TW202123970A - 1價ccap生成物之製造方法 - Google Patents

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高橋信明
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前田彩夏
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Abstract

本發明之目的在於提供一種血中半衰期長之藉由CCAP法所得之Fc修飾抗體等。更具體而言，本發明之目的在於基於本發明人等所得出之見解，提供一種僅1處結合有IgBP之抗體等。 本發明藉由利用與抗體之Fc區結合之管柱之Fc修飾抗體等之純化及製造，來提供目標抗體等。具體而言，藉由如下方式來提供Fc之2處結合位點中僅1處經選擇性修飾之抗體：使藉由CCAP法所製造之IgBP結合抗體吸附於IgBP固相化管柱之載體；或者在製出抗體之僅單個Fc與IgBP結合管柱結合之狀態後，將CCAP用肽試劑添加至管柱中，於管柱內進行CCAP法之反應。

Description

1價CCAP生成物之製造方法
本發明係關於一種對Fc之特定區域進行部位特異性修飾之方法。
本發明人等此前開發出一種對IgG進行部位特異性修飾之方法，該方法(CCAP法)使用與IgG之Fc區特異性結合之肽(IgBP)試劑(專利文獻1及非專利文獻1)或源自蛋白A之Z33肽試劑(專利文獻2)。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開WO2016/186206號 專利文獻2：國際公開WO2018/230257號 非專利文獻
非專利文獻1：Kishimoto，S.等人. Bioconjug. Chem. 30, 698-702 (2019).
[發明所欲解決之問題]
CCAP(Chemical Conjugation by Affinity Peptide，親和肽化學結合)法會帶來使肽與Fc區之特定部位結合之部位特異性，因此具有不阻礙抗體之抗原結合區與抗原結合的優勢。本發明人等為了將使用開發出之CCAP法使肽與Fc區特異性結合所製成之Fc修飾抗體用作醫藥及診斷藥，而進行了開發。結果發現，藉由CCAP法修飾了Fc之特定部位的抗體產生了如下問題：與非修飾抗體相比血中半衰期變短。針對其原因反覆進行了探究，結果發現，Fc區具有對稱性，通常存在2個IgG親和性肽(IgBP)結合位點，從而導致當IgBP與2處結合位點兩者結合時，血中半衰期會減少，另一方面，於使IgBP與上述2處結合位點中僅1處結合之情形時，上述血中半衰期之問題得以解決。因此，本發明之目的在於提供一種Fc區之2處結合位點中僅1處經選擇性修飾之抗體。 [解決問題之技術手段]
本發明人等為了解決該問題而針對多個實驗條件進行了反覆研究，但僅靠改良CCAP法之反應條件難以選擇性地修飾2處結合位點中之僅1處。因此，嘗試應用與Fc區結合之載體來純化及製造。具體而言，本發明人等嘗試使用已知會與Fc區結合之蛋白A結合管柱，自藉由CCAP法所製得之IgBP結合Fc分子進行僅1處結合有IgBP之Fc分子(其中一處未經修飾之Fc分子)(1價Fc分子)之純化。然而，無法高效率地進行與Fc區之IgBP結合價相應之分離。繼而，本發明人等嘗試製作IgBP固相化管柱並使其吸附藉由CCAP法所製得之IgBP結合Fc分子，藉此純化1價Fc分子。其結果為，1價Fc分子高效率地吸附於管柱，2處結合有IgBP之Fc分子(2價Fc分子)無法與管柱結合而被溶出。由此，本發明人等發現了一種能夠高效率地僅取得1價Fc分子之方法。進而，嘗試能否在製出僅單個Fc與IgBP結合管柱結合之狀態後，將CCAP用肽試劑添加至管柱中，於管柱內進行CCAP法。結果發現，藉由本方法能夠僅對不參與和載體之結合之結合位點進行肽修飾。根據該等結果，本發明人等成功地高效率地提供了一種Fc之2處結合位點中僅1處經選擇性修飾之Fc分子，從而完成了本發明。 [發明之效果]
本發明之方法能夠以高含量提供一種Fc之2處結合位點中僅1處經選擇性修飾之Fc分子，因此能夠提供一種血中半衰期較長之Fc分子。
本發明係基於如下發現：藉由使載體上之IgBP(載體結合用IgBP)與構成Fc分子之2條Fc鏈中之1條鏈之Fc之結合位點結合，能夠將結合有2個欲導入至Fc鏈中之IgBP(Fc分子結合用IgBP)之抗體與結合有1個或0個上述IgBP之抗體高效率地分離；及藉由使Fc分子結合用IgBP與結合有載體結合用IgBP之Fc鏈結合，能夠僅使1分子之IgBP與Fc分子結合。即，本發明提供一種應用結合有載體結合用IgBP之載體來製造僅結合有1分子之IgBP之Fc分子的方法。
於本說明書中，「IgG之Fc區」與「Fc區」含義相同，典型而言，意指以IgG之蛋白分解酶木瓜酶處理物之形式獲得之C末端側之片段。一般而言，Fc區包含2條對稱Fc鏈，但形成Fc區之2條Fc鏈無需嚴格相同。Fc鏈意指形成以IgG之蛋白分解酶木瓜酶處理物之形式獲得之C末端側之片段的二聚物單體。本說明書之IgG之Fc區無需為野生型IgG之Fc區之全長，只要對所使用之會與IgG之Fc區特異性結合之IgG親和性肽保持結合力，則亦可為上述IgG之Fc區之縮短形或變異體或與其他物質之融合物。本說明書中記載之方法可包括如下方法(CCAP法)：藉由親和性使交聯劑結合IgG親和性肽與IgG之Fc區結合後，藉由交聯劑形成IgG親和性肽與IgG之Fc區之共價鍵。因此，對所使用之會與IgG之Fc區特異性結合之IgG親和性肽的結合力意指如下兩種能力，即IgG親和性肽與IgG之Fc區藉由親和性而結合之能力、及將IgG親和性肽與IgG之Fc區共價結合之能力。例如，本說明書中之IgG之Fc區係野生型IgG之Fc區中除供結合所使用之IgG親和性肽之位置以外之胺基酸之一部分(1～10個、1～5個、1～3個)胺基酸，且此部位不會影響上述親和性，且可視需要置換、附加或插入、或者缺失參與共價結合之胺基酸(通常為Lys)以外之部位之胺基酸。
於本說明書中，「具有IgG之Fc區之分子」與「Fc分子」含義相同，意指包含IgG之Fc區之肽、蛋白質、或其他複合體，除了野生型或人工IgG或其變異體以外，亦包括以Fc融合蛋白質為代表之IgG之Fc區與其他物質(活性成分、藥劑、蛋白質、低分子化合物、中分子化合物、高分子化合物、基質、脂質、脂質體、奈米粒子、DDS(drug delivery system，藥物輸送系統)用媒劑、核酸及/或肽)之融合體、及僅由Fc區所構成之分子。例如，於Fc分子為Fc融合蛋白質之情形時，作為與Fc融合之蛋白質或肽，可列舉：受體、細胞激素、介白素、凝血因子VIII、CTLA4、人類乳鐵蛋白、TNF(tumor necrosis factor，腫瘤壞死因子)受體、或LFA-3、或其一部分(較佳為靶結合部分)等。於本說明書中，「Fc分子組合物」意指含有複數個Fc分子之組合物。
於本說明書中，「IgG」可為哺乳動物、例如人類及黑猩猩等靈長類、大鼠、小鼠、及兔子等實驗動物、豬、牛、馬、綿羊、及山羊等家畜動物、以及犬及貓等寵物之IgG，較佳為人類之IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。作為本說明書中之IgG，較佳為人類IgG1、IgG2、或IgG4、或兔子IgG，尤佳為人類IgG1、IgG2、或IgG4。
於本說明書中，「與IgG之Fc區特異性結合之IgG親和性肽」與「IgBP」含義相同，意指與IgG之Fc區特異性結合之肽。作為IgBP，較佳為與選自Fc中按照Eu編號(Eu numbering)之Lys248、Lys246、Lys338、Lys288、Lys290、Lys360、Lys414、及Lys439之部位及/或其接近區域、較佳為Lys248及/或其接近區域結合之肽、或者與蛋白A之結合區域結合之肽。例如，IgBP可為具有Fc結合能力之蛋白A之部分肽或其變異體。此種肽之具體例記載於國際專利公開公報WO2008/054030、WO2013/027796、WO2016/186206、WO2018/230257號、及Kyohei Muguruma等人，ACS Omega(2019)；4(11)：14390-14397.中，其等可依據各個文獻中記載之方法適當地製備。
本說明書中記載之方法係利用結合有IgBP(載體結合用IgBP)之載體，有效率地使與上述IgBP相同或不同之IgBP(Fc分子結合用IgBP)和Fc分子所具有之2處結合位點中之僅1處結合。以下，於本說明書中，將與載體結合之IgBP稱為「載體結合用IgBP」。又，將目的在於與Fc分子結合之IgBP稱為「Fc分子結合用IgBP」。又，將結合有載體結合用IgBP之載體稱為「IgBP結合載體」，將結合有Fc分子結合用IgBP之Fc分子稱為「IgBP結合Fc分子」。
作為載體結合用IgBP，具體而言，可列舉與IgG之Fc區特異性結合之如下(i)或(ii)之肽。再者，於本說明書中，Xm (m係整數)表示胺基酸。「Xm n 」表示結合有n個胺基酸Xm ，未記載有n之「Xm 」表示存在1個胺基酸Xm 。其中，於n為2以上之情形時，複數個Xm 可分別獨立為相同或不同之胺基酸。又，於n為「p-q」之情形時，表示存在p～q個胺基酸Xm 。 (i)下述式(I)所表示之肽： NH2 -(Linker)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )   (I) [式(I)中，(Linker)表示連接子，1～3個X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、及1～3個X8 分別相互獨立地表示相同或不同之胺基酸殘基， 各X1 、X2 、X3 及各X8 相互獨立地表示相同或不同之除C以外之任意之胺基酸殘基， X4 係H、R、S、或T， X5 係選自K、C、D、E、R、V、F、L、2-胺基辛二酸、Dpr、Orn、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Tle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基， X6 係E、N、R、或D， X7 係I或V。
式(I)中，Linker係(GSGGS)1-3 、(SGSGS)1-3 、(GGGGS)1-3 、或(PEG)2-10 (較佳為(PEG)4 )，或者不存在。又，為了與載體結合，可使胺基與式(I)之C末端之羧基末端(-COOH)結合而成為(-C(=O)NH2 )基，亦可任意地於該羧基末端與胺基之間插入Linker(如上所述定義)。於C末端存在Linker之情形時，亦可不存在N末端側之Linker。即，可為(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )-(Linker)-NH2 。又，式(I)中，N末端之胺基可被乙醯化(於此情形時，可在N末端側之Linker中之N末端附近之適當位置導入Lys殘基)。
作為上述式(I)所表示之肽，可較佳地列舉以下之肽。 [1]X1 1-3 係(S、G、F、或者無)-(D、G、A、S、P、Hcy、或者無)-(S、D、T、N、E、或R)所表示之胺基酸序列。 [2]X1 1-3 係D、GPD、R、GPR、SPD、GDD、GPS、SDD、RGN、G-Hcy-D、RGP、或GPD。 [3]X1 1-3 係D或GPD。 [4]X2 係A、S、或T。 [5]X2 係A或T。 [6]X2 係A。 [7]X3 係Y或W。 [8]X3 係Y。 [9]X4 係H。 [10]X5 係選自A、R、K、C、D、E、L、2-胺基辛二酸、Dpr、R、F、2-胺基辛二酸、Dpr、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基。 [11]X5 係K、R、AcOrn。 [12]X5 係選自V、Dab、F、R、L、Nva、Nle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基。 [13]X5 係選自F、R、L、Nva、Nle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基。 [14]X5 係選自L、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基。 [15]X6 係E或N。 [16]X6 係E。 [17]X7 係V。 [18]X8 1-3 係(S、T、或D)-(H、G、Y、T、N、D、F、Hcy、或者無)-(Y、F、H、M、或者無)。 [19]X8 1-3 係T、TFH、S、SFH、THH、TFY、TYH、或T-Hcy-H。 [20]X8 1-3 係T或TFH。
作為上述式(I)所表示之肽，可為以上條件之任意1個或2個以上之組合，例如可為滿足下文所記載之條件之肽：[8]與[9]；[8]與[17]；[9]與[17]；[8]、[9]與[17]；或其等與[10]～[14]中任一者之組合。 更具體而言，可列舉以下之肽(以下，X5 與上述相同；可於N末端具有NH2 -(Linker)-基，亦可於C末端具有-NH2 基或NH2 -(Linker)-基)： 1)DCAYHX5 GELVWCT(序列編號1) 2)GPDCAYHX5 GELVWCTFH(序列編號2) 3)RCAYHX5 GELVWCS(序列編號3) 4)GPRCAYHX5 GELVWCSFH(序列編號4) 5)SPDCAYHX5 GELVWCTFH(序列編號5) 6)GDDCAYHX5 GELVWCTFH(序列編號6) 7)GPSCAYHX5 GELVWCTFH(序列編號7) 8)GPDCAYHX5 GELVWCSFH(序列編號8) 9)GPDCAYHX5 GELVWCTHH(序列編號9) 10)GPDCAYHX5 GELVWCTFY(序列編號10) 11)SPDCAYHX5 GELVWCTFY(序列編號11) 12)SDDCAYHX5 GELVWCTFY(序列編號12) 13)RGNCAYHX5 GQLVWCTYH(序列編號13) 14)G-Hcy-DCAYHX5 GELVWCT-Hcy-H(序列編號14) 15)RRGPDCAYHX5 GELVWCTFH(序列編號15) 16)DCTYHX5 GNLVWCT(序列編號16) 17)DCAYHX5 GNLVWCT(序列編號17) 18)DCTYHX5 GELVWCT(序列編號18) 19)DCAWHX5 GELVWCT(序列編號19) 20)DCTYTX5 GNLVWCT(序列編號20) 21)DCAYTX5 GNLVWCT(序列編號21) 22)DCSYTX5 GNLVWCT(序列編號22) 23)DCTWTX5 GNLVWCT(序列編號23) 24)DCTYHX5 GNLVWCT(序列編號24) 25)DCTYRX5 GNLVWCT(序列編號25) 26)DCTYSX5 GNLVWCT(序列編號26) 27)DCTYTX5 GNLVWCT(序列編號27) 28)DCTYTX5 GELVWCT(序列編號28) 29)DCTYTX5 GRLVWCT(序列編號29) 30)DCTYTX5 GDLVWCT(序列編號30) 31)DCTYTX5 GNLIWCT(序列編號31) 32)DCAYHRGELVWCT(序列編號32) 33)GPDCAYHRGELVWCTFH(序列編號33) 34)RCAYHRGELVWCS(序列編號34) 35)GPRCAYHRGELVWCSFH(序列編號35) 36)SPDCAYHRGELVWCTFH(序列編號36) 37)GDDCAYHRGELVWCTFH(序列編號37) 38)GPSCAYHRGELVWCTFH(序列編號38) 39)GPDCAYHRGELVWCSFH(序列編號39) 40)GPDCAYHRGELVWCTHH(序列編號40) 41)GPDCAYHRGELVWCTFY(序列編號41) 42)SPDCAYHRGELVWCTFY(序列編號42) 43)SDDCAYHRGELVWCTFY(序列編號43) 44)DCTYHRGNLVWCT(序列編號44) 45)DCAYHRGNLVWCT(序列編號45) 46)DCTYHRGELVWCT(序列編號46) 47)DCAWHRGELVWCT(序列編號47) 48)DCTYTNGNLVWCT(序列編號48) 49)DCAYTNGNLVWCT(序列編號49) 50)DCSYTNGNLVWCT(序列編號50) 51)DCTWTNGNLVWCT(序列編號51) 52)DCTYHNGNLVWCT(序列編號52) 53)DCTYRNGNLVWCT(序列編號53) 54)DCTYSNGNLVWCT(序列編號54) 55)DCTYTRGNLVWCT(序列編號55) 56)DCTYTNGELVWCT(序列編號56) 57)DCTYTNGRLVWCT(序列編號57) 58)DCTYTNGDLVWCT(序列編號58) 59)DCTYTNGNLIWCT(序列編號59) 作為一例，可使用具有以下結構之肽作為載體結合用IgBP。 GSGGS-GPDCAYHRGELVWCTFH-NH2 (PEG)4 -GPDCAYHRGELVWCTFH-NH2 GSGGS-DCAYHRGELVWCT-NH2 (PEG)4 -DCAYHRGELVWCT-NH2 (ii)下述式(II)所表示之肽、或包含於(II)之胺基酸序列中在除X9 ～X13 以外之位置上附加、缺失、及/或置換1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列的肽： X9 1-2 NMQX10 QRRFYEALHDPNLNEEQRNAX11 IX12 SIRDDX13 -(Linker2)-CONH2 (序列編號60)       (II) [式(II)中，(Linker2)表示連接子， X9 1-2 選自由GF、AF、VF、LF、IF、MF、PF、FF、WF、KF、Orn-F、CF、DF、EF、beta丙胺酸-F、2-胺基辛二酸-F、Dpr-F、NH2 -(PEG)n -CO(其中，n＝1-50)-F、F、K、Orn、C、D、E、2-胺基辛二酸、Dpr、及乙醯基-K所組成之群， X10 係C或Q， X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、D、E、S、T、N、Q、Y、及C所組成之群， X13 係C或P，或者不存在]。
式(II)中，Linker2係(GSGGS)1-3 、(SGSGS)1-3 、(GGGGS)1-3 、或(PEG)2-10 -Lys(較佳為PEG)4 -Lys)，或者不存在。又，式(II)之N末端胺基酸之末端(-NH2 )可被乙醯化而成為(CH3 -C(=O)-NH-)基。又，Linker2可與胺基末端結合(於此情形時，可在N末端側之Linker中之N末端附近之適當位置導入Lys殘基)，於此情形時，C末端之Linker2可存在，亦可不存在。
作為具有上述式(II)所表示之胺基酸序列之肽，可較佳地列舉以下之肽。 [21]X9 選自由GF、AF、βAlaF、NH2 -(PEG)n -CO(n＝2～10)-F、F、K、Orn、C、及Dpr所組成之群。 [22]X9 選自由GF、F、及K所組成之群。 [23]X10 係Q。 [24]X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、及E所組成之群。 [25]X11 及X12 係R。
作為具有上述式(II)所表示之胺基酸序列之肽，更具體而言，可列舉以下之肽： 60)FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(序列編號62)、 61)GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(序列編號63)、 62)KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(序列編號64)、 63)GFNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(序列編號65)、 64)KNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(序列編號66)、 65)FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD(序列編號67)、或 66)GKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(序列編號68)。
例如，可使用具有以下結構之肽作為載體結合用IgBP。 乙醯基-FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDP- SGSGSK-NH2 乙醯基-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC- SGSGSK-NH2 乙醯基-FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDP- (PEG)4 - Lys-NH2 乙醯基-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC- (PEG)4 -Lys-NH2 為了與載體共價結合，載體結合用IgBP具有至少一個胺基(-NH2 )。此種胺基較佳為N末端之胺基，但只要可與載體結合，則可為N末端或C末端附近之(例如位於連接子中之)離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、Dpr、精胺酸殘基之側鏈胺基。
作為Fc分子結合用IgBP，具體而言，可列舉與IgG之Fc區特異性結合之以下(iii)或(iv)之肽。 (iii)下述式(I')所表示之肽： Z-[(Linker3)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )]  (I') [式(I')中，Z表示官能基，與[(Linker3)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )]所表示之結構之任意部分結合，(Linker3)表示連接子，1～3個X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、及1～3個X8 分別相互獨立地表示相同或不同之胺基酸殘基， 各X1 、X2 、X3 及各X8 相互獨立地表示相同或不同之除C以外之任意之胺基酸殘基， X4 係H、R、S、或T， X5 係選自K、C、D、E、R、V、F、L、2-胺基辛二酸、Dpr、Orn、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Tle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基， X6 係E、N、R、或D， X7 係I或V]。 上述式(I')所表示之肽可於C末端具有官能基來代替於N末端具有官能基。即，上述式(I')所表示之肽可為以下之式(I")所表示之肽。 [(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )-(Linker3)]-Z (I") [式(I")中，Z表示官能基，與[(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 ) -L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )-(Linker3)]所表示之結構之任意部分結合，(Linker3)表示連接子，1～3個X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、及1～3個X8 分別相互獨立地表示相同或不同之胺基酸殘基， 各X1 、X2 、X3 及各X8 相互獨立地表示相同或不同之除C以外之任意之胺基酸殘基， X4 係H、R、S、或T， X5 係選自K、C、D、E、R、V、F、L、2-胺基辛二酸、Dpr、Orn、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Tle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基， X6 係E、N、R、或D， X7 係I或V]。 式(I')及式(I")中，Linker3可為RRRGS、EEGGS或(PEG)1-8 (較佳為(PEG)4 )，或者不存在。又，可使胺基與式(I')之C末端胺基酸之末端(-COOH)結合而成為(-C(=O)NH2 )基。又，亦可使乙醯基與式(I")之N末端胺基酸之末端(-NH2 )結合而成為(CH3 -C(=O)-NH-)基。
作為具有上述式(I')及式(I")所表示之胺基酸序列之肽，可為Z-(Linker3)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )或(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )-(Linker3)-Z。較佳之胺基酸序列與上述式(I)所表示之肽中較佳之胺基酸序列相同。
一例中，作為Fc分子結合用IgBP，可列舉以下之肽。 乙醯基-K(Z)-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 乙醯基-K(Z)-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 乙醯基-K(Z)-(PEG)4 -GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 順丁烯二醯亞胺-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 順丁烯二醯亞胺-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 順丁烯二醯亞胺-(PEG)4 -GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 DBCO-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 DBCO-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 DBCO-(PEG)4 -GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 四𠯤-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 四𠯤-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 四𠯤-(PEG)4 -GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 TCO-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 TCO-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 TCO-(PEG)4 -GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2 乙醯基-K(Z)RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 乙醯基-K(Z)EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 乙醯基-K(Z)-(PEG)4 -DCAYHKGELVWCT-NH2 順丁烯二醯亞胺-RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 順丁烯二醯亞胺-EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 順丁烯二醯亞胺-(PEG)4 -DCAYHKGELVWCT-NH2 DBCO-RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 DBCO-EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 DBCO-(PEG)4 -DCAYHKGELVWCT-NH2 四𠯤-RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 四𠯤-EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 四𠯤-(PEG)4 -DCAYHKGELVWCT-NH2 TCO-RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 TCO-EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2 TCO-(PEG)4 -DCAYHKGELVWCT-NH2 (iv)包含下述式(II')所表示之胺基酸序列之肽、或包含於(II')之胺基酸序列中在除X9 ～X14 以外之位置上附加、缺失、及/或置換1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列的肽： X9 1-2 NMQX10 QX14 RFYEALHDPNLNEEQRNAX11 IX12 SIRDDX13 -(Linker2)-NH2 (序列編號61)      (II') [式(II')中，(Linker2)表示連接子， X9 1-2 選自由GF、AF、VF、LF、IF、MF、PF、FF、WF、KF、Orn-F、CF、DF、EF、beta丙胺酸-F、2-胺基辛二酸-F、Dpr-F、NH2 -(PEG)n -CO(其中，n＝1-50)-F、F、K、Orn、C、D、E、2-胺基辛二酸、Dpr、及乙醯基-K所組成之群， X10 係C或Q， X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、D、E、S、T、N、Q、Y、C、及K(Z)所組成之群， X13 係C或P，或者不存在， X14 係R、C、K、或K(Z)， Z係官能基]。
式(II')中，Linker2可為SGSGSK、SRRCR、SRRK(Z)R、SRRCRRCRRC、SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)、或(PEG)1-8 -Lys(較佳為(PEG)4 -Lys)，或者不存在。又，式(II')之N末端胺基酸之末端(-NH2 )可經乙醯化而成為(CH3 -C(=O)-NH-)基。又，連接子中所包含之Cys殘基(C)可視需要經由順丁烯二醯亞胺基而結合其他功能性分子。
作為具有上述式(II')所表示之胺基酸序列之肽，可較佳地列舉以下之肽。 [a]X9 選自由GF、AF、βAlaF、NH2 -(PEG)n -CO(n＝1～50)-F、F、K、Orn、C、Dpr、及乙醯基-K所組成之群。 [b]X9 選自由GF、F、及乙醯基-K所組成之群。 [c]X10 係Q。 [d]X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、及E所組成之群。 [e]X11 係R。 [f]X12 係R或K(Z)(較佳為，Z為疊氮基)。
作為具有上述式(II')所表示之胺基酸序列之肽，更具體而言，可列舉上述60)～66)中記載之肽(其中，所含離胺酸殘基可視需要結合官能基)。又，具體而言，作為Fc分子結合用IgBP，可列舉以下之肽： FNMQQQCRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD-NH2 FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-NH2 FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDP-SRRK(Z)R-NH2 FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDP-SRRCR-NH2 FNMQQQCRFYEALHDPNLNEEQRNARICSIRDDP-SRRCRRCRRC-NH2 FNMQQQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIK(Z)SIRDDP-SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)-NH2 乙醯基-KNMQQQCRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD-NH2 乙醯基-KNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-NH2 乙醯基-KNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDP- SRRK (Z)R-NH2 乙醯基-KNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDP -SRRCR-NH2 乙醯基-KNMQQQCRFYEALHDPNLNEEQRNARICSIRDDP - SRRCRRCRRC-NH2 乙醯基-KNMQQQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIK(Z)SIRDDP- SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)-NH2 GFNMQQQCRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD-NH2 GFNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-NH2 GFNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDP-SRRK(Z)R-NH2 GFNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDP-SRRCR-NH2 GFNMQQQCRFYEALHDPNLNEEQRNARICSIRDDP-SRRCRRCRRC-NH2 GFNMQQQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIK(Z)SIRDDP-SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)-NH2 FNMQCQZRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-NH2 乙醯基-KNMQCQZRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-NH2 GFNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-SRRK(Z)R-NH2 FNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-NH2 乙醯基-KNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC- SRRK(Z)R-NH2 GFNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)-NH2 乙醯基-KNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC- SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)-NH2 GFNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)-NH2 Fc分子結合用IgBP較佳為用以結合意圖與Fc分子結合之其他功能性分子之「官能基(Z)」與離胺酸殘基、N末端之胺基、或連接子結合，或者經由其他基或連接子與其他部分、例如C末端結合。本說明書中之「官能基」意指於穩定之條件下能夠與肽、蛋白質、核酸、或低分子醫藥進行反應而結合之基。作為官能基，可列舉：順丁烯二醯亞胺、硫醇或保護硫醇、醇、丙烯酸酯、丙烯醯胺、胺或保護胺、羧酸或保護羧酸、疊氮基、包含環炔之炔、包含環戊二烯及呋喃之1,3-二烯、α-鹵代羰基、N-羥基丁二醯亞胺基、N-羥基磺基丁二醯亞胺基、硝基苯酯、碳酸酯、二苯并環辛炔(DBCO)、四𠯤、甲基四𠯤(MTZ)、反式環辛烯(TCO)。
例如，本說明書之Fc分子結合用IgBP可於N末端或C末端(較佳為N末端)視需要經由連接子而結合有作為官能基之疊氮基。較佳為於IgBP之N末端及/或C末端上進而結合有1～3個(較佳為2個)麩胺酸之肽之末端具有疊氮基。具有疊氮基之IgBP藉由與具有二苯并環辛炔(Dibenzylcyclooctyne，DBCO)、炔、TCO之其他功能性分子進行點擊反應，而將該其他功能性分子與IgBP連結。又，Fc分子結合用IgBP與其他功能性物質之結合亦可藉由其他業者公知之方法、例如順丁烯二醯亞胺基與硫氫基之反應等而進行。
本說明書之Fc分子結合用IgBP可結合有其他功能性分子。例如，此種其他分子可經由上述官能基與(例如胺基末端等)結合，於Fc分子結合用IgBP中之胺基酸(例如離胺酸殘基)具有官能基之情形時，亦可與該官能基(例如，離胺酸殘基所具有之作為取代基之疊氮基)結合，或者還可經由順丁烯二醯亞胺基與Fc分子結合用IgBP中之Cys殘基(較佳為Linker，例如Linker2或Linker3中之Cys殘基)結合。
作為可與Fc分子結合用IgBP結合之其他功能性分子，包括包含肽、蛋白質、核酸、或低分子醫藥之標記物質或醫療用藥劑，但並不限於此。可結合能夠應用Fc分子之抗原特異性或其他特性之所有分子作為其他分子。作為此種物質，可列舉：抗癌劑、低分子醫藥品、放射性標記、螢光標記、核酸醫藥、基因治療藥、肽醫藥、IgA或VHH(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，單域重鏈抗體)等抗體等。
於經標記物質標記之情形時，藉由使Fc分子結合用IgBP與Fc分子形成複合體，可經由該標記物質進行Fc分子之檢測或定量。標記物質並無限定，例如包括：螢光色素、化學發光色素、放射性同位素(例如放射性碘或放射性同位素金屬離子之螯合錯合物、例如DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)或去鐵胺之螯合錯合物)、以及生物素及GFP(綠色螢光蛋白質)等螢光蛋白質、發光蛋白質、以及過氧化酶等酶，較佳之標記物質之例有：螢光素及FITC(Fluorescein Isothiocyanate，異硫氰酸螢光素)等螢光素衍生物、若丹明及四甲基若丹明等若丹明衍生物、以及德克薩斯紅等螢光色素。
於藉由其他藥劑來修飾Fc分子結合用IgBP之情形時，作為藥劑，並無限定，例如可列舉：奧瑞斯他汀E等奧瑞斯他汀、美登素、美坦辛、多柔比星、博來黴素、或其等之衍生物等抗癌劑；以及可與血腦障壁上之受體結合而轉移至中樞神經之藥劑、或能夠與癌細胞等結合並使抗體轉移至細胞內之藥劑等靶向劑。於連結藥劑之情形時，Fc分子結合用IgBP例如可藉由與用作醫藥抗體之IgG形成複合體而提高疾病之治療效果。
Fc分子結合用IgBP為了與抗體共價結合而具有至少一個胺基(-NH2 )。此種胺基可為胺基末端之胺基，亦可為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、二胺基丙酸、精胺酸殘基之側鏈胺基。
此種Fc分子結合用IgBP中之離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、二胺基丙酸、精胺酸殘基(較佳為離胺酸殘基)或1位之胺基酸之胺基可任意地藉由用以與抗體共價結合之交聯劑來修飾。於本說明書中，有時將如此經交聯劑修飾之IgBP稱為「CCAP試劑」。作為Fc分子結合用IgBP，較佳為CCAP試劑。本說明書中，「交聯劑」係指用以藉由共價鍵使IgBP與Fc分子連結之化學物質。只要為業者，便可適當選擇交聯劑，可製成具有至少2處可與所期望之胺基酸(例如，離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、二胺基丙酸、精胺酸殘基等)結合之部位的化合物。作為此種交聯劑，可列舉：DSG(二丁二醯亞胺基戊二酸酯)、DSS(二丁二醯亞胺基辛二酸酯)、DMA(二亞胺代己二酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMP(庚二醯亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMS(辛二醯亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DTBP(3,3'-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、及DSP(二硫代雙(丁二醯亞胺基丙酸酯))，較佳為DSG、DSS、或DSP。例如，DSS或DSG等包含丁二醯亞胺基之交聯劑由於會與離胺酸殘基之側鏈及多肽之N末端上所存在之一級胺發生反應，故可藉由將IgBP之N末端封端後與DSS或DSG進行反應，而利用DSS或DSG僅特異性修飾IgBP之離胺酸殘基之側鏈。只要為業者，便可適當選擇此種胺基酸殘基與交聯劑之組合。經交聯劑修飾之IgBP與IgG之間之交聯例如可於IgBP之上述X5 、X9 、X11 、X12 、X14 之胺基酸殘基與IgG之Fc區的Lys248或Lys246、較佳為Lys248之間部位特異性地產生。
較佳為，上述式(I)、(I')、(I")、(II)、及(II')所表示之肽中，最靠近C末端之半胱胺酸及最靠近N末端之半胱胺酸之2個半胱胺酸殘基彼此經由雙硫鍵或連接子連結而形成環狀肽。作為可用作此種連接子之2價基，例如可列舉：-CH2 -C(=O)-CH2 -基、-CH2 -C(=O)-基、-CH2 -C(=N-R)-CH2 -基、-CH2 -O-CH2 -基、-C(=O)-基、及-C(=N-R)-基(其中，R係可經取代之烷基，例如可經取代之C1～C6烷基、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、或己基，其中，作為經取代之情形時之取代基，例如可為羥基、(單或聚)環氧乙烷基、羧基、烷氧基、醯基、烷基、醯胺基、酯基、鹵基(F、Cl、Br、或I)、或其等之組合)。該連接子與通常之雙硫鍵相比，穩定性、例如耐鹼性或還原反應等耐性、較佳為耐鹼性優異。又，作為以此方式結合之2個半胱胺酸殘基，可列舉：式(I)、(I')、(I")中之位於X1 與X2 之間之半胱胺酸殘基及W與X8 之間之半胱胺酸殘基、以及式(II)、及(II')中之X10 與X13 同為半胱胺酸殘基之情形時之該等半胱胺酸殘基。
於本說明書中，K(Z)意指官能基結合離胺酸殘基，K(Z)較佳為K(Azide)。
又，本說明書之IgBP中，N末端之胺基酸之胺基可經乙醯化。又，本說明書之IgBP中，C末端之胺基酸之羧基可經醯胺化(結合有胺基)。又，進而，本說明書之IgBP中，其末端、或上述疊氮基與肽部分之間可視需要利用PEG(Polyethylene Glycol，聚乙二醇)進行修飾。於經PEG修飾之情形時，PEG之聚合度可設為2～10、3～8、4～7。
Fc分子於所含IgG之Fc區中具有2條成對對稱之重鏈恆定區之部分肽鏈(Fc鏈)，因此，存在2處Fc分子結合用IgBP之結合部位。因此，可於Fc分子1分子上結合0～2個Fc分子結合用IgBP。Fc分子1分子上結合有1個IgBP之Fc分子意指上述Fc分子中之2條對稱之來自重鏈恆定區之部分肽中之僅一條鏈上結合有IgBP之Fc分子。於本說明書中，將Fc分子1分子上未結合有Fc分子結合用IgBP之情況設為「0價」，將Fc分子1分子上結合有1個Fc分子結合用IgBP之情況設為「1價」，將Fc分子1分子上結合有2個Fc分子結合用IgBP之情況設為「2價」。再者，於本說明書中，Fc分子1分子這一用語意指包含可構成IgG1分子之成對之2個Fc區的分子。
本說明書中記載之胺基酸序列中，A係丙胺酸殘基，R係精胺酸殘基，N係天冬醯胺殘基，D係天冬胺酸殘基，C係半胱胺酸殘基，Q係麩醯胺殘基，E係麩胺酸殘基，G係甘胺酸殘基，H係組胺酸殘基，I係異白胺酸殘基，L係白胺酸殘基，K係離胺酸殘基，M係甲硫胺酸殘基，F係苯基丙胺酸殘基，P係脯胺酸殘基，S係絲胺酸殘基，T係蘇胺酸殘基，W係色胺酸殘基，Y係酪胺酸殘基，V係纈胺酸殘基。又，Hcy係升半胱胺酸，Dpr係二胺基丙酸，Orn係鳥胺酸殘基，βAla係β丙胺酸殘基，Dab係2,4-二胺基丁酸殘基，Nle係甘白胺酸殘基，Nva係正纈胺酸殘基，Tle係第三白胺酸殘基，Ala(t-Bu)係第三丁基丙胺酸殘基，且Cha係環己基丙胺酸殘基。又，側鏈具有胺基之殘基(離胺酸殘基、鳥胺酸殘基、2,4-二胺基丁酸殘基)中之胺基可視需要乙醯化。於本說明書中，天然及人工胺基酸之乙醯化形態有時亦可在上述胺基酸標記上帶有Ac之接頭語來記載，但應當理解，即便不記載為Ac，亦可包含乙醯化形態，除非是尤其如此理解會導致不一致之情況。K(Azide)表示疊氮基結合離胺酸殘基。 (利用純化之方法) 於一態樣中，本發明係關於一種方法，其係提高與(Fc分子結合)IgBP反應後之Fc分子組合物中之1價之比率的方法，其包括如下步驟： 使與Fc分子結合用IgBP發生(結合)反應而成之Fc分子和結合有與上述Fc分子結合用IgBP相同或不同之載體結合用IgBP之載體接觸，而使結合有上述Fc分子結合用IgBP之Fc分子與載體結合； 去除未與該載體結合之上述Fc分子；及 將與該載體結合之上述Fc分子回收。
上述純化方法中所使用之「與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子組合物」可藉由依據國際專利公開公報WO2008/054030、WO2013/027796、WO2016/186206、及WO2018/230257中記載之方法將Fc分子結合用IgBP與Fc分子混合而獲得。再者，於上述方法中，在第一個步驟之前，亦可包括如下步驟：使Fc分子結合用IgBP與Fc分子進行反應，從而獲得與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子組合物。較佳為，「與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子」意指經由上述交聯劑共價結合有Fc分子結合用IgBP之Fc分子。於Fc分子結合用IgBP經交聯劑修飾之情形時，關於該混合步驟之條件，只要在Fc分子結合用IgBP與Fc分子之間發生交聯反應之條件下進行，則並無特別限定，例如可藉由使Fc分子結合用IgBP與Fc分子於適當之緩衝液中在室溫(例如約15℃～30℃)下混合而進行反應。該混合步驟亦可視需要添加適量促進交聯反應之觸媒而進行。該混合步驟中之Fc分子結合用IgBP與Fc分子之混合比率並無特別限定，作為一例，IgBP：Fc分子之莫耳比率可設為1：1～20：1，較佳為2：1～20：1或5：1～10：1。關於該混合步驟中之混合時間(反應時間)，只要在Fc分子結合用IgBP與Fc分子之間發生交聯反應，則並無限定，例如可設為1分鐘～5小時，較佳為10分鐘～2小時或15分鐘～1小時。與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子組合物可進而視需要進行純化。純化可藉由本領域中公知之方法、例如凝膠過濾層析法、離子交換管柱層析法、親和層析法、逆相管柱層析法、及HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)等層析法等來進行。
本發明包括一種「結合有載體結合用IgBP之載體」。結合有載體結合用IgBP之載體例如可使載體結合用IgBP與具有胺基及反應性官能基之載體反應而製造。作為載體之形狀，可列舉：凝膠(例如管柱用凝膠)、粒子、珠粒、奈米粒子、微粒子、微珠粒、膜、微量盤、及陣列等形狀，作為其材質，可列舉：磁性物質、乳膠、瓊脂糖、玻璃、纖維素、瓊脂糖凝膠、硝化纖維素、聚苯乙烯、其他高分子材料。該載體較佳為管柱用凝膠。作為載體，例如可使用HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)等。反應係於兩者充分結合之條件下進行，例如可藉由在緩衝液中於室溫下使其等接觸1～5小時(較佳為2.5～3.5小時)而進行。
與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子與結合有載體結合用IgBP之載體的接觸係於兩者可充分接觸之條件下進行。例如，於載體為管柱之情形時，可藉由將與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子注入至載體結合用IgBP固定化管柱而進行。
可藉由常規方法來去除未與載體結合之上述Fc分子，例如可藉由利用緩衝液(pH值約7.0)將結合有Fc分子之載體洗淨而進行。
可於2.5以上之pH值下將與載體結合之Fc分子回收，但為了防止Fc分子改性，較理性為弱酸性度，較佳為pH3.6以上，進而，為了使1價修飾Fc分子以高比率溶出，為pH3.7以上，較佳為pH3.8以上，可設為pH3.8、pH3.9、pH4.0、pH4.1、pH4.2、pH4.3或其中任意2點間之值，例如可設為pH3.6～pH4.3、pH3.6～pH4.2、pH3.6～pH4.1、pH3.6～pH4.0、pH3.7～pH4.2、pH3.7～pH4.1、pH3.7～pH4.0、pH3.8～pH4.0或pH3.8～pH3.9。
作為所回收之Fc分子組合物中之1價Fc分子相對於全部Fc分子(100%)之比率，可設為55%以上、63%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上或98%以上。 (於載體上結合IgBP之方法) 於另一態樣中，本發明係關於一種方法，其係使用Fc分子結合用IgBP及載體結合用IgBP來製備1價Fc分子之方法，其包括如下步驟： 使Fc分子與結合有載體結合用IgBP之載體進行反應而獲得Fc分子結合載體； 使所獲得之Fc分子結合載體中之Fc分子與Fc分子結合用IgBP於載體上發生反應，而獲得(Fc分子結合用IgBP)-(Fc分子)-(載體結合用IgBP)-(載體)之結合物；及 自該載體將Fc分子結合用IgBP與Fc分子之結合物回收， 其中，上述Fc分子結合用IgBP與載體結合用IgBP可相同或不同。
本方法亦可包括如下步驟：藉由使用CCAP試劑作為Fc分子結合用IgBP，而利用交聯劑使抗體與Fc分子結合用IgBP共價結合。進而，本方法亦可包括如下步驟：使Fc分子結合用IgBP與其他功能性分子結合。該等步驟可在自載體回收Fc分子結合用IgBP與Fc分子之結合物之前於載體上進行，亦可針對自載體回收之Fc分子結合用IgBP與Fc分子之結合物進行。
結合有載體結合用IgBP之載體可依據上述純化方法中記載之方法來製造。
Fc分子與結合有載體結合用IgBP之載體之反應可依據上述純化方法中記載之與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子和結合有載體結合用IgBP之載體的接觸方法來進行。
載體結合Fc分子與Fc分子結合用IgBP之反應可藉由使兩者接觸而進行。反應溫度可設為4℃～室溫，反應pH值可設為4.5～6.0。反應時間較佳為3小時以上，更佳為6小時以上、12小時以上。於載體為管柱之情形時，作為所使用之Fc分子結合用IgBP之濃度，可設為10～60 μM、或20～40 μM。IgBP、較佳為Fc分子結合用IgBP與交聯劑結合，Fc分子與Fc分子結合用IgBP之反應包含交聯反應。
可藉由和上述純化方法中記載之與載體結合之Fc分子之回收同樣之方式自載體回收Fc分子結合用IgBP與Fc分子之結合物。
作為所回收之Fc分子組合物中之1價Fc分子相對於全部Fc分子(100%)的比率，可設為53%以上、55%以上、56%以上、59%以上、80%以上、85%以上、86%以上或89%以上。
作為1價Fc分子之製備方法中所獲得之1價Fc分子相對於所使用之全部Fc分子(100%)的比率，可設為39%以上(或40%以上、50%以上、55%以上、或74%以上)。
於載體為管柱之情形時，本法可使用高效液相層析儀進行自動化。於自動化之情形時，以0.03～1 mL/分鐘、或0.05～1 mL/分鐘使10～60 μM之Fc分子結合用IgBP溶液流動10分鐘來進行。 (官能基結合Fc分子之製備方法) 於一態樣中，本發明亦包括一種導入有1價官能基或1個其他功能性分子之Fc分子之製造方法。此種官能基或其他功能性分子可經由IgBP上之官能基、Cys殘基、Lys殘基、或胺基等結合性基而導入，亦可藉由使IgBP與Fc分子結合後使Fc分子之Cys殘基或Lys殘基等結合性基與具有官能基之化合物或功能性分子共價結合而導入。作為步序，可藉由上述方法使1價Fc分子結合用IgBP結合至Fc分子後再結合所需之官能基或其他功能性分子，或者亦可使用結合有此種官能基或其他功能性分子之Fc分子結合用IgBP來實施上述方法，藉此使導入有官能基或其他功能性分子之Fc分子結合用IgBP與Fc分子結合。
又，已知使用Fc分子結合用IgBP使官能基或其他功能性分子共價結合並導入至Fc分子上後，可去除Fc分子結合用IgBP(Kei Yamada等人，(2019)Angew.Chem.；131：5648-5653)。即，使Fc分子結合用IgBP結合於Fc分子上後，使Fc分子之Cys殘基或Lys殘基等結合性基與具有官能基之化合物或功能性分子共價結合，使Fc分子結合用IgBP自Fc分子解離後，Fc分子結合用IgBP可自Fc分子上被切斷去除。又，該步驟亦可於載體上針對載體結合用IgBP與Fc分子之結合物來進行。因此，本發明之導入有1價官能基或1個其他功能性分子之Fc分子亦可不包含Fc分子結合用IgBP。
即，本發明係關於一種製備Fc分子組合物之方法，上述Fc分子組合物包含多個Fc分子(官能基結合Fc分子)，上述Fc分子係Fc分子1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有官能基且未結合有IgBP者，上述方法包括如下步驟：(i)使Fc分子與結合有載體結合用IgG親和性肽(載體結合用IgBP)之載體反應而獲得Fc分子結合載體；(ii)使經由可裂解連接子(Cleavable Linker)結合有交聯劑之Fc分子結合用IgG親和性肽(可裂解(Cleavable)交聯劑(Crosslinking agent)結合IgBP：CCB-IgBP)與所獲得之Fc分子結合載體中之Fc分子反應，而獲得CCB-IgBP與Fc分子之結合物；(iii)使上述交聯劑與上述Fc分子反應而使其共價結合；(iv)使上述連接子裂解，而切斷交聯劑與Fc分子結合用IgBP之間之鍵結；(v)使Fc分子結合用IgBP自Fc分子解離，而獲得經由載體結合用IgBP結合於載體上之官能基結合Fc分子、及游離之Fc分子結合用IgBP；及(vi)自上述載體回收官能基結合Fc分子；其中，上述Fc分子結合用IgBP與載體結合用IgBP可相同或不同；其中，上述可裂解連接子與交聯劑之間可存在包含官能基之基；其中，官能基結合Fc分子中所包含之官能基係上述可裂解連接子與交聯劑之間所存在之官能基(參照圖11(E))、或者因連接子裂解而產生之基(參照圖10(C))。 (功能性分子結合Fc分子之製備方法) 本發明係關於一種方法，其係製備Fc分子組合物之方法，上述Fc分子組合物包含多個Fc分子(功能性分子結合Fc分子)，上述Fc分子係Fc分子1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有功能性分子且未結合有IgBP者，上述方法包括如下步驟：(i)使Fc分子與結合有載體結合用IgG親和性肽(載體結合用IgBP)之載體反應而獲得Fc分子結合載體；(ii)使經由可裂解連接子(Cleavable Linker)結合有交聯劑之Fc分子結合用IgG親和性肽(可裂解(Cleavable)交聯劑(Crosslinking agent)結合IgBP：CCB-IgBP)與所獲得之Fc分子結合載體中之Fc分子反應，而獲得CCB-IgBP與Fc分子之結合物；(iii)使上述交聯劑與上述Fc分子反應而使其共價結合；(iv)使上述連接子裂解，而切斷交聯劑與Fc分子結合用IgBP之間之鍵結；(v)使Fc分子結合用IgBP自Fc分子解離，而獲得經由載體結合用IgBP結合於載體上之官能基結合Fc分子、及游離之Fc分子結合用IgBP；(vi)使功能性分子與官能基結合Fc分子之官能基結合而獲得功能性分子結合Fc分子；及(vii)自上述載體回收功能性分子結合Fc分子；其中，上述Fc分子結合用IgBP與載體結合用IgBP可相同或不同；其中，上述可裂解連接子與交聯劑之間可存在包含官能基之基；其中，官能基結合Fc分子中所包含之官能基係上述可裂解連接子與交聯劑之間所存在之官能基(參照圖11(E))、或者因連接子裂解而產生之基(參照圖10(C))。再者，於本方法中，(vi)之功能性分子之結合步驟與(vii)之自載體回收Fc分子之步驟中任一步驟皆可先進行。
又，本發明係關於一種方法，其係製備Fc分子組合物之方法，上述Fc分子組合物包含多個Fc分子，上述Fc分子係Fc分子1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有功能性分子之功能性分子結合Fc分子，且未結合有IgBP，上述方法包括如下步驟：(i)使Fc分子與結合有載體結合用IgG親和性肽(載體結合用IgBP)之載體反應而獲得Fc分子結合載體；(ii)使經由可裂解連接子(Cleavable Linker)結合有交聯劑之Fc分子結合用IgG親和性肽(可裂解(Cleavable)交聯劑(Crosslinking agent)結合IgBP：CCB-IgBP)與所獲得之Fc分子結合載體中之Fc分子反應，而獲得CCB-IgBP與Fc分子之結合物；(iii)使上述交聯劑與上述Fc分子反應而使其共價結合；(iv)使上述連接子裂解，而切斷交聯劑與Fc分子結合用IgBP之間之鍵結；(v)使Fc分子結合用IgBP自Fc分子解離，而獲得經由載體結合用IgBP結合於載體上之功能性分子結合Fc分子、及游離之Fc分子結合用IgBP；及(vi)自上述載體回收功能性分子結合Fc分子；其中，上述Fc分子結合用IgBP與載體結合用IgBP可相同或不同；其中，上述可裂解連接子與交聯劑之間結合有功能性分子(參照圖11(E))。
「官能基結合Fc分子」意指未結合有IgBP且結合有官能基之Fc分子。官能基可經由連接子、交聯劑、及/或其他結構與Fc分子結合。「功能性分子結合Fc分子」意指未結合有IgBP且結合有官能基之Fc分子。功能性分子可經由連接子、交聯劑、及/或其他結構與Fc分子結合。「CCB-IgBP」只要為藉由可裂解連接子之分解而切斷交聯劑與IgBP之結構，即只要以(交聯劑)-(可裂解連接子)-(IgBP)之順序結合，則亦可包含其他物質，例如可為(交聯劑)-(欲導入至Fc分子中之物質或結構)-(可裂解連接子)-(IgBP)。其中，欲導入至Fc分子中之物質或結構之代表例係功能性分子或包含官能基之基。
於本案中，「可裂解連接子(Cleavable Linker)」係指Fc分子結合用IgG親和性肽與交聯劑之間之鍵結會因酸性條件、鹼性條件、還原、酸化、酶處理、光照射或β脫離分解而被切斷之具有結合基的連接子，例如可列舉：雙硫鍵、縮醛鍵、酯鍵、及醯胺鍵。又，此種可裂解連接子之一例係作為切斷性部分記載於WO2018/199337中。 (組合物) 於另一態樣中，本發明係關於一種包含藉由上述純化方法或製備方法所獲得之IgBP結合Fc分子的組合物。即，本發明係關於一種Fc分子組合物，其特徵在於，僅結合有1個IgBP之Fc分子相對於全部Fc分子之比率高於藉由先前之CCAP法所合成之IgBP結合Fc分子中之該比率。此處，先前之CCAP法係指於試管內使IgBP與Fc分子結合之CCAP法，使用該用語之目的在於與如本發明般之使用IgBP結合載體之方法區分開來。更具體而言，先前之CCAP法包括國際專利公開公報WO2008/054030、WO2013/027796、及WO2016/186206中記載之方法。
較佳為，本發明之組合物中，將全部Fc分子設為100%時，僅結合有1個IgBP之Fc分子之比率為52%以上、53%以上、55%以上、56%以上、59%以上、63%以上、70%以上、80%以上、85%以上、86%以上、89%以上、90%以上、95%以上、或98%以上。
本發明之組合物可視需要製成醫療用或診斷用組合物。於本發明之組合物為醫療用組合物(治療用及/或預防用組合物)之情形時，IgBP較佳為利用例如上述藥劑進行修飾，於包含在診斷用組合物中之情形時，IgBP較佳為利用例如上述標記物質進行修飾。醫療用或診斷用組合物之對象疾病可藉由選擇要使用之Fc分子或結合藥劑而適當設定，例如可列舉：可藉由抗體而靶向化之疾病或障礙、較佳為癌症、炎症性疾病、感染症、及神經退化性疾病。
例如，醫療用或診斷用組合物可以注射劑之形式使用，包括靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、肌肉注射劑、點滴注射劑等劑型。此種注射劑可藉由根據公知之方法例如使IgBP結合Fc分子在通常用於注射劑之無菌之水性或油性液中溶解、懸浮或乳化來製備。所製備之注射液通常填充於適當之安瓿、小玻璃瓶、注射器中。又，亦可藉由向IgBP結合Fc分子中添加適當之賦形劑，而製備冷凍乾燥製劑，於使用時利用注射用水、生理食鹽水等使其溶解而製成注射液。再者，一般而言，抗體等蛋白質之經口投予難以進行，因為其會被消化系統分解，但藉由抗體片段或經修飾之抗體片段及劑型之創意辦法，經口投予亦可能進行。作為經口投予之製劑，例如可列舉：膠囊劑、錠劑、糖漿劑、顆粒劑等。
醫療用或診斷用組合物較佳為製備成與活性成分投予量相容之投藥單位之劑型。作為此種投藥單位之劑型，可例示注射劑(安瓿、小玻璃瓶、預填充式注射器)，每個投藥單位劑型中通常含有5～500 mg、5～100 mg、10～250 mg之IgBP結合Fc分子。
醫療用或診斷用組合物可局部投予，亦可全身投予。投予方法並無特別限制，如上所述係非經口投予或經口投予。作為非經口投予路徑，可列舉對皮下、腹腔內、血中(靜脈內、或動脈內)或脊髓液之注射或點滴等，較佳為對血中之投予。醫療用或診斷用組合物可在某一時期投予，亦可持續性或斷續性投予。例如，投予亦可為1分鐘～2週之持續投予。
關於醫療用或診斷用組合物之投予，只要為能夠獲得所期望之治療效果或預防效果之投予量及投予時期，則並無特別限定，可根據症狀、性別、年齡等而適當決定。例如，在產生上述疾病之臨床症狀之前及/或後，藉由靜脈注射1個月1～10次左右、較佳為1個月1～5次左右來投予通常0.01～20 mg/kg體重左右、較佳為0.1～10 mg/kg體重左右、進而較佳為0.1～5 mg/kg體重左右作為有效成分之1次量較為合適。於其他非經口投予及經口投予之情形時，亦可投予以此為基準之量。
以下，使用實施例對本發明詳細地進行說明，但其並不限定本發明之範圍。再者，本案說明書整體所引用之文獻係以參照之方式整體併入本案說明書中。 (材料) 蛋白A管柱、蛋白G管柱、以及肽固定化用管柱係使用HiTrap Protein A HP Columns、HiTrap Protein G HP、HiTrap NHS-activated HP(1 ml，GE Healthcare)管柱。 (實施例1)利用CCAP法所獲得之抗體偶聯物之血中半衰期 (1)利用CCAP法製作抗體偶聯物 向溶解於20 mM乙酸緩衝液(pH4.5)之8 μM抗AVM(阿巴汀)抗體(人類IgG4)5 ml中添加溶解於DMSO中之CCAP試劑Azide-PEG4-EEGPDCAYH(丁二醯亞胺基戊二醯基Lys)GELVWCTFH(序列編號69)-NH2 (Azide-EEIgBP，534 μM)154μL(最終濃度16 μM)，於室溫下使其反應1小時。將該溶液之一部分(抗體3 μg)注入至與Nexera-i(Shimazu)連接之陰離子交換管柱Shodex QA825(Shodex)中，於10 mM之Tris(三羥甲基胺基甲烷)緩衝液(pH8.0)中，進行0至1 M之NaCl之梯度溶出，將所得之結果示於圖1中。對所獲得之1價抗體及2價抗體進行分取，利用PBS(Phosphate-buffered saline，磷酸鹽緩衝生理鹽水)進行透析後，用於血中半衰期測定用之樣本。 (2)血中半衰期之測定 使用小鼠，對抗阿巴汀(AVM)抗體之經Azide-EEIgBP肽試劑修飾之1價抗體、2價抗體之血中半衰期進行測定。以5 mg/kg向ICR小鼠i.v.投予(各群3隻)對照抗體(AVM)、肽一價附加抗體(AVM-pep1)、肽二價附加抗體(AVM-pep2)，對1小時後、4小時後、24小時後、48小時後、72小時後、168小時後之血清中抗體濃度進行解析。 (3)結果 圖2係表示自抗體投予起1小時後、4小時後、24小時後、48小時後、72小時後、及168小時後之血清中抗體濃度之解析結果。表1係根據該實驗之血清中抗體濃度之變化來對藥物動力學參數進行解析而得者。如表1所示，可知1價抗體之半衰期(T1/2β＝264 h)與未修飾抗體(T1/2β＝268 h)大致相等，相對於此，2價抗體與未修飾抗體相比，半衰期為大致一半(T1/2β＝139 h)。即，可知1價修飾不會對血中半衰期造成較大影響，但2價修飾會使得修飾抗體之血中半衰期大幅減弱。
[表1] 表1 1價抗體、2價抗體之小鼠血中半衰期之參數
   t1/2α (h) t1/2β (h) AUC0-t (μg・h/mL) AUC0- ∞ (μg・h/mL) CL (L/h/kg) Vdss (L/kg) MRT (h)
AVM 11.6±2.3 284±144 6490±490 18000±7400 0.305±0.102 107±14 394±205
AVM 1價肽 9.29±3.43 264±85 5350±750 14200±4400 0.382±0.143 129±18 367±121
AVM 2價肽 7.54±0.98 139±33 1720±320 2500±520 2.06±0.42 297±82 146±39
於將藉由CCAP法製成之偶聯物抗體用作醫藥品之情形時，使用血中半衰期與未修飾體相同之1價修飾體在保持藥劑之生物活性方面亦極為重要。然而，於利用CCAP法製作偶聯物之情形時，亦如圖1所示，除必然生成1價抗體以外，亦伴隨生成2價抗體。因此，明確知道，需要於生成反應之階段抑制2價抗體之生成並且提高1價抗體之生成效率，或者有效率地去除2價抗體而以高純度純化1價抗體之方法。 (實施例2)抗體結合管柱之製作 (1)IgBP固定化管柱之製作 使用F-moc法固相合成N末端上附加有GS連接子之IgG結合肽IgBP(WO2013/027796)：NH2 -GSGGS- DCAYHRGELVWCT- CONH2 (MW：1895.06)(序列編號70)，去保護後，利用逆相HPLC進行純化。使冷凍乾燥後之肽14 mg溶解於50 mM之Tris緩衝液(pH8.6)0.25 mL中，於室溫下放置1小時。藉由LC-MS(連接有Acquity UPLC之SQ detector，Waters)確認形成SS鍵之後，以最終為1%之方式添加TFA(Trifluoroacetic acid，三氟乙酸)而使其為酸性。將該溶液應用於逆相管柱(Sep-Pak C18)中，利用0.1%TFA洗淨後，藉由包含0.1%TFA之60%乙腈進行溶出，去除有機溶劑後，進行冷凍乾燥。
用0.2 M之NaHCO3 (pH值＝8.3)2.88 mL將溶解於DMSO之7.5 mM肽溶液0.720 mL稀釋後，每次1 ml(肽量：1.5 μmol)緩慢地將其注入至經5 mL之1 mM HCl洗淨過之HiTrap NHS-activated HP(1 ml，GE Healthcare)管柱(3根)中，注入後於室溫下放置3小時。利用0.2 M NaHCO3 (pH值＝8.3)5 mL洗淨後，利用包含6 mL之0.5 M NaCl之0.5 M單乙醇胺-HCl(pH7.5)進行封端(10分鐘)，並利用包含6 mL之0.5 M NaCl之0.1 M乙酸鈉-HCl緩衝液(pH4.0)進行洗淨，該等操作交替地反覆進行3次。最後，利用5 mL之20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)於管柱內進行置換，於4℃下進行保管。關於以此方式製作之3根管柱中之肽之固定化量，根據其相對於投予肽之比率，評價為72.7%(1090.5 nmol)、77.4%(1161 nmol)及73.1%(1096.5 nmol)。 (2)Z33固定化管柱之製作 使用F-moc法固相合成C末端上導入有用以進行管柱固定化之連接子部的IgG結合肽Z33(Braisted，A.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：5688-92(1996))：乙醯基- FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDPSGSGSK-NH2 )(序列編號71)，去保護後，利用逆相HPLC進行純化。使冷凍乾燥後之肽23.8 mg溶解於330 μL之DMSO中而製備15 mM之溶液。向該肽溶液250 μL中加入同量之DMSO，利用2.0 mL之0.2 M NaHCO3 (pH值＝8.3)稀釋之後，每次1 ml(肽量：1.5 μmol)將其放入經5 mL之1 mM HCl洗淨過之HiTrap NHS-activated HP(1 ml，GE Healthcare)管柱(2根)中，於室溫下放置3小時。利用0.2 M NaHCO3 (pH值＝8.3)5 mL洗淨後，利用包含6 mL之0.5 M NaCl之0.5 M單乙醇胺-HCl(pH7.5)進行封端(10分鐘)，並利用包含6 mL之0.5 M NaCl之0.1 M乙酸鈉-HCl緩衝液(pH4.0)進行洗淨，該等操作交替地反覆進行3次。最後，利用5 mL之20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)於管柱內進行置換，於4℃下進行保管。關於以此方式製作之2根管柱中之肽之固定化量，根據其相對於投予肽之比率，評價為60.8%(912 nmol)、40.5%(608 nmol)。 (3)IgBP固定化管柱之溶出條件以及DBC(Dynamic binding capacity，動態結合容量)之評價 將IgBP經固定化之1 ml之管柱(IgBP固定化量：995 nmol)連接於NGCTM 層析系統(BioRad)，使20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)以2 mL/分鐘流動5分鐘，藉此使其平衡化。注入溶解於20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)50 mL中之人類IgG1抗體1 mg，利用磷酸緩衝液(pH7.0)洗淨3分鐘後，使用pH3.5、3.0及2.5之0.1 M甘胺酸鹽酸之溶出液進行第1次溶出2.5分鐘。進而，利用pH2.5之0.1 M甘胺酸鹽酸進行第2次溶出，最後利用20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)進行初始化(圖3及圖4)。
圖4中示出了第1次溶出時之放大圖。隨著pH值自3.5降低至3.0及2.5，溶出時間趨於變早，但所溶出之抗體之波峰面積亦於各pH值間幾乎無差，又，pH2.5下之第2次溶出時未溶出任何物質，由此可知本管柱中之抗體之溶出可於pH3.5下充分進行。
繼而，使用相同之管柱，進行DBC(Dynamic binding capacity)之評價。使20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)以1.0 mL/分鐘於與NGCTM 層析系統(BioRad)連接之管柱中流動10分鐘，藉此使其平衡化，將以0.98 mg/ml溶解於該緩衝液中之源自人類血清之IgG(SIGMA，＃14506，Lot＃SLBR0560V)溶液30 mL以1 mL/分鐘注入至其中。根據自管柱漏出之中點求出DBC，可知結果為47 mg。又，利用緩衝液以1 mL/分鐘洗淨6分鐘後，使用0.1 M甘胺酸鹽酸(pH3.5)，以流速2.0 mL/分鐘使所結合之IgG溶出，根據溶出後之蛋白質之A280之吸光度，算出結合於管柱上之抗體量，結果為42 mg(總IgG抗體量係以1 mg/mL＝Abs280：1.38之形式計算)。 (4)Z33固定化管柱之溶出條件以及DBC(Dynamic binding capacity)之評價 對所製作之Z33固定化管柱之抗體之溶出條件進行探究。將Z33經固定化之1 ml管柱(IgBP固定化量：912 nmol)連接於NGCTM 層析系統(BioRad)，使20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)以1 mL/min流動10分鐘，藉此使其平衡化。注入溶解於20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)10 mL中之人類IgG1抗體1 mg，利用磷酸緩衝液(pH7.0)洗淨6分鐘後，以流速2 mL/分鐘，使用pH2.5及pH3.5之0.1 M甘胺酸鹽酸之溶出液使其溶出(圖5)。可知於任一pH值下進行溶出時，均觀察到了良好之溶出行為，可於pH3.5下充分地自本管柱溶出。
其次，使用相同之管柱，進行DBC(Dynamic binding capacity)之評價。使20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)以1.0 mL/分鐘於與NGCTM 層析系統(BioRad)連接之管柱中流動10分鐘，藉此使其平衡化，將以0.67 mg/ml溶解於該緩衝液中之源自人類血清之IgG(SIGMA，＃14506，Lot＃SLBR0560V)溶液50 mL以1 mL/分鐘注入至其中。根據自管柱漏出之中點求出DBC，可知結果為26 mg。又，利用緩衝液以2 mL/分鐘洗淨3分鐘後，使用0.1 M甘胺酸鹽酸(pH3.5)，以流速2.0 mL/分鐘使所結合之IgG溶出，根據溶出後之蛋白質之A280之吸光度，算出結合於管柱上之抗體量，結果為19 mg(總IgG抗體量係以1 mg/mL＝Abs280：1.38之形式計算)。 (5)管柱上之CCAP修飾體之利用離子交換管柱之解析 自親和管柱以洗淨組分或溶出組分之形式回收之抗體之解析係將各溶液0.05 mL注入至與Nexera-i(Shimazu)連接之陽離子交換管柱Shodex SP825(Shodex)中，於10 mM乙酸緩衝液(pH值＝5.5)中，藉由0至0.3 M之NaCl梯度溶出來進行。 (實施例3)使用IgBP固定化管柱之1價抗體之純化 (1)使用IgBP固定化管柱之2價抗體之去除 使10 mg(67 nmol)之曲妥珠單抗溶解於3.3 ml之20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)中，添加溶解於DMSO之70 mM之CCAP試劑(MTZ-DBCO-N3 -(PEG)7 -RRDCAYHKGELVWCT(序列編號72)-NH2 )2.9 μL(202 nmol)，並於室溫下使其反應一夜。取出一部分(約3 μg)，將其注入至連接有疏水層析用管柱TSKgel Butyl-NPR(4.6 mm I.D.×10 cm，Tosoh)之Simadzu LC2040(Shimazu)中，以流速0.5 ml/分鐘，於A液(包含1.5 M硫酸銨之25 mM磷酸緩衝液pH7.0)至B液(包含20%異丙醇之25 mM磷酸緩衝液pH7.0)之20分鐘梯度下進行溶出(圖6A)。將剩餘之反應物注入至IgBP固定化管柱中，利用20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)洗淨後，利用0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH3.5)使其溶出。將此時自管柱流穿之組分及利用酸性溶液溶出之組分之疏水層析法分析結果示於圖6B及C中。可知於IgBP管柱中，IgG及CCAP試劑之反應物中所存在之2價抗體自IgBP管柱流穿而被去除，可僅對未修飾體及1價抗體進行純化(圖6C)。 (9)藉由使用Z33固定化管柱之CCAP法自反應物去除2價抗體 利用疏水層析用管柱分析以與上述(8)相同之方法製備之樣本之一部分(約3 μg)(圖7A)。將剩餘之反應物注入至Z33固定化管柱中，利用20 mM磷酸緩衝液(pH7.0)洗淨後，利用0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH3.5)進行溶出。將此時自管柱流穿之組分及利用pH3.5溶液溶出之組分之疏水層析法分析結果示於圖7B及C中。可知Z33管柱亦與IgBP管柱同樣地，IgG及CCAP試劑之反應物中之2價抗體自IgBP管柱流穿，藉由利用酸性溶液使吸附於管柱上之抗體溶出，可高效率地對未修飾體及1價抗體進行純化。 (10)利用溶出時之pH值控制之1價抗體純化 如上所述，於IgBP中，可將2價抗體和1價抗體及未修飾抗體之混合物分離，但1價抗體與未修飾抗體之分離無法實現。因此，嘗試藉由控制溶出時之pH值而使1價抗體與未修飾抗體分離。即，使曲妥珠單抗與CCAP試劑(IgBP-N3 -RRRSS-SG)以莫耳比1：1於室溫下反應2小時後，將反應物應用於經0.1 M乙酸緩衝液(pH5.5)平衡化之IgBP管柱，利用該緩衝液洗淨後，利用0.1 M乙酸緩衝液(pH4.0、pH3.9、pH3.8、pH3.7)或0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH3.6)進行第1階段溶出後，利用0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH3.5)進行第2階段溶出。
如圖8A所示，於第1階段溶出中，於pH3.6-4.0之所有條件下，均獲得了溶出波峰，於第2階段溶出中，僅於第1階段pH3.6下溶出時未觀察到波峰。圖8B中示出了pH3.8下之第1階段溶出時之各組分之離子交換層析法之結果，流穿液組分中，2價抗體作為主要成分溶出，第1階段溶出組分中，1價抗體作為主要成分溶出，第2階段溶出組分中，2價抗體作為主要成分溶出，可知藉由IgBP管柱，該等成分被徹底地分離。表2中彙總了各條件下之各組分中之0、1、2價抗體之含量。可知第1階段溶出pH4.0-3.7之各條件雖然在純度上存在若干差異，但均以95%以上之高純度進行了1價抗體之純化。另一方面，可知於pH3.6之第1階段溶出中，0價抗體及1價抗體同時溶出，無法分離。
[表2]
Figure 02_image015
(實施例4)IgBP固定化管柱、蛋白A或蛋白G管柱上之利用CCAP反應之1價抗體之製備 可知前項為止，藉由使用IgBP管柱控制溶出時之pH值，能夠以95%以上之高純度進行1價抗體之純化。然而，難以抑制在溶液中伴隨著反應而生成2價抗體，因此從整體來看，作為1價抗體之產量，只能以供反應使用之抗體之最大50%多之產量回收。因此，於本項中，對如下方法進行了探究：在使抗體暫時先吸附於IgBP管柱或者蛋白A或蛋白G管柱上之狀態下使其與CCAP試劑發生反應，藉此抑制2價抗體之生成，並且優先合成1價抗體。
利用0.1 M乙酸緩衝液10 mL(pH5.5)將1 mg之曲妥珠單抗稀釋，並將其注入至經該緩衝液平衡化之IgBP管柱中。其後，使此前利用緩衝液稀釋為20或60 μM之CCAP試劑溶液於1 ml管柱中流動。將該管柱於室溫或4℃下培養3小時或12小時，利用5 ml之0.1 M乙酸緩衝液(pH5.5)將管柱洗淨後，利用0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH3.5)5 mL進行溶出。藉由實施例2中使用之陽離子交換管柱層析法對各條件下自反應物回收之流穿液組分、以及溶出組分進行分析，並計算各組分中之0、1、2價抗體之含有比率(%)。將結果示於表3中(自洗淨液中回收者僅為2價抗體，因此僅示出2價抗體之含有比率)。
於表3之1-4之條件中使固定化於IgBP管柱上之IgG以20 μM之CCAP試劑濃度於室溫下反應12小時之情形時(條件2)，溶出組分中所包含之1價抗體之生成率係整體(流穿液組分＋溶出組分)之74%，於進行比較之各個條件中，1價抗體之比率最高。於此情形時，雖然2價抗體不包含於溶出組分中，但於洗淨組分中觀察到了14%之2價抗體。為了提高1價抗體之生成率，將CCAP試劑之濃度設為3倍之60 μM(條件3)，但溶出組分中之1價抗體之比率最高，為89%(其餘11%為0價抗體)。再者，於此情形時，流穿液組分中之2價抗體增加至56%，整體中之1價抗體比率止於39%。另一方面，為了減少洗淨組分中2價抗體之比率，將反應時間自12小時縮短為3小時，結果流穿液組分中溶出之2價抗體於整體中之比率如預期減少為7%，但溶出組分中1價抗體之比率為59%(其餘41%為0價抗體)，相比於條件2(86%)及3(89%)有所降低。又，在出於相同目的，保持反應時間為12小時不變，將反應溫度自室溫變更為4℃之情形時(條件4)，流穿液組分中2價抗體之比率亦如預期減少為2%，表明整體中1價抗體之比率達到了55%(溶出組分中之比率亦為56%)。
作為比較例，使用蛋白A及蛋白G管柱作為與IgBP具有相同功能之市售管柱，於管柱上進行相同反應，將其結果示於表3中。蛋白A及蛋白G於抗體上之結合位點與IgBP大致相同，係Fc之CH2與CH3間之邊界區域，因而認為能夠以相同機制抑制CCAP試劑引起之2價抗體之生成。使用該等管柱之反應之特徵在於，流穿液組分中未見IgBP管柱中所觀察到之2價抗體(條件5-9)。可能是因為蛋白A及蛋白G與IgBP不同，該等配體於抗體上之結合位點並非1處(例如蛋白A及G於Fab區中亦具有結合位點)，因此，即便因為CCAP反應而於管柱中生成2價抗體，亦能夠繼續結合於管柱上。為了支持支持這一點，pH3.5下自蛋白A及G管柱溶出之溶出組分中不僅包含0價、1價抗體，而且包含2價抗體(表2之條件5-9)。可知純化使用IgBP管柱之理由在於，由於目的在於自溶出回收物去除2價抗體，因此蛋白A及G管柱不適於管柱上之利用CCAP反應之1價抗體之製備。
[表3]
Figure 02_image017
(實施例5)與高效液相層析儀連接之IgBP管柱上之自動化CCAP反應 為了提高利用CCAP反應製作偶聯物之再現性，解決方案之一係該反應之自動化。因此，根據圖9A之方案所示之流程，使用與高效液相層析儀(NGC，BioRad)連接之IgBP管柱對由CCAP反應所得之各修飾抗體之產率進行研究。自動化CCAP反應係使用NGC(BioRad)層析儀，按照以下之步驟進行。 1)注入mAb：使1 mg之抗體溶解於0.1 M乙酸緩衝液(pH5.5)20 mL中，以1 mL/分鐘自S1Port1注入(20分鐘)。 2)洗淨：以1 mL/分鐘使0.1 M乙酸緩衝液(pH5.5)流動10分鐘以將管柱洗淨(10分鐘)。 3)試劑：將在0.1 M乙酸緩衝液(pH5.5)中經稀釋之CCAP試劑(10、20、30、40 μM IgBP N3 RRR-SG)1 mL以0.1 mL/分鐘注入(10分鐘)。 4)洗淨：以1 mL/分鐘使0.1 M乙酸緩衝液(pH5.5)流動10分鐘以將管柱洗淨。 5)溶出：以1 mL/分鐘使0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH3.5)流動10分鐘以使結合物自管柱溶出。 6)再生：以1 mL/分鐘使0.1 M乙酸緩衝液(pH5.5)流動12分鐘以使管柱再生。
關於溶出組分，利用與實施例4相同之方法對所含成分進行了分析(圖9B)。於10 μM之試劑中，僅檢測出了極少1價抗體之生成，但添加20-40 μM之CCAP試劑時，確認到溶出組分中以52-59%之比率生成了1價抗體(其餘為0價抗體)。進而，雖然將試劑濃度提昇至60 μM，但1價抗體之生成率未上升，為57.8%。另一方面，於該等實驗中，與表1及2之實驗相比，反應試劑與抗體之接觸時間更短為10分鐘。因此，將CCAP試劑之注入速度設為流速0.05 mL/分鐘，將接觸時間延長為2倍，但1價抗體之生成率為53.9%，均未觀察到生成率增加(均未示出資料)。實際上於該等條件下，2價抗體之生成率係所回收之抗體整體之2%以下，由此認為不會導致大幅之產量損失。
以上之結果表明，藉由使用IgBP管柱之自動化CCAP反應，能夠以52-59%之比率獲得1價抗體。 [相關申請案之相互參照]
本國際申請案基於2019年10月24日向日本專利廳提出申請之申請案第2019-193830號而主張優先權，藉由參照而將申請案第2019-193830號之全部內容援用於本國際申請案中。
圖1係表示將CCAP試劑Azide-PEG4-EEGPDCAYH(succinimidyl glutaryl Lys)GELVWCTFH-NH2 (Azide-EEIgBP)與抗AVM(阿巴汀)抗體(人類IgG4)發生反應所獲得之溶液之一部分(抗體3 μg)注入陰離子交換管柱Shodex QA825(Shodex)中並進行0至1 M之NaCl之梯度溶出所得之結果的曲線圖。曲線圖之上段表示未反應之抗AVM抗體之結果，下段表示與Azide-EEIgBP發生反應之抗AVM抗體之結果。下段之各箭頭表示溶出之未修飾抗體、1價抗體、2價抗體之波峰。縱軸表示280 nm下之吸光度，橫軸表示溶出時間。 圖2係表示以5 mg/kg對ICR(Institute of Cancer Research，美國癌症研究所)小鼠i.v.投予(每個群3隻)對照抗體(AVM)、肽一價附加抗體(AVM-pep1)、肽二價附加抗體(AVM-pep2)，對1小時後、4小時後、24小時後、48小時後、72小時後、168小時後之血清中抗體濃度進行解析所得之結果。縱軸係抗體濃度(μg/mL)，橫軸係投予後之經過時間(小時)。AVM投予個體用四邊形標記表示，AVM-pep1投予個體用圓形標記表示，AVM-pep2投予個體用三角形標記表示。 圖3係表示將人類IgG1注入IgBP固定化管柱中後，以pH3.5(上段)、pH3.0(中段)、及pH2.5(下段)進行第1次溶出，以pH2.5進行第2次酸性溶出時之層析圖。縱軸表示280 nm下之吸光度，橫軸表示經過時間。曲線圖最下部表示該經過時間內對管柱進行之操作。 圖4係表示圖3中「第1次溶出」之經過時間部分之放大層析圖。曲線圖自上而下依序表示第1次溶出為pH3.5、pH3.0、及pH2.5時之結果。 圖5係表示將人類IgG1抗體注入Z33固定化管柱中後，以pH2.5及pH3.5進行溶出時之層析圖。曲線圖之灰線表示pH2.5時之結果，黑線表示pH3.5時之結果。縱軸表示280 nm下之吸光度，橫軸表示經過時間。 圖6係表示利用IgBP管柱所分級之IgG及CCAP試劑(IgBP-PEG7-N3-DBCO-MTZ-SG)之反應物之疏水層析法解析結果的曲線圖。(A)係IgG(20 μM)及CCAP試劑(60 μM)之30分鐘後之反應物。(B)係來自IgBP管柱之反應物之流穿液組分。(C)係吸附於IgBP管柱上之吸附組分(酸性溶出組分)。縱軸表示280 nm下之吸光度，橫軸表示經過時間。 圖7係表示利用Z33管柱所分級之IgG及CCAP試劑(Z33-R7C-Mal-PEG4MTZ-SG)之反應物之疏水層析法解析結果的曲線圖。(A)係IgG(20 μM)及CCAP試劑(60 μM)之30分鐘後之反應物。(B)係來自Z33管柱之反應物之流穿液組分。(C)係吸附於Z33管柱上之吸附組分。縱軸表示280 nm下之吸光度，橫軸表示經過時間。 圖8係表示藉由使用IgBP管柱來控制溶出pH值而由曲妥珠單抗(Trastuzumab)及CCAP試劑之反應物純化1價抗體的曲線圖。縱軸表示280 nm下之吸光度，橫軸表示經過時間。(A)表示第1階段之溶出pH值所導致之溶出模式之差異。自上而下依序表示第1階段之溶出pH值設為4.0、3.9、3.8、3.7、及3.6時之結果。(B)係表示利用陽離子交換層析法分析pH3.8下之第1階段溶出中之流穿液組分(上段)、第1階段溶出(pH3.8)(中段)、第2階段溶出(pH3.5)(下段)組分中之0價(未修飾)、1價、2價抗體之含量而得之結果的曲線圖。 圖9係表示與高效液相層析儀(NGC，BioRad)連接之IgBP管柱上之自動化CCAP反應之結果的曲線圖。(A)表示利用自動化CCAP反應進行之抗體修飾之自動化過程的流程。(B)係表示自動化CCAP反應中由CCAP試劑之濃度差異所產生之管柱溶出組分之陽離子交換層析法解析結果的曲線圖。自上而下依序表示使用10 μM、20 μM、30 μM、及40 μM之CCAP試劑的結果。縱軸表示280 nm下之吸光度，橫軸表示經過時間。曲線圖中之數值表示所獲得之抗體之IgBP之結合價數及其比率。 圖10(A)係使用抗體作為Fc分子時於載體上製造本發明之IgBP結合Fc分子之方法的模式圖。首先，使Fc分子與結合有載體結合用IgBP之載體接觸，經由載體結合IgBP使載體與Fc分子結合。使Fc分子結合用IgBP與該處接觸，而使其與未結合有IgBP之Fc鏈結合。最後，切斷載體結合用IgBP與Fc分子之結合，將1分子上結合有1個抗體結合用IgBP之Fc分子回收。(B)係在上段之(A)中使用CCAP試劑製造IgBP結合Fc分子之方法的模式圖。針對(A)之步驟，進而追加包括如下步驟：使Fc分子結合用IgBP與Fc分子結合後，使交聯劑與Fc分子共價結合。(C)係使用抗體結合用IgBP與交聯劑經由可裂解連接子連結之試劑來製造1價官能基結合Fc分子之方法的模式圖。使Fc分子結合用IgBP與Fc分子結合後，使交聯劑與Fc分子共價結合。由於交聯劑與抗體結合用IgBP經由可裂解連接子而連結，故而藉由在連接子部分切斷，使Fc分子結合用IgBP自Fc分子解離，能夠在不包含IgBP之情況下將1價官能基導入至Fc分子中。 圖11(D)係結合有1價官能基或功能性分子之Fc分子之製造方法之模式圖。於圖10之方法(C)中，進而包括如下步驟：於連接子部分切斷後使包含官能基之化合物或功能性分子與Fc分子結合。再者，於本模式圖中，使「F」所表示之官能基或功能性分子與Fc分子結合之後將其自載體回收，但亦可自載體回收後使官能基或功能性分子與Fc分子結合。(E)係使用包含官能基之基或功能性分子經由可裂解連接子與Fc分子結合用IgBP結合且該包含官能基之基或功能性分子進而與交聯劑結合的試劑來製造結合有1價官能基或功能性分子的Fc分子之方法的模式圖。與(C)同樣地，藉由使交聯劑與Fc分子共價結合後，進行連接子之裂解及抗體結合用IgBP之解離，能夠獲得未結合有IgBP之1價官能基結合Fc分子或功能性分子結合Fc分子。
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Claims (24)

  1. 一種提高與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子中Fc分子每1分子上結合有1個Fc分子結合用IgBP之Fc分子之比率的方法，其包括如下步驟： 使與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子與結合有與上述Fc分子結合用IgBP相同或不同之載體結合用IgBP之載體接觸，而使上述與Fc分子結合用IgBP反應後之Fc分子與載體結合； 去除未與該載體結合之上述Fc分子；及 將與該載體結合之上述Fc分子回收。
  2. 如請求項1之方法，其中Fc分子係IgG或Fc融合蛋白質。
  3. 如請求項1或2之方法，其中載體結合用IgBP係以下之(i)或(ii)之肽： (i)下述式(I)所表示之肽： NH2 -(Linker)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )  (I) [式(I)中，(Linker)表示連接子，1～3個X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、及1～3個X8 分別相互獨立地表示相同或不同之胺基酸殘基， 各X1 、X2 、X3 及各X8 相互獨立地表示相同或不同之除C以外之任意胺基酸殘基， X4 係H、R、S、或D， X5 係選自K、C、D、E、R、V、F、L、2-胺基辛二酸、Dpr、Orn、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Tle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基， X6 係E、N、R、或D， X7 係I或V]； (ii)下述式(II)所表示之肽、或包含於(II)之胺基酸序列中在除X9 ～X13 以外之位置上附加、缺失、及/或置換1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列的肽： X9 1-2 NMQX10 QRRFYEALHDPNLNEEQRNAX11 IX12 SIRDDX13 -(Linker2)-CONH2 (序列編號60)        (II) [式(II)中，(Linker2)表示連接子，X9 1-2 選自由GF、AF、VF、LF、IF、MF、PF、FF、WF、KF、Orn-F、CF、DF、EF、βAla-F、2-胺基辛二酸-F、Dpr-F、及NH2 -(PEG)n -CO(n＝1～50)-F、F、K、Orn、C、D、E、2-胺基辛二酸殘基、及Dpr所組成之群， X10 係C或Q， X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、D、E、S、T、N、Q、Y、及C所組成之群， X13 係C或P]。
  4. 如請求項1或2之方法，其中Fc分子結合用IgBP係以下之(iii)或(iv)之肽： (iii)下述式(I')或(I")所表示之肽： Z-[(Linker3)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )] (I') [(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )-(Linker3)]-Z     (I") [式(I')及式(I")中， Z表示官能基， (Linker3)表示連接子， 1～3個X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、及1～3個X8 分別相互獨立地表示相同或不同之胺基酸殘基， 各X1 、X2 、X3 及各X8 相互獨立地表示相同或不同之除C以外之任意胺基酸殘基， X4 係H、R、S、或D， X5 係選自K、C、D、E、R、V、F、L、2-胺基辛二酸、Dpr、Orn、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Tle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基， X6 係E、N、R、或D， X7 係I或V] (iv)包含下述式(II')所表示之胺基酸序列之肽、或包含於(II')之胺基酸序列中在除X9 ～X14 以外之位置上附加、缺失、及/或置換1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列的肽： X9 1-2 NMQX10 QX14 RFYEALHDPNLNEEQRNAX11 IX12 SIRDDX13 -(Linker2)-NH2 (序列編號61)      (II') [式(II')中，(Linker2)表示連接子，X9 1-2 選自由GF、AF、VF、LF、IF、MF、PF、FF、WF、KF、Orn-F、CF、DF、EF、βAla-F、2-胺基辛二酸-F、Dpr-F、及NH2 -(PEG)n -CO(n＝1～50)-F、F、K、Orn、C、D、E、2-胺基辛二酸殘基、Dpr、及乙醯基-K所組成之群， X10 係C或Q， X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、D、E、S、T、N、Q、Y、C、及K(Z)所組成之群， X13 係C或P，或者不存在， X14 係R、C、K(Z)， Z係官能基]。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中載體係管柱。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中Fc分子組合物中Fc分子1分子上結合有1個IgBP之Fc分子相對於全部Fc分子的比率為55%以上。
  7. 一種製備Fc分子組合物之方法，上述Fc分子組合物包含多個IgBP結合Fc分子，上述IgBP結合Fc分子於具有Fc區之分子(Fc分子)1分子上僅結合有1個Fc分子結合用IgG親和性肽(Fc分子結合用IgBP)，上述方法包括如下步驟： 使Fc分子與結合有載體結合用IgG親和性肽(載體結合用IgBP)之載體反應而獲得Fc分子結合載體； 使所獲得之Fc分子結合載體中之Fc分子與Fc分子結合用IgBP反應，而獲得Fc分子結合用IgBP與Fc分子之結合物；及 切斷載體結合用IgBP與Fc分子之結合，自上述載體回收Fc分子結合用IgBP與Fc分子之結合物； 其中，上述Fc分子結合用IgBP與載體結合用IgBP可相同或不同。
  8. 如請求項7之方法，其中載體結合用IgBP係以下之(i)或(ii)之肽： (i)下述式(I)所表示之肽： NH2 -(Linker)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )  (I) [式(I)中，(Linker)表示連接子，1～3個X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、及1～3個X8 分別相互獨立地表示相同或不同之胺基酸殘基， 各X1 、X2 、X3 及各X8 相互獨立地表示相同或不同之除C以外之任意胺基酸殘基， X4 係H、R、S、或D， X5 係選自K、C、D、E、R、V、F、L、2-胺基辛二酸、Dpr、Orn、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Tle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基， X6 係E、N、R、或D， X7 係I或V]； (ii)下述式(II)所表示之肽、或包含於(II)之胺基酸序列中在除X9 ～X13 以外之位置上附加、缺失、及/或置換1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列的肽： X9 1-2 NMQX10 QRRFYEALHDPNLNEEQRNAX11 IX12 SIRDDX13 -(Linker2)-CONH2 (序列編號60)            (II) [式(II)中，(Linker2)表示連接子，X9 1-2 選自由GF、AF、VF、LF、IF、MF、PF、FF、WF、KF、Orn-F、CF、DF、EF、βAla-F、2-胺基辛二酸-F、Dpr-F、及NH2 -(PEG)n -CO(n＝1～50)-F、F、K、Orn、C、D、E、2-胺基辛二酸殘基、及Dpr所組成之群， X10 係C或Q， X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、D、E、S、T、N、Q、Y、及C所組成之群， X13 係C或P]。
  9. 如請求項7或8之方法，其中Fc分子結合用IgBP係以下之(iii)或(iv)之肽： (iii)下述式(I')或(I")所表示之肽： Z-[(Linker3)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )] (I') [(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )-(Linker3)]-Z     (I") [式(I')及式(I")中， Z表示官能基， (Linker3)表示連接子， 1～3個X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、及1～3個X8 分別相互獨立地表示相同或不同之胺基酸殘基， 各X1 、X2 、X3 及各X8 相互獨立地表示相同或不同之除C以外之任意胺基酸殘基， X4 係H、R、S、或D， X5 係選自K、C、D、E、R、V、F、L、2-胺基辛二酸、Dpr、Orn、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Tle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基， X6 係E、N、R、或D， X7 係I或V] (iv)包含下述式(II')所表示之胺基酸序列之肽、或包含於(II')之胺基酸序列中在除X9 ～X14 以外之位置上附加、缺失、及/或置換1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列的肽： X9 1-2 NMQX10 QX14 RFYEALHDPNLNEEQRNAX11 IX12 SIRDDX13 -(Linker2)-NH2 (序列編號61)      (II') [式(II')中，(Linker2)表示連接子，X9 1-2 選自由GF、AF、VF、LF、IF、MF、PF、FF、WF、KF、Orn-F、CF、DF、EF、βAla-F、2-胺基辛二酸-F、Dpr-F、及NH2 -(PEG)n -CO(n＝1～50)-F、F、K、Orn、C、D、E、2-胺基辛二酸殘基、Dpr、及乙醯基-K所組成之群， X10 係C或Q， X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、D、E、S、T、N、Q、Y、C、及K(Z)所組成之群， X13 係C或P，或者不存在， X14 係R、C、K(Z)， Z係官能基]。
  10. 如請求項7至9中任一項之方法，其中載體係管柱。
  11. 如請求項10之方法，其中使Fc分子與結合有載體結合用IgBP之載體反應而獲得Fc分子結合載體之步驟係藉由將Fc分子注入結合有載體結合用IgBP之管柱中來進行，且使結合於載體上之Fc分子與Fc分子結合用IgBP反應而獲得Fc分子結合用IgBP與Fc分子之結合物的步驟係藉由將Fc分子結合用IgBP注入結合有Fc分子之管柱中來進行。
  12. 如請求項11之方法，其中所獲得之Fc分子1分子上結合有1個IgBP之Fc分子相對於所注入之Fc分子之總量的比率為55%以上。
  13. 如請求項7至12中任一項之方法，其中所獲得之Fc分子結合用IgBP與Fc分子之結合物中Fc分子1分子上結合有1個IgBP之Fc分子相對於全部Fc分子的比率為55%以上。
  14. 一種製備Fc分子組合物之方法，上述Fc分子組合物包含多個Fc分子(官能基結合Fc分子)，上述Fc分子係Fc分子1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有官能基且未結合有IgBP者，上述方法包括如下步驟： (i)使Fc分子與結合有載體結合用IgG親和性肽(載體結合用IgBP)之載體反應而獲得Fc分子結合載體； (ii)使經由可裂解連接子結合有交聯劑之Fc分子結合用IgG親和性肽(CCB-IgBP)與所獲得之Fc分子結合載體中之Fc分子反應，而獲得CCB-IgBP與Fc分子之結合物； (iii)使上述交聯劑與上述Fc分子反應而使其共價結合； (iv)使上述連接子裂解，而切斷交聯劑與Fc分子結合用IgBP之間之鍵結； (v)使Fc分子結合用IgBP自Fc分子解離，而獲得結合於載體上之官能基結合Fc分子、及游離之Fc分子結合用IgBP；及 (vi)自上述載體回收官能基結合Fc分子； 其中，上述Fc分子結合用IgBP與載體結合用IgBP可相同或不同； 其中，上述可裂解連接子與交聯劑之間可存在包含官能基之基； 其中，官能基結合Fc分子中所包含之官能基係上述可裂解之連接子與交聯劑之間所存在之官能基、或者因連接子裂解而產生之基。
  15. 一種製備Fc分子組合物之方法，上述Fc分子組合物包含多個Fc分子(功能性分子結合Fc分子)，上述Fc分子係Fc分子1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有功能性分子且未結合有IgBP者，上述方法包括如下步驟： (i)使Fc分子與結合有載體結合用IgG親和性肽(載體結合用IgBP)之載體反應而獲得Fc分子結合載體； (ii)使經由可裂解連接子結合有交聯劑之Fc分子結合用IgG親和性肽(CCB-IgBP)與所獲得之Fc分子結合載體中之Fc分子反應，而獲得CCB-IgBP與Fc分子之結合物； (iii)使上述交聯劑與上述Fc分子反應而使其共價結合； (iv)使上述連接子裂解，而切斷交聯劑與Fc分子結合用IgBP之間之鍵結； (v)使Fc分子結合用IgBP自Fc分子解離，而獲得結合於載體上之官能基結合Fc分子、及游離之Fc分子結合用IgBP； (vi)使功能性分子與官能基結合Fc分子之官能基結合而獲得功能性分子結合Fc分子；及 (vii)自上述載體回收功能性分子結合Fc分子； 其中，上述Fc分子結合用IgBP與載體結合用IgBP可相同或不同； 其中，上述可裂解連接子與交聯劑之間可存在包含官能基之基； 其中，官能基結合Fc分子中所包含之官能基係上述可裂解連接子與交聯劑之間所存在之官能基、或者因連接子裂解而產生之基。
  16. 一種製備Fc分子組合物之方法，上述Fc分子組合物包含多個Fc分子，上述Fc分子係Fc分子1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有功能性分子之功能性分子結合Fc分子，且未結合有IgBP，上述方法包括如下步驟： (i)使Fc分子與結合有載體結合用IgG親和性肽(載體結合用IgBP)之載體反應而獲得Fc分子結合載體； (ii)使經由可裂解連接子結合有交聯劑之Fc分子結合用IgG親和性肽(CCB-IgBP)與所獲得之Fc分子結合載體中之Fc分子反應，而獲得CCB-IgBP與Fc分子之結合物； (iii)使上述交聯劑與上述Fc分子反應而使其共價結合； (iv)使上述連接子裂解，而切斷交聯劑與Fc分子結合用IgBP之間之鍵結； (v)使Fc分子結合用IgBP自Fc分子解離，而獲得經由載體結合用IgBP結合於載體上之功能性分子結合Fc分子、及游離之Fc分子結合用IgBP；及 (vi)自上述載體回收功能性分子結合Fc分子； 其中，上述Fc分子結合用IgBP與載體結合用IgBP可相同或不同； 其中，上述可裂解連接子與交聯劑之間結合有功能性分子。
  17. 如請求項14至16中任一項之方法，其中載體係管柱。
  18. 如請求項14至17中任一項之方法，其進而包括如下步驟：在使上述連接子裂解而切斷交聯劑與Fc分子結合用IgG親和性肽(Fc分子結合用IgBP)之間之鍵結後並且切斷載體結合用IgBP與Fc分子之結合而自上述載體回收官能基結合Fc分子之前，使其他功能性分子與上述官能基結合。
  19. 一種Fc分子組合物，其特徵在於：以下之(a)～(c)中之任一比率均高於在試管內藉由CCAP法合成時之上述比率： (a)具有IgG之Fc區之分子(Fc分子)相對於全部Fc分子之比率，上述具有IgG之Fc區之分子僅結合有1個與IgG之Fc區特異性結合之IgG親和性肽(IgBP)； (b)具有Fc區之分子(Fc分子)1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有官能基之官能基結合Fc分子相對於全部Fc分子的比率；或者 (c)具有Fc區之分子(Fc分子)1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有其他功能性分子之官能基結合Fc分子相對於全部Fc分子的比率。
  20. 一種Fc分子組合物，其特徵在於：以下之(a)～(c)中任一比率為55%以上： (a)具有IgG之Fc區之分子(Fc分子)相對於全部Fc分子之比率，上述具有IgG之Fc區之分子僅結合有1個與IgG之Fc區特異性結合之IgG親和性肽(IgBP)； (b)具有Fc區之分子(Fc分子)1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有官能基之官能基結合Fc分子相對於全部Fc分子的比率；或者 (c)具有Fc區之分子(Fc分子)1分子中所存在之2條Fc鏈中僅1條鏈上結合有其他功能性分子之官能基結合Fc分子相對於全部Fc分子的比率。
  21. 如請求項19或20之組合物，其中Fc分子係IgG或Fc融合蛋白質。
  22. 如請求項19至21中任一項之組合物，其中上述IgBP相同或不同，係與IgG之Fc區特異性結合之以下(iii)或(iv)之肽： (iii)下述式(I')或(I")所表示之肽： Z-[(Linker3)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )] (I') [(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )-(Linker3)]-Z     (I") [式(I')及式(I")中， Z表示官能基， (Linker3)表示連接子， 1～3個X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、及1～3個X8 分別相互獨立地表示相同或不同之胺基酸殘基， 各X1 、X2 、X3 及各X8 相互獨立地表示相同或不同之除C以外之任意胺基酸殘基， X4 係H、R、S、或D， X5 係選自K、C、D、E、R、V、F、L、2-胺基辛二酸、Dpr、Orn、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Tle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基， X6 係E、N、R、或D， X7 係I或V]； (iv)包含下述式(II')所表示之胺基酸序列之肽、或包含於(II')之胺基酸序列中在除X9 ～X14 以外之位置上附加、缺失、及/或置換1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列的肽： X9 1-2 NMQX10 QX14 RFYEALHDPNLNEEQRNAX11 IX12 SIRDDX13 -(Linker2)-NH2 (序列編號61)      (II') [式(II')中，(Linker2)表示連接子，X9 1-2 選自由GF、AF、VF、LF、IF、MF、PF、FF、WF、KF、Orn-F、CF、DF、EF、βAla-F、2-胺基辛二酸-F、Dpr-F、及NH2 -(PEG)n -CO(n＝1～50)-F、F、K、Orn、C、D、E、2-胺基辛二酸殘基、Dpr、及乙醯基-K所組成之群， X10 係C或Q， X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、D、E、S、T、N、Q、Y、C、及K(Z)所組成之群， X13 係C或P，或者不存在， X14 係R、C、K(Z)， Z係官能基]。
  23. 如請求項19至22中任一項之組合物，其係醫療用或診斷用組合物。
  24. 一種載體，其結合有以下(i)或(ii)之肽： (i)下述式(I)所表示之肽： NH2 -(Linker)-(X1 1-3 )-C-(X2 )-(X3 )-(X4 )-(X5 )-G-(X6 )-L-(X7 )-W-C-(X8 1-3 )  (I) [式(I)中，(Linker)表示連接子，1～3個X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、及1～3個X8 分別相互獨立地表示相同或不同之胺基酸殘基， 各X1 、X2 、X3 及各X8 相互獨立地表示相同或不同之除C以外之任意胺基酸殘基， X4 係H、R、S、或D， X5 係選自K、C、D、E、R、V、F、L、2-胺基辛二酸、Dpr、Orn、AcOrn、AcDab、Dab、Nle、Nva、Tle、Ala(t-Bu)、及Cha之1個胺基酸殘基， X6 係E、N、R、或D， X7 係I或V]； (ii)下述式(II)所表示之肽、或包含於(II)之胺基酸序列中在除X9 ～X13 以外之位置上附加、缺失、及/或置換1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列的肽： X9 1-2 NMQX10 QRRFYEALHDPNLNEEQRNAX11 IX12 SIRDDX13 -(Linker2)-CONH2 (序列編號60)       (II) [式(II)中，(Linker2)表示連接子，X9 1-2 選自由GF、AF、VF、LF、IF、MF、PF、FF、WF、KF、Orn-F、CF、DF、EF、βAla-F、2-胺基辛二酸-F、Dpr-F、及NH2 -(PEG)n -CO(n＝1～50)-F、F、K、Orn、C、D、E、2-胺基辛二酸殘基、及Dpr所組成之群， X10 係C或Q， X11 及X12 分別獨立地選自由R、H、D、E、S、T、N、Q、Y、及C所組成之群， X13 係C或P]。
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