TW202128230A - 具有經ｒｉ標定之人類化抗體的複合體、放射性醫藥 - Google Patents

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Abstract

本發明之經RI標定之抗MUC5AC人類化抗體係螯合有放射性核種之螯合劑與抗體之複合體(上述放射性核種為發射α射線或正電子之金屬核種，上述抗體為與MUC5AC特異性結合之人類化抗體)，由於其對於MUC5AC之特異性及於腫瘤中之累積性優異，故對於MUC5AC過度表現之疾病、尤其是癌之治療及/或診斷極為有用。

Description

經RI標定之人類化抗體
本發明係關於一種螯合有放射性核種之螯合劑與黏蛋白亞型5AC特異性人類化抗體之複合體、包含其之放射性醫藥及其等之用途。
黏蛋白係自動物之上皮細胞等分泌出之黏液的主成分，其係包含大量分子量100萬〜1000萬之糖的糖蛋白。關於黏蛋白，有分泌型黏蛋白及膜結合型黏蛋白，上述分泌型黏蛋白係上皮細胞等所產生者，上述膜結合型黏蛋白係具有疏水性之膜貫通部位並以與細胞膜結合之狀態存在者。黏蛋白之核心蛋白統稱為MUC，已知編碼核心蛋白之基因有至少20種。作為其中1種之黏蛋白亞型5AC(MUC5AC)屬於分泌型黏蛋白。
MUC5AC於正常組織中的胃或氣管中表現，但報告了於胰腺癌中過度表現，此外，還報告了於甲狀腺癌、肝癌、大腸癌、胃癌、尿路上皮癌、乳癌、子宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、膽管癌中亦過度表現。關於對於MUC5AC之抗體，報告有以自人類胰腺癌細胞株SW1990之異種移植物純化所得之胰腺癌黏蛋白成分作為抗原所製作之小鼠抗體(非專利文獻1)、基於該小鼠抗體所製作之嵌合抗體(專利文獻1、2、非專利文獻2、3)、人類化抗體(專利文獻3、4)。
抗體係利用抗體所具有之對於靶分子之特異性，而使用為用於檢測靶分子之試劑、診斷劑，或用於治療疾病之醫藥品。為了進一步提高檢測性能及治療效果，正進行關於結合有放射性核種或藥劑之抗體的研究。於非專利文獻1中，報告有使用標定了屬於β射線發射核種之1 31 I之小鼠抗體的胰腺癌模型小鼠之放射免疫治療。於非專利文獻3中，報告了使用標定了屬於γ射線發射核種之111 In之嵌合抗體的胰腺癌患者之SPECT成像。於專利文獻3及4中，記載了MUC5AC特異性人類化抗體，其用9 0 Y或111 In等進行了標定。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開平7-203974號公報 [專利文獻2]日本專利特開平11-5749號公報 [專利文獻3]國際公開第2013/157102號 [專利文獻4]國際公開第2013/157105號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Japanese Journal of Cancer Research, 87, 977-984, 1996 [非專利文獻2]日本臨床第64卷，增刊號1，2006, 274-278 [非專利文獻3]Japanese Journal of Cancer Research, 90, 1179-1186, 1999
本發明之目的在於提供一種對於黏蛋白亞型5AC(MUC5AC)之特異性及於腫瘤中之累積性優異的經放射性核種標定之抗MUC5AC人類化抗體。
本發明人等鑒於上述課題進行了銳意研究，結果成功地製造出螯合有屬於金屬核種之放射性核種之螯合劑、與由特定胺基酸序列構成之抗MUC5AC人類化抗體的複合體，並發現該複合體對於MUC5AC之特異性及於腫瘤中之累積性優異，對該效果進行了確認而完成本發明。
本發明之一態樣係提供一種複合體，其係螯合有放射性核種之螯合劑與抗體之複合體，且放射性核種為發射α射線或正電子之金屬核種，抗體為與MUC5AC特異性結合之人類化抗體。
根據本發明，可提供一種對於MUC5AC之特異性及於腫瘤中之累積性優異的經放射性核種標定之抗MUC5AC人類化抗體及該抗體之用途。
除非另有特別說明，否則本說明書中所使用之術語可依本技術領域中所通常使用之含義來使用。
(1)複合體1 本發明提供一種複合體(以下，亦稱為本發明之複合體)，其係螯合有放射性核種之螯合劑(以下，亦稱為本發明之螯合劑)與抗體之複合體，且上述放射性核種為發射α射線之金屬核種，上述抗體為與MUC5AC特異性結合之人類化抗體。
(1-1)放射性核種 本發明之複合體所包含之放射性核種係發射α射線之金屬核種。 該金屬核種只要為於放射性金屬之衰變過程中發射α射線之核種即可，詳細而言，較佳為使用212 Bi、213 Bi、227 Th或225 Ac等，更佳為227 Th或225 Ac，進而較佳為225 Ac(錒-225)。 本發明之發射α射線之金屬核種可使用回旋加速器或線性加速器等加速器，藉由公知之方法進行製造，例如225 Ac可使用回旋加速器對226 Ra靶照射質子，藉由(p,2n)之核反應而生成。所生成之發射α射線之金屬核種可藉由自靶分離純化而進行純化，例如關於225 Ac，可利用酸等將包含225 Ac之靶溶解，向溶解液中添加鹼，藉此使包含225 Ac之鹽析出，對該鹽進行分離純化，藉此獲得經純化之225 Ac。對於如此地進行了純化之發射α射線之核種，可視需要實施化學處理以使其成為適合RI標定之化學形態，藉此用於RI標定。
(1-2)抗體 本發明之複合體所包含之抗體係與MUC5AC特異性結合之人類化抗體(以下，亦稱為本發明中所使用之人類化抗體)。作為該抗體，只要是具有與MUC5AC特異性結合之能力的人類化抗體，則無特別限定，較佳為具有穩定之物性且腫瘤累積性優異。該抗體亦可以其抗原結合片段之形式使用，該態樣亦包含於本案發明中。具體而言，可包含下述特定之重鏈可變區及輕鏈可變區，並視需要具有適當之重鏈恆定區及輕鏈恆定區。於本說明書中，「抗原結合片段」係表示包含本發明中所使用之人類化抗體之一部分的抗體片段，且具有與MUC5AC之結合能力者。只要具有與MUC5AC之結合能力，構成抗原結合片段之多肽所包含之胺基酸之數量並無特別限定。
以下示出作為本發明中所使用之人類化抗體之重鏈可變區的較佳胺基酸序列。重鏈可變區1(H01)、重鏈可變區2(H02)、重鏈可變區3(H03)、及重鏈可變區4(H04)分別相當於本說明書中所隨附之序列表之序列編號1〜4。帶下劃線之部位係CDR部位。
[化1] [重鏈可變區1(H01)]
Figure 02_image001
[重鏈可變區2(H02)]
Figure 02_image003
[重鏈可變區3(H03)]
Figure 02_image005
[重鏈可變區4(H04)]
Figure 02_image007
於以下表示本發明中作為人類化抗體之輕鏈可變區較佳之胺基酸序列。輕鏈可變區1(L01)、輕鏈可變區2(L02)、輕鏈可變區3(L03)、及輕鏈可變區4(L04)分別相當於於本說明書中所隨附之序列表之序列編號5〜8。帶下劃線之部位係CDR部位。
[化2] [輕鏈可變區1(L01)]
Figure 02_image009
[輕鏈可變區2(L02)]
Figure 02_image011
[輕鏈可變區3(L03)]
Figure 02_image013
[輕鏈可變區4(L04)]
Figure 02_image015
換言之，本發明中較佳之人類化抗體之重鏈可變區包含序列編號1至序列編號4之任一個所表示之胺基酸序列，輕鏈可變區包含序列編號5至序列編號8之任一個所表示之胺基酸序列。即，本發明中所使用之人類化抗體包含上述中所述之4個重鏈可變區(H01〜H04)與4個輕鏈可變區(L01〜L04)之組合。
本發明中適宜之人類化抗體係重鏈可變區為H01、H03、H04且輕鏈可變區為L01〜L04之任一者之人類化抗體。
本發明中最適宜之人類化抗體係重鏈可變區為H01且輕鏈可變區為L03之抗體。
本發明中人類化抗體之重鏈可變區並不限定於由序列編號1至序列編號4所表示之胺基酸序列所規定者，亦包括保持功能之變異體。即，包含與序列編號1至序列編號4所表示之胺基酸序列具有90%以上、較佳為95%以上、進而較佳為98%以上、最佳為99%以上之序列同一性之胺基酸序列之變異重鏈可變區，亦只要在與本發明之輕鏈可變區組合時具有與MUC5AC之結合能力，則可用作本發明中所使用之人類化抗體之重鏈可變區。
本說明書中胺基酸序列之同一性係指對象之2個蛋白質間之胺基酸序列之同一性，以使用該技術領域中公知之數學演算法所製成之胺基酸序列之最佳比對中一致之胺基酸殘基的比例(%)所表示。胺基酸序列之同一性可藉由視覺檢查及數學計算來確定，可使用熟悉本技藝者周知之同源性檢索程式(例如，BLAST、FASTA)或序列對位排列程式(例如，ClustalW))、或者基因資訊處理軟體(例如，GENETYX[註冊商標])等而算出。關於本說明書中之胺基酸序列之同一性，具體而言，可使用DDBJ(DNA DataBank of Japan，日本DNA資料庫)之網站上所公開之系統分析程式ClustalW (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja)，於初期設定之條件(Version2.1、Alignment type(比對形式):slow、DNA Weight Matrix(位置權重矩陣):Gonnet、GAP OPEN(空位開放):10、GAP EXTENSION(空位擴展):0.1)下求出。
此外，關於本發明中所使用之人類化抗體之重鏈可變區，包含於序列編號1至序列編號4所表示之胺基酸序列中缺失、置換或置換10個以下、較佳為8個以下、進而較佳為5個以下、最佳為3個以下之胺基酸而成之胺基酸序列的變異重鏈可變區，亦只要在與本發明之輕鏈可變區組合時具有與MUC5AC之結合能力，則可用作本發明中所使用之人類化抗體之重鏈可變區。
本發明中所使用之人類化抗體之輕鏈可變區並不限定於序列編號5至序列編號8所表示之胺基酸序列，亦包括保持功能之變異體。即，包含與序列編號5至序列編號8所表示之胺基酸序列具有90%以上、較佳為95%以上、進而較佳為98%以上、最佳為99%以上之序列同一性之胺基酸序列之變異輕鏈可變區，只要在與本發明之重鏈可變區組合時具有與MUC5AC之結合能力，則可用作本發明中所使用之人類化抗體之輕鏈可變區。
此外，關於本發明中所使用之人類化抗體之輕鏈可變區，包含於序列編號5至序列編號8所表示之胺基酸序列中缺失、置換或置換10個以下、較佳為8個以下、進而較佳為5個以下、最佳為3個以下之胺基酸而成之胺基酸序列的變異輕鏈可變區，亦只要在與本發明之重鏈可變區組合時具有與MUC5AC之結合能力，則可用作本發明中所使用之人類化抗體之輕鏈可變區。
本發明中所使用之人類化抗體可藉由本技術領域中通常實施之方法或依據其之方法而製造。具體而言，可以如下順序來進行。 於序列編號1至序列編號8中揭示了本發明中所使用之人類化抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區之胺基酸序列，基於該等胺基酸序列資訊來構建編碼所獲得之該抗體之核酸，將其插入至適當之表現載體。表現載體係除了包含編碼本發明中所使用之人類化抗體之核酸以外，還任意地包含用以提高轉譯效率之Kozak序列、當導入至宿主時促進本發明中所使用之人類化抗體分泌到培養基中之訊息序列、及啟動子序列等。本發明中可使用之載體可自本技術領域中通常使用者中進行選擇，較佳為屬於質體載體之pcDNA3.4。表現載體向宿主細胞之導入並無特別限定，作為向細胞內導入基因之方法，可使用本技術領域中習知使用之方法，例如磷酸鈣法、電穿孔法、脂轉染法、DEAE-葡聚糖法等熟悉本技藝者所公知之方法。如下述實施例中所進行般，尤其適宜的是使用脂轉染法之導入方法。再者，以此目的所使用之宿主細胞亦可使用本技術領域中習知使用者。作為此種宿主細胞之例，可列舉：CHO細胞、293細胞、大腸桿菌、畢赤氏酵母、Sf9細胞等。再者，目前市售有用以表現目標蛋白質之表現系統之套組，為了迅速且確實地表現目標蛋白質，尤佳為下述實施例中所使用之ExpiCHO系統(Thermo Fisher Scientific公司)。
將編碼本發明中所使用之人類化抗體之核酸插入至表現載體，藉由包含該核酸之表現載體將該核酸導入至宿主細胞，對導入有核酸之宿主細胞進行培養，藉由層析法等純化手段，自該培養上清液中獲得本發明中所使用之人類化抗體。於本方法中，藉由培養宿主細胞而使本發明中所使用之人類化抗體分泌至培養上清液中。可使用層析法等純化手段，自培養上清液中獲得本發明中所使用之人類化抗體或其抗原結合片段。作為層析法之手段，可使用親和層析法、離子交換層析法、尺寸排除層析法等本技術領域中所知之各種手段。尤佳為下述實施例中所使用之使用蛋白A管柱之親和層析法。
又，上述之人類化抗體亦可為多株抗體或單株抗體。
(1-3)螯合劑 本發明中螯合劑只要於構造中具有配位放射性核種之部位，則無特別限定，較佳為具有屬於放射性核種配位之部位的螯合部、及用以實現與抗體之複合化之取代基。作為螯合部，可舉例如：CB-TE2A(1,4,8,11-四氮雜雙環[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸)、CDTA(環己烷-反-1,2-二胺四乙酸)、CDTPA(4-氰基-4-[[(十二烷基硫醚基)硫代甲基]硫醚基]-戊酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α',α'',α'''-四甲基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-肆(胺甲醯基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷)、DOTA-GA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTP(((1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)肆(亞甲基))四膦酸)、DOTMP(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(亞甲基膦酸))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(乙醯胺基亞甲基膦酸)、DO2P(四氮雜環十二烷二甲烷膦酸)、去鐵胺(DFO)、DTPA(N,N-雙[2-[雙(羧甲基)胺基]乙基]-甘胺酸)、DTPA-BMA(5,8-雙(羧甲基)-11-[2-(甲基胺基)-2-氧代乙基]-3-氧代-2,5,8,11-四氮雜十三烷基-13-羧酸)、EDTA(2,2',2'',2'''-(乙烷-1,2-二基雙(氮三基))四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸)、NOTP(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三基参(亞甲基膦酸)、TETPA(1,4,8,11-四氮雜十四烷-1,4,8,11-四丙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮雜十四烷-N,N',N'',N'''-四乙酸)、TTHA(3,6,9,12-肆(羧甲基)-3,6,9,12-四氮雜十四烷二羧酸)、HEHA(1,2,7,10,13-六氮雜環十八烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸)、1,2-HOPO(N,N',N'',N'''-四(1,2-二氫-1-羥基-2-氧代吡啶-6-羰基)-1,5,10,14-四氮雜十四烷)、PEPA(1,4,7,10,13-五氮雜環十五烷-N,N',N'',N''',N''''-五乙酸)、H4octapa(N,N'-雙(6-羧基-2-吡啶基甲基)-乙二胺-N,N'-二乙酸)、H2bispa2(6,6'-({9-羥基-1,5-雙(甲氧基羰基)-2,4-二(吡啶-2-基)-3,7-二氮雜雙環[3.3.1]壬-3,7-二基}雙(亞甲基))二吡啶甲酸)、H2dedpa(1,2-[{6-(羧基)-吡啶-2-基}-甲基胺基]乙烷)、H2macropa(6-(1,4,10,13-四氧代-7,16-二氮雜環十八烷-N,N'-甲基)吡啶甲酸)、H5decapa(N,N''-雙(6-羧基-2-吡啶基甲基)-二伸乙基三胺-N,N',N''-三乙酸)、H6phospa(N,N'-(亞甲基膦酸酯基)-N,N'-[6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基]-甲基-1,2-二胺基乙烷)、HP-D03A(羥基丙基四氮雜環十二烷三乙酸)、卟啉，較佳為具有源自下述式(A)所表示之化合物之構造。
[化3]
Figure 02_image017
(式(A)中，R11 、R1 3 及R14 分別獨立地為包含-(CH2 )p COOH、-(CH2 )p C5 H5 N、-(CH2 )p PO3 H2 、-(CH2 )p CONH2 或-(CHCOOH)(CH2 )p COOH之基，R1 2 或R15 之一者為氫原子、羧基、或碳數2或者3之羧烷基，另一者為用以與上述抗體複合化之取代基，p為0以上3以下之整數，R1 2 為用以與上述抗體複合化之取代基時R15 為氫原子，R12 不為用以與上述抗體複合化之取代基時R1 5 為用以與上述抗體複合化之取代基)
作為式(A)所表示之具體構造，可列舉源自以下之式(A-1)〜(A-12)所表示之化合物之構造。
[化4]
Figure 02_image019
[化5]
Figure 02_image021
[化6]
Figure 02_image023
螯合部與用於實現與抗體之複合化之取代基的連結部位較佳為醯胺鍵、或硫脲鍵，由穩定性之觀點而言，更佳為醯胺鍵。
醯胺鍵係藉由使例如上述式(A-10)或(A-11)之N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS)基、或上述(A-12)之2,6-二側氧四氫-2H-吡喃基與一級胺反應而形成。又，硫脲鍵係藉由使上述式(A-2)、(A-3)所示之化合物之異硫氰酸酯基與一級胺或馬來醯亞胺基反應而形成。
本發明之複合體中，相對於抗體1分子，具有至少1分子以上之螯合劑即可，但較佳為具有1分子以上8分子以下之螯合劑。但是，由維持抗體其本身之活性(抗原識別作用、中和作用、補體活化作用及/或助噬作用)之觀點而言，較佳為向抗體之Fc區(恆定區)部位特異性地導入螯合劑，於本發明中，更佳為相對於抗體1分子，具有1分子或2分子之螯合劑。
於本發明之複合體中，螯合劑亦可經由連接子與抗體連接。作為連接子，可列舉：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、聚乙二醇(PEG)基、肽、糖鏈、二硫醚基及該等之組合等。 較佳為螯合劑經由連接子部位特異性地修飾抗體，更佳為修飾抗體之Fc區。於該情形時，可使用如下連接子，該連接子包含下述式(i)所表示之由13個以上且17個以下之胺基酸殘基所構成之肽(以下亦稱為「抗體修飾肽」)，且藉由經交聯劑修飾之抗體修飾肽與抗體之交聯反應所形成者。再者，於式(i)中，以胺基酸序列之紙面左側表示N末端側，胺基酸序列之紙面右側表示C末端側之方式來進行說明。於螯合劑經由作為連接子之抗體修飾肽而與抗體連接之情形時，螯合劑與抗體修飾肽所連結之位置並無特別限定，例如可直接或間接地與抗體修飾肽之N末端或C末端、較佳為N末端連結。又，抗體修飾肽之C末端亦可進行醯胺化等修飾以提高其穩定性等。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)  …    (i) 式(i)中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續之a個X、連續之b個X、連續之c個X、及連續之d個X， X係於側鏈不具有硫醇基及鹵代乙醯基之任一者之胺基酸殘基， a、b、c及d分別獨立地為1以上且5以下之整數，且滿足a＋b＋c＋d≦14， Xaa1及Xaa3分別獨立， 表示源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸的胺基酸殘基，或者其一者表示源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基，另一者表示源自於側鏈具有鹵代乙醯基之胺基酸之胺基酸殘基，Xaa1與Xaa3連結， Xaa2為離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，且經交聯劑修飾。
作為上述式(i)中之X中可包含之胺基酸殘基，可舉例如：源自甘胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸等胺基酸者，X可為包含相同種類之胺基酸之胺基酸殘基，亦可為包含各不相同之種類之胺基酸之胺基酸殘基。
式(i)中之a、b、c及d只要為上述範圍之數，則無特別限制，由肽與抗體之結合穩定性之觀點而言，以a＋b＋c＋d≦14作為條件，a較佳為1以上且3以下之整數，b較佳為1以上且3以下之整數，c較佳為3以上且5以下之整數，及d較佳為1以上且3以下之整數。
Xaa1及Xaa3係源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基，該等胺基酸各自可相同亦可不同。作為於側鏈具有硫醇基之胺基酸，可舉例如：半胱胺酸、高半胱胺酸。此類胺基酸殘基較佳為藉由雙硫鍵鍵結者，或者經由以下式(4)所示之連接子鍵結有硫醚基。式(4)中，虛線部分表示與硫醚基之鍵結部分。
[化7]
Figure 02_image025
關於Xaa1及Xaa3，亦可代替上述之組合，使Xaa1及Xaa3中一者為源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基，另一者為源自於側鏈具有鹵代乙醯基之胺基酸之胺基酸殘基。該等係經由硫醚鍵鍵結著。鹵代乙醯基係其末端經碘等鹵素取代，因與另一側鏈上之硫醇基之反應而鹵素脫離，形成硫醚鍵。
關於式(i)所表示之抗體修飾肽之具體胺基酸序列，可舉例如國際公開2016/186206號說明書、國際公開2017/217347號說明書及國際公開2018/230257號說明書中所記載之肽，亦可使用該等。
該等中，作為抗體修飾肽之胺基酸序列，較佳為具有以下之序列(1)〜(14)之任一個，進而較佳為具有以下之序列(1)、(2)、(13)或(14)。於以下之胺基酸序列(1)〜(14)中，(Xaa2)表示離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，(Xaa1)及(Xaa3)均表示高半胱胺酸殘基。又，以下之胺基酸序列(1)〜(14)中，(Xaa1)、(Xaa2)及(Xaa3)以外之胺基酸係以一個字母縮寫來表述。
(1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(序列編號9) (2)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(序列編號10) (3)RCAYH(Xaa2)GELVWCS(序列編號11) (4)GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(序列編號12) (5)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(序列編號13) (6)GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(序列編號14) (7)GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(序列編號15) (8)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(序列編號16) (9)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH(序列編號17) (10)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(序列編號18) (11)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(序列編號19) (12)SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(序列編號20) (13)RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH(序列編號21) (14)G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H(序列編號22)
(1-4)複合體之製造方法 本發明之複合體之製造方法可由如下2個步驟來製造，即接合步驟，其將螯合劑與抗體進行接合；及錯合物形成步驟，其形成放射性核種與螯合劑之錯合物。接合步驟可在錯合物形成步驟之前，亦可在錯合物形成步驟之後。
接合步驟中，可使用各種抗體之化學修飾法。具體而言，可列舉(a)〜(f)之方法。 (a)胺偶合法(使用具有經N-羥基丁二醯亞胺(NHS)基所活化之羧基之螯合劑或螯合物，對抗體之離胺酸殘基之胺基進行修飾之方法) (b)針對藉由將抗體之鉸鏈部位所存在之多肽鏈間之雙硫鍵(SS鍵)局部還原所產生之硫氫(SH)基，利用具有對SH基具有反應性之馬來醯亞胺基之螯合劑或連接子進行修飾之方法 (c)針對藉由利用基因工程造成之胺基酸變異而新導入至抗體之半胱胺酸，利用具有馬來醯亞胺基之螯合劑或連接子進行修飾之方法 (d)針對藉由利用基因工程造成之胺基酸變異而新導入至抗體之疊氮化離胺酸之疊氮基，利用點擊反應，並利用具有炔烴(例如二亞苄基環辛烯：DBCO)之螯合劑或連接子進行修飾之方法 (e)針對利用轉麩胺醯胺酶導入至抗體之特定位置之麩醯胺，利用具有離胺酸之側鏈之螯合劑或連接子進行修飾之方法 (f)利用具有上述(i)所示之抗體修飾肽之螯合劑或連接子，部位特異性地修飾抗體之Fc區之方法
錯合物形成步驟中，於螯合劑螯合(錯合物形成)放射性核種。關於此處所使用之放射性核種，由提高錯合物形成效率之觀點而言，較佳為以能夠游離之態樣使用，進而較佳為以離子之態樣使用。錯合物形成步驟只要能夠形成與放射性核種之錯合物，則放射性核種向螯合劑之添加順序並無限制。例如可使用使放射性金屬離子溶解於以水作為主體之溶劑中而成之溶液作為放射性核種。 形成錯合物後，亦可使用過濾器、膜濾器、填充有各種填充劑之管柱、層析法等，對所獲得之錯合物進行純化。
本發明之複合體之製造方法較佳為於錯合物形成步驟之後實行接合步驟。 於更佳之態樣中，於錯合物形成步驟(A)中，與具有能夠與放射性核種進行點擊反應之第1原子團作為用以實現與抗體複合化之取代基的螯合劑形成錯合物。繼而，於接合步驟(B)中，於肽修飾抗體與步驟(A)中所獲得之經錯合物形成之螯合劑之間實行點擊反應，而獲得本發明之複合體，上述肽修飾抗體係使用具有上述(i)所示之抗體修飾肽、及能夠進行點擊反應之第2原子團之抗體修飾連接子，部位特異性地修飾Fc區而成者。 以下針對步驟(A)及(B)，詳細地進行說明。
作為能夠進行點擊反應之第1原子團與第2原子團之組合，係根據點擊反應之種類來選擇適當之組合，可舉例如：炔烴與疊氮化物之組合、1,2,4,5-四
Figure 02_image027
與烯烴之組合等。關於該等原子團，只要第1原子團具有上述原子團之組合中之一個原子團，第2原子團具有上述原子團之組合中與第1原子團不同之一個原子團即可。由兼顧螯合劑及抗體之穩定性，與該等之鍵結效率提高的觀點而言，較佳為螯合連接子為炔烴且抗體修飾連接子為疊氮化物，或者螯合連接子為1,2,4,5-四
Figure 02_image027
且抗體修飾連接子為烯烴。作為此種原子團之組合之點擊反應之具體例，可列舉Huisgen環化加成反應、或反向電子要求型狄爾斯阿爾德反應等。
作為能夠進行點擊反應之原子團之組合之具體例，如以下式所示，可列舉：包含二苄基環辛炔(DBCO)作為第1原子團之炔烴的原子團(式(1a))、與包含疊氮基作為第2原子團之疊氮化物的原子團(式(2a))的組合；或者第1原子團為包含1,2,4,5-四
Figure 02_image027
之原子團(式(1b))、與包含反-環辛烯(TCO)作為第2原子團之烯烴的原子團(式(2b))的組合。較佳為式(1a)與式(2a)之組合。
[化8]
Figure 02_image030
(式中，R1 表示與螯合劑之連結部位，R2 表示與抗體中之抗體修飾肽之連結部位)
[化9]
Figure 02_image032
(式中，R3 及R4 中一者表示與螯合劑或抗體中之抗體修飾肽之任一者之連結部位，另一者表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基，R5 根據R3 或R4 表示與螯合劑或抗體中之抗體修飾肽之任一者之連結部位)
於使用包含上述式(1a)所表示之二苄基環辛炔(DBCO)作為第1原子團之炔烴的原子團的情形時，可列舉市售之各種DBCO試劑。具體而言，例如可選擇：DBCO-C6-Acid(二苄基環辛炔-C6-羧酸)、Dibenzylcyclooctyne-Amine(二苄基環辛炔-胺)、Dibenzylcyclooctyne Maleimide(二苄基環辛炔馬來醯亞胺)、DBCO-PEG acid(二苄基環辛炔-聚乙二醇-羧酸)、DBCO-PEG-NHS ester(二苄基環辛炔-聚乙二醇-琥珀醯亞胺酯)、DBCO-PEG-Alcohol、DBCO-PEG-amine(二苄基環辛炔-聚乙二醇-胺)、DBCO-PEG-NH-Boc、Carboxyrhodamine-PEG-DBCO(羧基若丹明-聚乙二醇-二苄基環辛炔)、Sulforhodamine-PEG-DBCO(磺醯若丹明-聚乙二醇-二苄基環辛炔)、TAMRA-PEG-DBCO、DBCO-PEG-Biotin(二苄基環辛炔-聚乙二醇-生物素)、DBCO-PEG-DBCO、DBCO-PEG-Maleimide(二苄基環辛炔-聚乙二醇-馬來醯亞胺)、TCO-PEG-DBCO、DBCO-mPEG等，但較佳為使用Dibenzylcyclooctyne Maleimide(二苄基環辛炔馬來醯亞胺)。
步驟(A)中，更佳為使用具有以下式(ii)所表示之構造之螯合劑。 A-B-C   …  (ii) 式(ii)中，A係以下式(iia)所表示之螯合部。
[化10]
Figure 02_image034
式(iia)中，Ra、Rb及Rc獨立為包含-(CH2 )p COOH、-(CH2 )p C5 H5 N、-(CH2 )p PO3 H2 、-(CH2 )p CONH2 或-(CHCOOH)(CH2 )p COOH之基，p為0以上且3以下之整數，Rd或Re之任一者為與B之鍵結部位(*)，另一者為氫原子，或者為包含-(CH2 )p COOH、-(CH2 )p C5 H5 N、-(CH2 )p PO3 H2 、-(CH2 )p CONH2 或-(CHCOOH)(CH2 )p COOH之基，p為0以上且3以下之整數。 式(ii)中，B由以下式(iib)表示。
[化11]
Figure 02_image036
式(iib)中，La及Lb獨立地為至少包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上且50以下之鍵結連接子，t為0以上且30以下之整數，s為0或1，*為與A之鍵結部位，**為與C之鍵結部位。 式(ii)中，C為以下式(iic)所表示之炔烴衍生物或式(iid)所表示之四
Figure 02_image027
衍生物之任一者。
[化12]
Figure 02_image039
式(iic)中，X為CHRk-**或N-**，Y為CHRk或C=O，Rk獨立為氫原子、或為碳數1以上且5以下之烷基，於X為CHRk-**且Y為CHRk之情形時，Rk部分可一起形成環烷基，Rf、Rg、Rh及Ri獨立為氫原子、鹵素原子、碳數1以上且5以下之烷基，可Rf與Rg一起、或Rh與Ri一起形成烴環，**表示與B之鍵結部位，式(iid)中，**表示與B之鍵結部位，Rj表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基)
作為步驟(A)中所使用之螯合劑，更佳為如下任一者：上述式(iia)中，Ra至Rd為-(CH2 )p COOH，p為1，Re為與B之鍵結部位之DOTA衍生物；或者Ra至Rc為-(CH2 )p COOH，p為1，Rd為與B之鍵結部位(*)，Re為氫原子之DO3A衍生物或DOTAGA衍生物。
進而更佳為如下DOTA-PEGt-DBCO衍生物或DOTA-PEGt-Tz衍生物：上述DOTA-PEGt-DBCO衍生物係於式(ii)中，A為上述DOTA衍生物之情形時，B中La為包含硫脲鍵之碳數1以上且50以下之鍵結連接子，s為0或1，於s為1之情形時，t為0以上30以下之整數，Lb為包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上且50以下之鍵結連接子，C為式(iic)所表示之炔烴衍生物，於式(iic)中，X為N-**，Y為CHRk，Rk為氫原子，Rf與Rg一起形成苯環，Rh與Ri一起形成苯環，**為與B之鍵結部位；上述DOTA-PEGt-Tz衍生物係於B中La為包含硫脲鍵之碳數1以上且50以下之鍵結連接子，s為0或1，於s為1之情形時，t為0以上且30以下之整數，Lb為包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上且50以下之鍵結連接子，C為式(iid)所表示之四
Figure 02_image027
衍生物。
進而更佳為如下DO3Α-PEGt-DBCO衍生物，即，於式(ii)中，A為上述DO3A衍生物之情形時，B中La為包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上且50以下之鍵結連接子，s為0或1，s為1之情形時，t為0以上且30以下之整數，Lb為包含醯胺鍵之碳數1以上且50以下之鍵結連接子，C為式(iic)所表示之炔烴衍生物，於式(iic)中，X為N-**，Y為CHRk，Rk為氫原子，Rf與Rg一起形成苯環，Rh與Ri一起形成苯環，**為與B之鍵結部位。
進而更佳為如下DOTAGΑ-PEGt-DBCO衍生物，即，於式(ii)中，A為上述DOTAGA衍生物之情形時，B中La為包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上且50以下之鍵結連接子，s為0或1，s為1之情形時，t為0以上且30以下之整數，Lb為包含醯胺鍵或硫脲鍵之碳數1以上且50以下之鍵結連接子，C為式(iic)所表示之炔烴衍生物，式(iic)中，X為N-**，Y為CHRk，Rk為氫原子，Rf與Rg一起形成苯環，Rh與Ri一起形成苯環，**為與B之鍵結部位。
關於螯合劑與放射性核種之莫耳比率，以螯合部/放射性核種計，下限較佳為10/1以上，更佳為100/1以上，進而較佳為500/1以上，上限較佳為10000/1以下，更佳為8000/1以下，進而較佳為7000/1以下，例如較佳為100/1以上且7000/1以下之範圍，更佳為500/1以上且7000/1以下之範圍。
錯合物形成反應較佳為於溶劑下進行。作為溶劑，例如可使用水、生理食鹽水、或乙酸鈉緩衝液、乙酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、参羥甲基胺基甲烷緩衝液(Tris緩衝液)、4-(2-羥乙基)-1-哌
Figure 02_image027
乙磺酸緩衝液(HEPES緩衝液)、或四甲基銨乙酸緩衝液等緩衝液等。
溶劑之液量並無特別限定，由製造步驟中之實用性之觀點而言，於步驟(A)之開始時，下限為0.01 mL以上，較佳為0.1 mL以上，更佳為1.0 mL以上，進而較佳為10 mL以上，進而更佳為100 mL以上，上限較佳為1000以下，更佳為100 mL以下，進而較佳為10 mL以下，進而更佳為1.0 mL以下，例如為0.01 mL以上且100 mL以下之範圍。
關於錯合物形成反應之反應液中之螯合劑之濃度，由目標螯合劑之產率之觀點而言，分別獨立，於步驟(A)之開始時，下限較佳為0.001 μmol/L以上，更佳為0.01 μmol/L以上，進而較佳為0.1 μmol/L以上，進而更佳為1 μmol/L以上，上限較佳為1000 μmol/L以下，更佳為100 μmol/L以下，進而較佳為10 μmol/L以下，可舉例如1 μmol/L以上且100 μmol/L以下之範圍。
作為錯合物形成反應之溫度，例如可為室溫(25℃)，亦可於加熱條件下，由兼顧抑制螯合劑之分解與提高錯合物之形成效率之觀點而言，下限較佳為20℃以上，更佳為30℃以上，進而較佳為35℃以上，進而更佳為37℃以上，尤佳為45℃以上，上限較佳為150℃以下，更佳為120℃以下，進而較佳為100℃以下，進而更佳為90℃以下，例如較佳為30℃以上且100℃以下之範圍，更佳為35℃以上且90℃以下之範圍。
關於反應時間，以上述反應溫度為條件，下限較佳為5分鐘以上，更佳為10分鐘以上，進而較佳為20分鐘以上，進而更佳為30分鐘以上，尤佳為45分鐘以上，上限較佳為180分鐘以下，更佳為150分鐘以下，進而較佳為120分鐘以下，進而更佳為90分鐘以下，尤佳為60分鐘以下，例如較佳為10分鐘以上且150分鐘以下之範圍，更佳為10分鐘以上且60分鐘以下之範圍。
步驟(B)中所使用之抗體係使用具有上述(i)所示之抗體修飾肽、及能夠進行點擊反應之第2原子團之抗體修飾連接子，部位特異性地修飾上述「(1-2)抗體」之項中所詳細說明之人類化抗體之Fc區(恆定區)而成之肽修飾抗體。
抗體修飾肽可藉由如下方式進行製造：將不限定於天然胺基酸及非天然胺基酸之胺基酸組合使用，並供於例如液相合成法、固相合成法、自動肽合成法、基因重組法及噬菌體呈現法等肽合成法。合成肽時，亦可視需要保護所使用之胺基酸之官能基。該等例如可依據國際公開2017/217347號說明書及國際公開2018/230257號說明書所記載之方法來進行。
抗體修飾連接子亦可為抗體修飾肽、與以下式(S1)所表示之連接子鍵結而成者。 *-((L1 )m -Z)k -L2 -AG2 …  (S1) (式中，*表示與肽之N末端或C末端之鍵結部位， L1 為聚乙二醇(PEG)連接子部， m為1以上且50以下之整數， Z為將(L1 )m 與L2 鍵結之第2連接子部， k為0或1， L2 為第二PEG連接子部， AG2 為第2原子團)。
上述式(S1)中，Z之構造只要為將(L1 )m 與L2 相互鍵結之連接子構造，則無特別限定，例如可含有包含1個以上且5個以下之胺基酸殘基之胺基酸序列。於該情形時，Z所包含之胺基酸序列較佳為包含半胱胺酸殘基，更佳為經由藉由半胱胺酸殘基之硫醇基與馬來醯亞胺基之鍵結所形成之硫醚基而與L2 鍵結。
本發明中，構成L2 之PEG連接子部較佳為具有以下式(P2)所示之構造。式(P2)中，n為整數，較佳為1以上且50以下，更佳為1以上且20以下，進而較佳為2以上且10以下，進而更佳為2以上且6以下。
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Figure 02_image043
PEG連接子部之構造之一端可藉由源自市售之PEG化試劑之構造或源自PEG化時通常使用之試劑之構造來進行修飾，並無特別限定，例如可例示源自二甘醇酸或其衍生物、馬來醯亞胺或其衍生物之構造。
關於向抗體修飾連接子導入上述第2原子團方法，可列舉如下方法：藉由上述方法獲得具有所需胺基酸序列之抗體修飾肽後，使該肽溶解於添加有溶解輔助劑及還原劑、以及視需要之酸之溶液中，向該溶液添加作為第2原子團之包含疊氮基或反-環辛烯(TCO)之原子團之有機溶劑溶液，於室溫下進行攪拌，藉此導入上述第2原子團。
於導入包含疊氮基之原子團作為第2原子團之情形時，可使用市售之疊氮基導入試劑，依據常規方法，向肽之N末端或C末端直接導入疊氮基；或者可經由上述連接子構造導入包含疊氮基之原子團。作為所使用之疊氮基導入試劑，可舉例如：矽烷基疊氮化物、磷酸疊氮化物、烷基銨疊氮化物、無機疊氮化物、磺醯基疊氮化物、或PEG疊氮化物等。
又，於導入包含TCO之原子團作為第2原子團之情形時，可使用包含TCO之市售之點擊化學用試劑，依據常規方法，向肽之N末端或C末端直接TCO；或者可經由上述連接子構造導入包含TCO之原子團。
使抗體修飾肽與抗體鍵結而獲得肽修飾抗體之方法，例如可使用交聯劑來進行。所謂交聯劑，係用以使抗體修飾肽與抗體藉由共價鍵連結之化學物質，作為其例，可列舉：戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DSG)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)等較佳為包含2個以上之琥珀醯亞胺基之交聯劑；由二亞胺代己二酸二甲酯等較佳為包含2個以上之醯亞胺酸部分之化合物或其鹽所構成之交聯劑；以及由3,3'-二硫代雙丙醯亞胺酸二甲酯、二硫代雙琥珀醯亞胺基丙酸等具有雙硫鍵之化合物或其鹽所構成者等。藉由使用此種交聯劑，可使抗體修飾肽中之Xaa2之胺基酸殘基與抗體之間產生交聯反應。關於抗體中之交聯反應，例如於使用本發明之人類化抗體作為抗體之情形時，Xaa2之胺基酸殘基、與本發明之人類化抗體中之基於Eu編號之Lys252殘基之間產生部位特異性。該等Lys殘基存在於本發明之人類化抗體之Fc區。
關於抗體修飾肽與抗體之鍵結方法，例如使上述抗體修飾肽、抗體、交聯劑、及視需要之觸媒於10℃以上且30℃以下之環境下分散於適當之緩衝液中來進行。反應時間可設為10分鐘以上且2小時左右。肽與抗體之反應時之莫耳比率以抗體/肽計，下限較佳為1/5以上，更佳為1/3以上，進而較佳為1/1.5以上，上限較佳為20/1以下，更佳為10/1以下，進而較佳為5/1以下，進而更佳為1/1以下，尤佳為1/1.7以下，例如較佳為1/5以上且20/1以下之範圍，更佳為1/1.5以上且1/1.7以下。
經以上步驟獲得之肽修飾抗體係將抗體1分子上鍵結有抗體修飾肽1分子之抗體(以下稱為「一價抗體」)、與抗體1分子上鍵結有抗體修飾肽2分子之抗體(以下稱為「二價抗體」)以任意比例含有之混合物，可將其直接供於以後之步驟，亦可藉由過濾器、膜濾器、填充有各種填充劑之管柱、各種層析法等方法將未修飾抗體、一價抗體、及二價抗體進行分離純化後，僅將任一價數之抗體供於以後之步驟。於純化之結果為無法將未修飾抗體與其他價數之抗體分離之情形時，亦可以含有該等之混合物之形式供於以後之步驟。 於將未修飾抗體、一價抗體、及二價抗體進行分離純化之情形時，上述所有純化方法均可進行分離純化，但較佳為使用填充有各種填充劑之管柱，更佳為使用填充有適合抗體等蛋白質之分離純化之填充劑的管柱。
作為適合抗體等蛋白質之分離純化之填充劑，只要為使與抗體特異性結合之免疫球蛋白結合性蛋白質被固定在由水不溶性基材所構成之載體者，則無特別限定。作為免疫球蛋白結合性蛋白質，可舉例如：蛋白A、蛋白G、蛋白L等。該等免疫球蛋白結合性蛋白質亦可為經基因操作之重組型，作為重組型之免疫球蛋白結合性蛋白質，可列舉：基因改變型蛋白A、基因改變型蛋白G、或蛋白A之區域與蛋白G之區域之融合型。本發明中，作為至少適合一價抗體與二價抗體之分離純化之填充劑，更佳為蛋白A，進而較佳為基因改變型蛋白A。此處，蛋白A及蛋白G係可與屬於抗體分子之IgG特異性結合之蛋白質分子，根據所分離之微生物之不同來源，分類為蛋白A(金黃色葡萄球菌：Staphylococcus aureus)或蛋白G(鏈球菌：Streptococcus屬)。基因改變型蛋白A係向蛋白A之IgG結合區(E、D、A、B及C區域)中之任一區域之胺基酸殘基導入至少1個胺基酸變異而成之蛋白A，本發明中，較佳為使導入有至少1個胺基酸變異之區域多聚體化而成之基因改變型蛋白A，更佳為使蛋白A之導入有至少1個胺基酸變異之A、B或C區域進行多聚體化而成者，進而更佳為多聚體化成二聚體以上且五聚體以下者。胺基酸變異可由基因之轉錄轉譯步驟中胺基酸序列或編碼胺基酸之鹼基序列之置換、缺失、插入等任一變異所造成。作為無特別限定之一例，可列舉國際公開2003/080655號說明書、國際公開2011/118699號說明書所記載之基因改變型蛋白A等。
作為供固定免疫球蛋白結合性蛋白質之水不溶性基材，可列舉：玻璃珠、矽膠等無機載體；包含交聯聚乙烯醇、交聯聚丙烯酸酯、交聯聚丙烯醯胺、交聯聚苯乙烯等合成高分子、或結晶性纖維素、交聯纖維素、交聯瓊脂糖、交聯葡聚糖等多糖類之有機載體；進而藉由組合該等所獲得之有機-有機、有機-無機等複合載體等。
作為填充有上述基因改變型蛋白A作為填充劑之管柱，例如市售有：Kaneka股份有限公司之KanCap(註冊商標)系列(KANEKA KanCapA prepacked column)、GE Healthcare公司之HiTrap(註冊商標)系列(HiTrap Mabselect、HiTrap Mabselect SuRe、HiTrap Mabselect Xtra)、GE Healthcare公司之HiScreen系列(HiScreen Mabselect SuRe)、或東曹股份有限公司之TOYOPEARL(註冊商標)系列(TOYOPEARL AF-rProtein A-650F)等。
以下舉例說明對步驟(B)中之點擊反應所使用之肽修飾抗體進行分離純化之情形。 肽修飾抗體係經抗體修飾步驟及抗體純化步驟後供於步驟(B)中之點擊反應，上述抗體修飾步驟係藉由具備抗體修飾肽之連接子(抗體修飾連接子)，部位特異性地修飾抗體之Fc區而獲得修飾抗體；上述抗體純化步驟係使用固定有上述免疫球蛋白結合性蛋白質之載體對修飾抗體進行純化。又，抗體純化步驟進而包括：保持步驟，其使載體所保持之修飾抗體被保持於載體；洗淨步驟，其將未被載體保持之修飾抗體洗淨；及溶出步驟，其使保持步驟中載體所保持之修飾抗體溶出。 更具體而言，抗體修飾步驟中，以包含未被抗體修飾連接子修飾之未修飾抗體、一價抗體、及二價抗體之混合物之形式獲得修飾抗體，於抗體純化步驟中，利用未修飾抗體、一價抗體及二價抗體對於免疫球蛋白結合性蛋白質之各不相同之相互作用，使包含相對較多之未修飾抗體及一價抗體之第一抗體組成物、與包含相對較多之二價抗體之第二抗體組成物分別溶出。即，在抗體純化步驟中之保持步驟及洗淨步驟中，使包含相對較多之與免疫球蛋白結合性蛋白質之相互作用之程度較低的肽修飾抗體(二價抗體)的第二抗體組成物溶出，在抗體純化步驟中之溶出步驟中，使包含相對較多之與免疫球蛋白結合性蛋白質之相互作用之程度較高之肽修飾抗體(未修飾抗體及一價抗體)的第一抗體組成物溶出。此處，「包含相對較多之未修飾抗體及一價抗體」意指第一抗體組成物所包含之未修飾抗體及一價抗體之合計量多於該抗體組成物所包含之二價抗體，較佳為相對於該抗體組成物所包含之未修飾抗體及修飾抗體之總量(100%)，未修飾抗體及一價抗體之合計量為55%以上、63%以上、70%以上、80%以上、或90%以上，「包含相對較多之二價抗體」意指第二抗體組成物所包含之二價抗體之量多於該抗體組成物所包含之一價抗體，較佳為相對於該抗體組成物所包含之未修飾抗體及修飾抗體之總量(100%)，二價抗體之量為55%以上、63%以上、70%以上、80%以上、或90%以上。
保持步驟中，將抗體修飾步驟中所獲得之含有未修飾抗體、一價抗體及二價抗體之混合物之溶液添加於管柱中，使載體所保持之未修飾抗體及一價抗體被保持於管柱，並使未被載體保持之二價抗體通過。此處，保持步驟中所通過之溶液係構成第二抗體組成物之一部分。 為了使未修飾抗體及一價抗體容易保持於管柱，又，為了防止該等凝集或改質，較佳為利用適當之稀釋溶劑對肽修飾抗體之混合溶液進行稀釋並添加於管柱中。作為稀釋溶劑，只要為肽修飾抗體可溶解、且於溶劑中不易凝集或改質之溶劑，則無特別限定，可使用水、生理食鹽水、或乙酸鈉緩衝液、乙酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、2-胺基-2-(羥甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)緩衝液、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤基]-乙磺酸(HEPES)緩衝液等緩衝液等，較佳為使用上述任一種緩衝液，更佳為使用乙酸鈉緩衝液。於稀釋溶劑使用緩衝液之情形時，關於緩衝劑之濃度，作為下限為10 mmol/L以上，較佳為15 mmol/L以上，更佳為20 mmol/L以上，作為上限為1000 mmol/L以下，較佳為500 mmol/L以下，更佳為100 mmol/L以下。又，由減少二價抗體或抗體修飾肽與管柱載體間之非特異性結合之觀點而言，溶出溶劑亦可含有氯化鈉、氯化鉀等添加劑。溶出溶劑所含有之添加劑之濃度並無特別限定，例如可使用0.15 mol/L。
洗淨步驟中，使用洗淨溶劑，使殘存在管柱內之修飾抗體自管柱中溶出。上述保持步驟中通過管柱之溶液、與洗淨步驟中自管柱中溶出之溶液係包含相對較多之二價抗體，因此可將該等合併而用作為第二抗體組成物。 作為洗淨溶劑，只要為肽修飾抗體可溶解、且於溶劑中不易凝集或改質，並具有適當之pH緩衝能力之緩衝液，則無特別限定，可使用乙酸鈉緩衝液、乙酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、2-胺基-2-(羥甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)緩衝液、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤基]-乙磺酸(HEPES)緩衝液等緩衝液等，較佳為使用上述任一種緩衝液，更佳為使用乙酸鈉緩衝液。關於洗淨溶劑所使用之緩衝劑之濃度，作為下限為20 mmol/L以上，較佳為30 mmol/L以上，作為上限為200 mmol/L以下，較佳為70 mmol/L以下。又，關於洗淨溶劑之pH值，作為下限為4.0以上，較佳為4.5以上，更佳為4.8以上，作為上限為7.4以下，較佳為6.0以下，更佳為5.2以下。進而，由減少二價抗體或抗體修飾肽與管柱載體間之非特異性結合之觀點而言，溶出溶劑亦可含有氯化鈉、氯化鉀等添加劑。溶出溶劑所含有之添加劑之濃度並無特別限定，例如可使用0.15 mol/L。
溶出步驟中，使用溶出溶劑，使載體所保持之修飾抗體自管柱中溶出。即，使用溶出溶劑，使包含相對較多之未修飾抗體及一價抗體之第一抗體組成物自管柱中溶出。 作為溶出溶劑，可使用乙酸鈉緩衝液、乙酸銨緩衝液、檸檬酸緩衝液等緩衝液等。又，由減少抗體修飾連接子、未修飾抗體及修飾抗體與管柱載體間之非特異性結合之觀點而言，溶出溶劑亦可含有氯化鈉、氯化鉀等添加劑。溶出溶劑所含有之添加劑之濃度並無特別限定，例如可使用0.15 mol/L。 於溶出溶劑包含緩衝劑之情形時，關於緩衝劑之濃度，作為下限為20 mmol/L以上，較佳為30 mmol/L以上，作為上限為200 mmol/L以下，較佳為70 mmol/L以下。又，關於溶出溶劑之pH值，為了減弱未修飾抗體及一價抗體與免疫球蛋白結合性蛋白質之相互作用，又，由防止抗體之改質及凝集之觀點而言，作為下限，較佳為pH值3.0以上，作為上限，較佳為pH值4.2以下。
抗體純化步驟中所取得之第一抗體組成物或第二抗體組成物可直接用於以後之步驟(B)中之點擊反應，亦可在調節所含有之肽修飾抗體之蛋白質濃度後用於步驟(B)中之點擊反應。
步驟(B)中之點擊反應係於螯合劑所具有之能夠進行點擊反應之第一原子團、與肽修飾抗體所具有之能夠進行點擊反應之第二原子團之間實行。藉由該點擊反應而形成將螯合劑與抗體連結之鍵結基(能夠與抗體複合化之取代基)。
只要肽修飾抗體與步驟(A)中所獲得之錯合物能夠進行點擊反應，則該等之添加順序不受限制，例如可於收容有溶劑之反應容器中添加該錯合物及該肽修飾抗體之一者，繼而添加另一者以進行反應，亦可使該螯合劑及該抗體之一者分散於溶劑中，於所獲得之分散液中添加另一者以進行反應。或者亦可於收容有溶劑之反應容器中同時添加該等以進行反應。
作為步驟(B)之點擊反應所使用之溶劑，可使用包含水之溶劑，例如可使用水、生理食鹽水、或乙酸鈉緩衝液、乙酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、或四甲基銨乙酸緩衝液等緩衝液等。於使用緩衝液之情形時，由兼顧錯合物及抗體之穩定性、與該等之鍵結效率之觀點而言，較佳為使25℃下之pH值成為4.0以上且10.0以下、進而較佳為5.5以上且8.5以下。
反應液量並無特別限定，由於製造步驟中之實用性之觀點而言，於步驟(B)之開始時，下限較佳為0.001 mL以上，更佳為0.01 mL以上，進而較佳為0.1 mL以上，進而更佳為1 mL以上，上限較佳為1000 mL以下，更佳為100 mL以下，進而較佳為10 mL以下，進而更佳為1 mL以下，例如較佳為0.001 mL以上且1000 mL以下之範圍，更佳為0.1 mL以上且10 mL以下之範圍。
又，螯合劑及抗體於反應液中之濃度係分別獨立，於步驟(B)之開始時，作為下限，較佳為0.001 μmol/L以上，更佳為0.01 μmol/L以上，進而較佳為0.1 μmol/L以上，進而更佳為1.0 μmol/L以上，作為上限，較佳為1000 μmol/L以下，更佳為100 μmol/L以下，例如較佳為0.1 μmol/L以上且1000 μmol/L以下之範圍，由目標複合體之產量之觀點而言，更佳為1 μmol/L以上且100 μmol/L以下之範圍。
由一面防止抗體之非刻意改質、一面提高反應效率之觀點而言，步驟(B)中之點擊反應中，反應溫度之上限較佳為50℃以下，更佳為40℃以下。又，關於反應溫度之下限，只要為反應會進行之溫度，則無特別限制，較佳為15℃以上。關於點擊反應之反應時間，以上述反應溫度作為條件，較佳為5分鐘以上，更佳為10分鐘以上，且較佳為24小時以下，更佳為20小時以下，例如較佳為5分鐘以上且24小時以下之範圍，更佳為10分鐘以上且20小時以下之範圍。
所獲得之複合體可直接使用，或者亦可使用過濾器、膜濾器、填充有各種填充劑之管柱、層析法等來進行純化。
藉由步驟(A)及(B)所製造之複合體係與MUC5AC特異性結合之人類化抗體之特定部位(例如抗體之Fc區之離胺酸殘基)經螯合劑特異性地修飾者。該複合體係相對於該抗體1分子，具備上述螯合劑1分子或2分子。螯合劑係經由連接子部位特異性地修飾本發明之抗體之Fc區。該連接子係由與螯合劑連接之螯合連接子、與該連接子連接之第1原子團、可與第1原子團進行點擊反應之第2原子團、與第2原子團連接之抗體修飾連接子(包含上述式(i)所表示之抗體修飾肽)所構成。因此，該連接子具有源自第1原子團及第2原子團之化學構造。作為此種化學構造，可認為下述式(10a)或(10b)所表示之含三唑骨架之構造或下述式(10c)所表示之含嗒
Figure 02_image027
骨架之構造。式(10a)與式(10b)由於互為異構物，故可以任意之比例含有。
[化14]
Figure 02_image045
式(10a)及式(10b)中，R1A 表示與螯合連接子之鍵結部位，R2A 表示與抗體修飾連接子之鍵結部位。式(10c)中，R3A 及R4A 中一者表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示與螯合連接子之鍵結部位，R5A 表示與抗體修飾連接子之鍵結部位。
(1-5)放射性醫藥 藉由上述(1-4)所示之方法所製造之複合體，可直接或在純化後，製備包含該複合體作為有效成分之放射性醫藥。所謂放射性醫藥，係指如下組成物，其包含本發明之複合體、即經放射性核種(發射α射線之金屬核種)標定之抗MUC5AC人類化抗體或其衍生物，並採用適合向對象之生物體內投予之形態。放射性醫藥例如可使藉由上述方法所製造之本發明之複合體溶解於以水為主體且與生物體大致等張之溶劑中來進行製造。於該情形時，放射性醫藥較佳為水溶液之形態，亦可視需要含有藥學上所容許之其他成分。關於放射性醫藥，將其有效量以經口之方式、或以靜脈內、皮下、腹腔內或肌肉內等非經口之方式向生物體投予，而用於治療疾病、診斷疾病、或檢測病灶等。 此處，作為投予對象，為人類、或小鼠、大鼠、猴、豚鼠、黑猩猩、綿羊、山羊、狗、貓、豬、牛或馬等動物，並無特別限定。較佳為人類。 作為較佳之對象疾病，可列舉癌。關於本發明中被治療、診斷之癌，可列舉：胰腺癌、甲狀腺癌、肝癌、大腸癌、胃癌、尿路上皮癌、乳癌、子宮頸癌、卵巢癌、或子宮內膜癌，尤佳為適用於胰腺癌。
作為本發明中被治療、診斷之癌之例，亦可列舉膽管癌。
又，已多次報告有MUC5AC為CA19-9之抗原載體(PLoS ONE(December2011, Volume6, Issue12, e29180, p1-10))。因此，作為本發明中被治療之癌，可列舉：過度表現CA19-9之膽道癌、子宮體癌、肺癌、或食道癌，可高效率地進行治療。
此處「有效量」係可獲得投予對象於治療上之有效效果之量。關於應向對象投予之有效量，係根據對象之種類、對象之體重、所投予之劑形(錠劑、注射劑等)及路徑(經口投予、非經口投予等)、及疾病(例如癌)之嚴重度等而有所不同。醫師或獸醫可考慮該等因子來決定適當之有效量。
藉由選擇具有治療效果者作為放射性核種，本發明之複合體可用於放射性核種內照射療法(RI內照射療法)。RI內照射療法係將放射性醫藥以靜脈注射或經口之方式投予，使該放射性藥劑於如癌原發病灶或轉移病灶之病灶部位中累積，藉由自放射性藥劑放射之放射線，將病灶部位之癌細胞破壞。因此，本發明之複合體可較佳地用於癌之RI內照射療法。於該情形時，該醫藥之投予量、用量係根據有效成分之有效性、投予之形態、路徑、疾病(尤其是癌)之進行階段、患者之體型•體重•年齡、所併用之其他疾病之治療藥之種類或量而適當選擇，通常可以每次250 kBq/kg以下之用量投予。即便為每次80 kBq/kg以下之用量，亦可發揮效果。
又，作為本發明之其他態樣，亦可準備放射性醫藥，其以如下複合體作為有效成分，即，於上述複合體中，僅將放射性核種替換成發射α射線之核種至發射正電子或γ射線之放射性核種(68 Ga、64 Cu、86 Y、89 Zr、111 In)，將上述所準備之放射性醫藥用於上述癌之RI內照射療法中之癌之診斷。本發明之癌之診斷用放射性醫藥可用於進行癌之RI內照射療法之前的診斷，亦可用於進行癌之RI內照射療法後的診斷。藉由用於進行癌之RI內照射療法之前的診斷，可用於治療選擇之判斷，即，是否實行使用具備發射α射線之金屬核種之本發明之複合體的癌之RI內照射療法。又，藉由用於進行癌之RI內照射療法後的診斷，可用於判定使用了具備發射α射線之金屬核種之本發明複合體的癌之RI內照射療法是否有治療效果、或增減投予量等使治療計劃適配化。
(2)複合體2 作為另一實施態樣，本發明提供一種複合體，其係螯合有放射性核種之螯合劑與抗體之複合體，且上述放射性核種為發射正電子之金屬核種，上述抗體為與MUC5AC特異性結合之人類化抗體。
螯合劑中之放射性核種為發射正電子之金屬核種，除此以外，應用與上述「(1)複合體1」相同之定義。 發射正電子之金屬核種只要為於放射性金屬之衰變過程中發射具有正電荷之電子(正電子)之核種即可，詳細而言，可較佳地使用68 Ga、64 Cu、86 Y及89 Zr等，更佳為89 Zr(鋯-89)。經正電子發射核種標定之抗體適宜用於PET(Positron Emission Tomography，正電子發射斷層攝影法)檢查。 又，使用正電子發射核種作為放射性核種之複合體2，亦可用作癌之診斷用放射性醫藥，該癌之診斷用放射性醫藥係用於使用了利用α射線發射核種作為放射性核種之上述複合體1的RI內照射療法。於該情形時，該醫藥之投予量只要為PET檢查中繪出疾病(尤其是癌)之病灶所需之充分量，則無特別限定，較佳為根據疾病(尤其是癌)之進行階段、患者之體型•體重•年齢、所併用之其他疾病之治療藥之種類或量來適當選擇。
根據以上所述之本發明之實施形態，提供一種對於MUC5AC之特異性及於腫瘤中之累積性優異之經放射性核種、尤其是經α射線發射核種標定之抗MUC5AC抗體、尤其是人類化抗體。 又，根據本發明之實施形態，提供一種用以達成治療診斷之癌診斷用及/或癌治療用之RI標定抗MUC5AC抗體。
本發明之上述實施形態包含以下之技術思想。 [1]一種複合體，其係螯合有放射性核種之螯合劑、與抗體之複合體，且上述放射性核種為發射α射線之金屬核種，上述抗體為與MUC5AC特異性結合之人類化抗體。 [2]如上述[1]記載之複合體，其中，上述抗體係具有重鏈可變區及輕鏈可變區的人類化抗體， 上述重鏈可變區包含： (1)序列編號1所表示之胺基酸序列(H01)、 (2)序列編號2所表示之胺基酸序列(H02)、 (3)序列編號3所表示之胺基酸序列(H03)、或 (4)序列編號4所表示之胺基酸序列(H04)； 上述輕鏈可變區包含： (5)序列編號5所表示之胺基酸序列(L01)、 (6)序列編號6所表示之胺基酸序列(L02)、 (7)序列編號7所表示之胺基酸序列(L03)、或 (8)序列編號8所表示之胺基酸序列(L04)。 [3]如上述[2]記載之複合體，其中，上述抗體係具有重鏈可變區及輕鏈可變區之人類化抗體， 上述重鏈可變區包含(1)序列編號1所表示之胺基酸序列(H01)； 上述輕鏈可變區包含(7)序列編號7所表示之胺基酸序列(L03)。 [4]如上述[1]至[3]中任一項記載之複合體，其中，發射α射線之上述金屬核種為錒-225。 [5]如上述[1]至[4]中任一項記載之複合體，其中，相對於上述抗體1分子，具備上述螯合劑1分子以上且8分子以下。 [6]如上述[1]至[5]中任一項記載之複合體，其中，上述螯合劑係經由連接子，部位特異性地修飾了上述抗體之Fc區。 [7]如上述[6]記載之複合體，其中，上述連接子包含下述式(i)所表示之由13個以上且17個以下之胺基酸殘基所構成之抗體修飾肽。 (Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) …  (i) (式中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續之a個X、連續之b個X、連續之c個X、及連續之d個X， X為於側鏈不具有硫醇基亦不具有鹵代乙醯基之胺基酸殘基， a、b、c及d分別獨立地為1以上且5以下之整數，且滿足a＋b＋c＋d≦14， Xaa1及Xaa3分別獨立地， 表示源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸的胺基酸殘基，且經由雙硫鍵鍵結著，或硫醚基經由連接子鍵結著，或者 一者表示源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸的胺基酸殘基，另一者表示源自於側鏈具有鹵代乙醯基之胺基酸的胺基酸殘基，且經由硫醚鍵鍵結著， Xaa2係離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸)。 [8]如上述[7]記載之複合體，其中，於上述抗體修飾肽係於上述式(i)中，Xaa2為離胺酸殘基。 [9]如上述[7]或[8]記載之複合體，其中，上述抗體修飾肽係含有由序列編號10(其中，Xaa2為離胺酸殘基)所表示之胺基酸序列所構成之抗體修飾肽。 [10]如上述[1]至[9]中任一項記載之複合體，其中，上述螯合劑具有源自下述式(A)所表示之化合物或其鹽之構造，
[化15]
Figure 02_image047
(式(A)中，R11 、R13 及R14 分別獨立地為由-(CH2 )p COOH、-(CH2 )p C5 H5 N、-(CH2 )p PO3 H2 、-(CH2 )p CONH2 或-(CHCOOH)(CH2 )p COOH所構成之基，R1 2 或R15 之一者為氫原子、羧基、或碳數2或者3之羧烷基，另一者為用於與上述抗體複合化之取代基，p為0以上且3以下之整數，R12 為用於與上述抗體複合化之取代基時R15 為氫原子，R12 不為用於與上述抗體複合化之取代基時，R15 為用於與上述抗體複合化之取代基)。 [11]如上述[6]至[10]中任一項記載之複合體，其中，上述螯合劑係經由連接子，部位特異性地修飾了上述抗體之Fc區，上述連接子具有藉由點擊反應所形成之鍵結基。 [12]如上述[11]記載之複合體，其中，上述連接子具有將上述螯合劑與上述藉由點擊反應所形成之鍵結基連接之螯合連接子、及將上述抗體與上述藉由點擊反應所形成之鍵結基連接之抗體修飾連接子，藉由上述點擊反應所形成之上述鍵結基係具備下述式(10a)所表示之含三唑骨架之構造、或含嗒
Figure 02_image027
骨架之構造，
[化16]
Figure 02_image050
(式中，R1A 表示與上述螯合連接子之鍵結部位，R2A 表示與上述抗體修飾連接子之鍵結部位)。 [13]一種放射性醫藥，其含有上述[1]至[12]中任一項記載之複合體作為有效成分。 [14]如上述[13]記載之放射性醫藥，其用於癌之RI內照射療法。 [15]如上述[14]記載之放射性醫藥，其用於在上述RI內照射療法中，以每次250 kBq/kg以下之投予量向對象投予。 [16]如上述[15]記載之放射性醫藥，其中，上述投予量為每次80 kBq/kg以下。 [17]一種RI內照射療法中之癌之診斷用放射性醫藥，係使用了上述[14]至[16]中任一項之放射性醫藥者， 其為含有螯合有放射性核種之螯合劑、與抗體之複合體的放射性醫藥，且上述抗體為與MUC5AC特異性結合之人類化抗體。 [18]一種複合體，其係螯合有放射性核種之螯合劑、與抗體之複合體，且 上述放射性核種為發射正電子之金屬核種， 上述抗體為與MUC5AC特異性結合之人類化抗體。 [19]如上述[18]記載之複合體，其中，上述抗體係具有重鏈可變區及輕鏈可變區之人類化抗體， 上述重鏈可變區包含： (1)序列編號1所表示之胺基酸序列(H01)、 (2)序列編號2所表示之胺基酸序列(H02)、 (3)序列編號3所表示之胺基酸序列(H03)、或 (4)序列編號4所表示之胺基酸序列(H04)； 上述輕鏈可變區包含： (5)序列編號5所表示之胺基酸序列(L01)、 (6)序列編號6所表示之胺基酸序列(L02)、 (7)序列編號7所表示之胺基酸序列(L03)、或 (8)序列編號8所表示之胺基酸序列(L04)。 [20]如上述[19]記載之複合體，其中，上述抗體係具有重鏈可變區及輕鏈可變區之人類化抗體， 上述重鏈可變區包含(1)序列編號1所表示之胺基酸序列(H01)； 上述輕鏈可變區包含(7)序列編號7所表示之胺基酸序列(L03)。 [21]如上述[18]至[20]中任一項記載之複合體，其中，發射正電子之上述金屬核種為鋯-89。 [22]如上述[18]至[21]中任一項記載之複合體，其中，相對於上述抗體1分子，具備上述螯合劑1〜8分子。 [23]如上述[18]至[21]中任一項記載之複合體，其中，上述螯合劑係經由連接子，部位特異性地修飾了上述抗體之Fc區。 [24]如上述[23]記載之複合體，其中，上述連接子含有下述式(i)所表示之由含13〜17個胺基酸殘基所構成之抗體修飾肽。 (Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) …  (i) (式中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續之a個X、連續之b個X、連續之c個X、及連續之d個X， X為於側鏈不具有硫醇基亦不具有鹵代乙醯基之胺基酸殘基， a、b、c及d分別獨立地為1以上且5以下之整數，且滿足a＋b＋c＋d≦14， Xaa1及Xaa3分別獨立地， 表示源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸的胺基酸殘基，且經由雙硫鍵鍵結著，或硫醚基經由連接子鍵結著，或者 一者表示源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸的胺基酸殘基，另一者表示源自於側鏈具有鹵代乙醯基之胺基酸的胺基酸殘基，且經由硫醚鍵鍵結著， Xaa2為離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸)。 [25]如上述[24]記載之複合體，其中，上述抗體修飾肽係於上述式(i)中，Xaa2為離胺酸殘基。 [26]如上述[24]或[25]記載之複合體，其中，上述抗體修飾肽係含有由序列編號10(其中，Xaa2為離胺酸殘基)所表示之胺基酸序列所構成之抗體修飾肽。 [27]如上述[18]至[26]中任一項記載之複合體，其中，上述螯合劑具有源自下述式(A)所表示之化合物之構造，
[化17]
Figure 02_image052
(式(A)中，R11 、R13 及R14 分別獨立地為由-(CH2 )p COOH、-(CH2 )p C5 H5 N、-(CH2 )p PO3 H2 、-(CH2 )p CONH2 或-(CHCOOH)(CH2 )p COOH所構成之基，R1 2 或R15 之一者為氫原子、羧基、或碳數2或者3之羧烷基，另一者為用於與上述抗體複合化之取代基，p為0以上且3以下之整數，R12 為用於與上述抗體複合化之取代基時R15 為氫原子，R12 不為用於與上述抗體複合化之取代基時R15 為用於與上述抗體複合化之取代基)。 [28]一種放射性醫藥，其含有 上述[18]至[27]中任一項記載之複合體作為有效成分。 [29]一種上述[1]至[12]及[18]至[27]中任一項記載之複合體之製造方法，其包括：複合化步驟，係將螯合有放射性核種之螯合劑、與抗MUC5AC抗體進行複合化，生成上述螯合劑與上述抗MUC5AC抗體之複合體。 [30]如上述[29]記載之複合體之製造方法，其中上述螯合劑係與螯合連接子連接，上述抗MUC5AC抗體係藉由具備抗體修飾肽之抗體修飾連接子而特異性地修飾Fc區，且藉由於上述複合化步驟中實行點擊反應，將上述螯合連接子與上述抗體修飾連接子連接。 [31]一種修飾抗體，係藉由具備抗體修飾肽之抗體修飾連接子，特異性地修飾抗體之Fc區而成之修飾抗體，上述抗體為抗MUC5AC抗體，上述抗體修飾連接子具有原子團，該原子團係用於藉由點擊反應而連接於螯合有放射性核種之螯合劑所具備之螯合連接子。 [32]一種修飾抗體之製造方法，其係藉由具備抗體修飾肽之抗體修飾連接子，特異性地修飾抗體之Fc區而成之修飾抗體的製造方法，其包括： 抗體修飾步驟，其利用具備抗體修飾肽之連接子，部位特異性地修飾上述抗體之Fc區而獲得修飾抗體； 抗體純化步驟，其使用固定有免疫球蛋白結合性蛋白質之載體對上述抗體進行純化，且 上述抗體為抗MUC5AC抗體。 [33]如上述[32]記載之修飾抗體之製造方法，其中，上述免疫球蛋白結合性蛋白質為蛋白A或基因改變型蛋白A。 [34]如上述[32]或[33]記載之修飾抗體之製造方法，其中，使用填充有上述載體之管柱實行上述抗體純化步驟。 [35]如上述[32]至[34]中任一項記載之修飾抗體之製造方法，其中，上述抗體純化步驟包括：保持步驟，其使上述修飾抗體保持於上述載體；及 溶出步驟，其使上述載體所保持之上述修飾抗體溶出。 [36]如上述[35]記載之修飾抗體之製造方法，其中，於上述抗體修飾步驟中，以包含未被上述抗體修飾連接子修飾之未修飾抗體、於上述抗體1分子經上述抗體修飾連接子1分子修飾而成之一價抗體、及於上述抗體1分子經上述抗體修飾連接子2分子修飾而成之二價抗體的混合物之形式，取得上述修飾抗體，且 於上述抗體純化步驟中，包括如下步驟：利用上述未修飾抗體、上述一價抗體及上述二價抗體對於上述免疫球蛋白結合性蛋白質之各不相同之相互作用，分別取得包含相對較多之未修飾抗體及一價抗體之第一抗體組成物及包含相對較多之二價抗體之第二抗體組成物。 [37]一種複合體之製造方法，其包括：修飾抗體製造步驟，其實行上述[32]至[36]中任一項記載之修飾抗體之製造方法而獲得修飾抗體；及複合化步驟，其將上述修飾抗體與螯合有放射性核種之螯合劑複合化，而生成上述螯合劑與上述修飾抗體之複合體。 [38]如上述[37]記載之複合體之製造方法，其中，於上述修飾抗體製造步驟中取得第一抗體組成物，該第一抗體組成物中，未被上述抗體修飾連接子修飾之未修飾抗體及上述於抗體1分子經上述抗體修飾連接子1分子修飾而成之一價抗體之合計比例多於上述於抗體1分子經上述抗體修飾連接子2分子修飾而成之二價抗體，且 於上述複合化步驟中，形成上述螯合劑、與上述一價抗體之複合體。 [39]如上述[37]記載之複合體之製造方法，其中，於上述修飾抗體製造步驟中取得第二抗體組成物，該第二抗體組成物中，上述於抗體1分子經上述抗體修飾連接子2分子修飾而成之二價抗體之比例多於未被上述抗體修飾連接子修飾之未修飾抗體及上述於抗體1分子經上述抗體修飾連接子1分子修飾而成之一價抗體之合計，且 於上述複合化步驟中，形成上述螯合劑、與上述二價抗體之複合體。 [40]如上述[37]至[39]中任一項記載之複合體之製造方法，其中，上述螯合劑係與螯合連接子連接，於上述複合化步驟中實行點擊反應，藉此將上述螯合連接子與上述抗體修飾連接子連接。 [41]一種套組，其係用以製造螯合有放射性核種之螯合劑、與抗體之複合體的套組，該套組包含(1)可螯合放射性核種之螯合劑及(2)抗MUC5AC抗體，上述複合體為上述[1]至[12]及[18]至[27]中任一項記載之複合體。 [42]如[41]記載之套組，其進而包含(1)能夠進行點擊反應之第一原子團及(2)能夠進行點擊反應之第二原子團。 [43]如[41]記載之套組，其進而包含可螯合於螯合劑之放射性核種。
根據上述[14]之放射性醫藥，由於含有具備與MUC5AC特異性結合之人類化抗體、及發射α射線之金屬核種之複合體作為有效成分，故藉由用於癌之RI內照射療法，將特異性地累積於表現MUC5AC之腫瘤，可不對正常細胞產生影響而對腫瘤細胞特異性地照射α射線，可獲得更高之安全性及治療效果。 根據上述[28]之放射性醫藥，由於含有具備與MUC5AC特異性結合之人類化抗體、及發射正電子之金屬核種之複合體作為有效成分，故適合於PET檢查，又，由於顯示與上述[14]之RI內照射療法所使用之放射性醫藥相同之累積性，故可有效率地用作用於表現MUC5AC之癌之RI內照射療法之診斷用放射性醫藥。 根據上述[29]之複合體之製造方法，由於包括將螯合有放射性核種之螯合劑、與抗MUC5AC抗體複合化之複合化步驟，故在對於抗體來說更苛刻之條件的螯合步驟中不需附加抗MUC5AC抗體，可防止抗體之改質，有效率地獲得該複合體。 根據上述[30]之複合體之製造方法，由於在複合化步驟中包括點擊反應，故可在緩衝溶液中且常溫之極為溫和的條件下進行複合化，可使抗MUC5AC抗體不致改質而有效率地獲得該複合體。 根據上述[31]之修飾抗體，由於抗MUC5AC抗體之Fc區經抗體修飾連接子特異性地修飾，故不致損及抗MUC5AC抗體之抗原結合能力，將該修飾抗體用於對於螯合有放射性核種之螯合劑所具有之螯合連接子之點擊反應。 根據上述[32]之修飾抗體之製造方法，由於具備：利用具備抗體修飾肽之連接子部位特異性地修飾抗MUC5AC抗體之Fc區而獲得修飾抗體的抗體修飾步驟；及使用固定有免疫球蛋白結合性蛋白質之載體對上述抗體進行純化的抗體純化步驟；故可更為提高該修飾抗體之純度。 根據上述[38]或[39]之複合體之製造方法，由於使用一價抗體或二價抗體之任一者之比例多於另一者之比例的抗體組成物進行複合化步驟，故可視目的調節與抗MUC5AC抗體鍵結之螯合劑之數量，可獲得更高純度之所需價數之複合體。 根據上述[41]之套組，在必要之時間點使可螯合放射性核種之螯合劑與抗體之複合體與放射性核種進行反應，可在使用時製備[1]至[12]及[18]至[27]中任一項記載之複合體，而可無損放射性核種之半衰期及抗體活性之兩者，實現有效率之治療或診斷。 根據上述[42]之套組，由於分別具備包含可螯合放射性核種之螯合劑與點擊反應原子團之複合體、及包含抗體與點擊反應原子團之複合體，故於必要之時間點使放射性核種螯合於螯合劑，使該等進行點擊反應，可在使用時製備[1]至[12]及[18]至[27]中任一項記載之複合體，而可無損放射性核種之半衰期及抗體活性之兩者，實現有效率之治療或診斷。
以下，藉由實施例等詳細地說明本發明，但本發明並不限定於該等。 [實施例]
製造例1：抗MUC5AC人類化抗體之製作 於考慮成為適合在CHO細胞中表現之密碼子用途之前提下，將附加有訊息序列之各種可變區之胺基酸序列、及各種恆定區之胺基酸序列轉換為鹼基序列。於訊息序列之起始密碼子部位附加Kozak序列，於恆定區之C末端側附加終止密碼子。進而於Kozak序列之上游與終止密碼子之下游附加限制酶部位，使之可導入至哺乳類細胞表現用質體(pcDNA3.4)之表現用基因導入部位。如此設計出之各DNA片段係藉由化學合成而製作。使用融合PCR，將包含如成為目標H鏈與目標L鏈之可變區之DNA片段、與包含恆定區之DNA片段連結。
對所製作之各種抗體基因進行制限處理後進行純化。同樣地，利用相同之限制酶亦對哺乳類細胞短暫性表現用質體(pcDNA3.4)進行處理後進行純化。將兩片段以適當之混合比加以混合並進行接合。將接合反應液與大腸桿菌DH5α勝任細胞進行混合來進行轉形。對於所產生之轉形體，進行群落PCR、單群落隔離、自小規模培養液之質體提取、插入部分之鹼基序列測定，選出在所設計之抗體基因全長如設計所示之序列並準確地插入在所意圖之方向上的質體(大腸桿菌純系)。針對所選出之大腸桿菌純系實施大規模培養，進行包括內毒素去除步驟之質體提取、純化。對於純化後之質體，測定260 nm之吸光度，算出濃度。
使用ExpiCHO 系統(Thermo Fisher Scientific公司)，實施利用CHO細胞之短暫性表現。自所製作之各H鏈表現用質體與各L鏈表現用質體中選擇H鏈1種、L鏈1種以成為目標組合，利用脂轉染法進行轉染，並進行培養、進料。在轉染7天〜13天後，回收培養液。將經離心分離及過濾器過濾之培養上清液添加至蛋白A管柱中，藉由通常之親和管柱層析法(吸附後洗淨、利用酸性緩衝液之溶出、溶出液之中和)對抗體進行純化。對於純化後之抗體，測定280 nm之吸光度，算出濃度。
使用上述方法製作下述抗MUC5AC人類化抗體。以下表示附於重鏈可變區與輕鏈可變區之組合的抗體編號。 抗體1：H01L03 抗體2：H01L04 抗體3：H02L04 抗體4：H04L04 此處，H01、H02及H04分別為序列編號1、序列編號2及序列編號4所示之重鏈可變區，L03及L04分別為序列編號7及序列編號8所示之輕鏈可變區。以下實施例中所使用之抗體包含重鏈恆定區1(序列編號25)與輕鏈恆定區1(序列編號26)、及上述抗體1至抗體4之重鏈可變區與輕鏈可變區之組合。
製造例2：利用肽連接子之部位特異性抗體修飾 (1)抗體修飾步驟 利用國際公開2017/217347號說明書所記載之方法製造抗體修飾肽，獲得下述式(P3)所表示之包含17個胺基酸殘基之肽。該肽之胺基酸序列中，序列編號10之Xaa2與屬於離胺酸殘基之序列一致，離胺酸殘基之側鏈末端胺基經R1 所示之構造修飾。又，2個半胱胺酸殘基相互進行雙硫鍵結，肽之N末端經由具有二甘醇酸及8個PEG之連接子構造，鍵結有乙基疊氮化物作為屬於第2原子團之包含疊氮基之原子團。
[化18]
Figure 02_image054
(式(P3)中，Gly表示甘胺酸，Pro表示脯胺酸，Asp表示天冬胺酸，Cys表示半胱胺酸，Ala表示丙胺酸，Tyr表示酪胺酸，His表示組胺酸，Glu表示麩胺酸，Leu表示白胺酸，Val表示纈胺酸，Trp表示色胺酸，Phe表示苯丙胺酸)
將該肽與製造例1中所製作之抗MUC5AC人類化抗體(抗體1)混合至乙酸鈉緩衝液(pH6.0)中而獲得混合液，使該混合液於室溫下反應30分鐘，獲得包含肽修飾抗體之溶液。該肽修飾抗體係抗體之Fc區經上述肽部位特異性修飾而成者。
(2)肽修飾抗體分離步驟 利用1 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.0)稀釋該肽修飾抗體，添加至蛋白A管柱(GE Healthcare公司製造，HiTrap MabSelect SuRe)中，使含有0.15 mol/L氯化鈉之0.05 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH5.7)流動，回收經肽2分子修飾而成之肽修飾抗體(以下亦稱為「二價抗體」)，以所回收之組分中所包含之二價抗體之濃度成為15 mg/mL之方式調整濃度。其後，使含有0.15 mol/L氯化鈉之0.05 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH3.5)流至蛋白A管柱，回收經肽1分子修飾而成之肽修飾抗體(以下亦稱為「一價抗體」)，並以所回收之組分中所包含之一價抗體之濃度成為15 mg/mL之方式調整濃度。
實施例1：225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體(225 Ac標定一價抗體)之製作1 (1)螯合劑合成步驟 將本實施例所使用之螯合部(Iris Biotech GmbH公司製造)之構造示於以下之式(L1-3)。使螯合部溶解於作為溶劑之0.1 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.0)中，製成包含螯合部1.7 mmol/L之溶液。將該溶液0.005 mL、與含作為放射性金屬源之225 Ac離子之溶液(0.2 mol/L鹽酸水溶液、放射能濃度300 MBq/mL、自Oak Ridge National Laboratory製製備、液量：0.005 mL)1.5 MBq(根據檢測日時放射能量進行衰減計算所得之計算值)進行混合而獲得反應液，使該反應液於加熱條件下進行反應，獲得225 Ac錯合物溶液。螯合部與放射性金屬離子之莫耳比率係螯合部：225 Ac離子＝約2000：1，且反應液之加熱溫度設為70℃，加熱時間設為90分鐘。
[化19]
Figure 02_image056
利用以下之方法測定所獲得之225 Ac錯合物之放射化學純度。即，利用薄層層析法(Agilent公司製造，型號：SGI0001、展開溶劑：乙腈/水混合液(體積比1：1))使225 Ac錯合物溶液之一部分展開，其後，利用放射性γ-薄層層析法(TLC，thin layer chromatography)分析儀(raytest製造，MODEL GITA Star)進行測定。將原點附近所檢測到之波峰之放射能(計數值)相對於檢測到之總放射能(計數值)的百分率作為225 Ac錯合物之放射化學純度(%)。其結果為，225 Ac錯合物之放射化學純度為86%。所獲得之225 Ac錯合物溶液直接用於接下來之標定步驟。
(2)標定步驟 將製造例2中所獲得之一價抗體之溶出液、及上述(1)之步驟中所獲得之225 Ac錯合物之溶液分別添加至含有0.02 mol/L(20 mM)抗壞血酸之0.09 mol/L乙酸鈉緩衝液中，於37℃下進行120分鐘點擊反應，獲得225 Ac標定一價抗體。225 Ac錯合物量及肽修飾抗體量分別為44 μmol及46 μmol，第1原子團(DBCO)與第2原子團(疊氮化物)之莫耳比分別為約1：1。 進而，使用超過濾器(Merck公司製造，型號：UFC505096)，對於37℃下反應2小時所獲得之225 Ac標定一價抗體之溶液進行純化，供於以後之實驗。純化後之225 Ac標定一價抗體(根據檢測日時放射能量進行衰減計算所得之放射能量0.303 MBq)之放射化學純度為93%，放射化學產率為39%。此處，放射化學純度係相當於22 5 Ac標定一價抗體之波峰之放射能計數值相對於利用薄層層析法進行分析之情形時薄層板之總放射能計數值的比例(%)，放射化學產率係根據225 Ac標定一價抗體之放射能計數值所計算出的放射能量相對於根據標定步驟開始時之放射能計數值所計算出的放射能量之比例(%)，該等放射能計數值係利用γ射線光譜儀(Ge半導體檢測器：GMX10P4-70(ORTEC公司製造)、多通道分析儀：M7-000(SEIKO EG&G公司製造)、資料處理：Spectrum Navigator：DS-P300(SEIKO EG&G公司製造)及Gamma Studio：DS-P600(SEIKO EG&G公司製造))所測得。
實施例2：225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體(225 Ac標定一價抗體)之製作2 (1)螯合劑合成步驟 將本實施例所使用之螯合部之構造示於以下之式(L1-4)。式(L1-4)所示之DOTA-Bn-DBCO係依據Wang H, Wang R, CaiK, He H, Liu Y, Yen J et al. Selective in vivo metabolic cell-labeling-mediated cancer targeting. Nat Chem Biol. Apr; 13 (4): 415-424. (2017)所記載之方法進行製造。使該螯合部溶解於作為溶劑之0.1 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.0)中，製成包含螯合部1.7 mmol/L之溶液。將該溶液0.0025 mL、與作為放射性金屬源之含有225 Ac離子之溶液(0.2 mol/L鹽酸水溶液、放射能濃度432 MBq/mL、Oak Ridge National Laboratory製造、液量：0.0025 mL)1.08 MBq(根據檢測日時放射能量進行衰減計算所得之計算值)及0.1mol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.0)0.0375mL進行混合而獲得反應液，使該反應液於加熱條件下進行反應，獲得225 Ac錯合物溶液。螯合部與放射性金屬離子之莫耳比率係螯合部：225 Ac離子＝約2000：1，反應液之加熱溫度設為70℃，加熱時間為90分鐘。
[化20]
Figure 02_image058
利用以下之方法測定所獲得之225 Ac錯合物之放射化學純度。即，利用薄層層析法(Agilent公司製造，型號：SGI0001、展開溶劑：乙腈/水混合液(體積比1：1))使225 Ac錯合物溶液之一部分展開，其後，利用放射性γ-TLC分析儀(raytest製造，MODEL GITA Star)進行測定。將原線附近所檢測到之波峰之放射能(計數值)相對於檢測到之總放射能(計數值)之百分率設為225 Ac錯合物之放射化學純度(%)。其結果為，225 Ac錯合物之放射化學純度為98%。所獲得之225 Ac錯合物溶液直接用於接下來之標定步驟。
(2)標定步驟 使製造例2中所獲得之一價抗體之溶出液、及上述(1)之步驟中所獲得之225 Ac錯合物之溶液於37℃下進行120分鐘點擊反應，獲得225 Ac標定一價抗體。225 Ac錯合物量及肽修飾抗體量分別為44 μmol及46 μmol，第1原子團(DBCO)與第2原子團(疊氮化物)之莫耳比分別為約1：1。 進而，於在37℃下反應120分鐘所獲得之225 Ac標定一價抗體之溶液中添加含有20 mmol/L抗壞血酸之90 mmol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.0)，使用超過濾器(Merck公司製造，型號：UFC505096)進行純化，供於以後之實驗。純化後之225 Ac標定一價抗體(根據檢測日時放射能量進行衰減計算所得之放射能量：0.231 MBq)之放射化學純度為86%，放射化學產率為21%。此處，放射化學純度係相當於225 Ac標定一價抗體之波峰之放射能計數值相對於利用薄層層析法進行分析之情形時之薄層板之總放射能計數值的比例(%)，放射化學產率係根據225 Ac標定抗體之放射能計數值所計算出的放射能量相對於根據標定步驟開始時之放射能計數值所計算出的放射能量之比例(%)，該等放射能計數值係利用γ射線光譜儀(Ge半導體檢測器：GMX10P4-70(ORTEC公司製造)、多通道分析器：M7-000(SEIKO EG&G公司製造)、資料處理：Spectrum Navigator：DS-P300(SEIKO EG&G公司製造)及Gamma Studio：DS-P600(SEIKO EG&G公司製造))所測得。
實施例3：225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體(225 Ac標定二價抗體)之製作 實施例2中，使用製造例2中所獲得之二價抗體之溶出液代替一價抗體之溶出液，除此以外，以相同之方式獲得225 Ac標定二價抗體。所獲得之2 25 Ac標定二價抗體(根據檢測日時放射能量進行衰減計算所得之放射能量：0.168 MBq)之放射化學純度為99%，放射化學產率為20%。
實施例4：使用In-111(111 In)標定抗體之人類化抗體之篩選 實施例4-1：111 In標定抗體之製備 為了找出腫瘤累積能力較高且最大耐用量較高之抗MUC5AC抗體，對各種抗體進行111 In標定，投予至患癌小鼠並進行SPECT-CT拍攝，根據所獲得之圖像算出腫瘤及肝臟之累積放射能量及吸收劑量並進行比較。 抗體係使用製造例1中所製作之抗MUC5AC人類化抗體4種與專利文獻1中所揭示之抗MUC5AC嵌合抗體1種，並經111 In標定。 專利文獻1中所揭示之嵌合抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列(分別為序列編號23及24)如以下所示。111 In標定係對於具有下述式所示之構造之標定前驅物與各種抗體之複合體來進行。
[化21] [重鏈可變區]
Figure 02_image060
[輕鏈可變區]
Figure 02_image062
[化22]
Figure 02_image064
上述標定前驅物具有如下構造：作為螯合部之DOTA經由8個聚乙二醇而連結於抗體修飾肽(具有與序列編號10之Xaa2為離胺酸殘基之序列一致之序列的包含17個胺基酸殘基之肽)之N末端，且經由該構造中之N-羥基丁二醯亞胺酯基，與各種抗體中之EU編號中第252號之離胺酸殘基連結。 使該標定前驅物450 μg溶解於作為溶劑之100 mmol/L之4-(2-羥乙基)-1-哌
Figure 02_image027
乙磺酸緩衝液(pH5.5)中。將該溶液、與放射能量10 MBq之作為放射性金屬源之含有111 In離子之溶液(氯化銦(111 In)注射液、Nihon Medi-Physics公司製造)進行混合，於45℃下進行120分鐘標定反應。
將各種111 In標定抗體之放射化學產率、放射化學純度、投予至動物之放射能量示於表1。此處所謂放射化學產率係指111 In標定抗體之放射能量相對於所使用之111 In之放射能量。放射能測定係使用放射性同位素劑量檢定器(CAPINTEC公司製造，型號：CRC-15R)。放射化學純度係指相當於111 In標定抗體之波峰之放射能計數值相對於利用濾紙層析法進行分析之情形時的濾紙之總放射能計數值之比例(%)。濾紙層析法係利用濾紙(ADVANTEC公司製造、型號：No.590、展開溶劑：0.01%EDTA、50 mM檸檬酸-檸檬酸鈉水溶液)進行展開，放射能計數值之檢測係使用放射性γ-TLC分析儀(raytest製造，MODEL GITA Star)。
[表1]111 In標定資訊
抗體名 嵌合抗體 人類化抗體
H01L03 H01L04 H02L04 H04L04
放射化學產率(%) 99.0 96.3 93.6 91.0 94.0
放射化學純度(%) 100
投予放射能量(MBq) 5.3±1.0 5.5±0.1 4.7±0.2 46±0.2 4.6±1.3
(平均±標準偏差、n＝4)
實施例4-2：使用患癌小鼠之體內分佈
(患癌小鼠之製作方法) 將0.7×107 個之人類胰腺癌細胞株SW1990皮下投予至Balb/c裸小鼠(雄性)之側腹至背部。 在將SW1990移植14天後，腫瘤之大小成為約150-300 mm3 之時間點，自小鼠尾靜脈投予實施例4-1中所製備之各種111 In標定抗體。又，腫瘤之體積藉由以下之計算式算出。 腫瘤之體積＝(腫瘤之短徑2 ×腫瘤之長徑)/2
[表2]
動物資訊(投予各111 In標定抗體時)
抗體名 嵌合抗體 人類化抗體
H01L03 H01L04 H02L04 H04L04
腫瘤體積(mm3 ) 203±110 201±45 285±24 209±83 193±80
體重(g) 23.2±1.3 23.4±0.6 23.5±0.7 22.1±1.7 21.2±1.8
(平均±標準偏差、n＝4)
(評價方法) SPECT-CT成像(小動物用SPECT-CT裝置：FX-3000，Trifoil公司製造)係於下表之條件下實施。拍攝之時間點係投予後1、6、24、48、72、168小時後。關於圖像再構成，利用OSEM(Ord-ered Subsets Expectation Maximization，有序子集期望最大化)法來實施SPECT，利用FBP(Filter Back-Projection，濾波背向投影)法來實施CT。實施各時間點之腫瘤及肝臟之VOI(volume of interest，三維ROI)分析。將器官每單位體積之計數值修正為%ID/g，將物理半衰期自111 In換算為225 Ac，對物理學半衰期之差進行修正，進而加上生物學半衰期而獲得時間-放射性曲線。根據該時間-放射性曲線之積分值算出累積放射能量，利用球體模型(OLINDA/EXM ver2.0)算出吸收劑量，將其於各抗體中進行比較研究。但是，關於H01L03，於投予後168小時之時未發現時間-放射性曲線之減少，因此不考慮生物學半衰期，僅加上物理半衰期。
[表3] SPECT拍攝條件
同位素 銦-111介質 ＋高能
準直儀 MMP952
旋轉半徑 50 mm
投影範圍 150 sec
投影數 16
旋轉角 90度
[表4] CT拍攝條件
投影數 207 views
平均幀數 1幀
檢測器圖像讀出模式 2×2
X射線管電流 270 uA
X射線管電壓 60 kV
曝光時間 230 ms
放大倍數 2.0
(結果) 將實施SPECT-CT拍攝所得之結果示於圖1。將實施各時間點之腫瘤及肝臟之VOI分析所得之結果示於圖2。將表示對投予後168小時後之SPECT-CT拍攝結束後之體內分佈、排泄路徑進行確認所得之結果的圖表示於圖3。 關於在腫瘤中之累積，使用人類化抗體(H01L03)之情形為最高，另一方面，使用嵌合抗體之情形為最低。關於在肝臟中之累積，使用嵌合抗體之情形為最高，使用人類化抗體之情形均低於嵌合抗體。使用人類化抗體(H01L03)之情形時之排泄為最慢，血液滯留性為最高。所有抗體在使用時，均於正常器官中在肝臟及脾臟中之累積較高，次高的是在肺及腎臟中之累積。
關於將肝臟之臨界劑量設定為30 Gy之情形時之最大耐用量，於使用人類化抗體(H01L03)之情形時，上述最大耐用量之值為較高之3.90 MBq，另一方面，於使用嵌合抗體之情形時，上述最大耐用量之值為較低之0.43 MBq。最大耐用量(MBq)係利用臨界劑量(Gy)/吸收劑量(Gy/MBq)算出。
實施例4-3：體外自動放射線攝影術 使用實施例4-1中所製備之各種111 In標定抗體，藉由體外自動放射線攝影術(ARG)針對各種抗體對於MUC5AC之結合性及特異性進行評價，將評價所得之圖像結果示於圖4。又，將目標區域(ROI)設定為切片整體，將所算出之ROI中之放射能密度(Bq/mm2 )之數值之圖表示於圖5。 將MUC5AC高表現腫瘤(SW1990移植腫瘤組織)或MUC5AC低表現腫瘤(MIAPaCa2移植腫瘤組織)於液態氮中進行冷凍而獲得冷凍塊，使用低溫恆溫器(Leica公司製造)製作厚度10 μm之切片，用於體外ARG。 使在-80℃下保存至使用時為止之切片恢復至室溫，乾燥30分鐘以上後，於磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬30分鐘，繼而，於含1體積%牛血清白蛋白之磷酸緩衝生理食鹽水中浸漬30分鐘，藉此進行切片之親水化。 將經親水化之冷凍切片於含有各種111 In標定抗體5 kBq/mL之含1體積%牛血清白蛋白之磷酸緩衝生理食鹽水中分別浸漬30分鐘。繼而，以含1體積%牛血清白蛋白之磷酸緩衝生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水之順序於各溶液中各浸漬5分鐘而將切片洗淨。對洗淨後之切片進行風乾，利用成像平板(BAS-SR2040、Fuji Film公司製造)曝光約15小時，使用氟影像分析儀(Typhoon FLA 7000IP，GE Healthcare公司製造)獲得自動放射圖。針對所獲得之自動放射圖，使用氟影像分析儀所附帶之分析軟體「Image Quant TL」，將目標區域(ROI)設定為切片整體，算出ROI中之放射能密度(Bq/mm2 )。 確認到經111 In標定之所有人類化抗體均保持對於MUC5AC之結合性及特異性(圖5，參照MUC5AC高表現腫瘤之資料)。確認到與嵌合抗體相比，各種人類化抗體之非特異性結合較少(圖5，參照MUC5AC低、未表現腫瘤之資料)。 根據實施例4-2、4-3之結果闡明，相較於嵌合抗體，人類化抗體對於MUC5AC之特異性較高，又，具有於腫瘤中之較高累積性及於肝臟等正常器官中之較低累積性，因此可提供有關RI標定抗體之更優異之遞送技術。
將本實施例之結果彙總於下表。表中，關於SPECT之吸收劑量，腫瘤體積係假定為150 mm3 而算出。又，關於肝臟之吸收劑量，係基於本實施例中所使用之小鼠肝臟重量之平均值(1.15±0.14 g、n＝19)而算出。體內分佈之數值以n＝4之平均±標準偏差來表示(其中，H02L04係n＝3)。
[表5]
   抗體名
嵌合抗體 人類化抗體
H01L03 H01L04 H02L04 H04L04
SPECT吸收 劑量 腫瘤 (Gy/MBq) 9.5 35.0 15.3 13.7 15.0
肝臟 (Gy/MBq) 70.1 7.7 33.4 27.0 35.4
投予後168小時 後之體內分佈 腫瘤 (%ID/g) 11.6±0.9 24.2±3.9 12.9±2.6 15.6±6.2 17.2±4.2
肝臟 (%ID/g) 7.9±1.9 3.6±1.7 3.1±0.9 2.7±0.7 3.9±1.4
脾臟 (%ID/g) 5.0±1.8 5.4±0.8 3.8±1.2 4.0±3.0 3.4±0.3
腎臟 (%ID/g) 1.8±0.3 2.5±0.4 1.1±0.3 1.4±1.0 1.6±0.2
血液 (%ID/g) 2.2±0.6 5.3±1.3 2.1±0.8 2.6±2.3 3.8±0.7
實施例5：使用患癌小鼠之225 Ac標定一價抗體之評價 使用依據實施例1所製造之225 Ac標定一價抗體(H01L03)。患癌小鼠根據225 Ac標定一價抗體之投予放射能量分為3個群，設為2.5 kBq投予群、5 kBq投予群、10 kBq投予群，並與投予有製造例1中所製造之人類化抗體(H01L03)之群(抗體對照群)進行比較。 各群設為6匹，在投予後之4週內實施一般狀態之觀察、體重及腫瘤體積之測定。評價所使用之患癌小鼠係以與實施例4-2相同之順序製作，於將SW1990移植10天後，腫瘤之大小成為約200 mm3 之時間點供於實驗。將各群之動物資訊彙總於以下。
[表6]
動物資訊(投予各225 Ac標定一價抗體時)
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體群
投予放射能量(kBq) - 2.5 5 10
腫瘤體積(mm3 ) 194±61 197±51 184±53 192±72
體重(g) 20.8±1.1 20.1±0.7 20.4±0.7 21.4±2.1
平均±標準偏差、n＝6
將腫瘤體積之經時性變化示於圖6中，將以投予前之腫瘤體積設為1.0之情形時之觀察期間最終日之腫瘤體積之相對比示於下述表。225 Ac標定一價抗體顯示用量依存性之腫瘤生長抑制效果，於全部之用量下統計學上顯著地抑制了腫瘤生長。
[表7]
觀察期間最終日之腫瘤體積與投予前之腫瘤體積之相對比
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體群
投予放射能量(kBq) - 2.5 5 10
相對比(ratio) 10.9 5.6 3.5 2.5
於觀察期間最終日實施病理解剖，實施腫瘤之採集、重量測定。將比較腫瘤重量所得之結果示於下述表中。若為225 Ac標定一價抗體，則用量依存性地腫瘤重量較低，發現於投予225 Ac標定一價抗體之所有群中，腫瘤重量在統計學上顯著地低於抗體對照群。
[表8]
腫瘤重量之比較
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體群
投予放射能量(kBq) - 2.5 5 10
腫瘤重量(g) 2.13±0.65 1.07±0.39* 0.71±0.23* 0.57±0.21*
平均±標準偏差、n＝6 顯著水準：*P＜0.005 vs 抗體對照群
將體重之經時性變化之相對值示於圖7。所有群中均未發現較投予前10%以上之體重減少。因此，表示不會因225 Ac標定一價抗體投予而產生對全身狀態之影響或其可能性足夠低。
於觀察期間最終日實施病理解剖，實施肝臟、腎臟及脾臟之採集、重量測定。將比較各器官重量所得之結果示於下述表中。於投予有225 Ac標定一價抗體2.5 kBq之群中，確認到肝臟之重量在統計學上顯著地低於抗體對照群，但未發現用量依存性，因此認為是偶發之結果。於腎臟及脾臟、其他用量下之肝臟中，未發現統計學上與抗體對照群之顯著差異，因此表示對肝臟、腎臟及脾臟無影響或其可能性足夠低。
[表9]
正常器官重量之比較
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體群
投予放射能量(kBq) - 2.5 5 10
肝臟重量(g) 1.00±0.05 0.86±0.05* 0.95±0.03 0.90±0.16
腎臟重量(g) 0.31±0.03 0.26±0.03 0.30±0.02 0.30±0.05
脾臟重量(g) 0.07±0.01 0.06±0.01 0.07±0.01 0.05±0.02
平均±標準偏差、n＝6顯著水準：*P＜0.05 vs 抗體對照群
使用在觀察期間結束時所採集之血液樣本，附帶地實施如下評價，即腎毒性(使用肌酸酐檢測套組(Cayman Chemical Company公司製造)測定血漿中肌酸酐)、肝毒性(使用ALT活性套組(Bio Vision公司製造)測定血漿中丙胺酸胺基轉移酶(ALT))及血液毒性(使用自動血球計測裝置(型號：thinka CB-1010，ARKRAY公司製造)測定白血球數及血小板數)之評價。對於各測定值，使用StatPreClinica(Takumi Information Technology公司製造)來確認測定值之等分散性，於存在等分散性之情形時，藉由參數檢驗之Dunnett法來進行分析，於不存在等分散性之情形時，藉由非參數檢驗之Steel法來進行分析。
將有關肝毒性及腎毒性之結果示於圖8。於225 Ac標定一價抗體之全部投予群中，相對於抗體對照群，於顯著水準5%下未發現統計學上顯著差異。將有關血液毒性之結果示於圖9。於採血之各時間點之225 Ac標定一價抗體之各用量群中，相對於抗體對照群，於顯著水準5%下未發現統計學上顯著差異。
藉由本實施例，確認到225 Ac標定一價抗體之腫瘤生長抑制效果。抑制效果依存於用量，於所有用量(2.5、5、10 kBq)時於顯著水準5%下顯示出統計學上顯著之抑制效果。又，與225 Ac標定一價抗體之投予前相比，並未發現10%以上之體重減少，此外，教示了225 Ac標定一價抗體之肝毒性及腎毒性、血液毒性之可能性較低。根據該等結果闡明，225 Ac標定一價抗體具有非常高之抗腫瘤效果並且安全性較高，為非常地有用之癌治療藥。
實施例6：使用患癌小鼠之225 Ac標定一價抗體之高用量評價 將投予放射能量設為25 kBq/匹(實施例5之最低用量之10倍)，除此以外，以與實施例5相同之方式評價225 Ac標定一價抗體(225 Ac標定一價抗體投予群)。又，設置投予僅使製造例1中所製造之抗體(H01L03)溶解於含有20 mM抗壞血酸之0.1 M乙酸緩衝液中而獲得溶液之群(抗體對照群)。本實施例中所使用之抗體係以與實施例5相同之方式製作。評價所使用之患癌小鼠係以與實施例4-2相同之方式製作。各群設為5匹，於投予後4週內實施一般狀態之觀察、體重及腫瘤體積之測定。將各群之動物資訊彙總於以下。
[表10]
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 25
腫瘤體積(mm3 ) 215±54 249±67
體重(g) 20.2±1.2 20.8±1.3
平均±標準偏差、n＝5
將確認腫瘤體積之經時性變化所得之結果示於圖10。於225 Ac標定一價抗體投予群中，統計學上顯著地抑制腫瘤生長，確認到因投予高用量之225 Ac標定一價抗體而產生之腫瘤生長抑制效果。
於觀察期間最終日實施病理解剖，實施腫瘤之採集、重量測定。將比較腫瘤重量所得之結果示於下述表中。於225 Ac標定一價抗體投予群中，發現腫瘤重量於統計學上顯著地低於抗體對照群。
[表11]
腫瘤重量之比較
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 25
腫瘤重量(g) 2.48±0.45 0.56±0.20*
平均±標準偏差、n＝5 顯著水準：*P＜0.05 vs 抗體對照群
將確認體重之經時性變化所得之結果示於圖11。於225 Ac標定一價抗體投予群中，於投予早期發現體重減少，但作為相對比未低於0.9。
於觀察期間最終日實施病理解剖，實施肝臟、腎臟及脾臟之採集、重量測定。將比較腫瘤重量所得之結果示於下述表中。於225 Ac標定一價抗體投予群中，發現僅脾臟之重量於統計學上顯著地低於抗體對照群。
[表12]
正常器官重量之比較
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 25
肝臟(g) 0.99±0.12 1.08±0.03
腎臟(g) 0.31±0.03 0.31±0.02
脾臟(g) 0.07±0.03 0.04±0.01*
平均±標準偏差、n＝5 顯著水準：*P＜0.05 vs 抗體對照群
將有關肝毒性及腎毒性之結果示於圖12。由於相對於抗體對照群，未發現統計學上顯著差異，故教示了於本用量下不致誘發肝損傷及腎損傷。將有關血液毒性之結果示於圖13。由於相對於抗體對照群，未發現統計學上顯著差異，故教示了於本用量下不致誘發血液毒性。
根據該等結果亦提示出，225 Ac標定一價抗體具有非常高之抗腫瘤效果並且安全性較高，為非常有用之癌治療藥。
作為根據小鼠投予量來換算人類投予量之方法，有如使用下述計算式之方法。 Animal dose in mg/kg×(animal weight in kg/human weight in kg)×0.33 於依據本式之情形時，本實施例中對於小鼠投予25 kBq/20 g相當於投予89.0 kBq/kg(人類)。
實施例7：使用患癌小鼠之225 Ac標定一價抗體及225 Ac標定二價抗體之評價 使用患癌小鼠，對225 Ac標定一價抗體及225 Ac標定二價抗體各自之抗體性能進行評價。將依據實施例2所製造之225 Ac標定一價抗體以投予放射能量5 kBq/匹或10 kBq/匹投予至以與實施例4-2相同之方式所製作的患癌小鼠(225 Ac標定一價抗體投予群)。又，將依據實施例3所製造之225 Ac標定二價抗體以投予放射能量5 kBq/匹或10 kBq/匹投予至以與實施例4-2相同之方式所製作的患癌小鼠(225 Ac標定二價抗體投予群)。又，與實施例5、6同樣地設置抗體對照群。各群設為6匹，在投予後4週內實施一般狀態之觀察、體重及腫瘤體積之測定。將各群之動物資訊彙總於以下。
[表13]
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體投予群 225 Ac標定二價抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 5 10 5 10
腫瘤體積(mm3 ) 194±40 209±21 203±31 192±38 188±50
體重(g) 21.0±1.2 21.5±0.9 21.9±1.1 21.3±1.6 21.0±1.2
平均±標準偏差、n＝6
將確認腫瘤體積之經時性變化所得之結果示於圖14。將觀察期間最終日之腫瘤體積、及以投予前之腫瘤體積設為1.0之情形之相對比彙總於下述表中。 於225 Ac標定一價抗體投予群中，統計學上顯著地抑制腫瘤生長，確認到用量依存性之腫瘤生長抑制效果。於225 Ac標定二價抗體投予群中顯示了抑制腫瘤生長之傾向。
[表14]
觀察期間最終日之腫瘤體積與投予前之腫瘤體積之相對比
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體投予群 225 Ac標定二價抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 5 10 5 10
腫瘤體積(mm3 ) 2156±737 858±357* 654±310* 1267±194 1406±166
相對比(ratio) 11.1 4.11 3.22 6.59 7.48
平均±標準偏差、n＝6 顯著水準：*P＜0.05 vs 抗體對照群
於觀察期間最終日藉由於異氟醚麻醉下進行放血來實施安樂死，實施腫瘤之採取、重量測定。將比較腫瘤重量所得之結果示於下述表中。於225 Ac標定一價抗體投予群中，發現腫瘤重量於統計學上顯著地低於抗體對照群，確認到用量依存性之腫瘤生長抑制效果。於225 Ac標定二價抗體投予群中，雖發現腫瘤重量低於抗體對照群，但未發現統計學上之顯著差異。
[表15]
腫瘤重量之比較
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體投予群 225 Ac標定二價抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 5 10 5 10
腫瘤重量(g) 1.96±0.51 0.86±0.25* 0.66±0.23* 1.41±0.19 1.39±0.29
平均±標準偏差、n＝6 顯著水準：*P＜0.05 vs 抗體對照群
將確認體重之經時性變化所得之結果示於圖15。作為相對比之平均值不低於0.9。又，作為各個體之相對比不低於0.8。
於觀察期間最終日藉由於異氟醚麻醉下進行放血來實施安樂死，實施病理解剖。病理解剖之結果為未發現異常處。又，實施肝臟、腎臟及脾臟之採集、重量測定。將比較正常器官重量所得之結果示於下表中。於所有225 Ac標定抗體投予群中均未發現與抗體對照群相比、器官重量於統計學上顯著之減少。
[表16]
正常器官重量之比較
   抗體對照群 225 Ac標定一價抗體投予群 225 Ac標定二價抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 5 10 5 10
肝臟(g) 1.10±0.14 1.13±0.13 1.14±0.14 0.97±0.09 1.01±0.10
腎臟(g) 0.32±0.05 0.30±0.03 0.32±0.04 0.28±0.03 0.30±0.04
脾臟(g) 0.077±0.012 0.065±0.017 0.068±0.010 0.060±0.011 0.061±0.013
平均±標準偏差、n＝6
將有關225 Ac標定一價抗體及225 Ac標定二價抗體之肝毒性之結果示於圖16。將有關腎毒性之結果示於圖17。由於相對於抗體對照群，未發現統計學上顯著之值上升，故教示了於本用量下不致誘發肝損傷及腎損傷。關於血液毒性，將投予後1週與投予後4週之白血球數之結果示於圖18。又，將投予後1週與投予後4週之血小板數之結果示於圖19。關於白血球數，於投予後1週時，相對於抗體對照群，於1價抗體投予群(5 kBq及10 kBq)及2價抗體投予群(10kBq)中發現統計學上顯著之差異，但於投予後4週內恢復。關於在投予後4週內，相對於抗體對照群發現有統計學上顯著差異之2價抗體投予群(5kBq)，並無用量依存之情況。關於血小板數，除1個體外，所有時間點均未低於正常範圍之下限值的500×109 cells/L。由此教示了於本用量下不致誘發血液毒性。
實施例8：使用In-111(111 In)標定一價抗體及111 In標定二價抗體之體內動態之比較 實施例8-1：製備各111 In標定抗體 為了對一價抗體與二價抗體之體內動態進行比較，對一價抗體及二價抗體進行111 In標定並向患癌小鼠投予，於投予20、68、188小時後實施體內分佈實驗，進行一價抗體與二價抗體之體內動態之比較。 (1)製作導入有螯合劑之各抗體 抗體係以與製造例1及製造例2相同之方式製作，獲得人類化抗體H01L03之肽修飾抗體之一價抗體及二價抗體。 使包含螯合部(構造式：L1-4)34 nmol之0.1 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.0)、與分別包含一價抗體或二價抗體34 nmol之含0.1 mol/L精胺酸之0.1 mol/L組胺酸緩衝液(pH6.0)於37℃下反應120分鐘，獲得螯合劑導入抗體。 使之通入除鹽管柱(型號：PD-10，GE Healthcare公司製造)，回收包含螯合劑導入抗體之組分。進而使用超過濾器(Merck公司製造，型號：UFC505096)對所回收之組分進行純化。經純化之一價抗體之濃度為7.13 mg/mL，二價抗體之濃度為5.07 mg/mL。
(2)各抗體之111 In標定 使用放射能量91〜92 MBq之作為放射性金屬源之含有111 In離子之溶液(氯化銦(111 In)注射液，Nihon Medi-Physics公司製造)，添加各螯合劑導入抗體0.05 mL並充分混合。藉由pH試驗紙(Merck公司製造)確認到pH為4。使其於45度下反應120分鐘。 反應液係使用超過濾器(Merck公司製造，型號：UFC505096)進行純化，此外，利用含有20 mmol/L抗壞血酸之90 mmol/L乙酸鈉緩衝液進行溶劑置換。
關於各111 In標定抗體之放射化學產率，一價抗體為55%，二價抗體為59%。關於放射化學純度，一價抗體為97%，二價抗體為98%。將投予至動物之放射能量示於表17。此處放射化學產率係指111 In標定抗體之放射能量相對於所使用之111 In之放射能量。放射能測定係使用放射性同位素劑量檢定器(CAPINTEC公司製造，型號：CRC-15R)。放射化學純度係指相當於111 In標定抗體之波峰之放射能計數值相對於利用薄層層析法進行分析之情形時之薄層板之總放射能計數值的比例(%)。薄層層析法(薄層板：Agilent公司製造，型號：SGI0001)係利用展開溶劑：100 mmol/L EDTA溶液(pH5.0)/乙腈混液(體積比1：1)來展開，放射能計數值之檢測係使用放射性γ-TLC分析儀(raytest公司製造，MODEL GITA Star)。
[表17]
111 In標定資訊
   111 In標定一價抗體 111 In標定二價抗體
時間點(群) 投予20小時後 投予68小時後 投予188小時後 投予20小時後 投予68小時後 投予188小時後
放射化學產率 (%) 55 59
放射化學純度(%) 97 98
投予放射能量(MBq) 4.76±0.10 5.02±0.08 4.85±0.04 4.95±0.22 4.91±0.18 4.89±0.14
實施例8-2：使用患癌小鼠之體內分佈
將0.5×107 個人類胰腺癌細胞株SW1990皮下投予至Balb/c裸小鼠(雄性)之側腹至背部。於腫瘤體積成為約300 mm3 左右之時間點，自尾靜脈投予實施例8-1中所製備之經111 In標定之一價抗體與二價抗體。
(評價方法) 患癌小鼠係於投予各111 In標定抗體後於代謝籠內進行飼養，回收直至各時間點(投予20、68、188小時後)為止所排泄之糞及尿。於各時間點藉由於異氟醚麻醉下對患癌小鼠進行放血來實施安樂死。採集腫瘤、血液、正常器官(包括剩餘之全身)並測定重量。除經重量測定之器官以外，亦測定排泄糞及排泄尿之放射能量(γ射線井式閃爍測定裝置：JDC-1712，Hitachi Aloka Medical公司製造)。根據各器官(包括排泄糞及排泄尿)之放射能量(計數值)算出相對於投予量之放射能累積率(%ID)，而算出以每器官重量之放射能累積率計之放射能累積量(%ID/g)。
(結果) 將表示各器官之放射能累積量之經時變化之結果示於圖20。將表示排泄糞及排泄尿之放射能累積率、合計該等所得之放射能累積率之經時變化的結果示於圖21。 關於血液之放射能累積量，與二價抗體相比，一價抗體於所有時間點均顯示出較高值。據此確認到一價抗體之血液滯留性高於二價抗體。關於腫瘤之放射能累積量，與二價抗體相比，一價抗體於所有時間點均顯示出較高值。關於放射能向正常器官累積之傾向，若為一價抗體，則確認到依序於脾臟、肝臟、肺、腎臟中為較高。若為二價抗體，則依序於肝臟及脾臟中顯示顯著較高之值，確認到依序於睾丸、心臟、腎臟、大腿骨中為較高。確認到各正常器官之放射能累積經時性地減少。關於排泄量，與一價抗體相比，二價抗體於所有時間點均顯示出較高值，關於排泄速度，確認到二價抗體較快。若為一價抗體，則糞及尿排泄量為相同程度。另一方面，若為二價抗體，則尿排泄高於糞排泄，確認到主要以腎尿路系統排泄。
實施例9：使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO之225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體之製造 (1.螯合劑合成步驟) 將本實施例所使用之螯合部(DOTAGA-DBCO)之構造示於以下之式(L1-5)。式(L1-5)所示之DOTAGA-DBCO係依據Bernhard et al. DOTAGA-Anhydride: A Valuable Building Block for the Preparation of DOTA-Like Chelating Agents Chem. Eur. J. 2012, 18, 7834-7841所記載之方法所製造。使該螯合部分散於作為溶劑之0.1 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.0)中，製成包含螯合部1.7 mmol/L之分散液。將該分散液0.004 mL、作為放射性金屬源之含有225 Ac離子之溶液(0.2 mol/L鹽酸水溶液，放射能濃度1225 MBq/mL，由Oak Ridge NationalLaboratory製所製造，液量0.004 mL)4.9 MBq(根據檢驗日時放射能進行衰減計算所得之計算值)及0.1 mol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.0)0.06 mL進行混合而獲得反應液，使該反應液於加熱條件下進行反應，獲得225 Ac錯合物溶液。螯合部與放射性金屬離子之莫耳比率係螯合部：225 Ac離子＝約670：1，反應液之加熱溫度為70℃，加熱時間設為30分鐘。
[化23]
Figure 02_image067
以與實施例1相同之方式測定所獲得之225 Ac錯合物之放射化學純度，結果225 Ac錯合物之放射化學純度為85%。所獲得之225 Ac錯合物溶液直接用於標定步驟。
(2.標定步驟) 將經上述(1.螯合劑合成步驟)所獲得之225 Ac錯合物之溶液、與包含除在室溫下反應60分鐘以外以與製造例2相同之方式所製造之肽修飾抗體(一價抗體；H01L03)之溶液在未純化之狀態下分別進行混合，於37℃下進行2小時點擊反應而獲得225 Ac錯合物標定抗體。螯合部或包含225 Ac標定錯合物之螯合部及肽修飾抗體(一價抗體)之量分別為68 nmol及80 nmol，第1原子團(DBCO)與第2原子團(疊氮)之莫耳比分別為約1：1.2。 進而，使用超過濾器(Merck公司製造，型號：UFC505096)，對在37℃下反應2小時所獲得之225 Ac錯合物標定抗體之溶液進行純化。純化後之225 Ac標定一價抗體之放射化學純度為96%，放射化學產率為68%。225 Ac標定一價抗體之放射化學純度及放射化學產率之測定方法係以與實施例1相同之方式進行。
實施例10：使用89 Zr標定DOTAGA-DBCO之89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體之製造(HPLC純化) (1-1.螯合劑合成步驟) 本實施例中使用與上述式(L1-5)所示之螯合部相同之螯合部。使該螯合部分散於DMSO溶液中，製成包含螯合部2.0 mmol/L之分散液。將該分散液0.150 mL、作為放射性金屬源之含有89 Zr離子之溶液(0.1 mol/L鹽酸水溶液，放射能濃度1335 MBq/mL，由Nihon Medi-Physics股份有限公司製造所製造，液量0.100 mL)134 MBq及含有300mmol/L之2,5-二羥苯甲酸之780 mmol/L乙酸緩衝液0.050mL加以混合而獲得反應液，使該反應液於加熱條件下進行反應而獲得89 Zr錯合物溶液。螯合部與放射性金屬離子之莫耳比率係螯合部：89 Zr離子＝約3333：1，反應液之加熱溫度為70℃，加熱時間係設為60分鐘。
利用以下方法測定所獲得之89 Zr錯合物之放射化學純度。即，利用薄層層析法(Agilent公司製造，型號：SGI0001，展開溶劑：乙腈/水混合液(體積比1:1))使89 Zr錯合物溶液之一部分展開，其後，利用放射性γ-TLC分析儀(raytest製造，MODEL GITA Star PS)進行測定。將原點附近所檢測到之波峰之放射能(計數值)相對於所檢測到之總放射能(計數值)的百分率設為89 Zr錯合物之放射化學純度(%)。其結果為，89 Zr錯合物之放射化學純度為98%。
(1-2.89 Zr錯合物純化步驟) 使用高效液相層析法(HPLC)分取上述(1-1.螯合劑合成步驟)中所獲得之89 Zr錯合物溶液，去除未反應之DOTAGA-DBCO。對所獲得之分取液進行溶劑蒸餾去除直至約30 μL，用於標定步驟。89 Zr錯合物標定抗體之未反應物去除步驟中之放射化學產率(HPLC回收率)之測定方法如下所述。即，將分取液之放射能相對於本步驟開始時所饋入之放射能量的百分率設為未反應物去除步驟中之HPLC回收率(%)。 HPLC條件如以下所示，分取保持時間27分鐘附近之組分。 ＜HPLC條件＞ 檢測器：紫外吸光光度計(測定波長：220 nm、254 nm)/閃爍檢測器 管柱：XBridge C18 3.5 μm、4.6×100 mm，Waters製造 流量：每分鐘0.5 mL 面積測定範圍：試樣注入後45分鐘 流動相A：10 mmol/L組胺酸緩衝液pH6.5 流動相B：液體層析法用乙腈 流動相C：乙腈/水混液(1：1) 流動相之送液：將流動相A、流動相B及流動相C混合比以如下方式變更以控制濃度梯度。
[表18]
注入後之時間(分鐘) 流動相A(vol%) 流動相B(vol%) 流動相C(vol%)
0.0〜40.0 90→50 10→50 0
40.0〜40.1 50→1 50→99 0
40.1〜45.0 1 99 0
45.1〜46.0 1→0 99→10 0→90
46.0〜50.0 0 10 90
50.0〜50.1 0→90 10 90→0
50.1〜55.0 90 10 0
(2.標定步驟) 將經上述各步驟所獲得之89 Zr錯合物之溶液、與包含以與製造例2相同之方式所製造之肽修飾抗體(一價抗體；H01L03)之溶液加以混合，於37℃下進行1.5小時點擊反應而獲得89 Zr錯合物標定抗體。包含89 Zr標定錯合物之螯合部及肽修飾抗體(一價抗體)之量分別為73 pmol及50 nmol，第1原子團(DBCO)與第2原子團(疊氮化物)之莫耳比分別為約1：685。 進而，使用超過濾器(Merck公司製造，型號：UFC505096)，對在37℃下反應1.5小時所獲得之89 Zr錯合物標定抗體之溶液進行純化。純化後之89 Zr錯合物標定抗體之放射化學純度為95%，放射化學產率為50%。89 Zr錯合物標定抗體之放射化學純度及放射化學產率之測定方法如下所示。即，利用薄層層析法(Agilent公司製造，型號：SGI0001，展開溶劑為乙腈：0.1 mmol/L EDTA溶液之混液(體積比1：1))，並利用放射性γ-TLC分析儀(raytest製造，MODEL GITA Star PS)進行測定，將原點附近所檢測到之波峰之放射能(計數值)相對於檢測到之總放射能(計數值)的百分率設為放射化學純度(%)。又，將超過濾純化後所回收之放射能相對於標定步驟開始時所施加之總放射能的百分率設為放射化學產率(%)。
實施例11：各89 Zr及225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體之人類及小鼠血漿中之穩定性評價 使用89 Zr標定DOTAGA-DBCO所製作之89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體係依據實施例10所製造。使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO所製作之89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體係使用上述式(L1-4)所示之螯合部作為螯合部，除此以外，依據實施例10所製造。 使用225 Ac標定DOTA-Bn-DBCO所製作之225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體係依據實施例2所製造。使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體係依據實施例9所製造。 再者，均使用0.1 M乙酸鈉緩衝液(pH6.0)作為溶劑。
將各種89 Zr標定抗體及225 Ac標定抗體與人類及小鼠血漿進行混合，針對在37℃下培養時於各經過時間點之穩定性，藉由乙酸纖維素膜電泳進行評價。此外，為了評價89 Zr標定抗體及225 Ac標定抗體以外之血漿中之分解物，假定89 Zr或225 Ac自各螯合劑之脫離、及各連接子部位之斷裂，將各單獨成分另外混合至各血漿中，實施乙酸纖維素膜電泳。使用自培養之各時間點採集之各血漿樣本，實施乙酸纖維素膜電泳，於泳動結束後將乙酸纖維素膜於成像平板上進行曝光。利用掃描式圖像解析裝置(GE Healthcare公司製造，型號：Typhoon-7000)讀取經曝光之成像板，利用成像分析軟體(GE Healthcare公司製造，軟體名：ImageQuant)對各種89 Zr標定抗體及225 Ac標定抗體之放射化學純度進行定量評價。將評價樣本之組成示於表19。將相當於各標定抗體之波峰之放射能(計數值)相對於檢測到之總放射能(計數值)的百分率設為放射化學純度(%)。
[表19] 使用RI標定DOTA-Bn-DBCO所製作之RI標定抗MUC5AC人類化抗體
評價化合物 (放射化學純度%) 混合試樣 培養開始時之放射能濃度
89 Zr標定抗體 (94%) 小鼠血漿 2.7 MBq/mL
人類血漿 3.4 MBq/mL
225 Ac標定抗體 (77%) 小鼠血漿 2 kBq/mL
人類血漿
n＝3
[表20] 使用RI標定DOTAGA-DBCO所製作之RI標定抗MUC5AC人類化抗體(n＝3)
評價化合物 (放射化學純度%) 混合試樣 培養開始時之放射能濃度
89 Zr標定抗體 (94%) 小鼠血漿 0.4 MBq/mL
人類血漿
225 Ac標定抗體 (100%) 小鼠血漿 1.6 kBq/mL
人類血漿
n＝3
關於使用RI標定DOTA-Bn-DBCO所製作之RI標定抗MUC5AC人類化抗體，於穩定性評價之培養時間後立即進行取樣，利用薄層層析法所測得之血漿樣本之放射化學純度於小鼠血漿中為94%，於人類血漿中為95%。最終培養了378小時之時間點之放射化學純度均為70%以上。結果之圖表係示於圖22A上段。 供於本評價之225 Ac標定抗體之放射化學純度為77%，觀察到與在穩定性評價之培養時間後立即進行取樣並利用薄層層析法所測得之血漿樣本之放射化學純度解離(小鼠：90%、人類：80%)。其係因為某些固體成分固著於原線，可認為所求出之放射化學純度低於實際值。最終培養了168小時之時間點之放射化學純度均為60%以上。結果之圖表係示於圖22B上段。
關於使用RI標定DOTAGA-DBCO所製作之RI標定抗MUC5AC人類化抗體，供於本評價之89 Zr標定抗體之放射化學純度為94%，為與穩定性評價之培養時間後立即進行測定所得之血漿樣本之放射化學純度大致相同之值(小鼠：99%、人類：99%)。最終培養了336小時之時間點之放射化學純度均為85%以上。結果之圖表係示於圖22A下段。 供於本評價之225 Ac標定抗體之放射化學純度為100%，為與穩定性評價之培養時間後立即進行測定所得之血漿樣本之放射化學純度大致相同之值(小鼠：97%、人類：100%)。最終培養了336小時之時間點之放射化學純度均為80%以上。結果之圖表係示於圖22B下段。
實施例12：RI標定抗MUC5AC人類化抗體對於MUC5AC之結合性及特異性 使用225 Ac或89 Zr標定DOTAGA-DBCO所製作之RI標定抗MUC5AC人類化抗體係依據實施例9及實施例10所製造。又，使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO所製作之RI標定抗MUC5AC人類化抗體係依據實施例11所製造。使用該等RI標定抗MUC5AC人類化抗體，藉由體外ARG來評價各RI標定抗體對於MUC5AC之結合性及特異性。關於具體之操作，除使用上述RI標定抗MUC5AC人類化抗體作為試驗樣品以外，依據實施例4-3來進行。將89 Zr標定抗體之結果之圖像示於圖23，將225 Ac標定抗體之結果示於圖24。又，於使用89 Zr標定抗體之情形時，將ROI設定為MUC5AC陽性腫瘤切片及陰性腫瘤切片之各切片整體，使用所算出之ROI中之數值，算出對於MUC5AC陽性腫瘤及陰性腫瘤之結合比。於使用225 Ac標定抗體之情形時，於MUC5AC陽性腫瘤切片及陰性腫瘤切片之腫瘤組織內設定多個較小之ROI，以其平均值算出對於MUC5AC陽性腫瘤與陰性腫瘤之結合比。其結果為，使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之RI標定抗MUC5AC人類化抗體顯示出6.5倍之結合比。使用89 Zr標定DOTAGA-DBCO所製作之RI標定抗MUC5AC人類化抗體顯示出138倍之結合比。使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO所製作之RI標定抗MUC5AC人類化抗體顯示出151倍之結合比。確認到使用89 Zr或225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之89 Zr或225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體及使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO所製作之89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體均保持對於MUC5AC之結合性及特異性。
實施例13：使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO及DOTAGA-DBCO所製作之89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體之PET-CT成像 使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO及DOTAGA-DBCO，依據實施例10來製造89 Zr標定抗體，分別投予至患癌小鼠，實施使用PET-CT成像之評價。 將0.7×107 個之屬於源自人類胰腺癌且MUC5AC高表現腫瘤細胞株之SW1990皮下投予至Balb/c裸小鼠(雄性)之側腹至背部。於移植後之腫瘤體積成為約150-300 mm3 之時間點，自小鼠尾靜脈投予各種89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體。再者，腫瘤之體積係根據以下計算式算出。 腫瘤之體積＝(腫瘤之短徑2 ×腫瘤之長徑)/2 將所投予之各種89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體之放射化學純度及動物資訊示於表21。
[表21]
投予放射能量及動物資訊(投予各種89 Zr標定抗體時)
抗體名 89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體
DOTA-Bn DOTAGA
腫瘤體積(mm3 ) 337±142 335±129
體重(g) 21.6±1.2 22.1±0.8
放射化學純度(%) 92% 94%
投予放射能量(MBq) 4.6±0.2 4.6±0.0
(平均±標準偏差、n＝4)
PET-CT成像(小動物用PET-CT裝置：Si78，Bruker公司製造)係於下表條件下實施。拍攝PET及CT之時間點係投予後12、48、84、168、252小時。關於圖像再構成，PET係利用MLEM法實施，CT係利用FBP法實施。實施各時間點之腫瘤及心臟(血液)、肝臟之標準化攝取值(SUV，standardized uptake value)之VOI分析，並根據時間-放射性曲線來比較SUV之推移。
[表22]
PET拍攝及再構成條件
同位素 89-Zr
採集時間 600 sec
能量窗 30%(357.7-664.3 keV)
PET圖像再構成 MLEM GPU 32×32 0.25(Iterations：12)
修正 散射、隨機、衰變、部分體積、衰減
[表23] CT拍攝條件
採集模式 靜態
掃描模式 連續(7 deg/s)
X射線源濾波器 AL-1.0 mm
像素尺寸 50 um
X射線管電流 771uA
X射線管電壓 65 kV
將投予各89 Zr標定抗體後實施48小時之PET-CT拍攝所得之結果示於圖25。將實施各時間點之腫瘤及心臟(血液)、肝臟之VOI分析所得之結果示於圖26。此外，將各時間點之腫瘤肝臟比之結果示於圖27。 關於向腫瘤累積之最大值，以SUV計均為2.8以上，關於投予後84小時之腫瘤肝臟比之最大值，使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO所製作之89 Zr標定抗體為3.6，使用89 Zr標定DOTAGA-DBCO所製作之89 Zr標定抗體為3.4。各值未發現統計學上顯著差異。 確認到各種89 Zr標定抗體於心臟(血液)中之累積經時性地減少，於投予後252小時之時確認到幾乎自血液中消失。此外，關於各種89 Zr標定抗體間於各時間點在心臟(血液)中之累積，未發現統計學上顯著差異。同樣地，確認到各種89 Zr標定抗體於肝臟及肌肉中之累積亦經時性地減少，關於各種89 Zr標定抗體間於各時間點在各組織中之累積，未發現統計學上顯著差異。
實施例14：使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO及DOTAGA-DBCO所製作之89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體之體內分佈實驗 為了確認更詳細之體內動態，將使用89 Zr標定DOTA-DBCO及DOTAGA-DBCO所製作之89 Zr標定抗體投予至患癌小鼠，於投予20、68、188小時後實施體內分佈實驗。再者，各種89 Zr標定抗體係以與實施例13相同之方式依據實施例10來製造。
體內分佈實驗係向利用與實施例4-2相同之方法所製作之患癌小鼠自尾靜脈投予各種89 Zr標定抗體。再者，將所投予之各種89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體之放射化學純度及動物資訊示於表24。作為投予放射能量，向任一群投予約5 MBq。
[表24]
投予放射能量及動物資訊(投予各種8 9 Zr標定抗體時)
抗體名 89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體
DOTA-Bn DOTAGA
時間點(小時) 20 68 188 20 68 188
腫瘤體積(mm3 ) 409±78 441±150 484±149 482±124 513±206 505±155
體重(g) 21.5±1.2 22.0±0.5 22.7±1.4 21.2±1.1 22.5±0.7 22.4±1.2
放射化學純度(%) 97% 95%
(年均±標準偏差、n＝4)
患癌小鼠係於投予各種89 Zr標定抗體後於代謝籠內進行飼養，回收直至各時間點(投予20、68、188小時後)為止所排泄之糞及尿。於各時間點藉由於異氟醚麻醉下對患癌小鼠進行放血來實施安樂死。採集腫瘤、血液、正常器官(包含剩餘之全身)並測定重量。除經重量測定之器官以外，還測定排泄糞及排泄尿之放射能量(γ射線井式閃爍測定裝置：JDC-1712，Hitachi Aloka Medical公司製造)。根據各器官(包括排泄糞及排泄尿)之放射能量(計數值)算出相對於投予量之放射能累積率(%ID)，而算出以每器官重量之放射能累積率計之放射能累積量(%ID/g)。將表示腫瘤組織及各器官之放射能累積量之經時變化之結果示於圖28A〜D中。根據排泄糞及排泄尿之放射能累積量(計數值)算出相對於投予量之放射能累積率(%ID)，將表示經時變化之結果示於圖29。
關於腫瘤之放射能累積量，若為使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO所製作之89 Zr標定抗體，則腫瘤之放射能累積量於投予後188小時之時為最高，若為使用89 Zr標定DOTAGA-DBCO所製作之89 Zr標定抗體，則腫瘤之放射能累積量於投予後68小時之時為最高。此時之放射能累積量顯示20%ID/g以上。關於血液之放射能累積之經時變化，各種89 Zr標定抗體顯示同樣地減少之傾向，可判斷血液清除率為相同程度。關於排泄，於投予後188小時之時，糞及尿中之放射能累積率為65%ID以上。關於向正常組織之放射能累積，均於投予後20小時之時為最高，於20小時以後，發現放射能累積減少之傾向。關於投予後20小時之放射能累積較高之正常組織，依序為肝臟、肺、脾臟。
實施例15：使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體之藥效評價 實施如下研究，即，將使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之225 Ac標定抗體向患癌小鼠進行投予，對腫瘤生長抑制效果進行確認。再者，225 Ac標定抗體係依據實施例9所製造。患癌小鼠係利用與實施例4-2相同之方法製作。 將225 Ac標定抗體以投予放射能量5 kBq/匹或10 kBq/匹向患癌小鼠進行投予，評價225 Ac標定抗體之性能。又，設置投予僅使抗MUC5AC人類化抗體溶解於0.1 M乙酸鈉緩衝液(pH6.0)中而成之溶液之群(抗體對照群)。各群設為6匹，於投予後4週內實施一般狀態之觀察、體重及腫瘤體積之測定。將結果示於表25。
[表25]
投予放射能量及動物資訊(投予各種225 Ac標定抗體時)
   抗體對照群 225 Ac標定抗MUC5AC人類化 抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 5 10
腫瘤體積(mm3 ) 165±43 161±36 161±29
體重(g) 20.7±0.7 20.8±1.0 21.3±1.2
將確認腫瘤體積之經時性變化所得之結果示於圖30之(A)。於225 Ac標定抗體投予群之任一種投予放射能量下，均與抗體對照群相比，統計學上顯著地抑制腫瘤生長，確認到由投予225 Ac標定抗體所產生之腫瘤生長抑制效果。
於觀察期間最終日實施病理解剖，實施腫瘤之採集、重量測定。將比較腫瘤重量所得之結果示於表26。於各種225 Ac標定抗體投予群中，發現與抗體對照群相比，腫瘤重量於統計學上顯著較低。
[表26]
腫瘤重量之比較
   抗體對照群 225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 5 10
腫瘤重量(g) 2.06±0.42 0.75±0.36* 0.36±0.15*
平均±標準偏差、n＝6顯著水準：*P＜0.05 vs 抗體對照群
將確認體重之經時性變化所得之結果示於圖30之(B)。於各種225 Ac標定抗體投予群之投予10 kBq之群中，於觀察期間早期發現體重減少，但作為相對比未低於0.9。於觀察期間後期，體重恢復至投予前程度。
於觀察期間最終日實施病理解剖，採集肝臟、腎臟及脾臟並進行重量測定。於所有225 Ac標定抗體投予群中，未發現組織重量於統計學上較抗體對照群顯著減少。
[表27]
組織重量之比較
   抗體對照群 225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體投予群
投予放射能量(kBq) - 5 10
肝臟(g) 0.98±0.09 1.02±0.06 1.18±0.10
腎臟(g) 0.30±0.02 0.34±0.03 0.35±0.03
脾臟(g) 0.068±0.012 0.073±0.008 0.078±0.007
將有關肝毒性及腎毒性之結果分別示於圖33及34。由於相對於抗體對照群未發現統計學上顯著差異，故教示了於本用量下不致誘發肝損傷及腎損傷。將有關血液毒性之結果示於圖31及32。由於相對於抗體對照群未發現統計學上顯著差異，故教示了於本用量下不會誘發血液毒性。
實施例16：89 Zr無規標定抗MUC5AC人類化抗體([89 Zr]Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體)之製作 將以與製造例2相同之方式所製造之肽修飾抗體(一價抗體；H01L03)0.1 mg(0.7 nmol)及1-(4-異硫氰基苯基)-3-[6,17-二羥基-7,10,18,21-四氧代-27-(N-乙醯基羥基胺基)-6,11,17,22-四氮雜庚烷二十碳四烯基]硫脲(p-SCN-Bn-DFO，Macrocyclics公司)0.26 mg(0.35 μmol)於0.1 M碳酸氫鈉緩衝液中進行混和，於室溫下反應120分鐘。反應結束後，藉由超過濾進行純化，將溶劑置換為含有100 mmol精胺酸之50 mmol組胺酸緩衝液(pH6.1)(以下，RH緩衝液)，藉此製作於抗MUC5AC人類化抗體之胺基上隨機地鍵結有DFO之抗MUC5AC人類化抗體(以下，「Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體」)。藉由NanoDrop2000(ThermoFisher公司)進行蛋白濃度測定，結果為，Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體溶液之蛋白濃度為1.12 mg/mL。將所獲得之Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體溶液89.6 μL(0.1 mg、0.67 μmol)與89ZrCl3溶液10 μL(11.8 MBq)在RH緩衝液301.6 μL中進行混合，藉此進行錯合物形成反應，形成錯合物後，藉由超過濾進行純化，藉此獲得[89 Zr]Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體。以與實施例10相同之方式算出放射化學純度，結果放射化學純度為97.3%。又，基於反應開始時之放射能算出放射化學產率，結果為43.0%。
實施例17：[89 Zr]Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體之PET-CT成像 將實施例16中所獲得之[89 Zr]Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體以成為1.27 MBq/22.5 μg蛋白/100 μL/小鼠之濃度之方式利用RH緩衝液進行稀釋、調整，向以與實施例4-2相同之方式所製作之患癌小鼠進行投予(n＝3)，於投予後19、42、86、158小時之時，實施使用PET-CT成像之評價。以與實施例4-2相同之方式算出供於本評價之動物之腫瘤體積，結果腫瘤體積之平均值為60.0±20.0 mm3 。PET拍攝條件及圖像再構成方法係依據實施例13。實施各時間點之腫瘤及心臟(血液)、肝臟之SUV之VOI分析，根據時間-放射性曲線來比較SUV之推移。
將實施PET-CT拍攝所得之結果示於圖35。將實施各時間點之腫瘤、心臟及肝臟之VOI分析所得之結果示於圖36。根據VOI分析之結果，於腫瘤中發現經時性累積，於所有時間點，SUV之平均值均為2.7以上，SUV之最大平均值於158小時之時為5.1。確認到腫瘤以外之器官(心臟(血液)、肝臟)中之SUV經時性減少。投予後158小時之SUV之腫瘤肝臟比為3.7。
實施例18：[89 Zr]Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體之體內分佈實驗 於實施例17中在158小時之時結束PET-CT拍攝後，於異氟醚麻醉下藉由放血來實施安樂死。採集腫瘤、血液、正常器官(包含剩餘全身)並測定重量。進而，使用γ射線井式閃爍測定裝置(JDC-1712，Hitachi Aloka Medical公司)來測定各器官之放射能量。根據各器官(包括排泄糞及排泄尿)之放射能量(計數值)算出相對於投予量之放射能累積率(%ID)，以器官每單位重量之放射能累積率之形式算出放射能累積量(%ID/g)。
將PET-CT拍攝結束後之體內分佈評價之結果示表28。投予後158小時之腫瘤之放射能分佈率為5.1±2.3%ID，每單位重量之放射能分佈率為49.5±5.2%ID。確認到於肝臟中之較高放射能分佈，肝臟中之放射能分佈率為5.1%ID，每單位重量之放射能分佈率為10.4%ID/g。除腫瘤以外之放射能分佈率較高之正常器官依序為肝臟、腎臟、肺。
[表28]
   放射能分佈率(%ID) 每單位重量之放射能分佈率(%ID/g)
血液 4.30 5.25
心臟 0.41 3.68
肺 1.01 7.76
脾臟 0.64 14.68
胰腺 0.13 0.90
肝臟 12.86 10.40
腎臟 1.47 4.06
腫瘤 5.06 49.52
剩餘全身 29.17 6.23
排泄物 44.21 -
以上，參照實施形態對本發明進行了說明，但本發明並不限定於上述實施形態。對於本發明之構成或詳細內容，可於本發明之範疇內進行熟悉本技藝者可理解之各種變更。 包含此處所述之專利及專利申請說明書之所有刊行物中記載之內容藉由被引用至本文中，而併入至本說明書中以至與明確所記載之所有內容相同之程度。 (產業上之可利用性)
本發明之經RI標定之抗MUC5AC人類化抗體由於特異性及於腫瘤中之累積性優異，故對於MUC5AC過度表現之疾病、尤其是癌之治療及/或診斷極為有用。
圖1係表示使用經111 In標定之各抗體並實施SPECT-CT成像所得之結果之圖。表示經111 In標定之各抗體之SPECT圖像。 圖2係表示自經111 In標定之各抗體之SPECT圖像對各時間點之腫瘤及肝臟進行VOI(感興趣容積(volume of interest)，三維ROI)分析所得之結果的圖表。 圖3係表示投予經111 In標定之各抗體並確認了168小時後之體內分佈及排泄路徑所得之結果的圖表。 圖4係表示對經111 In標定之各抗體之利用體外ARG所得之結合能進行比較所得之結果的圖像。 圖5係表示對經111 In標定之各抗體之利用體外ARG所得之結合能進行定量化並進行比較所得之結果的圖表。 圖6係表示投予225 Ac標定一價抗體後患癌小鼠之腫瘤體積之經時性變化之圖表。 圖7係將投予225 Ac標定一價抗體後患癌小鼠之體重之經時性變化以將投予前設為1.0之相對值表示的圖表。 圖8係表示對投予225 Ac標定一價抗體後患癌小鼠之肝毒性及腎毒性進行確認所得之結果的圖表。 圖9係表示對投予225 Ac標定一價抗體後患癌小鼠之血液毒性(白血球數、血小板數)進行確認所得之結果的圖表。 圖10係表示投予高用量之225 Ac標定一價抗體後患癌小鼠之腫瘤體積之經時性變化的圖表。 圖11係將投予高用量之225 Ac標定一價抗體後患癌小鼠之體重之經時性變化以將投予前設為1.0之情形之相對值表示的圖表。 圖12係表示對投予高用量之225 Ac標定抗體後患癌小鼠之肝毒性及腎毒性進行確認所得之結果的圖表。 圖13係表示對投予高用量之225 Ac標定抗體後患癌小鼠之血液毒性(白血球數、血小板數)進行確認所得之結果的圖表。 圖14係表示投予225 Ac標定一價抗體或225 Ac標定二價抗體後患癌小鼠之腫瘤體積之經時性變化的圖表。 圖15係將投予225 Ac標定一價抗體或225 Ac標定二價抗體後患癌小鼠之體重之經時性變化以將投予前設為1.0之情形之相對值表示的圖表。 圖16係表示對投予225 Ac標定一價抗體或225 Ac標定二價抗體後患癌小鼠之肝毒性進行確認所得之結果的圖表。 圖17係表示對投予225 Ac標定一價抗體或225 Ac標定二價抗體後患癌小鼠之腎毒性進行確認所得之結果的圖表。 圖18係表示對投予225 Ac標定一價抗體或225 Ac標定二價抗體後患癌小鼠之血液毒性(白血球數)進行確認所得之結果的圖表。 圖19係表示對投予225 Ac標定一價抗體或225 Ac標定二價抗體後患癌小鼠之血液毒性(血小板數)進行確認所得之結果的圖表。 圖20係表示投予經111 In標定之一價抗體或二價抗體20、68及188小時後之體內分佈中，各器官中之每單位重量之放射能累積量(%ID/g)之結果的圖表。 圖21係表示投予經111 In標定之一價抗體或二價抗體20、68及188小時後之體內分佈中，腫瘤、血液、排泄尿、排泄糞、及排泄尿與排泄糞之合計的放射能累積率之經時變化的圖表。 圖22A係評估經89 Zr標定之抗MUC5AC人類化抗體於人類(-■-、…■…)及小鼠(-●-、…●…)血漿中之穩定性。將各種89 Zr標定抗體與人類及小鼠血漿混合並於37℃下進行培養，於各經過時間點之放射化學純度之經時變化的圖表。上段表示使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO所製作之89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體之結果(培養後、24小時、48小時、168小時及378小時之時間點)，下段表示使用89 Zr標定DOTAGA-DBCO所製作之89 Zr標定抗MUC5AC人類化抗體之結果(培養後、24小時、168小時及336小時之時間點)。 圖22B係評估經225 Ac標定之抗MUC5AC人類化抗體於人類(-■-、…■…)及小鼠(-●-、…●…)血漿中之穩定性。將各種225 Ac標定抗體與人類及小鼠血漿混合並於37℃下進行培養，於各經過時間點之放射化學純度之經時變化的圖表。上段表示使用225 Ac標定DOTA-Bn-DBCO所製作之225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體之結果(培養後、21小時、115小時、140小時及168小時之時間點)，下段表示使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之225 Ac標定抗MUC5AC人類化抗體之結果(培養後、48小時、168小時及336小時之時間點)。 圖23係表示對經89 Zr標定之各抗體之利用體外ARG所得之結合能進行比較所得之結果的圖像。 圖24係表示對經225 Ac標定之抗體之利用體外ARG所得之結合能進行比較所得之結果的圖像。 圖25係表示實施投予各89 Zr標定抗體後48小時之PET-CT拍攝所得之結果的圖像。 圖26係表示根據使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO(-■-)及89 Zr標定DOTAGA-DBCO(…●…)所製作之經89 Zr標定之各抗體之SPECT圖像，對各時間點(12、48、84、168及252小時之時)之腫瘤(上段圖)、心臟(中段圖)及肝臟(下段圖)進行VOI(volume of interest、三維ROI)分析所得之結果的圖表。 圖27係表示投予使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO(-■-)及89 Zr標定DOTAGA-DBCO(…●…)所製作之經89 Zr標定之各抗體後，由各時間點(12、48、84、168及252小時之時)之於腫瘤及於肝臟中的累積算出腫瘤肝臟比所得之結果的圖表。 圖28A係表示投予使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO(-■-)及89 Zr標定DOTAGA-DBCO(…●…)所製作之經89 Zr標定之各抗體20、68及188小時後之體內分佈中於各器官中每單位重量之放射能累積量(%ID/g)之結果的圖表。上段表示腫瘤之結果，下段表示血液之結果。 圖28B係表示投予使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO(-■-)及89 Zr標定DOTAGA-DBCO(…●…)所製作之經89 Zr標定之各抗體20、68及188小時後之體內分佈中於各器官中每單位重量之放射能累積量(%ID/g)之結果的圖表。上段表示肝臟之結果，下段表示腎臟之結果。 圖28C係表示投予使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO(-■-)及89 Zr標定DOTAGA-DBCO(…●…)所製作之經89 Zr標定之各抗體20、68及188小時後之體內分佈中於各器官中每單位重量之放射能累積量(%ID/g)之結果的圖表。上段表示心臟之結果，下段表示肺之結果。 圖28D係表示投予使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO(-■-)及89 Zr標定DOTAGA-DBCO(…●…)所製作之經89 Zr標定之各抗體20、68及188小時後之體內分佈中於各器官中每單位重量之放射能累積量(%ID/g)之結果的圖表。分別表示脾臟及胰腺之結果。 圖29係表示投予使用89 Zr標定DOTA-Bn-DBCO(-■-、-□-)及89 Zr標定DOTAGA-DBCO(…●…、…〇…)所製作之經89 Zr標定之各抗體20、68及188小時後之排泄糞(-□-、…〇…)及排泄尿(-■-、…●…)之放射能累積率(%ID)之經時變化的圖表。 圖30係表示將使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之225 Ac標定抗體以投予放射能量5 kBq/匹或10 kBq/匹投予至患癌小鼠後之腫瘤體積(A)及體重(B)之經時性變化的圖表。 圖31係表示對投予使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之225 Ac標定抗體後患癌小鼠之血液毒性(白血球數)進行確認所得之結果的圖表。 圖32係表示對投予使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之225 Ac標定抗體後患癌小鼠之血液毒性(血小板數)進行確認所得之結果的圖表。 圖33係表示對投予使用225 Ac標定DOTAGA-DBCO所製作之225 Ac標定抗體後患癌小鼠之肝毒性(ALT、AST)進行確認所得之結果的圖表。 圖34係表示對投予使用225 Ac標定DOTAGA-DBO所製作之225 Ac標定抗體後患癌小鼠之腎毒性(BUN)進行確認所得之結果的圖表。 圖35係表示使用[89 Zr]Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體並經時性地實施SPECT-CT成像所得之結果的圖。 圖36係表示根據[89 Zr]Random-DFO-抗MUC5AC人類化抗體之SPECT圖像對各時間點之腫瘤(-●-)、心臓(血液)(…■…)及肝臟(…△…)進行VOI(volume of interest、三維ROI)分析所得之結果的圖表。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (14)

  1. 一種複合體，其係螯合有放射性核種之螯合劑、與抗體之複合體，且 上述放射性核種為發射α射線或正電子之金屬核種， 上述抗體為與黏蛋白亞型5AC特異性結合之人類化抗體。
  2. 如請求項1之複合體，其中，上述抗體為具有重鏈可變區及輕鏈可變區之人類化抗體， 上述重鏈可變區包含： (1)序列編號1所表示之胺基酸序列(H01)、 (2)序列編號2所表示之胺基酸序列(H02)、 (3)序列編號3所表示之胺基酸序列(H03)、或 (4)序列編號4所表示之胺基酸序列(H04)， 上述輕鏈可變區包含： (5)序列編號5所表示之胺基酸序列(L01)、 (6)序列編號6所表示之胺基酸序列(L02)、 (7)序列編號7所表示之胺基酸序列(L03)、或 (8)序列編號8所表示之胺基酸序列(L04)。
  3. 如請求項2之複合體，其中，上述抗體為具有重鏈可變區及輕鏈可變區之人類化抗體， 上述重鏈可變區包含(1)序列編號1所表示之胺基酸序列(H01)， 上述輕鏈可變區包含(7)序列編號7所表示之胺基酸序列(L03)。
  4. 如請求項1或2之複合體，其中，發射α射線之上述金屬核種為錒-225，發射正電子之金屬核種為Zr-89。
  5. 如請求項1或2之複合體，其中，相對於上述抗體1分子，具備上述螯合劑1分子以上且8分子以下。
  6. 如請求項1或2之複合體，其中，上述螯合劑係經由連接子，部位特異性地修飾上述抗體之Fc區。
  7. 如請求項6之複合體，其中，上述連接子係含有下述式(i)所表示之由13個以上且17個以下之胺基酸殘基所構成之肽，且係藉由經交聯劑修飾之上述肽與上述抗體之交聯反應所形成， (Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) … (i) (式中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續之a個X、連續之b個X、連續之c個X、及連續之d個X， X係於側鏈上不具有硫醇基亦不具有鹵代乙醯基之胺基酸殘基， a、b、c及d分別獨立地為1以上且5以下之整數，且滿足a＋b＋c＋d≦14， Xaa1及Xaa3分別獨立地， 表示源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基，或者一者表示源自於側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基，另一者表示源自於側鏈具有鹵代乙醯基之胺基酸之胺基酸殘基，Xaa1與Xaa3係連結著， Xaa2為離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，且經上述交聯劑修飾)。
  8. 如請求項1或2之複合體，其中，上述螯合劑具有源自下述式(A)所表示之化合物或其鹽之構造， [化1]
    Figure 03_image069
    (式(A)中，R11 、R13 及R14 分別獨立地為包含-(CH2 )p COOH、-(CH2 )p C5 H5 N、-(CH2 )p PO3 H2 、-(CH2 )p CONH2 、或-(CHCOOH)(CH2 )p COOH之基，R12 或R15 之一者為氫原子、羧基、或碳數2或者3之羧烷基，另一者為用以與上述抗體複合體化之取代基，p為0以上且3以下之整數，R12 為用以與上述抗體複合化之取代基時R15 為氫原子，R12 不為用以與上述抗體複合化之取代基時R15 為用以與上述抗體複合化之取代基)。
  9. 一種放射性醫藥，其含有請求項1或2之複合體作為有效成分。
  10. 如請求項9之放射性醫藥，其係用於癌之RI內照射療法，上述放射性核種為發射α射線之金屬核種。
  11. 如請求項10之放射性醫藥，其用於在上述RI內照射療法中，以每次250 kBq/kg以下之投予量向對象投予。
  12. 如請求項11之放射性醫藥，其中，上述投予量係每次80 kBq/kg以下。
  13. 如請求項9之放射性醫藥，其係用於癌之診斷，上述放射性核種係發射正電子之金屬核種。
  14. 一種RI內照射療法中之癌之診斷用放射性醫藥，係使用了請求項10至12中任一項之放射性醫藥，其係含有螯合有放射性核種之螯合劑、與抗體之複合體者，且 上述抗體係與黏蛋白亞型5AC特異性結合之人類化抗體。
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