CN114641491A

CN114641491A - 人源化抗体及其使用方法

Info

Publication number: CN114641491A
Application number: CN202080072096.6A
Authority: CN
Inventors: 的野光洋; 左海顺; 长井彻; 田沼直树; 理查德·别克
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2022-06-17
Also published as: KR20220083785A; AU2020366846A1; JP7291797B2; ZA202205288B; BR112022007271A2; TW202123969A; MX2022004569A; EP4046654A4; JPWO2021075545A1; CA3158326A1; EP4046654A1; US20220144927A1; WO2021075545A1; IL292176A

Abstract

本发明的目的在于提供一种人源化抗体或其抗原结合片段，其具有稳定的物理特性，展示优异的肿瘤积累且能够结合粘蛋白亚型5AC。为解决上述问题，本发明提供了人源化抗体或其抗原结合片段，其具有由SEQ ID NO:1‑4中所示的氨基酸序列或其变体构成的重链可变区和由SEQ ID NO:5‑8中所示的氨基酸序列或变体构成的轻链可变区，并且能够结合粘蛋白亚型5AC。

Description

人源化抗体及其使用方法

[技术领域]

本发明涉及特异性结合粘蛋白亚型5AC (MUC5AC)的人源化抗体或其抗原结合片段，及其使用方法。

[背景技术]

粘蛋白是从动物的上皮细胞等分泌的粘液的主要组分，并且是一种分子量为100-1000万的含有大量糖的糖蛋白。粘蛋白包括由上皮细胞等产生的分泌粘蛋白和具有疏水性跨膜位点并在与细胞膜结合的同时存在的膜结合粘蛋白。粘蛋白的核心蛋白被统称为MUC，并且已知存在至少20种类型的编码核心蛋白的基因。其中之一，MUC5AC，属于分泌型粘蛋白。

MUC5AC在正常组织中的胃和气管中表达，并且已经报道在胰腺癌中的过表达。也已经报道了在甲状腺癌、肝癌、结肠直肠癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胆管癌中的过表达。作为针对MUC5AC的抗体，已经报道了使用从人胰腺癌细胞系SW1990的异种移植物纯化的胰腺癌粘蛋白级分作为抗原制备的小鼠抗体以及基于其产生的嵌合抗体(专利文献1、2、非专利文献1、2)和人源化抗体(专利文献3)。

近年来，已经积极开发了抗体-药物复合物，其中具有抗肿瘤作用的药物与具有对癌细胞的靶向能力的抗体缀合。例如，当假设使用抗体作为抗体-药物复合物的递送工具时，由于抗体需要进一步经受生产步骤(例如，缀合步骤)，因此担心在生产过程期间抗体的变性和聚集。因此，需要生产中使用的抗体具有比一般抗体药物更稳定的作为抗体的特性。从其他方面，当假设使用抗体作为抗体-药物复合物的递送工具时，由于具有极高细胞-杀伤作用的药物在正常组织中的分布导致巨大的副作用，因此需要用于抗体-药物复合物的抗体具有比一般抗体药物更稳定的作为抗体的物理特性和肿瘤组织中更高的积累。

非专利文献1和2中公开的嵌合抗体已被证实在体内以及胰腺癌患者中显示肿瘤积累。由于还观察到肝脏和肾脏中的积累，因此应用于医药产品需要肿瘤积累的进一步改善。非专利文献1、2没有公开关于抗体的物理特性(变性、聚集)的任何信息。

此外，评估非专利文献1、2中公开的嵌合抗体的各种物理特性。作为结果，明确了抗体在加热时容易变性和聚集(低变性中点温度和低聚集起始温度)，并且当假定其用作例如抗体-药物复合物的递送工具时，实用性低。不用说，当抗体用于随后的生产步骤(例如，缀合步骤)中时，最好使用具有尽可能好的物理特性的抗体(不容易引起变性或聚集的抗体)。

专利文献3公开了人源化抗体；然而，其专注于获得对MUC5AC具有高结合活性的人源化抗体，并且没有公开或暗示抗体的稳定性。此外，评估专利文献3中公开的人源化抗体的各种物理特性。作为结果，明确了抗体在加热时容易聚集(聚集起始温度低)，并且当假定其用作例如抗体-药物复合物的递送工具时，实用性低。期望尽可能避免抗体的变性和聚集，因为预期导致化合物的效力降低和副作用发生的风险。已知下文提及的变性中点温度和聚集起始温度也与冷藏等中的长期稳定性相关，并且从不仅在生产步骤期间、而且在储存期间的稳定性的方面来看，期望开发不容易引起抗体的变性或聚集的具有良好物理特性的抗体。

[文献列表]

[专利文献]

专利文献1：JP-A-H7-203974

专利文献2：JP-A-H11-5749

专利文献3：WO 2013/157102

[非专利文献]

非专利文件1：Japanese Journal of Clinical Medicine vol. 64 extra issue1, 2006, p274-278

非专利文件2：Japanese Journal of Cancer Research, 90, 1179-1186, 1999。

[发明概述]

[技术问题]

因此，本发明的问题是提供具有稳定的物理特性、肿瘤积累优异且能够结合粘蛋白亚型5AC的人源化抗体或其抗原结合片段。更具体地，当加热时不容易引起变性或聚集并且能够结合粘蛋白亚型5AC的人源化抗体或其抗原结合片段，以及在肿瘤组织中比在正常组织中显示更高聚集且能够结合粘蛋白亚型5AC的人源化抗体或其抗原结合片段。

[问题的解决方案]

本发明人已经进行了深入研究以试图解决所述问题，并且发现所述问题可以通过以下方式解决。

也就是说，本发明提供了下列内容。

[1]人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体能够结合粘蛋白亚型5AC，并且包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区为

(1) SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加，

(2) SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加，

(3) SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加，或

(4) SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加，

且所述轻链可变区由以下组成：

(5) SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加，

(6) SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加，

(7) SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加，或

(8) SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加。

[2] [1]的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区由以下组成：

(4) SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加。

[3] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

(1)所述重链可变区由以下组成：SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，与SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加，且

(7)所述轻链可变区由以下组成：SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，与SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列具有不小于90%或不小于95%序列同一性的氨基酸序列，或SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列，其中不超过10个或不超过5个氨基酸被缺失、取代或添加。

[4] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列组成。

[5] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列组成。

[6] [1]至[3]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列组成。

[7] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列组成。

[8] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列组成。

[9] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列组成。

[10] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列组成。

[11] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列组成。

[12] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列组成。

[13] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列组成。

[14] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列组成。

[15] [1]或[2]的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区或由重链可变区和轻链可变区组成，

所述重链可变区由SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列组成且所述轻链可变区由SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列组成。

[16] [1]至[15]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是分离的抗体或分离的抗原结合片段。

[17] [1]至[16]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

[18] [1]至[17]中任一项的人源化抗体，其中所述抗体具有不大于20 nm、不大于15 nm、不大于12 nm、不大于11 nm或不大于10 nm的最常见粒径(Pk1 Mode Dia.)。

[19] [1]至[18]中任一项的人源化抗体，其中所述抗体具有不小于50℃、不小于55℃、不小于56℃、不小于57℃、不小于58℃、不小于59℃或不小于60℃的变性中点温度(Tm1)。

[20] [1]至[19]中任一项的人源化抗体，其中所述抗体具有不小于50℃、不小于55℃、不小于60℃、不小于61℃、不小于62℃、不小于63℃、不小于64℃或不小于65℃的聚集起始温度(Tagg)。

[21] [1]至[20]中任一项的人源化抗体，其具有与嵌合抗体的体外结合活性相当或更大的对粘蛋白亚型5AC的体外结合活性。

[22] [1]至[21]中任一项的人源化抗体，其中在施用所述抗体后7天，其在表达粘蛋白亚型5AC的肿瘤组织中的积累是肝组织中的不小于10倍、不小于11倍、不小于12倍、不小于13倍、不小于14倍、不小于15倍、不小于16倍、不小于17倍、不小于18倍、不小于19倍或不小于20倍。

[23] [1]至[22]中任一项的人源化抗体，其中在施用所述抗体后7天，其在表达粘蛋白亚型5AC的肿瘤组织中的积累是肾组织中的不小于10倍、不小于11倍、不小于12倍、不小于13倍、不小于14倍、不小于15倍、不小于16倍或不小于17倍。

[24]组合物，其包含[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段。

[25]药物组合物，其包含[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

[26]用于治疗过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的药物组合物，其包含[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

[27] [26]的药物组合物，其中所述癌症是胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、结肠直肠癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌或胆管癌。

[28] [27]的药物组合物，其中所述癌症是胰腺癌。

[29]抗体-药物缀合物，其包含[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的用于诊断和/或治疗的药物。

[30] [29]的抗体-药物缀合物，其中所述药物是毒素、荧光标记物质、核酸药物、病毒载体、纳米颗粒、低分子量药物或细胞因子。

[31] [29]或[30]的抗体-药物缀合物，其中所述人源化抗体或抗原结合片段和药物通过接头连接。

[32] [31]的抗体-药物缀合物，其中所述接头是一种至几种选自以下的接头：PEG接头、马来酰亚胺接头、PAS化的接头、HES化的接头、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯接头、核酸接头、肽接头、硅烷接头、多糖接头、作为温度敏感或辐照(IR、近-IR、UV)敏感的键的接头、作为pH敏感的键的接头、水解接头以及通过如下产生的接头：共价偶联、酰胺偶联、对碳-碳多键的加成、对叠氮炔的Husgene环加成、Diels-Alder反应、二硫键键合、迈克尔加成、硅烷偶联、尿烷的亲核开环反应、环氧化物、非醛醇羰基化学法和1,3-偶极加成反应或环加成反应诸如甲苯磺酰化。

[33]药物组合物，其包含[29]至[32]中任一项的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体。

[34]核酸，其编码[1]至[23]中任一项的人源化抗体。

[35]表达载体，其包含[34]的核酸。

[36]宿主细胞，其包含[35]的表达载体。

[37]用于产生[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段的方法，其包括

(1) 将编码所述人源化抗体或其抗原结合片段的核酸插入表达载体的步骤，

(2) 通过含有所述核酸的表达载体将上述核酸引入宿主细胞的步骤，

(3) 培养含有所述表达载体的宿主细胞的步骤，和

(4) 通过经由色谱纯化从所述宿主细胞的培养上清液中分离所述人源化抗体或其抗原结合片段的步骤。

[38] [1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段在产生[24]的组合物、[25]至[28]和[33]中任一项的药物组合物或[29]至[32]中任一项的抗体-药物缀合物中的用途。

[39]用于评估细胞或组织中的粘蛋白亚型5AC的表达水平的方法，其包括

(1) 通过将标记物附接至[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段来获得标记的人源化抗体或其抗原结合片段的步骤，其中所述标记物使得能够检测所述抗体或抗原结合片段，

(2) 使所述细胞或组织与标记的人源化抗体或其抗原结合片段接触的步骤，和

(3) 测量与所述细胞或组织结合的标记物的量，和基于此评估所述细胞或组织中表达的粘蛋白亚型5AC的表达水平的步骤。

[40]过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的治疗剂，其包含有效量的药物组合物，所述药物组合物包含[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段，或[29]至[32]中任一项的抗体-药物缀合物，以及药学上可接受的载体。

[41] [40]的癌症的治疗剂，其中所述药物减少癌细胞的数量和/或减小肿瘤的大小。

[42]用于测量受试者中过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的体积的方法，其包括

(2) 使所述受试者的组织和正常组织与标记的人源化抗体或其抗原结合片段接触的步骤，

(3) 测量受试者的组织和正常组织中的标记物的量的步骤，和

(4) 将受试者的组织中测量的标记物的量与作为正常组织中测量的标记物的量的标准量进行比较的步骤，和在其中受试者的组织中测量的量大于标准量的部分中测量癌组织的体积的步骤。

[43]用于诊断受试者是否患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的方法，其包括

(1) 通过将标记物附接至[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段来获得标记的人源化抗体或其抗原结合片段的步骤，

其中所述标记物使得能够检测所述抗体或抗原结合片段，

(2) 使所述受试者的细胞或组织和正常细胞或组织与标记的人源化抗体或其抗原结合片段接触的步骤，

(3) 测量受试者的细胞或组织和正常组织中的标记物的量的步骤，和

(4) 将受试者的细胞或组织中测量的标记物的量与作为正常细胞或组织中测量的标记物的量的标准量进行比较，并且当受试者的细胞或组织中测量的量显著大于标准量时，诊断受试者患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的步骤。

[44] [42]或[43]的方法，其中所述接触步骤在体外进行。

[45]用于测量受试者中过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的体积的方法，其包括

(1) 通过将标记物附接至[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段来获得标记的人源化抗体或其抗原结合片段的步骤，其中所述标记物使得能够检测所述抗体或抗体结合片段，

(2) 检测施用了标记的人源化抗体或其抗原结合片段的受试者的组织中的标记物的步骤，和

(3) 测量其中在上述步骤(2)中发现标记的人源化抗体或其抗原结合片段的积累的部分的体积的步骤。

[46]用于诊断受试者是否患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的方法，其包括

(3) 当在上述步骤(2)中在受试者的组织中发现标记的人源化抗体或其抗原结合片段的积累时，诊断受试者患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的步骤。

[47] [45]或[46]的方法，其中所述检测步骤在体外进行。

[48]用于治疗过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的方法，其包括将有效量的药物组合物施用于患有所述癌症的受试者，所述药物组合物包含[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

[49] [48]的方法，其减少癌细胞的数量和/或减小肿瘤的大小。

[50]用于诊断受试者是否患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的方法，其包括

(2) 从所述受试者和健康受试者收集细胞或组织的步骤，

(3) 使所述细胞或组织与标记的人源化抗体或其抗原结合片段接触的步骤，

(4) 测量所述细胞或组织中的标记物的量的步骤，和

(5) 当从受试者收集的细胞或组织中测量的标记物的量显著大于从健康受试者收集的细胞或组织中测量的标记物的量时，诊断受试者患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的步骤。

[51]用于诊断受试者是否患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的方法，其包括

(2) 将标记的人源化抗体或其抗原结合片段施用于受试者的步骤，

(3) 检测受试者的组织中的标记物的步骤，和

(4) 当在上述步骤(3)中在受试者的组织中发现标记的人源化抗体或其抗原结合片段的积累时，诊断受试者患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的步骤。

[52]用于治疗在[50]或[51]的方法中被诊断为已经患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的受试者的癌症的方法，其包括将有效量的药物组合物施用于所述受试者的步骤，所述药物组合物包含[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

[53]用于治疗和/或诊断过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的试剂盒，其包含[1]至[23]中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段，其具有使得能够检测所述抗体或其抗原结合抗体片段的标记物。

[本发明的有利效果]

本发明人已经进行了深入研究以尝试解决所述问题，并成功地发现了具有结合粘蛋白亚型5AC的能力并且甚至当加热时也不易变性或聚集的人源化抗体，即这样的人源化抗体，其具有上述结合活性，以及具有高变性中点温度和高聚集起始温度，并且显示与正常组织中相比，在肿瘤组织中非常高的积累，其导致本发明的完成。

[附图简述]

图1显示本发明的人源化抗体的重链可变区1 - 4 (H01 - H04)的氨基酸序列。

图2显示本发明的人源化抗体的轻链可变区1 - 4 (L01 - L04)的氨基酸序列。

图3显示专利文献3的人源化抗体的重链可变区5 - 6 (H05 - H06)和轻链可变区5 - 7 (L05 - L07)的氨基酸序列。

图4显示专利文献1的嵌合抗体的重链可变区7 (H07)和轻链可变区8 (L08)的氨基酸序列。

图5是显示实施例3-1(抗体3)的体内肿瘤积累随时间变化的照片。图5的上小图是第一只小鼠的照片，且下小图是第二只小鼠的照片。施用前、施用后1天、施用后2天、施用后3天和施用后7天的小鼠的照片从左起以该顺序显示。

[实施方案的描述]

(1) 本发明的人源化抗体

本发明提供了具有特定重链可变区和特定轻链可变区并且能够结合粘蛋白亚型5AC的人源化抗体及其抗原结合片段。本发明的人源化抗体的特征在于其具有稳定的物理特性并且肿瘤积累优异。除了特定重链可变区和特定轻链可变区之外，本发明的人源化抗体可以进一步具有适当的重链恒定区和适当的轻链恒定区。

在本说明书中，“人源化抗体”是指具有源自非人的互补决定区(CDR)的抗体，其中重链可变区和/或轻链可变区的除了CDR以外的至少一部分已被修饰为更“类似于人”，即更类似于人种系可变序列。互补决定区存在于抗体的重链和轻链的每个可变区中，并且它们从N-末端侧被称为互补决定区1 (CDR1)、互补决定区2 (CDR2)和互补决定区3 (CDR3)。框架区是与可变区中的互补决定区相邻的区域，并且它们从N-末端侧被称为框架区1 (FR1)、框架区2 (FR2)、框架区3 (FR3)和框架区4 (FR4)。

在本说明书中，“抗原结合片段”意指由本发明的人源化抗体的一部分组成且具有结合粘蛋白亚型5AC的能力的抗体片段。构成抗原结合片段的多肽中含有的氨基酸的数目没有特别限制，只要其具有结合粘蛋白亚型5AC的能力即可。

图1显示本发明中重链可变区的氨基酸序列。图1中的重链可变区1 (H01)、重链可变区2 (H02)、重链可变区3 (H03)和重链可变区4 (H04)分别对应于本说明书所附的序列表中的SEQ ID NO:1-4。图1中带下划线的部分是CDR位点。

图2显示本发明中轻链可变区的氨基酸序列。图2中的轻链可变区1 (L01)、轻链可变区2 (L02)、轻链可变区3 (L03)和轻链可变区4 (L04)分别对应于本说明书所附的序列表中的SEQ ID NO:5 - 8。图2中带下划线的部分是CDR位点。

换言之，本发明的人源化抗体的重链可变区由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中任一者中所示的氨基酸序列组成，且轻链可变区由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中任一者中所示的氨基酸序列组成。即，本发明的人源化抗体由上述四个重链可变区(H01-H04)和四个轻链可变区(L01-L04)的组合组成。

本发明的四个重链可变区(H01-H04)和四个轻链可变区(L01-L04)通过如下获得：基于嵌合抗体将粘蛋白亚型5AC-特异性抗体的可变区人源化和设计抗体以改善热稳定性、聚集特性和肿瘤积累。结合抗原所需的CDR位点没有改变。本说明书中的“嵌合抗体”意指专利文献1中公开的嵌合抗体，除非另有描述。

本发明中优选的人源化抗体具有重链可变区H01、H03或H04，以及L01-L04中的任一者作为轻链可变区。

本发明中最优选的人源化抗体具有重链可变区H01和轻链可变区L03。

然而，本发明中的人源化抗体的重链可变区不限于由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列限定的那些，并且还包括维持功能的变体。也就是说，由与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有不小于90%、优选不小于95%、进一步优选不小于98%、最优选不小于99%的序列同一性的氨基酸序列组成的突变的重链可变区也涵盖在本发明中的重链可变区中，只要当与本发明中的轻链可变区组合时，其可以结合粘蛋白亚型5AC。

在本说明书中，氨基酸序列的同一性是指两个目标蛋白之间的氨基酸序列的同一性，并且通过在使用相关技术领域中已知的数学算法准备的氨基酸序列的最佳比对中匹配的氨基酸残基的百分比(%)显示。氨基酸序列的同一性可以通过目视检查和数学计算来确定，并且可以使用本领域技术人员已知的同源性搜索程序(例如，BLAST、FASTA)或序列比对程序(例如，ClustalW)或遗传信息处理软件(例如，GENETYX[注册商标])等来计算。具体而言，本说明书中的氨基酸序列的同一性可以使用DDBJ (日本DNA数据库)的网站上公开的系统分析程序ClustalW (

lang=ja)通过初始设置条件(版本2.1，比对类型：慢，DNA权重矩阵：Gonnet，GAP OPEN：10，GAP EXTENSION：0.1)来确定。

此外，作为本发明中的人源化抗体的重链可变区，由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列组成的突变的重链可变区(其中不超过10个、优选不超过8个、进一步优选不超过5个、最优选不超过3个氨基酸被缺失、取代或添加)也涵盖在本发明中的重链可变区中，只要当与本发明中的轻链可变区组合时，其可以结合粘蛋白亚型5AC。

本发明中的人源化抗体的轻链可变区不限于SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，并且还包括维持功能的变体。也就是说，由与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有不小于90%、优选不小于95%、进一步优选不小于98%、最优选不小于99%的序列同一性的氨基酸序列组成的突变的轻链可变区也涵盖在本发明中的轻链可变区中，只要当与本发明中的重链可变区组合时，其可以结合粘蛋白亚型5AC。

此外，作为本发明中的人源化抗体的轻链可变区，由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列组成的突变的轻链可变区(其中不超过10个、优选不超过8个、进一步优选不超过5个、最优选不超过3个氨基酸被缺失、取代或添加)也涵盖在本发明中的轻链可变区中，只要当与本发明中的重链可变区组合时，其可以结合粘蛋白亚型5AC。

本发明的人源化抗体或抗原结合片段可以是分离的抗体或分离的抗原结合片段。即，本发明的人源化抗体例如分离自用编码本发明的人源化抗体或抗原结合片段的核酸引入的宿主细胞的培养上清液。此类核酸和宿主细胞在后文详述。

此外，本发明的人源化抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

此外，本发明的人源化抗体具有稳定的物理特性并且不易聚集。本发明的人源化抗体的最常见粒径是小的并且具体地不大于20 nm、不大于15 nm、不大于12 nm、不大于11nm或不大于10 nm。当发生抗体的聚集时，检测到许多具有超过100 nm的粒径的抗体。在本说明书中，最常见粒径是指当测量本发明的人源化抗体的粒径分布时最常检测到的粒径。

本发明的人源化抗体的特征之一是加热时不易变性。具体而言，本发明的人源化抗体的变性中点温度为不小于50℃、不小于55℃、不小于56℃、不小于57℃、不小于58℃、不小于59℃或不小于60℃。当本发明的人源化抗体被加热并使抗体变性时，抗体中固有存在的氨基酸的荧光光谱的峰值重心偏移。本说明书中的变性中点温度是指在峰值重心偏移的中点的温度(正常状态和变性状态达到1:1的温度)。

本发明的人源化抗体的特征之一是加热时不易聚集。具体而言，本发明的人源化抗体的聚集起始温度(Tagg)为不小于50℃、不小于55℃、不小于60℃、不小于61℃、不小于62℃、不小于63℃、不小于64℃或不小于65℃。当本发明的人源化抗体被加热并且抗体聚集时，当测量静态光散射时的散射强度变高。在本说明书中，聚集起始温度是指散射光开始变得更强的温度。在以下实施例中，散射光在266 nm处测量。

此外，本发明的人源化抗体特征性地具有对粘蛋白亚型5AC的高体外结合活性。具体而言，本发明的人源化抗体与粘蛋白亚型5AC的体外结合活性相当于或不小于专利文献1中公开的嵌合抗体的体外结合活性。如本文所用，“相当于”可以意指相同，并且也可以意指约不超过2.0倍、不超过1.9倍、不超过1.8倍、不超过1.7倍、不超过1.6倍、不超过1.5倍、不超过1.4倍、不超过1.3倍、不超过1.2倍或不超过1.1倍，或不小于1.0倍、不小于0.9倍、不小于0.8倍、不小于0.7倍、不小于0.6倍或不小于0.5倍的差异。

此外，由于本发明的人源化抗体对粘蛋白亚型5AC具有高结合活性，因此当施用于活体时，它在体内显示在表达粘蛋白亚型5AC的肿瘤组织中的高积累。在本说明书中，“在表达粘蛋白亚型5AC的肿瘤组织中的积累”是指与正常组织相比，本发明的人源化抗体在表达粘蛋白亚型5AC的肿瘤组织中积累多少倍。

在施用本发明的人源化抗体后7天，表达粘蛋白亚型5AC的肿瘤组织中的积累是肝组织中的不小于10倍、不小于11倍、不小于12倍、不小于13倍、不小于14倍、不小于15倍、不小于16倍、不小于17倍、不小于18倍、不小于19倍或不小于20倍。在施用本发明的人源化抗体后7天，表达粘蛋白亚型5AC的肿瘤组织中的积累是肾组织中的不小于10倍、不小于11倍、不小于12倍、不小于13倍、不小于14倍、不小于15倍、不小于16倍或不小于17倍。

(2) 含有本发明的人源化抗体的组合物

本发明提供了含有(1)中所述的本发明的人源化抗体或其抗原结合片段的组合物。含有本发明的人源化抗体的组合物可用于治疗和/或诊断过表达粘蛋白亚型5AC的癌症。

即，本发明是含有本发明的人源化抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的人源化抗体或其抗原结合片段特异性结合粘蛋白亚型5AC，并抑制表达粘蛋白亚型5AC的癌细胞的增殖。因此，本发明的药物组合物可用于治疗过表达粘蛋白亚型5AC的癌症。

待通过本发明治疗的癌症的实例包括胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、结肠直肠癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌，并且特别是可以有效地治疗胰腺癌。

待通过本发明治疗的癌症的实例还包括胆管癌。

存在多个报告指出粘蛋白亚型5AC是CA19-9的抗原载体(PLoS ONE (December2011, Volume 6, Issue 12, e29180, p1-10))。因此，待通过本发明治疗的癌症的实例还包括过表达CA19-9的胆道癌、子宫癌、肺癌和食道癌，并且可以有效地治疗这些。

本发明的药物组合物的剂型没有特别限定，并且例如可以制备口服制剂诸如片剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂等，或肠胃外药剂诸如注射剂、栓剂、外用液体等。本发明中使用的药学上可接受的载体可以是相关技术领域中通常使用的载体，并且可以由本领域普通技术人员考虑剂型和施用途径进行适当地选择。

作为本发明中使用的药学上可接受的载体，例如，赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、保湿剂、防腐剂、抗氧化剂等可用于口服制剂诸如片剂等，并且药物制剂可以根据常规方法配制。此时，本领域普通技术人员可以基于相关领域中的常见技术知识选择例如适当的表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、保湿剂、防腐剂和抗氧化剂。

在肠胃外施用的情况下，注射是典型的。本发明中用于注射剂的药学上可接受的载体可以是例如水溶性溶剂诸如生理盐水、林格溶液等，或水不溶性溶剂诸如植物油或脂肪酸酯等，并且该制剂可以通过在其中溶解而配制。此时，例如，可以任选地添加等渗剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂等来制备制剂。

(3) 其中药物与本发明的人源化抗体连接的抗体-药物缀合物

本发明提供了抗体-药物缀合物，其中用于诊断和/或治疗的药物与(1)中描述的人源化抗体或其抗原结合片段连接。药物的具体实例包括毒素、荧光标记物质、核酸药物、病毒载体、纳米颗粒、低分子量药物和细胞因子。由于本发明的人源化抗体及其抗原结合片段结合粘蛋白亚型5AC，因此它们可以通过与药物形成连接体而有助于过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的诊断或治疗。

当上述药物是能够检测本发明的抗体的标记物、例如用于荧光标记的物质时，本发明的抗体和标记物的连接体可以用作工具用于检测粘蛋白亚型5AC。例如，将与用于荧光标记的物质结合的本发明的抗体施用于活体，且然后可以基于该标记物检测过表达粘蛋白亚型5AC的器官，由此有助于癌症的诊断。甚至当不将其施用于活体时，也可以通过在体外使组织或细胞和与用于荧光标记的物质结合的本发明的抗体接触，来检测从活体收集的组织或细胞中的粘蛋白亚型5AC的表达。后面详细描述使用本发明的抗体诊断癌症的方法。

非限定地，待与本发明的抗体结合的用于荧光标记的物质包括例如荧光蛋白、荧光染料等。荧光蛋白的具体实例包括但不限于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。荧光染料的具体实例包括但不限于荧光素、罗丹明、Cy染料、Alexa Fluor(注册商标)、HiLyte FluorTM、藻红蛋白(PE)和别藻蓝蛋白(APC)。

当上述药物是治疗剂时，可以通过形成连接体来产生具有治疗剂和本发明的人源化抗体两者的作用的药物。可以通过将本发明的人源化抗体与例如具有抗癌作用的毒素、核酸药物、病毒载体、纳米颗粒、低分子量药物或细胞因子连接来实现药物效力的协同增加。

本说明书中使用的“毒素”是包括“细胞毒素”或“细胞毒剂”的概念，并且是指对细胞的生长和增殖有害并且可以起作用以减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任何药物。具体实例包括但不限于蓖麻毒素、皂草素、白喉毒素、假单胞菌毒素等。

本说明书中使用的“核酸药物”是具有作为基本骨架的天然核苷酸或化学修饰的核苷酸的药物，并且是指不经由基因表达而可以直接作用于活体的任何药物。具体实例包括但不限于siRNA、miRNA、反义核酸、诱饵核酸、适体和CpG寡核苷酸。

本说明书中使用的“病毒载体”是指通过将外源基因并入其中复制和增殖能力已经通过基因工程改造缺失的病毒或维持一部分的复制和增殖能力的病毒中，而具有有效引入和表达目标基因的能力的任何载体。具体实例包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒和单纯疱疹病毒。

本说明书中使用的“纳米颗粒”是指能够将药物转运至预定细胞或组织的任何纳米大小的递送载体。具体实例包括但不限于脂质体、纳米胶束和PLGA纳米颗粒。

本说明书中使用的“低分子量药物”是包括“细胞毒剂”、“化疗剂”、“靶向抗癌剂”和“免疫治疗剂”的概念，并且是指可以用于治疗细胞增殖病症诸如癌症等的任何药物。具体实例包括但不限于MMAE、MMAF、DM-1、DM-4、5-氟尿嘧啶、阿霉素、伊立替康、卡奇霉素等。

本说明书中使用的“细胞因子”是指作为由细胞分泌的低分子量蛋白、参与细胞间相互作用和影响周围细胞的任何生理活性物质。具体实例包括但不限于TNF-α、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、白介素-2等。

此外，通过共混抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体，可以提供用于治疗过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的药物组合物，或用于过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的治疗剂。这种药物组合物和治疗剂的实施方案如(2)中的药物组合物所述。这种药物组合物或治疗剂可以减少癌细胞的数量和/或减小肿瘤的大小。

在本发明的一个优选实施方案中，所述人源化抗体或抗原结合片段和药物通过接头连接。此处使用的接头优选地是能够在温和条件下将本发明的抗体与药物有效连接的接头。可用于本发明中的接头的具体实例包括但不限于接头；PEG接头、马来酰亚胺接头、PAS化的接头、HES化的接头、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯接头、核酸接头、肽接头、硅烷接头、多糖接头、作为温度敏感或辐照(IR、近-IR、UV)敏感的键的接头、作为pH敏感的键的接头、水解接头以及通过如下产生的接头：共价偶联、酰胺偶联、对碳-碳多键的加成、对叠氮炔的Husgene环加成、Diels-Alder反应、二硫键键合、迈克尔加成、硅烷偶联、尿烷的亲核开环反应、环氧化物、非醛醇羰基化学法和1,3-偶极加成反应或环加成反应诸如甲苯磺酰化。

(4)编码本发明的人源化抗体的核酸、含有所述核酸的载体、含有所述载体的宿主细胞

本发明提供了编码(1)中所述的人源化抗体或其抗原结合片段的核酸。由于本发明的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列公开于SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:8中，本领域普通技术人员可以获得编码具有所述氨基酸序列的人源化抗体的核酸。当如后面所述，意欲通过使用宿主细胞表达本发明的人源化抗体时，作为其编码核酸的密码子，优选地选择对于在宿主中表达最佳的密码子。

(1)中描述的突变的重链可变区可以通过对编码SEQ ID NO:1-4中所示的重链可变区的核酸进行例如位点特异性诱变(例如，Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20,p. 6487-6500, 1982，其内容通过引用全文并入本文)(这是众所周知的技术)来制备。突变的轻链可变区也可以通过对编码SEQ ID NO:5-8中所示的轻链可变区的核酸进行例如位点特异性诱变来制备。

可以制备并入这种核酸的表达载体。除了编码本发明的人源化抗体的核酸之外，所述载体可以任选地含有改进翻译效率的Kozak序列、当引入宿主时促进本发明的人源化抗体分泌至培养基中的信号序列、启动子序列等。可用于本发明中的载体可以选自相关技术领域中通常使用的那些，并且优选质粒载体，特别是以下实施例中使用的pcDNA3.4。

此外，本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。由于因此获得的宿主细胞含有编码(1)中描述的人源化抗体或其抗原结合片段的核酸，所以其可以用于下述(5)中描述的用于产生人源化抗体的方法中。作为用于将基因引入细胞的方法，可以使用相关技术领域中常规使用的方法，例如，本领域技术人员已知的方法，诸如磷酸钙方法、电穿孔方法、脂质体转染方法、DEAE-葡聚糖方法。特别优选使用脂质体转染方法的引入方法，如在以下实施例中所进行。

作为用于该目的的宿主细胞，可以使用相关技术领域中常规使用的那些。这种宿主细胞的实例包括CHO细胞、293细胞、大肠杆菌、毕赤酵母、Sf9细胞等。目前，用于表达目标蛋白的表达系统试剂盒也是市售的。以下实施例中使用的ExpiCHO系统(Thermo FisherScientific)特别优选用于快速且可靠地表达目标蛋白。

(5) 本发明的人源化抗体的生产方法

本发明还提供了(1)中描述的人源化抗体或其抗原结合片段的生产方法。该生产方法包括将上述(4)中描述的编码本发明的人源化抗体或其抗原结合片段的核酸插入表达载体中，通过含有所述核酸的表达载体将所述核酸引入宿主细胞，在引入所述核酸后培养宿主细胞，和通过纯化手段诸如色谱法等从其培养上清液获得本发明的人源化抗体。

通过培养宿主细胞，将本发明的人源化抗体或其抗原结合片段分泌在培养上清液中是便利且优选的。因此，如(4)中所述，期望设计载体并选择宿主细胞，使得宿主细胞有效地将本发明的抗体分泌至培养上清液中。

本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可以通过使用纯化手段诸如色谱法等从培养上清液获得。作为色谱法的手段，可以使用相关技术领域中已知的各种方法，诸如亲和色谱法、离子交换色谱法、大小排阻色谱法等。特别优选使用以下实施例中使用的使用蛋白A柱的亲和色谱法。

(6) 用于治疗癌症的方法

本发明提供了通过使用(1)中描述的人源化抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。即，可以通过将有效量的含有本发明的人源化抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物施用于患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的受试者来治疗癌症。由于本发明的人源化抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物结合粘蛋白亚型5AC并抑制过表达粘蛋白亚型5AC的癌细胞的增殖，因此可以预期癌症的治疗。此处待施用的药物组合物的剂型和施用途径如(2)中的药物组合物所述。

待通过本发明治疗的癌症的实例还包括胆管癌。

如本文所用，“受试者”是人，或动物，诸如小鼠、大鼠、猴、豚鼠、黑猩猩、绵羊、山羊、狗、猫、猪、牛、马等，优选地人类，但没有特别限制。

如本文所用，“有效量”是可以在受试者中提供癌症治疗的有用效果的量。待施用于受试者的有效量取决于受试者的类型、受试者的体重、剂型(片剂、注射剂等)和施用途径(口服施用、肠胃外施用等)、癌症的严重程度等而不同。医师和兽医可以考虑这些因素，并确定适当的有效量。

通过施用本发明的人源化抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物来治疗癌症，癌细胞的数量减少和/或肿瘤的大小减小。

(7) 用于诊断癌症的方法

本发明提供了通过使用(1)中描述的人源化抗体或其抗原结合片段，或抗体-药物缀合物来诊断癌症的方法。

在一个实施方案中，向本发明的人源化抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物附接使得能够对其进行检测的标记物，从受试者和健康受试者收集细胞或组织，使收集的细胞或组织与本发明的标记人源化抗体接触，测量收集的细胞或组织中的标记物的量，和将与从受试者收集的细胞或组织结合的标记抗体的量和与从健康受试者收集的细胞或组织结合的标记抗体的量进行比较，由此可以进行癌症诊断。当从受试者收集的细胞或组织中检测到的标记物的量大于从健康受试者收集的细胞或组织中检测到的标记物的量时，可以诊断所述受试者已经患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症。

如本文所用，“健康受试者”是明显未患有癌症的健康个体，与本发明中待关于癌症诊断的受试者不同。在此类健康受试者中，粘蛋白亚型5AC没有过表达，并且受试者可以用作对照。

如本文所用，“标记物”意指结合本发明的人源化抗体或其抗原结合片段并使得能够对其进行检测的任何标记物。标记物的具体实例包括用于荧光标记的物质。

在另一个实施方案中，向本发明的人源化抗体或其抗原结合片段附接使得能够对其进行检测的标记物，使受试者的细胞或组织和健康受试者的细胞或组织与本发明的标记的人源化抗体或其抗原结合片段接触，测量受试者的细胞或组织中标记物的量和健康受试者的细胞或组织中的标记物的量，和将受试者的细胞或组织中测量的标记物的量与标准量进行比较，所述标准量是健康受试者的细胞或组织中测量的标记物的量。当受试者的组织或细胞中测量的量显著大于标准量时，所述受试者可以被诊断为已经患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症。

如本文所用，“标准量”是在健康受试者中测量的标记物的量，并且显示在非癌性个体中粘蛋白亚型5AC的表达水平和与细胞非特异性结合或在组织中积累的标记物的量的总和。因此，当在待关于癌症诊断的受试者中测量的标记物的量大于标准量时，提示粘蛋白亚型5AC的过表达。在这种情况下，受试者可以被诊断为已经患有癌症。在该方法中，受试者的细胞或组织和本发明的标记抗体之间的接触可以使用从受试者获取的细胞或组织并在体外实施方案中进行。还可以在体内实施方案中进行受试者的细胞或组织和本发明的标记抗体之间的接触，而无需从受试者取出细胞或组织。

在另一个实施方案中，向本发明的人源化抗体或其抗原结合片段附接使得能够对其进行检测的标记物，从受试者收集细胞或组织，使收集的细胞或组织与本发明的标记的人源化抗体接触，测量收集的细胞或组织中的标记物的量，和将与从受试者收集的细胞或组织结合的标记抗体的量和与正常细胞或组织结合的标记抗体的量进行比较，由此可以进行癌症诊断。当从受试者收集的细胞或组织中检测到的标记物的量大于在正常细胞或组织中检测到的标记物的量时，所述细胞或组织可以被诊断为已经患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症。

如本文所用，“正常细胞或组织”是指从本发明中的待关于癌症诊断的受试者或健康受试者收集的并且被预先诊断为正常细胞或组织的细胞或组织。在这种正常细胞或组织中，粘蛋白亚型5AC没有过表达，并且其可以用作对照。

在另一个实施方案中，向本发明的人源化抗体或其抗原结合片段附接使得能够对其进行检测的标记物，将标记的人源化抗体或其抗原结合片段施用于受试者，在受试者的组织中检测标记物，并且检测到标记抗体的积累，由此可以进行癌症诊断。当在受试者的组织中发现标记的人源化抗体或其抗原结合片段的积累时，所述受试者被诊断为已经患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症。在该方法中，可以使用从受试者获取的组织并在体外实施方案中进行组织中标记物的检测。还可以在体内实施方案中进行受试者的组织中的标记物的检测，而无需从受试者取出组织。

在另一个实施方案中，向本发明的人源化抗体或其抗原结合片段附接使得能够对其进行检测的标记物，并且在施用了标记的人源化抗体或其抗原结合片段的受试者的组织中检测该标记物。当在受试者的组织中发现标记的人源化抗体或其抗原结合片段的积累时，所述受试者可以被诊断为已经患有癌症。

当通过上述方法将受试者诊断为患有过表达粘蛋白亚型5AC的癌症时，可以通过将含有(1)中描述的人源化抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物施用于受试者来治疗癌症。

此处的标记物的具体实例包括由用于荧光标记的物质进行标记，但其没有特别限制，只要可以检测到本发明的人源化抗体或其抗原结合片段即可。抗体和标记物之间的结合可以经由(3)抗体-药物缀合物中描述的接头进行。

(8) 用于测量癌症体积的方法

本发明提供了通过使用(1)中描述的人源化抗体或其抗原结合片段测量受试者中过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的体积的方法。在本说明书中，癌症的体积是指受试者的组织中由癌细胞构成的部分的体积，并且不包括由正常的非癌细胞构成的部分的体积。

在一个实施方案中，向本发明的人源化抗体或其抗原结合片段附接使得能够对其进行检测的标记物，使受试者的组织和健康受试者的组织与标记的人源化抗体或其抗原结合片段接触，和测量受试者的组织和健康受试者的组织中的标记物的量。将受试者的组织中测量的标记物的量与标准量进行比较，所述标准量是在健康受试者的组织中测量的标记物的量，并且其中受试者中测量的量大于标准量的部分是癌组织，并且测量其体积，由此可以测量癌症的体积。

如本文所用，“标准量”是在健康受试者中测量的标记物的量，并且显示在非癌症个体中粘蛋白亚型5AC的表达水平和与细胞特异性结合或在组织中积累的标记物的量的总和。因此，在受试者的组织中标记物的量高于标准量的部分可以被判断为癌组织，并且可以通过测量该部分的体积来确定癌症的体积。

在又另一个实施方案中，向本发明的人源化抗体或其抗原结合片段附接使得能够对其进行检测的标记物，在施用了标记的抗体或其抗原结合片段的受试者的组织中检测标记物，并测量其中发现标记的人源化抗体或其抗原结合片段的积累的部分的体积，由此可以测量癌症的体积。

对于癌症体积的测量，通过使用可以检测标记物的装置来检测标记物诸如用于荧光标记的物质等作为受试者中的图像，并且可以从其中在图像中检测到标记物的癌组织的大小，必要时通过使用适当的计算式来计算体积。体积也可以通过如下确定：从由受试者切除的样品取出组织并直接测量其中检测到标记物的部分的体积。

测量受试者中癌症的体积对于诊断受试者中癌症等的严重程度是有用的。此外，当受试者处于治疗下时，测量受试者中癌症得体积对于确定治疗效果是有用的。

尽管下面参考实施例更详细地描述了本发明，但是本发明不限于这些实施例。

[实施例]

尽管下面通过参考实施例和比较例更具体地描述了本发明，但本发明不限于此。实施例和比较例中的实验方法和测试方法如下。

实验例1：各种抗体的制备

考虑到适合在CHO细胞中表达的密码子使用，将具有向其添加的信号序列的各种可变区的氨基酸序列和各种恒定区的氨基酸序列转化为碱基序列。将Kozak序列添加至信号序列的起始密码子位点，并且将终止密码子添加至恒定区的C-末端侧。此外，将限制酶位点添加至Kozak序列的上游和终止密码子的下游，使得可以将它们引入哺乳动物细胞表达质粒(pcDNA3.4)的表达基因转移位点。以这种方式设计的每个DNA片段都通过化学合成产生。含有可变区的DNA片段和含有恒定区的DNA片段通过融合PCR连接以形成期望的H链和期望的L链。

对产生的各种抗体基因进行限制性处理，且然后进行纯化。类似地，用于哺乳动物细胞中瞬时表达的质粒(pcDNA3.4)也用相同的限制酶处理，且然后纯化。将两个片段以适当的混合比混合并连接。将连接反应溶液与大肠杆菌DH5α感受态细胞混合并转化。从所得的转化体进行菌落PCR、单菌落分离、从小规模培养基提取质粒和确定插入部分的碱基序列，并且选择其中设计的抗体全长基因以如设计的序列按预期方向正确插入的质粒(大肠杆菌克隆)。对选择的大肠杆菌克隆进行大规模培养，并进行质粒提取和纯化，包括内毒素除去步骤。测量纯化质粒在260 nm处的吸光度并计算浓度。

使用ExpiCHO系统(Thermo Fisher Scientific)，进行CHO细胞的瞬时表达。从制备的各H链表达质粒和各L链表达质粒中，选择1条H链和1条L链以达到期望组合，通过脂质体转染方法转染，培养和补料。在转染后7-13天收集培养基。将离心和过滤的培养上清液添加至蛋白A柱中，并通过常规亲和柱色谱法(吸附后洗涤，用酸性缓冲液洗脱，中和洗脱液)纯化抗体。测量纯化抗体在280 nm处的吸光度并计算浓度。

使用上述方法制备抗体1至抗体20。分配给重链可变区和轻链可变区的组合的抗体编号如下所示。

抗体1: H01L01

抗体2: H01L02

抗体3: H01L03

抗体4: H01L04

抗体5: H02L01

抗体6: H02L02

抗体7: H02L03

抗体8: H02L04

抗体9: H03L01

抗体10: H03L02

抗体11: H03L03

抗体12: H03L04

抗体13: H04L01

抗体14: H04L02

抗体15: H04L03

抗体16: H04L04

抗体17: H05L05

抗体18: H06L06

抗体19: H05L07

抗体20: H07L08。

如本文所用，H01、H02、H03和H04是分别在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中显示的重链可变区，且L01、L02、L03和L04是分别在SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中显示的轻链可变区。实施例1-1至1-16中使用的本发明的抗体由上述抗体1至抗体16的重链恒定区1和轻链恒定区1以及重链可变区和轻链可变区的组合组成。

另一方面，H05和H06是专利文献3中公开的人源化抗体的重链可变区，且L05、L06和L07是专利文献3中公开的人源化抗体的轻链可变区。比较例1-1至1-3中使用的专利文献3的人源化抗体是本领域的人源化抗体，其由上述抗体17至抗体19的重链恒定区1和轻链恒定区1以及重链可变区和轻链可变区的组合组成。H05和H06的氨基酸序列显示于SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10中，且L05、L06和L07的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13中。H05和H06的氨基酸序列以及L05-L07的氨基酸序列显示于图3中。

此外，H07是专利文献1中公开的嵌合抗体的重链可变区，L08是专利文献1中公开的嵌合抗体的轻链可变区。比较例1-4中使用的嵌合抗体是本领域的人源化抗体，其由上述抗体20的重链恒定区1和轻链恒定区1以及重链可变区和轻链可变区的组合组成。H07的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:14中，且氨基酸序列L08显示于SEQ ID NO:15中。此外，H07和L08的氨基酸序列显示于图4中。

测试例1：抗体的物理特性评估

将制备的各种抗体用150 mM醋酸盐缓冲液(pH4.7)稀释至约1 mg/mL的抗体浓度。由于比较例1-2的抗体浓度为约0.5 mg/mL，因此其不经稀释即原样使用。使用Uncle (由Unchained Labs Co., Ltd.制造)(其为蛋白物理特性评估装置)测定这些各种抗体溶液的变性中点温度、聚集起始温度和粒径分布。具体而言，对于变性中点温度和聚集起始温度的测量，将各种抗体从室温附近以每分钟1℃加热至75℃，且持续30秒，并且随着时间推移同时进行荧光光谱测量和静态光散射测量。利用当抗体变性时抗体中固有的氨基酸的荧光光谱的峰值重心偏移的现象，从荧光光谱测量的结果，测定峰值重心偏移的中点温度，即，变性中点温度。另外，利用当聚集时散射强度变得更强的事实，从静态光散射测定的结果，获得266 nm的散射光开始变得更强的温度，即聚集起始温度。通过在室温附近对各种抗体进行动态光散射测量来确定粒径分布。

对于抗体1-20，根据测试例1进行各种抗体的物理特性评估。结果显示于表1中。如上所提及，实施例1-1至1-16是本发明的人源化抗体，比较例1-1至1-3是专利文献3的人源化抗体，且比较例1-4是专利文献1的嵌合抗体。

[表1]

。

嵌合抗体的变性中点温度低且为49.5℃，且本发明的人源化抗体的变性中点温度高且为58.5℃-63.5℃。明确了本发明的人源化抗体与嵌合抗体相比具有稳定的物理特性。

嵌合抗体的聚集起始温度最低且为45.4℃，专利文献3的人源化抗体的聚集起始温度中等且为约55.9-61.1℃，且本发明的人源化抗体的聚集起始温度最高且为64.3℃-70.4℃。明确了本发明的人源化抗体与嵌合抗体和专利文献3的人源化抗体相比具有稳定的物理特性。

嵌合抗体的粒径为约203 nm，并且发现明显的聚集。在本发明的人源化抗体中，粒径为约10 nm，并且明确了所述人源化抗体是稳定的，并且作为单分散颗粒存在。

从以上结果，明确了本发明的人源化抗体与专利文献1的嵌合抗体和专利文献3的人源化抗体相比具有更稳定的物理特性。即预期本发明的抗体甚至当经历进一步的生产步骤(例如，与用于荧光标记的物质结合的缀合步骤)时，也可以稳定地获得目标化合物而不引起聚集等。

测试例2：体外结合活性的评估

将各种抗体添加至用各种抗原包被的96孔板，并将板在室温下静置1小时。洗涤板，添加封闭溶液，并将混合物在室温下静置30分钟。洗涤板，添加HRP-缀合的抗人IgG，并将混合物在室温下静置1小时或更长。洗涤板，添加显色试剂(Bethyl Laboratories,Inc.)，并通过微量板阅读器(VersaMax, Molecular Devices, LLC.)测量显色程度。

抗体和抗原之间的结合活性的评估结果显示于表2-表4中。在表2和表3中，将收集自用人胰腺癌细胞系SW1990移植的荷癌模型小鼠的肿瘤块均质化，并且使用离心后的上清液(粗提取物抗原溶液)作为抗原。在表4中，使用通过使用氯化铯的等密度离心从粗提取物抗原溶液获得的粘蛋白级分作为抗原。

对于抗体1-20，根据测试例2评估各种抗体的体外结合活性。结果显示于表2、表3和表4中。

表2显示抗体2-8与抗体1(实施例2-1)的体外结合活性比，表3显示抗体10-16与抗体9(实施例2-9)的体外结合活性比，且表4显示抗体3、4、8、16-19与抗体20(比较例2-4)的体外结合活性比。

如从这些结果可见，明确了本发明的人源化抗体具有与作为专利文献1的嵌合抗体的比较例2-4相当的体外结合活性。通常，嵌合抗体的人源化经常降低与抗原的结合活性。令人惊讶的是，本发明的人源化抗体维持与嵌合抗体相同水平的结合活性。此外，明确了本发明的人源化抗体具有相当于或高于专利文献3的人源化抗体的体外结合活性。

[表2]

。

[表3]

。

[表4]

。

测试例3：体内肿瘤积累的评估

将人胰腺癌细胞系SW1990(1×10⁷个细胞)从侧腹到其背部皮下施用于Balb/c裸小鼠。当移植SW1990后13-16天肿瘤大小达到约100-200 mm²时，从小鼠的尾静脉施用2 mg/kg的各种荧光标记的抗体(n=2)。使用CF(商标)染料SE蛋白标记试剂盒(由Biotium制造)对抗体进行荧光标记。肿瘤体积由以下计算式计算：

肿瘤体积=(肿瘤短轴²×肿瘤长轴)/2。

(肿瘤积累的时间进程评估)

作为体内肿瘤积累的时间进程评估，在施用各种荧光标记的抗体之前、之后1天、之后2天、之后3天和之后7天，使用IVIS LuminaIII (Perkin Elmer Inc.)拍摄由用所述抗体施用的小鼠发射的荧光。

(在最终时间点评估肿瘤积累)

此外，在施用各种荧光标记的抗体后7天，取出肿瘤、肝脏和肾脏并使用IVISLumina III (Perkin Elmer Inc.)进行拍照。使用分析计算机(Living Image软件)分析拍摄的图像数据并获取数值数据。数值计算为图像中指定区域中的平均亮度([p/s/cm²/sr]/[μW/cm²])。

通过以下计算法计算肿瘤积累。此处肿瘤内的积累量是使用上式计算的肿瘤区域内的平均亮度，并且肝脏或肾脏内的积累是使用上式计算的肝脏区域或肾脏区域内的平均亮度。

肿瘤-肝脏比率=施用荧光标记的抗体后7天在肿瘤中的积累/施用荧光标记的抗体后7天在肝脏中的积累

肿瘤-肾脏比率=施用荧光标记的抗体后7天在肿瘤中的积累/施用荧光标记的抗体后7天在肾脏中的积累。

对于抗体3、4、8、9、10、16-20，根据测试例3评估各种抗体的体内肿瘤积累。结果显示于表5和图5中。表5显示各种抗体的体内肿瘤积累(n=2的平均值)。

[表5]

从表5的这些结果，明确了本发明的人源化抗体(抗体3、4、8、9、10、16)具有比专利文献1的嵌合抗体(抗体20)更高的肿瘤-肝脏比率和更高的肿瘤-肾脏比率；即，获得了具有高肿瘤积累的人源化抗体。图5显示表5中具有最高的肿瘤-肝脏比率的实施例3-1(抗体3)的时间进程积累。明确了抗体积累在小鼠的背部右下方的肿瘤中。

如上所述，一般而言，由于嵌合抗体的人源化经常降低对抗原的结合活性，因此体内肿瘤积累也经常减少。令人惊讶的是，已经明确本发明的人源化抗体显示比嵌合抗体高得多的肿瘤积累。

当假设产生与具有非常高的细胞杀伤效果的药物缀合的抗体-药物缀合物时，作为其递送工具的抗体(即，本发明的人源化抗体)的高肿瘤积累是非常有用的，因为它不仅增强抗肿瘤作用，而且有可能减少对正常组织的副作用。

[产业实用性]

在本发明中，已经提供了能够结合粘蛋白亚型5AC的人源化抗体或其抗原结合片段。本发明的人源化抗体具有稳定的物理特性以及对粘蛋白亚型5AC的结合能力，并且肿瘤积累优异。因此，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段对于过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的治疗和/或诊断和进一步，对用于治疗和/或诊断过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的抗体-药物缀合物的生产极端有用。

本申请基于在日本提交的专利申请号2019-191560(申请日：2019年10月18日)，其内容完全并入本文。

Claims

1.能够结合粘蛋白亚型5AC的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：

重链可变区，其由以下组成：

(1) 与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有不少于90%序列同一性的氨基酸序列，

(2) 与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有不少于90%序列同一性的氨基酸序列，

(3) 与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有不少于90%序列同一性的氨基酸序列，或

(4) 与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有不少于90%序列同一性的氨基酸序列，和

轻链可变区，其由以下组成：

(5) 与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有不少于90%序列同一性的氨基酸序列，

(6) 与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列具有不少于90%序列同一性的氨基酸序列，

(7) 与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有不少于90%序列同一性的氨基酸序列，或，

(8) 与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有不少于90%序列同一性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区由以下组成：

(4) 与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有不少于90%序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：

重链可变区，其由以下组成：

(1) 与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有不少于95%序列同一性的氨基酸序列，

(3) 与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有不少于95%序列同一性的氨基酸序列，或

(4) 与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有不少于95%序列同一性的氨基酸序列，和

轻链可变区，其由以下组成：

(5) 与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有不少于95%序列同一性的氨基酸序列，

(6 )与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列具有不少于95%序列同一性的氨基酸序列，

(7) 与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有不少于95%序列同一性的氨基酸序列，或，

(8) 与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有不少于95%序列同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：

(1) 由与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有不少于95%序列同一性的氨基酸序列组成的重链可变区，和

(7) 由与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有不少于95%序列同一性的氨基酸序列组成的轻链可变区。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：

由SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的人源化抗体，其具有与嵌合抗体的体外结合活性相当或更大的对粘蛋白亚型5AC的体外结合活性。

7.组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。

8.药物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

9.用于治疗过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的药物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述癌症是胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、结肠直肠癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌或胆管癌。

11.核酸，其编码根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体。

12.表达载体，其包含根据权利要求11所述的核酸。

13.宿主细胞，其包含根据权利要求12所述的表达载体。

14.用于在根据权利要求13所述的宿主细胞中产生人源化抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：

(1) 将编码根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段的核酸插入表达载体的步骤，

(3) 培养含有所述表达载体的宿主细胞的步骤，和

(4) 通过经由色谱纯化，从所述宿主细胞的培养上清液分离所述人源化抗体或其抗原结合片段的步骤。

15.根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段在产生根据权利要求7所述的组合物或根据权利要求8至10中任一项所述的药物组合物中的用途。

16.用于评估细胞或组织中的粘蛋白亚型5AC的表达水平的方法，其包括：

(1) 通过将标记物附接至根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段来获得标记的人源化抗体或其抗原结合片段的步骤，其中所述标记物使得能够检测所述抗体或抗原结合片段，

17.过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的治疗剂，其包含有效量的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

18.用于测量受试者中过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的体积的方法，其包括：

(2) 使所述受试者的组织和健康受试者的组织与标记的人源化抗体或其抗原结合片段接触的步骤，

(3) 测量所述受试者的组织和健康受试者的组织中的标记物的量的步骤，和

(4) 将受试者的组织中测量的标记物的量与作为所述健康受试者的组织中测量的标记物的量的标准量进行比较的步骤，和在其中所述受试者中测量的量大于标准量的部分中测量癌组织的体积的步骤。

19.用于测量受试者中过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的体积的方法，其包括：

(1) 通过将标记物附接至根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段来获得标记的人源化抗体或其抗原结合片段的步骤，其中所述标记物使得能够检测所述抗体或抗体结合片段，

20.用于治疗和/或诊断过表达粘蛋白亚型5AC的癌症的试剂盒，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其具有使得能够检测所述抗体或其抗原结合抗体片段的标记物。