CN110101867B - 一种peg修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能抗肿瘤重组蛋白偶联物 - Google Patents

一种peg修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能抗肿瘤重组蛋白偶联物 Download PDF

Info

Publication number
CN110101867B
CN110101867B CN201910405541.5A CN201910405541A CN110101867B CN 110101867 B CN110101867 B CN 110101867B CN 201910405541 A CN201910405541 A CN 201910405541A CN 110101867 B CN110101867 B CN 110101867B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ldp
hsa
recombinant protein
peg
protein conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910405541.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110101867A (zh
Inventor
王阳阳
刘秀均
李良
甄永苏
李毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Original Assignee
Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS filed Critical Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority to CN201910405541.5A priority Critical patent/CN110101867B/zh
Publication of CN110101867A publication Critical patent/CN110101867A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110101867B publication Critical patent/CN110101867B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种PEG修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能重组蛋白偶联物及其制备方法和其用途。所述的重组蛋白偶联物，命名为F‑HSA‑LDP，其由叶酸‑PEG，人血清白蛋白和力达霉素的辅基蛋白LDP组成，通过叶酸‑PEG的醛基与重组蛋白HSA‑LDP的N末端氨基反应而成。该新型重组蛋白偶联物F‑HSA‑LDP既能够靶向叶酸受体，又有强烈的杀伤肿瘤细胞的活性，且与HSA‑LDP相比具有更长的半衰期，有望开发成为一类新型抗肿瘤药物。

Description

一种PEG修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能抗肿瘤重组 蛋白偶联物
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一类PEG修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能抗肿瘤重组蛋白偶联物制备及其用途。
背景技术：
叶酸受体(folate receptor,FR)介导的靶向给药系统是利用肿瘤细胞和正常细胞表面叶酸受体表达的差异性，特异性结合肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体，来实现叶酸结合物的靶向传递。叶酸受体是一种糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol,GPI)连接的膜糖蛋白，分子量为38-40kDa，是可以介导细胞内吞，将叶酸摄入真核细胞胞浆的一种高亲和力受体。叶酸受体在某些肿瘤细胞表面高度表达，而在正常组织无或很少表达，因而具有良好的肿瘤组织特异性。近年叶酸受体在药物靶向运输、癌症及免疫疗法等领域中的研究应用受到广泛关注。
研究表明原癌基因K-Ras突变与肿瘤的发生及发展密切相关，大部分的肺癌、结肠癌及超过90％的胰腺癌为K-Ras突变型。K-Ras基因发生突变与患者预后差，总体生存率低具有直接的相关性。而目前没有靶向K-Ras的抗肿瘤药物应用于临床。在K-Ras基因突变型的胰腺癌细胞中，巨胞饮作用得到持续性增强，大量吞噬胞外营养物质，这一途径可以作为抗肿瘤药物有效的靶向运输策略。
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子量大约为68kDa，是血液中含量最高的蛋白，无免疫原性，人体相容性好，所以选择白蛋白作为药物传输载体具有较多优点；另外，巨胞饮是白蛋白进入肿瘤细胞的主要途径，一些肿瘤细胞巨胞饮明显增强，并以白蛋白为主要营养来源，为其提供生长必需氨基酸。所以，可以利用白蛋白作为靶向巨胞饮的药物输送载体。
蛋白质或多肽的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰即PEG化(PEGylation)，是指将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。PEG修饰能赋予蛋白多种优良性能，例如循环半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少、物理化学和生物稳定性增强等，在很大程度上拓宽了蛋白的应用范围。PEG修饰包括随机修饰和定点修饰，定点修饰能够选择特定基团进行修饰，避免或减少了对活性位点的修饰，有利于产物质量控制。在蛋白骨架中，末端氨基酸残基的α-NH2的pKa值通常低于赖氨酸的ε-NH2的pKa值，在弱酸环境中，PEG-醛更易与末端氨基酸残基的α-NH2发生还原胺化反应，从而实现N-末端氨基的定点修饰。
力达霉素是迄今发现的最强的抗肿瘤抗生素之一，其分子由辅基蛋白(LDP)和烯二炔发色团(Active enediyne chromophore,AE)两部分组成，具有独特的可拆分分子结构特点。
基于上述，本发明制备一类重组蛋白偶联物，该偶联物包括叶酸-PEG(F-PEG)，白蛋白和LDP，命名为F-HSA-LDP。该蛋白通过叶酸受体的靶向作用和白蛋白介导的巨胞饮靶向作用，从而实现将力达霉素靶向运输至肿瘤部位，并可以迅速进入肿瘤细胞，发挥更有效的抗肿瘤效果，并且PEG修饰延长了此蛋白的半衰期。本发明所述一类基于叶酸受体及巨胞饮双功能的抗肿瘤药物的制备及用途，迄今尚未有国内外的相关报道。
发明内容：
本发明提供了一类PEG修饰的基于叶酸受体及巨胞饮双功能的重组蛋白偶联物。
本发明所述的重组蛋白偶联物，所述偶联物由叶酸-PEG、人血清白蛋白和力达霉素辅基蛋白LDP组成，该重组蛋白偶联物具有以下结构：叶酸-PEG-人血清白蛋白HSA-连接肽(G4S)2-LDP，简称为F-HSA-LDP。
本发明所述的重组蛋白偶联物，由叶酸-PEG与重组蛋白HSA-LDP通过还原胺化反应形成的偶联物。
本发明所述的重组蛋白偶联物，由叶酸-PEG的醛基与重组蛋白HSA-LDP的N末端氨基反应而成。
HSA具有58个赖氨酸残基，在此处进行PEG偶联不利于得到均一产物。
因此，具体地，本发明提供了一种在HSA的N末端进行PEG化的偶联方式。
本发明的另一个目的在于提供一种制备重组蛋白偶联物的方法，包括以下步骤：
(1)重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的制备：
将重组蛋白HSA-LDP与叶酸-PEG按照摩尔比为1:3-1:20进行偶联反应，
(2)重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的纯化：
将重组蛋白偶联物F-HSA-LDP经过DEAE阴离子层析法分离，即得。
其中，偶联反应体系为醋酸盐缓冲液pH 6.0，离子强度为10-100mmol/L。
优选的，本发明所述的制备方法，包括以下步骤：
(1)重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的制备：
将重组蛋白HSA-LDP用pH6.0，10mmol/L醋酸钠溶液配成5mg/ml，然后称取0.0126gCH3BrNa于10ml上述HSA-LDP溶液中至终浓度为20mmol/L，按摩尔比1:3-1:10(HSA-LDP:叶酸-PEG)称取叶酸-PEG加入上述溶液中，搅拌；
(2)重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的纯化：
反应混合液先对20mM Tris-HCl缓冲液透析，再将上步所得样品上样于同样缓冲液平衡好的DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱，用氯化钠梯度洗脱吸附蛋白，即得。
进一步优选的，本发明所述的制备方法，包括以下步骤：
(1)重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的制备：
将重组蛋白HSA-LDP用pH6.0，10mmol/L醋酸钠溶液配成5mg/ml，然后称取0.0126gCH3BrNa于10ml上述HSA-LDP溶液中至终浓度为20mmol/L，按摩尔比1:5(HSA-LDP:叶酸-PEG)称取0.038g叶酸-PEG加入上述溶液中，搅拌；
(2)重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的纯化：
反应混合液先对20mM Tris-HCl缓冲液(pH6.5)透析，再将上步所得样品上样于同样缓冲液平衡好的DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱，用0.1-0.5mol/L氯化钠梯度洗脱吸附蛋白，即得。
本领域熟知的，在氰基硼氢化钠存在条件下，带醛基的PEG会和伯胺发生还原氨化反应。醛基和其他的亲电活性基团不同，它只和胺基反应。虽然醛基的反应活性比NHS活性低，但它具有反应条件温和，易于连接的特点。因此，在弱酸环境下，PEG醛基会对蛋白质的N端进行选择性反应。
本发明的另一个目的在于提供重组蛋白偶联物在抗肿瘤的药物中的应用。
优选的，本发明所述的重组蛋白偶联物在抗胰腺癌的药物中的应用。
本发明提供了一种药物输送载体的选择方案，利用天然存在的叶酸受体作为研究对象，应用安全性好。
本发明另一个目的在于提供一种基于叶酸受体和巨胞饮的高效抗肿瘤药物在裸鼠移植瘤模型中的治疗作用。
综上所述，本发明通过化学偶联制备并纯化一种新型的重组蛋白偶联物，该重组蛋白偶联物不仅具有叶酸受体结合能力，并保持了白蛋白通过巨胞饮进入细胞的能力。
本发明的优点在于，利用化学偶联制备并纯化F-HSA-LDP。所获得的重组蛋白偶联物，不仅可以高效的结合叶酸受体及叶酸受体表达的肿瘤细胞表面，并能够通过巨胞饮途径大量进入肿瘤细胞。同时由于对蛋白进行了PEG修饰，有效延长其半衰期。体内实验结果表明重组蛋白F-HSA-LDP能够富集于肿瘤部位，将力达霉素的烯二炔发色团AE组装到F-HSA-LDP上得到强化的F-HSA-LDP-AE，强化的F-HSA-LDP-AE具有显著的AsPC-1裸鼠移植瘤治疗效果，表现出较好的应用前景。
附图说明：
图1为重组蛋白偶联物F-HSA-LDP及强化重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE构建示意图、重组蛋白偶联物F-HSA-LDP纯化及鉴定图
其中：图A为重组蛋白偶联物F-HSA-LDP及强化重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE构建示意图；
图B为重组蛋白偶联物F-HSA-LDP核磁氢谱鉴定结果(上：叶酸-PEG的核磁氢谱，中：HSA-LDP蛋白的核磁氢谱，下：F-HSA-LDP蛋白的核磁氢谱)；
图C为重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的DEAE阴离子层析分离纯化结果(峰1：未反应的叶酸-PEG，峰2：F-HSA-LDP蛋白，峰3：未反应的HSA-LDP蛋白)；
图D为重组蛋白HSA-LDP和重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的SEC-HPLC鉴定结果。
图2为重组蛋白偶联物F-HSA-LDP与FR及肿瘤细胞亲和活性图
其中：图A为ELISA法分析重组蛋白偶联物F-HSA-LDP与FR及3种胰腺癌细胞的亲和活性；
图B为流式细胞术法分析重组蛋白偶联物F-HSA-LDP与3种胰腺癌细胞的亲和活性。
图3为重组蛋白偶联物F-HSA-LDP在体外肿瘤细胞的摄取和体内的靶向能力图
其中：图A为Confocal检测BxPc-3和AsPC-1细胞通过巨胞饮摄取重组蛋白偶联物F-HSA-LDP；
图B为三种蛋白在不同时间点于裸鼠体内分布情况；
图C为HSA-LDP组和F-HSA-LDP组组织器官荧光分布情况。
图4为强化重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE对胰腺癌细胞的体外活性分析图
其中：图A为强化重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE的SEC-HPLC鉴定和MTT法检测强化重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE对3种胰腺癌细胞的增殖抑制作用
图B为FCM检测强化后重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE对MIA和AsPC-1细胞周期阻滞作用；
图C为Western blot检测强化后重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE对MIA和AsPC-1细胞凋亡诱导作用
图D为FCM检测强化后重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE对MIA和AsPC-1细胞凋亡诱导作用。
图5为对照组和给药组对AsPC-1裸鼠移植瘤的抑制作用图
其中：图A为实验过程中，对照组和给药组移植瘤的生长曲线图；
图B为实验过程中，对照组及给药组的裸鼠体重变化曲线图；
图C为H&E染色分析体内给药F-HSA-LDP-AE 1mg/kg对裸鼠各脏器的毒性。
具体实施方式：
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内
实施例1、重组蛋白HSA-LDP在毕赤酵母中的表达及纯化
接种重组蛋白HSA-LDP的表达工程菌株(已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.17450)于BMGY生长培养基(10％酵母提取物，20％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，100mM pH 6.0磷酸钾缓冲液，10％甘油)中，220rpm，30℃培养36h，室温静置或离心收集菌体，将其转移至BMMY诱导培养基(10％酵母提取物，20％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，100mM pH 6.0磷酸钾缓冲液，10％甲醇)，250rpm，28℃诱导表达73h(每24h补加100％甲醇至终浓度为1％)。重组蛋白分泌表达于培养基上清中，离心收集上清，经0.45μm滤膜过滤后，用GE Healthcare公司产品HisTrap亲和层析柱进行纯化，详细操作按照说明书进行。
实施例2、重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的制备及纯化
1.重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的制备
图1-A为重组蛋白偶联物F-HSA-LDP和强化的F-HSA-LDP-AE的构建流程图。叶酸-PEG丙醛(分子量10KDa，纯度>95％)购自上海芃硕生物科技有限公司，氰基硼氢化钠(CH3BrNa)购自Sigma公司。将纯化的HSA-LDP蛋白用pH6.0，10mmol/L醋酸钠溶液配成5mg/ml，称取0.0126g CH3BrNa于10ml上述HSA-LDP溶液中至终浓度为20mmol/L，按摩尔比1:5(HSA-LDP:叶酸-PEG)称取0.038g叶酸-PEG加入上述溶液中，4℃条件下100r/min搅拌反应24h。
2.重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的纯化
反应混合液先对20mM Tris-HCl缓冲液(pH6.5)透析，再将样品上样于同样缓冲液平衡好的DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱。用0.1-0.5mol/L氯化钠梯度洗脱吸附蛋白。反应液经DEAE Sepharose FF分离洗脱后，出现3个完全分离的峰，分别为未反应的F-PEG，反应产物F-HSA-LDP，未反应的HSA-LDP(图1-C)。收集分离后的洗脱峰2，超滤脱盐，采用凝胶柱进行检测，如图1-D，F-HSA-LDP(保留时间RT＝7.084min)和HSA-LDP(保留时间RT＝7.237min)在凝胶柱上的保留时间很接近。将F-PEG，HSA-LDP，F-HSA-LDP冻干粉用D2O溶解，600M核磁检测氢谱。从图1-B可看出，结果显示该偶联物同时具有PEG的特征氢(3.56ppm,-CH2-CH2-O-)以及叶酸的特征氢(4.64ppm,-NH-)，由此推断偶联成功。
实施例3、重组蛋白偶联物F-HSA-LDP与FR蛋白及肿瘤细胞亲和活性分析1.ELISA检测重组蛋白偶联物F-HSA-LDP对FR蛋白及胰腺癌细胞亲和活性
ELISA叶酸受体检测试剂盒购自武汉华美生物公司。胰腺癌细胞BxPc-3，MIAPaCa-2和AsPc-1以1×104个细胞/孔密度接种于96孔板，37℃培养24h，用PBS润洗2次，加入4℃预冷的0.05％戊二醛50μl/孔，放至4℃固定细胞20min，固定后的细胞用PBS润洗3次，甩干残留液体后备用。将预包被叶酸受体的96孔板及细胞固定后的96孔板用5％脱脂牛奶溶液以200μl/孔在室温封闭2h；用PBST缓冲液(PBS中含有0.05％的Tween-20)润洗3次；将重组蛋白偶联物用PBS按照一定比例稀释后加入到96孔板中，每个浓度设3个平行孔，50μl/孔，37℃孵育2h；用PBST润洗3次，加入试剂盒中检测溶液A或抗His-tag单克隆抗体(Abmart公司，1:2500稀释)，50μl/孔，37℃孵育2h；用PBST润洗3次，加入试剂盒中检测溶液B或HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:3000稀释)，50μl/孔，37℃孵育2h；用PBST润洗5次后，加入HRP的底物可溶型单组分TMB溶液(购自北京天根生化科技有限公司)每孔100μl，室温避光反应10-30min，根据显色程度，每孔加入2mol/L的硫酸100μl终止反应，测定450nm处的吸光值。结果如图2-A所示，重组蛋白偶联物F-HSA-LDP与FR具有显著的亲和活性，表明重组蛋白偶联物中的叶酸能够正常发挥其靶向FR的活性；相比之下HSA-LDP与细胞的亲和能力较弱，而LDP则与细胞几乎无亲和作用。AsPc-1,BxPc-3,MIAPaCa-2细胞中LDP几乎无结合活性，HSA-LDP有较弱结合，F-HSA-LDP的结合活性较强。三种细胞中AsPc-1和MIA Paca-2细胞与F-HSA-LDP的亲和力高于BxPc-3细胞。
2.流式细胞术检测重组蛋白偶联物F-HSA-LDP对胰腺癌细胞亲和活性
胰腺癌细胞BxPC-3，MIA PaCa-2和AsPC-1以5×104个细胞/孔密度接种于24孔板，37℃培养24h，用PBS润洗2次，并于4℃条件下预冷15-30min，将FITC标记的重组蛋白偶联物用PBS按照一定比例进行稀释并加至24孔内，4℃继续孵育2h，然后用PBS润洗5次，胰酶消化细胞后用PBS重悬上机检测。结果如图2-B所示，LDP蛋白与胰腺癌细胞几乎无结合；随着HSA-LDP蛋白浓度升高，荧光强度仅有较弱增加，并不明显；而随着F-HSA-LDP浓度的增加，三种胰腺癌细胞的荧光强度均有明显增加，证明与LDP和HSA-LDP相比，F-HSA-LDP与三种胰腺癌细胞的结合能力更强，这与ELISA结果相一致。
实施例4、激光共聚焦法检测胰腺癌细胞对重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的巨胞饮作用
将处于对数生长期的胰腺癌细胞BxPC-3、MIA PaCa-2、AsPC-1以5-8×104个细胞/孔密度接种于8孔腔室盖玻片中，37℃培养24h，将培养液弃尽，用无血清培养基润洗2次，加入由无血清培养基稀释的终浓度为5μM的FITC标记后的F-HSA-LDP，37℃避光培养30min。一组提前60min用终浓度为50μM的巨胞饮特异性抑制剂EIPA进行预处理，加入F-HSA-LDP的同时包含有50mM EIPA；另一组是F-HSA-LDP与巨胞饮指示剂等浓度Dextran共孵育。F-HSA-LDP作用30min后，用PBS润湿3次，4％多聚甲醛室温固定10min，再用PBS润洗5次，滴加含有DAPI染液的抗淬灭剂染色15min，油镜观察拍照。结果如图3A及3B，BxPC-3为K-Ras野生型的胰腺癌细胞株，对F-HSA-LDP的摄取量很低，而AsPC-1为K-Ras突变型细胞株，F-HSA-LDP的摄取量相比BxPC-3高，此外，F-HSA-LDP可以与巨胞饮指示剂Dextran共定位，并且加入巨胞饮抑制剂EIPA后，F-HSA-LDP进入细胞的量明显降低，表明F-HSA-LDP的确是通过巨胞饮途径进入肿瘤细胞内。
实施例5、MTT法检测重组蛋白偶联物F-HSA-LDP及强化后重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE对3种胰腺癌细胞增殖抑制作用
处于对数生长期的胰腺癌细胞BxPC-3，MIA PaCa-2和AsPC-1经胰酶消化后，进行细胞计数，根据细胞的生长速度，每孔2500-5000个细胞，37℃培养24h使细胞贴壁；将强化后的F-HSA-LDP-AE用PBS进行倍比稀释后，每孔加入100μl，每个浓度设三个复孔，同时设立对照组和空白组，37℃培养48h，然后每孔加入20μl浓度为5mg/ml MTT，37℃培养4h，小心弃尽上清，每孔加入150μl DMSO，室温下低速振荡10min，酶标仪测定570nm处的吸光值。按照以下公式计算细胞的存活率：存活率＝(AT-AB)/(AC-AB)×100％，其中AB,AC,AT分别代表空白组、对照组、加重组蛋白组平均A570值。以细胞存活率为纵坐标，重组蛋白浓度为横坐标作浓度反应曲线，并利用SPSS软件计算IC50值。
从MTT结果(图4)可以看出，F-HSA-LDP-AE对3种胰腺癌细胞具有浓度依赖的增殖抑制效果。从表1中可以看出，F-HSA-LDP-AE对肿瘤细胞具有极强的杀伤效果，其活性与LDM相近，IC50在0.006-0.08nM。
表1.LDM、HSA-LDP-AE和F-HSA-LDP-AE对3种胰腺癌细胞的IC50值
Figure GDA0002089724130000081
实施例6、强化后重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE对肿瘤细胞凋亡诱导、周期阻滞作用
1.强化后重组蛋白对BxPC-3，MIA和AsPC-1细胞周期阻滞
将对数生长期的肿瘤细胞BxPC-3，MIA和AsPC-1接种于6孔板，37℃培养24h使其贴壁，加入强化后重组蛋白使其终浓度分别为0.001nM、0.01nM及0.1nM，37℃继续培养24h。将细胞消化成细胞悬液，PBS润洗1次，用预冷的70％乙醇固定细胞2h或过夜固定，PBS润洗1次，每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴避光存放，染色完成后上机检测。从图5A结果中可以看出，F-HSA-LDP-AE能够引起肿瘤细胞G2/M期阻滞。
2.强化后重组蛋白诱导BxPC-3，MIA和AsPC-1细胞发生凋亡
将对数生长期的肿瘤细胞BxPC-3，MIA和AsPC-1接种于6孔板，37℃培养24h使其贴壁，加入F-HSA-LDP-AE使其终浓度分别为0.01nM、0.1nM及1nM，37℃继续培养24h。收集细胞，PBS润洗2次，加入100μl 1×Annexin V Binding Solution将细胞重悬；向细胞悬液中加入5μlAnnexin V,FITC结合物，加入5μlPI，室温下避光培养15min；加入400μl 1×Annexin VBinding Solution重悬细胞，流式细胞仪检测。结果如图5B，随着F-HSA-LDP-AE浓度的升高，细胞发生显著的凋亡，死亡的细胞比例逐渐升高。
将对数生长期的肿瘤细胞MIA和AsPC-1接种于6孔板，37℃培养24h使其贴壁，加入强化后重组蛋白使其终浓度分别为0.01nM、0.1nM及1nM，37℃继续培养24h。收集细胞，加入适量RIPA裂解液，冰上裂解并收集蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂牛奶室温下封闭1-2h，按相应比例稀释相关一抗，4℃孵育过夜；TBST润洗3次，加入与一抗相对应的二抗，继续孵育1-2h，TBST润洗5次，将Millipore公司发光检测液A和B按1:1混合后，加在PVDF膜上进行显色，凝胶成像系统拍照。结果如图5C，经过强化后重组蛋吧处理之后，能够检测到凋亡相关蛋白包括PARP、P53、Capase-3、Bax和Bcl-2发生变化，表明肿瘤细胞发生凋亡。
实施例7、体内活体成像检测重组蛋白偶联物F-HSA-LDP在AsPC-1裸鼠移植瘤模型体内分布情况
重组蛋白偶联物的标记：DyLight 680Antibody Labeling Kit购于Thermo公司，用PBS调节重组蛋白浓度为2.0mg/mL，取0.5mL蛋白溶液加入0.67M的硼酸盐缓冲液40μL，混匀后将全部液体转移至DyLight 680试剂中，轻柔混匀并将液体快速离心至管底，室温下避光反应60min，取两个上下套管组装在一起，加入250μL纯化树脂溶液，1,000×g离心1min，更换新的收集管，将标记好的蛋白溶液250μL加入上套管，1,000×g离心1min，将收集管中标记好的蛋白合并，4℃避光保存。
将人胰腺癌细胞AsPC-1接种至裸鼠右侧腋下。约3周后，肿瘤体积长至500mm3左右，将DyLight 680标记的重组蛋白，分别进行尾静脉注射荷瘤裸鼠，剂量为20mg/kg，于不同的时间点利用XENGOEN(美国Caliper公司)的小动物活体成像仪进行观察拍照，当瘤内荧光很弱时，将裸鼠的主要脏器进行剥离，在活体成像仪下进行拍照。从图中可以看出，F-HSA-LDP能够快速富集于肿瘤部位，并且持续时间长达两周，在其他组织器官分布较微弱，而HSA-LDP组瘤内分布不明显，并且持续时间短，LDP组在48h后就被代谢。结果表明F-HSA-LDP具有显著的肿瘤靶向作用。
实施例8、重组蛋白偶联物F-HSA-LDP及强化后重组蛋白偶联物F-HSA-LDP-AE对裸鼠移植瘤的生长抑制作用
将状态良好的AsPC-1细胞进行传代扩增，将肿瘤细胞进行消化，PBS润洗1次，再重悬于PBS缓冲液中，进行细胞计数，将其密度调整至2×107个/ml。自斯贝福公司购买重量18-20g的雌性BALB/c裸鼠，于裸鼠腋窝皮下每只接种200μL细胞悬液。待瘤块长至约50-100mm3时，按照裸鼠体重和瘤体积进行分组，每组8只，共8组，分别为对照组、20mg/kg F-HSA-LDP组、200mg/kg nab-paclitaxel组、0.1mg/kg LDM组、0.8mg/kg HSA-LDP-AE组、0.25mg/kg F-HSA-LDP-AE组、0.5mg/kg F-HSA-LDP-AE组和1mg/kg F-HSA-LDP-AE组。从接种细胞后的第7天开始通过尾静脉给药，每只180μL，第14天给药第2次，每只180μL，对照组不作处理。实验期间，每2天对裸鼠体重和肿瘤的体积进行测量，并观察裸鼠的精神状态。在第28天将动物处死，并解剖取主要脏器。根据公式V＝ab2/2计算肿瘤体积(a:肿瘤长径，b:肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线及裸鼠体重变化曲线图。如图所示，与对照组相比，20mg/kgF-HSA-LDP组、200mg/kg nab-paclitaxel组、0.1mg/kg LDM组、0.8mg/kg HSA-LDP-AE组、0.25mg/kg F-HSA-LDP-AE组、0.5mg/kg F-HSA-LDP-AE组和1mg/kg F-HSA-LDP-AE组的抑瘤率分别为：44.2％、55.1％、64.5％、86.7％、60.3％、91.2％和94.8％。可以看出，中剂量和高剂量F-HSA-LDP-AE的体内抑瘤效果明显强于LDM组和nab-paclitaxel组。上述各治疗组的小鼠状态良好，体重变化区间在10％以内。实验后取重要脏器进行组织病理学切片染色，未见明显病变，说明该剂量为可耐受剂量。

Claims (8)

1.一种PEG修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能重组蛋白偶联物，其特征在于，所述偶联物由叶酸-PEG、人血清白蛋白HSA和力达霉素辅基蛋白LDP组成，该重组蛋白偶联物具有以下结构：叶酸-HSA-LDP，简称为F-HSA-LDP，
其中，由叶酸-PEG与重组蛋白HSA-LDP通过还原胺化反应形成的偶联物，该偶联物由叶酸-PEG的醛基与重组蛋白HSA-LDP的N末端氨基反应而成。
2.根据权利要求1所述重组蛋白偶联物，其特征是，所述叶酸-PEG不限于叶酸与PEG的偶联物，包括所有能与叶酸受体结合的叶酸类似物与PEG的偶联物。
3.一种制备权利要求1所述的重组蛋白偶联物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的制备：
将重组蛋白HSA-LDP与叶酸-PEG按照摩尔比为1:3-1:20进行胺化反应，
重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的纯化：
将重组蛋白偶联物F-HSA-LDP经过DEAE阴离子层析法分离，即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，偶联反应体系为醋酸盐缓冲液pH6.0，离子强度为10-100mmol/L。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
（1）重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的制备：
将重组蛋白HSA-LDP用pH6.0，10mmol/L醋酸钠溶液配成5mg/ml，然后称取0.0126gCH3BNNa于10ml上述HSA-LDP溶液中至终浓度为20mmol/L，按摩尔比1:3-1:20 =HSA-LDP:叶酸-PEG称取叶酸-PEG加入上述溶液中，搅拌；
（2）重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的纯化：
反应混合液先用pH为6.5的20mM Tris-HCl 缓冲液透析，再将样品上样于同样缓冲液平衡好的DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱，用0.1-0.5mol/L氯化钠梯度洗脱吸附蛋白，即得。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
（1）重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的制备：
将重组蛋白HSA-LDP用pH6.0，10mmol/L醋酸钠溶液配成5mg/ml，然后称取0.0126gCH3BNNa于10ml上述HSA-LDP溶液中至终浓度为20mmol/L，按摩尔比1:5=HSA-LDP:叶酸-PEG称取0.038g叶酸-PEG加入上述溶液中，搅拌；
（2）重组蛋白偶联物F-HSA-LDP的纯化：
反应混合液先用pH为6.5的20mM Tris-HCl 缓冲液透析，再将样品上样于同样缓冲液平衡好的DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱，用0.1-0.5mol/L氯化钠梯度洗脱吸附蛋白，即得。
7.以权利要求1所述重组蛋白偶联物为活性成分与药学上可接受的载体组成的药物组合物。
8.权利要求1所述重组蛋白偶联物在制备抗肿瘤的药物中的应用。
CN201910405541.5A 2019-05-16 2019-05-16 一种peg修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能抗肿瘤重组蛋白偶联物 Active CN110101867B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910405541.5A CN110101867B (zh) 2019-05-16 2019-05-16 一种peg修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能抗肿瘤重组蛋白偶联物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910405541.5A CN110101867B (zh) 2019-05-16 2019-05-16 一种peg修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能抗肿瘤重组蛋白偶联物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110101867A CN110101867A (zh) 2019-08-09
CN110101867B true CN110101867B (zh) 2022-08-05

Family

ID=67490420

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910405541.5A Active CN110101867B (zh) 2019-05-16 2019-05-16 一种peg修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能抗肿瘤重组蛋白偶联物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110101867B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015010615A1 (zh) * 2013-07-23 2015-01-29 四川大学华西医院 一种重组trail蛋白及其制备方法和用途
CN104689330A (zh) * 2013-12-06 2015-06-10 上海交通大学 抗肿瘤药物peg化及其在逆转肿瘤多药耐药上的应用
CN108129569A (zh) * 2017-12-21 2018-06-08 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种基于抗体和巨胞饮的双靶向抗肿瘤重组蛋白的制备及用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1232537C (zh) * 2004-04-23 2005-12-21 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种重链可变区单域抗体强化融合蛋白vh－ldp－ae

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015010615A1 (zh) * 2013-07-23 2015-01-29 四川大学华西医院 一种重组trail蛋白及其制备方法和用途
CN104689330A (zh) * 2013-12-06 2015-06-10 上海交通大学 抗肿瘤药物peg化及其在逆转肿瘤多药耐药上的应用
CN108129569A (zh) * 2017-12-21 2018-06-08 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种基于抗体和巨胞饮的双靶向抗肿瘤重组蛋白的制备及用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Mono-N-terminal poly(ethylene glycol)–protein conjugates";Olaf Kinstler et al.;《Advanced Drug Delivery Reviews》;20021231;第54卷;第477-485页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110101867A (zh) 2019-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110835371A (zh) 抗ccr8单克隆抗体及其应用
JPH06510524A (ja) 免疫原性タンパク質をコードする遺伝子の標的への配達
CN109517045B (zh) 一种改进型低pH插入肽
CN106619515A (zh) 脂质体组合物及其用途
WO2021104414A1 (zh) 一种细胞表面偶联抗体的方法及其应用
US20220356243A1 (en) Anti-claudin 6 Antibody and Antibody-drug Conjugate
EP4309677A1 (en) Pd-l1 and tlr7 double-targeting nanobody coupling drug and use thereof in anti-tumor
JP2015512247A (ja) 光線力学的療法に使用するための新規光免疫複合体
CN107550864A (zh) Eppt多肽‑聚乙二醇‑磷脂复合膜材料、其制备方法及主动靶向脂质体递药系统和应用
TW201511774A (zh) 放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物及其用途
CN108570108B (zh) 肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用
CN114641491A (zh) 人源化抗体及其使用方法
CN110101867B (zh) 一种peg修饰的基于叶酸受体和巨胞饮的双功能抗肿瘤重组蛋白偶联物
JP2022524753A (ja) 電荷修飾グロビンを含む抗腫瘍細胞
CN110759940B (zh) 连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途
CN101475643B (zh) 一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE及其制备方法和应用
US20230346969A1 (en) Intermediate for preparing antibody-drug conjugate (adc), preparation method therefor, and use thereof
CN112156184B (zh) 靶向于egfr的抗体偶联药物、制备方法及应用
CA3224617A1 (en) Anti-trop2 single-domain antibody and use thereof
CN117343197A (zh) 重组融合抗体
US10450349B2 (en) Multivalent fibronectin-integrin binding compositions and methods of use thereof
CN108129569B (zh) 一种基于抗体和巨胞饮的双靶向抗肿瘤重组蛋白的制备及用途
CN107226858A (zh) 干扰素高分子结合体ifn-pmpc的制备及其应用
JP2022530539A (ja) コバルトポルフィリン・リン脂質コンジュゲート及びポリヒスチジンタグを含むナノ構造体
CN107586321B (zh) F-18标记修饰Dimer-San A探针的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant