CN109071606A - 利用IgG结合肽的位点特异性放射性同位素标记抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有能够与放射性金属核素结合的配体的IgG结合肽、用放射性金属核素标记的IgG结合肽、该IgG结合肽与IgG的复合物，以及含有该IgG结合肽或复合物的核医学影像诊断剂或癌症诊断剂等。

Description

利用IgG结合肽的位点特异性放射性同位素标记抗体
技术领域
本发明涉及含有能够与放射性金属核素结合的配体的IgG结合肽、用放射性金属核素标记的IgG结合肽、该IgG结合肽与IgG的复合物，以及含有该IgG结合肽或复合物的核医学影像诊断剂或癌症诊断剂等。
背景技术
一直以来在各种研究与开发中，抗体多用于检测靶标分子，其作为检测试剂及诊断药在产业方面也非常重要。另外，由于抗体针对靶标分子的特异性，因此抗体作为用于疾病治疗的药品也受到关注。
为了附加抗体的功能，有通过碘化和附加螯合化合物(非专利文献1)等进行放射性同位素的标记。现在主要通过抗体中含有的赖氨酸的氨基、半胱氨酸的巯基和活化的羧基等进行这些修饰，它们对官能团有特异性，但非位点特异性，因此存在因对抗体的抗原结合位点进行修饰等而导致抗体活性降低，以及难以控制所结合化合物的数量等问题。
为了克服这些问题，一直使用位点特异性地导入特定官能团的抗体，从而对抗体进行修饰。例如，通过基因工程改造向特定位点导入非天然氨基酸(非专利文献2～4)或游离的半胱氨酸(非专利文献5～6)，由此可以进行特定位点的修饰。这种位点特异性的抗体修饰技术正在开发中，但在很多情况下，需要抗体工程改造抗体本身，但考虑到随着其修饰的抗体功能降低及高开发成本，则未必是有用的方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Rodwell,J.D.et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,1986,83,pp.2632-2636
非专利文献2：Axup,J.Y.et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2012,109,pp.16101-16106
非专利文献3：Tian,F.et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2014,111,pp.1766-1771
非专利文献4：Zimmerman,E.S.et al.,Bioconjugate chemistry,2014,25,pp.351-361
非专利文献5：Shen,B.Q.et al.,Nature biotechnology,2012,30,pp.184-189
非专利文献6：Bernardes,G.J.et al.,Nature protocols,2013,8,pp.2079-2089
发明内容
因此，需要一种能够特异性且简便地修饰抗体的方法。
为了解决上述问题，本发明人等基于IgG结合肽与IgG Fc的复合物X射线晶体结构分析，详细地考察了在结合状态下IgG结合肽的各氨基酸位置与IgG Fc各氨基酸的位置关系。进一步，发现将能与交联剂结合的氨基酸导入到肽中，并利用交联剂修饰该氨基酸，由此可制备利用交联剂以位点特异性地修饰的IgG结合肽，并且能够用该IgG结合肽修饰IgG。另外，本发明人还发现能够将用放射性金属核素标记的IgG结合肽与IgG的复合物用作癌症的诊断剂，从而完成了本发明。
因此，本发明包含以下实施方式：
(1)一种肽，其含有下述式I所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述肽能够与人IgG结合，且含有能够与放射性金属核素结合的配体，
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，且
W是色氨酸残基。
(2)一种肽，其含有下述式I所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述肽能够与人IgG结合，且用放射性金属核素标记，
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，且
W是色氨酸残基。
(3)一种肽，其含有下述式V所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述肽能够与人IgG结合，且通过配体而结合有放射性金属核素，
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
式中，D是天冬氨酸残基，
C是半胱氨酸残基，
G是甘氨酸残基，
L是亮氨酸残基，
W是色氨酸残基，
T是苏氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
Xaa2是丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa3是色氨酸残基或酪氨酸残基，
Xaa4是组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa5是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基或天冬氨酸残基，且
Xaa6是异亮氨酸残基或缬氨酸残基。
(4)一种肽与IgG的复合物，其通过由交联剂修饰Xaa1的上述肽和IgG的交联反应而形成。
(5)一种核医学影像诊断剂或癌症诊断剂，其含有结合有放射性金属核素的(2)或(3)所述的肽或(4)所述的复合物。
(6)一种确定受试对象是否患有癌症的方法，包括以下步骤：
使从受试对象获得的样品与结合有放射性金属核素的(2)或(3)所述的肽或(4)所述的复合物进行反应的步骤；
测定样品中来自放射性金属核素的放射性的水平或存在的步骤；以及
根据放射性的水平或存在，确定受试对象是否患有癌症的步骤。
(7)一种确定受试对象是否患有癌症的方法，包括以下步骤：
对受试对象给予结合有放射性金属核素的(2)或(3)所述的肽或(4)所述的复合物的步骤；
测定受试对象中来自放射性金属核素的放射性的水平或存在的步骤；以及
根据放射性的水平或存在，确定受试对象是否患有癌症的步骤。
本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2016-117395号、2016-227025号的公开内容。
本发明的IgG结合肽能够容易地与放射性金属核素结合，因此通过使用本发明的IgG结合肽，可以利用放射性金属核素特异性且简便地标记IgG。另外，本发明的IgG结合肽无需改变抗体分子的序列，因此不会随着抗体分子基因改变而导致功能降低。此外，无需现有所必需的利用放射性金属核素直接标记IgG的反应，并且不会因该反应导致抗体功能降低。
附图说明
图1(A)表示IgG结合肽(C35A-3/15：DCAYHRGELVWCT(SEQ ID NO:33))与人IgG Fc的复合物结构。用空间填充模型表示IgG结合肽，用带状模型表示IgG Fc，用线状模型表示Fc的糖链。图1(B)表示利用DSG修饰的IgG结合肽(C35A-3/15(R8K)：DCAYHKGELVWCT(SEQ IDNO:34))与IgG Fc的交联结构模型。用带状模型表示肽的主链。肽-Lys8表示C35A-3/15(R8K)的第6位赖氨酸残基，肽-Tyr6-Gly9表示C35A-3/15(R8K)的第4位酪氨酸残基至第7位甘氨酸残基。另外，Fc-Lys248表示按照EU编号的Fc的Lys248，Fc-Pro247-Asp249表示按照EU编号的Fc的Pro247至Asp249。
图2表示标记化IgG结合肽与各种蛋白的混合物SDS-PAGE(A)和蛋白质印迹法(B)的结果。图中，DSG表示供试验用的与DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)反应的IgG结合肽，DSS表示供试验用的与DSS(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)反应的IgG结合肽。另外，图中hIgG表示人IgG，hIgA表示人IgA，HAS表示人血清白蛋白。
图3表示在标记化IgG结合肽与IgG的反应中，反应摩尔比(A)和反应时间(B)的ELISA考察结果。DSS R8K 0min是在IgG的10倍摩尔比的标记化IgG结合肽中加入Tris-HCl(pH7.0)封闭NHS基后，加入孔中而得到的。无DSS R8K(No DSS R8K)使用未结合DSS的生物素化IgG结合(R8K)肽，无肽(no pep)表示未加入肽的对照。
图4表示使用尺寸排除色谱法测定标记化IgG结合肽对各蛋白(hIgA、hIgG、BSA(牛血清白蛋白))的反应性结果。(A)表示测定利用DSS修饰的IgG结合肽的反应性结果，(B)表示测定利用DSG修饰的IgG结合肽的反应性结果。
图5(A)表示向人IgG的Fc溶液中，相对于人IgG以摩尔比为0.5、1.0、2.0或5.0加入溶解于DMF中的经DSG修饰的IgG结合肽，搅拌后在室温下反应后的液相色谱法结果。图5(B)表示使人IgG与经DSG修饰的IgG结合肽在以各摩尔比进行反应时，未反应(波峰2)、1个肽的附加物(波峰3)和2个肽的附加物(波峰4)的生成量的变化。
图6表示相对于以pH4.0(A)、pH5.5(B)或pH7.0(C)制备的人IgG的Fc溶液，以摩尔比为1.0加入溶解于DMF中的经DSG修饰的IgG结合肽，搅拌后在室温下反应，在反应的1、5、10或30分钟后，未反应(波峰2)、1个肽的附加物(波峰3)和2个肽的附加物(波峰4)的生成量的变化。
图7表示[111In]标记曲妥珠单抗-1在给予6小时后的包括肿瘤部位的SPECT/CT图像(A)和CT图像(B)，以及[111In]标记曲妥珠单抗-2在给予4小时后的包括肿瘤部位的SPECT/CT图像(C)。
图8表示[111In]标记曲妥珠单抗-1在给予24小时后(A)和48小时后(B)的包括肿瘤部位的SPECT/CT图像，以及[111In]标记曲妥珠单抗-2在给予24小时后(C)和48小时后(D)的包括肿瘤部位的SPECT/CT图像。
图9表示[111In]标记曲妥珠单抗-1在给予6小时后(A)的包括肝脏的SPECT/CT图像，以及[111In]标记曲妥珠单抗-2在给予4小时后(B)的包括肝脏的SPECT/CT图像。
图10表示实施例9中制备的具有利用二氯丙酮的SS交联结构的IgG结合肽的合成流程。
图11表示[89Zr]标记曲妥珠单抗-1或[89Zr]标记曲妥珠单抗-2在给予6小时后、24小时后和48小时的包括肿瘤部位的PET图像。实线箭头表示HER2高表达肿瘤组织，短划线箭头表示HER2低表达肿瘤组织。
具体实施方式
<IgG结合肽>
在一个实施方式中，本发明涉及一种含有能够与放射性金属核素结合的配体的IgG结合肽。IgG结合肽中的配体位置没有特别限制，例如可以与IgG结合肽的N末端或C末端连接，优选与N末端连接。配体与肽连接的方法是本领域技术人员公知的。例如，当配体与IgG结合肽的N末端连接时，只要将N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、异硫氰基(ITC)、磺酰氯、羧酰氯、环氧乙烷、烷基氯、醛基和羧酸酐等反应基团附加在配体上，使其与IgG结合肽的N末端的氨基反应即可。或者，也可以通过公知的合成法等直接合成含有这种配体的IgG结合肽。
作为能够与本发明IgG结合肽可含有的放射性金属核素结合的配体，可举出但不限于：螯合剂，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、去铁胺、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、二吡哆醛二磷酸(DPDP)、TPPS4、亚乙基二羟基苯基甘氨酸(EHPG)、己二胺四乙酸、二甲基膦甲烷(DMPE)、亚甲基二磷酸、二巯基丁二酸(DMPA)，以及它们的衍生物等。
在一个实施方式中，IgG结合肽中结合有放射性金属核素。作为放射性金属核素的示例，可举出：111In(铟)、89Zr(锆)、67/68Ga(镓)、99mTc(锝)、64Cu(铜)，优选为111In和89Zr。与IgG结合肽结合的放射性金属核素可以根据IgG结合肽和后述的IgG结合肽与IgG的复合物的用途来选择。例如，癌症的检测和诊断可以使用111In、89Zr、64Cu、67/68Ga和99mTc，例如PET(Positron Emission Tomography，正电子发射计算机断层扫描)可以使用89Zr和64Cu，SPECT(Single Photon Emission Computed Tomography，单光子发射计算机断层成像术)可以使用111In和99mTc。
放射性金属核素也可以与IgG结合肽直接结合，优选通过所述螯合剂等配体与IgG结合肽结合。放射性金属核素与配体的优选组合可以由本领域技术人员适当选择(例如请参考樱井弘和横山阳编辑的《放射性药物学概论》(放射薬品学概論))，作为其示例，可举出：111In和DTPA；89Zr和去铁胺；64Cu和DOTA或NOTA；99mTc和二甲基膦甲烷(DMPE)、DTPA、亚甲基二磷酸、二巯基丁二酸(DMPA)、二缩氨基硫脲或二氨基乙二醇；67/68Ga和去铁胺或DTPA衍生物等，优选为111In和DTPA；89Zr和去铁胺；64Cu和DOTA或NOTA，更优选为111In和DTPA；89Zr和去铁胺，进一步优选为111In和DTPA。
下面对本发明的IgG结合肽进行详细说明。
本说明书中使用的“IgG”是指哺乳动物，例如人和黑猩猩等灵长类，大鼠、小鼠和兔等实验动物，猪、牛、马、绵羊和山羊等家畜动物，以及狗和猫等宠物的IgG，优选人的IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本说明书中的IgG进一步优选为人IgG1、IgG2或IgG4，或者兔IgG，特别优选为人IgG1、IgG2或IgG4。
在一个实施方式中，本发明的IgG结合肽含有下述式I所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG结合，
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，且
W是色氨酸残基)。
上述式中，N末端或C末端的X1-3的表述是指除半胱氨酸(C或Cys)之外的独立的任意氨基酸残基X连续有1～3个，组成其的氨基酸残基为相同或不同的残基，优选3个全部由不同的残基的序列组成。同样地，X2也是指除半胱氨酸(C或Cys)之外的独立的任意氨基酸残基X连续有2个，组成其的氨基酸残基为相同或不同的残基，优选该2个连续的氨基酸残基由不同的残基的序列组成。
式I的2个半胱氨酸残基可以通过二硫键形成环状肽。通常，在式I的肽中(当Xaa1为半胱氨酸残基时，则不是Xaa1)，外侧的2个半胱氨酸残基形成二硫键。或者，在式I的肽中，外侧的2个半胱氨酸残基中的硫醚基可以由下式所示的接头进行连接：
[化1]
上述式中的短划线部分是指与硫醚基的结合位点。与通常的二硫键相比，该接头对还原反应等更稳定。因此，例如在使用锆等可使二硫键不稳定的放射性金属核素时，优选使用该接头。
该肽例如可通过以下方法来获得，该方法包括以下步骤：
将含有2个以上半胱氨酸，优选为2个半胱氨酸残基的肽与下式所示的化合物混合，
[化2]
(式中，R1和R2是彼此独立的任意卤素原子)，得到2个以上半胱氨酸残基，优选2个半胱氨酸残基中的硫醚基通过下式所示的接头连接而形成的肽：
[化3]
上述式中的短划线部分是指与硫醚基的结合位点。
在所述化合物中，R1和R2优选选自由F、Cl、Br和I组成的组，更优选选自由Cl、Br和I组成的组。R1和R2优选相同，进一步优选R1和R2均为Cl。
对于本方法中混合步骤的条件，只要是在肽的半胱氨酸残基间发生连接反应的条件，就没有特别限制。例如，可以通过在室温(例如约15℃～30℃)下，将肽与所述化合物在适当的缓冲液如含有盐酸胍的缓冲液中混合进行反应。根据需要，可加入适量的促进连接反应的催化剂进行该混合步骤。
本方法混合步骤中的肽与化合物的混合比例没有特别限制。肽与化合物的摩尔比例如可以设为1:0.2～1:10，优选设为1:0.5～1:5或1:1～1:2。
对于该混合步骤中的混合时间(反应时间)，只要在肽的半胱氨酸残基间发生连接反应，就没有限制，例如可以设为1分钟～5小时，优选设为10分钟～2小时或15分钟～1小时。
根据需要，本方法还可以包括如下步骤：从进行上述步骤之后的混合物中分离杂质，例如未反应的肽和化合物等，并纯化连接有半胱氨酸残基的肽。该步骤可以通过本领域的公知方法进行，例如凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相柱色谱法和HPLC(高效液相色谱法)等色谱法等。
式I肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式I’和式I”所示的肽如下所示。
即，式I’所示的肽含有下式所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I’)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
Y是酪氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
N是天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，且
W是色氨酸残基)。
式I”所示的肽含有下式所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I”)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
A是丙氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
E是谷氨酸残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，且
W是色氨酸残基)。
另外，式I肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式II所示的肽如下所示。
即，式II所示的肽含有下式所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，
W是色氨酸残基，
Xaa3是丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4是酪氨酸残基或色氨酸残基)。
在上述的式I’、式I”和式II肽的氨基酸序列中，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1位和第2位以及第16位和第17位氨基酸残基X可以缺失，这样肽的长度由13个氨基酸组成。
本说明书中使用的“设为17个氨基酸残基时”是在用氨基酸编号命名肽的氨基酸残基时，对于式I的肽，从长度最长的氨基酸17个残基的N末端起依次编号为第1位至第17位，为此而方便表达的术语。
另外，式I肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式III所示的肽如下所示。
即，式III所示的肽含有下式所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
A是丙氨酸残基，
Y是酪氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基或谷氨酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，且
W是色氨酸残基)。
在上述的式III肽的氨基酸序列中，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1位和第2位以及第16位和第17位氨基酸残基X可以缺失，这样肽的长度由13个氨基酸组成。
进一步，上述各式肽的氨基酸序列除半胱氨酸(C)之外的氨基酸残基，即设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1～3、5、6、15～17位各氨基酸残基优选选自以下残基。本文中，各大写字母为氨基酸的单字母符号：
第1位氨基酸残基是S、G、F、R，或者无；
第2位氨基酸残基是D、G、A、S、P、高半胱氨酸，或者无；
第3位氨基酸残基是S、D、T、N、E或R；
第15位氨基酸残基是S、T或D；
第16位氨基酸残基是H、G、Y、T、N、D、F、高半胱氨酸，或者无；
第17位氨基酸残基是Y、F、H、M，或者无。
第5位氨基酸残基是A或T；
第6位氨基酸残基是Y或W。
另外，式I肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式IV所示的肽如下所示。
即，式IV所示的肽含有下式所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(式中，D是天冬氨酸残基，
C是半胱氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，
W是色氨酸残基，
T是苏氨酸残基，
Xaa3是丙氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4是酪氨酸残基或色氨酸残基)。
在以下的1)～18)中列举若干式I肽的具体例，但不言而喻并不限于这些肽：
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:1)；
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:2)；
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(SEQ ID NO:3)；
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:4)；
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:5)；
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:6)；
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:7)；
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:8)；
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(SEQ ID NO:9)；
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:10)；
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:11)；
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:12)；
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:13)；
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(SEQ ID NO:36)；
15)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:14)；
16)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:15)；
17)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:16)；以及
18)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:17)
(式中，Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，Xaa2为高半胱氨酸，优选高半胱氨酸彼此相互形成二硫键)。
作为式I肽的优选具体例，可举出：
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:1)；
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:2)；
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:13)；以及
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(SEQ ID NO:36)，
作为特别优选的示例，可举出2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:2)(式中，Xaa1为赖氨酸残基，Xaa2为高半胱氨酸，优选半胱氨酸和/或高半胱氨酸彼此相互形成二硫键)。
另外，在一个实施方式中，本发明的IgG结合肽作为广义的一级结构，含有下述式V所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中，D是天冬氨酸残基，
C是半胱氨酸残基，
G是甘氨酸残基，
L是亮氨酸残基，
W是色氨酸残基，
T是苏氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
Xaa2是丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa3是色氨酸残基或酪氨酸残基，
Xaa4是组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa5是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基或天冬氨酸残基，且
Xaa6是异亮氨酸残基或缬氨酸残基)。
式V的2个半胱氨酸残基可以通过二硫键形成环状肽。通常，式V肽(当Xaa1为半胱氨酸残基时，则不是Xaa1)的外侧的2个半胱氨酸残基形成二硫键。或者，在式V的肽中，外侧的2个半胱氨酸残基中的硫醚基可以由下式所示的接头进行连接：
[化4]
上述式中的短划线部分是指与硫醚基的结合位点。与通常的二硫键相比，该接头对还原反应等更稳定。因此，例如在使用锆等可使二硫键不稳定的放射性金属核素时，优选使用该接头。该肽可以通过本说明书记载的方法制备。
在以下的18)～29)中列举若干式V肽的具体例，但不言而喻并不限于这些肽：
18)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:18)；
19)DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:19)；
20)DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:20)；
21)DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:21)；
22)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:22)；
23)DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:23)；
24)DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:24)；
25)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:25)；
26)DCTYT(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:26)；
27)DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(SEQ ID NO:27)；
28)DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(SEQ ID NO:28)；以及
29)DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(SEQ ID NO:29)，
(式中，Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸)。
如上所述，本发明涉及的上述式肽的特征在于，在各氨基酸序列中具有间隔的至少2个半胱氨酸(C)残基，并以能够在该半胱氨酸残基间形成二硫键地配置半胱氨酸残基，优选的肽是2个半胱氨酸残基通过二硫键形成环状肽，并在各半胱氨酸残基的N末端侧和C末端侧可以具有1或2个除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基。在各半胱氨酸残基的N末端侧和C末端侧具有1或2个氨基酸残基的情况下，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1～2、16～17位各氨基酸残基为上述例示的氨基酸残基。
如上所述，在本发明的肽中，Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基等蛋白质氨基酸，以及二氨基丙酸和2-氨基辛二酸等非蛋白质氨基酸，优选为赖氨酸残基。Xaa1优选可以利用后述的交联剂修饰。本说明书中“非蛋白质氨基酸”是指在生物体内不用于组成蛋白质的氨基酸。为了提高利用交联剂修饰本发明的肽时的位点特异性，本发明的肽优选在其序列中完全不具有或几乎不具有(例如仅具有1个或2个)与Xaa1相同的残基。例如，在Xaa1为赖氨酸残基的情况下，本发明的肽优选在其序列中除Xaa1之外完全不具有或几乎不具有赖氨酸残基。
本发明的肽与人IgG的结合亲和力与其他人免疫球蛋白(IgA、IgE、IgM)相比高约10倍以上，优选约50倍以上，更优选约200倍以上。关于本发明的肽与人IgG的结合的解离常数(Kd)，可以通过表面等离子共振光谱分析(例如使用BIACORE系统)来确定，例如小于1×10-1M～1×10-3M，优选小于1×10-4M，更优选小于1×10-5M。
本发明的IgG结合肽与IgG的Fc结构域结合。如在后述的实施例中所示，本发明的IgG结合肽在上述Xaa1中靠近IgG Fc的指定区域，即人IgG Fc中按照EU编号的Lys248残基(以下，在本说明书中也简记为“Lys248”，相当于人IgG CH2(SEQ ID NO:30)的第18位残基)或Lys246残基(以下，在本说明书中也简记为“Lys246”，相当于人IgG CH2(SEQ ID NO:30)的第16位残基)，优选靠近Lys248。
本发明的肽可以通过常用的液相合成法、固相合成法等肽合成法；利用自动肽合成仪的肽合成等进行制造(Kelley et al.,Genetics Engineering Principles andMethods,Setlow,J.K.eds.,Plenum Press NY.(1990)Vol.12,p.1-19；Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis(1989)W.H.Freeman Co.；Houghten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:p.5132、《新生化学实验讲座1蛋白质IV》(1992)日本生化学会编，株式会社东京化学同人)。或者，可以通过使用编码本发明肽的核酸的基因重组法或噬菌体展示法等来制造肽。例如，可以将编码本发明肽的氨基酸序列的DNA整合入表达载体中再导入到宿主细胞中培养来制造目标肽。所制造的肽可以通过常规方法进行回收或纯化，例如凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相柱色谱法、HPLC等色谱法、硫酸铵分级沉淀、超滤，以及免疫吸附法等。
在肽合成中，例如准备各氨基酸(不论是天然的还是非天然的)中保护要结合的α-氨基与除α-羧基之外的官能团的氨基酸类，在各自氨基酸的α-氨基与α-羧基之间进行肽键形成反应。通常，先通过适当的间隔基或接头将位于肽C末端的氨基酸残基的羧基与固相结合。选择性地除去这样得到的二肽的氨基末端保护基，在与下一个氨基酸的α-羧基之间形成肽键。连续进行这样的操作，制造侧基有保护的肽，最后，除去所有的保护基，从固相中分离。保护基的种类及保护方法、肽键法的详细内容详细地记载于上述文献中。
利用基因重组法的制造例如可以通过包括如下步骤的方法进行：将编码本发明肽的DNA插入适当的表达载体中，再将载体导入适当的宿主细胞中，培养细胞，从细胞内或从细胞外液中回收目标肽。载体没有限制，例如为质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒和病毒等载体。作为质粒载体没有限制，可举出：源自大肠杆菌的质粒(例如pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、源自枯草杆菌的质粒(例如pUB110、pTP5等)和源自酵母的质粒(例如YEp13、YCp50等)等。作为噬菌体载体没有限制，可举出：T7噬菌体展示载体(T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen))和λ噬菌体载体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等)。作为病毒载体没有限制，可举出例如：逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒和仙台病毒等动物病毒，以及杆状病毒等昆虫病毒等。作为粘粒载体没有限制，可举出Lorist 6、Charomid9-20和Charomid9-42等。作为噬菌粒载体没有限制，例如已知有pSKAN、pBluescript、pBK和pComb3H等。载体中可包含调控序列以表达目的DNA，或者用于筛选含有目的DNA的载体的选择标记物、用于插入目的DNA的多克隆位点等。这种调控序列中包含启动子、增强子、终止子、S-D序列或核糖体结合位点、复制起始位点和多聚A位点等。另外，在选择标记物中，可使用例如氨苄青霉素耐性基因、新霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因和二氢叶酸还原酶基因等。用于导入载体的宿主细胞为大肠杆菌及枯草杆菌等细菌、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞)和植物细胞等，对这些细胞的转化或转染例如包括磷酸钙法、电穿孔法、脂质体转染法、基因枪法(particle gun)和PEG法等。转化细胞的培养按照宿主生物的培养中使用的通常方法进行。例如，大肠杆菌和酵母细胞等微生物的培养液含有宿主微生物可同化的碳源、氮源和无机盐类等。为了容易回收本发明的肽，优选使通过表达生成的肽分泌到细胞外。这可以通过以下方式进行：将编码如下肽序列的DNA与编码目标肽的DNA的5’末端侧结合，所述肽序列的肽是能从其细胞分泌的肽。转移至细胞膜的融合肽被信号肽酶酶切，从而目标肽分泌释放至培养基中。或者，也可以回收聚集在细胞内的目标肽。这种情况下，将细胞物理性或化学性地破坏，并使用蛋白质纯化技术回收目标肽。
因此，本发明还涉及一种编码本发明肽的核酸。本文中，核酸包括DNA或RNA(例如mRNA)。
使本发明的IgG结合肽与其他蛋白融合的情况下，既可以在分别地制备IgG结合肽与其他蛋白之后，根据需要用接头使IgG结合肽与蛋白融合，也可以利用基因重组法根据需要加入适当的接头制作为融合蛋白。这种情况下，优选本发明的IgG结合肽以不破坏与IgG的结合力地制作融合蛋白。
<用交联剂修饰的肽>
在一个实施方式中，本发明中的上述IgG结合肽优选利用交联剂进行修饰。
如上所述，如在后述的实施例中所示，本发明的IgG结合肽在上述Xaa1中靠近IgGFc的指定区域，即人IgG Fc中按照EU编号的Lys248或Lys246，优选靠近Lys248。因此，通过用交联剂修饰本发明的IgG结合肽的Xaa1并与IgG进行交联反应，可以在IgG结合肽的Xaa1与IgG Fc的Lys248或Lys246，优选Lys248之间形成位点特异性的交联结构。如上所述，通过用交联剂和各种化合物修饰本发明的IgG结合肽的Xaa1并与IgG进行交联反应，可以将各种化合物特异性且简便地导入到IgG。另外，根据本发明，可以通过IgG结合肽而导入化合物，因此可以将各种结构的化合物导入到IgG。进一步，本发明的方法也具有如下优点：得到的产物的收率高，此外由于不伴随抗体本身改变，因此使抗体功能降低的可能性低。
本发明的IgG结合肽也可以对除人之外的动物的IgG使用，优选对哺乳动物的IgG使用。这种情况下，阅读本说明书的本领域技术人员，例如通过将人IgG的序列与其他动物的IgG的序列进行比对，可以容易地确定本发明的IgG结合肽结合的IgG中的位点。
在本发明中，“交联剂”是指用于使本发明的IgG结合肽与IgG Fc通过共价键连接的化学物质。本发明的交联剂可以由本领域技术人员适当选择，可以设为具有至少2处能够与所期望的氨基酸(例如赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸，或者二氨基丙酸和精氨酸等)结合的位点的化合物。其示例没有限制，可举出：DSG(disuccinimidyl glutarate，双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、DSS(disuccinimidyl suberate，双琥珀酰亚胺辛二酸酯)等优选含有2个以上琥珀酰亚氨基的交联剂、DMA(dimethyladipimidate·2HCl，己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl，庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DMS(dimethyl suberimidate·2HCl，辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)等优选含有2个以上酰亚胺酸部分的交联剂，以及DTBP(dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate·2HCl、3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)，二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯))等具有SS键的交联剂。
本发明的IgG结合肽可以利用其他功能性物质，例如IgA或VHH等抗体、标记物和/或其他药剂进行修饰。IgG结合肽与其他功能性物质的连接可以通过本领域技术人员所公知的方法，例如叠氮基与二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne)的反应，或者马来酰亚胺基与硫氢基的反应等进行。利用标记物进行标记的情况下，通过本发明的IgG结合肽与IgG形成复合物，可以通过该标记物进行IgG的检测或定量。标记物没有限制，例如包括：上述放射性同位素基金属核素、荧光色素、化学发光色素，以及生物素及GFP(绿色荧光蛋白)等荧光蛋白、发光蛋白，以及过氧化物酶等酶，优选的标记物的示例为荧光素和FITC等荧光素衍生物、罗丹明和四甲基罗丹明等罗丹明衍生物，以及德克萨斯红等荧光色素。将本发明的肽利用其他药剂修饰的情况下，药剂没有限制，例如可举出：澳瑞他汀、美登素、阿霉素、博莱霉素或它们的衍生物等抗癌剂；以及与血脑屏障上的受体结合且可以向中枢神经转移的药剂，或者与癌细胞等结合且抗体可以向细胞内转移的药剂等靶向剂。
本发明的利用交联剂修饰的IgG结合肽，例如可以通过使按照上述<IgG结合肽>的项目中记载的方法得到的IgG结合肽与交联剂反应来制造。这种情况下，需要对IgG结合肽中的上述Xaa1的氨基酸残基的侧链特异性地进行修饰，这可以通过例如选择Xaa1的种类和交联剂的组合进行。例如，由于含有DSS或DSG等琥珀酰亚胺基的交联剂会与存在于赖氨酸残基的侧链和多肽的N末端的伯胺进行反应，因此通过在封闭IgG结合肽的N末端的基础上与DSS或DSG进行反应，可以仅将赖氨酸残基的侧链用DSS或DSG特异性地修饰。这样的氨基酸残基和交联剂的组合可以由本领域技术人员适当选择。
本发明的利用交联剂修饰的IgG结合肽例如也可以通过使用利用交联剂修饰的氨基酸残基进行肽合成来制造。同样地，在用标记物和/或其他药剂修饰IgG结合肽的情况下，可以通过使用加入了这些修饰的氨基酸残基进行肽合成制备用标记物和/或其他药剂修饰的IgG结合肽。
另外，本发明的IgG结合肽例如也可以通过N末端的PEG化(附加聚乙二醇)和C末端的酰胺化等进行修饰，以提高其稳定性等。进行PEG化时，PEG的分子数没有特别限制，例如可以附加1～50个分子、1～20个分子、2～10个分子、2～6个分子，或4个分子的PEG。
<交联反应>
在一个实施方式中，本发明涉及一种生产IgG结合肽与IgG的复合物的方法，其包括将本发明的用交联剂修饰的IgG结合肽与IgG混合的步骤。通过本步骤，在用交联剂修饰的IgG结合肽与IgG之间可产生交联反应。尤其是在IgG结合肽中的上述Xaa1的氨基酸残基与IgG Fc的Lys248或Lys246，优选Lys248之间可以位点特异性地产生交联反应。
对于该混合步骤的条件，只要是在本发明的IgG结合肽与IgG之间产生交联反应的条件下进行，就没有特别限制。例如，可以在室温(例如约15℃～30℃)下，通过将本发明的IgG结合肽与IgG在适当的缓冲液中混合进行反应。根据需要，可加入适量的促进交联反应的催化剂进行该混合步骤。
该混合步骤中的本发明的IgG结合肽与IgG的混合比例没有特别限制。本发明的IgG结合肽与IgG的摩尔比例如可以设为1:1～20:1，优选设为2:1～20:1或5:1～10:1。
该混合步骤中的混合时间(反应时间)只要是在本发明的IgG结合肽与IgG之间产生交联反应，就没有限制，例如可以设为1分钟～5小时，优选设为10分钟～2小时或15分钟～1小时。
生产本发明的IgG结合肽与IgG的复合物的方法根据需要还可以包括如下步骤：从进行上述步骤之后的混合物中分离杂质，例如未反应的IgG结合肽、IgG和试剂等，并将该复合物进行纯化。该步骤可以通过本领域的公知方法进行，例如凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相柱色谱法和HPLC等色谱法等。
<复合物>
在一个实施方式中，本发明涉及一种本发明的IgG结合肽与IgG的复合物。该复合物可通过上述交联反应而形成。因此，本发明优选涉及一种IgG结合肽与IgG的复合物，其是IgG结合肽中的上述Xaa1的氨基酸残基与IgG Fc的Lys248或Lys246，优选Lys248之间通过交联剂位点特异性地结合而成的。
本发明的复合物通过位点特异性的交联反应而形成，因此该交联反应对IgG的活性产生负面影响的可能性少。另外，通过将修饰的IgG结合肽与IgG连接，可以对IgG附加新的功能性。例如，连接附加有111In、89Zr、64Cu、67/68Ga和99mTc等放射性金属核素的IgG结合肽的IgG能够用于癌症的检测和诊断。这种情况下，IgG可根据癌症种类适当选择，例如乳腺癌可使用曲妥珠单抗，大肠癌可使用西妥昔单抗。
<核医学影像诊断剂或癌症诊断剂，以及核医学影像诊断法或确定是否患有癌症的方法>
在一个实施方式中，本发明涉及一种核医学影像诊断剂或癌症诊断剂，其含有与放射性金属核素结合的上述IgG结合肽、用上述交联剂修饰的IgG结合肽，或者用上述交联剂修饰的IgG结合肽与IgG的复合物。
本发明的核医学影像诊断剂能够用于测定生物体内各种物质的分布状况和/或体内动力学。例如，含有本发明的IgG结合肽与IgG的复合物的核医学影像诊断剂能够用于测定作为IgG靶标的炎症标记物等抗原的分布状况，以及IgG抗体本身的体内动力学。
作为成为本发明的癌症诊断剂对象的癌症，没有限制，例如列举有：乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、大肠癌、例如结肠癌、胃癌、宫颈癌、脑肿瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、肺癌、白血病和恶性淋巴瘤等。
本发明的核医学影像诊断剂或癌症诊断剂可以通过口服给予或非口服给予(例如静脉注射、肌肉注射、皮下给予、腹腔内给予、直肠给予或经粘膜给予等)进行给予。另外，本发明的核医学影像诊断剂或癌症诊断剂可根据给予途径制成适当的剂型。具体，可以制备成颗粒剂，片剂，丸剂，胶囊剂，糖浆剂，乳剂，悬浮剂，静脉注射、动脉注射或肌肉注射用的注射剂，滴剂，外用剂或栓剂等各种制剂形态。给予方法和剂型可以由本领域技术人员根据患者的性别、年龄、体重、症状等适当选择。
本发明的核医学影像诊断剂或癌症诊断剂可以按照常规方法进行制剂化(例如请参考《雷明登氏药学全书》(Remington’s Pharmaceutical Science)，最新版，麦克出版公司，伊斯顿，美国)，可以同时含有药学上可接受的载体和添加剂。
作为可在本发明的核医学影像诊断剂或癌症诊断剂中含有的载体和药物添加剂的示例，可举出：水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和作为药物添加剂可接受的表面活性剂等。
实际的添加剂根据本发明的核医学影像诊断剂或癌症诊断剂的剂型从上述中单独或适当组合地选择，但并不限于这些。例如，当作为注射用制剂使用时，可以使用将本发明的IgG结合蛋白或者IgG结合蛋白与IgG的复合物溶解于溶液，例如生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等中，并向其中加入防容器吸附剂，例如Tween80、Tween 20、明胶、人血清白蛋白等而成的制剂。或者，为了制成在使用前进行溶解并重建的剂型，也可以是冷冻干燥所得物，作为用于冷冻干燥的稳定剂，例如可以使用甘露醇、葡萄糖等糖醇和/或糖类。
本发明的核医学影像诊断剂或癌症诊断剂的有效给予量和给予间隔，可以根据患者的性别、年龄、体重和症状等进行适当选择。
在一个实施方式中，本发明涉及一种确定受试对象是否患有癌症的方法，包括以下步骤：
使从受试对象获得的样品与本说明书记载的IgG结合肽，或者IgG结合肽与IgG的复合物进行反应的步骤，并且放射性金属核素与所述IgG结合肽结合的步骤；
测定样品中来自放射性金属核素的放射性的水平或存在的步骤；以及
根据放射性的水平或存在，确定受试对象是否患有癌症的步骤。
在一个实施方式中，本发明涉及一种检测受试对象中的抗原或IgG的方法，包括以下步骤：
使从受试对象获得的样品和本说明书记载的IgG结合肽与IgG的复合物进行反应的步骤，并且放射性金属核素与所述IgG结合肽结合的步骤；
测定样品中来自放射性金属核素的放射性的水平或存在的步骤；以及
根据放射性的水平或存在，检测抗原或IgG的步骤。
通过检测样品中的抗原或IgG，可以推测受试对象中的抗原或IgG的分布状况和/或体内动力学。
作为本方法中使用的样品，列举有组织和生物样品。作为组织的示例，可举出：病变部位，例如乳房、肝脏、胰腺、前列腺、卵巢、大肠、例如结肠、胃、宫颈、骨髓、淋巴结等，例如可以使用这些组织的活检样品。作为生物样品的示例，例如可举出：血液、血浆、淋巴液、组织液、尿液和细胞，例如末梢血细胞、毛母细胞、口腔细胞、鼻腔细胞、肠道细胞、阴道内细胞、粘膜细胞和咳痰(可以包括肺细胞或气管细胞等)，优选血液或血浆。
测定放射性的水平或存在的方法没有特别限制，可以使用本领域技术人员知晓的任意方法。例如，既可以进行SPECT/CT等的图像分析，也可以使用闪烁计数器等检测器来测定放射性的水平或存在。
根据放射性的水平或存在来确定或检测受试对象是否患有癌症的步骤没有特别限制，可以使用本领域技术人员知晓的任意方法。例如，对于来自确定未患有癌症的受试对象的多个，例如2个以上、3个以上、4个以上，优选5个以上的样品，当用于本发明方法的来自受试对象的样品中放射性的水平明显高时，则可以判断受试对象患有癌症的可能性较高。
在一个实施方式中，本发明涉及一种确定受试对象是否患有癌症的方法，包括以下步骤：
对受试对象给予本说明书记载的IgG结合肽，或者IgG结合肽与IgG的复合物的步骤，并且放射性金属核素与所述IgG结合肽结合的步骤；
测定受试对象中来自放射性金属核素的放射性的水平或存在的步骤；以及
根据放射性的水平或存在，确定受试对象是否患有癌症的步骤。
在一个实施方式中，本发明涉及一种检测受试对象中的抗原或IgG的方法，包括以下步骤：
对受试对象给予本说明书记载的IgG结合肽与IgG的复合物的步骤，并且放射性金属核素与所述IgG结合肽结合的步骤；
测定受试对象中来自放射性金属核素的放射性的水平或存在的步骤；以及
根据放射性的水平或存在，检测抗原或IgG的步骤。
本方法优选为核医学影像诊断法。通过本方法，可以推测受试对象中的抗原或IgG的分布状况和/或体内动力学。
本方法中，给予的方法与本发明的核医学影像诊断剂或癌症诊断剂的相关记载相同，故不赘述。另外，关于测定放射性的水平或存在的步骤，以及确定受试对象是否患有癌症的步骤与上述相同，故不赘述。
本说明书中，受试对象的生物种例如可举出：人和黑猩猩等灵长类；大鼠、小鼠、兔等实验动物；猪、牛、马、绵羊和山羊等家畜动物；以及狗和猫等宠物，优选为人。
[实施例]
参照以下的实施例，进一步对本发明进行具体说明，但本发明的范围并不受这些实施例限制。
[实施例1：IgG结合肽与IgG的复合物X射线晶体结构分析]
<方法>
(1)IgG结合肽溶液的制作
通过利用F-moc法的肽固相合成法，按照常规方法制备具有G(HC)DCAYHRGELVWCT(HC)H-NH2的序列(SEQ ID NO:31，其中，HC为高半胱氨酸，第4位和第14位2个Cys、第2位和第16位2个高半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)的环状高半胱氨酸肽。将制备的0.8mg的IgG结合肽粉末溶解于24μL的100％二甲基亚砜(和光纯药)中，制备IgG结合肽溶液。
(2)Fc与IgG结合肽的复合物的制作
在含有10mM EDTA和1mM L-半胱氨酸的20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，在37℃下使用木瓜蛋白酶(罗氏公司制)酶切人IgG(中外制药)的铰链(hinge)部分。接着，使用阳离子交换色谱柱(TSKgel SP5-PW(东曹))，流速为1mL/min，在20mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)中，通过0M-0.3M NaCl的梯度洗脱并纯化人IgG Fc。将63μL含有16mg/mL人IgG Fc的溶液(0.1M氯化钠(和光纯药)、0.04M 2-吗啉代乙烷磺酸(和光纯药)(pH6.0))与上述(1)中制作的2μL的IgG结合肽溶液混合，制备Fc与IgG结合肽的复合物溶液。
(3)Fc与IgG结合肽的复合物的结晶的制作
Fc与IgG结合肽的复合物的结晶通过坐滴气相扩散法得到。即，上述(2)中制作的Fc与IgG结合肽的复合物物溶液0.3μL与结晶剂(20％聚乙二醇3350(Sigma-Aldrich)、0.2M碘化钾(和光纯药)(pH6.9))0.3μL，使用结晶用机器人HydoraII+(Matrix公司制)，在Intelli结晶板(VERITAS公司制)的S1孔上混合，制成结晶滴。分注上述结晶剂70μL作为储藏溶液。将结晶板用PowerSeal CRISTAL VIEW(Greiner Bio-One公司制)密闭后，在20℃的恒温槽内静置约2周，得到结晶。
(4)Fc与IgG结合肽的复合物的结晶的X射线衍射强度数据的收集
将上述(3)中得到的结晶移至稳定母液(22％聚乙二醇3350、0.2M碘化钾、0.1M氯化钠、25％甘油(w/v)、0.04M 2-吗啉代乙烷磺酸(pH6.0))，通入-170℃的氮气流快速冷冻，用振动法测定X射线衍射数据。用X射线的波长为1埃、振动角为1°/帧实施。接着，使用衍射强度数据处理程序HKL2000(HKLResearch公司制)，以分辨率3.0埃对衍射强度数据进行处理。其结果是结晶的空间群为P21，格子常数为a＝66.1埃、b＝60.5埃、c＝69.5埃，α＝γ＝90°、β＝101.3°。得到的数据的完整度(Completeness)为99.9％，Rmerge为13.8％。
(5)Fc与IgG结合肽的复合物的晶体结构的确定
对DCAYHRGELVWCT(SEQ ID NO:33)，将上述(4)中得到的衍射强度数据尝试利用CCP4(Collaborative Computational Project Number 4)中所含的程序Phaser进行分子置换法的位相确定。分子置换法的搜索模型利用在蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB,URL:http://www.rcsb.org/pdb/)中注册为PDB accession code：1DN2的Fc部分的模型。其结果是可以在非对称单元中发现1个分子的模型。接着，重复实施使用CCP4中所含的结构精密化程序Refmac5的结构精密化和使用模型构建程序X-tal view的模型的修正，得到Fc与IgG结合肽(DCAYHRGELVWCT(SEQ ID NO:33))的复合物的晶体结构。在Fc的肽结合位点观测到相当于IgG结合肽的电子密度。确定的晶体结构的精确性指标R因子为0.216。进一步，在精密化的阶段根据相当于未纳入计算的全部反射的5％的结构因子计算的自由R因子(Rfree)为0.317。
(6)交联结构模型的创建
根据上述X射线结晶分析的结构，在计算科学软件MOE(Molecular OperatingEnvironment)上创建交联结构模型。将DCAYHRGELVWCT(SEQ ID NO:33)的第6位氨基酸置换为Lys之后，以在该Lys的ε氨基与抗体Fc的第248位Lys的ε氨基之间连接的形式，将DSG或DSS的交联结构进行模型化。
<结果>
如图1A所示，认为IgG结合肽结合在与蛋白A的结合位点重叠的CH2与CH3结构域的边界区域，并且以与已经报道的IgG结合肽Fc-III(DeLano,W.L.et al.,Science,2000,287,pp.1279-1283)类似的形式与IgG结合。IgG结合肽与Fc的特征性的相互作用为IgG结合肽的第8位残基Arg的侧链的胍基以2.91埃与Fc的Glu380(按照EU编号，以下相同)的侧链的羧酸进行盐结合这一点。该Glu380的侧链在人IgG Fc中，与Lys248进行盐结合而形成分子内的盐结合的网络，IgG结合肽的Arg8和Fc的Lys248通过与Fc的Glu380的相互作用而接近。因此，考虑将IgG结合肽的第8位残基Arg置换为Lys，以与该盐结合的网络结构类似的形式将肽的Lys8与抗体的Lys248的侧链的氨基用交联剂进行交联。实际上，根据IgG结合肽与人IgG Fc的复合物结构，创建DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)或DSS(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)的交联结构模型，结果认为空间上也可以不伴随抗体的主链结构变形地导入交联剂(图1B)。
[实施例2：标记用肽的制备与特性]
<方法>
利用Fmoc固相合成法并按照常规方法，合成用生物素(Biotin)或5/6-田村琥珀酰亚胺酯(TAMURA succinimidyl ester)(AnaSpec公司)(荧光色素)对氨基修饰的氨基-PEG4化合成肽GPDCAYHXGELVWCTFH(SEQ ID NO:2)(其中，C末端为酰胺化)。除去保护基之后，在pH8.5的水溶液中在氧化条件下形成分子内S-S键，使用反相HPLC，流速为1.0ml/min，通过含有0.1％的TFA的10％至60％的乙腈的梯度洗脱，纯化具有分子内S-S键的肽。
将含有1mM的经纯化的IgG结合肽的DMF溶液100μL与100mM的DSS或DSG(赛默飞世尔科技公司)的乙腈溶液100μL混合后，在室温下反应过夜。将反应物用0.1％TFA稀释至2.5倍之后，注入到沃特世公司制的μ-Bondasphere 5C18 100埃(直径3.9mm×150mm)中，用含有0.1％TFA的4％至60％的乙腈的梯度进行洗脱。对得到的生成物加成交联剂，在连接BEH300C18(1.7μm、直径2.1mm×50mm)色谱柱的液质联用系统(LC-Mass spectrometry)(Acquity SQD UPLC system，沃特世公司)上用含有0.1％甲酸的4％至60％的乙腈的梯度进行洗脱，通过测定波峰的分子量进行确认。
得到的标记试剂肽的亲和力分析是在通过加入十分之一量的1M Tris-HCl(pH＝7.0)反应15min将NHS基水解后，用以下的方法进行的。在安装在BIAcoreT200(GEHealthcare)的CM5传感器芯片上，将0.4M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)与0.1M磺酸基-NHS(Sulfo-N-hydroxysuccinimide，磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺)等量混合后，以10μl/ml的流速注射7分钟到传感器芯片，激活传感器芯片，在pH4.0(10mM醋酸钠)的条件下，固定量按RU值计为4000～5000的方式固定IgG。在使用HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.005％Tween 20、3mM EDTA、pH7.0)的同时，通过流速50μl/ml注射180秒从10nM至2μM的浓度的肽监控结合反应，然后通过用缓冲液洗涤600秒来对解离反应进行测定。结合参数的分析使用BIAevalution T100软件进行。
<结果>
为了考察导入交联结构是否对IgG结合肽的特异性和亲和力产生影响，通过SPR分析对导入交联结构的IgG结合肽与IgG的结合力进行测定(表1)。将第8位残基的精氨酸置换为赖氨酸的IgG结合肽(以下也称为I型(R8K))针对人IgG的亲和力为131nM(Kd)，与置换前的IgG结合肽(以下也称为I型)相比，亲和力降低10倍。在I型(R8K)肽上结合各交联剂的物质中，针对IgG的亲和力，I型(R8K)-DSG-OH约为330nM(Kd)，I型(R8K)-DSS-OH约为390nM(Kd)，未见交联剂结合导致的亲和力的明显减少。即使是对任一种肽，也具有Kd值为μM以下的亲和力，因此认为可以进行充分特异性的标记化。
[表1]
I型(R8K)与各交联剂结合肽的水解产物的亲和力(全部使用将肽的N末端用生物素化
PEG4封闭的产物)。I型(R8K)-DSG-OH、I型(R8K)-DSS-OH表示在I型(R8K)中对导入的
交联剂的NHS基进行水解的产物。
[实施例3：利用IgG结合肽的人IgG-Fc的特异性修饰]
<方法>
通过与实施例2相同的方法制备对在N末端附加生物素-PEG4的IgG结合肽(I型(R8K))用DSS或DSG修饰的标记化试剂肽，使其与人IgG Fc反应，考察人IgG Fc的标记化反应。即，通过与实施例2相同的方法利用反相柱对与过量的DSS或DSG反应的IgG结合肽(R8K)(200pmol/5μL于0.1％TFA)进行纯化之后，减压除去乙腈，然后加入约1/8的0.5M Na2HPO4进行中和，立即以摩尔比10倍量加入蛋白样品(hIgG(中外制药)、hIgA(Athens Research&Technology)、HSA(Sigma-Aldrich)，或者血清(采自健康人))(各为40pmol/5μL，血清用PBS稀释10倍)中，用PBS使最终量为20μL之后，在室温下放置5分钟。然后，加入1M Tris-HCl(pH＝7.0)1μl使反应停止后，加入4×SDS样品溶液6.7μl和2-巯基乙醇1.4μl(最终量的5％)，在95℃下处理10分钟后，使用5％-20％的预制凝胶SuperSepTMAce(和光纯药)进行SDS-PAGE电泳。泳动后的凝胶使用Hoefer半干转印电泳仪TE70(Hoefer Semiphor TE70)Trans-Blot系统，以35mA、60分钟转印到PMDF膜之后，用0.5％BSA进行封闭。用生物素化肽标记的蛋白使用HRP-SA共轭物(稀释1000倍，Vector Laboratories)并利用化学发光试剂(Immunostar(注册商标)Basic，和光纯药)进行检测。
<结果>
如图2B所示，在蛋白质印迹法中，仅在与IgG反应的情况下，可观察到视为复合物的条带，因此可知：与DSG或DSS反应的IgG结合肽均不与IgA及HAS、血清中的除IgG之外的蛋白结合，而选择性地与IgG结合。
[实施例4：针对IgG的IgG结合肽的反应条件的考察]
<方法>
(1)反应摩尔比的考察
在96孔微孔板(Nunc(注册商标)MaxiSorp)的孔中，将含有各蛋白(IgG(中外制药)、IgA(Athens Research&Technology)，或者牛明胶(Bovine gelatin)(和光纯药))(50ng(0.33pmol)/μl/孔)的0.1M NaHCO3溶液加入微孔板中，在室温下放置过夜，由此使各蛋白吸附在微孔板的表面，用0.5％BSA进行封闭之后，在各孔中加入用与实施例2同样地制备的用DSG修饰的生物素化IgG结合肽(摩尔比为0、1、2、5、10)，经过1小时后，加入1M Tris-HCl(pH7.0)3μL，使反应停止。加入用0.5％BSA稀释2000倍的SA-HRP(VectorLaboratories)50μL，在室温下反应1小时后，用0.1％PBST洗涤5次后，对HRP的发色使用TMB溶液(Wako Chemicals)，进行5分钟的显色反应后，用ELISA板阅读仪(680型微孔板阅读仪(Bio-Rad))测定450nm处的吸光度。
(2)反应时间的考察
用50ng/50μL的溶液对在4℃下固定过夜的hIgG(50ng)，以摩尔比为2加入用DSG修饰的生物素化IgG结合肽，在各反应时间(0～60分钟)内加入1M Tris-HCl(pH7.0)3μL，使反应停止。结合的检测与(A)同样地进行。
<结果>
使用DSS标记化IgG结合肽，利用ELISA对与抗体反应的摩尔数和反应时间的不同导致的反应效率进行考察(图3)。即，使在塑料微孔板上固定的IgG结合肽的摩尔比从1变化至10并与hIgG反应，结果在大致摩尔比为5时可看到饱和，由此认为：如果加入摩尔比为5左右的肽试剂，则对抗体的标记化充分(图3A)。在没有用DSS修饰的生物素化IgG结合(R8K)肽(无DSS R8K)中，可看到非常弱的结合，其认为是用非共价键结合的肽导致的结合活性。进一步，即使过量地加入标记化IgG结合肽试剂，也完全未检测出对其他蛋白(hIgA、牛明胶(Bovine gelatin)或用作封闭剂的BSA)的结合。
接着，对以IgG与IgG结合肽的摩尔比为1:2进行反应时的反应时间进行考察。其结果是约15分钟可看到饱和，因此认为反应在15分钟内基本结束(图3B)。
以上结果表明：用交联剂修饰的本发明的IgG结合肽在短时间内特异性地与IgG结合。
[实施例5：利用荧光IgG结合肽的Fc的标记化]
<方法>
使IgG(中外制药)、IgA(Athens Research&Technology)或BSA(Sigma-Aldrich)(15μg：换算IgG为100pmol)和按照实施例2制备的DSG交联肽或DSS交联肽(500pmol)在200μL中在室温下反应60分钟，加入1M Tris-HCl(pH＝7.0)10μL，使反应停止。然后，用SuperdexTM20010/30GL直径1.0cm×30cm(GE Healthcare)；流速：0.3ml/min；电泳缓冲液：PBS pH7.4进行尺寸排除色谱法，使用RF-10A荧光检测器(岛津制作所)(激发光：541nm，荧光：565nm)进行测定。
<结果>
使DSS或DSG反应而形成的标记化IgG结合肽以相对于各蛋白的摩尔比为1:5地与蛋白在室温下反应60分钟，利用尺寸排除色谱法进行分析。即使使用任一种标记化IgG结合肽(DSS或DSG)，对IgG的反应性的特异性也为同等程度，完全未检测出对hIgA和BSA等其他蛋白的荧光标记化(图4)。由上述可知：即使使用制作的任一种IgG结合肽，也具有高特异性，可以荧光标记人IgG。
[实施例6：利用IgG结合肽的Fc的修饰物的分析(pH4.5)]
<方法>
加入人IgG(中外制药)的Fc溶液(20μM、0.1M醋酸缓冲液pH4.5)200μL和溶解于DMF中的通过与实施例2相同的方法经DSG修饰的IgG结合肽(RGNCAYHXGQLVWCTYH(SEQ ID NO:35)，X为赖氨酸)(4mM)0.5、1.0、2.0、5.0μL(摩尔比为0.5、1.0、2.0、5.0)，快速搅拌后，在室温下反应15分钟，加入1M Tris-HCl(pH7.0)10μL，使反应停止。将反应物50μL注入到连接Shodex IEC SP-825柱的NGC Chromatography system(Bio-Rad)，进行从25mM醋酸缓冲液(Acetate buffer)(pH4.5)至含有1M NaCl的25mM醋酸缓冲液(pH4.5)的梯度洗脱，通过215nm处的吸光度监控蛋白的洗脱。分别收集得到的各波峰部分，用于利用LC/MS的分子量测定。
在连接Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm 2.1mm×100mm)柱的ShimadzuLCMS-8030中注射20μL所得到的波峰洗脱液之后，进行从含有0.1％甲酸的4％乙腈至含有0.1％甲酸的60％乙腈的梯度洗脱。进行所洗脱的波峰的质谱分析，通过由使用分析软件的多价离子波峰的解卷积(deconvolution)计算质量。
<结果>
使人IgG1-Fc与经DSG修饰的IgG结合肽(4mM、生物素-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH2；分子量2760，X为经DSG化的赖氨酸，2个Cys形成分子内SS键)以摩尔比为0.5、1.0、2.0或5.0进行反应，结果如图5A所示，出现原来的人IgG1-Fc的洗脱位置的波峰(波峰2)和2个波峰3、4(波峰1认为是经DSG化的IgG结合肽)。为了鉴定这些分子种类，进行LCMS分析。反应前的IgG1-Fc在离子交换色谱中在波峰1时被洗脱，在LCMS分析中，可得到55084的值。对反应后的2、3、4的波峰进行LCMS分析，结果分别可得到55087、57735(55087+2648)、60384(55087+5297)的值。由此可知：反应后的波峰2为未反应的Fc，波峰3和4在Fc上分别结合1个和2个肽。
图5B是各以摩尔比进行反应时，将未反应(波峰2)、1个肽的附加物(波峰3)、2个肽的附加物(波峰4)的生成量的变化予以图表化的图。可知：例如即使在以摩尔比为1:1进行反应的情况下，未反应物为20％以下，在摩尔比为1:2中，未反应物为10％以下，产量也非常高。另外可知：即使在过量的摩尔比为1:5的情况下，2个肽的附加物的生成比例也相对地增加，但附加上述摩尔比以上肽的Fc在离子交换色谱上未被检测出，因此该标记反应非常有特异性。
[实施例7：pH与反应时间对于利用IgG结合肽的Fc的反应的影响]
<方法>
对用pH4.0(25mM醋酸缓冲液)、pH5.5(25mM醋酸缓冲液)或pH7.0(PBS)制备的人IgG的Fc溶液200μL，加入实施例5中制备的溶解于DMF中的经DSG修饰的IgG结合肽(4mM)1.0μL(摩尔比为1.0)，快速搅拌后，在室温下反应。在反应后1、5、10或30分钟时加入1M Tris-HCl(pH7.0)10μL，使反应停止，将反应物50μL注入到连接Shodex IEC SP-825柱的NGC层析系统(Bio-Rad)，进行从25mM醋酸缓冲液(pH4.5)至含有1M NaCl的25mM醋酸缓冲液(pH4.5)的梯度洗脱，通过215nm处的吸光度监控蛋白的洗脱。根据得到的色谱，计算各波峰的比例。
<结果>
如图6所示，可知：在试验的pH4.0、pH5.5和pH7.0的任一种中，标记化反应均很快，反应的90％以上在1分钟以内结束。另外，在pH4.0中，未反应物的剩余量超过40％，反应收率低，特别是2个肽的附加物(波峰4)的产量为15％左右，与其他pH的情况(35％-40％)相比较低。在pH5.5和pH7.0中，未反应物的产量也低至10％内，可知有效地进行反应。作为pH5.5与pH7.0之差，波峰4的产量在为pH7.0时可看到一些变低的趋势。
[实施例8：利用放射性金属核素标记的IgG结合肽和使用该IgG结合肽的癌症检测1]
1)含有DTPA的IgG结合肽的制作
利用Fmoc固相合成法并按照常规方法，合成N末端氨基用DTPA-tetra(tBu)ester(CheMatech公司制)修饰的氨基PEG4化IgG结合肽GPDCAYHKGELVWCTFH(SEQ ID NO:37，分子内的2个Cys形成SS键，C末端酰胺化)。脱保护之后，将经纯化的DTPA-IgG结合肽溶解于20μL(19mM)的DMSO。向肽溶液中加入溶解于乙腈的DSG(500mM)20μL和吡啶0.2μL(最终浓度0.5％)，在50℃下反应3小时。总量用10ml含有0.1％TFA的15％乙腈稀释，离心后将上清液注入到InertSustain(注册商标)C18色谱柱(7.6mm1×250mm，GL Science)中，用含有0.1％TFA的15％至80％的乙腈的梯度进行洗脱。对洗脱物进行质量分析，回收目标物(DSG修饰DTPA-PEG4化IgG结合肽)之后，除去溶剂，然后冷冻干燥。
2)含有DTPA的IgG结合肽与曲妥珠单抗结合而成的放射性核素标记抗体“DTPA修饰曲妥珠单抗”的制作
将上述1)中制备的DSG修饰DTPA-PEG4化IgG结合肽以5.0mM的浓度溶解于DMSO中的溶液1.36μL，与溶解于10mM乙酸缓冲液(pH5.5)中的6.8μM抗HER2人抗体(曲妥珠单抗)(中外制药)1mL混合，在室温下反应30分钟(肽与抗体的摩尔比为1:1)。这样制备的DTPA修饰人抗体(抗体药物偶联物，ADC)使用阴离子交换色谱柱Shodex QA825(8.0mm×75mm，Shodex)，通过含有10mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.0)的0M至0.5M的NaCl梯度洗脱进行纯化。对除未反应抗体以外的2个波峰(波峰A、B)分离之后，在Vivaspin(截留10000Da，Sartorius)上通过3000g下离心进行脱盐浓缩。对于得到的样品，使用MALDI-TOF-MASautoflex speed TOF/TOF-KG飞行时间质谱仪(Bruker Daltonics)测定质量，波峰A与原来的抗HER2人抗体相比增加了2716(理论值2722)，波峰B与原来的抗HER2人抗体相比增加了5398(理论值5444)，由此分别可以确认到附加有DTPA的DTPA-PEG4化IgG结合肽导入了1个(抗HER2抗体-DTPA*1)和2个(抗HER2抗体-DTPA*2)。
3)DTPA修饰曲妥珠单抗的111In标记，以及[111In]标记DTPA标记曲妥珠单抗的放射化学纯度的确认
用微量移液器准确称量上述2)中制备的DTPA修饰曲妥珠单抗，放入到容量1.5mL的Eppendorf Tubes微量离心管中。向其中加入含有10mM柠檬酸的0.15M乙酸-氨缓冲液(pH5.5)。使用Myjector注射器抽取DTPA修饰曲妥珠单抗溶液总量，放入到15mL容量的无色玻璃药瓶中。使用Myjector注射器抽取与DTPA修饰曲妥珠单抗溶液总量相同量的[111In]Cl3溶液，放入到无色玻璃药瓶中，充分混合。予以说明，制备成DTPA修饰曲妥珠单抗的摩尔数相对于[111In]为20-100倍。使其在室温下反应30分钟。反应结束后，使用放射性同位素剂量校准器测定放射性活度。
使用微量移液器分别准确称量5mL的1M柠檬酸溶液和1M柠檬酸三钠溶液，转移到100mL量瓶。加入纯水，准确定量为100mL。使用微量移液器准确量取1mL的1％EDTA溶液，转移到步骤1的100mL量瓶，充分混合。将其作为展开溶剂(使用时配制)。在展开容器中放入展开溶剂，直到溶剂从容器的底部起达到1cm。使用微量移液器准确量取3μL受试物质，将滤纸下端2cm作为原点，向原点滴下。滴下后立即进行干燥。溶剂前沿到原点距离为10cm，放入到展开溶剂中，使下端浸湿。在到达溶剂前沿上端后，立即进行干燥。使用放射性薄层色谱分析仪测定残留在滤纸上的放射性(条件计数时间：20分钟；能量范围：125-285keV；像素混合(Binning)：2)，根据原点波峰面积的比例，计算出[111In]标记DTPA修饰曲妥珠单抗的放射化学纯度[％]。
表2表示使用两种DTPA修饰曲妥珠单抗进行标记考察的结果，所述两种DTPA修饰曲妥珠单抗相对于一分子曲妥珠单抗，DTPA结合肽的修饰数目不同。如表1所示，可以使用111In标记所有DTPA修饰曲妥珠单抗。
[表2]
4)111In标记曲妥珠单抗的HER2结合能力和特异性的评价
使用胰蛋白酶-EDTA混合液回收HER2高表达细胞株SK-OV-3(源自人的卵巢癌细胞)和HER2低表达细胞株MDA-MB-231(源自人的乳腺癌细胞)(均从美国典型培养物保藏中心获得)，制作由无血清培养基制备成1.5×107个/mL的细胞悬浮液。用微量移液器准确称量200μL细胞悬浮液，放入到容量1.5mL的微量离心管中，用冰冷却。予以说明，样品数分别为3个。
将上述3)中制备的111In标记曲妥珠单抗用无血清培养基稀释，制备成放射性浓度为10～200kBq/mL。
用微量移液器准确称量制备成放射性浓度的含有111In标记曲妥珠单抗的无血清培养基500μL，加入到放入有细胞悬浮液的微量离心管中，与细胞悬浮液充分混合。在冰上使其反应1小时。反应结束后，为了洗涤未通过HER2而非特异性地附着于各细胞的111In标记曲妥珠单抗，进行离心分离(离心加速度：5000g；温度：4℃；时间：5分钟)，并用微量移液器除去上清液。然后，加入1mL冷磷酸缓冲液再悬浮，进行离心分离(离心加速度：5000g；温度：4℃；时间：5分钟)。重复进行3次该洗涤操作。最后，使用微量移液器完全除去上清液，只留下沉淀。
用微量移液器准确称量含有111In标记曲妥珠单抗的无血清培养基500μL，放入到容量1.5mL的塑料离心管中。予以说明，作为空白只准备塑料离心管(用于测量计算下述计算公式的净值(net value)所用的背景值)。此外，将样品数分别设为3个。通过全自动伽玛计数器(测定条件能量范围：111-252keV；预设时间：60秒)测定各样品的放射性活度，使用得到的测定值，并根据以下计算公式计算出[111In]标记曲妥珠单抗对于各细胞的结合率(％)。
[数1]
※计数值均表示净值(net value)(从测定值中减去背景值并进行衰减校正后得到的值)。
结果如表3所示。在所有的[111In]标记曲妥珠单抗中确认到具有对HER2的结合能力和特异性。
[表3]
5)利用SPECT成像分析对[111In]标记曲妥珠单抗在肿瘤内HER2结合能力和特异性的确认
制作在小鼠(BALB/c-nu/nu，19周龄，雌性，各1例)左右下肢移植SK-OV-3(HER2高表达细胞株)和MDA-MB-231(HER2低表达细胞株)而成的荷瘤模型，进行SPECT/CT成像。SPECT成像使用两种[111In]标记曲妥珠单抗(相对于一分子曲妥珠单抗，有1分子或2分子DTPA结合肽修饰而成)。
(111In标记曲妥珠单抗的制备)
111In标记曲妥珠单抗通过上述“3)DTPA修饰曲妥珠单抗的111In标记，以及[111In]标记DTPA标记曲妥珠单抗的放射化学纯度的确认”记载的方法制备，并将通过超滤法纯化的物质用于以后的实验。予以说明，将在一分子抗体内具有1分子DTPA的作为[111In]标记曲妥珠单抗-1，将具有2分子DTPA的作为[111In]标记曲妥珠单抗-2。
(荷瘤模型的制作)
制作在BALB/c-nu/nu裸鼠的左下肢移植HER2高表达细胞株SK-OV-3，在右下肢移植HER2低表达细胞株MDA-MB-231而成的荷瘤模型。予以说明，将各细胞移植到同一个体。裸鼠从日本SLC株式会社购买，使用6只6周龄的雌小鼠。在成像进行日当天测定各肿瘤体积，选择2例具有适合于成像实验肿瘤体积的模型。另外，用于这些小鼠的各癌细胞分别使用从美国典型培养物保藏中心获得的细胞。
(SPECT/CT摄影)
(SPECT摄影)
在移植后13周，从模型尾静脉给予[111In]标记曲妥珠单抗-1溶液(3.83MBq)或[111In]标记曲妥珠单抗-2(2.64MBq)溶液。在给予后4小时起，使用SPECT/CT相机(产品名称：FX3000临床前成像系统)进行摄影。然后，在给予后24小时、48小时的时间点进行摄影。
(CT摄影)
为了确认各肿瘤组织同时容纳在SPECT摄影的视野内，在SPECT摄影之前进行CT摄影。使用异氟烷诱导麻醉，在保持麻醉的状态下放置在动物床上。将该模型放入CT设备内，照射X光，以使肿瘤处于视野中心地进行定位。CT摄影在以下所示的摄影条件下进行，获取肿瘤的CT图像(RAW文件)。
投影计数(Project count)：200视野
平均帧数(Frames averaged)：1帧/视野
探测器像素(Detector Binning)：2×2
X射线管电流(X-ray tube current)：默认值(150μA)
X射线管电压(X-ray tube voltage)：60kV
曝光时间(Exposure time)：230ms
放大倍数(Magnification)：1.8
使用Trifoil Console重构得到的RAW文件(重构条件：Half Res)，再用图像显示软件转换重构图像，制作DICOM文件，用图像分析软件(产品名称PMOD 3.6)读取这些图像，并显示图像，用于以后的分析。
(SPECT/CT图像分析)
在给予[111In]标记曲妥珠单抗-1溶液或[111In]标记曲妥珠单抗-2溶液之后的各时间点制作SPECT和CT的融合图像，以冠状面显示。
表4记载了用于体内实验模型的详情情况和给予的[111In]标记曲妥珠单抗-1、[111In]标记曲妥珠单抗-2的信息。
[表4]
※：肿瘤块处确认到溃疡。
SPECT的摄影条件如表5所示，图像重构条件如表6所示。
[表5]
[表6]
项目 数值/条件
空间平滑(Smoothing) 中等(Middle)
分辨率(Resolution) 中等(Middle)
迭代(Iteration) 中等(Middle)
SPECT/CT摄影之后，制作SPECT和CT的融合图像，以冠状面显示。给予了[111In]标记曲妥珠单抗-1和[111In]标记曲妥珠单抗-2的SPECT/CT摄影结果如图7、8、9所示。
将分别在[111In]标记曲妥珠单抗-1和[111In]标记曲妥珠单抗-2给予后6小时和给予后4小时摄影的SPECT/CT图像作为包括肿瘤的断层图像，如图7所示。确认到[111In]标记曲妥珠单抗-1和[111In]标记曲妥珠单抗-2在HER2高表达肿瘤组织的聚集，但未确认到在HER2低表达肿瘤组织的聚集。予以说明，[111In]标记曲妥珠单抗-1在尾部确认到非特异性聚集，这是因为在给予时一部分血液漏出到血管外。
将在[111In]标记曲妥珠单抗-1和[111In]标记曲妥珠单抗-2给予后24小时、48小时的SPECT/CT图像作为包括肿瘤的断层图像，如图8所示。以给予[111In]标记曲妥珠单抗-1之后24小时的摄影时间为基准，对SPECT图像进行衰减校正，与标度值一并显示。确认到[111In]标记曲妥珠单抗-1和[111In]标记曲妥珠单抗-2在HER2高表达肿瘤组织的聚集，但未确认到在HER2低表达肿瘤组织的聚集。另外，在任何时间点，[111In]标记曲妥珠单抗-1在HER2高表达肿瘤组织的聚集均高于[111In]标记曲妥珠单抗-2。
将分别在[111In]标记曲妥珠单抗-1和[111In]标记曲妥珠单抗-2给予后6小时和给予后4小时摄影的SPECT/CT图像作为包括肝脏的断层图像，如图9所示。在给予初期，[111In]标记曲妥珠单抗-2在肝脏的聚集高于[111In]标记曲妥珠单抗-1。予以说明，肝脏的位置是通过上部为胸腔来判断的。
[实施例9：具有利用二氯丙酮的SS交联结构的IgG结合肽的制备]
利用Fmoc固相合成法并按照常规方法，合成N末端乙酰化RRC(Acm保护)-PEG4化合成肽GPDCAYHXGELVWCTFH(SEQ ID NO:2，X为赖氨酸，C末端酰胺化)在肽合成磁珠(Rink-amide-Chemmatrix resin，Biotage)上。从树脂将肽切割下、脱保护之后，从而得到肽(图10、a)。将得到的肽65mg(15.6μmol)溶解于含有6M的Gn·HCl的磷酸缓冲液(pH＝7.3)5mL中，向其中加入溶解于乙腈120μL的1,3-二氯-2-丙酮(2.9mg,23.4μmol,1.5摩尔当量)，在室温下搅拌。1小时后，通过HPLC分析确认反应结束，将反应溶液直接用HPLC进行纯化，由此得到环化肽(图10、b，33mg，7.8μmol，收率为50％)。向该环化肽加入悬浮于90％醋酸水溶液(8.8mL)的乙酸银(30.8mg，184.5μmol)，在室温、避光下搅拌5小时。加入二硫苏糖醇(DTT：352mg，2.3mmol)，通过离心分离除去产生的沉淀，通过HPLC纯化所得到的上清液，由此得到环化肽(图10、c，20.5mg，5.2μmol，收率为67％)。
[实施例10：利用放射性金属核素标记的IgG结合肽和使用该IgG结合肽的癌症检测2]
<方法>
1)含有去铁胺的IgG结合肽的制作
利用Fmoc固相合成法并按照常规方法，合成N末端氨基用去铁胺-tetra(tBu)ester(CheMatech公司制)修饰的氨基PEG4化IgG结合肽GPDCAYHKGELVWCTFH(SEQ ID NO:37，分子内的2个Cys形成SS键，C末端酰胺化)。脱保护之后，将经纯化的去铁胺-IgG结合肽溶解于40μL(18mM)的DMSO。向肽溶液中加入溶解于乙腈的DSG(500mM)40μL和吡啶0.5μL(最终浓度0.6％)，在50℃下反应3小时。总量用10ml含有0.1％TFA的15％乙腈稀释，离心后将上清液注入到InertSustain(注册商标)C18色谱柱(6.0×250mm，GL Science)中，用含有0.1％TFA的10％至66％的乙腈的梯度进行洗脱。对洗脱物进行质量分析，回收目标物(DSG修饰去铁胺-PEG4化IgG结合肽)之后，除去溶剂，然后冷冻干燥。
2)含有去铁胺的IgG结合肽与曲妥珠单抗结合而成的放射性核素标记抗体“去铁胺修饰曲妥珠单抗”的制作
将上述1)中制备的DSG修饰去铁胺-PEG4化IgG结合肽以13mM的浓度溶解于DMSO中而成的溶液10μL，与溶解于10mM乙酸缓冲液(pH5.5)中的22μM抗HER2人抗体(曲妥珠单抗)(中外制药)1mL混合，在室温下反应2小时(肽与抗体的摩尔比为6:1)。这样制备的去铁胺修饰人抗体(抗体药物偶联物，ADC)使用阴离子交换色谱柱QA-825(8.0mm×75mm，Shodex)，通过含有10mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.0)的0M至0.5M的NaCl梯度洗脱进行纯化。对除未反应抗体以外的2个波峰(波峰A、B)分离之后，在Vivaspin(注册商标)(截留10000Da，Sartorius)上通过3000g下离心进行脱盐浓缩。对于得到的样品，使用MALDI-TOF-MASautoflex speed TOF/TOF-KG飞行时间质谱仪(Bruker Daltonics)测定质量，波峰A与原来的抗HER2人抗体相比增加了2716(理论值2722)，波峰B与原来的抗HER2人抗体相比增加了5398(理论值5444)，由此分别可以确认到在曲妥珠单抗中，导入有1分子或2分子的附加有去铁胺的去铁胺-PEG4化IgG结合肽。
3)去铁胺修饰曲妥珠单抗的89Zr标记和纯化
将89Zr溶解于1M草酸溶液为200MBq/200μL。向微量离心管中加入200μL的89Zr-草酸溶液、90μL的2M碳酸钠，在室温下放置3分钟。向放置3分钟后的微量离心管，边搅拌边加入1030μL的含有5mg/mL龙胆酸的0.5M的HEPES缓冲液(pH7.1-7.3)。向650μL该溶液中加入300μL上述2)中制备的去铁胺修饰曲妥珠单抗(一价或二价)并混合，用pH试纸确认反应药瓶中反应液的pH值为6.8-7.2。确认pH值之后，在室温下反应1小时。然后，用20mL含有5mg/mL龙胆酸的0.25M乙酸钠(pH5.4-5.6)对PD-10色谱柱进行溶剂更换后，将89Zr标记溶液加入到PD-10色谱柱(GE Healthcare)。加入1.5mL含有5mg/mL龙胆酸的0.25M乙酸钠(pH5.4-5.6)，弃去洗脱液。加入2mL含有5mg/mL龙胆酸的0.25M乙酸钠(pH5.4-5.6)，每次分离0.2mL洗脱液。收集含有放射性的组分，通过超滤用离心色谱柱(Amicon Ultra，默克密理博公司制)进行浓缩操作。使用反相修饰硅胶薄层色谱(TLC)板、TLC硅胶60RP-18F254s(默克密理博)，将50mM的EDTA(pH5.0)作为展开溶剂，使89Zr标记溶液展开。将展开后的TLC板曝露在成像板(富士胶片)上，用Fluoro Image Analyzer(FLA-7000，GE Healthcare公司制)获取放射自显影。根据获得的放射自显影的原点波峰面积的比例，计算出[89Zr]标记曲妥珠单抗(一价或二价)的放射化学纯度[％]。
4)89Zr标记曲妥珠单抗的给予和PET成像
制作在小鼠(BALB/c-nu/nu，雌性，13周龄)左右下肢移植SK-OV-3(HER2高表达细胞株)和MDA-MB-231(HER2低表达细胞株)(均从美国典型培养物保藏中心获得)而成的荷瘤模型，并进行PET成像。PET成像使用按照上述3)制备的两种[89Zr]标记曲妥珠单抗(相对于一分子曲妥珠单抗，有1分子或2分子去铁胺结合肽修饰而成)。予以说明，将在一分子抗体内具有1分子去铁胺的作为[89Zr]标记曲妥珠单抗-1，将具有2分子去铁胺的作为[89Zr]标记曲妥珠单抗-2。
从模型尾静脉给予[89Zr]标记曲妥珠单抗-1溶液或[89Zr]标记曲妥珠单抗-2溶液。在给予后6小时起，使用PET相机(产品名称：Clairvivo(注册商标)PET)进行摄影。然后，在给予后24小时和48小时的时间点进行摄影。PET图像的重构法使用3D-DRAMA法。
表7记载了用于体内实验的模型的详情情况和给予的[89Zr]标记曲妥珠单抗-1、[89Zr]标记曲妥珠单抗-2的信息。
[表7]
各时间点的摄影时间如表8所示。各时间点的摄影时间设置中，考虑了各标记物的给予量和放射性的衰减。
[表8]
<结果>
将分别在[89Zr]标记曲妥珠单抗-1和[89Zr]标记曲妥珠单抗-2给予后6小时、24小时和48小时摄影的PET图像作为包括肿瘤的断层图像，如图11所示。如图11所示，确认到[89Zr]标记曲妥珠单抗-1和[89Zr]标记曲妥珠单抗-2在HER2高表达肿瘤组织的聚集均高于在HER2低表达肿瘤组织的聚集。
本发明的IgG结合肽能够容易地与放射性金属核素结合，因此利用放射性金属核素，可以特异性且简便地标记IgG，并且不会损伤其功能。通过放射性金属核素标记的IgG能够用于癌症的诊断。
本说明书所引用的全部出版物、专利以及专利申请均通过直接引用而并入本说明书。
序列表
<110> 国立大学法人鹿儿岛大学
<120> 利用IgG结合肽的位点特异性放射性同位素标记抗体
<130> PH-6993-PCT
<150> JP 2016-117395
<151> 2016-06-13
<150> JP 2016-227025
<151> 2016-11-22
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、 2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 1
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> IgG结合肽
<220>
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<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
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<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 13
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr
1 5 10 15
His
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 14
Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 15
Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 16
Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 17
Asp Cys Ala Trp His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 18
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 19
Asp Cys Ala Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 20
Asp Cys Ser Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 21
Asp Cys Thr Trp Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 22
Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 23
Asp Cys Thr Tyr Arg Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 24
Asp Cys Thr Tyr Ser Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 25
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 26
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 27
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Arg Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 28
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asp Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 29
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Ile Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 30
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是高半胱氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是高半胱氨酸
<400> 31
Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa
1 5 10 15
His
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 32
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<400> 33
Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<400> 34
Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<400> 35
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr
1 5 10 15
His
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是高半胱氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸
或二氨基丙酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是高半胱氨酸
<400> 36
Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa
1 5 10 15
His
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG结合肽
<400> 37
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His

Claims (25)

1.一种肽，其含有下述式I所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述肽能够与人IgG结合，且含有能够与放射性金属核素结合的配体，
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，且
W是色氨酸残基。
2.一种肽，其含有下述式I所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述肽能够与人IgG结合，且用放射性金属核素标记，
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，且
W是色氨酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其中，放射性金属核素选自由111In、89Zr、64Cu、67/68Ga和99mTc组成的组。
4.根据权利要求2或3所述的肽，其中，放射性金属核素通过配体与肽结合。
5.根据权利要求1或4所述的肽，其中，所述配体与N末端连接。
6.根据权利要求1、4或5所述的肽，其中，所述配体为螯合剂。
7.根据权利要求6所述的肽，其中，所述螯合剂选自由以下物质组成的组：二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、去铁胺、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
8.根据权利要求4或5所述的肽，其中，放射性金属核素与配体的组合选自由111In与DTPA、89Zr与去铁胺，以及64Cu与DOTA或NOTA组成的组。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的肽，其含有下述式II所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，
W是色氨酸残基，
Xaa3是丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4是酪氨酸残基或色氨酸残基。
10.根据权利要求9所述的肽，其含有下述式III所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (III)
式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C是半胱氨酸残基，
A是丙氨酸残基，
Y是酪氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基或谷氨酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，且
W是色氨酸残基。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的肽，其中，当氨基酸残基为17个时，从N末端起，第1～3位、15～17位氨基酸残基分别如下：
第1位氨基酸残基是S、G、F、R，或者无；
第2位氨基酸残基是D、G、A、S、P、高半胱氨酸，或者无；
第3位氨基酸残基是S、D、T、N、E或R；
第15位氨基酸残基是S、T或D；
第16位氨基酸残基是H、G、Y、T、N、D、F、高半胱氨酸，或者无；
第17位氨基酸残基是Y、F、H、M，或者无。
12.根据权利要求9所述的肽，其由以下1)～14)中任一项氨基酸序列组成，其中，Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，在以下14)中，Xaa2是高半胱氨酸，
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:1)
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:2)
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(SEQ ID NO:3)
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:4)
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:5)
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:6)
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:7)
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:8)
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(SEQ ID NO:9)
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:10)
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:11)
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:12)
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:13)
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(SEQ ID NO:36)。
13.根据权利要求1～9中任一项所述的肽，其含有下述式IV所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
式中，D是天冬氨酸残基，
C是半胱氨酸残基，
H是组氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G是甘氨酸残基，
Xaa2是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基，
L是亮氨酸残基，
V是缬氨酸残基，
W是色氨酸残基，
T是苏氨酸残基，
Xaa3是丙氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4是酪氨酸残基或色氨酸残基。
14.一种肽，其含有下述式V所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述肽能够与人IgG结合，且通过配体而结合有放射性金属核素，
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
式中，D是天冬氨酸残基，
C是半胱氨酸残基，
G是甘氨酸残基，
L是亮氨酸残基，
W是色氨酸残基，
T是苏氨酸残基，
Xaa1是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
Xaa2是丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa3是色氨酸残基或酪氨酸残基，
Xaa4是组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa5是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基或天冬氨酸残基，且
Xaa6是异亮氨酸残基或缬氨酸残基。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的肽，其中，所述肽在外侧的2个半胱氨酸(C)残基间形成二硫键，或者肽的外侧的2个半胱氨酸残基中的硫醚基通过下式所示的接头进行连接
[化1]
16.根据权利要求1～15中任一项所述的肽，其中，在所述肽中，N末端PEG化和/或C末端酰胺化。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的肽，其中，Xaa1为赖氨酸残基。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的肽，其中，Xaa1由交联剂修饰。
19.根据权利要求18所述的肽，其中，所述交联剂选自由以下物质组成的组：DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、DSS(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、DMA(己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMS(辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DTBP(3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DSP(二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯))。
20.根据权利要求19所述的肽，其中，所述交联剂为DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)或DSS(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)。
21.根据权利要求17～20中任一项所述的肽，其由GPDCAYHKGELVWCTFH(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列组成，其中，该肽分子内的2个Cys(C)形成SS键。
22.一种肽与IgG的复合物，其通过由交联剂修饰的权利要求18～21中任一项所述的肽和IgG的交联反应而形成。
23.一种核医学影像诊断剂或癌症诊断剂，其含有结合有放射性金属核素的权利要求2～21中任一项所述的肽或权利要求22所述的复合物。
24.一种确定受试对象是否患有癌症的方法，包括以下步骤：
使从受试对象获得的样品与结合有放射性金属核素的权利要求2～21中任一项所述的肽或权利要求22所述的复合物进行反应的步骤；
测定样品中来自放射性金属核素的放射性的水平或存在的步骤；以及
根据放射性的水平或存在，确定受试对象是否患有癌症的步骤。
25.一种确定受试对象是否患有癌症的方法，包括以下步骤：
对受试对象给予结合有放射性金属核素的权利要求2～21中任一项所述的肽或权利要求22所述的复合物的步骤；
测定受试对象中来自放射性金属核素的放射性的水平或存在的步骤；以及
根据放射性的水平或存在，确定受试对象是否患有癌症的步骤。
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