞后的第9天开始通过尾静脉给药，每只180μL，第16天给药第2次，每只180μL，对照组不作处理。实验期间，每2天对裸鼠体重和肿瘤的体积进行测量，并观察裸鼠的精神状态。在第28天将动物处死，并解剖取主要脏器。根据公式V＝ab²/2计算肿瘤体积(a:肿瘤长径，b:肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线及裸鼠体重变化曲线图。如图7所示，与对照组相比，20mg/kg Fv-LDP组、20mg/kg Fv-LDP-3D组、0.05mg/kg LDM组、0.25mg/kg Fv-LDP-3D-AE组和0.4mg/kg Fv-LDP-3D-AE组的抑瘤率分别为：37.7％、58.2％、59.8％、64.6％和81.2％。可以看出，等剂量的重组蛋白Fv-LDP-3D的体内抑瘤效果明显强于重组蛋白Fv-LDP；强化后的重组蛋白Fv-LDP-3D能够发挥更强抑瘤效果。上述各治疗组的小鼠状态良好，未发生死亡，体重变化区间在10％以内。

序列表

<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所

<120> 一种基于抗体和巨胞饮作用的双靶向抗肿瘤融合蛋白的制备及用途

<160> 2

<210> 1

<211> 578

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

MET Ala Gln Val Gln Leu Gln Lys Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro

5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys

20 25 30

Asp Thr Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ile Ile Tyr Asp Pro

50 55 60

Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Thr Ala Thr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser

130 135 140

Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Val

145 150 155 160

Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp

165 170 175

Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

195 200 205

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Thr Asn Pro

210 215 220

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala

245 250 255

Ser Gly Leu Ser Asp Gly Gln Ser Val Ser Val Ser Val Ser Gly Ala

260 265 270

Ala Ala Gly Glu Thr Tyr Tyr Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly

275 280 285

Gln Asp Ala Cys Asn Pro Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp Ala

290 295 300

Ser Gly Ala Ala Ser Phe Ser Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr Thr Gly

305 310 315 320

Ser Thr Pro Glu Gly Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Cys Ala Thr Ala

325 330 335

Ala Cys Asn Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly Leu Asp Leu Gly His Val

340 345 350

Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val

355 360 365

Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln

370 375 380

Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys

385 390 395 400

Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn

405 410 415

Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg

420 425 430

MET Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys

435 440 445

Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys

450 455 460

Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val

465 470 475 480

Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe

485 490 495

His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

500 505 510

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys

515 520 525

Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys

530 535 540

Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys

545 550 555 560

Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu His His His His

565 570 575

His His

<210> 2

<211> 1734

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcccagg tccagcttca aaagtctgga gctgagcttg tcaagcctgg agcctccgtc 60

aaactttcct gcactggttc tggttttaat attaaagata cttacttgca ctgggtcaaa 120

cagagaccag agcagggatt ggagtggatc ggaagaatcg accctgccaa tggaaatatt 180

atctacgacc caaaatttca gggtaaagcc actattaccg tcgatactta ctccaatacc 240

gcctatttgc agttgtcttc tcttacctcc gaggacaccg ccgtctatta ctgcgccacc 300

gccacccact attggggaca gggaaccact gttattgttt cttctggggg aggaggatca 360

ggaggaggag gatcaggagg tggaggatcc gacatcgagc ttacccagtc ccctgccatc 420

atgtccgcct ccccaggaga aaaggtcacc atgacctgct ccgcttcttc tagagttgtc 480

tatatgcatt ggtaccagca aaaatctgga acctccccta aaagatggat ctacgacacc 540

tccaaacttg cctccggagt cccaaccaga ttttctggat ccggatccgg aacctcctat 600

tcccttacca tttcttctat ggaggccgaa gacgccgcta cttactactg ccaacaatgg 660

tctactaatc ctccaacctt tggttctggt actaagttgg aaattaagag aggaggagga 720

ggaagtggtg gtggtggttc tgctccagct ttctctgttt ctcctgcttc tggtttgtct 780

gatggtcaat ctgtttctgt ttctgtttct ggtgctgctg ctggagagac ttactatatt 840

gctcaatgtg ctccagttgg tggtcaagat gcttgtaacc ctgctactgc tacttctttt 900

actactgatg cttctggtgc tgcttctttt tctttcgttg ttagaaaatc ttatactggt 960

tctactccag aaggtactcc tgttggttct gttgattgtg ctactgctgc ttgtaacttg 1020

ggtgctggta attctggttt ggatttgggt catgttgctt tgactttcgg aggaggagga 1080

ggatctggag gtggtggttc tgttgaagag ccacaaaact tgattaaaca aaactgtgaa 1140

ttgtttgagc aattgggtga atacaagttc caaaacgctt tgttggttag atacactaag 1200

aaagttccac aagtttctac tcctactttg gttgaggttt ctagaaattt gggtaaagtt 1260

ggttctaaat gttgtaagca tccagaagct aagagaatgc cttgtgctga ggattacttg 1320

tctgttgttt tgaaccaatt gtgtgttttg cacgaaaaga ctccagtttc tgatagagtt 1380

actaagtgtt gtactgagtc tttggttaac agaagaccat gtttttctgc tttggaagtt 1440

gatgagactt atgttcctaa ggaattcaat gctgagactt ttactttcca tgctgatatt 1500

tgtactttgt ctgaaaagga gagacaaatt aagaaacaaa ctgctttggt tgaattggtt 1560

aagcacaaac caaaggctac taaagagcaa ttgaaggctg ttatggatga ttttgctgct 1620

ttcgttgaaa aatgttgtaa ggctgatgat aaggagactt gtttcgctga agagggtaaa 1680

aagttggttg ctgcttctca agctgctttg ggtttgcatc accatcacca tcac 1734

Claims

1.一类基于抗体和巨胞饮的双靶向抗肿瘤药物，其特征是，所述抗肿瘤药物由重组蛋白及偶联化疗药物组成，

其中，重组蛋白由scFv-连接肽(G₄S)₂-辅基蛋白-连接肽(G₄S)₂-人血清白蛋白DomainIII组成，如SEQ ID NO:1氨基酸序列所示，共578个氨基酸，

其中，化疗药物为疏水性化学小分子药物。

2.权利要求1所述抗肿瘤药物，其特征是，所述化疗药物为力达霉素发色团、紫杉醇、平阳霉素。

3.权利要求1所述抗肿瘤药物，其特征是，所述重组蛋白的编码基因，如SEQ IDNO:2核苷酸序列所示，共1734bp。

4.权利要求1所述抗肿瘤药物的制备方法，其特征是，重组蛋白的制备方法，其主要步骤是：

A.重组表达载体pPIC9K-scFv-辅基蛋白-人血清白蛋白Domain III的构建；

B.重组蛋白在毕赤酵母中的表达；

C.重组蛋白的纯化。

5.权利要求4所述的制备方法，其特征是，

运用基因工程技术获得scFv-(G₄S)₂-辅基蛋白-(G₄S)₂-人血清白蛋白Domain III基因和His6-tag序列；将scFv-(G₄S)₂-辅基蛋白-(G₄S)₂-人血清白蛋白Domain III基因和His6-tag序列基因片段与pPIC9K质粒载体进行连接，得到重组质粒表达载体pPIC9K-scFv-辅基蛋白-人血清白蛋白Domain III。

6.权利要求4或5所述的制备方法，其特征是，将重组质粒表达载体pPIC9K-scFv-辅基蛋白-人血清白蛋白Domain III转化至大肠杆菌DH5α中，提取表达质粒，经Sal I酶切线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，培养、诱导表达，检测重组蛋白，含pPIC9K-scFv-辅基蛋白-人血清白蛋白Domain III表达载体菌株命名为GS115-FL3，其编号为CGMCCNo.14867。

7.权利要求4或5所述的制备方法，其特征是，将含pPIC9K-scFv-辅基蛋白-人血清白蛋白Domain III表达载体菌株接种于BMGY生长培养基，220rpm，30℃培养36h，将其转移至BMMY诱导培养基，250rpm，28℃诱导表达96-120h，离心收集上清，经0.45μm滤膜过滤后，用HisTrap亲和层析柱进行纯化。

8.权利要求1所述双靶向抗肿瘤药物在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。