KR20230088764A - 항her2 항체의 방사성 복합체, 및 방사성 의약 - Google Patents

항her2 항체의 방사성 복합체, 및 방사성 의약 Download PDF

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고타 도노야
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니혼 메디피직스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 약효를 손상시키지 않고 종래보다도 안정성이 높여진 복합체를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명의 복합체는, 펩티드로 부위 특이적으로 수식된 항HER2 항체와 킬레이트제의 복합체이며, 킬레이트제에 방사성 금속핵종이 킬레이트화되어 있으며, 펩티드와 킬레이트제가 링커 (L)을 통해 연결되어 있으며, 링커 (L)은 티오우레아 결합을 포함하지 않는다.

Description

항HER2 항체의 방사성 복합체, 및 방사성 의약
본 발명은, 항HER2 항체의 방사성 복합체, 및 방사성 의약에 관한 것이다.
HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor Type2: 인간 상피 증식 인자 수용체 2형)는 인간 암 유전자 HER2/neu의 유전자 산물로서 동정된 증식 인자 수용체이며, 분자량 약 185kDa의 막 관통형 단백질이다.
항HER2 항체로서 트라스투주맙(Trastuzumab)이 알려져 있고, HER2 과잉 발현한 유방암 또는 위암을 적응증으로 하는 항종양제로서, 임상에서 사용되고 있다.
트라스투주맙은 출시되어 있는 몇 가지의 ADC(Antibody Drug Conjugate(항체 약물 복합체))로 사용되고 있는 항체인 것이 알려져 있다. ADC는 항체에 링커를 통해 화학 요법제인 페이로드(약물)를 공유 결합한 약제이다.
항체 의약은 표적에 대한 선택성이 높고 비교적 부작용이 적은 한편, 약효가 불충분한 경우가 있다. 화학 요법제는 강력한 약효를 갖지만, 표적에 대한 선택성이 낮기 때문에, 암 세포를 사멸시키기 위해 필요한 최소 유효량이 높고, 한편, 독성의 관점에서 용량을 크게 올릴 수 없는 점에서 최대 내성 용량이 낮아, 치료 용량 영역이 좁은 것이 과제로 되어 있다.
ADC에 의하면, 화학 요법제를 암 세포에 선택적으로 많이 도달시킬 수 있게 되고, 그 결과, 보다 소량으로 효과를 나타내게 되고, 정상 세포에 도달하는 화학 요법제가 저감되는 점에서 최대 내성 용량도 높아짐으로써, 치료 용량 영역이 넓어질 것이 기대된다.
ADC의 하나의 어프로치로서 방사성 면역 복합체(Radioimmunoconjugate)가 있다. 방사성 면역 복합체에 있어서는 페이로드 대신에 방사성 핵종이 사용된다.
예를 들어, 비특허문헌 1, 2에는, 킬레이트제로서 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10테트라아세트산(DOTA)을 사용하여, DOTA에 도입된 이소티오시아네이트기와 트라스투주맙의 말단 아미노기를 반응시킴으로써, 트라스투주맙을 랜덤하게 225Ac로 표지한, 225Ac 표지 트라스투주맙이 기재되어 있다.
또한, 특허문헌 1에는, 항HER2 항체로서, 트라스투주맙 및 페르투주맙에 대하여 랜덤하게 아지드기를 수식한 후, Ac-225로 표지된 DOTAGA-DBCO와 클릭 반응시킴으로써 트라스투주맙을 랜덤하게 225Ac로 표지한 225Ac 표지 트라스투주맙 및 225Ac 표지 페르투주맙이 기재되어 있다.
또한, 방사성 핵종으로서, 감마선이나 포지트론을 방출하는 방사성 핵종을 사용한 방사성 면역 복합체는, 핵의학 검사에 이용할 수 있다. 특허문헌 2에는, 항체의 Fc 영역을 부위 특이적으로 수식하는 펩티드와 항HER2 항체의 복합체가 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 3에는, 이 펩티드에 DTPA를 도입하여 트라스투주맙을 수식하고, In-111로 표지하여 111In 표지 트라스투주맙을 얻은 것, 당해 펩티드에 DFO를 도입하여 트라스투주맙을 수식하고, Zr-89로 표지하여 89Zr 표지 트라스투주맙을 얻은 것이 기재되어 있다.
WO2019/125982 WO2016/186206 WO2017/217347
Cancer Res. 2003 Aug 15; 63(16): 5084-90 Clin Cancer Res. 2004 Jul 1; 10(13): 4489-97
그러나, 이소티오시아네이트기가 도입된 DOTA와 아미노기의 반응에 의해 티오우레아 결합을 형성한 항HER2 항체의 방사성 복합체는, 안정성이 낮은 등의 과제가 있는 것이 본 발명자들의 지견에 의해 명확해졌다.
특허문헌 1에는, 펩티드에 의한 항HER2 항체의 부위 특이적 수식에 대해서는 기재되어 있지 않다. 또한, 티오우레아 결합을 형성한 항HER2 항체의 과제에 관한 개시 내지 시사는 없다.
본 발명의 일 양태는, 펩티드로 부위 특이적으로 수식된 항HER2 항체와 킬레이트제의 복합체이며, 킬레이트제에 방사성 금속핵종이 킬레이트화되어 있으며, 펩티드와 킬레이트제가 링커 (L)을 통해 연결되어 있으며, 링커 (L)은 티오우레아 결합을 포함하지 않는 복합체이다.
본 발명의 다른 양태는, 상기 복합체를 유효 성분으로서 함유하는 방사성 의약이다.
또한, 본 발명의 다른 양태는, 방사성 금속핵종이 킬레이트화된 킬레이트제와, 항HER2 항체의 복합체를 유효 성분으로서 함유하고, 항HER2 항체와 킬레이트제의 연결에 티오우레아 결합을 포함하지 않고, 실온에서 7일간 보관했을 때의 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상인, 방사성 의약이다.
또한, 본 발명에서 말하는 「연결」이란, 특별히 언급이 없을 경우, 직접적 또는 간접적으로 접속되어 있는 것의 양쪽을 의미한다.
본 발명에 따르면, 약효를 손상시키지 않고 종래보다도 안정성이 높여진 항HER2 항체의 방사성 복합체가 제공된다.
도 1은 방사성 복합체(실시예 1)군, 방사성 복합체(비교예 1)군, 항체 대조군 및 비히클군의 담암 마우스에 있어서의 경시적인 종양 체적의 변화를 나타낸 그래프이다. 종축은 각 약제 투여 시의 종양 체적을 1로 한 경우의 상대값을 나타내고, 횡축은 각 약제를 투여한 후의 경과 일수를 나타낸다. 그래프는 각 군의 종양 체적의 평균값±표준 편차를 나타내고, 「*」은 항체 대조군에 대하여 유의차(p<0.05)가 확인된 시간점, 「**」은 항체 대조군에 대하여 유의차(p<0.01)가 확인된 시간점, 「†」은 비히클군에 대하여 유의차(p<0.05)가 확인된 시간점, 「‡」은 비히클군에 대하여 유의차(p<0.01)가 확인된 시간점을 나타낸다.
도 2는 방사성 복합체(실시예 1)군, 방사성 복합체(비교예 1)군, 항체 대조군 및 비히클군의 담암 마우스에 있어서의 경시적인 체중의 변화를 나타낸 그래프이다. 종축은 각 약제 투여 시의 체중을 1로 한 경우의 상대값을 나타내고, 횡축은 각 약제를 투여한 후의 경과 일수를 나타낸다. 그래프는 각 군의 체중 평균값±표준 편차를 나타낸다.
도 3은 실시예 1 및 비교예 1을 따라서 제조한 방사성 복합체의 항원 결합성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 종축은 사용한 종양 절편 상에 설정한 관심 영역(ROI) 내의 카운트값을 ROI의 면적으로 나눈 값을 표준 선원의 카운트값을 표준 선원의 면적으로 나눈 값으로 보정한 값을 나타내고, 횡축은 각 평가일점에 있어서의 사용한 종양 절편의 세포종을 나타낸다. 그래프는 각 샘플(n=10)의 평균값±표준 편차를 나타낸다.
도 4는 실시예 4 및 비교예 4를 따라서 제조한 방사성 복합체의 항원 결합성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 종축은 사용한 종양 절편 상에 설정한 관심 영역(ROI) 내의 카운트값을 ROI의 면적으로 나눈 값을 표준 선원의 카운트값을 표준 선원의 면적으로 나눈 값으로 보정한 값을 나타내고, 횡축은 각 평가일점에 있어서의 사용한 종양 절편의 세포종을 나타낸다. 그래프는 각 샘플(n=10)의 평균값±표준 편차를 나타낸다.
도 5는 실시예 5 및 비교예 5를 따라서 제조한 방사성 복합체의 항원 결합성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 종축은 사용한 종양 절편 상에 설정한 관심 영역(ROI) 내의 카운트값을 ROI의 면적으로 나눈 값을 표준 선원의 카운트값을 표준 선원의 면적으로 나눈 값으로 보정한 값을 나타내고, 횡축은 각 평가일점에 있어서의 사용한 종양 절편의 세포종을 나타낸다. 그래프는 각 샘플(n=10)의 평균값±표준 편차를 나타낸다.
도 6은 실시예 2를 따라서 제조한 방사성 복합체를 SK-OV-3 세포의 피하 담암 모델 마우스에 투여하고, PET 촬상을 행한 결과의 대표예를 나타내는 화상이다. 도면 중의 화살표는 담암한 종양을 나타낸다.
도 7은 각 방사성 복합체 투여군, 각 ADC 약제 투여군의 담암 마우스에 있어서의 경시적인 종양 체적의 변화를 나타낸 그래프이다. 종축은 각 약제 투여 시의 종양 체적을 1로 한 경우의 상대값을 나타내고, 횡축은 각 약제를 투여한 후의 경과 일수를 나타낸다. 그래프는 각 군의 종양 체적의 평균값±표준 편차를 나타내고, 「*」은 엔하츠(등록 상표) 저용량군에 대하여 유의차(p<0.05)가 확인된 시간점을 나타낸다.
도 8은 각 방사성 복합체 투여군, 각 ADC 약제 투여군, 항체 대조군 및 비히클군의 담암 마우스에 있어서의 경시적인 종양 체적의 변화를 나타낸 그래프이다. 종축은 각 약제 투여 시의 종양 체적을 1로 한 경우의 상대값을 나타내고, 횡축은 각 약제를 투여한 후의 경과 일수를 나타낸다. 그래프는 각 군의 종양 체적의 평균값±표준 편차를 나타내고, 「**」은 항체 대조군에 대하여 유의차(p<0.01)가 확인된 시간점, 「‡」은 비히클군에 대하여 유의차(p<0.01)가 확인된 시간점을 나타낸다.
(1) 방사성 복합체
본 발명은, 펩티드로 부위 특이적으로 수식된 항HER2 항체와 킬레이트제의 복합체이며, 킬레이트제에 방사성 금속핵종이 킬레이트화되어 있으며, 펩티드와 킬레이트제가 링커 (L)을 통해 연결되어 있으며, 링커 (L)은 티오우레아 결합을 포함하지 않는 복합체(이하, 본 발명의 방사성 복합체라고도 함)이다.
(1-1) 방사성 금속핵종
본 발명의 방사성 복합체에 포함되는 방사성 금속핵종은, α선을 방출하는 방사성 핵종, β선을 방출하는 방사성 핵종, 포지트론을 방출하는 방사성 핵종 또는 γ선을 방출하는 방사성 핵종이다. 본 발명의 방사성 복합체를 암 치료에 사용하는 경우에는, α선을 방출하는 방사성 핵종 또는 β선을 방출하는 방사성 핵종을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 방사성 복합체를 암의 진단 혹은 검출에 사용하는 경우에는, 포지트론을 방출하는 방사성 핵종 또는 γ선을 방출하는 방사성 핵종을 사용하는 것이 바람직하다. α선을 방출하는 방사성 핵종으로서, Bi-212, Bi-213, Ac-225, Th-227이 예시된다. 또한, β선을 방출하는 방사성 핵종으로서, Cu-64, Y-90 또는 Lu-177이 예시된다. 또한, 포지트론을 방출하는 방사성 핵종으로서, Cu-64, Ga-68, Y-86, Zr-89가 예시된다. 또한, γ선을 방출하는 방사성 핵종으로서, Tc-99m 또는 In-111이 예시된다. 본 발명의 방사성 복합체에 포함되는 방사성 금속핵종은, Ac-225, Y-90, Lu-177 또는 Zr-89인 것이, 보다 바람직하다.
(1-2) 항체
본 발명의 방사성 복합체에 포함되는 항체는, HER2에 특이적으로 결합하는 면역 글로불린(이하, 본 발명에서 사용되는 항체라고도 함)이다. 본 발명에서 사용되는 항체는 폴리클로날 항체여도 되고, 모노클로날 항체여도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 항체의 유래는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 비인간 동물의 항체, 비인간 포유 동물의 항체 및 인간 항체를 들 수 있고, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스 및 토끼를 예시할 수 있다. 항체가 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지의 기술을 사용하여, 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하지만, 본 발명에 사용되는 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체여도 된다. 또한, 본 발명에서 사용되는 항체는 이중 특이성 항체여도 된다.
본 발명의 방사성 복합체에 사용되는 항체는, 트라스투주맙 또는 페르투주맙인 것이 보다 바람직하다.
트라스투주맙(trastuzumab)은, 마우스 모노클로날 항체(4D5)의 항원 결합 부위의 아미노산 서열을, 인간 IgG1의 상당 부분에 유전자 공학적으로 치환한 유전자 재조합 인간화 모노클로날 항체이며, 마우스 항인간 상피 증식 인자 수용체 2형(HER2) 모노클로날 항체의 상보성 결정부, 인간 프레임워크부 및 인간 IgG1의 정상부를 포함한다. 트라스투주맙은 차이니즈 햄스터 난소 세포에 의해 산생된다.
본 명세서에 있어서, 트라스투주맙은 일본 특허 공표 평6-508267호에 기재된 항체이며, 구체적으로는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열:
Figure pct00001
(서열 번호 1)
및 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열:
Figure pct00002
(서열 번호 2)
를 포함하는 인간화 항체이다.
트라스투주맙은, HER2 과잉 발현이 확인된 유방암 또는 HER2 과잉 발현이 확인된 치유 절제 불능한 진행·재발의 위암을 적응증으로 하는 항종양제로서, 임상에서 사용되고 있으며, 하셉틴(등록 상표) 또는 각종 바이오시밀러품(트라스투주맙 BS)으로서 입수 가능하다.
하셉틴(등록 상표) 및 그 바이오시밀러품에 있어서 트라스투주맙은, 450개의 아미노산 잔기를 포함하는 H쇄(γ1쇄) 2분자 및 214개의 아미노산 잔기를 포함하는 L쇄(κ쇄) 2분자로 구성되는 당단백질(분자량: 약 148,000)이다.
페르투주맙(pertuzumab)은, 마우스 모노클로날 항체(2C4)의 항원 결합 부위의 아미노산 서열을, 인간 IgG1의 상당 부분에 유전자 공학적으로 치환한 유전자 재조합 인간화 모노클로날 항체이며, 마우스 항HER2 모노클로날 항체의 상보성 결정부, 그리고 인간 IgG1의 프레임워크 및 정상부를 포함한다. 페르투주맙은 차이니즈 햄스터 난소 세포에 의해 산생된다. 페르투주맙은 HER2 양성의 유방암을 적응증으로 하는 항종양제로서, 임상에서 사용되고 있으며, 파제타(등록 상표)로서 입수 가능하다. 파제타(등록 상표)에 있어서 페르투주맙은, 449개의 아미노산 잔기를 포함하는 H쇄(γ1쇄) 2분자 및 214개의 아미노산 잔기를 포함하는 L쇄(κ쇄) 2분자로 구성되는 당단백질(분자량: 약 148,000)이다.
(1-3) 킬레이트제
본 발명에 있어서 킬레이트제는, 방사성 금속핵종이 배위하는 부위를 구조 중에 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 킬레이트제로서, 예를 들어 CB-TE2A(1,4,8,11-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸-4,11-디아세트산), CDTA(시클로헥산-트랜스-1,2-디아민 테트라-아세트산), CDTPA(4-시아노-4-[[(도데실티오)티옥소메틸]티오]-펜탄산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α',α",α'"-테트라메틸-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTAM(1,4,7,10-테트라키스(카르바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸), DOTA-GA(α-(2-카르복시에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTP(((1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라일)테트라키스(메틸렌))테트라포스폰산), DOTMP(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라키스(메틸렌포스폰산)), DOTA-4AMP(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라키스(아세트아미도메틸렌포스폰산)), DO2P(테트라아자시클로도데칸 디메탄포스폰산), 데페록사민(DFO), DTPA(글리신, N,N-비스[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸]-), CHX-A"-DTPA(2,2'-((2-(((1S,2R)-2-(비스(카르복시메틸)아미노)시클로헥실)(카르복시메틸)아미노)에틸)아잔디일)디아세트산), DTPA-BMA(5,8-비스(카르복시메틸)-11-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸]-3-옥소-2,5,8,11-테트라아자트리데칸-13-산), EDTA(2,2',2",2'"-(에탄-1,2-디일비스(아잔트리일))테트라아세트산), NOTA(1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산), NOTP(1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리일트리스(메틸렌포스폰산)), TETPA(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라프로피온산), TETA(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산), TTHA(3,6,9,12-테트라키스(카르복시메틸)-3,6,9,12-테트라아자테트라데칸디오산), HEHA(1,2,7,10,13-헥사아자시클로옥타데칸-1,4,7,10,13,16-헥사아세트산), 1,2-HOPO(N,N',N",N'"-테트라(1,2-디히드로-1-히드록시-2-옥소피리딘-6-카르보닐)-1,5,10,14-테트라아자테트라데칸), PEPA(1,4,7,10,13-펜타아자시클로펜타데칸-N,N',N",N'",N""-펜타-아세트산), H4옥타파(N,N'-비스(6-카르복시-2-피리딜메틸)-에틸렌디아민-N,N'-디아세트산), H2비스파2(6,6'-({9-히드록시-1,5-비스(메톡시카르보닐)-2,4-디(피리딘-2-일)-3,7-디아자비시클로[3.3.1]노난-3,7-디일}비스(-메틸렌))디피콜린산), H2데드파(1,2-[{6-(카르복시)-피리딘-2-일}-메틸아미노]에탄), H2마크로파(6-(1,4,10,13-테트라옥사-7,16-디아자시클로옥타데칸-N,N'-메틸)피콜린산), H5데카파(N,N"-비스(6-카르복시-2-피리딜메틸)-디에틸렌트리아민-N,N',N"-트리아세트산), H6포스파(N,N'-(메틸렌포스포네이트)-N,N'-[6-(메톡시카르보닐)피리딘-2-일]-메틸-1,2-디아미노에탄), HP-D03A(히드록시프로필테트라아자시클로도데칸트리아세트산), 포르피린 등을 들 수 있지만, 하기 식 (A)로 표시되는 화합물이 바람직하다.
Figure pct00003
(식 (A) 중, R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은 -(CHCOOH)(CH2)pCOOH를 포함하는 기이며, R15가 수소 원자이며, p가 0 이상 3 이하의 정수이다.)
식 (A)로 표시되는 화합물로서는 바람직하게는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA), 또는 그의 유도체에서 유래하는 구조를 포함하는 화합물이며, 구체적으로는 구조 중에 DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α',α",α'"-테트라메틸-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTAM(1,4,7,10-테트라키스(카르바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸), DOTA-GA(α-(2-카르복시에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTP(((1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라일)테트라키스(메틸렌))테트라포스폰산), DOTMP(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라키스(메틸렌포스폰산)), DOTA-4AMP(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라키스(아세트아미도메틸렌포스폰산)), DO2P(테트라아자시클로도데칸 디메탄포스폰산)에서 선택되는 하나의 킬레이트제에서 유래하는 구조를 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 이하의 식 (A-1) 내지 (A-6)으로 표시되는 화합물을 들 수 있다. 본 발명의 방사성 복합체에 사용되는 킬레이트제는, DOTA-GA(식 (A-6)으로 표시되는 화합물)가 보다 더욱 바람직하다.
Figure pct00004
본 발명에서 사용되는 킬레이트제는 링커 (L)을 통해 펩티드와 연결되어 있다. 본 발명의 방사성 복합체에 있어서, 킬레이트제와 링커 (L)은 공유 결합에 의해 접속되어 있는 것이 바람직하다. 따라서, 전술한 킬레이트제는 본 발명의 방사성 복합체에 있어서는 화합물 내의 일부의 기가 링커 (L)과 공유 결합을 형성하는 기로 치환되어 있어도 된다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 킬레이트제가 식 (A)로 표시되는 화합물인 경우에는, R12 또는 R15가 링커 (L)과 공유 결합을 형성하는 기로 치환되어 있어도 된다. 바람직하게는 R12가 링커 (L)과 공유 결합을 형성하는 기로 치환되어 있을 때, R15는 수소 원자이며, R12가 -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 또는 -(CHCOOH)(CH2)pCOOH를 포함하는 기일 때, R15가 링커 (L)과 공유 결합을 형성하는 기로 치환되어 있다.
킬레이트제와 링커 (L)의 공유 결합은, 티오우레아 결합을 포함하지 않으면 되고, 탄소-탄소 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 에스테르 결합 등을 들 수 있다.
킬레이트제와 링커 (L)의 접속은, 예를 들어 하기 식 (A-7)이나 (A-8)의 N-히드록시숙신이미드에스테르(NHS)기, 또는 하기 식 (A-9)의 2,6-디옥소테트라히드로-2H-피라닐기와, 링커 (L)의 제1급 아민의 반응에 의해 형성된다.
Figure pct00005
(1-4) 항체 수식 펩티드
본 발명에 있어서 펩티드는, 항체를 부위 특이적으로, 바람직하게는 Fc 영역을 부위 특이적으로, 보다 바람직하게는 항체의 Fc 영역에 있어서의 리신 잔기를 부위 특이적으로 수식하는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 이에 의해, 항체 그 자체의 활성(항원 인식 작용, 중화 작용, 보체 활성화 작용 및/또는 옵소닌 작용)을 유지할 수 있다.
본 발명에 사용되는 펩티드는 쇄상 펩티드여도 환상 펩티드여도 되지만, 환상 펩티드가 바람직하다. 보다 바람직하게는 하기 식 (i)로 표시되는 13 이상 17 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열(이하, 「항체 수식 펩티드」라고도 함)을 포함하며, 또한 가교제로 수식되어 있다. 또한, 식 (i)에 있어서, 아미노산 서열의 지면 좌측이 N 말단측을 나타내고, 아미노산 서열의 지면 우측이 C 말단측을 나타내는 것으로 하여 설명한다.
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) ··· (i)
식 (i) 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는 각각, 연속되는 a개의 X, 연속되는 b개의 X, 연속되는 c개의 X, 및 연속되는 d개의 X를 나타내고,
X는 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기 중 어느 것도 갖지 않는 아미노산 잔기이며,
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이며, 또한 a+b+c+d≤14를 충족시키고,
Xaa1 및 Xaa3은 각각 독립적으로
측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기, 또는 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 단, Xaa1 및 Xaa3 중 어느 한쪽이 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기이며, 바람직하게는 Xaa1 및 Xaa3이 연결됨으로써, 환 구조가 형성되어 있고,
Xaa2는 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산 또는 디아미노프로피온산, 바람직하게는 리신 잔기이며, 또한 Xaa2가 가교제로 수식되어 있다.
상기 식 (i)에 있어서의 X에 포함될 수 있는 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 티로신, 메티오닌 등의 아미노산에서 유래하는 것을 들 수 있고, X는 동일한 종류의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기여도 되고, 각각 다른 종류의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기여도 된다.
식 (i) 중의 a, b, c 및 d는 상술한 범위의 수라면 특별히 제한은 없지만, 펩티드와 항HER2 항체의 결합 안정성의 관점에서, a+b+c+d≤14를 조건으로 하여, a는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수, b는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수, c는 바람직하게는 3 이상 5 이하의 정수, 및 d는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수이다.
Xaa1 및 Xaa3의 적어도 한쪽은, 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기이며, 해당 아미노산은 각각 동일해도 되고, 다르게 되어 있어도 된다. 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 시스테인, 호모 시스테인을 들 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는 디술피드 결합에 의해 결합되어 있거나, 또는 이하의 식 (4)에 나타내는 구조를 통해, 술피드기가 결합되어 있는 것이 바람직하다. 식 (4) 중, 파선 부분은 술피드기와의 결합 부분을 나타낸다.
Figure pct00006
Xaa1 및 Xaa3은 상술한 조합 대신에, Xaa1 및 Xaa3 중 한쪽이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기이며, 다른 쪽이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기여도 된다. 이들은 티오에테르 결합을 통해 결합되어 있다. 할로아세틸기는 그 말단이 요오드 등의 할로겐으로 치환되어 있으며, 다른 쪽의 측쇄에 있어서의 티올기와의 반응에 의해 할로겐이 탈리되어, 티오에테르 결합이 형성된다.
식 (i)로 표시되는 항체 수식 펩티드의 구체적인 아미노산 서열은, 예를 들어 WO2016/186206, WO2017/217347 및 WO2018/230257에 기재된 펩티드를 들 수 있고, 이들을 사용할 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 항체 수식 펩티드는 하기 식으로 표시되는 13 내지 17아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다.
(X1-3)-C-(Xaa3')-(Xaa4')-H-(Xaa1')-G-(Xaa2')-L-V-W-C-(X1-3)
식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1'는 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산 또는 디아미노프로피온산이며,
G는 글리신 잔기이며,
Xaa2'는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며,
W는 트립토판 잔기이며,
Xaa3'는 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며, 또한
Xaa4'는 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.
상기 식에서, N 말단 또는 C 말단의 X1-3이라는 표기는, 시스테인(C 또는 Cys) 이외의 독립적으로 임의의 아미노산 잔기 X가 1 내지 3개 연속되어 있는 것을 의미하고, 그것을 구성하는 아미노산 잔기는 동일하거나 또는 다른 잔기이지만, 바람직하게는 3개 모두가 동일한 잔기가 아닌 서열을 포함한다.
이들 중, 항체 수식 펩티드의 아미노산 서열로서, 이하의 서열 (1) 내지 (14) 중 어느 하나를 갖고 있는 것이 바람직하고, 이하의 서열 (1), (2), (13) 또는 (14)를 갖고 있는 것이 더욱 바람직하다. 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (14)에 있어서, (Xaa2)는 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산 또는 디아미노프로피온산, 바람직하게는 리신 잔기를 나타내고, 바람직하게는 (Xaa2)는 가교제로 수식되어 있으며, (Xaa1) 및 (Xaa3)은 모두 호모 시스테인 잔기를 나타낸다. 또한, 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (14) 중, (Xaa1), (Xaa2) 및 (Xaa3) 이외의 아미노산은 1문자 약호로 표기한다.
(1) DCAYH(Xaa2)GELVWCT(서열 번호 3)
(2) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열 번호 4)
(3) RCAYH(Xaa2)GELVWCS(서열 번호 5)
(4) GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(서열 번호 6)
(5) SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열 번호 7)
(6) GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열 번호 8)
(7) GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열 번호 9)
(8) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(서열 번호 10)
(9) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH(서열 번호 11)
(10) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(서열 번호 12)
(11) SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(서열 번호 13)
(12) SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(서열 번호 14)
(13) RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH(서열 번호 15)
(14) G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H(서열 번호 16)
상기 식 (i)로 표시되는 펩티드, 또는 서열 (1) 내지 (14)를 갖는 펩티드는, 바람직하게는 N 말단에 링커 (L)이 도입되어, C 말단이 아미드화된다. 또한, 이들 펩티드 Xaa2가 가교제로 수식되어 있으며, 이에 의해, 가교제를 통해 펩티드가 인간 IgG 또는 토끼 IgG의 Fc 영역과 공유 결합할 수 있다. 여기서, 본 명세서에 있어서, 「인간 항HER 항체」라고 할 때는, 인간 IgG에 있어서, 항체 수식 펩티드를 결합할 수 있는 영역이 보존되어 있는 항HER 항체를 의미하고, 바람직하게는 인간 IgG의 Fc 영역이 보존되어 있는 항HER2 항체를 말한다.
가교제는 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하고, 원하는 아미노산(예를 들어, 리신, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 2-아미노수베르산 또는 디아미노프로피온산 및 아르기닌 등)과 결합 가능한 부위를 적어도 2군데 갖는 화합물로 할 수 있다. 그 예로서, 한정되는 것은 아니지만, DSG(disuccinimidyl glutarate, 디숙신이미딜글루타레이트), DSS(disuccinimidyl suberate, 디숙신이미딜수베레이트) 등의 숙신이미딜기를 바람직하게는 2 이상 포함하는 가교제, DMA(dimethyl adipimidate·2HCl, 아디프이미드산디메틸이염산염), DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl, 피멜이미드산디메틸이염산염) 및 DMS(dimethyl suberimidate·2HCl, 수베르이미드산디메틸이염산염) 등의 이미드산 부분을 바람직하게는 2 이상 포함하는 가교제, 그리고 DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl, 3,3'-디티오비스프로피온이미드산디메틸이염산염) 및 DSP(dithiobis(succinimidyl propionate), 디티오비스숙신이미딜프로피온산) 등의 SS 결합을 갖는 가교제, SBAP(숙신이미딜3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트)를 들 수 있다. DSS 또는 DSG 등의 숙신이미딜기를 포함하는 가교제는, N 말단에 존재하는 1급 아민과 반응하기 때문에, N 말단을 블로킹한 후에 DSS 또는 DSG와 반응시킴으로써, Xaa2의 아미노기만을 DSS 또는 DSG로 특이적으로 수식할 수 있다. 예를 들어, 항체 수식 펩티드의 N 말단에 미리 링커 (L)을 도입시킨 후에 DSS 또는 DSG와 반응시켜도 된다. DSS 또는 DSG의 숙신이미딜기가, 인간 항HER2 항체(예를 들어, 트라스투주맙)에 있어서의 Eu 넘버링을 따르는 Lys248 잔기 또는 Lys246 잔기, 바람직하게는 Lys248 잔기와 반응함으로써, 인간 항HER2 항체가 펩티드로 부위 특이적으로 수식된다. 이들 Lys 잔기는 인간 IgG에 있어서의 Fc 영역에 존재하고, 트라스투주맙 이외의 항HER2 항체여도 당업자라면 항체의 아미노산 서열을 얼라인먼트하여, 상당하는 Lys 잔기를 특정할 수 있다.
(1-5) 링커 (L)
링커 (L)은, 본 발명의 방사성 복합체에 있어서, 킬레이트제와 펩티드를 연결할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 링커 (L)은 티오우레아 결합을 포함하는 것이 아니면 특별히 한정되지 않고, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬기, 폴리에틸렌글리콜(PEG)기, 펩티드, 당쇄, 디술피드기, 아미드기 및 이들의 조합 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 링커 (L)이란, 펩티드로 수식된 항HER2 항체와 킬레이트제의 접속에 사용되는 링커의 총칭이며, 항체 수식 링커 (L1) 및 킬레이트 링커 (L2)를 포함하는 용어이다. 항체 수식 링커 (L1)은 상세한 것은 후술하지만, (1-4)에서 설명한 펩티드의 N 말단측에 도입되는 것이며, 킬레이트 링커 (L2)도 상세한 것은 후술하지만, (1-3)에서 설명한 킬레이트제의 관능기에 도입되는 것이다.
본 발명에서 사용되는 링커 (L)은 클릭 반응으로 형성된 결합 부위를 포함하고 있어도 되고, 바람직하게는 항체 수식 링커 (L1)과 킬레이트 링커 (L2)가 클릭 반응에 의해 결합되어 있다. 본 발명에 있어서, 클릭 반응으로 형성된 결합 부위와, 킬레이트제 사이에, 티오우레아 결합을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 바꾸어 말하면, 킬레이트 링커 (L2)가 티오우레아 결합을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 여기서, 클릭 반응으로 형성된 결합 부위는, 바람직하게는 하기 식 (10a) 또는 (10b)로 표시되는 트리아졸 골격 함유 구조 또는 하기 식 (10c)로 표시되는 피리다진 골격 함유 구조를 생각할 수 있다. 식 (10a)과 식 (10b)는 이성체의 관계에 있기 때문에 임의의 비율로 포함되어 있어도 된다.
Figure pct00007
식 (10a) 및 식 (10b) 중, R1A는 킬레이트제와의 연결 부위를 나타내고, R2A는 항체 수식 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다. 식 (10c) 중, R3A 및 R4A 중 한쪽은 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타내고, 다른 쪽은 킬레이트제와의 연결 부위를 나타내고, R5A는 항체 수식 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다. 식 (10a), 식 (10b) 및 식 (10c)에 있어서, 항체 수식 펩티드와의 연결 부위는 항체 수식 링커 (L1)을 통해 펩티드가 연결되어 있으며, 킬레이트제와의 연결 부위는 킬레이트 링커 (L2)를 통해 킬레이트제가 연결되어 있다.
본 발명의 방사성 복합체는, 펩티드로 부위 특이적으로 항체가 수식되고, 펩티드와 킬레이트제가 링커 (L)을 통해 연결되기 때문에, 항HER2 항체 1분자에 대하여 1분자 또는 2분자의 킬레이트제를 복합화시킨 것이 된다.
(1-6) 복합체의 제조 방법
본 발명의 방사성 복합체의 제조 방법은, 킬레이트제와 항HER2 항체를 콘주게이션하는 콘주게이션 공정과, 방사성 금속핵종과 킬레이트제의 착체를 형성하는 착체 형성 공정의 2개의 공정으로 제조할 수 있다. 콘주게이션 공정은 착체 형성 공정 전이어도 되고 착체 형성 공정 후여도 된다.
콘주게이션 공정에 있어서는 전술한 식 (i)로 나타내는 항체 수식 펩티드를 갖는 킬레이트제 또는 링커 (L)을, 항체의 Fc 영역에 부위 특이적으로 수식한다.
착체 형성 공정에서는, 킬레이트제에 방사성 금속핵종을 킬레이트(착체 형성)시킨다. 여기서 사용하는 방사성 금속핵종은, 착체 형성 효율을 높이는 관점에서, 전리 가능한 양태에서 사용하는 것이 바람직하고, 이온의 양태에서 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 착체 형성 공정은, 방사성 금속핵종과의 착체 형성이 가능하면, 킬레이트제로의 방사성 금속핵종의 첨가 순서는 상관없다. 예를 들어, 물을 주체로 하는 용매에, 방사성 금속 이온이 용해된 용액을 방사성 핵종으로서 사용할 수 있다.
착체 형성 후, 여과 필터, 멤브레인 필터, 각종 충전제를 충전한 칼럼, 크로마토그래피 등을 사용하여, 얻어진 착체를 정제해도 된다.
본 발명의 방사성 복합체의 제조 방법은, 착체 형성 공정 후에 콘주게이션 공정이 실행되는 것이 바람직하다.
보다 바람직한 양태에 있어서, 착체 형성 공정 (A)에서는, 방사성 금속핵종과, 클릭 반응 가능한 제1 원자단을 항체와 복합화를 가능하게 하기 위한 치환기로서 갖는 킬레이트제 사이에 착체를 형성한다. 이어서, 콘주게이션 공정 (B)에서는, 전술한 식 (i)로 나타내는 항체 수식 펩티드와 클릭 반응 가능한 제2 원자단을 갖는 항체 수식 링커 (L1)을 사용하여, Fc 영역이 부위 특이적으로 수식된 펩티드 수식 항체와, 공정 (A)에서 얻어진 착체 형성된 킬레이트제 사이에 클릭 반응을 실행하여, 본 발명의 방사성 복합체를 얻는다.
이하 공정 (A) 및 (B)에 대해서, 상세하게 설명한다.
클릭 반응 가능한 제1 원자단과 제2 원자단의 조합으로서는, 클릭 반응의 종류에 따라서 적절한 것이 선택되고, 예를 들어 알킨과 아지드의 조합, 1,2,4,5-테트라진과 알켄의 조합 등을 들 수 있다. 이들 원자단은, 제1 원자단이 상기 원자단의 조합 중 하나를 갖고, 제2 원자단이 상기 원자단의 조합 중 제1 원자단과 다른 하나가 되는 원자단을 갖고 있으면 된다. 킬레이트제 및 항체의 안정성과, 이들의 결합 효율의 향상을 양립시키는 관점에서, 킬레이트 링커 (L2)가 알킨이며 또한 항체 수식 링커 (L1)이 아지드이거나, 또는 킬레이트 링커 (L2)가 1,2,4,5-테트라진이며 또한 항체 수식 링커 (L1)이 알켄인 것이 바람직하다. 이러한 원자단의 조합에 의한 클릭 반응의 구체예로서, 휘스겐 환화 부가 반응, 혹은 역전자 요청형 딜스알더 반응 등을 들 수 있다.
클릭 반응 가능한 원자단의 조합의 구체예로서는, 이하의 식에 나타내는 바와 같이, 제1 원자단의 알킨으로서 디벤질시클로옥틴(DBCO)을 포함하는 원자단(식 (1a))과, 제2 원자단의 아지드로서 아지드기를 포함하는 원자단(식 (2a))의 조합, 혹은 제1 원자단이 1,2,4,5-테트라진을 포함하는 원자단(식 (1b))과, 제2 원자단의 알켄으로서 trans-시클로옥텐(TCO)을 포함하는 원자단(식 (2b))의 조합을 들 수 있다. 바람직하게는 식 (1a)과 식 (2a)의 조합이다.
Figure pct00008
식 (1a) 중, R1은 킬레이트제와의 연결 부위를 나타내고, 식 (2a) 중, R2는 항체 수식 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다.
Figure pct00009
식 (1b) 중, R3 및 R4 중 한쪽이 킬레이트제와의 연결 부위 또는 항체 수식 펩티드와의 연결 부위를 나타내고, 다른 쪽이 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타낸다. R5는 식 (1b)의 원자단이 킬레이트제와 연결되어 있을 때, 항체 수식 펩티드와의 연결 부위이며, 식 (1b)의 원자단이 항체 수식 펩티드와 연결되어 있을 때 킬레이트제와의 연결 부위를 나타낸다.
제1 원자단의 알킨으로서, 상기 식 (1a)로 표시되는 디벤질시클로옥틴(DBCO)을 포함하는 원자단을 사용하는 경우에는, 시판되고 있는 각종 DBCO 시약을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 DBCO-C6-산, 디벤질시클로옥틴-아민, 디벤질시클로옥틴 말레이미드, DBCO-PEG산, DBCO-PEG-알코올, DBCO-PEG-아민, DBCO-PEG-NH-Boc, 카르복시로다민-PEG-DBCO, 술포로다민-PEG-DBCO, TAMRA-PEG-DBCO, DBCO-PEG-비오틴, DBCO-PEG-DBCO, DBCO-PEG-말레이미드, TCO-PEG-DBCO, DBCO-mPEG 등을 선택할 수 있지만, 바람직하게는 디벤질시클로옥틴 말레이미드를 사용한다.
착체 형성 공정 (A)에서는, 보다 바람직하게는 이하의 식 (ii)로 표시되는 구조를 갖는 화합물을 사용한다.
A-B-C··· (ii)
식 (ii) 중, A는 전술한 킬레이트제이며, B와 C의 총칭이 킬레이트 링커 (L2)이다
식 (ii) 중, B는 이하의 식 (iib)로 표시된다.
Figure pct00010
식 (iib) 중, La 및 Lb는 독립적으로 적어도 아미드 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, t는 0 이상 30 이하의 정수이며, s는 0 또는 1이며, *은 A와의 결합 부위이며, **은 C와의 결합 부위이다.
식 (ii) 중, C는 이하의 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체 또는 식 (iid)로 표시되는 테트라진 유도체 중 어느 것이다.
Figure pct00011
식 (iic) 중, X는 CHRk-** 또는 N-**이며, Y는 CHRk 또는 C=O이며, Rk는 독립적으로 수소 원자이거나, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며, X가 CHRk-**이며, Y가 CHRk인 경우에는, Rk 부분이 하나가 되어 시클로알킬기를 형성해도 되고, Rf, Rg, Rh 및 Ri는 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며, Rf와 Rg가 하나가 되고, 혹은 Rh와 Ri가 하나가 되어 탄화수소환을 형성해도 되고, **은 B와의 결합 부위를 나타내고, 식 (iid) 중, **은 B와의 결합 부위를 나타내고, Rj는 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타낸다)
공정 (A)에서 사용되는 킬레이트제로서, 상기 식 (A) 중, R11 내지 R14가 -(CH2)pCOOH이며, p가 1이며, R15가 B와의 결합 부위인 DOTA 유도체; 또는 R11 내지 R14가 -(CH2)pCOOH이며, p가 1이며, R12가 B와의 결합 부위(*)이며, R15가 수소 원자인 DO3A 유도체 혹은 DOTAGA 유도체 중 어느 것이 보다 바람직하다.
식 (ii) 중, A가 상기 DO3A인 경우, B는 La가 아미드 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, s가 0 또는 1이며, s가 1인 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이며, Lb가 아미드 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, C는 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체이며, 식 (iic) 중, X가 N―**이며, Y가 CHRk이며, Rk가 수소 원자이며, Rf와 Rg가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있으며, Rh와 Ri가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있으며, **은 B와의 결합 부위인, DO3A-PEGt-DBCO가 바람직하다.
식 (ii) 중, A가 상기 DOTAGA 유도체인 경우, B는 La가 아미드 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, s가 0 또는 1이며, s가 1인 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이며, Lb가 아미드 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이며, C는 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체이며, 식 (iic) 중, X가 N-**이며, Y가 CHRk이며, Rk가 수소 원자이며, Rf와 Rg가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있으며, Rh와 Ri가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있으며, **은 B와의 결합 부위인, DOTAGA-PEGt-DBCO 유도체가 바람직하다. 보다 바람직하게는 하기 DOTAGA-DBCO이다.
Figure pct00012
킬레이트제와 방사성 금속핵종의 몰 비율은, 킬레이트부/방사성 금속핵종으로서, 하한이 10/1 이상이 바람직하고, 100/1 이상이 보다 바람직하고, 500/1 이상이 더욱 바람직하고, 상한이 10000/1 이하가 바람직하고, 8000/1 이하가 보다 바람직하고, 7000/1 이하가 더욱 바람직하고, 예를 들어 100/1 이상 7000/1 이하의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 500/1 이상 7000/1 이하의 범위이다.
착체 형성 반응은 용매 하에서 행하는 것이 바람직하다. 용매로서는, 예를 들어 물, 생리 식염수, 또는 아세트산나트륨 완충액, 아세트산암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, 트리스히드록시메틸아미노메탄 완충액(Tris 완충액), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 완충액(HEPES 완충액), 혹은 테트라메틸암모늄아세트산 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다.
용매의 액량은 특별히 한정되지 않지만, 제조 공정에 있어서의 실용성의 관점에서, 공정 (A)의 개시 시에 있어서, 하한은 0.01mL 이상, 바람직하게는 0.1mL 이상, 보다 바람직하게는 1.0mL 이상, 더욱 바람직하게는 10mL 이상, 보다 더욱 바람직하게는 100mL 이상이며, 상한은 바람직하게는 1000mL 이하, 보다 바람직하게는 100mL 이하, 더욱 바람직하게는 10mL 이하, 보다 더욱 바람직하게는 1.0mL 이하이며, 예를 들어 0.01mL 이상 100mL 이하의 범위이다.
착체 형성 반응의 반응액 중의 킬레이트제의 농도는, 목적으로 하는 킬레이트제의 수율의 관점에서, 각각 독립적으로 공정 (A)의 개시 시에 있어서, 하한은 바람직하게는 0.001㎛ol/L 이상, 보다 바람직하게는 0.01㎛ol/L 이상, 더욱 바람직하게는 0.1㎛ol/L 이상, 보다 바람직하게는 1㎛ol/L 이상이며, 상한은 바람직하게는 1000㎛ol/L 이하, 보다 바람직하게는 100㎛ol/L 이하, 더욱 바람직하게는 10㎛ol/L 이하이며, 예를 들어 1㎛ol/L 이상 100㎛ol/L 이하의 범위를 들 수 있다.
착체 형성 반응의 온도로서는, 예를 들어 실온(25℃)이어도 되고, 가열 조건 하여도 되지만, 킬레이트제의 분해 억제와 착체의 형성 효율 향상을 양립시키는 관점에서, 하한은 바람직하게는 20℃ 이상, 보다 바람직하게는 30℃ 이상, 더욱 바람직하게는 35℃ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 37℃ 이상, 특히 바람직하게는 45℃ 이상이고, 상한은 바람직하게는 150℃ 이하, 보다 바람직하게는 120℃ 이하, 더욱 바람직하게는 100℃ 이하, 보다 더욱 바람직하게는 90℃ 이하이며, 예를 들어 30℃ 이상 100℃ 이하의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 35℃ 이상 90℃ 이하의 범위이다.
공정 (B)에서 사용되는 항체는, 전술한 식 (i)로 나타내는 항체 수식 펩티드와, 클릭 반응 가능한 제2 원자단을 갖는 항체 수식 링커 (L2)를 사용하여, 상기 「(1-2) 항체」의 항에서 상세하게 설명한 항HER2 항체의 Fc 영역(정상 영역)이 부위 특이적으로 수식된 펩티드 수식 항체이다.
항체 수식 펩티드는 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 묻지 않는 아미노산을 조합하여 사용하고, 예를 들어 액상 합성법, 고상 합성법, 자동 펩티드 합성법, 유전자 재조합법 및 파지 디스플레이법 등의 펩티드 합성법에 제공함에 따라서 제조할 수 있다. 펩티드의 합성 시에, 필요에 따라서, 사용되는 아미노산의 관능기 보호를 행해도 된다. 이들은, 예를 들어 WO2017/217347 및 WO2018/230257에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
항체 수식 링커 (L2)는 항체 수식 펩티드와, 이하의 식 (S1)로 표시되는 링커 (L2)가 결합된 것이어도 된다.
*-((Li)m-Z)k-Lii-AG2 ··· (S1)
(식 중, *은 펩티드의 N 말단 또는 C 말단과의 결합 부위를 나타내고,
Li는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 링커부이며,
m은 1 이상 50 이하의 정수이며,
Z는 (Li)m과 Lii를 결합하는 제2 링커부이며,
k는 0 또는 1이며,
Lii는 제2 PEG 링커부이며,
AG2는 제2 원자단이다.)
상기 식 (S1)에 있어서, Z의 구조는 (Li)m과 Lii를 서로 결합하는 링커 구조라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1 이상 5 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우, Z에 포함되는 아미노산 서열은, 시스테인 잔기를 포함하는 것이 바람직하고, 시스테인 잔기의 티올기와 말레이미드기의 결합에 의해 형성된 티오에테르기를 통해 L2와 결합되어 있는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, Lii를 구성하는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 링커부는 이하의 식 (P2)에 나타내는 구조를 갖고 있는 것이 바람직하다. 식 (P2) 중, n은 정수이며, 바람직하게는 1 이상 50 이하, 보다 바람직하게는 1 이상 20 이하, 더욱 바람직하게는 2 이상 10 이하, 한층 바람직하게는 2 이상 6 이하이다.
Figure pct00013
PEG 링커부의 구조의 일단부는, 시판되고 있는 PEG화 시약에서 유래하는 구조 또는 PEG화할 때에 통상 사용되는 시약에서 유래하는 구조에 의해 수식되어 있어도 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 디글리콜산 또는 그의 유도체, 말레이미드 또는 그의 유도체에서 유래하는 구조가 예시된다.
항체 수식 링커 (L2)에의 상기 제2 원자단에의 도입 방법은, 상술한 방법에 의해 원하는 아미노산 서열을 갖는 항체 수식 펩티드를 얻은 후, 해당 펩티드를, 용해 보조제 및 환원제, 그리고 필요에 따라서 산을 첨가한 용액에 용해시키고, 해당 용액에 제2 원자단으로서, 아지드기 또는 trans-시클로옥텐(TCO)을 포함하는 원자단의 유기 용매 용액을 첨가하여, 실온에서 교반함으로써 도입하는 방법을 들 수 있다.
제2 원자단으로서 아지드기를 포함하는 원자단을 도입하는 경우에는, 시판되고 있는 아지드기 도입 시약을 사용하여, 통상의 방법에 따라서, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 직접 아지드기를 도입하거나, 또는 상술한 링커 구조를 통해 아지드기를 포함하는 원자단을 도입할 수 있다. 사용되는 아지드기 도입 시약으로서는, 예를 들어, 실릴아지드, 인산아지드, 알킬암모늄아지드, 무기 아지드, 술포닐아지드 또는 PEG 아지드 등을 들 수 있다.
또한, 제2 원자단으로서 TCO를 포함하는 원자단을 도입하는 경우에는, TCO를 포함하는 시판되고 있는 클릭 케미스트리용 시약을 사용하여, 통상의 방법에 따라서, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 직접 TCO를 도입하거나, 또는 상술한 링커 구조를 통해 TCO를 포함하는 원자단을 도입할 수 있다.
항체 수식 펩티드와 인간 항HER2 항체를 결합시켜, 펩티드 수식 항체를 얻는 방법은, WO2016/186206의 기재에 준하여, 예를 들어 상술한 항체 수식 펩티드와, 인간 항HER2 항체와, 가교제와, 필요에 따라서 촉매를, 적절한 완충액 중에 분산시켜 행할 수 있다. 여기서, 가교제는 상술한 것을 사용할 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 개시는, 가교제로 수식되어 있는 항체 수식 펩티드와 인간 항HER2 항체를 혼합하는 공정을 포함하는 항체 수식 펩티드와 인간 항HER2 항체의 복합체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 공정에 의해, 가교제로 수식되어 있는 항체 수식 펩티드와 인간 항HER2 항체 사이에 가교 반응이 발생할 수 있다. 가교 반응은, 항체 수식 펩티드의 상기 Xaa2의 아미노산 잔기와, 인간 IgG Fc에 있어서의 Eu 넘버링(numbering)을 따르는 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게는 Lys248 사이에서 부위 특이적으로 발생할 수 있다.
해당 혼합 공정의 조건은, 항체 수식 펩티드와 인간 항HER2 항체 사이에 가교 반응이 발생하는 조건에서 행하는 것이면 특별히 한정하지 않는다. 예를 들어, 항체 수식 펩티드와 인간 항HER2 항체를, 적당한 버퍼 중에 있어서, 실온(예를 들어 약 15℃ 내지 30℃)에서 혼합함으로써 반응을 행할 수 있다. 해당 혼합 공정은, 필요에 따라서 가교 반응을 촉진시키는 촉매를 적량 가하여 행해도 된다.
일례로서, 적어도 물을 포함하는 용매를 첨가하여, 인간 항HER2 항체를 용해시킨다. 이 용매는 물 이외에는, 예를 들어 디메틸술폭시드, 아세토니트릴, 생리 식염수, 또는 아세트산나트륨 완충액, 아세트산암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, Tris 완충액, HEPES 완충액, 테트라메틸암모늄아세트산 완충액 혹은 히스티딘 완충액 등의 완충액 등을 들 수 있다. 완충액을 사용하는 경우, 항체의 안정성의 관점에서, 25℃에서의 pH를 바람직하게는 4.0 이상 10.0 이하, 보다 바람직하게는 5.5 이상 8.5 이하로 한다. 항체의 농도는 가교 반응의 개시 시에 있어서, 바람직하게는 하한을 1.0㎛ol/L 이상, 상한을 1000㎛ol/L 이하로 하고, 상한에 대하여 보다 바람직하게는 500㎛ol/L 이하로 하는 것이 바람직하다.
이어서, 가교제에 의해 수식된 항체 수식 펩티드와 필요에 따라서 촉매를 첨가하여, 10℃ 이상 30℃ 이하에서 분산시켜 행할 수 있다.
해당 혼합 공정에서의 항체 수식 펩티드와 인간 항HER2 항체의 혼합 비율은, 특별히 한정하지 않는다. 항체 수식 펩티드와 인간 항HER2 항체의 몰 비율은, 예를 들어 1:1 내지 20:1, 바람직하게는 2:1 내지 20:1 또는 5:1 내지 10:1로 할 수 있다.
어떤 바람직한 양태에서는, 상기 혼합 공정에 있어서는, 인간 항HER2 항체에 대하여 항체 수식 펩티드(몰비)는 0.5 내지 2.2, 바람직하게는 0.8 내지 1.8로 혼합할 수 있다. 이렇게 함으로써, 인간 항HER2 항체 1분자에 대하여, 항체 수식 펩티드 1분자가 결합된 항체(이하, 「1가 항체」라고 함)를 효율적으로 얻을 수 있다.
해당 혼합 공정에서의 혼합 시간(반응 시간)은, 항체 수식 펩티드와 인간 항HER2 항체 사이에 가교 반응이 발생하는 한 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 1분 내지 5시간, 바람직하게는 10분 내지 2시간으로 할 수 있다.
이상의 공정을 거쳐 얻어지는 펩티드 수식 항체는, 인간 항HER2 항체 1분자에 대하여 항체 수식 펩티드 1분자가 결합된 항체(즉, 1가 항체)와, 인간 항HER2 항체 1분자에 대하여 항체 수식 펩티드 2분자가 결합된 항체(이하, 「2가 항체」라고 함)를 임의의 비율로 함유하는 혼합물이지만, 이것을 그대로 이후의 공정에 제공해도 되고, 여과 필터, 멤브레인 필터, 각종 충전제를 충전한 칼럼, 각종 크로마토그래피 등의 방법으로, 미수식 항체와, 1가 항체와, 2가 항체를 분리 정제한 후에 어느 가수의 항체만을 이후의 공정에 제공해도 된다. 정제의 결과, 미수식 항체와 다른 가수의 항체의 분리를 할 수 없는 경우에는, 이들을 함유하는 혼합물로서 이후의 공정에 제공해도 된다.
미수식 항체와, 1가 항체와, 2가 항체를 분리 정제하는 경우에는, 상기 어느 정제 방법으로 분리 정제해도 되지만, 각종 충전제를 충전한 칼럼을 사용할 수 있고, 예를 들어 프로테인 A, 프로테인 G 또는 상술한 항체 수식 펩티드 등의 단백질이 담체에 결합된 충전제가 충전된 칼럼을 사용할 수 있다. 이러한 칼럼에 충전되는 충전제의 담체 형상으로서는, 겔(예를 들어 칼럼용 겔), 입자, 비즈, 나노 입자, 미립자 및 매크로 비즈 등의 형상을 들 수 있고, 담체의 재질로서는 자성 물질, 라텍스, 아가로오스, 유리, 셀룰로오스, 세파로스, 니트로셀룰로오스, 폴리스티렌, 기타 고분자 재료를 들 수 있다. 구체적으로는 상술한 항체 수식 펩티드를, 칼럼용 겔에 결합시킨 IgG-BP 칼럼을 예시할 수 있다(WO2021/080008 참조).
IgG-BP 칼럼은 IgG 결합 펩티드를 고상화한 칼럼이다. 2가 항체는, 결합 부위가 이미 IgG 결합 펩티드로 점유되어 있기 때문에 당해 칼럼에는 결합할 수 없고, 1가 항체만이 당해 칼럼에 대하여 친화성을 나타낸다. 이 IgG-BP 칼럼을 사용하여, 항체 수식 펩티드에 대한 각각의 상호 작용의 차이를 이용하여, 미수식 항체 및 1가 항체를 상대적으로 많이 포함하는 제1 항체 조성물과, 2가 항체를 상대적으로 많이 포함하는 제2 항체 조성물을 각각 분리 정제할 수 있다. 어떤 바람직한 양태에서는, 제1 항체 조성물에 있어서, 미수식 항체와 1가 항체의 몰비가 4 내지 47:53 내지 96, 바람직하게는 4 내지 30:70 내지 96, 보다 바람직하게는 4 내지 20:80 내지 96, 더욱 바람직하게는 4 내지 10:90 내지 96이다.
이와 같이 하여, 분리 정제한 제1 항체 조성물 또는 제2 항체 조성물은, 그대로 이후의 공정 (B)에 있어서의 클릭 반응에 사용해도 되고, 함유하는 펩티드 수식 항체의 단백질 농도를 조절하고 나서 공정 (B)에 있어서의 클릭 반응에 사용해도 된다.
공정 (B)에 있어서의 클릭 반응은, 킬레이트제가 갖는 클릭 반응 가능한 제1 원자단과, 펩티드 수식 항체가 갖는 클릭 반응 가능한 제2 원자단 사이에 실행되는 것이다. 이러한 클릭 반응에 의해 킬레이트제와 항체를 연결하는 결합기(항체의 복합화를 가능하게 하는 치환기)가 형성된다.
펩티드 수식 항체와 공정 (A)에서 얻어진 착체가 클릭 반응 가능하면, 이들의 첨가 순서는 막론하고, 예를 들어 용매를 수용한 반응 용기에, 해당 착체 및 해당 펩티드 수식 항체의 한쪽을 첨가하고, 이어서 다른 쪽을 첨가하여 반응시켜도 되고, 해당 킬레이트제 및 해당 항체의 한쪽을 용매에 분산시킨 분산액에 다른 쪽을 첨가하여 반응시켜도 된다. 혹은, 용매를 수용한 반응 용기에, 이들을 동시에 첨가하여 반응시켜도 된다.
공정 (B)의 클릭 반응에 사용되는 용매로서는, 물을 포함하는 용매를 사용할 수 있고, 예를 들어 물, 생리 식염수, 또는 아세트산나트륨 완충액, 아세트산암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, Tris 완충액, HEPES 완충액, 혹은 테트라메틸암모늄아세트산 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다. 완충액을 사용하는 경우, 착체 및 항체의 안정성과, 이들의 결합 효율을 양립시키는 관점에서, 25℃에서의 pH를 바람직하게는 4.0 이상 10.0 이하, 더욱 바람직하게는 5.5 이상 8.5 이하로 한다.
반응액량은 특별히 한정되지 않지만, 제조 공정에 있어서의 실용성의 관점에서, 공정 (B)의 개시 시에 있어서, 하한은 0.001mL 이상이 바람직하고, 0.01mL 이상이 보다 바람직하고, 0.1mL 이상이 더욱 바람직하고, 1mL 이상이 보다 더욱 바람직하고, 상한은 1000mL 이하가 바람직하고, 100mL 이하가 보다 바람직하고, 10mL 이하가 더욱 바람직하고, 1mL 이하가 보다 더욱 바람직하고, 예를 들어 0.001mL 이상 1000mL 이하의 범위가 바람직하고, 0.1mL 이상 10mL 이하의 범위가 보다 바람직하다.
또한, 킬레이트제 및 항체의 반응액 중의 농도는, 각각 독립적으로 공정 (B)의 개시 시에 있어서, 하한으로서, 0.001㎛ol/L 이상이 바람직하고, 0.01㎛ol/L 이상이 보다 바람직하고, 0.1㎛ol/L 이상이 더욱 바람직하고, 1.0㎛ol/L 이상이 보다 더욱 바람직하고, 상한으로서, 1000㎛ol/L 이하가 바람직하고, 100㎛ol/L 이하가 보다 바람직하고, 예를 들어 0.1㎛ol/L 이상 1000㎛ol/L 이하의 범위가 바람직하고, 1㎛ol/L 이상 100㎛ol/L 이하의 범위인 것이, 목적으로 하는 복합체의 수량의 관점에서 보다 바람직하다.
항체의 의도하지 않은 변성을 방지하면서, 반응 효율을 높이는 관점에서, 공정 (B)에 있어서의 클릭 반응은, 반응 온도의 상한은 50℃ 이하가 바람직하고, 40℃ 이하가 보다 바람직하다. 또한, 반응 온도의 하한은, 반응이 진행되는 온도라면 특별히 제한은 없지만, 15℃ 이상이 바람직하다. 클릭 반응의 반응 시간은, 상술한 반응 온도인 것을 조건으로 하여, 바람직하게는 5분 이상, 보다 바람직하게는 10분 이상이며, 24시간 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20시간 이하이며, 예를 들어 5분 이상 24시간 이하의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10분 이상 20시간 이하의 범위이다.
얻어진 복합체는 이것을 그대로 사용해도 되고, 혹은 여과 필터, 멤브레인 필터, 각종 충전제를 충전한 칼럼, 크로마토그래피 등을 사용하여 정제해도 된다.
공정 (A) 및 (B)에 의해 제조되는 복합체는, 항HER2 항체의 Fc 영역의 리신 잔기가 킬레이트제에 의해 특이적으로 수식된 것이다. 이 복합체는 해당 항체 1분자에 대하여 상기 킬레이트제를 1분자 또는 2분자 구비한다. 킬레이트제는 링커 (L)을 통해, 본 발명의 항체 Fc 영역을 부위 특이적으로 수식하고 있다. 해당 링커 (L)은, 킬레이트제에 접속되는 킬레이트 링커 (L2), 해당 링커 (L2)에 접속하는 제1 원자단, 제1 원자단과 클릭 반응할 수 있는 제2 원자단, 제2 원자단에 접속하는 항체 수식 링커 (L1)(상기 식 (i)로 표시되는 항체 수식 펩티드를 포함함)로 구성된다. 따라서, 해당 링커 (L)은 제1 원자단과 제2 원자단에서 유래하는 화학 구조를 갖는다. 이러한 화학 구조로서는, 상술한 식 (10a) 또는 (10b)로 표시되는 트리아졸 골격 함유 구조 또는 하기 식 (10c)로 표시되는 피리다진 골격 함유 구조를 생각할 수 있다. 식 (10a)와 식 (10b)는 이성체의 관계에 있기 때문에 임의의 비율로 포함되어 있어도 된다.
(1-7) 방사성 의약(방사성 의약 (1))
방사성 의약이란, 본 발명의 방사성 복합체를 포함하고, 대상의 생체 내에의 투여에 적합한 형태로 되어 있는 조성물을 가리킨다. 방사성 의약은, 예를 들어 상술한 (1-6)에 나타내는 방법으로 제조한 방사성 복합체를 그대로, 또는 이것을 정제한 후에, 물을 주체로 하고, 또한 생체와 대략 등장의 용매에 용해시켜 제조할 수 있다. 이 경우, 방사성 의약은 수용액의 형태인 것이 바람직하고, 필요에 따라서, 약학적으로 허용되는 다른 성분을 포함하고 있어도 된다. 방사성 의약은 그의 유효량이 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 혹은 근육 내 등의 비경구적으로 생체에 투여되어, 암의 치료, 암의 진단, 혹은 병소의 검출 등에 사용된다.
여기서 투여 대상으로서는 인간 또는 마우스, 래트, 원숭이, 모르모트, 침팬지, 양, 염소, 개, 고양이, 돼지, 소 혹은 말 등의 동물이지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 인간이다.
바람직한 대상 질환으로서 HER2가 과잉 발현되고 있는 암을 들 수 있다. 본 발명에서 치료, 진단 혹은 검출되는 HER2가 과잉 발현되고 있는 암은, HER2를 과잉 발현되고 있으면 그 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 타액선암, 난소암, 방광암, 담관암, 위암 또는 유방암을 들 수 있다. 또한, HER2가 과잉 발현되고 있는 암은, 어떠한 병기의 암이어도 되고, 국한성 혹은 전이성, 또는 원발성 혹은 재발성 중 어느 것이어도 된다. 여기서 「과잉 발현」이란, 공지된 검사 수법으로 측정한 경우에 종양 조직에 있어서의 HER2 유전자가 비종양 조직에 비교하여 유의미한 증폭 또는 HER2 단백질의 발현이 비종양 조직에 비교하여 유의미한 항진이 관찰되는 상태를 말한다.
여기에서의 「유효량」이란, 투여 대상에 있어서의 진단상 또는 치료상 유효한 효과를 얻을 수 있는 양이다. 대상에 투여해야 할 유효량은, 대상의 종류, 대상의 체중, 투여하는 제형(정제, 주사제 등) 및 경로(경구 투여, 비경구 투여 등), 및 질환(예, 암)의 중증도 등에 따라서 다르다. 의사나 수의사는 그들의 인자를 고려하여, 적절한 유효량을 결정할 수 있다.
본 발명의 방사성 의약은, 실온에서 보관했을 때, 그 방사성 의약을 구성하는 방사성 금속핵종의 반감기를 기준으로 하여, 반감기의 1 이상 5 이하의 배수의 기간 경과 시점에 있어서, 일정한 비율 이상의 방사 화학적 순도를 갖는다. 상기 방사성 금속핵종이 β선 핵종(예를 들어, Lu-177 또는 Y-90)일 때, 바람직하게는 실온에서 제조 종료로부터 7일간 보관했을 때의 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상이며, 보다 바람직하게는 95％ 이상이다. 또한, 방사성 금속핵종이 α선 핵종(예를 들어, Ac-225)일 때, 바람직하게는 실온에서 제조 종료로부터 14일간 보관했을 때의 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상이며, 보다 바람직하게는 95％ 이상이다. 여기서 본 명세서에 있어서의 「실온」이란, 바람직하게는 일본 약전에서 정의되는 「상온」을 말하고, 구체적으로는 15 내지 25℃이다.
여기서, 방사 화학적 순도는, 시료를 시판되고 있는 방사선 검출기로 분석한 경우에 검출된 전방사능(카운트)에 대한, 복합체에 상당하는 피크의 방사능(카운트)의 백분율을 말한다. 방사 화학적 순도의 분석에는, 고속 액체 크로마토그래피나 박층 크로마토그래피를 사용할 수 있지만, 박층 크로마토그래피를 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 후술하는 실시예에 기재된 조건을 사용한 박층 크로마토그래피를 사용한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방사성 의약은, 수용액의 형태인 것이 바람직하지만, 상기한 바와 같이 방사 화학적 순도를 유지하는 관점에서 완충액의 형태가 보다 바람직하다. 완충액으로서는, 항HER2 항체 또는 항HER2 항체의 ADC를 유효 성분으로서 함유하는 항체 의약에서 사용되고 있는 임의의 완충액을 사용할 수 있고, 특별히 한정되지 않는 일례로서, 히스티딘 완충액 또는 숙신산 완충액을 사용할 수 있다. 히스티딘 완충액은 히스티딘과 그의 염으로 구성되고, 예를 들어 히스티딘과 그 염산염, 또는 히스티딘과 그 아세트산염으로 구성할 수 있다. 숙신산 완충액은 숙신산과 그의 염으로 구성되고, 예를 들어 숙신산과 그 나트륨염으로 구성할 수 있다. 본 발명의 방사성 의약에는, 수크로오스 또는 트레할로오스 등의 임의의 당류를 포함하고 있어도 되고, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 등의 가용화제를 포함하고 있어도 된다.
방사성 금속핵종으로서 치료 효과를 갖는 것, 구체적으로는 α선을 방출하는 방사성 핵종 또는 β선을 방출하는 핵종(바람직하게는 Ac-225, Y-90, Lu-177이며, 보다 바람직하게는 Ac-225)을 선택함으로써, 본 발명의 방사성 의약은 암의 방사선 내용 요법에 사용할 수 있다. 이 방사선 내용 요법에서는, 본 발명의 방사성 의약을 정맥 주사나 경구로 투여하여, 암 원발소나 전이소와 같은 병소 부위에 본 발명의 방사성 복합체를 집적시키고, 방사성 금속핵종으로부터 방출되는 방사선에 의해, 병소 부위의 암 세포를 파괴할 수 있다. 본 발명의 방사성 의약의 투여량 및 용량은, 유효 성분의 유효성, 투여의 형태·경로, 암의 진행 스테이지, 환자의 체형·체중·연령, 병용하는 다른 질환의 치료약 종류나 양에 따라서, 적절히 선택된다.
또한, 방사성 금속핵종으로서, 포지트론을 방출하는 방사성 핵종이나 γ선을 방출하는 방사성 핵종(바람직하게는 Zr-89)을 선택함으로써, 암의 진단 또는 병소의 검출에 사용할 수 있다. 포지트론을 방출하는 방사성 핵종이 사용된 방사성 의약의 경우, PET(Positron Emission Tomography) 검사에 적합하게 사용할 수 있고, γ선을 방출하는 방사성 핵종이 사용된 방사성 의약의 경우, SPECT(Single Photon Emission Computed Tomography) 검사에 적합하게 사용할 수 있다. 이것을 상술한 암의 방사선 내용 요법에 있어서의 암의 진단 또는 병소의 검출에 병용해도 된다. 본 발명의 암 진단용 방사성 의약은, 암의 방사선 내용 요법을 행하기 전의 진단에 사용해도 되고, 암의 방사선 내용 요법을 행한 후의 진단에 사용해도 된다. 암의 방사선 내용 요법을 행하기 전의 진단에 사용됨으로써, α선을 방출하는 금속핵종을 구비한 본 발명의 방사성 의약을 사용한 암의 방사선 내용 요법을 실행할지 여부의 치료 선택의 판단에 사용할 수 있다. 또한, 암의 방사선 내용 요법을 행한 후의 진단에 사용됨으로써, 본 발명의 방사성 의약을 사용한 암의 방사선 내용 요법의 효과가 있는지의 판정이나 투여량의 증감 등의 치료 계획의 적정화에 사용할 수 있다.
(2) 방사성 의약(방사성 의약 (2))
본 발명의 다른 양태는, 방사성 금속핵종이 킬레이트화된 킬레이트제와, 항HER2 항체의 복합체를 유효 성분으로서 함유하고, 항HER2 항체와 킬레이트제의 연결에 티오우레아 결합을 포함하지 않고, 실온에서 보관했을 때, 그 방사성 의약을 구성하는 방사성 금속핵종의 반감기를 기준으로 하여, 반감기의 1 이상 5 이하의 배수의 기간 경과 시점에 있어서, 일정한 비율 이상의 방사 화학적 순도를 갖는다. 상기 방사성 금속핵종이 β선 핵종(예를 들어, Lu-177 또는 Y-90)일 때, 바람직하게는 실온에서 제조 종료로부터 7일간 보관했을 때의 상기 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상이며, 보다 바람직하게는 95％ 이상이다. 또한, 방사성 금속핵종이 α선 핵종(예를 들어, Ac-225)일 때, 바람직하게는 실온에서 제조 종료로부터 14일간 보관했을 때의 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상이며, 보다 바람직하게는 95％ 이상이다. 실온의 정의는 상술한 방사성 의약 (1)과 마찬가지이다.
방사성 의약 (2)에서는, 킬레이트제와, 항HER2 항체의 복합화에 있어서, 펩티드를 사용한 부위 특이적 수식의 방법에 더하여, 이하 (a) 내지 (d)의 방법도 사용할 수 있지만, 이외에는 방사성 의약 (1)과 마찬가지이기 때문에, 설명을 생략한다.
(a) 항체의 힌지 부위에 있는 폴리펩티드 쇄간의 디술피드 결합(SS 결합)을 부분적으로 환원함으로써 발생하는 술프히드릴(SH)기에 대하여, SH기에 반응성을 갖는 말레이미드기를 갖는 킬레이트제 또는 링커 (L)로 수식하는 방법
(b) 유전자 공학에 의한 아미노산 변이에 의해, 항체에 새롭게 도입된 시스테인에 대하여 말레이미드기를 갖는 킬레이트제 또는 링커 (L)을 수식하는 방법
(c) 유전자 공학에 의한 아미노산 변이에 의해, 항체에 새롭게 도입된 아지드화 리신의 아지드기에, 클릭 반응을 이용하여, 알킨(예를 들어 디벤조시클로옥틴: DBCO)을 갖는 킬레이트제 또는 링커 (L)을 수식하는 방법
(d) 트랜스글루타미나아제를 이용하여, 항체가 특정한 위치에 도입된 글루타민에, 리신의 측쇄를 갖는 킬레이트제 또는 링커 (L)을 수식하는 방법
본 발명에서는, 항HER2 항체를 부위 특이적으로 수식하는 펩티드와 킬레이트제를 티오우레아 결합을 사용하지 않고 연결시키고 있으므로, 실온에서도 안정한 방사성 복합체, 및 방사성 의약으로 할 수 있다. 항체의 부위 특이적 수식은 랜덤 수식과는 달리, 1가 항체 혹은 2가 항체 또는 이들 양쪽을 임의의 비율로 포함하도록 할 수 있으므로, 안정된 품질의 방사성 복합체, 및 방사성 의약이 된다. 또한, 본 발명의 방사성 복합체는 종래와 동등한 약효를 유지하고 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 약효를 유지하면서, 보다 품질의 우수한 항HER2 항체의 복합체 및 그 방사성 의약을 제공할 수 있다.
이하의 양태도 본 발명의 기술적 사상에 포함된다.
[1] 펩티드로 부위 특이적으로 수식된 항HER2 항체와 킬레이트제의 복합체이며,
상기 킬레이트제에 방사성 금속핵종이 킬레이트화되어 있으며,
상기 펩티드와 킬레이트제가 링커 (L)을 통해 연결되어 있으며, 상기 링커 (L)은 티오우레아 결합을 포함하지 않는 복합체.
[2] 상기 킬레이트제가 DOTAGA(α-(2-카르복시에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)인, [1]에 기재된 복합체.
[3] 상기 펩티드가, 하기 식 (i):
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) ··· (i)
(식 (i) 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는 각각 연속되는 a개의 X, 연속되는 b개의 X, 연속되는 c개의 X, 및 연속되는 d개의 X를 나타내고,
X는 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기 중 어느 것도 갖지 않는 아미노산 잔기이며,
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이며, 또한 a+b+c+d≤14를 충족시키고,
Xaa1 및 Xaa3은 각각 독립적으로
측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기, 또는 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 단, Xaa1 및 Xaa3 중 어느 한쪽이 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기이며,
Xaa1 및 Xaa3이 연결됨으로써, 환 구조가 형성되어 있고,
Xaa2는 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산 또는 디아미노프로피온산이며, 또한 Xaa2가 가교제로 수식되어 있다.)로 표시되는 13 내지 17아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열인, [1] 또는 [2]에 기재된 복합체.
[4] 상기 방사성 금속핵종이 Ac-225, Y-90, Lu-177 또는 Zr-89인, [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 복합체.
[5] 상기 링커 (L)이 식 (10a), 식 (10b) 또는 식 (10c)를 포함하는, [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 복합체.
Figure pct00014
(식 (10a) 및 식 (10b) 중, R1A는 상기 킬레이트제와의 연결 부위를 나타내고, R2A는 상기 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다. 식 (10c) 중, R3A 및 R4A 중 한쪽은 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타내고, 다른 쪽은 상기 킬레이트제와의 연결 부위를 나타내고, R5A는 상기 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다.)
[6] 상기 펩티드와의 연결 부위와 상기 펩티드 사이에, 폴리에틸렌글리콜기를 포함하는, [5]에 기재된 방사성 복합체.
[7] N 말단에 아지드기가 도입된 상기 펩티드가 부위 특이적으로 수식되어 있는 항HER2 항체와, 하기 식으로 표시되는 DOTAGA-DBCO의 방사성 금속 착체를 클릭 반응시킴으로써 복합화한, [1] 내지 [6]에 기재된 방사성 복합체
Figure pct00015
[8] 상기 항HER2 항체가 트라스투주맙인, [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 복합체.
[9] 상기 항HER2 항체가 페르투주맙인, [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 복합체.
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 유효 성분으로서 함유하는 방사성 의약.
[11] 암의 방사선 내용 요법에 사용되는, [10]에 기재된 방사성 의약.
[12] 암의 진단에 사용되는, [10]에 기재된 방사성 의약.
[13] [11]에 기재된 방사성 의약을 사용한 암의 방사선 내용 요법에 병용되는, [12]에 기재된 방사성 의약.
[14] 방사성 금속핵종이 킬레이트화된 킬레이트제와, 항HER2 항체의 복합체를 유효 성분으로서 함유하고,
항HER2 항체와 킬레이트제의 연결에 티오우레아 결합을 포함하지 않고,
실온에서 7일간 보관했을 때의 상기 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상인, 방사성 의약.
[15] 상기 복합체가 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 복합체인, [14]에 기재된 방사성 의약.
[16] 암의 방사선 내용 요법에 사용되는, [15]에 기재된 방사성 의약.
[17] 암의 진단에 사용되는, [15]에 기재된 방사성 의약.
[18] [16]에 기재된 방사성 의약을 사용한 암의 방사선 내용 요법에 병용되는, [17]에 기재된 방사성 의약.
[19] 방사성 금속핵종이 킬레이트화된 킬레이트제와, 항HER2 항체의 복합체를 유효 성분으로서 함유하고,
항HER2 항체와 킬레이트제의 연결에 티오우레아 결합을 포함하지 않는, 하기 (1) 또는 (2)의 조건을 충족시키는 방사성 의약:
(1) 상기 방사성 금속핵종이 177Lu 또는 90Y이며, 실온에서 7일간 보관했을 때의 상기 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상이다.
(2) 상기 방사성 금속핵종이 225Ac이며, 실온에서 14일간 보관했을 때의 상기 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상이다.
[20] 방사성 금속핵종이 킬레이트화된 킬레이트제와, 항HER2 항체의 복합체를 유효 성분으로서 함유하고,
항HER2 항체와 킬레이트제의 연결에 티오우레아 결합을 포함하지 않고,
상기 방사성 금속핵종의 반감기를 기준으로 하여, 상기 반감기의 1 이상 5 이하의 배수의 기간 경과 시점에 있어서, 상기 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상인 방사성 의약.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되지 않는다. 이하의 표 중, 「-」란은 실시하지 않은 것을 나타낸다.
[실시예 1] 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO를 사용한 트라스투주맙과의 복합체의 제조
(1. 항체 수식 공정)
WO2017/217347에 기재된 방법으로, 하기 식 (P3)으로 표시되는 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 얻었다. 이 펩티드의 아미노산 서열은, 서열 번호 2의 Xaa2가 리신 잔기인 서열과 동일하고, 리신 잔기의 측쇄 말단 아미노기가 R1로 나타내지는 구조로 수식되어 있었다. 또한, 2개의 시스테인 잔기로 서로 디술피드 결합되어 있고, 펩티드의 N 말단은 디글리콜산 및 8개의 PEG를 갖는 링커 (L1) 구조를 통해, 제2 원자단인 아지드기를 포함하는 원자단으로서, 에틸아지드가 결합되어 있는 것이었다.
Figure pct00016
(서열 번호 17)
(식 (P3) 중, Gly는 글리신을, Pro는 프롤린을, Asp는 아스파르트산을, Cys는 시스테인을, Ala는 알라닌을, Tyr은 티로신을, His는 히스티딘을, Glu는 글루탐산을, Leu는 류신을, Val은 발린을, Trp는 트립토판을, Phe는 페닐알라닌을 나타낸다.)
이 펩티드와, 트라스투주맙(하셉틴(등록 상표), 로슈사제)을 0.02mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 6.0)에 혼합한 혼합액을, 실온에서 30분간 반응시켜, 펩티드 수식 항체를 포함하는 용액을 얻었다. 이 펩티드 수식 항체는 상기 펩티드에 의해 항체의 Fc 영역이 부위 특이적으로 수식된 것이다.
이어서, IgG-BP 칼럼에 통액하여, 미표지 항체 및 1가 항체를 상대적으로 많이 포함하는 제1 항체 조성물과, 2가 항체를 상대적으로 많이 포함하는 제2 항체 조성물로 분리하였다.
상기 공정에서 얻어진 펩티드 수식 항체를 포함하는 용액을, 0.02mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 희석하여, 상기 IgG-BP 칼럼에 첨가하고, 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.10mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 5.7)을 흘려, 제2 항체 조성물을 회수하고, 회수한 분획에 포함되는 2가 항체의 농도가 15mg/mL가 되도록 농도를 조정하였다. 그 후, IgG-BP 칼럼에 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.10mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 3.5)을 흘려, 제1 항체 조성물을 회수하고, 회수한 분획에 포함되는 1가 항체의 농도가 15mg/mL가 되도록 농도를 조정하였다. 얻어진 제1 항체 조성물을 포함하는 용액을 후술하는 표지 공정에 제공하였다.
(2. 착체 형성 공정)
하기 식으로 표시되는 DOTAGA-DBCO를 Bernhard et al. DOTAGA-Anhydride: A Valuable Building Block for the Preparation of DOTA-Like Chelating Agents Chem. Eur. J. 2012, 18, 7834-7841에 기재된 방법을 기초로 하여 제조하였다. 이 킬레이트제를, 용매로서 0.1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 6.0)에 분산시켜, 킬레이트제를 1.7mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.005mL와, 0.1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 6.0) 0.075mL와, 방사성 금속원으로서 225Ac 이온 함유 용액(0.2mol/L 염산 수용액, 방사능 농도 320 내지 340MBq/mL, Oak Ridge National Laboratory제로부터 조제, 액량 0.005mL) 1.6 내지 1.7MBq(검정 일시 방사능량으로부터 감쇠 계산한 계산값)를 혼합한 반응액을, 가열 조건 하에서 반응시켜, 225Ac 착체 용액을 얻었다. 킬레이트제와 방사성 금속 이온의 몰 비율은, 킬레이트제:225Ac 이온=약 2500:1이며, 반응액의 가열 온도는 70℃, 가열 시간은 30분간으로 하였다.
Figure pct00017
얻어진 225Ac 착체의 방사 화학적 순도(RCP)를 다음 방법으로 측정하였다. 즉, 225Ac 착체 용액의 일부를 박층 크로마토그래피(Agilent사제, 형식 번호: SGI0001, 전개 용매: 아세토니트릴/물 혼합액(체적비 1:1))로 전개하고, 그 후, 라디오 γ-TLC 애널라이저(raytest사제, MODEL GITA Star)로 측정하였다. 검출된 전방사능(카운트)에 대한, 원점 부근에 검출된 피크의 방사능(카운트)의 백분율을 225Ac 착체의 RCP(％)로 하였다. 그 결과, 225Ac 착체의 RCP는 90％였다. 얻어진 225Ac 착체 용액은, 그대로 표지 공정에 사용하였다.
(3. 표지 공정)
상술한 공정 (2)를 거쳐 얻어진 미정제인 그대로의 225Ac 착체의 용액과, 상기 공정 (1)에서 얻어진 펩티드 수식 항체(1가 항체)를 포함하는 용액을, 각각 0.1mol/L 아르기닌 함유 0.1mol/L 히스티딘 완충액 pH 6.0에 첨가하고, 37℃에서 120분간 클릭 반응시켜, 225Ac 착체 표지 항체를 얻었다. 225Ac 착체의 양 및 펩티드 수식 항체(1가 항체)의 양은 각각 85nmol이며, DBCO기와 아지드기의 몰비는 각각 약 1:1.2였다. 미정제 시의 225Ac 착체 표지 항체의 반응률(％)을 이하의 표 1에 나타낸다. 여기서, 반응률(％)이란, 착체 형성 공정에서의 표지율(％)에 대한 225Ac 착체 표지 항체의 RCP(％)를 의미하고, 표지율(％)이란 투입 방사능량에 대한 225Ac 착체의 방사능량(％)을 의미한다.
또한, 37℃에서 2시간 반응시켜 얻어진 225Ac 착체 표지 항체의 용액을 한외 여과 필터(Merck사제, 형식 번호: UFC505096)를 사용하여 정제하였다. 정제 후의 225Ac 착체 표지 항체의 RCP 및 방사 화학적 수율(RCY)을 이하의 표 1에 나타낸다.
225Ac 착체 표지 항체의 RCP 및 RCY의 측정 방법은 이하와 같이 하였다. 즉, 박층 크로마토그래피(Agilent사제, 형식 번호: SGI0001, 전개 용매는 아세토니트릴: 0.1mmol/L EDTA 용액의 혼합액(체적비 1:1))을 라디오 γ-TLC 애널라이저(raytest사제, MODEL GITA Star)로 측정하고, 검출된 전방사능(카운트)에 대한, 원점 부근에 검출된 피크의 방사능(카운트)의 백분율을 RCP(％)로 하였다. 또한, 표지 공정 개시 시에 첨가한 전방사능(γ선 스펙트로미터(Ge 반도체 검출기: GMX10P4-70(ORTEC사제), 멀티채널 애널라이저: M7-000(세이코·이지앤지사제), 데이터 처리: Spectrum Navigator: DS-P300(세이코·이지앤지사제) 및 Gamma Studio: DS-P600(세이코·이지앤지사제))로 측정한 카운트로부터 계산한 방사능량)에 대하여, 한외 여과 정제 후에 회수한 방사능(상술과 마찬가지로, γ선 스펙트로미터에서 측정한 카운트로부터 계산한 방사능량)의 백분율을 RCY(％)로 하였다.
Figure pct00018
[실시예 2] 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO를 사용한 트라스투주맙과의 복합체의 제조
(1. 착체 형성 공정)
DOTAGA-DBCO를, 용매로서 DMSO에 분산시켜, 킬레이트제를 0.33mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.030mL와, 방사성 금속원으로서 89Zr 이온 함유 용액(0.1mol/L 염산 수용액, 방사능 농도 181MBq/mL, 니혼 메디피직스 가부시키가이샤제로부터 조제, 액량 0.33mL) 60MBq를 혼합한 반응액을, 가열 조건 하에서 반응시켜, 89Zr 착체 용액을 얻었다. 킬레이트제와 방사성 금속 이온의 몰 비율은, 킬레이트제:89Zr 이온=약 250:1이며, 반응액의 가열 온도는 70℃, 가열 시간은 60분간으로 하였다.
얻어진 89Zr 착체의 RCP를, 다음 방법으로 측정하였다. 즉, 89Zr 착체 용액의 일부를 박층 크로마토그래피(Agilent사제, 형식 번호: SGI0001, 전개 용매: 아세토니트릴/물 혼합액(체적비 1:1))로 전개하고, 그 후, 라디오 γ-TLC 애널라이저(raytest사제, MODEL GITA StarPS)로 측정하였다. 검출된 전방사능(카운트)에 대한, 원점 부근에 검출된 피크의 방사능(카운트)의 백분율을 89Zr 착체의 RCP(％)로 하였다. 그 결과, 89Zr 착체의 RCP는 90％였다. 얻어진 89Zr 착체 용액은, 그대로 표지 공정에 사용하였다.
(2. 표지 공정)
상술한 공정 (1)을 거쳐 얻어진 미정제인 그대로의 89Zr 착체의 용액과, 실시예 1과 마찬가지로 하여 얻어진 펩티드 수식 항체(1가 항체)를 포함하는 용액을, 미정제인 그대로의 각각 0.1mol/L 아르기닌 함유 0.1mol/L 히스티딘 완충액 pH 6.0에 첨가하고, 37℃에서 120분간 클릭 반응시켜, 실시예 2에89Zr 착체 표지 항체를 얻었다. 89Zr 착체의 양 및 펩티드 수식 항체(1가 항체)의 양은 각각 100nmol이며, DBCO와 아지드의 몰비는 각각 약 1:1이었다. 미정제 시의 실시예에 89Zr 착체 표지 항체의 반응률(％)을 이하의 표 2에 나타낸다. 여기서, 반응률(％)이란 착체 형성 공정에서의 표지율(％)에 대한 89Zr 착체 표지 항체의 RCP(％)를 의미하고, 표지율(％)이란 투입 방사능량에 대한 89Zr 착체의 방사능량(％)을 의미한다.
또한, 37℃에서 2시간 반응시켜 얻어진 89Zr 착체 표지 항체의 용액을 한외 여과 필터(Merck사제, 형식 번호: UFC505096)를 사용하여 정제하였다. 정제 후의 89Zr 착체 표지 항체의 RCP 및 RCY를 이하의 표 2에 나타낸다.
89Zr 착체 표지 항체의 RCP 및 RCY의 측정 방법은, 실시예 1과 마찬가지로 행하였다.
Figure pct00019
[비교예 1] 225Ac 표지 DOTA-DBCO를 사용한 트라스투주맙과의 복합체의 제조
DOTAGA-DBCO를 하기 DOTA-DBCO로 바꾼 것 이외에는, 실시예 1에 준하여 조작을 행하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure pct00020
Figure pct00021
[실시예 3] 제제화 공정
실시예 1 및 비교예 1의 기재를 따라서 제조하는 방사성 복합체를 각각 0.5mL 에펜 튜브(LoBind, 에펜도르프사제)에 일부 발취하고, 보존 완충액(19g/L 트레할로오스 수화물, 0.47g/L L-히스티딘염산염 수화물, 0.30g/L L-히스티딘 및 85mg/L 폴리소르베이트 20 혼합액)으로 희석하였다.
[평가 1] 안정성 평가
실시예 3에서 얻어진 각 방사성 복합체를, 실온(24.5 내지 25.5℃)에서 2주일 보존하고, 각 시간점(0일점, 1일점, 7일점 및/또는 14일점)에 있어서, RCP, 응집체의 비율, 항원 결합 활성을 평가하였다. 또한, 제조 종료로부터 14일간은, 방사성 금속핵종이 Ac-225인 경우에는, 약 1.5반감기에 상당한다.
[평가 1-1] 방사 화학적 순도
RCP를 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석하였다. TLC의 조건은, 실시예 1에서 반응률을 조사할 때에 사용한 조건과 마찬가지로 하였다.
결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00022
티오우레아 결합을 포함하지 않는 실시예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체는, 제조 종료 후 실온에서 7일간 보존한 경우에는, RCP로서 99％ 이상이 유지되고 있었다. 제조 종료 후 실온에서 14일간 보존한 경우에도, RCP로서 99％ 이상이 유지되고 있었다.
티오우레아 결합을 포함하는 비교예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체는, 제조 종료 후 실온에서 7일간 보존한 경우, RCP로서 90％ 이상이 유지되고 있었지만, 95％를 하회하고 있었다. 제조 종료 후 실온에서 14일간 보존한 경우에는 RCP로서 80％를 하회하고 있었다.
[평가 1-2] 응집체의 비율
응집체의 비율은 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)로 확인하였다. 액체 크로마토그래피 장치로서 Waters사제의 2695형 세퍼레이션 모듈 또는 e2695형 세퍼레이션 모듈을 사용하고, UV 검출기로서 Waters사제의 2489형UV/Vis 검출기를 사용하여, 하기 조건에서 분석하였다. 제조 종료 후 14일간 보존한 경우의 각 성분의 비율을 표 5에 나타낸다. 제조 종료 후 14일간 보존한 경우, 티오우레아 결합을 포함하지 않는 실시예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체의 응집체의 비율은, 티오우레아 결합을 포함하는 비교예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체의 응집체의 비율에 비교하여 적어졌다.
Figure pct00023
[HPLC조건]
칼럼: TOSOH TSKgel guard column SWXL(6mmx4cm), TOSOH TSKgel G3000SWXL(5㎛, 7.8×30cm)×2개(직렬)
칼럼 온도: 25℃ 부근의 일정 온도
이동상: 0.2mol/L 아르기닌 염산염 함유 0.1mol/L 인산 완충액(pH 6.8)
유량: 매분 1.0mL
면적 측정 범위: 30분
검출 파장: 280nm
[평가 1-3] 항원 결합 활성
항원 결합 활성은 시험관 내 오토라디오그래피(ARG)로 확인하였다(제조일(0일점) 및 보존 마지막날(14일점)만). ATCC(American Type Culture Cullection)로부터 구입한 HER2 양성의 인간 난소암 세포주인 SK-OV-3 세포 및 HER2 음성의 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포를 자성 BALB/c nu/nu 마우스의 옆구리 피하에 각각 5×106cells 및 1×107cells 투여하여 담암 마우스를 제작하였다. 그 후, SK-OV-3 종양 및 MDA-MB-231 종양을 적출하여 티슈·테크 O.C.T. 컴파운드(사쿠라파인테크 재팬)에 포매하여 동결 절편을 제작하였다. 10％ 소 혈청 알부민 함유 PBS에 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 방사성 복합체를 각각 1kBq/mL가 되도록 첨가하고, SK-OV-3 종양 절편 및 MDA-MB-231 종양 절편을 침지시켰다. 절편을 이메징 플레이트에 콘택트한 후, 스캐너 타입 화상 해석 장치로 판독하고, 절편에 결합된 방사능량을 평가하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
각각의 용액에 트라스투주맙을 첨가한 용액에서 마찬가지로 평가를 행함으로써, 각 방사성 복합체의 HER2에 대한 특이성을 확인할 수 있다.
보존 최종점(14일점)에 있어서, 실시예 1 및 비교예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체 중 어느 것에서도 HER2에 대한 결합 활성이 확인되었다. 실시예 1 및 비교예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체는 어느 쪽도 SK-OV-3 종양 절편에만 결합하고, HER2 선택적인 결합을 나타내었다. 트라스투주맙을 첨가한 용액에서는, SK-OV-3 종양 절편에 대한 결합이 저해되어, 결합의 HER2 특이성이 확인된다. 보존 최종점(14일점)에 있어서, 모든 샘플에서 HER2에 대한 결합의 선택성이 유지되고 있었다. SK-OV-3 종양 절편에 결합된 방사능은 실시예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 사용한 샘플쪽이 비교예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체보다도 많아졌다.
[평가 2] 약효 평가
마우스를 사용하여 SK-OV-3 세포의 피하 담암 모델을 제작하고, 실시예 1 및 비교예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체의 항종양 효과를 확인하였다.
ATCC로부터 구입한 HER2 양성의 인간 난소암주인 SK-OV-3 세포를 McCoy's 5A 배지(gibco)에 현탁시키고, 5주령의 자성 BALB/c nu/nu(니혼 찰스 리버)의 옆구리 피하에 5×106cells 투여하여 담암 마우스를 제작하였다. 담암 처치로부터 3주일 후, 종양 체적이 대략 100 내지 300mm3인 것을 확인하고, 종양 직경 측정에 적합한 형상의 개체로부터 무작위로 군 분류를 실시하였다. 그 때의 각 마우스의 종양 체적과 체중을 표 6에 나타낸다. 종양 체적은 이하 식을 따라서 산출하였다.
종양 체적(mm3)=(종양 긴 직경×(종양 짧은 직경)2)×1/2
Figure pct00024
실시예 1 및 비교예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 모두 15kBq/마리(트라스투주맙으로서 50μg/마리)의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또한, 컨트롤군으로서, 각 방사성 복합체와 동일한 항체량의 트라스투주맙을 투여한 군(항체 대조군) 및 보존 완충액을 투여한 비히클군을 설정하였다. 각 군은 6마리로 하고, 투여 후 38일까지 경시적으로, 일반 상태의 관찰, 체중 및 종양 체적을 계측하였다. 경시적인 종양 체적의 변화를 도 1에, 경시적인 체중 변화를 도 2에 나타낸다.
실시예 1 및 비교예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 투여한 군은, 투여 후 38일점에 있어서, 2개의 컨트롤군(항체 대조군, 비히클군)과 비교하여 항종양 효과에 유의미한 차가 확인되었다(P<0.01). 유의차의 판정에는, 통계 해석 소프트웨어 Stat Preclinica(타쿠미 인포메이션 테크놀로지사제)를 사용하여 Tukey 검정을 행하였다. 한편, 각 방사성 복합체를 투여한 군 사이에, 항종양 효과에 유의미한 차는 확인되지 않았다. 또한, 각 군 모두 일반 상태에 현저한 변화는 없고, 현저한 체중 감소 등의 독성 징후는 확인되지 않았다.
[실시예 4] 177Lu 표지 DOTAGA-DBCO를 사용한 트라스투주맙과의 복합체의 제조
(1. 항체 수식 공정)
실시예 1에서의 항체 수식 공정에 기재된 방법과 마찬가지로 행하였다.
(2. 착체 형성 공정)
DOTAGA-DBCO의 제조 방법은 실시예 1과 마찬가지로 행하였다. 이 킬레이트제를, 용매로서 0.156mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5)에 분산시켜, 킬레이트제를 0.45mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.02mL와, 0.225mmol/L의 겐티신산을 용해시킨 0.156mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5) 0.02mL와, 방사성 금속원으로서 177Lu 이온 함유 용액(0.04mol/L 염산 수용액, 방사능 농도 516MBq/mL, POLATOM제로부터 조제, 액량 0.05mL) 25.8MBq(검정 일시 방사능량으로부터 감쇠 계산한 계산값)를 혼합한 반응액을, 가열 조건 하에서 반응시켜, 177Lu 착체 용액을 얻었다. 킬레이트제와 방사성 금속 이온의 몰 비율은, 킬레이트제:177Lu 이온=약 236:1이며, 반응액의 가열 온도는 70℃, 가열 시간은 5분간으로 하였다.
얻어진 177Lu 착체의 RCP 측정은 실시예 1의 방사성 복합체의 RCP 측정과 마찬가지로 행하였다. 그 결과, 177Lu 착체의 RCP는 99％였다. 얻어진 177Lu 착체 용액은, 그대로 표지 공정에 사용하였다.
(3. 표지 공정)
상술한 공정 (2)를 거쳐 얻어진 미정제인 그대로의 177Lu 착체의 용액과, 상기 공정 (1)에서 얻어진 펩티드 수식 항체(1가 항체)를 포함하는 용액을, 각각 0.1mol/L 아르기닌 함유 0.1mol/L 히스티딘 완충액 pH 6.0에 첨가하고, 37℃에서 120분간 클릭 반응시켜, 177Lu 착체 표지 항체를 얻었다. 177Lu 착체의 양 및 펩티드 수식 항체(1가 항체)의 양은 각각 8.4nmol 및 10nmol이며, DBCO기와 아지드기의 몰비는 각각 약 1:1.2였다. 미정제 시의 177Lu 착체 표지 항체의 반응률(％)을 이하의 표 7에 나타낸다.
또한, 실시예 1과 마찬가지로 한외 여과 필터를 사용하여 정제한 후의 177Lu 착체 표지 항체의 RCP 및 RCY를 이하의 표 7에 나타낸다.
177Lu 착체 표지 항체의 RCP 및 RCY의 측정 방법은 실시예 1과 마찬가지로 실시하였다.
Figure pct00025
[비교예 4] 177Lu 표지 DOTA-DBCO를 사용한 트라스투주맙과의 복합체의 제조
DOTAGA-DBCO를 DOTA-DBCO로 바꾼 것 이외에는, 실시예 4에 준하여 조작을 행하였다. 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure pct00026
[실시예 5] 90Y 표지 DOTAGA-DBCO를 사용한 트라스투주맙과의 복합체의 제조
(1. 항체 수식 공정)
실시예 1에서의 항체 수식 공정에 기재된 방법과 마찬가지로 행하였다.
(2. 착체 형성 공정)
DOTAGA-DBCO의 제조 방법은 실시예 1과 마찬가지로 행하였다. 이 킬레이트제를, 용매로서 0.156mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5)에 분산시켜, 킬레이트제를 0.3mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.03mL와, 0.15mol/L의 겐티신산을 용해시킨 0.156mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5) 0.03mL와, 방사성 금속원으로서 90Y 이온 함유 용액(0.04mol/L 염산 수용액, 방사능 농도 3786 내지 3943MBq/mL, Eckert&Ziegler사제로부터 조제, 액량 0.03mL) 113 내지 118MBq(검정 일시 방사능량으로부터 감쇠 계산한 계산값)를 혼합한 반응액을, 가열 조건 하에서 반응시켜, 90Y 착체 용액을 얻었다. 킬레이트제와 방사성 금속 이온의 몰 비율은, 킬레이트제:90Y 이온=69 내지 72:1이며, 반응액의 가열 온도는 70℃, 가열 시간은 5분간으로 하였다.
얻어진 90Y 착체의 RCP 측정은 실시예 1의 RCP 측정과 마찬가지로 행하였다. 그 결과, 90Y 착체의 RCP는 99％였다. 얻어진 90Y 착체 용액은, 그대로 표지 공정에 사용하였다.
(3. 표지 공정)
상술한 공정 (2)를 거쳐 얻어진 미정제인 그대로의 90Y 착체의 용액과, 상기 공정 (1)에서 얻어진 펩티드 수식 항체(1가 항체)를 포함하는 용액을, 각각 0.1mol/L 아르기닌 함유 0.1mol/L 히스티딘 완충액 pH 6.0에 첨가하고, 37℃에서 120분간 클릭 반응시켜, 90Y 착체 표지 항체를 얻었다. 90Y 착체의 양 및 펩티드 수식 항체(1가 항체)의 양은 각각 9nmol 및 10nmol이며, DBCO기와 아지드기의 몰비는 각각 약 1:1.1이었다. 미정제 시의 90Y 착체 표지 항체의 반응률(％)을 이하의 표 9에 나타낸다.
또한, 실시예 1과 마찬가지로 한외 여과 필터를 사용하여 정제한 후의 90Y 착체 표지 항체의 RCP 및 RCY를 이하의 표 9에 나타낸다.
90Y 착체 표지 항체의 RCP 및 RCY의 측정 방법은 실시예 1과 마찬가지로 행하였다.
Figure pct00027
[비교예 5] 90Y 표지 DOTA-DBCO를 사용한 트라스투주맙과의 복합체의 제조
DOTAGA-DBCO를 DOTA-DBCO로 바꾼 것 이외에는, 실시예 5에 준하여 조작을 행하였다. 결과를 표 10에 나타낸다.
Figure pct00028
[실시예 6] 실시예 4, 실시예 5, 비교예 4 또는 비교예 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체의 보존 안정성
(제제화 공정)
실시예 4, 실시예 5, 비교예 4 또는 비교예 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 각각 0.5mL 에펜 튜브(LoBind, 에펜도르프사제)에 일부 발취하고, 보존 완충액(42g/L 트레할로오스 수화물, 0.47g/L L-히스티딘염산염 수화물, 0.30g/L L-히스티딘 및 85mg/L 폴리소르베이트 20 혼합액)으로 희석하였다.
[평가 3] 안정성 평가
실시예 6에서 얻어진 각 방사성 복합체를, 실온(20.6 내지 21.8℃)에서 2주일 보존하고, 각 시간점(0일점, 1일점, 7일점 및/또는 14일점)에 있어서, RCP, 항원 결합 활성을 평가하였다. 또한, 제조 종료로부터 7일간은, 방사성 금속핵종이 Lu-177인 경우에는, 약 1반감기에 상당하고, Y-90인 경우에는, 약 2.5반감기에 상당하고, 제조 종료로부터 14일간은, 방사성 금속핵종이 Lu-177인 경우에는, 약 2반감기에 상당하고, Y-90인 경우에는, 약 5반감기에 상당한다.
[평가 3-1] 방사 화학적 순도
RCP를 TLC로 분석하였다. TLC의 조건은, 실시예 1에서 반응률을 조사할 때에 사용한 조건과 마찬가지로 하였다. 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure pct00029
티오우레아 결합을 포함하지 않는 실시예 4 또는 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체는, 제조 종료 후 7일간 보존한 경우에는, RCP로서 95％ 이상이 유지되고 있었다. 티오우레아 결합을 포함하지 않는 실시예 4 또는 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체는, 제조 종료 후 14일간 보존한 경우에도, RCP로서 90％ 이상이 유지되고 있었다.
비교예 4의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 제조 종료 후 실온에서 7일간 보존한 경우에는, RCP로서 85％를 하회하고 있으며, 비교예 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 제조 종료 후 실온에서 7일간 보존한 경우에는, RCP로서 75％를 하회하고 있었다. 비교예 4의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 제조 종료 후 실온에서 14일간 보존한 경우에는, RCP로서 60％를 하회하고 있으며, 비교예 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 제조 종료 후 실온에서 14일간 보존한 경우에는, RCP로서 65％를 하회하고 있었다.
[평가 3-2] 항원 결합 활성
항원 결합 활성은 시험관 내 ARG로 확인하였다(0 및 14일점만). 평가 방법은 평가 1-3 기재의 방법과 마찬가지로 행하였다. 결과를 도 4, 5에 나타낸다.
보존 최종점(14일점)에 있어서, 실시예 4, 실시예 5, 비교예 4 또는 비교예 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체 중 어느 것에서도 HER2에 대한 결합 활성이 확인되었다. 실시예 4, 실시예 5, 비교예 4 또는 비교예 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체는 모두 SK-OV-3 종양 절편에만 결합하고, HER2 선택적인 결합을 나타내었다. 보존 최종점(14일점)에 있어서, 모든 샘플에서 HER2에 대한 결합의 선택성이 유지되고 있었다. SK-OV-3 종양 절편에 결합된 방사능은 실시예 4 또는 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 사용한 샘플쪽이 비교예 4 또는 5의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 사용한 샘플보다도 많아졌다.
[평가 4]
마우스를 사용하여 SK-OV-3 세포의 피하 담암 모델을 제작하고, 실시예 2의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체의 종양 집적을 확인하였다.
ATCC로부터 구입한 HER2 양성의 인간 난소암주인 SK-OV-3 세포를 McCoy's 5A 배지(gibco)에 현탁시키고, 5주령의 BALB/c nu/nu(니혼 찰스 리버)의 옆구리 피하에 5×106cells 투여하여 담암 마우스를 제작하였다. 담암 처치로부터 4주일 후, 종양 체적이 대략 100 내지 400mm3인 것을 확인하였다.
실시예 2의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 5MBq/마리(n=24)의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 투여 후 60시간 후에 소(小)동물 PET 이미징 장치(PET/CT Si78, Bruker사제)를 사용하여 하기 표의 조건에서 촬상을 행하였다.
PET 촬상을 실시한 결과의 대표예를 도 6에 나타낸다. 종양에는, 다른 장기와 비교하여 방사능이 높은 농도로 집적하고, HER2 양성 종양의 묘출이 가능하였다.
Figure pct00030
[실시예 7] 225Ac 착체 표지 항체와 ADC 약제의 약효 비교
[평가 5] 225Ac 착체 표지 항체를 사용한 약효 평가
마우스를 사용하여 SK-OV-3의 피하 담암 모델을 제작하고, 실시예 1의 기재를 따라서 제조한 225Ac 착체 표지 항체와 시판되고 있는 항체-약물-복합체(Antibody-Drug-Conjugate)(ADC) 약제의 항종양 효과를 비교하였다. ADC 약제는 트라스투주맙 델쿠스테칸(엔하츠(등록 상표), 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤) 및 트라스투주맙 엠탄신(카도사일라(등록 상표), 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤)을 사용하였다. 또한, 항체 대조로서 트라스투주맙(하셉틴(등록 상표), 로슈사제)을 사용하였다.
평가 2에 기재된 방법을 사용하여, SK-OV-3 종양 담암 마우스를 제작하였다. 담암 처치 후, 종양 체적이 150 내지 550mm3인 것을 확인하고, 종양 직경 측정에 적합한 형상의 개체로부터 무작위로 군 분류를 실시하였다. 그 때의 각 군 마우스의 종양 체적과 체중을 표 13에 나타낸다. 또한, 엔하츠(등록 상표)는 투여량에 따라서 저용량 투여군과 고용량 투여군으로 나누고, 저용량 투여군은 투여되는 항체량이 225Ac 착체 표지 항체군과 동일한 정도가 되도록 조정하고, 고용량 투여군은 임상 용량을 마우스로 체중 환산한 항체량을 투여하도록 조정하였다.
Figure pct00031
실시예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 20kBq/마리(트라스투주맙으로서 20μg/마리)의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또한, 하셉틴(등록 상표)에서는 20μg/마리의 용량으로, 카도사일라(등록 상표)에서는 72μg/마리의 용량으로, 엔하츠(등록 상표) 저용량군에서는 20μg/마리의 용량으로, 엔하츠(등록 상표) 고용량군에서는 108μg/마리의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 각 군은 4마리로 하고, 투여 후 35일까지 경시적으로 일반 상태의 관찰, 체중 및 종양 체적을 계측하였다. 그 때의 각 군 마우스의 종양 체적의 변화를 도 7에 나타낸다.
방사성 복합체 투여군은, 투여 후 35일점에 있어서, 엔하츠(등록 상표) 저용량군과 비교하여 항종양 효과에 유의미한 차가 확인되었다(P<0.05). 유의차의 검정에는, 통계 해석 소프트웨어 Stat Preclinica를 사용하여 Tukey 검정을 행하였다. 또한, 투여 후 35일점에 있어서, 엔하츠(등록 상표) 저용량군 이외의 ADC 약제 투여군과 비교하여, 방사성 복합체 투여군에서는 항종양 효과가 강해지는 경향이 확인되었지만, 유의미한 차는 확인되지 않았다. 각 군 모두 일반 상태에 현저한 변화는 없고, 현저한 체중 감소 등의 독성 징후는 확인되지 않았다.
[실시예 8] 방사성 복합체의 투여량마다의 약효 비교
[평가 6] 방사성 복합체를 사용한 약효 평가
마우스를 사용하여 SK-OV-3의 피하 담암 모델을 제작하고, 실시예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체와 시판되고 있는 ADC 약제의 항종양 효과를 비교하였다. ADC 약제는 트라스트주맙 델쿠스테칸(엔하츠(등록 상표), 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤)을 사용하였다.
평가 2에 기재된 방법을 사용하여, SK-OV-3 종양 담암 마우스를 제작하였다. 담암 처치로부터 3주일 후, 종양 체적이 100 내지 300mm3인 것을 확인하고, 종양 직경 측정에 적합한 형상의 개체로부터 무작위로 군 분류를 실시하였다. 그 때의 각 마우스의 종양 체적과 체중을 표 14에 나타낸다.
Figure pct00032
실시예 1의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 고방사능 투여군에서는 20kBq/21g의 용량으로, 중방사능 투여군에서는 10kBq/21g의 용량으로, 저방사능 투여군에서는 5kBq/21g(각 군 모두 트라스투주맙으로서 3.57mg/kg)의 용량으로, 꼬리 정맥 내 투여하였다. ADC 약제는 10mg/kg의 중용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또한 방사성 복합체 투여군과 동일한 항체량(트라스투주맙으로서 3.57mg/kg)의 트라스투주맙을 투여한 군(항체 대조군) 및 보존 완충액을 투여한 비히클군을 설정하였다. 각 군은 6마리로 하고, 투여 후 46일까지 경시적으로 일반 상태의 관찰, 체중 및 종양 체적을 계측하였다. 그 때의 각 군 마우스의 종양 체적의 변화를 도 8에 나타낸다. 또한, 관찰 마지막날에 배검(培檢)을 실시하고, 심장, 폐, 비장, 간장 및 신장을 채취하여, 그 중량을 측정하였다.
각 방사성 복합체 투여군은, 투여 후 46일점에 있어서, 항체 대조군 및 비히클군과 비교하여 항종양 효과에 유의미한 차가 확인되었다(P<0.01). 또한, 투여한 방사능 의존적으로 항종양 효과가 강해지는 경향이 확인되어, 투여 방사능 의존적으로 항종양 효과가 강해지는 것이 시사되었다. 유의차의 검정에는, 통계 해석 소프트웨어 Stat Preclinica를 사용하여 Tukey 검정을 행하였다. 또한, 투여 46일점에 있어서, ADC 약제 투여군과 비교하여, 방사성 복합체 고방사능군 및 방사성 복합체 중방사능군에서는 항종양 효과에 유의미한 차가 확인되지 않고, 항종양 효과는 동등한 것이 시사되었다. 각 군 모두 일반 상태에 현저한 변화는 없고, 현저한 체중 감소 등의 독성 징후는 확인되지 않았다. 또한, 관찰 마지막날에, 배검에 의해 채취한 장기의 중량에 유의미한 차는 확인되지 않았다.
[실시예 9] 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO를 사용한 페르투주맙과의 복합체의 제조
(1. 항체 수식 공정)
실시예 1과 마찬가지의 방법으로, 상기 식 (P3)으로 표시되는 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 얻었다.
이 펩티드와, 페르투주맙(파제타(등록 상표), 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤)을 0.02mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 6.0)에 혼합한 혼합액을, 실온에서 60분 반응시켜, 펩티드 수식 항체를 포함하는 용액을 얻었다. 이 펩티드 수식 항체는, 상기 펩티드에 의해 항체의 Fc 영역이 부위 특이적으로 수식된 것이다.
이어서, IgG-BP 칼럼에 통액하여, 미표지 항체 및 1가 항체를 상대적으로 많이 포함하는 항체 조성물을 얻었다. 회수한 분획에 포함되는 1가 항체의 농도가 14.6mg/mL가 되도록 보존 완충액(41g/L 수크로오스, 3.1g/L L-히스티딘, 0.66g/L 빙초산 혼합액)(pH 6.0)으로 농도를 조정하였다. 미표지 항체 및 1가 항체를 상대적으로 많이 포함하는 용액을 후술하는 표지 공정에 제공하였다.
(2. 착체 형성 공정)
DOTAGA-DBCO를 실시예 1과 마찬가지로 하여 제조하였다. 이 킬레이트제를, 용매로서 0.156mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5)에 분산시켜, 킬레이트제를 0.3mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.02835mL와, 방사성 금속원으로서 225Ac 이온 함유 용액(0.1mol/L 염산 수용액, 방사능 농도 259MBq/mL, Rosatom State Atomic Energy Corporation제로부터 조제, 액량 0.0126mL) 3.25MBq(검정 일시 방사능량으로부터 감쇠 계산한 계산값)를 혼합한 반응액을 가열 조건 하에서 반응시켜, 225Ac 착체 용액을 얻었다. 그 때의 킬레이트제와 방사성 금속 이온의 몰 비율은, 킬레이트제:225Ac 이온=약 1270:1이며, 반응액의 가열 조건은 70℃, 가열 시간은 30분으로 하였다.
얻어진 225Ac 착체의 RCP를 실시예 1과 마찬가지로 측정하였다. 그 결과, 225Ac 착체의 RCP는 67％였다. 얻어진 225Ac 착체 용액은, 그대로 표지 공정에 사용하였다.
(3. 표지 공정)
상술한 공정 (2)를 거쳐 얻어진 미정제인 그대로의 225Ac 착체의 용액과, 상기 공정 (1)에서 얻어진 펩티드 수식 항체(1가 항체)를 포함하는 용액을 혼합하고, 37℃에서 2시간 클릭 반응시켜, 225Ac 착체 표지 항체를 얻었다. DBCO기와 아지드기의 몰비는 각각 약 1:1.3이었다. 미정제 시의 225Ac 착체 표지 항체의 반응률을 이하의 표 15에 나타낸다.
또한, 37℃에서 2시간 반응시켜 얻어진 225Ac 착체 표지 항체의 용액을 한외 여과 필터(Merck사제, 형식 번호: UFC803096)를 사용하여 정제하였다. 정제 후의 225Ac 착체 표지 항체의 RCP 및 RCY를 이하의 표 15에 나타낸다. 또한, 225Ac 착체 표지 항체의 RCP 및 RCY는 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 얻어진 방사능량을 기초로 산출하였다.
Figure pct00033
[실시예 10] 제제화 공정
실시예 9의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체를 각각 0.5mL 에펜 튜브(LoBind, 에펜도르프사제)에 일부 발취하고, 보존 완충액(41g/L 수크로오스, 3.1g/L L-히스티딘, 0.66g/L 빙초산 및 0.2g/L 폴리소르베이트 20 혼합액)으로 희석하였다.
[평가 7] 안정성 평가
실시예 9에서 얻어진 방사성 복합체를, 실온(24.5 내지 25.5℃)에서 2주일 보존하고, 각 시간점(0일점, 1일점, 7일점 및 14일점)에 있어서, RCP, 응집체의 비율을 평가하였다.
[평가 7-1] RCP
RCP는 TLC 분석 결과로부터 산출하였다. TLC의 조건은 실시예 1에서 반응률을 평가했을 때에 사용한 조건과 마찬가지로 하였다. 결과를 표 16에 나타낸다.
Figure pct00034
실시예 9의 기재를 따라서 제조한 방사성 복합체는, 제조 종료 후 실온에서 7일간 보존한 경우에는, RCP로서 98％ 이상 유지되었다. 제조 종료 후 실온에서 14일간 보존한 경우에도, RCP로서 97％ 이상 유지되고 있었다.
[평가 7-2] 응집체의 비율
응집체의 비율은, 실시예 1에 기재된 방법과 마찬가지로, SEC로 확인하였다. 제조 종료 후 14일간 보존한 경우의 각 평가일점에서의 각 성분의 비율을 표 17에 나타낸다. 제조 종료 후 14일 보존한 경우의 응집체의 비율은 1.66％였다.
Figure pct00035
본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허 출원 제2020-174840호(출원일: 2020년 10월 16일), 일본 특허 출원 제2020-215740호(출원일: 2020년 12월 24일) 및 일본 특허 출원 제2021-024688호(출원일: 2021년 2월 18일)를 기초로 하고 있고, 그들 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NIHON MEDI-PHYSICS CO., LTD. <120> Radioconjugates of anti-HER2 antibody, and radiopharmaceuticals <130> 093200 <150> JP2020-174840 <151> 2020-10-16 <150> JP2020-215740 <151> 2020-12-24 <150> JP2021-024688 <151> 2021-02-18 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 3 Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 4 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 5 Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 6 Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 1 5 10 15 His <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 7 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 8 Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 9 Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 10 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 1 5 10 15 His <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 11 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His 1 5 10 15 His <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 12 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 13 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 14 Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <400> 15 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> Xaa is a homosysteine residue. <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a lysine residue, a cysteine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, a 2-aminosuberic acid or diaminopropionic acid. <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> Xaa is a homosysteine residue. <400> 16 Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa 1 5 10 15 His <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for modifying antibody <220> <221> DISULFID <222> (4)..(14) <400> 17 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His

Claims (14)

  1. 펩티드로 부위 특이적으로 수식된 항HER2 항체와 킬레이트제의 복합체이며,
    상기 킬레이트제에 방사성 금속핵종이 킬레이트화되어 있으며,
    상기 펩티드와 킬레이트제가 링커 (L)을 통해 연결되어 있으며, 상기 링커 (L)은 티오우레아 결합을 포함하지 않는 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 킬레이트제가 DOTAGA(α-(2-카르복시에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)인, 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가, 하기 식:
    (Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) ··· (i)
    (식 (i) 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는 각각 연속되는 a개의 X, 연속되는 b개의 X, 연속되는 c개의 X, 및 연속되는 d개의 X를 나타내고,
    X는 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기 중 어느 것도 갖지 않는 아미노산 잔기이며,
    a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이며, 또한 a+b+c+d≤14를 충족시키고,
    Xaa1 및 Xaa3은 각각 독립적으로
    측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기, 또는 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 단, Xaa1 및 Xaa3 중 어느 한쪽이 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기이며,
    Xaa1 및 Xaa3이 연결됨으로써, 환 구조가 형성되어 있고,
    Xaa2는 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산 또는 디아미노프로피온산이며, 또한 Xaa2가 가교제로 수식되어 있다.)로 표시되는 13 내지 17아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열인, 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사성 금속핵종이 Ac-225, Y-90, Lu-177 또는 Zr-89인, 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 (L)이 식 (10a), 식 (10b) 또는 식 (10c)를 포함하는, 복합체.
    Figure pct00036

    (식 (10a) 및 식 (10b) 중, R1A는 상기 킬레이트제와의 연결 부위를 나타내고, R2A는 상기 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다. 식 (10c) 중, R3A 및 R4A 중 한쪽은 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타내고, 다른 쪽은 상기 킬레이트제와의 연결 부위를 나타내고, R5A는 상기 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다.)
  6. 제5항에 있어서, 상기 펩티드와의 연결 부위와 상기 펩티드 사이에, 폴리에틸렌글리콜기를 포함하는, 방사성 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, N 말단에 아지드기가 도입된 상기 펩티드가 부위 특이적으로 수식되어 있는 항HER2 항체와, 하기 식으로 표시되는 DOTAGA-DBCO의 방사성 금속 착체를 클릭 반응시킴으로써 복합화한, 방사성 복합체.
    Figure pct00037
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항HER2 항체가 트라스투주맙 또는 페르투주맙인, 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 유효 성분으로서 함유하는 방사성 의약.
  10. 제9항에 있어서, 암의 방사선 내용 요법에 사용되는, 방사성 의약.
  11. 제9항에 있어서, 암의 진단에 사용되는, 방사성 의약.
  12. 제11항에 있어서, 제10항에 기재된 방사성 의약을 사용한 암의 방사선 내용 요법에 병용되는, 방사성 의약.
  13. 방사성 금속핵종이 킬레이트화된 킬레이트제와, 항HER2 항체의 복합체를 유효 성분으로서 함유하고,
    항HER2 항체와 킬레이트제의 연결에 티오우레아 결합을 포함하지 않는, 하기 (1) 또는 (2)의 조건을 충족시키는 방사성 의약:
    (1) 상기 방사성 금속핵종이 177Lu 또는 90Y이며, 실온에서 7일간 보관했을 때의 상기 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상이다.
    (2) 상기 방사성 금속핵종이 225Ac이며, 실온에서 14일간 보관했을 때의 상기 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상이다.
  14. 방사성 금속핵종이 킬레이트화된 킬레이트제와, 항HER2 항체의 복합체를 유효 성분으로서 함유하고,
    항HER2 항체와 킬레이트제의 연결에 티오우레아 결합을 포함하지 않고,
    상기 방사성 금속핵종의 반감기를 기준으로 하여, 상기 반감기의 1 이상 5 이하의 배수의 기간 경과 시점에 있어서, 상기 복합체의 방사 화학적 순도가 90％ 이상인 방사성 의약.
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