CN102770764B - 对给定靶标具有亲和力的人脂质运载蛋白2（Lcn2，hNGAL）的突变蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于产生突变蛋白的新文库和源自人脂质运载蛋白2（Lcn2，hNGAL）的新突变蛋白以及相关蛋白，所述蛋白以可检测的亲和力结合给定靶标。本发明还涉及编码这样的突变蛋白的相应的核酸分子以及用于产生所述核酸分子的方法。本发明进一步涉及用于生产这样的突变蛋白的方法。例如，这样的突变蛋白可以用于结合天然生物分子的致病形式，例如阿尔茨海默氏病中的β淀粉样肽，并使其耗尽，或者可以与肿瘤新生血管相关的纤连蛋白额外结构域B为靶向。<!--1-->

Description

对给定靶标具有亲和力的人脂质运载蛋白2（Lcn2，hNGAL）的突变蛋白

概述

本发明涉及用于产生突变蛋白的新文库和源自人脂质运载蛋白2（Lcn2，hNGAL）的新突变蛋白以及相关蛋白，所述蛋白以可检测的亲和力结合给定靶标。本发明还涉及编码这样的突变蛋白的相应的核酸分子以及用于产生所述核酸分子的方法。本发明进一步涉及用于生产这样的突变蛋白的方法。此外，本发明涉及包含这样的脂质运载蛋白突变蛋白的药物组合物以及所述突变蛋白的多种用途。

根据本发明的Lcn2突变蛋白显示出在数个疾病领域作为治疗和/或诊断试剂的潜力。例如，它们可以用于结合天然生物分子的致病形式（例如阿尔茨海默氏病中的β淀粉样肽）并使其耗尽。在另一个实施例中，它们可以用于将各种标记或毒素特异靶向至疾病相关的细胞表面标记物，例如与肿瘤新生血管相关的纤连蛋白额外结构域B。由于可以根据本发明的产生的Lcn2突变蛋白的特殊益处，各种其它应用或实施例也是可以的。

背景技术

阿尔茨海默氏病(AD)是老年人群中最为常见的痴呆形式。与AD相关的淀粉样前体蛋白的缺陷性进程产生具有潜在神经毒性的包含40-42个残基的β淀粉样肽(Aβ)。Aβ之后聚集成低聚物和长纤维，这在该疾病的过程中具有关键作用，从而聚集形成老年斑块（Haass和Selkoe (2007) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112）。尽管AD越来越重要，但对于预防、治疗或减缓所述痴呆的有效疗法的需求仍未得到满足。

当前的抗淀粉样方法的目标为：(i)预防Aβ形成，(ii)阻断其聚集，(iii)降低脑中可溶Aβ的水平，以及(iv)分解存在的淀粉样斑块。迄今为止，包括主动和被动免疫AD患者的免疫疗法在此领域最有希望（Dodel等人(2003) Lancet Neurology 2, 215-220；Lichtlen和Mohajeri (2007) J. Neurochem. 104, 859-874；Brody和Holtzmann (2008) Annu. Rev. Neurosci. 31, 175-193）。然而，由于6%的患者发生了脑膜脑炎，因此停止了主动免疫AD患者的近期临床试验。由于这些Fc介导的免疫功能的潜在不良反应，非Ig结合试剂例如Anticalin，提供了替代方案。与β淀粉样蛋白具有特异性的亲和体分子的识别是示出基因工程的非Ig结合蛋白的潜力的一个实例（Grönwall等人(2007) J. Biotechnol. 128, 162-183；Hoyer等人(2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 5099-5104）。

然而，亲和体的细菌来源可能在人患者中造成免疫原性的问题。

纤连蛋白(FN)在细胞粘附、迁移、增殖和分化中起重要作用。FN为大的模块化的二聚体糖蛋白，其包含I、II和III型的多个结构域。FN的可选剪切变体，例如其额外结构域B（ED-B，在FN^III7和FN^III8结构域之间掺入）表现为组织特异的和发育阶段依赖的行为（Zardi等人(1987)EMBO J 6, 2337-2342）。

ED-B不存在于正常成人组织中，但在伤口愈合和肿瘤的血管形成期间例外。因此，含有ED-B的纤连蛋白在吸引新血管形成和经历异常血管生成的多种不同肿瘤类型中大量表达。尽管ED-B在血管生成中的实际生物学功能尚不清楚，其在FN中的加入起到肿瘤发生的良好标记物的作用。通常，区分恶性组织和健康器官是有利的治疗策略，原因在于，使药物直接选择性靶向到肿瘤组织使得药物局部浓度提高。

为了特异性检测和靶向ED-B，使用噬菌体展示抗体技术提供了重组抗体片段。分离的抗体片段中的一种为L19单链Fv（Carnemolla等人 (1996) Int. J. Cancer 68, 397-405；Ebbinghaus等人 (2004) Curr. Pharm. Des. 10, 1537-1549）。目前通过L19组合有效的细胞毒性药剂来解决ED-B显示了癌症治疗和诊断的前景（Schliemann和Neri (2007) Biochim. Biophys. Acta 1776, 175-192；Kaspar等人 (2006) Int. J. Cancer 118, 1331-1339）。

然而，L19 scFv片段易于寡聚化。

由于在治疗阿尔茨海默氏病和肿瘤的诊断或治疗中存在的上述问题，本发明的目的是提供可以用于治疗和肿瘤的诊断或治疗中的替代方法和化合物。

发明内容

本发明人发现，源自脂质运载蛋白2的蛋白的特定突变蛋白由于其稳定性更好并且尺寸更小，因此是具有吸引力的化合物。本发明人鉴定了特定组的脂质运载蛋白2突变蛋白，其在特定位点具有突变，显示具有例如与ED-B的高亲和力和特异性。这种Lcn2突变蛋白以高灵敏性特异性地识别人细胞上的含ED-B的纤连蛋白，因而显示了作为用于诊断和治疗肿瘤疾病的治疗试剂的前景。

本发明人还得以鉴定了与Aβ肽具有高亲和力和特异性的特定Lcn2突变蛋白。这种Lcn2突变蛋白还可以抑制Aβ聚集，并因而显示了在进一步改进和修饰后可以作为治疗AD的治疗试剂的前景。

此外，本发明还描述了基于人Lcn2支架的新随机文库，所述文库允许有效产生通常与给定靶标具有高亲和力和特异性的突变蛋白，例如本发明的突变蛋白。这种文库或其部分的实例示于图1和2。

在一个方面，至少在编码hLcn2线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中任一个的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸三联体处，通过此位置处以核苷酸三联体组实现的替换，进行随机突变。核苷酸三联体组可以是指、但不限于(a)少于由核苷酸NNN编码的64个可能的三联体（如果N = A、T、G、C，则表示4x4x4=64个可能的三联体），(b)少于由核苷酸NNK或NNS编码的32个可能的三联体，(c)少于编码全部20个天然蛋白氨基酸的必需三联体。在另一个实施方案中，在突变期间，编码半胱氨酸的核苷酸三联体不用于替换。这意味着突变不带来在原始未经突变的序列中不包含的携带新半胱氨酸的突变蛋白。因而，在这一方面规定了那些核苷酸三联体将被引入到如本段落所规定的待突变位置（同样参见实施例1和图2）。

因而，在第一方面，本发明涉及一种产生源自人脂质运载蛋白2（Lcn2；也称为人中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白即hNGAL或称为siderocalin）的突变蛋白的方法。以此方法获得的突变蛋白能够以可检测的亲和力结合非天然靶标。该方法包括：使编码人脂质运载蛋白2（Lcn2，hNGAL）的核酸分子发生突变，所述突变发生在对应于人脂质运载蛋白2线性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中的至少一个处，从而得到一种或多种突变蛋白核酸分子。

根据上文，术语“人脂质运载蛋白2”或“人中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(hNGAL)”包括来自其它物种的已被鉴定或尚未分离的结构同源物，所述结构同源物具有大于约60%的氨基酸序列同源性或序列同一性。优选的是，上文描述的这些人脂质运载蛋白在对应于hNGAL线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的序列位置中的任一个处包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个突变的氨基酸残基。本文使用的术语“同源性”以其通常的含义在本文中使用，并且包括相同氨基酸以及认为是在两个互相比较的蛋白质线性氨基酸序列等价位置处的保守替换的氨基酸（例如天冬氨酸残基交换谷氨酸残基）。本发明所用的术语“序列同一性”或“同一性”表示本发明多肽序列与有关序列同源性比对之后，形成配对的相同残基相对于这两个序列中较长一个的残基数量的百分比。

本文中，使用程序BLASTP，blastp 2.2.5版（2002年11月16日；参见Altschul, S. F.等人 (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402）测定序列同源性或序列同一性百分比。同源性百分比基于包括前肽序列的完整多肽序列比对（matrix: BLOSUM 62; gap costs: 11.1; cutoff value set to 10^-3），在配对比较中使用人脂质运载蛋白2作为参考。其计算为，以BLASTP程序输出的结果表示的“阳性”（同源氨基酸）除以该程序选择用于比对的氨基酸总数的百分比。在这方面应注意，所选择的氨基酸的总数可以与人脂质运载蛋白2的长度不同。

在不同于人脂质运载蛋白2的蛋白用于本发明的情况下，针对人脂质运载蛋白2给出的突变序列位置的定义可以在公开的序列比对或比对方法的帮助下指定给该其它脂质运载蛋白，所述公开的序列比对或比对方法是技术人员可获得的。可以例如如WO 99/16873（参见本文图3）中所述，使用例如公开的比对（例如Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 241-248的图1中的比对）进行序列比对。如果可获得脂质运载蛋白的三维结构，则可以将结构叠加用确定要进行本发明的突变的那些序列位置。结构分析的其它方法，例如多维核磁共振波谱法也可用于此目的。

人脂质运载蛋白2的同源物也可以是人脂质运载蛋白2的突变蛋白本身，其中在不同于本发明中选择的位置的位置处引入氨基酸替换。例如，这种突变蛋白可以是这样的蛋白：相比于人脂质运载蛋白2的野生型序列，蛋白中的β桶的溶剂暴露表面处的位置被突变，以便提高蛋白的溶解性或稳定性。

通常，术语“人脂质运载蛋白2”包括与人脂质运载蛋白2的序列同源性或序列同一性大于60%、70%、80%、85%、90%或95%的所有蛋白。优选的是，上文描述的这些人脂质运载蛋白在对应于hNGAL线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的序列位置中的任一个处包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个突变的氨基酸残基。

因而，在另一方面，本发明提供了一种源自人脂质运载蛋白2的突变蛋白（即，人脂质运载蛋白突变蛋白或突变的人脂质运载蛋白，优选突变的成熟hNGAL，其中所述成熟hNGAL具有SWISS-PROT数据库登记号P80188，更优选所述成熟hNGAL具有SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列）。此突变蛋白在对应于人Lcn2线性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中的任一个处包含至少一个或两个突变的氨基酸残基，并且其中该突变蛋白以可检测的亲和力结合给定非天然靶标。

本文使用的“突变蛋白”、“突变的”的实体（蛋白或核酸）或“突变体”是指，相比于天然存在的（野生型）核酸或蛋白“参照”支架，分别为一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。优选地，分别交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数量为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多，例如25、30、35、40、45或50。

本文使用的术语“人中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白”或“hNGAL”或“脂质运载蛋白2”或“Lcn2”是指具有SWISS-PROT数据库登记号P80188的成熟hNGAL（本文示例为SEQ ID NO: 44）。

在此上下文中，应注意本发明基于下述令人吃惊的发现：使人脂质运载蛋白2、大鼠α2微球蛋白相关蛋白(A2m)和小鼠24p3/uterocalin(24p3)在这些上文提及的3个序列位置中的一个或多个处进行突变，提供了具有结合预定靶标的足够亲和力的突变蛋白，所述预定靶标可以包括、但不限于肽、蛋白、蛋白的片段或结构域和小有机分子。

给定靶标可以是任何期望的非天然靶标/配体。在一个实施方案中，术语“非天然配体”是指在生理条件下不结合天然的成熟hNGAL的化合物。

本文针对非天然靶标使用的术语“有机分子”或“小有机分子”是指这样的有机分子：其包含至少两个碳原子，但是优选不大于7或12个可旋转碳键，分子量范围为100至2000道尔顿，优选100至1000道尔顿，并且任选地包含一个或两个金属原子。

本文针对非天然靶标使用的术语“肽”是指具有2至45个氨基酸的二肽或寡肽。在一个实施方案中，该肽具有2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15或2-10个氨基酸残基。该肽可以是天然存在的肽或合成肽，并且除了20个天然存在的L-氨基酸之外，还可以包括D-氨基酸、非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物。在一个实施方案中，该肽为β淀粉样肽（Aβ或Aβ）。在另一个实施方案中，β淀粉样肽为Aβ40肽或Aβ42肽。

在一个实施方案中，该小有机分子为显示具有免疫半抗原的特征的化合物。

在一个实施方案中，非天然靶标是蛋白，且是纤连蛋白或其结构域，例如EB-结构域或EB-结构域的片段。

本发明的人脂质运载蛋白2突变蛋白可以包含位于突变的氨基酸序列位置之外的野生型（天然）氨基酸序列。在其它方面，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白还可以含有进行突变的序列位置之外的氨基酸突变，只要这些突变不干扰突变蛋白的结合活性和折叠即可。使用已建立的标准方法（Sambrook, J.等人(1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）可以非常容易地在DNA水平上实现此类突变。氨基酸序列的可能改变为插入或缺失以及氨基酸替换。此类替换可以是保守的，即氨基酸残基被化学上相似的氨基酸残基替代。保守替换的实例为以下组成员的替代：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可以在氨基酸序列中引入非保守改变。此外，除了替代单一的氨基酸残基，还可以插入或缺失人脂质运载蛋白2一级结构的一个或多个连续的氨基酸，只要这些缺失或插入产生稳定的折叠/功能突变蛋白即可。

总的来说，氨基酸序列的这种修饰包括单一氨基酸位置的定点突变，以便通过掺入特定限制性酶的切割位点而简化突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，可掺入这些突变以进一步提高脂质运载蛋白突变蛋白与给定靶标的亲和力。并且，可以引入突变，以便调节突变蛋白的某些特征，例如以改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶解性，或者如果必要的话以降低聚集倾向。例如，天然存在的半胱氨酸残基可以突变成其它氨基酸，以防止二硫键的形成。然而，还可以有意地将其它氨基酸序列位置突变成半胱氨酸，以便引入新的反应性基团，例如用于缀合至其它化合物，例如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉（HES）、生物素、肽或蛋白质或者用于形成非天然的二硫键。将半胱氨酸残基引入人脂质运载蛋白2突变蛋白的氨基酸序列的这种突变的示例性可能包括，在对应于hNGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的序列位置中的至少一个处引入半胱氨酸(Cys)残基。产生的位于氨基酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146和/或158中的任一个一侧的硫醇部分可以用于对突变蛋白进行PEG化或HES化，例如以便提高相应的人脂质运载蛋白2突变蛋白的血清半衰期。

在一个实施方案中，本发明的突变蛋白包含在对应于人脂质运载蛋白2线性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中至少2个或全部3个处突变的氨基酸残基。

在本发明的另一个实施方案中，该突变蛋白在对应于hNGAL线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的序列位置中的任一个处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个突变的氨基酸残基。在另一个实施方案中，该突变蛋白在hNGAL线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138中的任一个处包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个突变的氨基酸残基。在另一个实施方案中，该突变蛋白在人脂质运载蛋白2线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138中的任一个处包含18、19或20个突变的氨基酸残基。

在本发明的一个实施方案中，该突变蛋白在上文列出的序列位置中的至少任意10、14、15、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、35或全部45个处包含突变的氨基酸残基。

本发明的结合β淀粉样肽（例如Aβ40肽或Aβ42肽）的突变蛋白可以相对示例于图17的成熟人脂质运载蛋白2野生型氨基酸序列(Lcn2)包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替代，所述氨基酸替代包括、但不限于Leu36 → Val或Cys；Ala40 → Tyr或Lys或Val；Ile41 → Thr或Ser或Leu；Gln49 → Leu或Trp；Leu70→ Gly；Arg72 → Gly或Asp；Lys73 → Leu或Thr或Asp；Asp77 → Asn或His或Leu；Trp79 → Lys；Asn96 → Ile或Arg；Tyr100 → Gln或Arg或Glu；Leu103 → Met或Arg或Gly；Tyr106→ Tyr或Ala或Trp；Lys125 → Thr或Val或Glu；Ser127 → Gly或Gln或Ala；Tyr132 → Met或Ser或Thr；以及Lys134 → Asn。已发现，这种突变蛋白可以减少体外或体内Aβ聚集。优选的是，本文描述的突变蛋白结合Aβ且抑制Aβ聚集，所述Aβ优选Aβ40，更优选在实施例11所指定的测定条件下（优选地包括突变蛋白：Aβ40的比率为1:10）。本发明还涉及如上文描述的突变蛋白，当与突变蛋白US7比较时，其具有可比较的生物学功能。“可比较的生物学功能”表示，这些突变蛋白能够结合和抑制Aβ，优选Aβ40，其中就US7的聚集抑制活性的差异不大于约40%、30%、20%、15%、10%、5%、2,5%、2%或1%，例如在等同于实施例11中所列出的那些条件或与其相同的条件下（优选地，包括突变蛋白：Aβ40的比率为1:10）。本发明还涉及本文描述的突变蛋白，其用于治疗或预防神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病。

在一个实施方案中，本发明的结合β淀粉样肽（例如Aβ40肽或Aβ42肽）的突变蛋白包含下述氨基酸替代：Leu36 → Val；Ala40 →Tyr；Ile41 → Thr；Gln49 → Leu；Leu70 → Gly；Lys73→ Leu；Asp77 → Asn；Trp79 → Lys；Asn96 → Ile；Tyr100 → Gln；Leu103 → Met；Lys125 → Thr；Ser127 →Gly；Tyr132 → Met；以及Lys134 → Asn。包含这种氨基酸替代的突变蛋白的实例为示例于图17的S1-A4 (SEQ ID NO: 39)。

在另一个实施方案中，本发明的结合β淀粉样肽（例如Aβ40肽或Aβ42肽）的突变蛋白包含下述氨基酸替代：Leu36 → Val；Ala40 →Lys；Ile41 → Ser；Gln49 → Trp；Leu70 → Gly；Arg72→ Gly；Lys73 → Thr；Asp77 → His；Trp79 → Lys；Asn96 → Arg；Tyr100 → Arg；Leu103 → Arg；Tyr106→ Ala；Lys125 → Val；Ser127 → Gln；Tyr132 → Ser；以及Lys134 → Asn。包含这种氨基酸替代的突变蛋白的实例为示例于图17的US-7 (SEQ ID NO: 41)。

本发明还预见了突变的成熟hNGAL脂质运载蛋白（如保藏于SWISS-PROT数据库，登记号为P80188，优选具有SEQ ID NO: 40中所示的氨基酸序列），其在对应于野生型hNGAL线性多肽序列的位置36、40、41、49、70、72、73、77、79、96、100、103、106、125、127、132、134的位置处包含一个或多个如本文描述的突变氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明的结合β淀粉样肽（例如Aβ40肽或Aβ42肽）的突变蛋白包含下述氨基酸替代：Leu36 → Cys；Ala40 →Val；Ile41 → Leu；Gln49 → Leu；Leu70 → Gly；Arg72→ Asp；Lys73 → Asp；Asp77 → Leu；Trp79 → Lys；Asn96 → Arg；Tyr100 → Glu；Leu103 → Gly；Tyr106 →Trp；Lys125 → Glu；Ser127 → Ala；Tyr132 → Thr；以及Lys134 → Asn。包含这种氨基酸替代的突变蛋白的实例为示例于图17的H1-G1 (SEQ ID NO: 43)。

在另一个实施方案中，本发明的结合β淀粉样肽（例如Aβ40肽或Aβ42肽）的突变蛋白包含下述氨基酸替代：Leu36 → Ala；Ala40 →Val；Ile41 → Leu；Gln49 → Leu；Leu70 → Gly；Arg72→ Asp；Lys73 → Asp；Asp77 → Leu；Trp79 → Lys；Asn96 → Arg；Tyr100 → Glu；Leu103 → Gly；Tyr106 →Trp；Lys125 → Glu；Ser127 → Ala；Tyr132 → Thr；以及Lys134 → Asn。包含这种氨基酸替代的突变蛋白的实例为示例为SEQ ID NO: 50的H1GA。

优选的是，本文上文描述的突变蛋白结合Aβ且抑制Aβ聚集，所述Aβ优选Aβ40，更优选在实施例23所指定的测定条件下（优选地，Aβ40：H1GA的比率为10:2）。本发明还涉及如上文描述的突变蛋白，当与突变蛋白H1GA比较时，其具有可比较的生物学功能。“可比较的生物学功能”表示，这些突变蛋白能够结合和抑制Aβ，优选Aβ40，其中就H1GA的聚集抑制活性的差异不大于约40%、30%、20%、15%、10%、5%、2,5%、2%或1%，例如在等同于实施例23中所列出的那些条件或与其相同的条件下（优选地，Aβ40：H1GA的比率为10:2）。本发明还涉及本文描述的突变蛋白，其用于治疗或预防神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病。

在另一个实施方案中，本发明的结合β淀粉样肽（例如Aβ40肽或Aβ42肽）的突变蛋白包含下述氨基酸替代：Leu36 → Val；Ala40 →Val；Ile41 → Leu；Gln49 → Leu；Leu70 → Gly；Arg72→ Asp；Lys73 → Asp；Asp77 → Leu；Trp79 → Lys；Asn96 → Arg；Tyr100 → Glu；Leu103 → Gly；Tyr106 →Trp；Lys125 → Glu；Ser127 → Ala；Tyr132 → Thr；以及Lys134 → Asn。包含这种氨基酸替代的突变蛋白的实例为示例为SEQ ID NO: 52的H1GV。

优选的是，本文上文描述的突变蛋白在实施例21所指定的测定条件下结合Aβ40。本发明还涉及如上文描述的突变蛋白，当与突变蛋白H1GV比较时，其具有可比较的生物学功能。“可比较的生物学功能”表示，这些突变蛋白能够结合和抑制Aβ，优选Aβ40，其中就H1GV的聚集抑制活性的差异不大于约40%、30%、20%、15%、10%、5%、2,5%、2%或1%，例如在等同于实施例21中所列出的那些条件或与其相同的条件下。本发明还涉及本文描述的突变蛋白，其用于治疗或预防神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病。

在另一个实施方案中，本发明的结合额外结构域B或其片段的突变蛋白包含下述氨基酸替代：Leu36 → Lys；Ala40 → His；Ile41 →Asp；Gln49 → Arg；Tyr52 → Gln；Ser68 → Asn；Leu70→ Arg；Arg72 → Val；Lys73 → His；Asp77 → Asn；Trp79 → Arg；Arg81 → Trp；Tyr100 → Trp；Tyr106 →Trp；Lys125 → Arg；Ser127 → Tyr；Tyr132 → Leu；Lys134 → Glu以及Ser146 → Asn。包含这种氨基酸替代的突变蛋白的实例为示例于图17的N7A (SEQ ID NO: 20)。

在另一个实施方案中，本发明的结合额外结构域B或其片段的突变蛋白包含下述氨基酸替代：Leu36 → Arg；Ala40 → Met；Ile41 →Arg；Gln49 → Ala；Tyr52 → Val；Ser68 → Lys；Leu70→ Met；Arg72 → Gln；Lys73 → Arg；Asp77 → Lys；Trp79 → Met；Arg81 → Asn；Asn96 → Ala；Tyr100 → Pro；Leu103 → Pro；Tyr106 → Thr；Lys125 → His；Ser127 → Phe；以及Lys134 → His。包含这种氨基酸替代的突变蛋白的实例为示例于图17的N9B (SEQ ID NO: 24)。

在另一个实施方案中，本发明的结合额外结构域B或其片段的突变蛋白包含下述氨基酸替代：Leu36 → Ala；Ala40 → Thr；Ile41 →Trp；Gln49 → Tyr；Tyr52 → Gln；Ser68 → Asn；Arg72→ Met；Lys73 → Ser；Asp77 →Arg；Trp79 → Met；Arg81 → His；Asn96 → Ser；Tyr100→ Trp；Tyr106 → Trp；Lys125 → Arg；Ser127 → Tyr；Tyr132 → Phe；以及Lys134 → Gly。包含这种氨基酸替代的突变蛋白的实例为示例于图17的N10D (SEQ ID NO: 26)。

在另一个实施方案中，本发明的结合额外结构域B或其片段的突变蛋白包含下述氨基酸替代：Leu36 → Glu；Ala40 → Ser；Ile41 →Leu；Gln49 → Arg；Leu70 → Arg；Lys73 → Ser；Asp77→ His；Trp79 → Leu；Asn96 → Leu；Tyr100 → Lys；Leu103 → His；Tyr106 → Phe；Lys125 → Thr；Ser127 →Ala；以及Lys134 → Phe。包含这种氨基酸替代的突变蛋白的实例为示例于图17的N7E (SEQ ID NO: 22)。

参考图17描述的上述突变蛋白可以包括其它氨基酸替代。该突变蛋白可以进一步包括下述氨基酸替代：所述氨基酸替代可以包括、但不限于Gln28 → His或Cys87 → Ser。其它可能的氨基酸替代包括、但不限于Tyr52 → Gln或Val；Ser68 → Lys或Asn；或Arg81 →Trp或Asn或His。

本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够以可检测的亲和力、即以至少200 nM的解离常数(K_D)结合期望的非天然靶标。在另一个实施方案中，该突变蛋白以1 µM或更低、100 µM或更低、1 µM或更低、500nM、200 nM或更低、100 nM或更低、50 nM或更低、10 nM或更低、或者1 nM或更低的KD结合给定非天然靶标。在另一个实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白以对于给定靶标的至少100、20、1 nM或甚至更低的解离常数结合期望的靶标。可以通过多种方法测量突变蛋白与期望靶标的结合亲和力，所述方法例如荧光滴定法、竞争ELISA或表面等离子共振(BIAcore)。

对本领域技术人员显而易见的是，与靶标形成复合体取决于多种因素，例如结合配偶体的浓度、竞争剂的存在、缓冲体系的离子强度等。选择和富集通常在允许分离脂质运载蛋白突变蛋白的条件下进行，所述脂质运载蛋白突变蛋白在与期望靶标复合时具有如上文所述的解离常数。然而，可以在多种严格程度下进行洗涤和洗脱步骤。例如，可以在这样的条件下进行选择：所述条件有利于与靶标显示缓慢解离（或换言之，低K_off速率）的突变蛋白与靶标形成复合体。或者，可以在这样的条件下进行选择：所述条件有利于快速（或换言之，高K_on速率）形成突变蛋白与靶标的复合体。

本发明的突变蛋白通常作为单体蛋白存在。然而，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白还可能能够自发地二聚化或寡聚化。尽管对一些应用而言可能优选使用形成稳定单体的脂质运载蛋白突变蛋白（例如由于更快的扩散和更好的组织透过性），但在其它情况下使用形成稳定的同型二聚体或多聚体的脂质运载蛋白突变蛋白可能是有利的，因为这种多聚体可以提供对给定靶标（进一步）提高的亲和力和/或亲合力。此外，寡聚体形式的脂质运载蛋白突变蛋白可具有更慢的解离速率或延长的血清半衰期。

还应注意，各个突变蛋白及其配体之间的复合物形成受多种因素影响，例如各自的结合配偶体的浓度、竞争剂的存在、pH和使用的缓冲体系的离子强度以及用于测定解离常数K_D的实验方法（例如例如荧光滴定法、竞争ELISA或表面等离子共振等）或甚至用于评估实验数据的数学算法。

因此，本领域技术人员也十分清楚，该K_D值（各个突变蛋白与其配体形成的复合体的解离常数）可在一定实验范围内变化，这取决于用于测定特定脂质运载蛋白突变蛋白对给定配体的亲和力的方法和实验设置。这意味着，取决于例如是通过表面等离振子共振(Biacore)还是通过竞争ELISA测定K_D值，所测得的K_D值可能稍有变化或者是可接受的范围。

在一个实施方案中，本文公开的突变蛋白在N或C端连接亲和标签，例如五组氨酸标签、六组氨酸标签或Strep-标签^®。因而，本申请包括带有这种标签的所有明确和大致描述的突变蛋白。

本发明结合特征脂质运载蛋白突变蛋白片段使用的术语“片段”涉及源自全长成熟Lcn2的蛋白或肽，其在N端和/或C端截短，即缺少至少一个N端和/或C端氨基酸。这种片段包括成熟Lcn2一级序列的优选至少10个、更优选20个、最优选30个或更多的连续氨基酸，并且通常可在成熟Lcn2的免疫测定中检测到。

本发明范围内还包括在其免疫原性方面发生了改变的上述突变蛋白。

细胞毒性T细胞识别与I类主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原呈递细胞的细胞表面上的肽抗原。肽与MHC分子结合的能力是等位基因特异性的，并与其免疫原性相关。为了降低给定蛋白质的免疫原性，预测蛋白质中哪些肽具有与给定MHC分子结合的能力十分有价值。先前已经描述了利用计算机线程法(computational threading approach)鉴定潜在T细胞表位来预测给定肽序列与I类MHC分子的结合的方法（Altuvia等人 (1995) J. Mol. Biol. 249: 244-250）。

这样的方法还可以用于鉴定本发明突变蛋白中的潜在T细胞表位，并用于根据其预期用途而基于其预测免疫原性选择特定的突变蛋白。它还可以对预测含有T细胞表位的肽区域进行额外的突变，以减少或消除这些T细胞表位，因而使免疫原性最小化。从遗传改造的抗体中除去两性表位已有描述（Mateo等人 (2000) Hybridoma 19(6):463-471），并可以适用于本发明的突变蛋白。

这样获得的突变蛋白可以具有最小化的免疫原性，这在其治疗和诊断应用中是期望的，如下文所述。

对于一些应用，使用缀合形式的本发明的突变蛋白也是有用的。相应地，本发明还涉及与这样的化合物缀合的脂质运载蛋白突变蛋白：所述化合物包括、但不限于有机分子、酶标记、有色标记、细胞抑制剂、毒素、可以被光活化且适用于光动力治疗的标记、荧光标记、放射性标记、生色标记、发光标记、金属复合物、金属例如胶体金、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、化疗金属等等。突变蛋白还可以缀合至有机药物分子。可以通过本领域已知的任何常规偶联方法进行缀合。

通常，可以以任何合适的化学物质或酶来标记Lcn2突变蛋白，所述化学物质或酶在化学、物理、光学或酶促反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号。物理反应并且同时是光学反应/标记物的实例是在照射后发出荧光。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶是催化形成生色反应产物的酶标记（也是光学标记）的实例。通常，常用于抗体的所有标记（除了仅用于免疫球蛋白Fc部分的糖部分的那些标记以外）也均可用于与本发明突变蛋白缀合。本发明的突变蛋白还可以缀合任何合适的治疗活性剂，例如用于将这样的活性剂靶向递送至给定细胞、组织或器官或者用于选择性靶向细胞（如肿瘤细胞）而不影响周围的正常细胞。这些治疗活性剂的实例包括放射性核素、毒素、小有机分子和治疗肽（例如作为细胞表面受体激动剂/拮抗剂的肽或者竞争给定细胞靶标上蛋白质结合位点的肽）。合适的毒素的实例包括、但不限于百日咳毒素、白喉毒素、蓖麻毒素、肥皂草素、绿脓杆菌外毒素、加里刹毒素或其衍生物、紫杉烷、类美坦素、tubulysin或dolastatin类似物。该dolastatin类似物可以是auristatin E、单甲基auristatin E、auristatin PYE和auristatin PHE。细胞抑制剂的实例包括、但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、泰索帝（多西他赛）、紫杉醇、蒽环霉素（多柔比星）、甲氨蝶呤、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、达卡巴嗪、环磷酰胺、依托泊苷、阿霉素、喜树碱、Combretatastin A-4相关化合物、磺胺、噁唑啉、苯并[b]噻吩合成螺缩酮吡喃、单四氢呋喃化合物、curacin和curacin衍生物、甲氧基雌二醇衍生物和甲酰四氢叶酸。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白还可缀合治疗活性核酸，如反义核酸分子、小干扰RNA、小RNA或核酶。这种缀合物可通过本领域熟知的方法产生。

在一个实施方案中，本发明的突变蛋白还可以与靶向特定机体部位的靶向部分偶联，以便将本发明突变蛋白递送至体内期望的部位或区域。可为理想的这种修饰的一个实例是穿过血脑屏障。为了穿过血脑屏障，本发明的突变蛋白可以与有利于主动转运穿过该屏障的部分偶联（参见Gaillard PJ等人(2005). International Congress Series. 1277,185-198或Gaillard PJ等人 (2005) Expert Opin Drug Deliv. 2(2), 299-309）。这样的化合物例如以商品名2B-Trans™ (BBB technologies BV, Leiden, NL)购得。本发明的突变蛋白可以偶联的其它示例性靶向分子包括与期望的靶标分子具有亲和力的抗体、抗体片段或脂质运载蛋白突变蛋白。靶向部分的靶标分子可以例如为细胞表面抗原。细胞表面抗原可以对于细胞或组织类型（例如癌症细胞）特异性的。这种细胞表面蛋白的示例性实例为HER-2或蛋白多糖例如NEU-2。

如上文所述，在一些实施方案中，本发明的突变蛋白可以与延长该突变蛋白的血清半衰期的化合物缀合（在这方面也参见PCT公开WO 2006/56464，其中参考对CTLA-4具有结合亲和力的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的突变蛋白描述了这种缀合策略）。延长血清半衰期的化合物可以是聚亚烷基二醇分子，例如聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物；羟乙基淀粉；脂肪酸分子，例如棕榈酸(Vajo & Duckworth 2000, Pharmacol. Rev. 52, 1-9)、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白或其片段、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白、转铁蛋白等等。白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体、抗体片段，包括结构域抗体（参见例如美国专利6,696,245）或者对白蛋白具有结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白。相应地，用于延长本发明脂质运载蛋白突变蛋白半衰期的合适的缀合化合物包括白蛋白（Osborn等人 (2002) J. Pharmacol.Exp. Ther. 303, 540-548）或者白蛋白结合蛋白，例如细菌白蛋白结合结构域，例如链球菌G蛋白中的一种（König, T. 和 Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83)。可以用作缀合配偶体的白蛋白结合肽的其他实例例如具有Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cys共有序列的那些，其中Xaa₁是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa₂是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa₃是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；Xaa₄是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如美国专利申请2003/0069395或Dennis等人（Dennis等人(2002) J. Biol. Chem.277、35035-35043）所述。

在其他实施方案中，白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段可以用作本发明脂质运载蛋白突变蛋白的化合物，以延长该突变蛋白的血清半衰期。术语“白蛋白”包括所有哺乳动物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可以如美国专利5,728,553或欧洲专利申请EP 0 330 451和EP 0 361 991所述重组产生。用作蛋白稳定剂的重组人白蛋白(Recombumin®)例如可从Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK)得到。

如果所述白蛋白结合蛋白是抗体片段，则它可以是结构域抗体。结构域抗体(dAb)被改造为允许精确控制生理特性和体内半衰期，以产生最佳的安全性和效力产品特性。结构域抗体例如可从Domantis Ltd.(Cambridge, UK and MA, USA)商购得到。

如果使用转铁蛋白作为延长本发明突变蛋白的血清半衰期的部分，该突变蛋白可以基因操作方式融合至非糖基化转铁蛋白的N端或C端，或者这两个末端。非糖基化的转铁蛋白具有14-17天的半衰期，转铁蛋白融合蛋白将相似地具有延长的半衰期。转铁蛋白载体还提供高生物利用率、生物分布和循环稳定性。该技术可从BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, USA)商购获得。用作蛋白稳定剂的重组人转铁蛋白(DeltaFerrin™)也可从Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK)商购获得。

如果使用免疫球蛋白的Fc部分来延长本发明突变蛋白的血清半衰期，则可以使用可从Syntonix Pharmaceuticals, Inc (MA, USA)商购获得的SynFusion™技术。使用该Fc融合技术允许产生作用更长的生物药物，并可以例如由与抗体的Fc区连接的两个拷贝的突变蛋白组成，以改进药代动力学、溶解度和产生效率。

延长本发明突变蛋白的半衰期的另一个替代方案是将本发明突变蛋白的N端或C端融合到富含甘氨酸的长的非结构化的柔性序列（例如具有约20至80个连续甘氨酸残基的聚甘氨酸）。公开于例如WO2007/038619的这种方法也称为“rPEG”（重组PEG）。

如果将聚亚烷基二醇用作延长突变蛋白的半衰期的化合物，则该聚亚烷基二醇可以是被取代的或未取代的。其还可以是活化的聚亚烷基衍生物。合适的化合物的实例为聚乙二醇(PEG)分子，如WO 99/64016、美国专利6,177,074或美国专利6,403,564中关于干扰素所描述的，或者如针对其它蛋白质所描述的，所述其它蛋白质例如PEG修饰的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶（参见例如Fuertges等人(1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control. Release 11, 139-148）。这样的聚合物（优选聚乙二醇）的分子量可以为约300至约70.000道尔顿的范围，包括例如分子量为约10.000、约20.000、约30.000或约40.000道尔顿的聚乙二醇。此外，例如如美国专利6,500,930或6,620,413中所述，可将碳水化合物的寡聚物和多聚体（如淀粉或羟乙基淀粉(HES)）缀合至本发明的突变蛋白，以用于延长血清半衰期的目的。

在另一实施方案中，为了提供用于将上文化合物中的一种缀合至本发明突变蛋白的合适的氨基酸侧链，可以通过突变引入人工氨基酸。通常，这种人工氨基酸设计成更具反应性，因而有利于缀合至期望部分。这种可以经由人工tRNA引入的人工氨基酸的一个实例是对乙酰基苯丙氨酸。

对于本文公开的突变蛋白的若干应用而言，以融合蛋白的形式使用它们可能是有利的。在一些实施方案中，本发明的突变蛋白在其N端和/或其C端融合至蛋白质、蛋白质结构域或肽（如信号序列和/或亲和标签）。

对于药物应用而言，本发明的突变蛋白可以融合至延长该突变蛋白体内血清半衰期的融合配偶体（也参见PCT公开WO 2006/56464，其中参考对CTLA-4具有结合亲和力的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的突变蛋白描述了合适的融合配偶体）。类似于上文所述的缀合化合物，融合配偶体可以是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白等等。再次，白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白或者对白蛋白具有结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。相应地，用于延长本发明脂质运载蛋白突变蛋白的半衰期的合适的融合配偶体包括白蛋白（Osborn, B.L.等人 (2002)同上 J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548）或白蛋白结合蛋白，例如细菌白蛋白结合结构域，例如链球菌G蛋白中的一种（König, T.和Skerra, A. (1998)同上 J. Immunol. Methods 218, 73-83）。Dennis等人，同上(2002)或美国专利申请2003/0069395中描述的具有Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cys共有序列的白蛋白结合肽也可以用作融合配偶体，其中Xaa₁是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa₂是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa₃是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；Xaa₄是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr。还可以使用白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段作为本发明脂质运载蛋白突变蛋白的融合配偶体。术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。重组产生白蛋白或其片段是本领域熟知的，并例如描述于美国专利5,728,553、欧洲专利申请EP 0 330 451或EP 0 361991。

融合配偶体可以赋予本发明脂质运载蛋白突变蛋白新的特征，例如酶活性或对其他分子的结合亲和力。合适的融合蛋白的实例为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶、G蛋白的白蛋白结合结构域、A蛋白、抗体片段、寡聚化结构域、具有相同或不同结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白（导致形成“双运载蛋白”，参见Schlehuber, S.和Skerra, A. (2001), Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dual specificity derived from the lipocalin fold. Biol. Chem. 382, 1335-1342）或毒素。

特别地，可以将本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与独立的酶活性位点融合，使得得到的融合蛋白的两个“组分”一起作用于给定治疗靶标。脂质运载蛋白突变蛋白的结合结构域附着至致病靶标，从而允许酶结构域消除该靶标的生物学功能。

亲和标签例如Strep-tag®或Strep-tag® II（Schmidt, T.G.M.等人 (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766）、myc-标签、FLAG-标签、His6-标签或HA-标签，或者例如谷胱甘肽-S-转移酶的蛋白质也允许对重组蛋白容易地进行检测和/或纯化，是优选融合配偶体的其它实例。最后，具有生色或荧光特性的蛋白质如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)也是用于本发明脂质运载蛋白突变蛋白的合适的融合配偶体。

本文使用的术语“融合蛋白”还包括含有信号序列的根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白。多肽N端的信号序列将该多肽引导至特定的细胞区室，例如大肠杆菌的外周胞质或真核细胞的内质网。大量的信号序列是本领域已知的。用于将多肽分泌进入大肠杆菌外周胞质的优选信号序列是OmpA-信号序列。

本发明还涉及包含编码本文所述突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子（DNA和RNA）。由于遗传密码的简并性允许某些密码子替换成指定相同氨基酸的其它密码子，因此本发明不限于编码本发明突变蛋白的特定核酸分子，而是包括包含编码功能性突变蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。

因此，本发明还包括编码根据本发明的突变蛋白的核酸序列，其包括至少在Lcn2线性多肽序列的氨基酸序列位置96、100和106中任一个的一个密码子处的突变。

如本文公开的本发明还包括编码Lcn2突变蛋白的核酸分子，其包含在实验突变所指出序列位置之外的其它突变。这种突变经常是可以容忍的，或甚至可以证明是有利的，例如如果它们有助于提高该突变蛋白的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和力的话。

本申请中公开的核酸分子可以“可操作地连接”至调节序列，从而能够表达该核酸分子。

如果核酸分子（如DNA）包含含有关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，并且这种序列“可操作地连接”至编码多肽的核苷酸序列，则称其“能够表达核酸分子”或能“允许表达核苷酸序列”。可操作的连接是这样的连接：其中调节序列元件与待表达序列以使得基因能够表达的方式相连。基因表达所需调节区的确切性质在物种之间可能不同，但通常，这些区域包含启动子，其在原核生物中包含启动子本身（即指导转录起始的DNA元件）以及在转录成RNA时将发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区通常包括参与转录和翻译起始的5’非编码序列（如-35/-10盒），以及原核生物中的Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5’加帽元件。这些区域还可以包括增强子或阻抑基因元件以及用于将天然多肽靶向至宿主细胞特定区室的翻译的信号和前导序列。

此外，3’非编码序列可以含有参与转录终止、多腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定宿主细胞中的功能不令人满意，则可以将它们替换成在该细胞中有功能的信号。

因此，本发明的核酸分子可以包含调节序列，优选启动子序列。在另一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子包含启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子为例如tet启动子、lacUV5启动子或T7启动子。可用于在真核细胞中表达的启动子的实例为SV40启动子或CMV启动子。

本发明的核酸分子还可以是载体或其他类型克隆运载体（如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体）的一部分。

在一个实施方案中，核酸分子包含在质粒中。质粒载体指编码融合至目的cDNA的温和噬菌体（如M13或f1）基因间区域或其功能部分的载体。用这样的噬菌粒和合适的辅助噬菌体（如M13K07、VCS-M13或R408）超感染细菌宿主细胞后，产生完整的噬菌体颗粒，从而使得可以将编码的异源cDNA物理偶联至在噬菌体表面上展示的其相应多肽（综述于例如Kay, B.K.等人 (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual,第一版, Academic Press, New York NY；Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401–424，或Rodi, D.J.和Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87–93)。

除了上文描述的调节序列和编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白的核酸序列以外，这种克隆载体可以包括源自与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及赋予转化或转染细胞可选择表型的选择标记物。大量合适的克隆载体是本领域已知的，并可商购得到。

编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白的DNA分子，特别是含有这种脂质运载蛋白突变蛋白的编码序列的克隆载体，可以转化进能够表达该基因的宿主细胞中。可以使用标准技术（Sambrook, J.等人 (1989),同上）进行转化。

因此，本发明还涉及含有本文公开的核酸分子的宿主细胞。

在适于表达编码本发明融合蛋白的核苷酸序列的条件下培养转化的宿主细胞。合适的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌(E. coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或者是真核细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆虫细胞、永生化哺乳动物细胞系（例如HeLa细胞或CHO细胞）或原代哺乳动物细胞。

本发明还涉及用于产生本发明的突变蛋白的方法，其中通过遗传工程方法，从编码该突变蛋白的核酸开始产生该突变蛋白、该突变蛋白的片段或该突变蛋白与另一个多肽的融合蛋白。该方法可以在体内进行，突变蛋白可以在例如细菌或真核宿主生物体中产生，然后从该宿主生物体或其培养物中分离。还可以在体外产生蛋白质，例如使用体外翻译系统。

在体内产生突变蛋白时，通过重组DNA技术（上文已概述）将编码本发明突变蛋白的核酸引入合适的细菌或真核宿主生物体中。为此，首先使用成熟的标准方法（Sambrook, J.等人 (1989), 同上）用克隆载体转化该宿主细胞，所述克隆载体包含编码本发明突变蛋白的核酸分子。然后在允许表达该异源DNA并因而允许合成相应多肽的条件下培养该宿主细胞。之后，从细胞或培养基中回收该多肽。

在一个方面，本发明涉及一种产生本发明的突变蛋白的方法，该方法包括：

(a)使编码人脂质运载蛋白2的核酸分子发生突变，所述突变发生在编码对应于Lcn2线性多肽序列的序列位置96、100和106的任何序列位置中的至少一个的核苷酸三联体处，从而得到一种或多种突变蛋白核酸分子。

该方法可以进一步包括：

(b)在合适的表达系统中表达在(a)中获得的一种或多种突变蛋白核酸分子，以及

(c)通过选择和/或分离富集对给定靶标具有可检测的结合亲和力的一种或多种突变蛋白。

本文使用的术语“突变”表示，选择该实验条件，使得Lcn2（hNGAL；Swiss-Prot数据库目录P80188）给定序列位置处的天然存在的氨基酸可以被替换为在相应天然多肽序列的此特定位置处不存在的至少一个氨基酸。术语“突变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸进行的序列区段长度的（其它）修饰。因而，下述情况在本发明的范围内：例如，所选序列位置处的一个氨基酸被替代为3个随机突变的区段，从而相比于野生型蛋白的相应区段的长度插入两个氨基酸残基。这种插入或缺失可以彼此独立地引入到可以进行本发明的突变的肽区段中的任一个。在本发明的一个示例性实施方案中，若干突变的插入可以引入到所选脂质运载蛋白支架的环AB中（参见国际专利申请WO 2005/019256，其通过引用以其全文并入本文）。术语“随机突变”表示，在某些序列位置处不存在预先确定的单个氨基酸（突变），但是在突变期间，至少两个氨基酸可以以一定可能性被掺入于预定序列位置处。

将人脂质运载蛋白2的编码序列用作进行本发明中选择的肽区段的突变的起点。为了进行所述氨基酸位置的突变，本领域技术人员可以自行选择各种已建立的标准方法来进行定点突变（Sambrook, J.等人 (1989), 上文）。通常使用的技术为使用合成的寡核苷酸的混合物，通过PCR（聚合酶链式反应）引入突变，所述合成的寡核苷酸具有期望序列位置处的简并碱基组成。例如，使用密码子NNK或NNS（其中N =腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；K = 嘌呤或胸腺嘧啶；S= 腺嘌呤或胞嘧啶）允许在突变期间掺入全部20个氨基酸以及琥珀终止密码子，而密码子VVS将可以掺入的氨基酸的数量限制于12个，这是因为其排除了氨基酸Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val被掺入多肽序列的所选择的位置；例如，使用密码子NMS（其中M = 腺嘌呤或胞嘧啶），将所选择的序列位置处可能的氨基酸的数量限制于11个，这是因为其排除了氨基酸Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val被掺入所选择的序列位置处。在这方面应注意，其它氨基酸（除了规则的20个天然存在的氨基酸，例如硒半胱氨酸或吡咯赖氨酸）的密码子可以掺入到突变蛋白的核酸中。还可以的是，如Wang, L.,等人 (2001) Science292, 498-500或Wang, L.,和Schultz, P.G. (2002) Chem. Comm. 1, 1-11描述的，使用通常被识别为终止密码子的“人工”密码子，例如UAG，以插入其它不常见的氨基酸，例如邻甲基-L-酪氨酸或对氨基苯丙氨酸。

使用碱基对特异性降低的核苷酸构件，例如肌苷、8-氧-2’脱氧鸟苷或6(2-脱氧-ß-D-呋喃核糖苷)-3,4-二氢-8H-嘧啶并-1,2-噁嗪-7-酮（Zaccolo等人 (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603），是用于将突变引入到所选序列区段的其它选择。

其它可能是所谓的三联体突变。此方法使用不同核苷酸三联体的混合物，其中每一个均编码一个氨基酸，以掺入到编码序列中（Virnekäs B, Ge L, Plückthun A, Schneider KC, Wellnhofer G, Moroney SE. 1994 Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res 22, 5600-5607）。

一种用于在相应多肽的所选择的区域中引入突变的可行策略基于使用四种寡核苷酸，其中每一个均部分源自要突变的相应的序列区段中的一个。当合成这些寡核苷酸时，本领域技术人员可以采用核酸构件的混合物，以合成那些对应于要突变的氨基酸位置的核苷酸三联体，以使得编码全部天然氨基酸的密码子随机出现，这样最后得以产生脂质运载蛋白肽文库。例如，第一个寡核苷酸在其序列中——除了突变位置——对应于脂质运载蛋白多肽最N端位置处要突变的肽区段的编码链。相应地，第二个寡核苷酸对应于该多肽序列后的第二个序列区段的非编码链。第三个寡核苷酸依次对应于相应的第三个序列区段的编码链。最后，第四个寡核苷酸对应于第四个序列区段的非编码链。可以用相应的第一个和第二个寡核苷酸进行聚合酶链式反应，如果需要，可以单独用相应的第三个和第四个寡核苷酸进行聚合酶链式反应。

可以通过多种已知方法将这两个反应的扩增产物组合成包含从第一个至第四个序列区段的序列的单个核酸，其中已在选定的位置处引入突变。为此，可以使用侧翼寡核苷酸以及一种或多种中介体核酸分子（其贡献第二个与第三个序列区段之间的序列）将两种产物例如进行新的聚合酶链式反应。在选择寡核苷酸序列中用于突变的数目和排列时，本领域技术人员根据其需要有多种备选方案。

可以通过连接将上文限定的核酸分子与缺少的编码脂质运载蛋白多肽的核酸的5’及3’序列和/或载体连接在一起，并可以克隆到已知的宿主生物体中。多种已建立的方法可用于连接和克隆（Sambrook, J.等人 (1989), 同上）。例如，可以将也存在于克隆载体中的限制性内切核酸酶的识别序列改造到所述合成寡核苷酸的序列中。因而，在扩增各PCR产物和酶切割之后，所得的片段可以容易地使用相应的识别序列进行克隆。

也可以经由已知方法将编码选择用于突变的蛋白质的基因内更长的序列区段进行随机突变，例如通过在提高错误率的条件下使用聚合酶链式反应、通过化学突变或通过使用细菌增变菌株。这些方法还可以用于进一步优化脂质运载蛋白突变蛋白的靶标亲和力或特异性。实验突变区段以外可能发生的突变通常是接受的，或者甚至可以证明是有利的，例如如果它们有助于改善脂质运载蛋白突变蛋白的折叠效率或折叠稳定性的话。

根据本发明的一个实施方案，上述方法包括使编码人脂质运载蛋白2蛋白的核酸分子发生突变，所述突变至少发生在编码人脂质运载蛋白2的上文所述的序列位置中的任一个的2或3个核苷酸三联体处。

在另一个实施方案中，该方法进一步包括使核酸分子发生突变，所述突变发生在编码对应于hNGAL线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的任何序列位置中的至少一个核苷酸三联体处。

在另一个实施方案中，该方法包括使核酸分子发生突变，所述突变发生在编码对应于人脂质运载蛋白2线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的序列位置中的至少任意2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个的核苷酸三联体处。

根据本发明的方法，从编码hNGAL的核酸开始获得了突变蛋白。这种核酸进行突变并且通过重组DNA技术被引入到合适的细菌或真核宿主生物体中。可以使用本领域已知的任何合适的技术获得人脂质运载蛋白2的核酸文库以用于产生具有类似抗体的特性的脂质运载蛋白突变蛋白，即与给定靶标具有亲和力的突变蛋白。这种组合方法的实例更详细地描述于例如国际专利申请WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471、WO 03/029462、WO03/029463、WO 2005/019254、WO 2005/019255、WO 2005/019256或WO 2006/56464。这些专利申请中每一件的内容都通过引用以其全文并入本文。在进行了突变的核酸序列在适合的宿主中表达之后，可以从获得的文库中选择结合给定靶标的克隆，所述克隆携带该多种各脂质运载蛋白突变蛋白的遗传信息。可以利用熟知技术来选择这些克隆，例如噬菌体展示（综述于Kay, B.K.等人(1996) 上文；Lowman, H.B. (1997) 上文或Rodi, D.J.,和Makowski, L. (1999)上文）、菌落筛选（综述于Pini, A.等人 (2002) Comb. Chem.High Throughput Screen. 5, 503-510）、核糖体展示（综述于Amstutz, P.等人 (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405）或如Wilson, D.S.等人 (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755中报道的mRNA展示或具体描述于WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471、WO 03/029462、WO 03/029463、WO 2005/019254、WO 2005/019255、WO 2005/019256或WO2006/56464中的方法。

根据本公开内容，在上述方法的另一实施方案中，步骤(c)还包括：

(i)提供选自以下的化合物作为给定靶标/配体：例如游离或缀合形式的显示免疫半抗原特征的化合物、肽、蛋白质或其他大分子例如多糖、核酸分子（例如DNA或RNA）或完整的病毒颗粒或类病毒，

(ii)将多种突变蛋白与所述靶标/配体接触，以便允许在所述配体与对所述靶标/配体具有结合亲和力的突变蛋白之间形成复合体，以及

(iii)去除无结合亲和力或无实质结合亲和力的突变蛋白。

在本发明的具体实施方案中，该靶标/配体为非天然靶标，其包括、但不限于肽、蛋白、蛋白的片段或结构域、或小有机分子。在一个实施方案中，小有机分子为显示免疫半抗原的特征的化合物。在另一个实施方案中，肽为β淀粉样肽，例如Aβ40肽或Aβ42肽。在另一个实施方案中，给天然靶标为纤连蛋白或其结构域，例如EB-结构域或EB-结构域的片段。

在本发明方法的一个实施方案中，步骤(c)中的选择在竞争性条件下进行。本文使用的“竞争性条件”表示，突变蛋白的选择包括至少一个其中将突变蛋白与人脂质运载蛋白2（靶标）的给定非天然配体在其他配体存在下进行接触的步骤，该其他配体与突变蛋白竞争结合靶标。这种其他配体可以是靶标的生理配体、过量的靶标本身或者靶标的任何其他生理配体，其至少结合与本发明突变蛋白所识别表位重叠的表位，因而干扰该突变蛋白的靶标结合。或者，该其他配体通过别构效应将与突变蛋白的结合位点不同的表位与靶标络合而竞争与突变蛋白的结合。

给出了使用温和M13噬菌体进行的噬菌体展示技术的实施方案（综述于Kay, B.K.等人 (1996), 同上；Lowman, H. B. (1997) 同上或者Rodi, D. J.和Makowski, L. (1999), 同上）作为可以在本发明中使用的选择方法的实例。可以用于选择本发明突变蛋白的噬菌体展示技术的另一个实施方案是如Broders等人（Broders等人 (2003) “Hyperphage. Improving antibody presentation in phage display.” Methods Mol. Biol. 205:295-302）所述的超级噬菌体(hyperphage)技术。其他温和噬菌体（例如f1）或溶菌性噬菌体（例如T7）也可以使用。就示例性选择方法而言，产生了M13噬菌粒，其允许将突变的脂质运载蛋白核酸序列表达为在N端与信号序列（优选OmpA信号序列）融合并在C端与噬菌体M13衣壳蛋白pIII或其能掺入噬菌体衣壳的片段融合的融合蛋白。优选使用包含野生型序列的氨基酸217至406的噬菌体衣壳蛋白的C端片段ΔpIII来产生融合蛋白。在一个实施方案中，特别优选的是其中位置201处的半胱氨酸残基丢失或被另一个氨基酸替换的pIII C端片段。

相应地，本发明方法的另一个实施方案包括将编码多种人脂质运载蛋白2突变蛋白并由3’末端突变所得的核酸分子与编码M13家族丝状噬菌体衣壳蛋白pIII或该衣壳蛋白片段的基因可操作地融合，以便选择至少一种与给定配体结合的突变蛋白。

该融合蛋白可以包含额外的组分，例如允许固定、检测和/或纯化该融合蛋白或其部分的亲和标签。此外，可以将终止密码子设置于编码脂质运载蛋白或其突变蛋白的序列区与噬菌体衣壳基因或其片段之间，其中该终止密码子（优选为琥珀型终止密码子）在适当的抑制菌株中进行翻译期间至少部分地翻译成氨基酸。

例如，本文描述的质粒载体pTLPC27（现在也称为pTlc27），可以用于制备编码人脂质运载蛋白2突变蛋白的噬菌粒文库。使用两个BstXI限制性位点将本发明编码hNGAL突变蛋白的核酸分子插入载体中。连接之后，用所得的核酸混合物转化合适的宿主菌株，例如大肠杆菌XL1-Blue，以获得大量独立的克隆。如果需要，可以产生用于制备超级噬菌粒文库的相应载体。

接着，使用适当的M13辅助噬菌体或超级噬菌体，将所得的文库在液体培养物中进行超感染，以便产生功能性噬菌粒。重组噬菌粒在其表面上以带有衣壳蛋白pIII或其片段的融合蛋白的形式展示脂质运载蛋白突变蛋白，而该融合蛋白的N端信号序列通常被切掉。另一方面，它还带有由辅助噬菌体提供的天然衣壳蛋白pIII的一个或多个拷贝，因而能感染接受者，所述接受者一般是带有F或F’质粒的细菌菌株。在超级噬菌体展示的情况下，超级噬菌粒在其表面上以带有感染性衣壳蛋白pIII而不是天然衣壳蛋白的融合蛋白的形式展示脂质运载蛋白突变蛋白。在用辅助噬菌体或超级噬菌体感染期间或感染之后，可以诱导脂质运载蛋白突变蛋白与衣壳蛋白pIII之间的融合蛋白的基因表达，例如通过加入无水四环素来诱导。将诱导条件选择成使得所获得的噬菌粒的大部分在其表面上展示至少一个脂质运载蛋白突变蛋白。在超级噬菌体展示的情况下，诱导条件产生带有3至5个融合蛋白的超级噬菌粒群，所述融合蛋白由脂质运载蛋白突变蛋白和衣壳蛋白pIII组成。已知多种方法用于分离噬菌粒，例如用聚乙二醇进行沉淀。通常在6-8小时的孵育时间段后进行分离。

然后通过与期望的靶标一起孵育来对所分离的噬菌粒进行选择，其中该靶标以允许将那些噬菌粒至少暂时固定的形式存在，所述噬菌粒在其衣壳中带有具有期望的结合活性的突变蛋白作为融合蛋白。在本领域技术人员已知的多个实施方案中，靶标可以例如与载体蛋白（如血清白蛋白）缀合，并经由该载体蛋白与蛋白质结合表面（例如聚苯乙烯）结合。适用于ELISA技术的微量滴定板或所谓的“免疫棒”可以优选地用于这样的靶标固定。或者，可以使用靶标与其他结合基团（例如生物素）的缀合物。接着可将靶标固定在选择性结合该基团的表面上，例如包被有链霉亲和素、中性亲和素(neutravidin)或亲和素的微量滴定板或顺磁性颗粒。如果靶标与免疫球蛋白的Fc部分融合，那么也可以固定在表面上，例如包被有A蛋白或G蛋白的微量滴定板或顺磁性颗粒。

可以如ELISA方法中已知的那样，用封闭溶液饱和表面上存在的非特异性噬菌粒结合位点。然后通常在生理缓冲液存在下使噬菌粒与固定在表面上的靶标接触。通过多次洗涤除去未结合的噬菌粒。然后洗脱表面上剩余的噬菌粒颗粒。对于洗脱而言，若干方法都是可行的。例如，可以通过加入蛋白酶或者在酸、碱、洗涤剂或离液盐存在下或在适度变性的条件下洗脱噬菌粒。优选方法是使用pH 2.2的缓冲液洗脱，其中接着中和洗脱液。或者，可以加入游离靶标的溶液以便与固定的靶标竞争结合噬菌粒，或者可以通过与特异性结合目的靶标的免疫球蛋白或天然配体蛋白竞争来洗脱靶标特异性噬菌粒。

其后，用洗脱的噬菌粒感染大肠杆菌细胞。或者，可以从洗脱的噬菌粒中提取核酸并用于序列分析、扩增或以其他方式转化细胞。从以此方式获得的大肠杆菌克隆开始，根据上文所述的方法通过用M13辅助噬菌体或超级噬菌体进行超感染而再次产生新鲜的噬菌粒或超级噬菌粒，并且将以此方式扩增的噬菌粒再次以固定的靶标进行选择。经常需要多个选择循环才能以足够富集的形式获得带有本发明突变蛋白的噬菌粒。优选地，将选择循环数选择成使得在后续的功能分析中至少0.1％所研究的克隆产生与给定靶标具有可检测亲和力的突变蛋白。根据所使用文库的大小（即复杂性），通常需要2至8个循环来达到这一目的。

对于选定突变蛋白的功能分析，用从选择循环获得的噬菌粒感染大肠杆菌菌株，并且分离相应的双链质粒DNA。从该质粒DNA开始或者同样从提取自该噬菌粒的单链DNA开始，可以通过本领域已知的方法测定本发明选定突变蛋白的核酸序列，并且可由此推断氨基酸序列。可以在另一个表达载体中亚克隆完整hNGAL突变蛋白的突变区或序列，然后在合适的宿主生物体中表达。例如，可以使用载体pTLPC26（现在也称为pTlc26）在大肠杆菌菌株（例如大肠杆菌TG1）中表达。可以通过多种生物化学方法纯化由此产生的hNGAL突变蛋白。所产生的hNGAL突变蛋白（例如用pTlc26产生）在其C端带有亲和肽Strep-标签II（Schmidt等人，同上），因此优选地可以通过链霉亲和素亲和层析进行纯化。

还可以通过其他方法进行选择。许多相应的实施方案是本领域技术人员已知的，或者已在文献中描述。此外，可以使用方法的组合。例如，可以使通过“噬菌体展示”选择或至少富集的克隆再进行“菌落筛选”。该方法具有以下优势：就产生对靶标具有可检测的结合亲和力的人脂质运载蛋白2突变蛋白这方面，可以直接分离各个克隆。

除了使用大肠杆菌在“噬菌体展示”技术或“菌落筛选”方法中作为宿主生物体以外，其它细菌菌株、酵母或者昆虫细胞或哺乳动物细胞也可以用于此目的。除了从上文所述的随机文库中选择人脂质运载蛋白2突变蛋白以外，还可以使用进化方法（包括限制性突变），以使已对靶标具有一定结合活性的突变蛋白在对靶标的亲和力或特异性方面进行优化。

一旦以及选择了与给定靶标具有亲和力的突变蛋白，还可以对使这种突变蛋白进行另一突变，以便随后选择具有甚至更高亲和力的变体，或者选择具有改进的特性（例如更高的热稳定性；提高的血清稳定性；热力学稳定性；提高的溶解度；改进的单体行为；对热变性、化学变性、蛋白水解或去污剂等提高的抗性等）的变体。这一其它突变（在目的为更高亲和力的情况下可认为是体外“亲和力成熟”）可以通过基于推理性设计的位点特异性突变或随机突变来实现。获得更高亲和力或改进的特性的另一种可行方法是使用易错PCR，该易错PCR导致在脂质运载蛋白突变蛋白的选定序列位置范围中产生点突变。易错PCR可以根据任何已知的方案来进行，例如Zaccolo等人 (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603所述的方案。适用于这种目的的其它随机突变方法包括如Murakami, H等人 (2002) Nat. Biotechnol. 20, 76-81描述的随机插入/缺失(RID)突变或者如Bittker, J. A等人 (2002) Nat. Biotechnol. 20,1024-1029描述的非同源随机重组(NRR)。如果需要，还可以根据WO 00/75308或Schlehuber, S.等人 J. Mol. Biol.297, 1105-1120中描述的方法进行亲和力成熟，其中获得了对洋地黄毒苷具有高亲和力的后胆色素结合蛋白的突变蛋白。用于改进亲和力的其它方法为进行位置饱和突变。在此方法中，产生“小”核酸文库，其中仅在四个环区段中任一个内的单个位置处引入氨基酸交换/突变。然后使这些文库直接进行选择步骤（亲和力筛选），而无需其它淘选轮次。此方法允许对促成对期望靶标改进的结合的残基进行鉴定，并且允许鉴定对于结合来说重要的“热点”。

在一个实施方案中，上述用于修饰突变蛋白的方法进一步包括在对应于人脂质运载蛋白2野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的任何序列位置中的至少一个处引入Cys残基，以及经由在对应于hNGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的任何序列位置中的至少一个处引入的Cys残基的硫醇基团偶联能够改变所述突变蛋白的血清半衰期的部分。该能够改变所述突变蛋白的血清半衰期的部分可以选自聚亚烷基二醇分子和羟乙基淀粉。

在另一方面，本发明涉及对人脂质运载蛋白2的给定非天然配体具有可检测的结合亲和力的人脂质运载蛋白2突变蛋白，其能够通过本发明上文详述的方法获得或者通过本发明上文详述的方法获得。

在本发明的一些人脂质运载蛋白2突变蛋白中，去除了Cys 76与Cys175之间的天然存在的二硫键。相应地，这种突变蛋白（或不包括分子内二硫键的任何其它人脂质运载蛋白2突变蛋白）可以在具有还原性氧化还原环境的细胞隔室中产生，例如，在革兰氏阴性细菌的细胞质中。

在本发明脂质运载蛋白突变蛋白包括分子内二硫键的情况下，可以优选的是，使用适合的信号序列将新生多肽引导至具有氧化性氧化还原环境的细胞隔室。这种氧化性环境可以由革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌）的外周胞质、在革兰氏阳性细菌的细胞外环境中或在真核细胞的内质网中提供，并且这种氧化性环境通常有利于形成结构性二硫键。

然而，还可以在宿主细胞（优选大肠杆菌）的胞液中产生本发明的突变蛋白。在这种情况下，该多肽可以以可溶和折叠状态直接获得，也可以以包涵体的形式回收，然后体外复性。其它选择为使用具有氧化性细胞内环境的特定宿主菌株，其可以因而允许在胞液中形成二硫键（Venturi等人 (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8.）。

然而，本发明的突变蛋白可以不必定为仅通过利用基因工程生产。而是，还可以通过化学合成或通过体外转录和翻译获得脂质运载蛋白突变蛋白，所述化学合成例如Merrifield固相多肽合成。例如可行的是，使用分子建模鉴定有希望的突变，然后体外合成希望的（设计的）多肽，然后研究对于给定靶标的结合活性。用于固相和/或液相合成蛋白的方法是本领域熟知的（例如综述于Lloyd-Williams等人 (1997)Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press, Boca Raton, Fields, GB, andColowick (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. AcademicPress, San Diego或Bruckdorfer等人 (2004) Curr. Pharm.Biotechnol. 5, 29-43）。

在另一个实施方案中，本发明的突变蛋白可以使用本领域技术人员已知的成熟方法通过体外转录/翻译产生。

本发明还涉及药物组合物，该药物组合物包含至少一种权利要求中所指的本发明突变蛋白或其融合蛋白或缀合物以及任选的药学上可接受的赋形剂。

根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以经由对蛋白质药物而言有治疗效果的任何肠胃外或非肠胃外（肠内）途径给药。肠胃外施用法包括，例如皮内、皮下、肌内或静脉内的注射和输注技术，例如注射液、输注液或酊剂以及气雾剂装置和吸入（例如气雾剂混合物）、喷雾剂或粉剂的形式。非肠胃外递送模式为例如经口（例如丸剂、片剂、胶囊剂、溶液剂或混悬剂的形式）或直肠（例如栓剂的形式）。根据需要，本发明的突变蛋白可以在含有常规无毒药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和运载体的制剂中全身或局部给药。

在本发明的一个实施方案中，所述药物肠胃外施用至哺乳动物，特别是人。相应的给药方法包括、但不限于例如皮内、皮下、肌内或静脉内的注射及输注技术，例如注射液、输注液或酊剂以及气雾剂装置和吸入（例如气雾剂混合物的形式）、喷雾剂或粉剂的形式。静脉内和皮下输注和/或注射的组合对于血清半衰期相对短的化合物而言可能是最方便的。所述药物组合物可以是水溶液、水包油乳剂或油包水乳剂。

就这一点而言，应该注意，如Meidan和Michniak (2004) Am. J.Ther. 11(4), 312-316所述的经皮递送技术（例如离子电渗、超声促渗或微针增强递送）也可以用于经皮递送本文所述的突变蛋白。非肠胃外递送模式为例如经口（例如丸剂、片剂、胶囊剂、溶液剂或混悬剂的形式）或直肠施用（例如栓剂的形式）。本发明的突变蛋白可在含有多种常规无毒药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和运载体的制剂中全身或局部给药。

所施用的突变蛋白剂量可以在宽范围内变化，以实现期望的预防效果或治疗响应。例如，这将取决于该化合物对选定配体的亲和力以及该突变蛋白与该配体的复合体在体内的半衰期。此外，最佳剂量将取决于该突变蛋白或其融合蛋白或其缀合物的生物分布、给药模式、所治疾病/病症的严重程度以及患者的医学状况。例如，当在膏剂中用于局部施用时，可以使用高浓度的人脂质运载蛋白2突变蛋白。然而，如果需要，也可以在持续释放制剂中给予该突变蛋白，例如脂质体分散体或基于水凝胶的聚合物微球体，如PolyActive^TM或OctoDEX^TM（参见Bos等人, Business Briefing: Pharmatech 2003: 1-6）。

相应地，可以使用药学上可接受的成分以及已建立的制备法将本发明的突变蛋白配制成组合物（Gennaro, A.L.和Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第二十版, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia,PA）。为了制备药物组合物，可以使用药学上惰性的无机或有机赋形剂。为了制备例如丸剂、粉剂、明胶胶囊剂或栓剂，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然和硬化的油。用于产生溶液剂、悬浮剂、乳剂、气雾剂混合物或粉剂（在使用前将粉剂重建成溶液剂或气雾剂混合物）的合适的赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。

所述药物组合物还可以含有添加剂，例如填料、粘合剂、湿润剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，以及其它溶剂或增溶剂或用于实现贮存效应的试剂。后者使得融合蛋白可以掺入缓慢或持续释放或靶向递送系统（如脂质体和微囊剂）。

可通过多种方法对制剂进行灭菌，包括通过截留细菌的滤器过滤，或通过以无菌固体组合物的形式掺入消毒剂，所述消毒剂可以在临用前溶于或分散于无菌水或其他无菌介质中。

本发明的突变蛋白或其融合蛋白或缀合物可以用于多种应用中。通常，这种突变蛋白可以用于所有使用抗体的应用，除了特异地依赖于Fc部分的糖基化的那些以外。

因此，在本发明的另一方面，本发明的人脂质运载蛋白2突变蛋白用于结合和/或检测人脂质运载蛋白2的给定非天然配体。这样的用途可以包括以下步骤：在合适的条件下使该突变蛋白接触疑似含有给定配体的样品，由此允许在该突变蛋白与该给定配体之间形成复合物，以及通过合适的信号检测复合的突变蛋白。

可检测信号可以通过如上文所述的标记产生，或通过由于结合（即复合物形成）本身而导致的物理特性的变化而产生。一个实例是等离子体表面共振，其数值在结合配偶体结合时发生改变，所述配偶体中的一者固定在表面上，例如金箔上。

本文公开的人脂质运载蛋白2突变蛋白还可以用于分离人脂质运载蛋白2的给定非天然配体。这样的用途可以包括以下步骤：在合适的条件下使该突变蛋白接触推测含有所述配体的样品，由此允许在该突变蛋白与该给定配体之间形成复合物，以及从样品中分离突变蛋白/配体复合物。

在突变蛋白用于检测给定非天然配体以及分离给定配体的两个用途中，突变蛋白和/或靶标均可以固定在合适的固相上。

本发明的人脂质运载蛋白2突变蛋白还可以用于使化合物以预先选择的部位为靶向。在一个这样的实施方案中，人脂质运载蛋白2的突变蛋白用于使有药学活性的化合物以生物体或组织中预先选择的部位为靶向，包含：

a)将突变蛋白与所述化合物缀合，以及

b)将突变蛋白/化合物复合物递送至该预先选择的部位。

就这样的目的而言，使突变蛋白与目的化合物接触，以便允许形成复合物。然后将包含该突变蛋白和目的化合物的复合物递送至预先选择的部位。这可以例如通过使突变蛋白与靶向部分偶联而实现，所述靶向部分例如抗体、抗体片段、脂质运载蛋白突变蛋白或对该选择的靶标具有结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白片段。

该用途特别适用于、但不限于将药物（选择性地）递送至生物体中的预先选择的部位，例如旨在用该药物进行治疗的受到感染的机体部分、组织或器官。除了在突变蛋白与目的化合物之间形成复合物以外，突变蛋白还可以与给定化合物反应，以得到突变蛋白与化合物的缀合物。与上述复合物相似，这样的缀合物可以适用于将化合物递送至预先选择的靶部位。这样的突变蛋白与化合物的缀合物还可包括将突变蛋白和化合物彼此共价连接的接头。任选地，这样的接头在血流中稳定，但在细胞环境中可被切割。

因而，本文公开的突变蛋白及其衍生物可以用于与抗体或其片段相似的多个领域。除了与支持物结合以允许固定或分离给定突变蛋白的靶标或该靶标的缀合物或融合蛋白这种用途以外，该突变蛋白还可以用于以酶、抗体、放射性物质或任何其他具有生物化学活性或确定的结合特征的基团进行标记。这样，它们各自的靶标或其缀合物或融合蛋白可以被检测或者与它们接触。例如，本发明的突变蛋白可以用于通过已建立的分析法（如ELISA或蛋白质印迹）或通过显微术或免疫传感器来检测化学结构。这里，检测信号可以通过使用合适的突变蛋白缀合物或融合蛋白直接产生，或者通过经由抗体对结合的突变蛋白进行免疫化学检测而间接产生。

医学领域中还存在本发明突变蛋白的众多可能的应用。除了在诊断和药物递送中的用途以外，可以产生结合例如组织或肿瘤特异性细胞表面分子的本发明突变多肽。这样的突变蛋白例如可以以缀合形式或作为融合蛋白用于“肿瘤成像”或直接用于癌症治疗。

因此，本发明还涉及本发明的人脂质运载蛋白2突变蛋白用于与给定非天然配体或靶标形成复合物的用途。

在另一方面，本发明还包括根据本发明的突变蛋白在制备药物组合物中的用途。因而获得的药物组合物可以适于治疗退行性障碍，例如阿尔兹海默氏病。所述药物组合物还可以用于治疗癌症、治疗纤维化或治疗炎症。所述药物组合物可以用于单独治疗或组合治疗。

在另一方面，本发明还涉及包含根据本发明的突变蛋白的诊断或分析试剂盒。

本发明的另一方面涉及治疗患有神经退行性疾病、癌症、纤维化或炎症的受试者的方法，该方法包括有此需要的受试者施用本发明的各突变蛋白或包含本发明的突变蛋白的药物组合物。

需要这种治疗的受试者可以哺乳动物，例如人、狗、小鼠、大鼠、猪、猿（例如猕猴），以上仅为几个示例性实例。

在另一方面，本发明涉及用于受试者的体内成像的方法，该方法包括所述受试者施用本发明的突变蛋白或包含本发明的突变蛋白的药物组合物。受试者可以如上文进行限定。

附图说明

通过下述非限制性实例和附图进一步说明本发明，其中：

图1示出了用于同时随机突变成熟Lcn2氨基酸序列中的20个氨基酸位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134（下划线标出且编号的）的PCR组装策略。这20个位置分成四个序列组。为了随机化各组中的氨基酸，合成了寡脱氧核苷酸（SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 4），其中在突变的密码子处利用核苷酸的NNK混合物。N表示全部四个碱基A、C、G和T的混合物，而K表示仅两个碱基G和T的混合物，因此这样的三联体编码全部20种天然氨基酸以及琥珀型终止密码子TAG，其在大肠杆菌supE-菌株XL1-blue（Bullock等人,BioTechniques 5 (1987), 376-378）或TG1（Sambrook等人,Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press）中翻译成谷氨酰胺，所述菌株用于噬菌粒产生和基因表达。还在组装反应中使用四个其它的寡脱氧核苷酸（SEQID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8），其具有对应于非编码链（在DNA双链序列下方以3'-5'方向写出）且填充上述寡脱氧核苷酸之间的间隙的固定核苷酸序列。额外添加的两个较短且带有生物素基团的侧翼寡脱氧核苷酸（SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10）用作所组装的整个合成基因片段的PCR扩增引物。两个侧翼引物各自包括BstXI限制性位点(CCANNNNNNTGG)，从而经酶消化产生相互不相容的突出。这种限制性位点的特殊排列使得合成的基因能够进行特别有效的连接和克隆。对初始Lcn2序列将氨基酸Gln28替换成His是必需的，从而引入第一BstXI位点，而第二个天然存在于Lcn2的cDNA中。此外，未配对残基Cys87在基因组装期间被替代为Ser。在一次罐式PCR (pot PCR)之后，将得到的基因片段插入到提供Lcn2结构基因的丢失部分的载体中。该图示还描述了两个短引物（SEQID NO: 45和SEQ ID NO: 46），分别在由该两个BstXI限制性位点侧翼的盒的上游和下游，已用于双链DNA测序。

图2示出了合成的Lcn2基因文库的核苷酸序列（仅示出了如图1中由该两个BstXI限制性位点侧翼的中心盒）。此基因片段由Sloning BioTechnology GmbH制备。与图1中描述的DNA文库相比，存在两个不同。第一，只要可行，就对非突变的氨基酸位置进行了用于大肠杆菌表达的密码子优化。第二，在20个随机化位置处采用了各自编码不同氨基酸（除了Cys）的19个不同三联体（GAC、TTC、CTG、CAC、AAT、AGC、ACC、GCA、ATG、CCT、GTT、TGG、GAG、CAA、ATC、GGA、CGT、GCA、TAC）的混合物，其与图1中所描述的那些相同。此处氨基酸的编号对应于Sloning BioTechnology GmbH采用的内部方案，由此Gly no.1为直接位于第一个氨基酸密码子。

图3示出了在大肠杆菌中表达后，重组Aβ融合蛋白Trx-Aβ28 (A)和MBP-Aβ40 (B)的SEC洗脱曲线。通过SDS-PAGE分析评估合成的Aβ40和重组Aβ融合蛋白二者的纯度(C)。两种融合蛋白均在大肠杆菌JM83的细胞质中表达。在用弗氏压碎器破坏细胞之后，经由His₆-标签亲和色谱、然后进一步施用于Superdex 75 HR 10/30柱子（在Trx-Aβ28的情况下）或施用于Superdex 200 HR 10/30柱子（在MBP-Aβ40的情况下）纯化蛋白。在尺寸排阻色谱中两种蛋白均主要以单体洗脱，并且在纯化后为基本上匀质的。Aβ40获得Keck Foundation，用HFIP处理，在SpeedVac中蒸发，最后溶解于蒸馏水中。15%凝胶示出了HFIP处理后的Aβ40以及MAC纯化和SEC之后的Trx-Aβ28和MBP-Aβ40样品。M表示分子量标记物，其相应的谱带大小以kDa为单位示于凝胶的左侧。

图4示出了Lcn2突变蛋白H1-G1、S1-A4和US7 (A)的SEC洗脱曲线的叠加和经由15% SDS-PAGE (B)进行的纯化蛋白分析结果。3个Lcn2突变蛋白H1-G1、S1-A4和US7在大肠杆菌JM83或TG1-F^-的外周胞质中表达（如本文所示），并且经由Strep-标签II亲和色谱纯化。全部3个突变蛋白从Superdex 75 HR 10/30柱子上主要以单体蛋白洗脱，保留体积为10至11 ml。取决于具体突变蛋白的表达产量，峰值强度相异。(B)示出了重组野生型Lcn2（泳道1、5）和突变蛋白US7（泳道2、6）、H1-G1（泳道3、7）和Strep-标签II亲和纯化和SEC之后的S1-A4（泳道4、8)的15% SDS-PAGE分析结果。泳道1-4示出用2-巯基乙醇还原的Lcn2突变蛋白，泳道5-8示出在非还原条件下的蛋白。M表示分子量标记物，其相应的谱带大小以kDa为单位示于凝胶的左侧。

图5示出了Lcn2突变蛋白H1-G1、S1-A4和US7在捕获ELISA中与不同生物素化的Aβ靶标的结合活性。将10 μg/ml的StrepMAB-Immo固定在微量滴定板上，然后用于经由Strep-标签II捕获1 μM Lcn2突变蛋白。在图A至C中，示出了Lcn2突变蛋白S1-A4和US7与(A)生物素化的Aβ40、(B)生物素化的Trx-Aβ28和(C)生物素化的MBP-Aβ40的结合。通过用ExtrAvidin/AP孵育和之后用pNPP进行的显色反应检测结合。将卵白蛋白(Ova)、硫氧还蛋白(Trx)和麦芽糖结合蛋白(MBP)用作阴性对照。此外，测试了野生型(wt)脂质运载蛋白的结合。将数据拟合成单价结合模型。图D示出了以Lcn2 H1-G1以及生物素化的Aβ40和Trx-Aβ28作为靶标进行的相同ELISA程序。针对Aβ40测定的K_D值为：对于S1-A4为2.7 nM，对于US7为6.8 nM，对于H1-G1为16.2 nM；针对Trx-Aβ28测定的相应的值为：1.9 nM，2.4 nM，24.3 nM。与MBP-Aβ40的结合示出的K_D值为：对于S1-A4为4.7 nM，对于US7为11.4 nM。相应地，针对Aβ16-27的K_D值为2.6 nM和2.1 nM。

图6示出了Lcn2突变蛋白S1-A4和US7在直接ELISA中的结合活性。将Aβ靶标Trx-Aβ28和MBP-Aβ40以及对照蛋白麦芽糖结合蛋白(MBP)以2μM在PBS中固定过夜。经由它们的Strep-标签II使用链霉亲和素/AP然后用pNPP进行显色反应，检测结合的Lcn2突变蛋白。作为对照，测试了野生型(wt)脂质运载蛋白的结合。将数据拟合成单价结合模型。针对Trx-Aβ28测定的K_D值为：对于S1-A4为16.2 nM，对于US7为9.6nM；针对MBP-Aβ40的相应的值为149 nM和49.7 nM。

图7示出了Lcn2突变蛋白S1-A4(A)和US7 (B)在竞争ELISA中的结合活性。将StrepMAB-Immo以10 μg/ml固定在微量滴定板上，然后用于经由Strep-标签II捕获1 μM Lcn2突变蛋白。为进行竞争，将作为示踪物的恒定浓度的生物素化的Trx-Aβ28与不同浓度的未标记的Trx-Aβ28混合。之后，经由用ExtrAvidin/AP孵育然后通过用pNPP进行显色反应检测结合的生物素化的Trx-Aβ28。使用sigmoidal方程将数据进行拟合。针对S1-A4的K_D值为21.7 nM，针对US7的值为76.9 nM。

图8示出了在Biacore仪器上以10 μl/min的流量测量的Lcn2突变蛋白S1-A4 (A)和US7 (B)的动力学实时分析结果。经由胺化学将MBP-Aβ40融合蛋白偶联在CMD 200I芯片(RU = 1455)上，每一种经纯化的Lcn2突变蛋白都以不同浓度的系列应用。在每种情况下，测得的信号示为灰色线条，而曲线拟合示为黑色线条。两种突变蛋白的k_on和k_off速率显著不同（k_on(S1-A4) = 0.48·10⁵ M^-1s^-1，k_on(US7) = 2.02·10⁵ M^-1s^-1，k_off(S1-A4) = 8.36·10^-5 s^-1，k_off(US7) = 25.2·10^-5 s^-1）。然而，总体K_D值相当类似，其中S1-A4为1.74 nM，US7为1.25 nM。

图9示出了在thioflavin T聚集分析中测试的Lcn2突变蛋白S1-A4和US7的功能活性。用10 μM的US7、S1-A4、野生型(wt)脂质运载蛋白或用PBS在37 °C下不振摇孵育100 μM Aβ40。在所示时间点，将20 μl的各样品与180 μl的5 μM thioflavin T混合，然后用450 nm的激发波长和482 nm的发射波长测量荧光。在1:10 (US7:A40)的比率下，Lcn2突变蛋白US7显示出聚集的强抑制。在此比率下，S1-A4无法显著抑制聚集，但是在1:2 (S1-A4:Aβ40)的比率下施加了明确抑制（未示出）。野生型Lcn2未对Aβ聚集显示出抑制性作用。

图10示出了重组ED-B（泳道1）、FN7B8（泳道2）和FN789（泳道3）在离子交换色谱之后的SDS-PAGE分析结果（用考马斯亮蓝染色之后的）。全部样品都用2-巯基乙醇还原。M：分子量标记物(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)。

图11示出了Lcn2突变蛋白s N7A（泳道1）、N7E（泳道2）、N9B（泳道3）和N10D（泳道4）在Strep-标签II亲和纯化之后的SDS-PAGE分析结果（用考马斯亮蓝染色之后的）。全部样品都用2-巯基乙醇还原。M：分子量标记物(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)。

图12示出了在ELISA中的结合活性。用经纯化的蛋白FN7B8和FN789包被微量滴定板，用系列稀释的所选Lcn2突变蛋白孵育，然后用链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物和pNPP底物检测。重组Lcn2突变蛋白N7A、N9B和N10D在此分析中显示对FN789的可忽略信号，这缺乏ED-B并用作阴性对照。

图13示出了在Biacore仪器上测量的Lcn2突变蛋白N9B的动力学实时分析结果。经由胺化学将FN7B8偶联到CMD 200 m传感器芯片(∆RU =500)上，经纯化的Lcn2突变蛋白以不同浓度应用。在每种情况下，测得的信号示为灰色线条，而曲线拟合示为黑色线条。从该组曲线测得的动力学常数列于表2（实施例17）。

图14示出了在Biacore仪器上测量的Lcn2突变蛋白N7E的动力学实时分析结果。经由胺化学将FN7B8偶联到CMD 200 m传感器芯片(∆RU =500)上，经纯化的Lcn2突变蛋白以不同浓度应用。在每种情况下，测得的信号示为灰色线条，而曲线拟合示为黑色线条。从该组曲线测得的动力学常数列于表2（实施例17）。

图15示出了在Biacore仪器上测量的Lcn2突变蛋白N7A的动力学实时分析结果。经由胺化学将FN7B8偶联到CMD 200 m传感器芯片(∆RU =500)上，经纯化的Lcn2突变蛋白以不同浓度应用。在每种情况下，测得的信号示为灰色线条，而曲线拟合示为黑色线条。从该组曲线测得的动力学常数列于表2（实施例17）。

图16示出了在Biacore仪器上测量的Lcn2突变蛋白N10D的动力学实时分析结果。经由胺化学将FN7B8偶联到CMD 200 m传感器芯片(∆RU =500)上，经纯化的Lcn2突变蛋白以不同浓度应用。在每种情况下，测得的信号示为灰色线条，而曲线拟合示为黑色线条。从该组曲线测得的动力学常数列于表2（实施例17）。

图17示出了命名为S1-A4 (SEQ ID NO: 39)、US-7 (SEQ ID NO: 41)、H1-G1 (SEQ ID NO: 43)、N7A (SEQ ID NO: 20)、N7E (SEQ ID NO: 22)、N9B (SEQ ID NO: 24)和N10D (SEQID NO: 26)的人Lcn2突变蛋白与Lcn2的序列比对结果。序列下方最后一行指示脂质运载蛋白的二级结构特征（Schönfeld等人 (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA106, 8198-8203）。

图18示出了Lcn2突变蛋白H1GA和H1GV (A)的SEC洗脱曲线的叠加和经由15% SDS-PAGE (B)进行的纯化蛋白分析结果。2个Lcn2突变蛋白H1GA和H1GV (A)在大肠杆菌JM83的外周胞质中表达，并且经由Strep-标签II亲和色谱纯化。2个突变蛋白从Superdex 75 HR 10/30柱子上主要以单体蛋白洗脱，保留体积为10至11 ml。取决于突变蛋白的表达产量，峰值强度相异。(B)示出了重组Lcn2突变蛋白H1-G1、H1GA和H1GV在Strep-标签II亲和纯化和SEC之后的15% SDS-PAGE分析结果。全部3个Lcn2突变蛋白在使用2-巯基乙醇的还原条件下示出。M表示分子量标记物。

图19示出了Lcn2突变蛋白H1GA、H1GV和H1-G1在捕获ELISA中与生物素化的Aβ靶标Aβ40 (A)和Trx-Aβ28 (B)的结合活性。将10 μg/ml的StrepMAB-Immo固定在微量滴定板上，然后用于经由Strep-标签II捕获1 μM Lcn2突变蛋白。然后通过用ExtrAvidin/AP孵育和之后用pNPP进行的显色反应检测生物素化的靶标（以系列稀释应用）的结合。将生物素化的卵白蛋白(Ova)和硫氧还蛋白(Trx)用作阴性对照，该阴性对照不显示结合Lcn2突变蛋白（未示出）。将数据拟合成单价结合模型。针对Aβ40测定的K_D值为：对于H1GA为4.2 nM，对于H1GV为4.9 nM，对于H1-G1为21.5 nM；针对Trx-Aβ28测定的相应的值分别为：3.8 nM、4.2 nM和24.4 nM。

图20示出了在Biacore仪器上以20 μl/min的流量测量的Lcn2突变蛋白H1GA (A)和H1GV (B)的动力学实时分析结果。经由胺化学将MBP-Aβ40融合蛋白偶联在CMD 200I芯片(RU = 1455)上，每一种经纯化的Lcn2突变蛋白都以不同浓度的系列应用。在每种情况下，测得的信号示为灰色线条，而曲线拟合示为黑色线条。两种突变蛋白的k_on和k_off速率显著不同：kon(H1GA) = 5.77·104 M-1s-1，kon(H1GV)= 6.84·104 M-1s-1，koff(H1GA) = 2.75·10-5 s-1，koff(H1GV) = 7.26·10-5 s-1。总体K_D值为：对于H1GA为0.476 nM，对于H1GV为1.06 nM。

图21示出了在固定有Aβ40的Biacore仪器上测量的Lcn2突变蛋白H1GA的动力学实时分析结果，其中对于以高浓度测量的轨迹使用延长的解离时间。经由胺化学将靶标肽Aβ40偶联到Biacore CM5芯片(ΔRU=325)上，经纯化的Lcn2突变蛋白H1GA以30 μl/min的流量应用。为了准确测定低koff速率，以测试的最高浓度进行解离7200 s。使用系列稀释的Lcn2突变蛋白H1GA测定kon速率，其中连接和解离时间均为300 s。测得的H1GA的动力学值如下：kon = 1.25·105 M-1s-1，koff = 1.18·10-5 s-1，KD = 0.095 nM。

图22 (A)示出了在thioflavin T聚集分析中测试的Lcn2突变蛋白H1GA的功能活性。在不存在或存在不同摩尔比率的Lcn2突变蛋白H1GA的情况下，在0.5 x PBS中于37 °C下并搅拌，孵育500 µl的1 mg/ml单体Aβ。一式三份地制备聚集反应。为了进行荧光测量，以周期性间隔取得的20 µl样品各自与终浓度为0.5 x PBS中50 µM的180 µl ThT混合，然后以450 nm的激发波长和482 nm的发射波长分析。在等摩尔比率下，Lcn2突变蛋白H1GA显示出聚集的强抑制。在此比率下，S1-A4无法显著抑制聚集，但是在1:2 (S1-A4: Aβ40)的比率下施加了明确抑制（未示出）。野生型Lcn2未对Aβ聚集显示出抑制性作用。在10:2 (Aβ40:H1GA)的非等摩尔(subequimolar)比率下，聚集仍得到了显著减弱。(B)相比之下，作为阴性对照的等摩尔量BSA或Lcn2均对Aβ40的聚集无抑制性作用。

图23总结了在不同ELISA程序中以及在表面等离子体共振测量中针对Lcn2突变蛋白H1GA和H1GV测定的KD值。

图24示出了Lcn2突变蛋白S1-A4 (SEQ ID NO: 39)、US7 (SEQID NO: 41)、H1-G1 (SEQ ID NO: 43)、H1GA (SEQ ID NO:50)、H1GV (SEQ ID NO: 52)、N7A (SEQ ID NO: 20)、N7E (SEQ ID NO: 22)、N9B (SEQ ID NO: 24)和N10D (SEQID NO: 26)与Lcn2 (SEQ ID NO: 44)的序列比对结果。

图25示出了突变蛋白H1GA (SEQ ID NO: 50)和H1GV (SEQ IDNO: 52)与它们的前体H1-G1 (SEQ ID NO: 43)和野生型Lcn2 (SEQ ID NO: 44)的相互序列比对结果。

图26示出了Lcn2变体N7E在ELISA中对FN7B8的特异结合活性。用FN7B8、FN789、BSA或卵白蛋白包被微量滴定板，用系列稀释的N7E孵育，然后用链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物和pNPP底物检测。Lcn2变体N7E在此分析中显示了对FN789、BSA和卵白蛋白的可忽略信号。

图27示出了示出了在Biacore仪器上测量的Lcn2变体N7A (A)、N7E(B)、N9B (C)和N10D (D)的动力学实时分析结果。经由胺化学将单个纤连蛋白结构域ED-B偶联在CMD 200 m传感器芯片(∆RU =180)上，经纯化的Lcn2变体都以不同浓度应用。测得的信号示为与曲线拟合一起的轨迹。由这些感应谱的测定的动力学常数列于表3（实施例24）。

图28示出了Lcn2变体N7A (A)、N10D (B)、N9B (C)和N7E (D)的分析性尺寸排阻色谱。将经亲和纯化的蛋白施加到用TBS平衡的Superdex S75 10/30柱子。箭头指示了柱子的排斥体积(6.7 ml)。分析性凝胶过滤得到该四种Lcn2变体中每一种的主峰蛋白的表观分子量为：N7A为21.0 kDa，N10D为21.3 kDa，N9B为21.7 kDa，N7E为21.7kDa，从而指示了仅单体物质不存在。

具体实施方式

实施例1：构建突变体Lcn2噬菌体展示文库

在克隆的cDNA基础上产生了Lcn2变体的组合文库（Breustedt等人 (2006) Biochim. Biophys. Acta 1764, 161-173），所述文库携带了氨基酸替换Cys87Ser以去除单个未配对的硫醇侧链（Goetz等人(2000) Biochemistry 39,1935-1941）以及Gln28His以引入第二个BstXI限制性位点。基本上根据已公开的策略（Beste等人 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96, 1898-1903; Skerra (2001) J. Biotechnol. 74,257-275），进行了此区域的突变和聚合酶链式反应(PCR)组装，此时使用采用如示例于图1的寡脱氧核苷酸(SEQ ID NO: 1-10)的一罐式扩增反应。设计寡脱氧核苷酸，使得具有SEQ ID NO: 1-4的引物对应于编码链并且分别在氨基酸位置36、40、41、49、52或68、70、72、73、77、79、81或96、100、103、106或125、127、132、134处携带简并密码子，而具有SEQ ID NO: 5-8的引物对应于非编码链并且不携带简并密码子或反密码子。过量使用具有SEQ ID NO: 9和SEQID NO: 10的两个侧翼引物，并且用于扩增组装的随机化基因片段。如所述，使用Go-Taq Hot Start DNA聚合酶(Promega, Mannheim, Germany)进行全部PCR步骤（Schlehuber等人 (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120）。

HPLC级的不携带简并密码子的寡脱氧核苷酸购自Metabion (Munich,Germany)。脱盐的含NNK的寡脱氧核苷酸购自同一个供应商并且通过尿素PAGE进一步纯化。用BstXI (Promega, Mannheim, Germany)切割所得的DNA文库，然后在噬菌粒载体phNGAL102 (SEQ ID NO: 11)上克隆，所述噬菌粒载体phNGAL102基于通用表达载体pASK111（Vogt和Skerra (2001) J. Mol. Recognit. 14 (1), 79-86)并编码由OmpA信号肽、经修饰的成熟Lcn2、随后的琥珀密码子以及丝状噬菌体M13的基因III外壳蛋白C端片段组成的融合蛋白，即类似于之前针对后胆色素结合蛋白进行描述的（Beste等人，上文；Skerra，上文）。在用8,4μg经消化的PCR产物和94 µg经消化的质粒DNA的连接混合物电穿孔大肠杆菌XL1-Blue（Bullock等人(1987) Biotechniques5, 376-378）之后，获得了1 x 10¹⁰个转化子。

或者，从Sloning BioTechnology GmbH (Puchheim, Germany)获得了描述于图2的克隆的合成Lcn2随机文库。使用适合的引物（SEQID NO: 9和SEQ ID NO: 10）经由PCR在20个循环中扩增由两个BstXI限制性位点侧翼的中心基因盒，然后在phNGAL108 (SEQ ID NO: 12)上亚克隆，从而产生复杂度对应于1,7 x 10¹⁰个独立转化子的文库。基于通用表达载体pASK75 (Skerra (1994) Gene 151,131-135)的phNGAL108编码由OmpA信号肽、经修饰的成熟Lcn2、Strep-标签、之后的琥珀型密码子以及丝状噬菌体M13的全长基因III外壳蛋白（Vogt和Skerra (2004) ChemBioChem 5, 191-199）组成的融合蛋白。

对两个Lcn2文库相同地进行文库产生中的后续步骤。将100 ml的培养物转移到无菌Erlenmeyer烧瓶，然后在37 °C下、以160rpm在2YT培养基（无抗生素选择压力）中孵育一个小时，其中所述培养物含有用质粒载体转化的细胞，所述质粒载体分别基于phNGAL102或phNGAL108，从而编码作为噬菌体pIII融合蛋白的脂质运载蛋白突变蛋白的文库。在用VCS-M13辅助噬菌体感染之前，将培养物在2YT培养基中稀释到OD550为0,1，其中加入了相应的抗生素并在相同条件下进一步生长直到达到OD550为0,6。在用VCS-M13辅助噬菌体(Agilent Technologies, La Jolla, USA)以大约为10的感染复数感染之后，再在37 °C下以100 rpm摇动培养物30分钟。然后将培养箱温度降低至26 °C，并将摇床速度再次升高至160 rpm，10分钟后加入卡那霉素（70µg/ml，之后经由加入25 µg/l（在每升培养物中加入125 µl的在二甲基甲酰胺DMF中的200 µg/ml母液）的无水四环素(ACROS Organics, Geel, Belgium)诱导基因表达。在26 °C下以160 rpm再继续孵育12-15个小时。

通过离心(30 min, 18000 g, 4 °C）沉淀来自整个培养物的细胞。无菌过滤(0.45 µm)含有噬菌粒的上清液，与1/4体积的20 %w/v PEG 8000、15 % w/v NaCl混合，然后在冰上孵育至少2个小时。在离心(30 min, 18000 g, 4 °C)之后，将来自1升培养物的沉淀的噬菌粒溶解于30 ml的冷BBS/E（200 mM硼酸钠, 160 mMNaCl, 1 mM EDTA pH 8.0)中，所述BBS/E含有50 mM苯甲脒(Sigma)和Pefabloc 1 µg/ml (Roth, Karlsruhe, Germany)。将溶液在冰上孵育1个小时。在离心(10 min, 43000 g, 4 °C)未溶解的组分之后，将每个上清液转移到新的反应管。

加入1/4体积的20 % w/v PEG 8000、15 % w/v NaCl和在冰上孵育60分钟使得再次沉淀噬菌粒，然后将噬菌粒等分并在-80°C下冷冻以进行保存。为了进行第一个选择循环，解冻噬菌粒并离心(30 min, 34000 g, 4 °C)，去除上清液，然后溶解沉淀的噬菌粒并合并在含有50 mM苯甲脒的总计400 µl的PBS中。在冰上孵育30 min之后，离心(5 min, 18500 g, 4°C)该溶液，以便去除参与的聚集体并将上清液直接用于噬菌体展示选择。

实施例2：制备不同形式的Aβ靶标

购买了对应于成熟β-淀粉样序列（Dodel等人 (2003) Lancet Neurology 2, 215-220）的氨基酸1至40的Aβ40肽(SEQ ID NO: 29)，该Aβ40肽为合成的冻干的肽，具有经由赖氨酸间隔物连接的C端生物素基团(PeptideSpeciality Laboratory, Heidelberg, Germany)或为未标记形式(W. M. Keck Laboratory, New Haven, USA)。通过在室温下将多达5 mg的肽在0.5 mL的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)溶解至少0.5小时，获得了均一单体Aβ40。之后，在SpeedVac浓缩仪中蒸发掉HFIP，并将Aβ40溶解于合适体积的蒸馏水中，随后在冷水中超声(Bandelin, Sonorex, RK100, Germany)15分钟。用0.22 µm过滤器（Spin-X离心管过滤器;Corning, USA）过滤后，通过在280 nm下使用计算的消光系数1490 M^-1cm^-1（Gasteiger等人 (2003) ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31, 3784-3788, http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）进行吸光度测量，测定蛋白浓度。

还从Peptide Speciality Laboratory购买了较短形式的β-淀粉样肽，例如N-端的肽Aβ1-11 (SEQ ID NO: 30)和中间的肽Aβ16-27 (SEQ ID NO: 31)。将这些较短形式的肽直接溶解于选择的缓冲液中，未进行预先的HFIP处理。

除了合成的肽，构建了编码不同的重组Aβ融合蛋白的两个载体以进行细菌表达：首先，根据Hortschansky等人((2005) Protein Sci.14, 1753-1759)构建了具有麦芽糖结合蛋白(MBP, pMBP-His, SEQID NO: 32)的融合蛋白，从而得到pASK75-MBP-Aβ40 (SEQ IDNO: 33)。第二，根据Moretto等人((2007) J. Biol. Chem.282, 11436-11445)构建了pASK75-TrxAβ28H6 (SEQ ID NO: 34)，在pASK75-TrxAβ28H6中，将成熟淀粉样肽的氨基酸1至28插入到硫氧还蛋白(Trx, pASK75-TrxH6, SEQ ID NO: 35)的活性位点环中。

顺序克隆在麦芽糖结合蛋白基因框架内携带延长的N端的人Aβ40，产生了新的质粒pASK75-MBP-Aβ40，这是载体pASK75的衍生物(Skerra(1994) Gene 151, 131-135)。此载体编码这样的融合蛋白：在麦芽糖结合蛋白之后为His₆标签（以便于蛋白纯化）、烟草蚀刻病毒(TEV)识别位点（以用于切割该融合蛋白）以及人Aβ40的序列。所述载体处于四环素启动子/操纵子或系统的紧密控制下，并且允许在大肠杆菌的细胞质中以高产率表达融合蛋白。

经由硫氧还蛋白的活性环中的独特的CpoI位点（核苷酸位置99-105，对应于氨基酸残基34和35），将编码成熟淀粉样肽的(Aβ28)氨基酸1至28的序列插入到硫氧还蛋白环位点中，从而产生载体pASK75-Trx-Aβ28H6。

在大肠杆菌JM83（Yanisch-Perron等人 (1985) Gene 33, 103-119）中于37 °C下表达两个Aβ融合蛋白Trx-Aβ28和MBP-Aβ40以及未融合的对照蛋白Trx和MBP。通过加入溶解于无水二甲基甲酰胺(DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)中的200 μg/l无水四环素(aTc; Acros, Geel, Belgium)、然后继续搅拌孵育3小时，以0.5的光密度OD₅₅₀诱导蛋白表达。通过在4 °C下以4200 g离心20分钟收集细胞。将来自2 L培养物的细胞重悬于20 ml裂解缓冲液(100 mM Tris/HClpH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)中，然后通过使所得的悬浮液3次通过弗氏压碎器而匀质化。如果离心(34500 g, 4 °C, 20min)去除不溶物，用0.45 μm过滤器(Filtropur S 0.45; Sarstedt, Nuembrecht, Germany)过滤上清液并经由每种蛋白的His₆标签进行亲和纯化。在固定化金属亲和色谱(IMAC)之后，经由尺寸排阻色谱(SEC)进一步纯化该融合蛋白。

通过在280 nm下使用下述计算的消光系数进行吸光度测量，测定蛋白浓度：对于MBP (SEQ ID NO: 32)为66350 M^-1cm^-1，对于MBP-Aβ40 (SEQ ID NO: 33)为69330 M^-1cm^-1，对于Trx-Aβ28 (SEQ ID NO: 34)为15470 M^-1cm^-1，对于Trx (SEQ ID NO: 35)为13980 M^-1cm^-1（Gasteiger等人，上文）。

为了进行下述实验，将两种Aβ融合蛋白Trx-Aβ28和MBP-Aβ40以及用作对照蛋白的卵白蛋白(Ova; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)、Trx和MBP，用生物素或洋地黄毒苷(DIG)以2:1的摩尔比率（标记试剂：靶蛋白）进行标记。

为此，将溶解于无水二甲基甲酰胺(DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)或二甲基亚砜(DMSO; Sigma-Aldrich, Steinheim,Germany)中的D-生物素-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)或洋地黄毒苷-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim,Germany)以PBS (4 mM KH₂PO₄, 16 mM Na₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7.4)中蛋白的2倍摩尔比率加入。将混合物在室温下旋转1小时。然后，加入1 M Tris/HCl pH 8.0至终浓度为10 mM，并且孵育10分钟，从而浸透剩下的活性NHS酯基团，之后经由在Superdex75 HR 10/30柱子(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)上进行SEC纯化标记的蛋白。为了被用作噬菌体展示选择中的靶标，首先用洋地黄毒苷标记Trx-A281小时，然后——为了封闭任何未配对的Cys残基——加入50倍的过量碘乙酰胺(Sigma-Aldrich, Steinheim,Germany)，然后孵育1小时。之后，用1 M Tris/HCl pH 8.0处理经修饰的蛋白并如上进行纯化。

实施例3：通过噬菌体展示选择对Aβ40肽具有亲和力的Lcn2突变蛋白

对于每个淘选循环，用PBS/T（含有0.1 % (v/v) Tween 20 [聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯; AppliChem, Darmstadt, Germany]的PBS）中的2 % (w/v) BSA封闭PBS (4 mM KH₂PO₄, 16 mMNa₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7.4)中的约10¹²个重组噬菌粒1小时。用PBS/T分别洗涤50 μL和25 μL的多份链霉亲和素包被的磁珠悬浮液（Dynabeads M-280 Streptavidin; Dynal Biotech, Invitrogen, Karlsruhe, Germany和Streptavidin Magnetic Particles; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany），然后用PBS/T中的2 % (w/v) BSA封闭1小时。将25 μL经封闭的珠子用于预吸附经封闭的噬菌粒以去除对该柱子特异的噬菌粒，将50 μL之后用于个选择循环。

用25 μL经洗涤且封闭的链霉亲和素包被的磁珠孵育经封闭的噬菌粒。然后用单管磁场(Promega, Mannheim, Germany)向下拉动珠子2分钟，用来自实施例2的100 nM生物素化的Aβ40，以400 µL的总体积，将含有未结合至珠子的噬菌粒的上清液孵育1-2小时。用50 μL经封闭的珠子孵育噬菌粒和肽靶标的混合物0.5小时，之后用单管磁场向下拉动2分钟。丢弃含有未结合的噬菌粒的上清液。用400 μL PBS/T洗涤结合至磁珠的靶标/噬菌粒复合物10次，然后在旋转下用350μL 0.1 M甘氨酸/HCl, pH 2.2洗脱结合的噬菌粒10分钟，然后立即用55 μL 0.5 M Tris碱中和。或者，在用PBS中的400 μL4 M尿素的变性条件下进行洗脱30分钟，然后用1 mL PBS稀释。对于选择循环1和2应用用酸或尿素的变性条件下的洗脱，而对于循环3和4，通过将400 μL 100 µM非生物素化的Aβ40加入到结合的噬菌粒并旋转1小时，而在竞争条件下进行洗脱。总的来说，进行4个选择循环。

为了扩增洗脱的噬菌粒，在37 °C下感染指数生长的大肠杆菌XL-1Blue 30分钟。通过将指数生长期的大肠杆菌XL-1 Blue直接加入到珠子中，洗脱剩余的珠子结合的噬菌粒。在4 °C下离心之后，将细菌沉淀重悬在合适体积的2x YT培养基(16 g/L Bacto Tryptone,10 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCl, pH 7.5)中，涂布到LB-Cam板（10 g/L Bacto Tryptone, 5 g/L BactoYeast Extract, 5 g/L NaCl, 15 g/L Bacto Agar, 35 mg/L氯胺苯醇, pH 7.5）上，然后在32 °C下孵育14-16小时。之后，从板上刮下细胞并用于获得和扩增重组噬菌粒。

在第四个淘选步骤之后，通过筛选ELISA（实施例5）进行富集的噬菌粒集合的筛选。

实施例4：通过噬菌体展示选择对Trx-Aβ28融合蛋白具有亲和力的Lcn2突变蛋白

对于每个淘选循环，首先用PBS/T（含有0.1 % (v/v) Tween 20的PBS）中的2 % (w/v) BSA封闭PBS (4 mM KH₂PO₄, 16 mMNa₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7.4)中的约10¹²个重组噬菌粒1小时。来自进行的选择循环3，将PBS/T中的2 % (w/v)脱脂奶(Sucofin,TSI, Zeven, Germany)用作封闭试剂。用PBS/T洗涤50 μL和25μL的抗DIG-IgG包被的磁珠悬浮液(Europa Bioproducts Ltd,Cambridge, UK)，然后分别用PBS/T或脱脂奶中的2 % (w/v) BSA封闭1小时。

用洗涤且经封闭的25 μL抗DIG-IgG包被的磁珠孵育经封闭的噬菌粒30分钟。然后用单管磁场(Promega, Mannheim, Germany)向下拉动珠子2分钟，用来自实施例2的15 μM未标记的Trx将含有未结合至珠子的噬菌粒的上清液孵育30分钟，以去除对Trx特异的噬菌粒。之后加入洋地黄毒苷化和羧甲基化的Trx-Aβ28至终浓度为100 nM，以400μL的总体积孵育混合物1-2个小时。然后用从50 µL份排出的经封闭的珠子孵育噬菌粒、Trx和Trx-Aβ28的混合物0.5小时。接着用单管磁场向下拉动珠子2分钟。丢弃含有未结合的噬菌粒的上清液。用500μL PBS/T洗涤具有结合的噬菌粒的磁珠10次。之后，在PBS中的400μL 4 M尿素在旋转下洗脱结合的噬菌粒30分钟，之后用1 mLPBS稀释。总的来说，进行6个选择循环。

为了扩增洗脱的噬菌粒，在37 °C下感染指数生长的大肠杆菌XL-1Blue 30分钟。通过将指数生长期的大肠杆菌XL-1 Blue直接加入到珠子中，洗脱剩余的珠子结合的噬菌粒。在4 °C下离心之后，将细菌沉淀重悬在合适体积的2x YT培养基(16 g/L Bacto Tryptone,10 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCl, pH 7.5)中，涂布到LB-Cam板（10 g/L Bacto Tryptone, 5 g/L BactoYeast Extract, 5 g/L NaCl, 15 g/L Bacto Agar, 35 mg/L氯胺苯醇, pH 7.5）上，然后在32 °C下孵育14-16小时。之后，从板上刮下细胞并用于获得和扩增重组噬菌粒。

在第六个淘选步骤之后，通过过滤器夹心的菌落筛选分析(filter-sandwich colony screening synthsis)（实施例6）进行富集的噬菌粒集合的筛选。

实施例5：经由筛选ELISA鉴定对Aβ特异的Lcn2突变蛋白

在如实施例3所述用Aβ40进行4个循环的噬菌粒选择之后，将富集的Lcn2突变蛋白集合在phNGAL98 (SEQ ID NO: 27)上进行亚克隆，用于转化大肠杆菌supE菌株TG1-F^-（大肠杆菌K12 TG1（Kim等人 (2009) J. Am. Chem. Soc. 131, 3565-3576的衍生物）），然后进行筛选ELISA。

为此目的，将来自富集的集合的单个菌落在96孔板（圆底带盖的Multiple Well Plate 96；Sarstedt, Nuembrecht, Germany）中、在100 µL TB-Amp培养基（12 g/L Bacto Tryptone, 24 g/LBacto酵母提取物, 55 mM甘油, 17 mM KH₂PO₄, 72 mM K₂HPO₄, 100 mg/L氨苄西林）中于37 °C下生长过夜。用过夜培养物接种具有100 µL TB-Amp培养基的新的培养板，然后在22 °C或37 °C下生长到指数期。用溶解于无水二甲基甲酰胺(DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)的20 µL 0.2 µg/mL无水四环素(aTc; Acros, Geel, Belgium)在20 °C下诱导Lcn2突变蛋白的外周胞质表达13-17个小时。用包含1 mg/mL溶菌酶的40 µL BBS（800 mM硼酸钠, 640 mM NaCl, 8 mM EDTA, pH 8.0），通过在4 °C下孵育1小时和以750 rpm (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Germany)搅拌，释放外周胞质蛋白。在用PBS/T（4 mM KH₂PO₄, 16 mM Na₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7.4，具有0.05 % (v/v) Tween 20）中的40 µL 10 % (w/v) BSA于4 °C和750 rpm下封闭1小时之后，在4 °C和3000 g下离心培养板10分钟。将上清液用于ELISA。

为了选择性地捕获携带C端Strep-标签II（Schmidt和Skerra (2007)Nat. Protoc. 2, 1528-1535）的Lcn2突变蛋白，在4 °C下用PBS中的10 µg/mL StrepMAB-Immo (IBA, Göttingen, Germany)包被96孔MaxiSorp聚苯乙烯微量滴定板(Nunc, Langenselbold,Germany)过夜，然后在室温下用PBS/T（具有0.1 % (v/v) Tween20的PBS）中的3 % (w/v) BSA封闭1个小时。用PBS/T的3次洗涤步骤之后，每孔应用来自上文的120 µL细胞提取物，然后以300 rpm孵育1.5小时。洗涤之后，加入来自实施例2的生物素化的Aβ40至浓度为0.5 µM，然后孵育1小时。作为对照，使用生物素化的Ova，而非Aβ40。再次洗涤各孔，用PBS/T中1:5000稀释的50 µL的ExtrAvidin/AP缀合物(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)检测结合的生物素化的肽或蛋白，之后在100 mM Tris/HCl, pH 8.8, 100 mMNaCl, 5 mM MgCl₂中的100 µL 0.5 mg/mL对硝基苯磷酸酯(AppliChem, Darmstadt, Germany)存在下进行信号显示长达1小时。在SpectraMax 250读板仪(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)中测量405 nm下的吸光度。

或者，将来自实施例2的0.5 µM非生物素化的Aβ40直接固定在96孔MaxiSorp聚苯乙烯微量滴定板(Nunc, Langenselbold, Germany)上，然后进行封闭。在与来自上文的细胞提取物一起孵育并洗涤之后，经由Strep-标签II、使用1:1500稀释的Streptactin/AP缀合物(IBA,Göttingen, Germany)检测结合的Lcn2突变蛋白。作为对照，将0.5µM Ova固定到ELISA板上。

实施例6：经由过滤器夹心的菌落筛选分析鉴定对Trx-Aβ28特异的Lcn2突变蛋白

在用如实施例4中描述的Trx-Aβ28进行6个循环的噬菌粒选择之后，经由BstXI (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)在质粒phNGAL124 (SEQ ID NO: 42)上亚克隆经突变的Lcn2基因盒，所述质粒编码这样的融合蛋白：OmpA信号肽、具有C端Strep-标签II (Schmidt and Skerra (2007) Nat. Protoc. 2, 1528-1535)的Lcn2编码区、然后使琥珀型终止密码子以及用于来自链球菌G蛋白（Schlehuber等人 (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120）的白蛋白结合。结构域(ABD)的基因。

然后进行过滤器夹心的菌落筛选分析，由此从涂在亲水滤膜（PVDF型GVWP, 0.22 μm; Millipore, Schwalbach, Germany）上的菌落释放Lcn2-ABD融合蛋白，然后功能性捕获在下面的第二个膜（Immobilon-P膜, 0.45 μm; Millipore, Schwalbach, Germany）上，所述第二个膜包被了人血清白蛋白(HSA, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)，之后进行由Schlehuber等人((2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120)详细描述的程序。用来自实施例2的PBS/T中的100 nM DIG标记的Trx-Aβ28探测该膜1个小时。用抗DIG Fab/碱性磷酸酶(AP)缀合物(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)检测结合的靶标缀合物，之后用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、4-甲苯胺蓝(BCIP; AppliChem, Darmstadt, Germany)和氮蓝四唑(NBT; AppliChem, Darmstadt, Germany)进行显色反应。在此膜上鉴定到具有强烈颜色信号的点之后，从第一过滤器上挑取相应菌落，然后经繁殖与第二个菌落筛选中进行并排比较。

为此目的，将分离的细菌以及表达对照Lcn2突变蛋白（例如野生型脂质运载蛋白）的细菌点到新鲜的亲水膜上，然后使之生长直到小菌落可见。对DIG标记的Trx-Aβ28以及DIG标记的对照蛋白Trx和Ova测试结合情况。将在第二个筛选中对Trx-Aβ28靶标产生特异信号的Lcn2突变蛋白进一步繁殖以进行质粒分离和之后的序列分析。

实施例7：可溶产生和纯化对Aβ和ED-B特异的Lcn2突变蛋白

通过在大肠杆菌BL21（Studier和Moffat (1986) J. Mol. Biol.189, 113-130）、大肠杆菌W3110 (Bachmann (1990) Microbiol. Rev. 54, 130-197)、大肠杆菌JM83（Yanisch-Perron等人(1985) Gene 33, 103-119)或大肠杆菌supE菌株TG1-F^-（大肠杆菌K12 TG1的一种衍生物[Kim等人 (2009) J. Am. ,Chem.Soc.131，3565-3576]，使用吖啶橙由其游离基因而加工而成）的外周胞质分泌，产生重组Lcn2及其突变蛋白，为了进行可溶蛋白表达，使用质粒phNGAL98 (SEQ ID NO: 27)，其编码OmpA信号肽与成熟Lcn2蛋白(SEQ ID NO: 28)和C端Strep-标签II的融合蛋白，由此该质粒携带用于单向亚克隆该突变的基因盒的两个不相容的BstXI限制性位点。

通过Strep-标签II（Schmidt和Skerra (2007) Nat. Protoc. 2,1528-1535）、然后通过使用PBS缓冲液在Superdex 75 HR10/30柱子(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)上进行尺寸排阻色谱(SEC)，亲和纯化该可溶蛋白。通过SDS-PAGE（Fling和Gregerson (1986) Anal. Biochem. 155, 83-88）检测蛋白纯度。通过在280nm下使用下述计算的消光系数进行吸光度测量，测定蛋白浓度：对于野生型Lcn2 (SEQ ID NO: 44)为31400 M^-1cm^-1，对于Aβ特异突变蛋白H1-G1 (SEQ ID NO: 43)为26930 M^-1cm^-1、对于S1-A4 (SEQ ID NO: 38)为24410 M^-1cm^-1，对于US7 (SEQ ID NO: 41)为26930 M^-1cm^-1。ED-B特异Lcn2突变蛋白的计算的消光系数为：对于突变蛋白N7A (SEQ ID NO: 20)为37930 M^-1cm^-1，对于N7E (SEQID NO: 22)为22920 M^-1cm^-1，对于N9B (SEQ ID NO: 24)为21430 M^-1cm^-1，对于N10D (SEQ ID NO: 26)为39420 M^-1cm^-1（Gasteiger等人，上文）。

实施例8：在ELISA实验中测量对不同Aβ靶标的结合活性

为了选择性捕获携带C端Strep-标签II（Schmidt和Skerra (2007)Nat. Protoc. 2, 1528-1535）的Lcn2突变蛋白，在4°C下用PBS中的10 µg/mL StrepMAB-Immo (IBA, Göttingen, Germany)包被96孔MaxiSorp聚苯乙烯微量滴定板(Nunc, Langenselbold, Germany)过夜，然后在室温下用PBS/T中的3 % (w/v) BSA封闭1个小时。在用PBS/T的3次洗涤步骤之后，将50 µL来自实施例7的经纯化的Lcn2突变蛋白的1 µM溶液应用到全部孔中1个小时。洗涤之后，加入50 µL来自实施例2的系列稀释的生物素化的靶标Aβ40、MBP-Aβ40或Trx-Aβ28并孵育1个小时，由此将来自实施例2的生物素化形式的Ova、MBP和Trx用作阴性对照蛋白。再次洗涤各孔，然后用PBS/T中1:5000稀释的50 µL的ExtrAvidin/AP缀合物(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)检测结合的缀合物1个小时，之后在100 mM Tris/HCl, pH 8.8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂中的100µL 0.5 mg/mL对硝基苯磷酸酯(AppliChem, Darmstadt, Germany)存在下进行信号显示。在SpectraMax 250读板仪(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)中测量405 nm下吸光度∆A/∆t的时间，然后用KaleidaGraph软件(Synergy software, Reading, PA)将数据拟合到方程

ΔA = ΔA_max x [L]_tot / (K_D + [L]_tot)中，

其中[L]_tot表示应用的配体缀合物的浓度，K_D为解离常数（Voss和Skerra (1997) Protein Eng. 10, 975-982）。

或者，为了进行“直接”ELISA，将2 µM来自实施例2的未标记的Aβ40靶标吸附到96孔MaxiSorp聚苯乙烯微量滴定板(Nunc, Langenselbold, Germany)上，然后用经纯化的Lcn2突变蛋白孵育，其经由Strep-标签II、使用1:1500稀释的链霉亲和素/AP缀合物(GE HealthcareUK Ltd, Buckinghamshire, UK)进行检测。作为对照，将来自实施例2的2 µM MBP吸附到ELISA板上。在SpectraMax 250读板仪(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)中测量405 nm下的吸光度。

或者，以与上文描述的“捕获”ELISA相似的方式进行“竞争性”ELISA。再次地，在固定StrepMAB-Immo并洗涤之后，将50 µL来自实施例7的经纯化的Lcn2突变蛋白的1 µM溶液应用到全部孔中1个小时。洗涤之后，在不同浓度的游离未标记的靶标作为竞争物存在下，应用固定浓度为5 nM（对于S1-A4）或40 nM（对于US7）的来自实施例2的生物素化的靶标Trx-Aβ28。以100倍过量开始，在每个步骤中以2倍降低竞争物浓度。在这种情况下，将数据拟合为sigmoidal方程

ΔA = (ΔA_max – ΔA_min)/(1+ ([L]_tot ^free/K_D)^p) + ΔA_min

其中将曲线斜率p（Hill系数）作为其它参数。

下表1总结了在不同ELISA程序中以及在表面等离子体共振（参见实施例9）中测定的K_D值。

表1:

实施例9：经由表面等离子体共振(SPR)测量对Aβ的结合活性

在Biacore X system (Biacore, Uppsala, Sweden)上、使用PBS/T（含有0.005 % (v/v) Tween 20的PBS）作为流动缓冲液，进行Lcn2突变蛋白的实时分析。使用标准的胺偶联化学，将来自实施例2的MBP-Aβ40在10 mM乙酸钠, pH 4.5中的50 µg/mL溶液固定到CMD 200I芯片(Xantec, Düsseldorf, Germany)上，从而得到1455共振单位(RU)的配体密度。以范围为2 nM至125 nM的浓度和10 µL/min的流量应用来自实施例7的经纯化的Lcn2突变蛋白S1-A4和US7。通过减去针对对照通道测得的相应信号，校正感应谱，所述对照通道已被活化且用乙醇胺封闭。通过用BIAevaluation软件V 3.0（Karlsson等人 (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240）拟合，进行动力学数据评估。在此步骤期间，整体拟合k_on和k_off速率，而对每条曲线局部地拟合最大响应差异R_max。

实施例10：经由SPOT膜上的表位作图确定Aβ表位

在如Frank ((2002) J. Immunol. Methods 262, 13-26)描述的自动化程序中，使用MultiPep RS仪器(Intavis, Köln, Germany)和来自同一供应商的活化氨基酸，制备用于进行Lcn2突变蛋白S1-A4和US7的Aβ表位作图的SPOT膜（Amino-PEG500-UC540片，100 x 150 mm, Intavis, Köln, Germany）。在膜上以连续的六聚体、十聚体和十五聚体合成Aβ40氨基酸序列(SEQ ID NO: 29)，每一个均具有1个氨基酸的错位，从而覆盖整个序列。这些肽的C端共价地连接到膜上，而它们的N端被乙酰基化。固定的Strep-标签II用作该检测方法的阳性对照。

用95 %三氟乙酸(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)、3 %三异丙基硅烷(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)和2 %蒸馏水进行侧链脱保护2个小时。在用二氯甲烷(Sigma-Aldrich, Steinheim,Germany)洗涤膜4次、用二甲基甲酰胺(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)洗涤两次和用乙醇洗涤两次之后，风干该膜。

在使用之前，该膜用乙醇洗涤一次、用PBS (4 mM KH₂PO₄, 16mM Na₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7.4)洗涤3次，然后用PBS/T（含有0.1 % (v/v) Tween 20的PBS）中的3 % (w/v) BSA封闭1个小时。在用PBS/T洗涤3次之后，将膜用PBS/T中的Lcn2突变蛋白S1-A4 (50 nM)、US7 (100 nM)或野生型Lcn2 (100 nM)孵育1个小时，然后用PBS/T洗涤3次。然后，用PBS/T中的1:1500稀释的链霉亲和素/AP缀合物(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)孵育该膜1个小时，以经由Strep-标签II进行蛋白检测。之后，将该膜用PBS/T洗涤3次，在AP缓冲液(100 mM Tris/HCl, pH 8.8, 100 mM NaCl,5 mM MgCl₂)中洗涤1次，然后用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、4-甲苯胺蓝(BCIP; AppliChem, Darmstadt, Germany)和氮蓝四唑(NBT; AppliChem, Darmstadt, Germany)在AP缓冲液进行显色反应，如Schlehuber等人((2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120)所述。

比较分别用S1-A4和野生型Lcn2孵育的膜，仅在用S1-A4孵育膜后产生了明显的点，而在用野生型Lcn2孵育膜后没有产生。在十五聚体Aβ40片段的情况下，基序LVFFAED看起来对于S1-A4的结合是重要的。在较短的六聚体和十聚体肽序列的情况下，检测到S1-A4结合到最小基序VFFAED和FFAEDV。在此分析中，Lcn2突变蛋白US7显示了类似的表位图谱。

实施例11：在ThT聚集分析进行与Aβ具有亲和力的Lcn2突变蛋白的功能分析

在存在或不存在各种Lcn2突变蛋白的情况下，使来自实施例2的固定和均匀单体的非生物素化的Aβ40进行thioflavin T聚集分析。Thioflavin T (ThT; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)与富含β-片层的淀粉样纤维和低聚前体特异地结合，但是不与单体Aβ肽结合，所述结合伴随着ThT荧光的增加（Khurana等人 (2005) J. Struct. Biol. 151, 229-238）。

为此，将ThT溶解于蒸馏水至浓度为1 mM。通过用5 mM甘氨酸/NaOH, pH 8.5将1 mM母液稀释到终浓度为5 µM制备工作溶液。在37°C下无需搅拌，孵育500 µL 200 µM Aβ40在蒸馏水中的1:1 混合物（根据实施例2进行溶解）和PBS中的来自实施例7的20 µM Lcn2突变蛋白。在不同时间点的每次荧光测量之前，短暂涡旋样品10次，将20µL的各样品与180 µL ThT工作溶液混合。在荧光分光仪(LS 50 B, Perkin Elmer, Waltham, USA)中，用450 nm的激发波长和482 nm的发射波长测量荧光强度。

如图9所示，Lcn2突变蛋白US7显示了1:10的比率的Aβ40聚集强抑制。

实施例12：制备含有额外结构域B(ED-B)的重组纤连蛋白片段

将人纤连蛋白的3种不同重组片段用作选择的靶标：仅额外结构域-B（命名为ED-B; Zardi等人 (1987) EMBO Journal, 6, 2337-2342）；在其相邻结构域7和8中的相同结构域（称为FN7B8）；和包含常规结构域7、8和9的FN789，因而缺少ED-B（Carnemolla等人 (1996), Int. J. 癌症, 68, 397-405；Leahy等人 (1994) Proteins 19, 48-54）。

将FN7B8、FN789和ED-B的编码序列克隆在载体pASK75（Skerra (1994) Gene 151, 131-135）或其衍生物pASG-IBA-33 (IBA, Göttingen, Germany)上，从而分别得到pASK75-FN7B8 (SEQ ID NO:13)、pASK75-FN789 (SEQ ID NO: 17)和pASG-IBA-33-EDB (SEQID NO: 15)。全部构建体在羧基端提供His₆标签，以经由固定化金属亲和色谱(IMAC)进行纯化，在大肠杆菌TG1/F^- [大肠杆菌K12 TG1的衍生物(Gibson (1984) Studies on the Epstein-Barr virus genome, Cambridge University, England)]或BL21（Studier和Moffatt (1986), 189, 113-130）的细胞质产生了可溶蛋白。因此，在37 °C下在含有100 µg/ml氨苄西林的LB培养基中，使携带该表达质粒的大肠杆菌的2L培养物生长到对数期中期。加入200 µg/L无水四环素(Acros, Geel, Belgium)之后，在37°C下继续生长5至7个小时。通过离心浓集细胞，重悬于35 ml冰冷的色谱缓冲液(40 mM Hepes/NaOH, 1 M NaCl, pH 7.5)中，然后通过超声(S250D, Branson, Danbury CT, USA)裂解。

下文给出的纯化操作程序对于全部三种重组纤连蛋白片段而言是相同的。将经澄清的裂解液施加于Zn²⁺/IDA-Sepharose柱子(GE Healthcare, Munich, Germany)，所示柱子装有10 mM ZnSO₄并用40 mMHepes/NaOH, 1 M NaCl, pH 7.5平衡。用色谱缓冲液中的0至300 mM咪唑（用HCl调节pH）之间的浅梯度洗脱结合的蛋白。通过混合了终浓度为1 mM的EDTA的SDS-PAGE鉴定含有重组蛋白的级分，然后针对20 mM Hepes/NaOH,pH 7.4透析过夜。之后，将蛋白装载于离子交换色谱柱子(ResourceQ, GE Healthcare, Munich, Germany)上，所示柱子用20或40mM Hepes/NaOH, pH 7.4平衡。为了洗脱结合的纤连蛋白片段，使用0至300 mM NaCl的梯度。

最后，通过SDS-PAGE分析和尺寸排阻色谱确定蛋白的纯度。为了通过280 nm处的吸光度测量测定蛋白的浓度，使用下述计算的消光系数（Gasteiger等人 (2003) Nucleic Acids Res. 31, 3784-3788）：对于FN7B8为31,400 M^-1cm^-1，对于FN789为28420 M^-1cm^-1，对于ED-B为11460 M^-1cm^-1。通常，每2L摇瓶培养物获得约10至20 mg经纯化的蛋白。将经纯化的蛋白保存于4°C下，用于全部实验。

根据供应商的手册，在室温下，以过量（4:1摩尔比率）的洋地黄毒苷-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)进行1个小时的经纯化纤连蛋白片段的洋地黄毒苷标记。为了去除游离的洋地黄毒苷，将蛋白溶液施加于PD-10脱盐柱子(GE Healthcare, Munich, Germany)，所示柱子用40mM Tris/HCl, 115 mM NaCl和1 mM EDTA, pH 7.5平衡。通过SDS-PAGE、ESI质谱或经由用抗洋地黄毒苷-AP、Fab片段(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)染色的点印记检查洋地黄毒苷化成功与否和蛋白的完整性。

实施例13：通过噬菌体展示选择与ED-B具有亲和力的Lcn2变体

使用基于合成的基因集合的Lcn2随机噬菌粒文库进行一共4个噬菌粒展示选择循环，所示合成的基因集合最初由Sloning BioTechnologyGmbH合成，如实施例1中所述。对于第一个选择循环，将约5x10¹²个重组噬菌粒溶解于补充了50 mM苯甲脒的300 L TBS/E (40 mMTris/HCl, 115 mM NaCl and 1 mM EDTA, pH 7.4)中，然后通过加入TBS中的100 µL 8 % (w/v) BSA (Sigma-Aldrich,Munich, Germany)封闭30分钟，所述TBS含有0.4 % (v/v) Tween20 [聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯; AppliChem, Darmstadt,Germany])。然后用抗洋地黄毒苷IgG磁珠(Europa Bioproducts, Cambridge, UK)将此溶液孵育1个小时，所述磁珠已经用TBS/T（含有0.1 % (v/v) Tween 20的TBS）中的2 % (w/v) BSA封闭了1个小时，并装载了400 µl的0,1 µM 洋地黄毒苷标记的重组FN7B89（参见实施例12）。

在经由磁体收集珠子并丢弃上清液之后，用TBS/T进行10个洗涤步骤，然后首先用400 µl的0.1 M三乙基胺（未调节pH）洗脱剩余结合的噬菌粒6分钟，然后用350 µl的0.1 M甘氨酸/HCl pH 2.2第二次洗脱8分钟。收集洗脱液，然后分别用适合量的2 M乙酸或50 µl0.5 M Tris碱立刻中和，合并，并用于感染指数生长的大肠杆菌XL1-Blue。滴定噬菌粒，然后在根据已公开的操作程序进行下一个淘洗步骤之前再次扩增（Beste等人 (1999) PNAS 96, 1898-903；Schlehuber等人 (2000) J Mol Biol 297 1109-20）。

对于第二轮选择，使用约2x10¹²个扩增的噬菌粒，并通过与400 µl的231 nmol/ml游离重组ED-B竞争而洗脱结合的噬菌粒75分钟。

在第三和第四个选择循环中，首先用100 nM洋地黄毒苷标记的FN7B8将约2x10¹²个扩增的噬菌粒孵育1个小时。然后，在抗洋地黄毒苷IgG磁珠上捕获噬菌粒-抗原复合物20分钟。用TBS/T洗涤珠子10次之后，通过与400 µl的140至231 nmol/ml游离重组ED-B竞争而洗脱结合的噬菌粒75分钟。

实施例14：通过筛选ELISA选择与ED-B具有亲和力的Lcn2变体

通过筛选ELISA监测Lcn2突变蛋白的富集，所述Lcn2突变蛋白由实施例13中描述的噬菌体展示选择得到，特异性地结合靶标蛋白ED-B。使用来自上一个淘洗步骤的合并的质粒制备物，经由BstXI将经突变的基因盒亚克隆到表达质粒phNGAL98上，其编码用于在大肠杆菌中外周胞质产生的OmpA信号肽和具有C端Strep-标签II（Schmidt and Skerra(2007) Nat. Protoc. 2, 1528-1535）的Lcn2编码区的融合蛋白。如下进行在96孔板中可溶表达各Lcn2突变蛋白：用随机挑选的单个菌落接种含有100 µg/ml氨苄西林的100 µl TB培养基（Tartof和Hobbs (1987) Bethesda Research Laboratory Focus 9, 12），然后在37°C下振摇（500至800 rpm; Thermomixer comfort;Eppendorf, Hamburg, Germany）孵育5个小时。对于每个克隆，用10 µl该培养物接种100 µl的新鲜培养基，然后在37°C下振摇孵育1至2个小时，然后将温度降低至22°C。进一步孵育2-4小时之后，用0.2 µg/ml无水四环素(Acros, Geel, Belgium)在指数生长的细胞中表达Lcn2突变蛋白12-14个小时。在室温下并振摇，通过加入含有1mg/ml溶菌酶(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)的40µl 2xBBS（0.2 M硼酸盐/NaOH, 160 mM NaCl, 1 mM EDTA,pH 8.0）进行蛋白的外周胞质释放1个小时。用TBS中的40 µl10 % w/v BSA(Applichem, Darmstadt, Germany)和0,5 % Tween-20封闭裂解液1个小时，然后通过离心10分钟，从粗提取物中去除细胞碎片。

为了将FN7B8或FN789吸附在96孔Nunc Maxisorp板(Thermo FisherScientific, Langenselbold, Germany)的表面上，每孔加入50 µl的TBS中的100 µg/ml蛋白溶液，然后在4°C下孵育过夜。在用TBS/T的三次洗涤步骤之后，在室温下，用TBS/T中的2 % (w/v) BSA封闭孔3个小时，并且在暴露于来自大肠杆菌的粗提取物之前重复洗涤。为了进行ELISA，每孔施加50 µl的经澄清的裂解液，孵育1个小时，然后用TBS/T洗涤三次。用链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物（TBS/T中1:1500; GE Healthcare, Munich, Germany），使用底物即0.1M Tris/HCl, 0.1 M NaCl, 5 mM MgCl₂, pH 8.8中的4-硝基苯磷酸酯(pNpp, 0.5 mg/ml; AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany)，检测结合的Lcn2突变蛋白（参见实施例16）。

在此筛选ELISA中鉴定了四个克隆。在后面的实验（参见实施例16-18）中，发现这四个Lcn2突变蛋白还在ED-B阳性的人结肠癌细胞的ELISA、SPR-分析和免疫荧光显微术显示了对FN7B8的特异结合活性。将这些Lcn2突变蛋白命名为N7A (SEQ ID NO: 20)、N7E (SEQ IDNO: 22)、N9B (SEQ ID NO: 24)和N10D (SEQ ID NO: 26)。

实施例15：Lcn2及其变体的可溶蛋白产生和纯化

详见实施例7。

实施例16：在ELISA中测量对ED-B的结合活性

为了将FN7B8或FN789吸附到96孔Nunc Maxisorp板(Thermo FisherScientific, Langenselbold, Germany)的表面上，每孔加入50 µl的TBS中的100 µg/ml蛋白溶液，然后在室温下孵育2个小时。此外，为了包括对照蛋白，将空白孔暴露于TBS/ET中的120 µl 2 %(w/v) BSA (AppliChem, Darmstadt, Germany)。在三次洗涤步骤之后，用TBS/ET中的120 µl 2 % (w/v) BSA (AppliChem, Darmstadt, Germany)封闭孔2个小时，并且重复洗涤，然后加入50µL系列稀释的经纯化的Lcn2突变蛋白并孵育1个小时。再次洗涤各孔，然后用TBS/T中1:1500稀释的50 µL链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物(GE Healthcare, Munich, Germany)检测结合的Lcn2突变蛋白1个小时，之后在100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, pH 8.8中的50 µL 0.5 mg/mL对硝基苯磷酸酯(AppliChem, Darmstadt, Germany)存在下进行信号显示。在SpectraMax 250读板仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中测量405 nm下吸光度∆A/∆t的时间，然后用KaleidaGraph软件(Synergy software, Reading, PA)将数据拟合到方程

ΔA = ΔA_max x [L]_tot/(K_D + [L]_tot)

其中[L]_tot表示应用的配体缀合物的浓度，K_D为解离常数（Voss和Skerra (1997) Protein Eng. 10, 975-982）。发现Lcn2变体N7A、N9B和N10D以14.8 nM (N7A)、40.1 nM (N9B)、30.0 nM (N7E)和51.2 (N10D)的K_D值特异性地结合FN7B8，但是不结合FN789或BSA。

实施例17：经由表面等离子体共振(SPR)测量对重组纤连蛋白FN7B8的结合活性

在BIAcore X系统(BIAcore, Uppsala, Sweden)上，使用HBS/ET（20 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA，含有0.005 % (v/v) Tween 20）作为流动缓冲液，进行Lcn2突变蛋白的实时分析。使用标准胺偶联化学(Biacore, Uppsala, Sweden)，将10 mM乙酸钠, pH 4.0中的200 µg/ml重组FN7B8溶液固定在CMD200 m传感器芯片(XanTec bioanalytics, Duesseldorf, Germany)上，从而得到约500共振单位(RU)的配体密度。以25 µl/min的流量、以2.5至160 nM的浓度应用经纯化的Lcn2突变蛋白。

通过减去针对对照通道测得的相应信号，校正感应谱，所述对照通道已被活化且用乙醇胺封闭。通过用BIAevaluation软件V 4.1（Karlsson等人 (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240）拟合，进行动力学数据评估。

表2. 通过表面等离子体共振测定所选择的Lcn2突变蛋白对FN7B8的动力学结合数据。

Lcn2变体	kon [M-1s-1]	koff [s-1]	KD [M]
				N7A	4.6x106	2.6x10-2	5.8x10-9
N7E	4.1x106	3.0x10-2	7.2x10-9
				N9B	2.1x106	7.5x10-2	3.6x10-8
N10D	1.5x106	5.8x10-2	3.8x10-8

实施例18：免疫染色ED-B阳性的CaCo2细胞

在37°C下和加湿气氛中，在Nunc Lab-Tek™ II室载玻片™系统（每个载玻片4个室; Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Germany）上、在MEM中，培养人结肠癌细胞（CaCo2细胞由H. Daniel, Technische Universität München, Germany友情提供；Pujuguet等人, Am. J. Pathol. 148, 579-592），所述MEM具有依格氏盐和L-谷氨酰胺，并补充了10 %胎牛血清、1x MEM非必需氨基酸和50 µg/ml庆大霉素(PAA Laboratories, Pasching, Austria)，直到细胞汇合度为约50至70 %。用PBS（无Ca²⁺和Mg²⁺的杜氏;PAA Laboratories, Pasching, Austria)、然后用蒸馏水洗涤附着于载玻片的细胞单层，之后固定，用含有5 µg/ml DAPI（4´,6-二脒基-2-苯基吲哚; Sigma-Aldrich, Munich, Germany）的冰冷甲醇复染5分钟。

在暗处进行后续全部孵育。洗涤固定的细胞，然后用500 µl 1 µM野生型Lcn2、Lcn2突变蛋白、PBS或ED-B特异抗体scFv-L19（Pini等人 (1998) J. Biol. Chem. 273, 21769-21776）孵育1小时。这些试剂全部纯化为Strep-标签II融合蛋白（Schmidt和Skerra，上文）。用PBS洗涤细胞，然后用未标记的抗体StrepMABimmo（PBS中5 µg/ml; IBA, Göttingen, Germany）孵育1小时，之后进行2个洗涤步骤。最后，使用PBS中1:200稀释的荧光标记的抗小鼠IgG (H+L)F(ab´)₂片段Dylight-488缀合物(Cell Signaling Technology,Danvers, USA)作为第二抗体，检测与CaCo2细胞的特异结合。

当在Axiovert 40 CFL显微镜(Carl Zeiss, Göttingen, Germany)下观察时，全部Lcn2变体以及抗体scFv-L19显示了特异的细胞染色，而重组野生型Lcn2和PBS在此分析中显示了可忽略的信号。

实施例19：经由在位置36处的H1-G1中交换自由的半胱氨酸残基，产生Aβ特异的Lcn2突变蛋白H1GA和H1GV

提供定点突变将Cys36替代为Ala或Val。为此，用简并寡脱氧核苷酸DH-4 (SEQ ID NO: 45)和第二寡脱氧核苷酸J08rev (SEQ ID NO: 48)以及编码Lcn2突变蛋白H1-G1的质粒DNA作为模板(SEQ ID NO: 37)，进行PCR。经由BstXI将扩增的片段亚克隆在表达质粒phNGAL98上并测序，从而鉴定各替换变体。取决于引入的氨基酸交换，将所得的Lcn2变体命名为H1GA (SEQ ID NO: 49, 50)和H1GV (SEQID NO: 51, 52)。

实施例20：使用大肠杆菌培养物，以高光密度可溶产生和纯化新的Aβ特异的Lcn2突变蛋白H1GA和H1GV

通过在大肠杆菌JM83中外周胞质分泌产生重组Lcn2及其突变蛋白。为了进行可溶蛋白表达，使用了具有编码H1GA (SEQ ID NO: 49)或H1GV (SEQ ID NO: 51)的相应BstXI插入片段的质粒phNGAL98。在搅拌下于22 °C，在含有100 mg/L氨苄西林(Amp)的2 L LB培养基中使培养物生长。通过加入无水四环素(aTc)至终浓度为0.2 mg/L，在OD₅₅₀ = 2.5的细胞密度时，诱导基因表达。在孵育5个小时之后，通过离心收集细胞，重悬于40 mL含有0.1 mg/mL溶菌酶的冰冷的外周胞质分级缓冲液（0.5 M蔗糖, 1 mM EDTA, 100 mM Tris–HCl pH 8.0)中，然后在冰上孵育30分钟。通过重复离心沉淀所得的球形体，然后挥手含有可溶重组蛋白的上清液。

通过Strep-标签II经亲和纯化可溶蛋白，然后在Superdex 75 HR10/30柱子上使用PBS缓冲液(4 mM KH₂PO₄, 16 mM Na₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7.4)进行尺寸排阻色谱(SEC)。通过SDS-PAGE检查蛋白纯度。通过在280 nm下使用Aβ特异的突变蛋白H1GA (SEQID NO: 50)和H1GV (SEQ ID NO: 52)的计算的消光系数27055M-1cm-1进行吸光度测量，测定蛋白浓度。

实施例21：在BiacoreX仪器上经由表面等离子体共振测量对MBP-Aβ40的结合活性

在Biacore X系统上使用PBS/T (4 mM KH₂PO₄, 16 mM Na₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7.4，含有0.005 % (v/v) Tween 20)作为流动缓冲液，进行Lcn2突变蛋白H1GA或H1GV与MBP-Aβ40 (SEQID NO: 33)之间的相互作用的实时分析。使用标准胺偶联化学，将10 mM乙酸钠, pH 4.5中的来自实施例2的MBP-Aβ40的15 µg/mL溶液固定到CMD 200I芯片(Xantec, Düsseldorf, Germany)上，从而得到1316共振单位(RU)的配体密度。以4 nM至128 nM范围的浓度、以20 µL/min的流量应用来自实施例20的经纯化的Lcn2突变蛋白H1GA和H1GV。通过减去针对对照通道（已被活化且用乙醇胺封闭）测得的相应信号，以及减去针对缓冲液注入的平均值测得的信号，对该数据进行双重参照。整体使用BIAevaluation软件V 3.0（Karlsson等人(1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240）拟合动力学数据。

实施例22：在Biacore T100仪器上经由表面等离子体共振测量对Aβ40的结合活性

在Biacore T100系统(Biacore, Uppsala, Sweden)上使用PBS/T(4 mM KH₂PO₄, 16 mM Na₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7.4，含有0.005 % (v/v) Tween 20)作为流动缓冲液，进行Lcn2突变蛋白H1GA与Aβ40 (SEQ ID NO: 29)之间的相互作用的实时分析。使用标准胺偶联化学，将10 mM乙酸钠pH 4.5中的来自实施例2的Aβ40的10 µg/mL溶液固定到CMD芯片(Biacore, Uppsala, Sweden)上，从而得到325 RU的配体密度。以1 nM至32 nM范围的浓度、以30µL/min的流量应用来自实施例20的经纯化的Lcn2突变蛋白H1GA。注入的系列稀释的H1GA的连接和解离时间均为300 s，以获得k_on信息。为了准确测定低k_off速率，使用7200 s的解离时间分析最高浓度。如实施例21中对数据进行双重参考。使用Biacore T100 Evaluation软件V2.0.3进行数据处理和动力学拟合，从整个数据组测得了结合反应的k_on和k_off。整体使用1:1结合模型拟合数据。

实施例23：在ThT聚集分析中对Lcn2突变蛋白H1GA进行功能分析

为了进行Thioflavin T (ThT)聚集分析，将合成的Aβ肽(SEQ IDNO: 29)在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)中溶解12个小时。在真空蒸发HFIP，并将Aβ溶解于合适体积的双蒸水中，在4 °C下超声15分钟，然后过滤（CostarSpin-X离心管过滤器醋酸纤维素膜, 0.45 µm; Corning Inc., Corning, NY）。然后立刻将溶解的单体Aβ用于聚集分析。

在不存在或存在不同摩尔比率的Lcn2突变蛋白或BSA的情况下，在0.5x PBS中于37 °C下并搅拌，孵育500 µl的1 mg/ml Aβ。一式三份地制备聚集反应。为了进行荧光测量，将周期性取得的20 µl样品与终浓度为0.5 x PBS中50 µM的180 µl ThT混合，然后使用FluoroMax-3荧光光度仪(HORIBA Jobin Yvon, Grasbrunn,Germany)以450 nm的激发波长和482 nm的发射波长分析。

实施例24：经由表面等离子体共振(SPR)测量对重组纤连蛋白单个结构域ED-B的结合活性

在BIAcore X仪器上，使用HBS/ET (20 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA，含有0.005 % (v/v) Tween 20)作为流动缓冲液，进行Lcn2突变蛋白的实时相互作用分析。使用标准胺偶联化学，将10 mM乙酸钠,pH 4.0中的重组ED-B的100 µg/ml溶液固定在CMD 200 m传感器芯片上，从而得到约180共振单位(RU)的配体密度。以2.5至160 nM的浓度、以25 µL/min的流量应用经纯化的Lcn2突变蛋白。通过减去针对对照通道测得的相应信号，校正感应谱，所述对照通道已被活化且用乙醇胺封闭。通过用BIAevaluation软件V 4.1（Karlsson等人 (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240）整体拟合，进行动力学数据评估。在此步骤期间，整体拟合k_on和k_off速率，而对每条曲线局部地拟合最大响应差异R_max。在N10D的情况下，将异源分析物竞争性反应模型用于数据拟合，从而得到两组动力学常数。

表3. 通过表面等离子体共振测定的Lcn2突变蛋白对ED-B的动力学结合数据

Claims (55)

1.一种用于产生源自hNGAL的突变蛋白的方法，其中所述突变蛋白以200nM或更低的解离常数(K_D)结合给定非天然靶标，所述方法包括：

(a)使编码hNGAL的核酸分子发生突变，所述突变发生在编码对应于SEQ ID NO:44中所示成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置96、100和106的任何序列位置中的至少一个的核苷酸三联体处；并且还至少发生在编码成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132和134中任意的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或全部17个核苷酸三联体处，从而得到一种或多种突变蛋白核酸分子，并且

(b)在合适的表达系统中表达在步骤(a)中获得的所述一种或多种突变蛋白核酸分子，以及

(c)通过选择和/或分离富集对给定靶标具有可检测的结合亲和力的一种或多种突变蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)为：

(a)使编码hNGAL的核酸分子发生突变，所述突变至少发生在编码对应于SEQ ID NO:44中所示成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置96、100和106的任何序列位置中的2个核苷酸三联体处，并且至少发生在编码成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132和134中任意的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或全部17个核苷酸三联体处，从而得到一种或多种突变蛋白核酸分子。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)为：

(a)使编码hNGAL的核酸分子发生突变，所述突变发生在编码对应于SEQ ID NO:44中所示成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中的全部3个核苷酸三联体处，并且至少发生在编码成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132和134中任意的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或全部17个核苷酸三联体处，从而得到一种或多种突变蛋白核酸分子。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其通过仅以核苷酸三联体组实现的替换，使至少在编码成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中任意的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸三联体处发生随机突变。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在突变期间，编码半胱氨酸的核苷酸三联体不用于替换。

6.一种通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法可获得的源自hNGAL的突变蛋白，其中所述突变蛋白在对应于成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中的任意处包含至少一个突变的氨基酸残基，其中所述突变蛋白进一步在对应于成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132和134的序列位置中的任意处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个突变的氨基酸残基，其中所述突变蛋白以200nM或更低的解离常数(K_D)结合给定非天然靶标。

7.根据权利要求6所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白在成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置96、100和106处包含2或3个突变的氨基酸残基。

8.根据权利要求7所述的突变蛋白，其在成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中的任意处包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个突变的氨基酸残基。

9.根据权利要求8所述的突变蛋白，其在成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中的任意处包含18、19或20个突变的氨基酸残基。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的突变蛋白，其中所述非天然靶标选自肽、蛋白、蛋白的结构域、和小有机分子，其中所述小有机分子是这样的有机分子：其包含至少两个碳原子，分子量范围为100至2000道尔顿。

11.根据权利要求10所述的突变蛋白，其中所述小有机分子为显示免疫半抗原的特征的化合物。

12.根据权利要求10所述的突变蛋白，其中所述肽具有2-45个氨基酸的长度。

13.根据权利要求12所述的突变蛋白，其中所述肽为β淀粉样肽。

14.根据权利要求13所述的突变蛋白，其中所述β淀粉样肽为Aβ40肽或Aβ42肽。

15.根据权利要求13或14所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白相对成熟hNGAL氨基酸序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替代，所述氨基酸替代选自Leu36→Val或Cys；Ala40→Tyr或Lys或Val；Ile41→Thr或Ser或Leu；Gln49→Leu或Trp；Leu70→Gly；Arg72→Gly或Asp；Lys73→Leu或Thr或Asp；Asp77→Asn或His或Leu；Trp79→Lys；Asn96→Ile或Arg；Tyr100→Gln或Arg或Glu；Leu103→Met或Arg或Gly；Tyr106→Tyr或Ala或Trp；Lys125→Thr或Val或Glu；Ser127→Gly或Gln或Ala；Tyr132→Met或Ser或Thr；以及Lys134→Asn。

16.根据权利要求15所述的突变蛋白，其由SED ID NO:39或SEQ IDNO:41或SEQ ID NO:43的序列编码。

17.根据权利要求10所述的突变蛋白，其中所述蛋白为纤连蛋白或其结构域。

18.根据权利要求17所述的突变蛋白，其中所述纤连蛋白结构域为额外结构域B。

19.根据权利要求17或18所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白相对成熟hNGAL氨基酸序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸替代，所述氨基酸替代选自Leu36→Lys或Glu或Arg或Ala；Ala40→His或Met或Thr或Ser；Ile41→Asp或Arg或Trp或Leu；Gln49→Arg或Ala或Tyr；Leu70→Leu或Arg或Met；Arg72→Val或Arg或Gln或Met；Lys73→His或Arg或Ser；Asp77→Asn或His或Lys或Arg；Trp79→Arg或Met或Leu；Asn96→Lys或Ala或Ser；Tyr100→Trp或Pro或Lys；Leu103→His或Pro；Tyr106→Phe或Trp或Thr；Lys125→Arg或His或Thr；Ser127→Tyr或Phe Ala；Tyr132→Leu或Phe；Lys134→Glu或His或Gly或Phe；以及Ser146→Asn。

20.根据权利要求19所述的突变蛋白，其由SED ID NO:20或SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26的序列编码。

21.根据权利要求6所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白相对成熟hNGAL氨基酸序列进一步包含选自Gln28→His和Cys87→Ser的氨基酸替代。

22.根据权利要求6所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白在对应于成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置137和145的序列位置中的任意处不包含突变的氨基酸残基。

23.根据权利要求6所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白相对成熟hNGAL氨基酸序列包含选自Tyr52→Gln或Val；Ser68→Lys或Asn；Arg81→Trp或Asn或His的氨基酸替代。

24.根据权利要求6所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与选自下述的化合物缀合：(1)有机分子，(2)金属或金属络合物，(3)酶标记、放射性标记、有色标记、生色标记、和发光标记，或(4)细胞抑制剂。

25.根据权利要求6所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与荧光标记缀合。

26.根据权利要求24所述的突变蛋白，其中所述有机分子为半抗原或毒素；或者其中所述金属为胶体金。

27.根据权利要求24所述的突变蛋白，其中所述有机分子为洋地黄毒苷或生物素。

28.根据权利要求6所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白在其N端和/或其C端融合至融合配偶体，所述融合配偶体为蛋白、蛋白结构域或肽。

29.根据权利要求6所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与延长所述突变蛋白的血清半衰期的化合物缀合。

30.根据权利要求29所述的突变蛋白，其中所述延长血清半衰期的化合物选自聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽以及白蛋白结合蛋白。

31.根据权利要求30所述的突变蛋白，其中所述聚亚烷基二醇为聚乙二醇(PEG)或其活化的衍生物。

32.根据权利要求28所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白的融合配偶体为延长所述突变蛋白的血清半衰期的蛋白结构域。

33.根据权利要求32所述的突变蛋白，其中所述蛋白结构域为免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽、或白蛋白结合蛋白。

34.根据权利要求33所述的突变蛋白，其中所述白蛋白结合蛋白为细菌白蛋白结合结构域或脂质运载蛋白突变蛋白。

35.根据权利要求34所述的突变蛋白，其中所述细菌白蛋白结合结构域为链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域。

36.根据权利要求33所述的突变蛋白，其中所述白蛋白结合肽具有式Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cys，其中Xaa₁是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa₂是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa₃是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；Xaa₄是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr。

37.根据权利要求6所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白以100nM或更低的KD结合所述给定非天然靶标。

38.根据权利要求37所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白以50nM或更低的KD结合所述给定非天然靶标。

39.根据权利要求37所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白以10nM或更低的KD结合所述给定非天然靶标。

40.根据权利要求37所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白以1nM或更低的KD结合所述给定非天然靶标。

41.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求6至40中任一项所述突变蛋白的核苷酸序列。

42.根据权利要求41所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至调节序列从而能够表达所述核酸分子。

43.根据权利要求41或42所述的核酸分子，其包含在载体中。

44.根据权利要求41或42所述的核酸分子，其包含在噬菌粒载体中。

45.一种宿主细胞，其含有根据权利要求41至44中任一项所述的核酸分子。

46.一种用于生产根据权利要求6至40中任一项所述的突变蛋白的方法，其中通过基因工程方法从编码所述突变蛋白的核酸开始生产所述突变蛋白或所述突变蛋白和另一多肽的融合蛋白。

47.根据权利要求46所述的方法，其中在细菌或真核宿主生物体中生产所述突变蛋白并且从此宿主生物体或其培养物中分离所述突变蛋白。

48.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求6至40中任一项所述的突变蛋白。

49.根据权利要求6至40中任一项所述的突变蛋白用于结合/检测给定靶标的用途，其包括：

(a)使所述突变蛋白与推测含有所述靶标的测试样品接触，以及

(b)通过合适的信号检测突变蛋白/靶标复合物。

50.根据权利要求6至40中任一项所述的突变蛋白用于使化合物以预先选择的部位为靶向的用途，其包括：

(a)使所述突变蛋白与所述化合物接触，以及

(b)将突变蛋白/化合物复合物递送至所述预先选择的部位。

51.根据权利要求6至40中任一项所述的突变蛋白用于与给定靶标形成复合物的用途。

52.如权利要求6至40中任一项限定的突变蛋白用于制备药物组合物的用途。

53.如权利要求13至16中任一项限定的突变蛋白用于制备药物组合物的用途，其中所述药物组合物用于治疗阿尔茨海默氏病。

54.如权利要求17至20中任一项限定的突变蛋白用于制备药物组合物的用途，其中所述药物组合物用于癌症的治疗、纤维化的治疗、或涉及新血管形成的疾病的治疗。

55.一种诊断或分析试剂盒，其包含如权利要求6至40中任一项限定的突变蛋白。