KR20170115306A - 단일사슬항체조각과 바이러스 외피 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단일사슬항체조각(scFv)과 바이러스 외피 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단일사슬항체조각과 바이러스 외피 단백질이 결합된 융합단백질은 바이러스 외피 단백질의 자가조립 특성을 통해 나노클러스터를 형성하며, 이를 통한 항원인식부위의 클러스터링 효과에 의해 단일사슬항체조각의 항원결합력이 향상되는 것을 확인하였는바, 다양한 항원인식부위를 갖는 단일사슬항체조각 서열을 이용하여 융합단백질을 제조하는 경우 항원 검출에 효과적인 폴리클로날 항체시스템 확보 및 이를 이용한 진단키트, 단백질 칩 등의 개발이 가능하다. 또한, 상기 나노클러스터의 내부 또는 표면에 치료제제 또는 진단/검출제제를 도입함으로써 질병의 치료 또는 진단을 위한 약물 전달체로 유용하게 이용될 수 있다.
한편, 상기 융합단백질의 N-말단 및 C-말단에 각각 말토스 결합 단백질(MBP) 및 히스티딘 태그를 융합시킴으로써 정제 순도 및 발현량이 증진되고, 용해도가 현저히 향상된 융합단백질을 수득할 수 있으며, 또한, 상기 융합단백질은 대장균 단백질 발현 시스템을 이용하므로 상대적으로 항체 생산에 비해 생산 비용 및 시간을 절감할 수 있는 장점이 있다.

Description

단일사슬항체조각과 바이러스 외피 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{Novel fusion proteins comprising single chain fragment variable and viral coat protein, and uses thereof}
본 발명은 단일사슬항체조각(scFv)과 바이러스 외피 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
바이러스 외피 단백질은 바이러스의 구조를 형성하는 단백질로서, 자가조립 능력이 있어 수십~수백 개의 단량체가 모여서 거대한 구형 혹은 막대형의 삼차원적 구조를 형성하는 독특한 특성을 나타낸다. 예컨대, 브롬모자이크바이러스(Brome Mosaic Virus; BMV)의 경우 180개의 단량체가 모여 구형입자를 형성하게 되며, 그 크기는 외경이 약 30 nm이고 내경은 약 20 nm이다.
바이러스 외피 단백질은 다양한 조건에 따라 단량체로 흩어지기도 하고 단량체가 결합한 나노클러스터를 형성하기도 하는데 이러한 특성을 이용하면 바이러스 외피 단백질 내에 다양한 물질을 포집할 수 있다. 일반적으로는 나노클러스터 모양의 바이러스 외피 단백질은 내부에 핵산, 금속, 산화철(iron oxide)을 가지고 있으나, 이외에도 산화망간, 산화코발트, 산화니켈, 산화인듐, 황화철, 황화카드뮴, 셀레노카드뮴, 셀레노아연 등 다양한 무기 금속을 포함시키는 사례들이 보고되고 있다. 따라서 바이러스 외피 단백질의 내ㆍ외부는 분자생물학적 방법을 통해 다양한 기능단을 도입할 수 있으며, 다양한 기능단이 도입된 바이러스 외피 단백질 구조체는 선택적인 방법으로 적절한 기능단을 이용한 수식(modification)이 가능하며 필요한 다양한 물리화학적 성질을 부여할 수 있는 장점을 가지게 된다.
한편, 표적지향형 약물전달시스템이란 약물을 치료부위에 선택적으로 전달함으로써 건강한 조직을 약물에 노출시키지 않음과 동시에 소량의 약물만으로도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있도록 설계된 기술을 말한다. 표적지향형 약물전달시스템을 이용하게 되면 질병이 있는 인체의 특정 부위에 약물을 집중시킴으로써 약물치료 효과를 극대화할 수 있으며, 항암제 등 독성이 강한 약물에 의한 부작용을 최소화시킬 수 있다. 최근에는 표적지향적 약물전달 시스템을 이용하여 치료와 진단을 동시에 할 수 있는 테라노시스(Theranosis = Therapy+diagnosis) 기술개발이 활발히 진행되고 있다. 즉, 표적지향형 약물전달 시스템에 분자영상 추적자(molecular imaging probe)를 부착하고 비침습성 생체영상화 장비(non-invasive in vivo imaging)를 이용하여 추적자를 영상화함으로써 약물전달과 동시에 치료과정을 실시간으로 모니터링할 수 있는 기술을 말한다.
표적지향성을 부여하는 대표적인 물질로써 신호펩티드와 항체가 많이 이용되고 있다. 항체는 척추동물의 면역반응으로 생성되는 단백질로서, 항원의 특정 부위를 특이적으로 인식하고 결합하여 항원의 작용을 비활성시키거나 제거시키는 면역 단백질인데, 표적지향성 물질로 일반적이나 항체의 특정부위를 선택적으로 수식(modification)하는 것이 매우 어려운 기술로 알려져 있다. 항체는 중쇄(heavy chain) 2개와 경쇄(light chain) 2개를 가지며 기본적으로 Y자형을 이루고 있다. 경쇄와 중쇄의 가변영역이 합쳐져 항원결합부위(antigen binding site)가 형성되는데 이 부위를 인위적으로 펩타이드 링커를 통해 연결한 작은 단편인 단일사슬항체조각(single chain variable fragment;, scFv)을 이용하여 항체의 기능을 수행하고자 하는 연구가 진행되고 있다.
단일사슬항체조각은 일반 항체에 비해 크기가 작기 때문에 조직이나 암 조직으로의 침투율이 높고, 대장균시스템을 비롯한 다양한 발현시스템에서 대량생산이 가능하며, 다양한 분자생물학적 수식이 가능하고 생산에 드는 시간과 비용을 절감할 수 있는 장점이 있다. 그러나 크기가 작고 Fc 부위가 없기 때문에 인체 내에서 반감기가 짧다는 단점을 가진다. 예컨대, 보고된 TSH(thyroid stimulating hormone)-페리틴의 경우, 대장균에서 발현은 되나 침전이 형성되고 자가조립이 이루어지지 않는 문제가 있어 추가적인 강산을 이용하는 리폴딩 과정이 필수적으로 요구된다. 이는 기능성 단백질 나노입자의 제조에 많은 시간과 비용이 소모되며, 또한 단백질을 변성시킴으로써 고유의 기능(선택성, 결합력, 안정성)에도 악영향을 줄 수 있다.
의약품 전달체로는 생체 세포막의 구성성분인 인지질을 주성분으로 하는 리포좀과 같은 나노구조체가 많이 사용된다. 그러나 리포좀은 세포 내 독성이 높고 약물로 주입되었을 때 대식세포의 식작용으로 순환계에서 소실되는 등의 문제점을 가지고 있다. 다른 나노구조체인 마이셀은 친수성과 소수성 부위를 동시에 가진 사슬형 분자로 이루어진 전달체로서, 수용액 상에서 중심부는 소수성 부분이 서로 모여 구형을 이루게 되며, 보통 난용성 약물을 중심부에 포집시켜 용해도를 증가시키고 생체 이용률을 높이는데 이용된다. 항암치료제의 경우 나노입자를 이용한 약물전달체는 수동적 표적지향 방법인 EPR(enhanced permeability and retention)효과를 통해 암 조직에 선택적으로 축적이 되는 방법을 이용하나, 항상 일정한 효과를 기대하기 어려운 단점이 있다.
따라서 보다 효과적인 표적화를 위하여 표적 부위에서 발현되는 항원이나 수용체를 인지할 수 있는 항체가 결합된 약물전달체를 사용하는 방법이 개발되었다. 현재 표적화를 위한 항체의 고정화 방법으로 사용되는 화학적 공유결합 형성 방법은 재현성이 떨어지고 항체의 고유한 기능을 손상시킬 우려가 있다. 일반의약품과 마찬가지로 생물 유래 의약품의 경우도 제조과정에서 구조적 변화가 동반될 경우, 식약청으로부터 의약품으로 허가를 받기 위해서는 구조변화의 정확한 규명, 약물의 약효 증명 및 독성시험 등을 수행하여야 한다. 따라서 항체 고정화의 재현성 확보 없이는 항체를 이용한 표적지향형 약물전달시스템을 인체에 적용하는 것은 거의 불가능한 실정이다.
상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 단일사슬항체조각의 활용성을 향상시키는 방법의 개발을 위해 예의 연구한 결과, 단일사슬항체조각과 바이러스 외피 단백질이 융합된 단백질을 제조하였고, 상기 융합단백질은 바이러스 외피단백질의 자가조립 특성에 의해 나노클러스터를 형성하고 이에 따라 항원 결합능이 향상되는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 단일사슬항체조각(scFv)과 바이러스 외피 단백질이 결합된, 융합단백질 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 나노클러스터, 상기 나노클러스터를 포함하는 진단키트, 및 단백질 칩을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 나노클러스터에 약물이 도입된 것을 포함하는, 약물 전달체 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 나노클러스터를 이용한 항원 검출방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일사슬항체조각(scFv)과 바이러스 외피 단백질이 결합된 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 단일사슬항체조각은 바이러스 외피 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단일사슬항체조각은 항체의 중쇄단편 및 경쇄단편을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 바이러스 외피 단백질은 브롬모자이크바이러스(brome mosaic virus) 또는 꽃양배추모자이크바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 브롬모자이크바이러스 및 꽃양배추모자이크바이러스 유래 외피 단백질은 각각 서열번호 1 및 서열번호 8의 염기서열에 의해 암호화된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 융합단백질은 C-말단에 히스티딘 태그(Histidine tag) 또는 N-말단에 말토스 결합 단백질(maltose binding protein)이 추가로 융합된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 융합단백질의 제조방법을 제공한다.
(a) 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 제작된 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환체로부터 융합단백질을 발현시킨 후 상기 발현된 융합단백질을 수득하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는, 나노클러스터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 나노클러스터는 융합단백질을 구성하는 바이러스 외피 단백질의 자가조립에 의해 형성되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노클러스터에 약물이 도입된 것을 포함하는, 약물 전달체 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 약물은 치료제제 또는 진단/검출제제일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 치료제제는 핵산, 펩타이드, 항체, 항체단편, 화합물, 독소, 핵산가수분해효소, 호르몬, 면역조절제, 항암제, 킬레이터, 붕소화합물, 또는 광활성(photoactive)제제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 진단/검출제제는 방사성동위원소, 염료, 조영제, 형광단백질, 형광화합물, 또는 MRI(magnetic resonance imaging) 조영 증강제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약물은 나노클로스터의 내부 또는 표면에 결합되어 표적지향적 약물전달이 가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 나노클러스터를 포함하는 진단키트 또는 단백질 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노클러스터에 임상 시료를 처리하여 항원-항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 항원 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 임상 시료는 환자 유래 혈액, 혈청, 혈장, 체액, 타액, 소변, 장액, 림프액, 또는 복강액일 수 있다.
본 발명에 따른 단일사슬항체조각과 바이러스 외피 단백질이 결합된 융합단백질은 바이러스 외피 단백질의 자가조립 특성을 통해 나노클러스터를 형성하며, 이를 통한 항원인식부위의 클러스터링 효과에 의해 단일사슬항체조각의 항원결합력이 향상되는 것을 확인하였는바, 다양한 항원인식부위를 갖는 단일사슬항체조각 서열을 이용하여 융합단백질을 제조하는 경우 항원 검출에 효과적인 폴리클로날 항체시스템 확보 및 이를 이용한 진단키트, 단백질 칩 등의 개발이 가능하다. 또한, 상기 나노클러스터의 내부 또는 표면에 치료제제 또는 진단/검출제제를 도입함으로써 질병의 치료 또는 진단을 위한 약물 전달체로 유용하게 이용될 수 있다.
한편, 상기 융합단백질의 N-말단 및 C-말단에 각각 말토스 결합 단백질(MBP) 및 히스티딘 태그를 융합시킴으로써 정제 순도 및 발현량이 증진되고, 용해도가 현저히 향상된 융합단백질을 수득할 수 있으며, 또한, 상기 융합단백질은 대장균 단백질 발현 시스템을 이용하므로 상대적으로 항체 생산에 비해 생산 비용 및 시간을 절감할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 단일사슬항체조각-브롬모자이크바이러스 외피 단백질(scFv-BMV) 융합단백질의 구성을 나타내는 개념도이다.
도 2는 scFv-BMV 융합단백질의 정제 후 SDS-PAGE를 통해 융합단백질의 크기 및 단백질 순도를 확인한 결과이다.
도 3은 scFv-BMV 융합단백질을 투과전자현미경으로 관찰한 이미지로서, 60개의 단량체가 모인 집합구조로써 전체적으로 구형을 형성함을 나타내는 결과이다.
도 4는 FITC 형광이 표지된 scFv-BMV 융합단백질의 HER2 발현 암세포의 표적화를 보여주는 결과이다(NIH3T 6.7(Her2/neu): HER2를 과발현시킨 쥐 유래 근육세포, MCF10A: HER2를 발현하지 않는 유방 조직세포인 섬유낭종세포).
도 5는 단일사슬항체조각-꽃양배추모자이크바이러스 외피 단백질(scFv-CMV) 융합단백질의 정제 후 SDS-PAGE를 통해 융합단백질의 크기 및 단백질 순도를 확인한 결과이다.
도 6은 C-말단에 히스티딘 태그가 융합된 scFv-BMV 융합단백질의 정제 후 SDS-PAGE를 통해 융합단백질이 고순도로 분리됨을 보여주는 결과이다.
도 7a 및 7b는 N-말단 말토스 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP) 및 C-말단 히스티딘 태그가 융합된 scFv-페리틴(ferritin) 융합단백질의 정제 후 SDS-PAGE를 통해 융합단백질의 발현량 및 분리 순도가 증가함을 보여주는 결과로서, 도 7a는 10 mM의 말토스 및 도 7b는 250 mM의 말토스를 이용하여 상기 융합단백질을 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 정제된 MBP-scFv-페리틴 융합단백질에 다양한 비율로 caspase-3를 처리함으로써 융합단백질로부터 MBP 절단을 통해 분리가 가능함을 확인한 결과이다.
본 발명자들은 단일사슬항체조각의 활용성을 향상시키는 방법의 개발을 위해 예의 연구한 결과, 단일사슬항체조각과 바이러스 외피 단백질이 융합된 단백질을 제조하였고, 상기 융합단백질은 바이러스 외피단백질의 자가조립 특성에 의해 나노클러스터를 형성하고 이에 따라 항원 결합능을 향상시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 단일사슬항체조각(scFv)과 바이러스 외피 단백질이 결합된 형태의 융합단백질을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “항체”란, 특정 항원과 반응성을 갖는 항원결합능력을 가지는 면역글로불린 분자를 포함하며, 폴리클로날(polyclonal) 항체 및 모노클로날(monoclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 항체는 구조적으로 중쇄 및 경쇄로 이루어지며, 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변영역 및 가변영역을 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 “상보성 결정 영역(complementarity-determining region; CDR)”이라고 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 “구조영역(framework region)”을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “단일사슬항체조각(single chain variable fragment; scFv)"이란, 항체로부터 형성되는 일반적인 단편이 아니라, 항체를 구성하는 중쇄의 가변영역을 포함하는 단편과 경쇄의 가변영역을 포함하는 단편을 인위적으로 융합시켜서 구성된 융합단백질이다. 상기 단일사슬항체조각은 단클론 항체 또는 다클론 항체 등의 다양한 항체로부터 유래된 중쇄단편과 경쇄단편이 순차적으로 또는 역순으로 결합된 형태일 수 있고, 상기 중쇄단편과 경쇄단편 사이에 10 내지 25개의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 링커가 삽입된 형태가 될 수도 있다. 이때, 사용되는 링커는 세린(S)과 글리신(G)으로 구성된 펩타이드 링커가 될 수 있는데 상기 링커의 길이는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 단일사슬항체조각은 핵산 또는 아미노산 서열이 알려져 있는 경우라면 그 종류가 제한되지 않는다.
상기 단일사슬항체조각의 원천이 되는 항체는 치료용 항체, 치료제제 또는 진단/검출제제와 결합할 수 있는 항체, 특정 세포 또는 조직으로의 표적화를 위한 항체, 또는 단순히 항원-항체반응을 위한 항체일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “바이러스 외피 단백질(viral coat protein)”이란, 바이러스 입자를 구성하는 단백질로서, 다양한 조건에 따라 단량체로 흩어지기도 하고 수십~수백 개의 단량체가 결합하여 거대한 구형 또는 막대형의 나노클러스터를 형성하는 자가조립 특성을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되는 브롬모자이크바이러스(brome mosaic virus; BMV) 유래 외피 단백질 또는 서열번호 8의 염기서열에 의해 암호화되는 꽃양배추모자이크바이러스(cauliflower mosaic virus; CMV) 유래 외피 단백질일 수 있으나, 자가조립 특성을 가져 나노클러스터를 형성할 수 있는 바이러스 유래 외피 단백질이라면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “융합단백질”은 상기 단일사슬항체조각과 바이러스 외피 단백질이 결합된 것으로 단일사슬항체조각이 바이러스 외피 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 형태일 수 있고, 상기 단일사슬항체조각은 직접적으로 바이러스 외피 단백질과 결합되거나 또는 펩타이드 링커를 통하여 결합될 수 있으며, 상기 링커의 길이 및/또는 아미노산 조성을 조절하여 단일사슬항체조각 간의 간격 및 배향을 조절할 수 있다.
본 발명자들은 실제로 단일사슬항체조각(scFv)-바이러스 외피 단백질 융합단백질을 제조하고, 그 특성을 분석하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 유방암의 표적치료제로 이용되는 허셉틴(Herceptin)의 단일사슬항체조각과 브롬모자이크바이러스(이하, BMV) 또는 꽃양배추모자이크바이러스(이하, CMV)의 외피 단백질이 융합된 융합단백질을 제조하였다. BMV 또는 CMV의 외피 단백질을 암호화하는 유전자를 PCR로 증폭시켜 벡터에 클로닝함으로써 바이러스 외피 단백질 발현용 플랫폼 벡터를 제작하고, 상기 허셉틴 유래 scFv에 대한 유전자를 상기 플랫폼 벡터에 클로닝하여 scFv-BMV 또는 scFv-CMV 융합단백질 발현벡터를 제작하였다(실시예 1-1 내지 1-2, 3-1 내지 3-2 참조). 이후 상기 발현벡터를 대장균에 도입함으로써 제작된 형질전환체를 배양시켜 상기 융합단백질의 발현을 유도한 후 상기 융합단백질을 분리 및 정제하였다(실시예 1-3 및 3-3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, scFv-BMV 융합단백질을 이용하여 그 특성을 분석하였다. 구체적으로, scFv-BMV 융합단백질의 항원결합력을 알아보기 위해 허셉틴, scFv 단량체, 및 scFv-BMV 융합단백질의 HER2에 대한 결합력을 측정한 결과, HER2에 대한 친화도 및 결합력 측면에서 scFv-BMV 융합단백질이 허셉틴 및 scFv 단량체에 비하여 약 50배 이상의 높은 항원결합력을 보이는 것을 확인하였다(실시예 2-1 참조).
또한, 전자현미경을 통해 scFv-BMV 융합단백질의 구조를 관찰한 결과 상기 융합단백질은 60개의 단량체가 모인 집합구조를 형성하는 것을 알 수 있었다(실시예 2-2 참조).
이에 더하여, scFv-BMV 융합단백질의 암세포 표적화 기능을 알아보기 위해, HER2를 과발현시킨 NIH3T-6.7 세포와 세포 표면에 HER2를 발현하지 않는 유방 조직세포인 MCF10A 섬유낭종세포에 FITC 형광으로 표지한 융합단백질을 처리하고 배양한 후 현미경으로 관찰한 결과, 상기 융합단백질이 HER2를 과발현하는 세포만을 표적하는 것을 확인하였다(실시예 2-3 참조).
상기 결과를 통해, 본 발명을 통해 제조된 융합단백질은 바이러스 외피 단백질의 자가조립 특성에 의한 항원인식부위의 클러스터링 효과에 의해 단일사슬항체조각의 항원결합력이 향상되는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 단일사슬항체조각-바이러스 외피 단백질이 결합된 융합단백질의 C-말단에는 히스티딘 태그(Histidine tag)를 추가로 융합하여 정제 과정에서 얻어지는 단백질의 순도를 향상시킬 수 있고, 상기 융합단백질의 N-말단에 말토오스 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP)을 추가로 융합하여 제조된 융합단백질의 발현량과 수용성을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, C-말단에 히스티딘 태그가 발현되는 pET 21(a) 벡터를 이용하여 C-말단에 히스티딘 태그가 융합된 scFv-BMV 융합단백질을 발현하는 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 대장균에 도입한 후 형질전환체로부터 상기 단백질을 분리 및 정제한 결과 고순도의 융합단백질이 분리된 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 발현량 및 수용성이 개선된 융합단백질을 제조하기 위하여 N-말단에 말토스 결합 단백질(maltose binding protein; MBP)이 발현되고, C-말단에 히스티딘 태그가 발현되는 벡터(MBP-DEVD-28a vector)를 이용하여 융합단백질을 제조하였다. 그 결과, 말토스를 이용하여 발현량 및 수용성이 개선된 융합단백질을 고순도로 얻을 수 있음을 확인하였다(실시예 5-1 및 5-2 참조). 또한, 상기 말토스 결합 단백질은 상기 융합단백질에 caspase-3를 처리함으로써 절단되어 융합단백질로부터 분리할 수 있음을 확인하였다(실시예 5-3 참조).
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일사슬항체조각-바이러스 외피 단백질이 결합된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 융합단백질의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 염기서열 또는 상기 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열이 상기 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “재조합 발현벡터”는, 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 개시 코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 구비될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 프로모터는 본 발명의 재조합 발현벡터 내의 핵산을 대장균과 같은 숙주에서 발현되도록 하는 한 그 종류는 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는데, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동 가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50), λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 배큘로바이러스(baculovirus) 등이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “형질전환”이란, 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA 사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 말한다. 본 발명에서 형질전환은 본 발명에서 제공하는 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 본 발명에 따른 융합단백질이 발현되도록 하는 것을 의미한다.
형질전환은 다양한 방법에 의해 수행될 수 있는데, 구체적으로 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개 형질전환 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 숙주세포는 상기 재조합 발현벡터를 도입하여 상기 융합단백질을 발현시킬 수 있는 세포라면 특별히 종류에 제한이 없으며, 대장균(E. coli), 효모세포, 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포 등을 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 제작된 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체로부터 융합단백질을 발현시킨 후 상기 발현된 융합단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 융합단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 (c)에서, 융합단백질을 수득하는 단계는 그 방법에 제한이 없고, 당업계의 기술자가 통상의 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 융합단백질을 포함하는 나노클러스터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “나노클러스터”란, 본 발명의 융합단백질을 구성하는 바이러스 외피 단백질의 자가조립 특성에 의하여 융합단백질 단량체가 자가조립되어 형성되는 것을 의미하며, 상기 나노클러스터의 크기 및 형태는 융합단백질 제조에 사용되는 바이러스 외피 단백질의 종류에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 나노클러스터에 약물이 도입된 것을 포함하는 약물 전달체 조성물을 제공한다.
상기 나노클러스터는 약물을 내부 또는 표면에 결합시켜 표적지향적 약물을 전달할 수 있고, 상기 약물은 치료제제, 진단제제, 또는 검출제제일 수 있다. 상기 치료제제는 핵산, 펩타이드, 항체, 항체단편, 화합물, 독소, 핵산가수분해효소, 호르몬, 면역조절제, 항암제, 킬레이터, 붕소화합물, 또는 광활성(photoactive)제제일 수 있으며, 상기 진단/검출제제는 방사성동위원소, 염료, 조영제, 형광단백질, 형광화합물, 또는 MRI(magnetic resonance imaging) 조영 증강제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 나노클러스터를 포함하는 진단키트 또는 단백질 칩을 제공한다.
본 발명의 진단키트는 목적하는 질환을 진단할 수 있는 표적 단백질과 결합할 수 있는 단일사슬항체조각을 포함하는 나노클러스터를 포함할 수 있다. 이때, 목적하는 질환은 나노클러스터에 포함된 단일사슬항체조각에 의해 검출될 수 있는 표적 단백질을 포함하는 한 특별히 제한되지 않는데, 예컨대, 세균 또는 바이러스에 의한 감염성 질환, 유전적인 변이로 인하여 특정 단백질이 발현됨에 따라 발병될 수 있는 유전성 질환, 생체 내 대사를 교란하는 물질의 유입으로 인하여 발병될 수 있는 대사성 질환 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 진단키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치로 구성되며, 예컨대, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 2차 항체, 검출용 제제, 멸균수, 또는 효소 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 단백질 칩은 진단키트의 종류로서, 본 발명에서 제공하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질로 구성된 나노클러스터가 고체 기질에 고정된 형태일 수 있는데, 이때, 상기 고체 기질은 바이오 칩에 사용될 수 있다면 특별히 이에 제한되지 않으나, 예컨대, 금, 유리, 변형된 실리콘, 테트라플루오로에틸렌(tetrafluoroethylene), 폴리스티렌(polystyrene) 및 폴리프로필렌(polypropylene) 등 흔히 사용되는 중합체나 겔 등이 될 수 있다. 또한, 상기 기판의 표면은 중합체, 플라스틱, 수지, 탄수화물, 실리카, 실리카 유도물질, 탄소, 금속, 무기 유리 및 막 등으로 표면 처리될 수 있다. 상기 기판은 지지체로서의 역할 뿐 아니라, 고정된 항체와 항원 간의 결합 반응이 일어나는 장소를 제공한다. 상기 기판의 규격 및 기판상에 고정되는 위치, 크기 및 모양은 분석의 목적, 점적 기기(spotting machine) 및 스캐너(scanner) 등의 장치에 따라 변화될 수 있다.
단백질 칩 이외에도, 상기 진단키트는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 키트, RT-PCR, DNA 칩, 또는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 나노클러스터에 임상 시료를 처리하여 항원-항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는 항원 검출방법을 제공한다.
상기 임상시료는 환자 유래 혈액, 혈청, 혈장, 체액, 타액, 소변, 장액, 림프액, 또는 복강액일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 상기 단백질 시료와 나노클러스터를 반응시킨 후, 항원-항체 반응의 발생을 확인하기 전에, 나노클러스터와 미처 결합하지 못한 표적 물질 및 결합이 가능하지 않은 시료 내 다른 물질을 세척하여 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 허셉틴( Herceptin ) 유래 scFv - BMV 융합단백질의 제조
1-1. 단일사슬항체조각 - BMV 융합단백질 제조를 위한 BMV 플랫폼 벡터 제작
단일사슬항체조각(single chain variable fragment; scFv)-BMV 바이러스 융합단백질 제조를 위한 플랫폼 벡터를 다음과 같은 방법으로 제작하였으며, 도 1에는 scFv-BMV 바이러스 파티클 융합단백질의 발현을 위한 바이러스 융합단백질의 구성을 나타내는 개념도를 도시하였다.
구체적으로, 식물 바이러스인 브롬모자이크바이러스(brome mosaic virus; BMV)의 파티클을 암호화하는 유전자(서열번호 1)를 하기에 나타낸 프라이머로 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 수행하여 증폭시켰다. 이후 제한효소 BamHI과 NotI을 이용하여 벡터 pET 28(a)에 클로닝한 다음, 클로닝된 바이러스 파티클(BMV) 유전자를 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
P1: 5'-GTCGCGGATCCATGTCGACTTCAGGAACTGGTAA-3'(서열번호 2)
P2: 5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACCTATAAACCGGGG-3'(서열번호 3)
1-2. 허셉틴( Herceptin ) 유래 scFv - BMV 융합단백질의 재조합 DNA 제작
상기 실시예 1-1에서 제작된 브롬모자이크바이러스(이하, BMV) 유래의 바이러스 외피 단백질 발현용 플랫폼 벡터 및 유방암 치료제로 널리 사용되고 있는 허셉틴의 단일사슬항체조각(이하, scFv)에 대한 유전자(서열번호 4)를 이용하여, scFv-BMV 융합단백질을 제조하기 위해 재조합 DNA를 제작하고자 하였다.
이를 위해, 허셉틴의 scFv(HL) 유전자를 주형으로 하고, 하기 프라이머(서열번호 5 및 6)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 상기 유전자에 대한 증폭산물을 수득하였으며, 제한효소 NdeI, BamHI을 이용하여 상기 증폭시킨 유전자를 실시예 1-1에서 제작된 브롬모자이크바이러스(BMV) 유래 바이러스 외피단백질 발현용 플랫폼 벡터에 클로닝하고, 클로닝된 scFv(HL)-BMV 유전자(서열번호 7)는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
P3: 5'-gggaattccatatgaccgtggcccaggcggccgaagtg-3'(서열번호 5)
P4: 5'-cgcggatccgctgccggccgcgtgctggccggcctg-3'(서열번호 6)
한편, 허셉틴의 scFv(HL) 유전자를 주형으로 하고, 상기 프라이머(서열번호 5 및 6)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 증폭산물을 수득하였으며, 제한효소 NdeI, BamHI을 이용하여 상기 증폭산물을 벡터 pET 28(a)에 클로닝하고, 클로닝된 scFv(HL) 유전자는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
1-3. scFv - BMV 융합단백질의 발현 및 정제
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 제작된 허셉틴 유래 단일사슬항체조각-브롬모자이크 외피단백질(이하, scFv-BMV) 발현벡터 및 scFv(HL) 유전자를 클로닝한 pET 28(a) 벡터를 각각 대장균 숙주에 형질전환하고, 수득된 형질전환체를 0.1~1 mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactoside)가 첨가된 배지 및 10~37℃ 온도 조건하에서 배양함으로써 scFv-BMV 융합단백질 및 scFv 단백질의 과발현을 유도하였다. 이후 다음과 같은 과정을 통해 상기 단백질들을 분리 및 정제하였다.
구체적으로, 배양시킨 대장균 세포를 집균 후 컬럼완충용액(50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 0.05% β-mercaptoethanol)에 현탁하고 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 후, 이를 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이후 10 ㎖의 컬럼완충용액으로 탈론 레진(1 ㎖, Talon resin, Clontech)을 2번 씻어서 활성화시키고, 상기 상층액을 가하여 4℃에서 1시간 동안 천천히 진탕하여 단백질을 탈론 수지에 흡착시켰다. 이어서 상기 탈론 수지를 컬럼완충용액(10 ㎖)으로 두 번 세척하고, 10 ㎖의 용출 완충용액(elution buffer: 100 mM 이미다졸)을 가한 후 다시 1 시간 동안 천천히 진탕(rocking)하여 용출액을 수득하였다. 상기 수득된 용출액에 포함된 단백질은 브래드포드 검출법(Bradford assay)을 통해 정량하고, 정제된 단백질은 SDS-PAGE 분석을 통하여 단백질 단량체의 크기 및 정제된 단백질의 순도를 확인하였다.
SDS-PAGE 분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 정제한 scFv-BMV 융합단백질은 약 51kDa 크기이며, 높은 순도로 분리된 것을 확인하였다.
실시예 2. scFv - BMV 융합단백질의 특성 분석
2-1. scFv - BMV 융합단백질의 항원 결합력 분석
상기 실시예 1을 통해 제조한 scFv-BMV 융합단백질의 항원결합력을 분석하기 위하여, 항원인 HER2에 대한 상기 융합단백질, 실시예 1-2와 1-3을 통해 제조한 허셉틴 유래 scFv 단량체, 및 허셉틴의 결합력을 SPR(Surface plasmon resonance) 분석법을 이용하여 비교하였다.
구체적으로, 상기 분석을 위해 Biacore T100 분석기(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 사용하였는데, 바이오센서 분석에서는 EDC / NHS(N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride / N-hydroxysuccinimide)로 활성화한 CM5 센서 칩(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에 10 ㎕/min의 유속으로 HER2 단백질(10 ㎍/㎖ in 10 mM Sodium acetate, pH 5.0)을 5분간 흘려주어 고정화시켰다. 센서 칩 표면에 남아있는 활성화 부분은 1.0 M 에탄올아민(ethanolamine, pH 8.5)을 첨가하여 비활성화시켰다. 이 상태에서 허셉틴, 허셉틴 유래 scFv 단량체, 또는 scFv-BMV 융합단백질을 각 농도별로 완충용액(1 X PBS, pH 7.4)에 희석한 후, 30 ㎕/min의 유속으로 흘러주면서 결합 센서그램과 해리 센서그램을 확인하였다. 이때, 센서 칩과의 비특이적 결합에 의해 발생하는 센서그램을 보정하기 위해서 BSA(bovine serum albumin)로만 완전히 비활성화된 셀을 사용하였고 HER2의 센서그램에서 BSA의 센서그램을 빼줌으로써 비특이성 결합을 보정하였다. 센서 칩의 표면은 재생(regeneration) 완충용액(20 mM NaOH)을 흘려줌으로써 재생하였다.
실험 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, HER2에 대한 친화도 및 결합력의 측면에서 scFv-BMV 융합단백질이 허셉틴(Whole antibody) 및 허셉틴 유래 scFv 단량체(scFv monomer)와 비교하여 약 50배 이상의 높은 결합력을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과는 scFv-BMV 융합단백질이 종래의 허셉틴 항체 및 이의 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합력이 높은 수준으로 증진되었음을 의미하는 것이다.
ka (1/Ms) kd (1/s) KD
Whole antibody 9.64E+04 2.36E-04 2.45E-09
scFv monomer 2.15E+04 6.51-04 3.02E-08
scFv-HFL 2.60E+06 3.23E-04 1.24E-10
scFv-BMV 4.31+07 8.21E-04 1.90E-11
2-2. scFv - BMV 융합단백질의 투과전자현미경 분석
상기 실시예 1을 통해 제조한 scFv-BMV 융합단백질에 대하여 투과전자현미경(transmission electron microscope; TEM) 분석을 실시하여 단백질의 형태를 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 정제된 scFv-BMV 융합단백질은 60개의 단량체가 모인 집합구조를 형성하여 전체적으로 구형을 형성하는 것을 확인하였다.
2-3. scFv - BMV 융합단백질의 암세포 표적화 확인
상기 실시예 1에서 제조 및 정제하여 수득한 scFv-BMV 융합단백질의 암세포 표적화 기능을 확인하기 위하여, HER2가 세포막 표면에 과발현되는 암세포와 HER2가 발현되지 않는 유방 조직세포를 이용하여 표적화 여부를 분석하였다.
이를 위해, scFv-BMV 융합단백질에 과량의 FITC(Fluoresceine isothiocyanate; Thermo Scientific) solution을 처리하고, PD-10 Desalting column(GE Healthcare)을 이용하여 융합단백질과 반응하지 못한 FITC를 제거해주어 융합단백질의 표면에 노출된 Lysine에 FITC를 도입함으로써 형광 표지를 하였다. 다음으로, 쥐 유래 근육세포 표면에 HER2를 과발현시킨 NIH3T-6.7 세포와 세포 표면에 HER2를 발현하지 않는 유방 조직세포인 MCF10A 섬유낭종세포를 8 well microslide에 각 Well당 200㎕, 2x104/Well씩 씨딩(seeding)한 후 배양하고, 형광이 표지된 scFv-BMV 융합단백질 용액을 각 세포에 500 uM 농도로 200 ㎕씩 처리한 뒤 상온에서 차광된 상태로 30분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 PBST로 3회 반복하여 헹궈주고, DAPI 염색을 통해 세포핵을 염색시켰다. 이후 다시 PBST로 3회 헹궈주고, 마지막으로 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)로 상온에서 15분 동안 세포를 고정한 후 현미경으로 세포 표면의 형광 이미지를 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, HER2가 과발현되는 NIH3T-6.7 세포에서는 FITC 형광이 잘 검출되는 것으로 보아 scFv-BMV 융합단백질이 세포 표면의 HER2에 결합된 것을 확인하였다. 반면, HER2가 발현되지 않는 MCF10A 세포에서는 FITC 형광이 거의 관찰되지 않았다. 상기 결과는 scFv-BMV 융합단백질이 HER2를 과발현하는 세포만을 표적하는 것을 의미하는 것이다.
실시예 3. 허셉틴( Herceptin ) 유래 scFv - CMV 융합단백질의 제조
3-1. 단일사슬항체조각 - CMV 융합단백질 제조를 위한 CMV 플랫폼 벡터 제작
단일사슬항체조각(single chain variable fragment; scFv)-CMV 바이러스 융합단백질 제조를 위한 플랫폼 벡터를 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
구체적으로, 식물 바이러스인 꽃양배추모자이크바이러스(cauliflower mosaic virus; 이하, CMV)의 파티클을 암호화하는 유전자(서열번호 8)를 하기에 나타낸 프라이머로 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 수행하여 증폭시켰다. 이후 제한효소 BamHI과 NotI을 이용하여 벡터 pET 28(a)에 클로닝한 다음, 클로닝된 바이러스 파티클(CMV) 유전자를 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
P5: 5'-ctcgcggatccatggacaaatctgaatcaacc-3' (서열번호 9)
P6: 5'-aaggaaaaaagcggccgctcagactgggagcactccaga-3' (서열번호 10)
3-2. 허셉틴( Herceptin ) 유래 scFv - CMV 융합단백질의 재조합 DNA 제작
상기 실시예 3-1에서 제작된 CMV 유래의 바이러스 외피 단백질 발현용 플랫폼 벡터 및 상기 실시예 1-2에서 이용한 것과 동일한 허셉틴의 단일사슬항체조각(이하, scFv)에 대한 유전자를 이용하여, scFv-CMV 융합단백질을 제조하기 위해 재조합 DNA를 제작하고자 하였다.
이를 위해, 허셉틴의 scFv(HL) 유전자를 주형으로 하고, 프라이머(서열번호 5 및 6)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 상기 유전자에 대한 증폭산물을 수득하였으며, 제한효소 NdeI, BamHI을 이용하여 상기 증폭시킨 유전자를 실시예 3-1에서 제작한 CMV 유래 바이러스 외피단백질 발현용 플랫폼 벡터에 클로닝하고, 클로닝된 scFv(Herceptin)-CMV 유전자(서열번호 11)는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
3-3. scFv - CMV 융합단백질의 발현 및 정제
상기 실시예 3-2의 방법에 따라 제작된 허셉틴 유래 단일사슬항체조각-꽃양배추모자이크 외피단백질(이하, scFv-BMV) 발현벡터를 각각 대장균 숙주에 형질전환하고, 상기 실시예 1-3과 동일한 방법에 따라 대장균 형질전환체에서 scFv-CMV 융합단백질 발현을 유도하고, 이후 분리 및 정제하였다.
SDS-PAGE 분석을 통하여 단백질 단량체의 크기 및 정제된 단백질의 순도를 확인한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 약 51 kDa의 scFv-CMV 융합단백질이 높은 순도로 정제된 것을 확인하였다.
실시예 4. 정제 순도 증진을 위한 scFv -단백질 나노입자 융합단백질 제조
4-1. C-말단 히스티딘 태그가 융합된 scFv - BMV 융합단백질 제조
발현되는 단백질의 정제 순도를 향상시키기 위하여, 상기 실시예 1-1의 scFv-BMV 융합단백질의 제조 과정에서 pET 28(a) 벡터 대신 C-말단에 히스티딘 태그(Histidine tag)가 발현되는 pET 21(a) 벡터(Novagen)를 사용하여 scFv-BMV 융합단백질 제조를 진행하였다. 이는 단백질 발현 과정 중 early termination되는 단백질을 정제 과정에서 배제하기 위함이다.
보다 구체적으로, BMV의 파티클을 암호화하는 유전자(서열번호 1)를 하기에 나타낸 프라이머로 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 수행하여 증폭시켰다. 이후 제한효소 BamHI과 NotI을 이용하여 벡터 pET 21(a)에 클로닝한 다음, 클로닝된 바이러스 파티클(BMV) 유전자를 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
P7: 5'-gtcgcggatccatgtcgacttcaggaactggtaa-3' (서열번호 12)
P8: 5'-aaggaaaaaagcggccgcgtccacttcgtccctataaaccgggg-3’(서열번호 13)
다음으로, 허셉틴의 scFv(HL) 유전자를 주형으로 하고, 프라이머(서열번호 5 및 6)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 상기 유전자에 대한 증폭산물을 수득하였으며, 제한효소 NdeI, BamHI을 이용하여 상기 증폭시킨 유전자를 상기 방법으로 제작된 BMV 유래 바이러스 외피단백질 발현용 플랫폼 벡터 pET 21(a)에 클로닝하고, 클로닝된 scFv(HL)-BMV 유전자(서열번호 7)는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
4-2. C-말단 히스티딘 태그가 융합된 scFv - CMV 융합단백질 제조
상기 실시예 4-1의 C-말단 히스티딘 태그가 융합된 scFv-BMV 융합단백질의 제조 방법과 유사하게 scFv-CMV 융합단백질을 제조하였다.
먼저, CMV의 파티클을 암호화하는 유전자(서열번호 8)를 하기에 나타낸 프라이머로 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 수행하여 증폭시켰다. 이후 제한효소 BamHI과 NotI을 이용하여 벡터 pET 21(a)에 클로닝한 다음, 클로닝된 바이러스 파티클(CMV) 유전자를 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
P9: 5'-ctcgcggatccatggacaaatctgaatcaacc-3' (서열번호 14)
P10: 5'-aaggaaaaaagcggccgcgtccacttcgtcgactgggagcactccaga-3' (서열번호 15)
다음으로, 허셉틴의 scFv(HL) 유전자를 주형으로 하고, 프라이머(서열번호 5 및 6)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 상기 유전자에 대한 증폭산물을 수득하였으며, 제한효소 NdeI, BamHI을 이용하여 상기 증폭시킨 유전자를 실시예 3-1에서 제작한 CMV 유래 바이러스 외피단백질 발현용 플랫폼 벡터에 클로닝하고, 클로닝된 scFv(HL)-CMV 유전자(서열번호 11)는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
4-3. C-말단 히스티딘 태그가 융합된 scFv - BMV 및 scFv - CMV 융합단백질의 정제 효율 분석
상기 실시예 4-1 및 4-2의 방법에 따라 제조한 scFv-BMV 및 scFv-CMV 융합단백질 발현 벡터 각각을 대장균 숙주에 형질전환 시키고, 실시예 1-3과 동일한 방법으로 각 융합단백질을 발현시킨 후 분리 및 정제하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE 분석을 통하여 단백질 단량체의 크기 및 정제된 단백질의 순도를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1-3 및 2-3에서 정제한 scFv-BMV(도 2) 및 scFv-CMV(도 5) 융합단백질에 비하여, C-말단 히스티딘 태그를 이용한 단백질 발현 및 정제방법을 통해 좀 더 고순도의 단백질이 분리되었음을 확인하였다.
실시예 5: 수용성 단백질 발현량을 증진을 위한 MBP 태그를 이용한 scFv -단백질 나노입자 융합단백질의 제조
5-1. N-말단 MBP 및 C-말단 히스티딘 태그가 융합된 scFv -페리틴 융합단백질 제조
발현되는 scFv-단백질 나노입자 융합단백질의 발현량 증가 및 수용성 개선을 위하여, N-말단에 말토스 결합 단백질(maltose binding protein; MBP)이 발현되고, C-말단에 히스티딘 태그가 발현되는 벡터(MBP-DEVD-28a vector; 실험실 보유)를 사용하여 융합단백질을 제조하였다.
구체적으로, 허셉틴의 scFv(HL) 유전자를 주형으로 하고, 프라이머(서열번호 5 및 6)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 상기 유전자에 대한 증폭산물을 수득하였으며, 제한효소 NdeI와 BamHI을 이용하여 상기 증폭시킨 유전자를 페리틴(ferritin) 발현용 플랫폼 벡터 MBP-DEVD-28a에 클로닝하고, 클로닝된 scFv(HL)-페리틴 유전자는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
5-2. N-말단 MBP 및 C-말단 히스티딘 태그가 융합된 scFv - ferritin 융합단백 질의 정제 효율 분석
상기 실시예 5-1의 방법에 따라 제조한 scFv-ferritin 융합단백질 발현 벡터를 대장균 숙주에 형질전환시키고, 실시예 1-3과 동일한 방법으로 형질전환체에서 MBP-scFv-ferritin 융합단백질의 발현을 유도한 후 하기와 같은 과정을 통해 상기 융합단백질을 분리 및 정제하였다.
구체적으로, 배양시킨 대장균 세포를 집균 후 컬럼완충용액(50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 0.05% β-mercaptoethanol)에 현탁하고 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 후, 이를 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이후 50 ㎖의 컬럼완충용액으로 컬럼에 충진된 아밀로즈 레진(10 ㎖, Amylose resin, NEB)을 씻어서 활성화시키고, 상기 상층액을 가하여 단백질을 아밀로즈 레진에 흡착시켰다. 이어서, 상기 아밀로즈 레진을 컬럼완충용액(100 ㎖)으로 세척하고, 20 ㎖의 세척완충용액(1 mM 말토스가 포함된 컬럼완충용액)을 가한 후 다시 10 mM 말토스가 포함된 컬럼 용출용액을 이용하여 단백질을 레진으로부터 분리 정제하였다. 상기 수득한 용출액에 포함된 단백질은 브래드포드 검출법(Bradford assay)을 통해 정량하고, 정제된 단백질은 SDS-PAGE 분석을 통하여 단백질 단량체의 크기 및 정제된 단백질의 순도를 확인하였다.
SDS-PAGE 분석 결과, 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 아밀로즈 레진에 도입하기 전단계의 전체 단백질(1번 레인), 레진에 결합하지 않는 잔여 단백질(2번 레인), 및 비특이적 결합으로 인해 세척된 단백질(3번 레인)들과 달리, 10 mM 또는 250 mM 농도의 말토스를 이용하는 경우 컬럼으로부터 MBP-scFv-ferritin 융합단백질이 순차적으로 용출되는 것을 확인하였다(각각 4번 내지 13번 레인). 상기 결과를 통해, MBP-scFv-ferritin 융합단백질이 높은 효율과 순도로 정제됨을 확인하였다.
5-3. N-말단 MBP 태그 절단을 통한 제거
상기 실시예　5-２에서 정제된 단백질은 N-말단에 MBP 태그를 부가적으로 가지고 있는데, 단백질 정제 후에는 상기 태그를 제거하는 것이 항체로서의 기능 혹은 단백질 입자의 자가조립에 유리할 것으로 판단되어 단백질 분해효소를 이용하여 MBP 태그를 제거하였다. 상기 실시예 5-1에서 제작된 융합단백질 발현용 벡터는 MBP 태그와 목적 단백질 사이에 DEVD 서열을 가지고 있는데, 이는 단백질 가수분해효소인 Caspase-3에 의해 절단된다. 따라서 Caspase-3를 처리하는 경우 DEVD 서열이 절단됨으로써 목적 단백질로부터 MBP 태그를 제거할 수 있다.
실험 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 5-2를 통해 정제한 MBP-scFv-ferritin 융합단백질에 Caspase-3 처리한 경우, 상기 융합단백질과 caspase-3의 비율이 250:1부터 2000:1인 경우까지 모두 13시간 이후 MBP 단백질이 완전히 절단되어 scFv-ferritin 융합단백질이 MBP로부터 완전히 분리되는 것을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel fusion proteins comprising single chain fragment variable and viral coat protein, and uses thereof <130> MP16-244 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 570 <212> DNA <213> Brome mosaic virus <400> 1 atgtcgactt caggaactgg taagatgact cgcgcgcagc gtcgtgctgc cgctcgcaga 60 aatcgttgga ccgctagggt ccaaccagta attgtcgaac cactcgctgc tggccaaggc 120 aaggccatta aagcgattgc aggatacagc atatcaaagt gggaggcgtc ttcggacgcg 180 attacagcga aagccaccaa tgccatgagt atcactctgc cccatgagct ctcttctgaa 240 aagaataagg agcttaaggt cggcagggtg ctgctttggt tgggacttct tcctagcgtt 300 gctgggagga ttaaggcttg tgttgctgag aaacaggcac aggccgaggc tgcttttcaa 360 gtagccttgg cggttgcaga ctcctcgaaa gaggtggtcg cggccatgta tacggacgcc 420 tttcgagggg cgactctggg ggatttgctt aatctccaga tttatctgta tgcatctgaa 480 gcagtgcctg ctaaggcggt cgttgtacat ctagaagttg agcacgtaag gcctacgttc 540 gatgacttct tcaccccggt ttataggtag 570 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial 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Claims (23)

  1. 단일사슬항체조각(scFv)과 바이러스 외피 단백질이 결합된, 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단일사슬항체조각은 바이러스 외피 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합되는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단일사슬항체조각은 항체의 중쇄단편 및 경쇄단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스 외피 단백질은 브롬모자이크바이러스(brome mosaic virus) 또는 꽃양배추모자이크바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 단백질인 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 브롬모자이크바이러스 외피 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 꽃양배추모자이크바이러스 외피 단백질은 서열번호 8의 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 단백질의 C-말단에 히스티딘 태그(Histidine tag)가 추가로 융합된 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 단백질의 N-말단에 말토스 결합 단백질(maltose binding protein)이 추가로 융합된 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  11. 제10항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  12. 하기의 단계를 포함하는, 융합단백질의 제조방법:
    (a) 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;
    (b) 상기 제작된 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환체로부터 융합단백질을 발현시킨 후 상기 발현된 융합단백질을 수득하는 단계.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 융합단백질을 포함하는, 나노클러스터.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 나노클러스터는 융합단백질을 구성하는 바이러스 외피 단백질의 자가조립에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는, 나노클러스터.
  15. 제13항의 나노클러스터에 약물이 도입된 것을 포함하는, 약물 전달체 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 약물은 치료제제 또는 진단/검출제제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 치료제제는 핵산, 펩타이드, 항체, 항체단편, 화합물, 독소, 핵산가수분해효소, 호르몬, 면역조절제, 항암제, 킬레이터, 붕소화합물, 또는 광활성(photoactive)제제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 진단/검출제제는 방사성동위원소, 염료, 조영제, 형광단백질, 형광화합물, 또는 MRI(magnetic resonance imaging) 조영 증강제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 약물은 나노클로스터의 내부 또는 표면에 결합되어 표적지향적 약물전달이 가능한 것을 특징으로 하는, 조성물.
  20. 제13항의 나노클러스터를 포함하는, 진단키트.
  21. 제13항의 나노클러스터를 포함하는, 단백질 칩.
  22. 제13항의 나노클러스터에 임상 시료를 처리하여 항원-항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 항원 검출방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 임상 시료는 환자 유래 혈액, 혈청, 혈장, 체액, 타액, 소변, 장액, 림프액, 또는 복강액인 것을 특징으로 하는, 방법.
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