TW201636364A

TW201636364A - 對於螢光鐵載體及綠膿桿菌螯鐵蛋白具特異性之新穎蛋白

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Publication number: TW201636364A
Application number: TW105104396A
Authority: TW
Inventors: 卡斯汀科爾維; 海克史坦普; 約亨庫如普; 伯納德卡蘭德; 阿斯特麗德雷伊; 娜塔莉卡司特; 邁克爾穆若茲; 羅倫法蘭斯; 克莉絲汀羅特; 安德列阿拉斯德佛爾; 亞歷山大偉德曼; 馬里恩赫納; 布蘭得利倫德; 克利斯蒂安詹森; 馬丁赫勒邁爾
Original assignee: 賽諾菲公司
Priority date: 2015-02-18
Filing date: 2016-02-16
Publication date: 2016-10-16
Also published as: MA41072A1; HK1245293A1; US20180346532A1; CL2017002082A1; CO2017009433A2; US20180371037A1; US10065998B2; EA035824B1; AU2016221816B2; CR20170425A; DOP2017000191A; US9884898B2; US20180371038A1; PE20171652A1; UY36561A; JP2018506979A; ZA201705257B; PH12017501473A1; GT201700184A; BR112017017530A2

Abstract

本案提供了hNGAL突變蛋白，其結合綠膿桿菌螢光素家族成員或綠膿桿菌螯鐵蛋白，並且可以用於各種應用，包括藥物應用，例如以抑制或降低綠膿桿菌的生長。本案亦關於生成本文中描述的一種或多種結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的突變蛋白的方法及包含一種或多種此類突變蛋白的組合物。本揭示內容進一步涉及編碼此類突變蛋白的核酸分子和用於生成此類突變蛋白和核酸分子的方法。另外，本申請揭示了這些突變蛋白及包含一種或多種此類突變蛋白的組合物的治療和/或診斷用途。

Description

對於螢光鐵載體及綠膿桿菌螯鐵蛋白具特異性之新穎蛋白

綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)一種引起主要與組織損傷相關的急性感染的機會病原體。綠膿桿菌在留置裝置上以及在具有遺傳病症囊性纖維化的患者的肺組織上形成生物膜。生物膜感染難以用常規的抗生素療法治療。然而，研究已經證明瞭鐵是綠膿桿菌的正確生物膜形成必需的，因此鐵攝取系統是抗假單胞菌療法的潛在標靶。

綠膿桿菌能夠通過使用分泌性鐵結合鐵載體(siderophore)綠膿桿菌螯鐵蛋白(pyochelin)和綠膿桿菌螢光素(pyoverdine)從宿主環境中清除鐵。綠膿桿菌螢光素(Pvd)是一種肽連接的氧肟酸鹽-和兒茶酚鹽-型(catecholate-type)配體，而綠膿桿菌螯鐵蛋白(Pch)是水楊酸鹽和兩個半胱胺酸分子的且具有酚、羧酸鹽和胺配體官能度的衍生化綴合物。Pvd和Pch兩者都已經證明瞭以協同作用的某種指示在綠膿桿菌毒力中的作用。不能生成任一種鐵載體的雙重缺陷突變體比僅不能生成兩種鐵載體之一的單一缺陷突變體在毒力上減弱得多(Takase等，Infection and immunity,Apr.2000,p.1834-1839)。此外，綠膿桿菌螢光素作用為信號傳導分子以控制幾種毒力因數及綠膿桿菌螢光素自身的生成；同時已經提出了除三價鐵外，綠膿桿菌螯鐵蛋白可為用於獲得二價金屬，如二價鐵和鋅以實現綠膿桿菌的致病性的系統的一部分(Visca等，1992)。

已經從幾種綠膿桿菌菌株中鑒定出三種結構上不同的綠膿桿菌螢光素類型或組：從綠膿桿菌ATCC 15692(Briskot等，1989,Liebigs Ann Chem,p.375-384)，從綠膿桿菌ATCC 27853(Tappe等，1993,J.Prakt-Chem.,335,p.83-87)以及從天然隔離群(natural isolate)綠膿桿菌R(Gipp等，1991,Z.Naturforsch,46c,p.534-541)。此外，對88株臨床隔離群和上文提及的兩種保藏中心菌株的比較生物學調查根據下述參照菌株揭示了三種不同的菌株特異性綠膿桿菌螢光素介導的鐵攝取系統(Cornells等，1989,Infect Immun.,57,p.3491-3497；Meyer等，1997,Microbiology,143,p.35-43)：綠膿桿菌ATCC 15692(I型Pvd或Pvd I)、綠膿桿菌ATCC 27853(II型Pvd或Pvd II)和臨床隔離群綠膿桿菌R和pa6(III型Pvd或Pvd III)。

每種綠膿桿菌螢光素類型具有作為琥珀醯基、琥珀酸醯胺基(succinamid)或a-酮戊二醯基的側鏈上有所不同的三種成員(亞型)，即Pvd I型琥珀醯基、Pvd I型琥珀酸醯胺基、Pvd I型α-酮戊二醯基、Pvd II型琥珀醯基、Pvd II型琥珀酸醯胺基、Pvd II型α-酮戊二醯基、Pvd III型琥珀醯基、Pvd III型琥珀酸醯胺基和Pvd III型α-酮戊二醯基。

每種綠膿桿菌菌株表達一種Pvd類型，即綠膿桿菌ATCC 15692表達I型Pvd，綠膿桿菌ATCC 27853表達II型Pvd，而綠膿桿菌R和pa6表達III型Pvd，從而每種Pvd類型包括相應類型的所有三種成員，並且每種所述菌株還表達綠膿桿菌螯鐵蛋白。

在這方面，本發明將綠膿桿菌螢光素和綠膿桿菌螯鐵蛋白鑒定為對於綠膿桿菌的致病性至關重要的靶物，並且在不產生由常規抗生素造成的強選擇壓力的情況下開發出針對如本文中揭示的此類靶物，即針對每種Pvd類型，包括對於每種類型而言在側鏈上不同的三種成員(亞型)(Pvd I s，Pvd I sa，Pvd I αKG，Pvd II s，Pvd II sa，Pvd II αKG，Pvd III s，Pvd III sa，Pvd III αKG)以及針對Pch，並且在每種情況下針對游離的鐵載體及針對具有結合鐵的鐵載體的特異性抑制劑。此外，本發明選擇區別游離的和加載有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白的抑制劑。

作為代表Pieris AG，Sanofi-Aventis和Sanofi-Pasteur Inc.(它們是現有聯合研究協議的各方)承擔的活動的結果做出本發明，並且在聯合研究協議的範圍內做出。

定義

以下列表定義了貫穿本說明書使用的術語、短語和縮寫。本文中列出並定義的所有術語意圖涵蓋所有語法形式。

如本文中使用的，「綠膿桿菌螢光素」意指在鐵缺乏性生長條件下由革蘭氏陰性細菌綠膿桿菌生成並且對鐵具有高親和力的螢光鐵載體。綠膿桿菌螢光素由三個結構部分構成：二羥基喹啉生色團、側鏈和可變肽鏈。肽鏈模塊參與受體識別和結合。已經鑒定出三種不同Pvd(在它們的肽鏈上不同)(I-III型)。綠膿桿菌螢光素類型的大小和胺基酸組成及綠膿桿菌螢光素識別特異性對於每種物種是獨特的。可以區別三種綠膿桿菌菌株，每種生成不同綠膿桿菌螢光素類型(I-III型，圖1)和相關的(cognate)FpvA受體。

如本文中使用的，「綠膿桿菌螯鐵蛋白」意指由綠膿桿菌生成並且溶解三價鐵的水楊酸鹽和兩個半胱胺酸分子的且具有酚、羧酸鹽和胺配體官能度的噻唑啉衍生化綴合物。綠膿桿菌螯鐵蛋白是一種擁有酚鹽，而既無氧肟酸鹽也無兒茶酚鹽模塊的結構上獨特的鐵載體(參見圖1)。

如本文中使用的，「可檢出的親和力」意指以一般至少約10^-5M以下的親和常數結合選擇的靶物的能力。更低的親和力一般用常見的方法，如ELISA不再能測量到，因此是次等重要的。

如本文中使用的，可通過本領域技術人員已知的多種方法測量揭示內容的蛋白質(例如人脂籠蛋白(lipocalin)2的突變蛋白)或其融合多肽對選擇的靶物(在本案的情況中為綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白)的「結合親和力」(從而確定突變蛋白-配體複合物的KD值)。此類方法包括但不限於螢光滴定、直接ELISA、競爭ELISA、量熱方法，如等溫滴定量熱學(ITC)和表面等離振子共振(surface Plasmon resonance)(BIAcore)。此類方法是本領域中完善建立的，並且其例子也在下文詳述。

還注意到相應的結合劑和其配體之間的複合物形成受到許多不同因素影響，如相應結合配偶體的濃度、競爭劑的存在、使用的緩衝液系統的pH和離子強度、和用於測定解離常數K_D的實驗方法(例如螢光滴定、直接ELISA、競爭ELISA或表面等離振子共振，僅舉幾例)或者甚至用於評估實驗數據的數學演算法。

因此，技術人員還清楚的是，K_D值(相應結合劑和其靶物/配體之間形成的複合物的解離常數)可以在某個實驗範圍內變化，這取決於用於測定特定突變蛋白對給定配體的親和力的方法和實驗設置。這意味著可以有測量的K_D值的略微偏差或公差範圍，這取決於例如通過表面等離振子共振(Biacore)，通過競爭ELISA，還是通過「直接ELISA」測定K_D值。

如本文中使用的，「突變蛋白」、「突變的」實體(不管是蛋白質還是核酸)或「突變體」指與天然存在(野生型)核酸或蛋白質「參照」支架相比一個或多個核苷酸或胺基酸的交換、缺失或插入。所述術語還包括如本文中描述的突變蛋白和變體的片段。優選地，本揭示內容的突變蛋白、其片段或變體保留結合如本文中描述的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的功能。

如本文中與揭示內容的突變蛋白相聯使用的術語「片段」涉及N端和/或C端縮短，即缺乏至少一個N端和/或C端胺基酸的源自全長成熟人脂籠蛋白2的蛋白質或肽。此類片段可包括成熟人脂籠蛋白2的一級序列的至少10，更多，如20或30或更多個連續胺基酸，並且在成熟人脂籠蛋白2的免疫測定法中通常可檢出。一般地，如本文中就揭示內容的突變蛋白或根據揭示內容的組合或本文中描述的融合蛋白的相應蛋白質配體而言使用的，術語「片段」涉及N端和/或C端縮短的蛋白質或肽配體，其保留全長配體被根據揭示內容的突變蛋白識別和/或結合的能力。

如本文中使用的，術語「誘變」意指實驗條件選擇為使得成熟人脂籠蛋白2的給定序列位置處天然存在的胺基酸可以由至少一種不存在于相應天然多肽序列中的此特定位置處的胺基酸替換。術語「誘變」還包括通過缺失或插入一個或多個胺基酸的序列區段長度的(額外)修飾。因此，在揭示內容的範圍內的是例如選定序列位置處的一個胺基酸由三個隨機突變的區段替換，導致與野生型蛋白質的相應區段的長度相比兩個胺基酸殘基的插入。可以在能進行揭示內容中的誘變的任何肽區段中彼此獨立引入此類插入或缺失。

術語「隨機誘變」意指某個序列位置處不存在預先確定的單個胺基酸(突變)，而是可以在誘變期間在預先確定的序列位置處以某種概率併入至少兩個胺基酸。

「同一性」是序列的特性，其測量它們的相似性或關係。如本揭示內容中使用的，術語「序列同一性」或「同一性」意指成對相同殘基(揭示內容的多肽的序列與所討論的序列的(同源)比對後)相對於這兩個序列中的較長者中的殘基數目的百分比。通過用相同胺基酸殘基的數目除以殘基的總數，並且將結果乘以100測量序列同一性。

術語「同源性」在本文中以其通常的意義使用，包括相同胺基酸及在揭示內容的多肽(例如揭示內容的任何突變蛋白)的線性胺基酸序列中的等同位置處視為保守取代(例如用天冬胺酸殘基替換谷胺酸殘基)的胺基酸。

在本文中可以例如使用程式BLASTP，版本blastp 2.2.5(2002年11月16日；參見Altschul,S.F.等，(1997)Nucl.Acids Res.25,3389-3402)測定序列同源性或序列同一性的百分比。在此實施方案中，同源性百分比基於整個多肽序列(包括前肽序列)的比對(矩陣：BLOSUM 62；缺口代價：11.1；截留值設置為10^-3)，優選在成對比較中使用野生型蛋白質支架作為參照。它以作為BLASTP程式輸出中的結果指示的「陽性」(同源胺基酸)數目除以由比對程式選擇的胺基酸總數的百分比計算。

具體地，為了確定與野生型人脂籠蛋白2不同的突變蛋白的胺基酸序列的胺基酸殘基是否對應於野生型人脂籠蛋白2的胺基酸序列中的某個位置，熟練技術人員可以手動或通過使用計算機程式如BLAST2.0(其代表基本局部比對搜索工具)或ClustalW或適合於產生序列比對的任何其它合適的程式使用本領域中公知的手段和方法，例如比對。因而，野生型人脂籠蛋白2可以充當「主題序列」或「參照序列」，而與本文中描述的野生型人脂籠蛋白2不同的突變蛋白的胺基酸序列充當「查詢序列」。術語「參照序列」和「野生型序列」在本文中可互換使用。

「缺口」是作為胺基酸添加或缺失的結果的比對中的空格。因此，完全相同的序列的兩個拷貝具有100%同一性，但是不太高度保守，並且具有缺失、添加或替換的序列可具有較低程度的序列同一性。本領域技術人員會認可幾種計算機程式可用於使用標準參數測定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402)，Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215,403-410)和Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147,195-197)。

如本揭示內容中使用的，術語「變體」涉及包含胺基酸序列的修飾(例如通過取代、缺失、插入或化學修飾)的蛋白質或肽的衍生物。在一些實施方案中，此類修飾不降低蛋白質或肽的功能性。此類變體包括蛋白質，其中一個或多個胺基酸已經被其相應的D-立體異構體或被除了天然存在的20種胺基酸外的胺基酸，如例如鳥胺酸、羥脯胺酸、爪胺酸、高絲胺酸、羥賴胺酸、正纈胺酸替換。然而，此類取代也可以是保守的，即胺基酸殘基用化學上類似的胺基酸殘基替換。保守取代的例子是下組的成員間的替換：1)丙胺酸、絲胺酸和蘇胺酸；2)天冬胺酸和谷胺酸；3)天冬醯胺和穀胺醯胺；4)精胺酸和賴胺酸；5)異亮胺酸、亮胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸；和6)苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸。

「天然序列」人脂籠蛋白2意指具有與源自自然的相應多肽相同胺基酸序列的人脂籠蛋白2。因此，天然序列人脂籠蛋白2可以具有相應的天然存在的人脂籠蛋白2的胺基酸序列。此類天然序列多肽可以從自然界中分離或者可以通過重組或合成手段生成。術語「天然序列」多肽具體涵蓋人脂籠蛋白2的天然存在的截短或分泌形式，人脂籠蛋白2的天然存在的變體形式，如可替換的剪接形式和天然存在的等位變體。多肽「變體」意指與天然序列多肽具有至少約50%、60%、70%、80%或至少約85%胺基酸序列同一性的生物學活性多肽。此類變體包括例如下述多肽，其中在多肽的N或C端添加或缺失一個或多個胺基酸殘基。一般地，變體與天然序列多肽具有至少約70%，包括至少約80%，如至少約85%胺基酸序列同一性，包括至少約90%胺基酸序列同一性或至少約95%胺基酸序列同一性。

術語「位置」在根據揭示內容使用時意指本文中描述的胺基酸序列內的胺基酸的位置或本文中描述的核酸序列內的核苷酸的位置。為了理解如本文中在一種或多種突變蛋白的胺基酸序列位置的語境中使用的術語「對應」或「對應的」，對應的位置不僅由前述核苷酸/胺基酸的編號確定。因而，可以取代的根據揭示內容的給定胺基酸的位置可由於(突變體或野生型)人脂籠蛋白2中別處的胺基酸缺失或添加而變化。類似地，可以取代的根據揭示內容的給定核苷酸的位置可由於突變蛋白或野生型人脂籠蛋白2 5’-非翻譯區(UTR)中別處的缺失或額外的核苷酸而變化，所述5’-非翻譯區(UTR)包括啟動子和/或任何其它調節序列或基因(包括外顯子和內含子)。

因此，對於根據揭示內容的相應位置，優選地理解核苷酸/胺基酸的位置可以在指定的編號上不同於類似的相鄰核苷酸/胺基酸，但是一個或多個相應的位置也包括所述相鄰的核苷酸/胺基酸(其可以被交換，缺失或添加)。

另外，對於基於根據揭示內容的參照支架的突變蛋白中的相應位置，優選地理解核苷酸/胺基酸的位置在結構上對應於突變蛋白或野生型人脂籠蛋白2中別處的位置，即使它們可以在指定的編號上不同。

如本文中對非天然靶物使用的術語「有機分子」或「小有機分子」意指包含至少兩個碳原子，但是優選不超過7或12個可旋轉碳鍵，具有範圍為100-2000道爾頓，優選100-1000道爾頓的分子量，且任選包含一個或兩個金屬原子的有機分子。

如本文中使用的，詞語「檢測」或「可檢測的」在定量和定性水準兩者及其組合上理解。因此，它包括感興趣分子的定量、半定量和定性測量。

「受試者」是脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人。術語「哺乳動物」在本文中用於指分類為哺乳動物的任何動物，包括但不限於人、家畜和農場動物(farm animal)、和動物園、運動或寵物動物，如綿羊、犬、馬、貓、牛、大鼠、豬、猿，如獼猴等，僅舉幾個說明性例子。優選地，本文中的哺乳動物是人。

「有效量」指足以實現有益或期望結果的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。

「樣品」定義為從任何受試者中採集的生物樣品。生物樣品包括但不限於血液、血清、尿液、糞便、精液或組織。

發明之詳細說明

本揭示內容提供了對綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合特異性的多肽，其中多肽包含以可檢出的親和力結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白。

如本文中使用的，術語「人脂籠蛋白2」或「人Lcn 2」或「人NGAL」或「hNGAL」指具有SWISS-PROT/UniProt數據庫登錄號P80188的成熟人嗜中性粒細胞明膠酶相關的脂籠蛋白(NGAL)。揭示內容的人脂籠蛋白2突變蛋白在本文中也可以稱為「hNGAL突變蛋白」。SWISS-PROT/UniProt數據庫登錄號P80188中顯示的胺基酸序列可用作優選的「參照序列」，更優選地，將SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列用作參照序列。

在一些實施方案中，以可檢出的親和力結合綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白可包含天然半胱胺酸殘基被另一種胺基酸(例如絲胺酸殘基)的至少一個胺基酸取代。在一些其它實施方案中，以可檢出的親和力結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的突變蛋白可包含取代野生型hNGAL的一個或多個胺基酸的一個或多個非天然半胱胺酸殘基。在又一個具體的實施方案中，根據揭示內容的hNGAL突變蛋白包含天然胺基酸被半胱胺酸殘基的至少兩個胺基酸取代，由此形成一個或多個半胱胺酸橋。在一些實施方案中，所述半胱胺酸橋可連接至少兩個環區。這些區的定義在本文中根據Flower(Flower,1996，見上文，Flower等，2000，見上文)和Breustedt等(2005，見上文)使用。

在一些實施方案中，揭示內容的hNGAL突變蛋白不結合腸菌素。

在一個方面，本揭示內容包括至少以可檢出的親和力結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的各種hNGAL突變蛋白。在此意義上，綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白視為參照野生型hNGAL的非天然配體，其中「非天然配體」指在生理學條件下不結合野生型人脂籠蛋白2的化合物。通過在某些序列位置處用一處或多處突變工程化改造野生型hNGAL，本發明人已證明對非天然配體綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的高親和力和高特異性是可能的。在一些實施方案中，在編碼野生型I人脂籠蛋白2上的某些序列位置的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多個核苷酸三聯體處，可經由這些位置處被核苷酸三聯體的子集取代進行隨機誘變。

此外，揭示內容的突變蛋白可在與hNGAL的線性多肽序列的某些序列位置(如人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145)對應的任何一個或多個，包括至少在任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個序列位置處具有突變的胺基酸殘基。

揭示內容的突變蛋白可包含突變的胺基酸序列位置外部的「親本」蛋白支架(如hNGAL)的野生型(天然)胺基酸序列。在一些實施方案中，根據揭示內容的hNGAL突變蛋白還可攜帶一個或多個序列位置處的一個或多個胺基酸突變，只要此類突變至少實質上不阻礙或不干擾突變蛋白的結合活性和折疊。可使用建立的標準方法(Sambrook,J.等(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)在DNA水準上非常容易地完成此類突變。胺基酸序列的改變的說明性例子是插入或缺失以及胺基酸取代。此類取代可為保守的，即胺基酸殘基用化學相似特性(特別就極性以及大小而言)的胺基酸殘基替換。保守取代的例子是下組的成員間的替換：1)丙胺酸、絲胺酸和蘇胺酸；2)天冬胺酸和谷胺酸；3)天冬醯胺和穀胺醯胺；4)精胺酸和賴胺酸；5)異亮胺酸、亮胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸；和6)苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸。另一方面，也可在胺基酸序列中引入非保守的改變。另外，代替替換單一胺基酸殘基，也可插入或缺失人脂籠蛋白2的一級結構的一個或多個連續胺基酸，只要這些缺失或插入導致穩定的折疊/功能性突變蛋白(例如具有截短的N和C端的hNGAL突變蛋白)。在此類突變蛋白中，例如，在多肽的N或C端添加或缺失一個或多個胺基酸殘基。一般地，此類突變蛋白與成熟hNGAL的胺基酸序列可具有約至少70%，包括至少約80%，如至少約85%胺基酸序列同一性。作為一個說明性例子，本揭示內容還涵蓋如上文定義的hNGAL突變蛋白，其中已經缺失了成熟hNGAL的線性多肽序列的4個胺基酸殘基(G-N-I-K；第95-98位；SEQ ID NO：130)(例如SEQ ID NO：46)。

在與其它脂籠蛋白比較序列同一性時，本文中揭示的hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與成熟hNGAL(SEQ ID NO：1)具有高序列同一性。在此一般語境中，揭示內容的突變蛋白的胺基酸序列與天然的野生型hNGAL的胺基酸序列是至少基本上相似的，條件是比對中可能有缺口(如下文定義)，其是胺基酸添加或缺失的結果。在一些實施方案中，與成熟hNGAL的序列基本上相似的揭示內容的突變蛋白的相應序列與成熟hNGAL的序列具有至少70%同一性或序列同源性、至少75%同一性或序列同源性、至少80%同一性或序列同源性、至少82%同一性或序列同源性、至少85%同一性或序列同源性、至少87%同一性或序列同源性、或至少90%同一性或序列同源性，包括至少95%同一性或序列同源性，條件是改變的位置或序列得到保留，並且一個或多個缺口是可能的。

如本文中使用的，若揭示內容的突變蛋白能夠區分靶物和一種或多種參照靶物，則它「特異性結合」靶物(例如綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白)，因為結合特異性不是絕對的，而是相對的性質。可例如根據Western印跡、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-測試、FACS、IHC和肽掃描測定「特異性結合」。

在一個實施方案中，揭示內容的突變蛋白在其N端和/或其C端與融合配偶體融合，所述融合配偶體是延長突變蛋白的血清半衰期的蛋白質域。在其它具體的實施方案中，蛋白質域是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白結合肽、或清蛋白結合蛋白。

在另一個實施方案中，將揭示內容的突變蛋白與延長突變蛋白的血清半衰期的化合物綴合。更優選地，將突變蛋白與選自下組的化合物綴合：聚亞烷基二醇分子、羥乙基澱粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白結合肽、或清蛋白結合蛋白。

在又一個實施方案中，本揭示內容涉及核酸分子，其包含編碼本文中揭示的突變蛋白的核苷酸序列。揭示內容涵蓋含有所述核酸分子的宿主細胞。

對綠膿桿菌螢光素特異性的突變蛋白。

迄今為止，綠膿桿菌隔離群的研究幫助將綠膿桿菌螢光素分類成三種不同類型(Meyer等，Use of Siderophores to Type Pseudomonads：The Three Pseudomonas Aeruginosa Pyoverdine Systems,Microbiology,1997；vol.143 no.1 35-43)。大致42%的綠膿桿菌隔離群具有與Pvd I型相同的綠膿桿菌螢光素系統，42%的綠膿桿菌隔離群行為像Pvd II型，而16%的綠膿桿菌隔離群屬Pvd III型(Cornelis等，1989a；表4)。每種類型具有作為琥珀醯基、琥珀酸醯胺基或a-酮戊二醯基的側鏈中不同的三種成員(亞型)，即Pvd I型琥珀醯基、Pvd I型琥珀酸醯胺基、Pvd I型a-酮戊二醯基、Pvd II型琥珀醯基、Pvd II型琥珀酸醯胺基、Pvd II型a-酮戊二醯基、Pvd III型琥珀醯基、Pvd III型琥珀酸醯胺基和Pvd III型a-酮戊二醯基。

為了處理生成不同類型的綠膿桿菌螢光素的綠膿桿菌，本揭示內容提供了針對不同類型的綠膿桿菌螢光素的hNGAL突變蛋白。揭示內容還提供可用於此類突變蛋白的應用、生成本文中揭示的結合綠膿桿菌螢光素的hNGAL突變蛋白的方法及包含此類突變蛋白的組合物。揭示內容的結合綠膿桿菌螢光素的hNGAL突變蛋白及其組合物可在檢測樣品中的綠膿桿菌螢光素的方法中或者在結合受試者中的綠膿桿菌螢光素的方法中使用。先前尚未描述伴隨由本揭示內容提供的用途的具有這些特徵的此類hNGAL突變蛋白。

綠膿桿菌螢光素不結合天然野生型hNGAL，而hNGAL的天然配體腸菌素以高親和力對接於(dock into)hNGAL的萼體(calyx)中。因此，綠膿桿菌螢光素是毒力因數和隱性鐵載體，其避免hNGAL識別，從而允許綠膿桿菌建立感染(Peek等，Pyoverdine,the Major Siderophore in Pseudomonas aeruginosa,Evades NGAL Recognition,Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases,2012)。

因而，本揭示內容的目的是提供源自人嗜中性粒細胞明膠酶相關的脂籠蛋白(NGAL)(又稱為人脂籠蛋白2)的突變蛋白，該突變蛋白與天然的野生型hNGAL相比對綠膿桿菌螢光素具有高特異性。

對綠膿桿菌螢光素特異性的例示性突變蛋白。

在一個方面，本揭示內容涉及對一類綠膿桿菌螢光素(如Pvd I型、Pvd II型或Pvd III型)特異性的新的特異性結合人脂籠蛋白2(人Lcn2或hNGAL)突變蛋白。

本揭示內容的一個實施方案涉及突變蛋白，其能夠以可檢出的親和力結合一類綠膿桿菌螢光素，如通過約200nM以下，如約150nM以下的K_D測量的親和力。

在一個方面，本揭示內容提供了hNGAL突變蛋白，其能夠以約20nM以下，如15nM以下的K_D結合與鐵複合的Pvd I型，例如在基本上在實施例6中描述的測定法中通過Biacore T200儀測量時。

在一些另外的實施方案中，本揭示內容的一種或多種hNGAL突變蛋白能夠以通過約200nM以下的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合的鐵的Pvd I型琥珀醯基、Pvd I型琥珀酸醯胺基和Pvd I型a-酮戊二醯基，例如在基本上在實施例5中描述的ELISA測定法中測量時。

在一些實施方案中，在基本上在實施例7中描述的競爭ELISA形式中，突變蛋白能夠以約150nM以下的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素I型琥珀醯基介導的鐵攝取。

在一些實施方案中，在基本上在實施例8中描述的測定法中，突變蛋白能夠抑制Pvd I菌株的細菌生長。

在這點上，揭示內容涉及多肽，其中所述多肽包括hNGAL突變蛋白，並且所述hNGAL與成熟hNGAL的線性多肽序列相比在序列位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或甚至更多個突變胺基酸殘基，且其中所述多肽結合Pvd I型，包括Pvd I型琥珀醯基、Pvd I型琥珀酸醯胺基和Pvd I型a-酮戊二醯基。

在一些實施方案中，揭示內容的結合Pvd I型的hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一個或多個包含下列突變的胺基酸殘基中的一個或多個：Leu 36→Asn、Thr、Val、Trp或Phe；Ala 40→Gly、Asn、Thr或Phe；Ile 41→Arg、Ala、 Thr、Phe或Trp；Gln 49→Ile、Leu、Vla、Ala或Pro；Tyr 52→Met、Trp或Pro；Ser 68→Asp、Vla或Glu；Leu 70→Gln、Trp、Asp或Thr；Arg 72→Trp、Ala、Ser、Leu、Pro或Glu；Lys 73→Asp、Leu、Ala、Glu或Asn；Asp 77→Arg、Leu、Tyr、Ser、Gln、Thr、Ile或Asn；Trp 79→Gln、Asp、Ser、Arg、Met或Glu；Arg 81→Gln、Gly、Ile、Glu、His或Asp；Asn 96→His、Ile、Gly、Tyr或Asp；Tyr 100→Lys、Glu、Asn、Ser、Phe或Tyr；Leu 103→Lys、Pro、Gln、His、Asp、Tyr、Glu、Trp或Asn；Tyr 106→His、Gln或Phe；Lys 125→Arg、Ser、Trp、Tyr、Val或Gly；Ser 127→Trp、Asn、Ala、Thr、Tyr、His、Ile、Val或Asp；Tyr 132→Trp、Asn、Gly或Lys；和Lys 134→Asn、His、Trp、Gly、Gln或Asp。在一些實施方案中，揭示內容的hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的這些序列位置處包含兩個或更多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多或所有突變的胺基酸殘基。

另外，與成熟hNGAL的線性多肽序列相比，根據揭示內容的結合Pvd I型的hNGAL突變蛋白也可以包含下述取代：Gln 28→His；Lys 46→Glu；Thr 54→Vla或Ala；Ile 55→Vla；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp或Gln；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser或Asn；和Thr 136→Ala。

在一些別的實施方案中，揭示內容的hNGAL突變蛋白(其結合Pvd I型)與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下述胺基酸替換：Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Gln；Arg 72→Trp；Lys 73→Asp；Asp 77→Leu；Trp 79→Gln；Arg 81→Gln；Cys 87→Ser；Asn 96→His；Tyr 100→Lys；Leu 103→His；Tyr 106→His；Lys 125→Arg；Ser 127→Trp；Tyr 132→Trp；Lys 134→Asp；Gln 28→His；Leu 36→Thr；Ala 40→Gly；Ile 41→Phe；Gln 49→Leu；Tyr 52→Trp；Leu 70→Trp；Arg 72→Ala；Lys 73→Leu；Asp 77→ Tyr；Trp 79→Asp；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Glu；Leu 103→His；Tyr 106→Gln；Lys 125→Trp；Ser 127→Asn；Tyr 132→Asn；Lys 134→Gln；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Lys；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ala；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Asn；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Met；Ser 68→Asp；Leu 70→Thr；Arg 72→Glu；Lys 73→Ala；Asp 77→Arg；Trp 79→Arg；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Tyr 100→Lys；Leu 103→Pro；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ser；Ser 127→Thr；Tyr 132→Trp；Lys 134→Gly；Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Phe；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Phe；Ile 41→Phe；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Trp；Arg 72→Leu；Lys 73→Asn；Asp 77→Gln；Trp 79→Glu；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Leu 103→Tyr；Tyr 106→His；Lys 125→Val；Ser 127→His；Tyr 132→Lys；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu； Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Asp；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Val；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Thr；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Asn；Leu 103→Glu；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Asp；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Val；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Asn；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Vla；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser； Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Vla；Lys 59→Arg；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；Leu 36→Trp；Asn 39→Asp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Ala；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Vla；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu； Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；or Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Vla；Lys 59→Arg；Asn 65→Gln；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His。

在殘留區(即與序列位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136不同的區域)中，揭示內容的hNGAL突變蛋白可包含突變的胺基酸序列位置外部的野生型(天然)胺基酸序列。

在另外的具體的實施方案中，根據本揭示內容的突變蛋白包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：2-18或其片段或變體。

揭示內容的結合Pvd I的hNGAL突變蛋白的胺基酸序列可以與選自SEQ ID NO：2-18的序列具有高序列同一性，如至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性。

揭示內容還包括具有選自SEQ ID NO：2-18的胺基酸序列的hNGAL突變蛋白的結構同源物，該結構同源物相對於所述hNGAL突變蛋白具有超過約60%，優選超過65%，超過70%，超過75%，超過80%，超過85%，超過90%，超過92%，且最優選超過95%的胺基酸序列同源性或序列同一性。

可通過誘變人脂籠蛋白2的天然存在形式獲得根據本揭示內容的結合Pvd I型的hNGAL突變蛋白。在誘變的一些實施方案中，取代(或替換)是保守取代。雖然如此，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下文的例示性取代的一種或多種)，只要突變蛋白保留其結合Pvd I型的能力，和/或由於它與成熟人脂籠蛋白2的胺基酸序列(SWISS-PROT數據庫登錄號P80188)是至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高的同一性，它與然後取代的序列具有同一性。

在另一個方面中，本揭示內容提供了hNGAL突變蛋白，其以約20nM以下，如5nM以下的K_D結合與鐵複合的Pvd II型，例如在通過基本上在實施例6中描述的測定法中的Biacore T200儀測量時。

在又一些另外的實施方案中，本揭示內容的一種或多種hNGAL突變蛋白能夠以通過約200nM以下的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合的鐵的Pvd II型琥珀醯基、Pvd II型琥珀酸醯胺基和Pvd II型a-酮戊二醯基，例如在基本上在實施例5中描述的ELISA測定法中測量時。

在一些實施方案中，突變蛋白能夠在基本上在實施例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM以下的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素II型琥珀醯基介導的鐵攝取。

在一些實施方案中，突變蛋白能夠在基本上在實施例8中描述的測定法中抑制Pvd II菌株的細菌生長。

在一些其它實施方案中，突變蛋白能夠在基本上在實施例10中描述的測定法中抑制或降低表達綠膿桿菌螢光素II型的綠膿桿菌菌株的生長。

在這點上，揭示內容涉及多肽，其中所述多肽包含hNGAL突變蛋白，並且所述hNGAL與成熟hNGAL的線性多肽序列相比在序列位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多個突變的胺基酸殘基，且其中所述多肽結合Pvd II型。

在一些實施方案中，揭示內容的結合Pvd II型的hNGAL突變蛋白在成熟 hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134的任何一個或多個包含下列突變的胺基酸殘基中的一個或多個：Leu 36→Asn、Ile或Val；Ala 40→Glu、Gly、Asn、Thr或His；Ile 41→Arg、Val或Thr；Gln 49→Gly、Ala或Pro；Tyr 52→Asn、Gly、Trp或Pro；Ser 68→Asp、Arg或Glu；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His、Ile、Ala、Ser或Gly；Lys 73→Asn、Met、Pro、Phe、Gln或Arg；Asp 77→His、Ile、Met、Lys、Gly或Asn；Trp 79→Ser、Tyr、Ala、Asp、Phe或Trp；Arg 81→Glu、Ser、Tyr或Asp；Asn 96→Met、Ile、Arg、Asp、Lys、Asn或Ala；Tyr 100→Lys、Glu、Asn、Ser、Phe或Tyr；Leu 103→Thr、Ile、Gln、Gly、Met、His、Trp或Val；Tyr 106→Met、Gln、Ala、Ile、Asn、Gly、Met或Phe；Lys 125→Ala、Ile或Asn；Ser 127→Lys、Arg、Ser、Met、Asp或Asn；Tyr 132→Met、Phe、Asn、Ala、Ile、Gly或Val；和Lys 134→Trp或Tyr。在一些實施方案中，揭示內容的hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的這些序列位置處包含2或更多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多個或所有突變的胺基酸殘基。

此外，根據揭示內容的結合Pvd II型的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比還可以包含下述取代：Gln 28→His；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp或Gln和Cys87→Ser。

在一些額外的實施方案中，揭示內容的hNGAL突變蛋白(其結合Pvd II型)與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下述胺基酸替換：Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→ Trp；Gln 28→His；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Met；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Met；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Ile；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Pro；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gly；Tyr 106→Ala；Lys 125→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Ala 40→Asn；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ser；Lys 73→Gln；Asp 77→Met；Trp 79→Ala；Arg 81→Tyr；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Pro；Leu 103→Thr；Tyr 106→Ile；Lys 125→Lys；Ser 127→Met；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Ala 40→His；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Asp；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Asp；Leu 103→Met；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ala；Ser 127→Asp；Tyr 132→Asn；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Ser 68→Arg；Leu 70→Trp；Arg 72→Asn；Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Thr；Leu 103→Trp；Tyr 106→Asn；Lys 125→Asn； Ser 127→Met；Tyr 132→Ile；Lys 134→Tyr；Gln 28→His；Leu 36→Vla；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gly；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→Gly；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Trp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Gly；Lys 125→Lys；Ser 127→Asn；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→His；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Ala；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Gly；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp； Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Phe；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Met；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Gln；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp； Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；或Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp。

在殘留區(即與序列位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134不同的區域)中，揭示內容的hNGAL突變蛋白可以包含在突變的胺基酸序列位置外的野生型(天然)胺基酸序列。

在其它具體的實施方案中，根據本揭示內容的突變蛋白包含選自SEQ ID NO：19-37的胺基酸序列或其片段或變體。

揭示內容的結合Pvd II型的hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與選自SEQ ID NO：19-37的序列可具有高序列同一性，如至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性。

揭示內容還包括具有選自SEQ ID NO：19-37的胺基酸序列的hNGAL突變蛋白的結構同源物，該結構同源物相對於所述hNGAL突變蛋白具有超過約60%，優選超過65%，超過70%，超過75%，超過80%，超過85%，超過90%，超過92%且最優選超過95%的胺基酸序列同源性或序列同一性。

可通過誘變人脂籠蛋白2的天然存在形式獲得根據本揭示內容的結合Pvd II型的hNGAL突變蛋白。在誘變的一些實施方案中，取代(或替換)是保守取代。雖然如此，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下文的例示性取代的一個或多個)，只要突變蛋白保留其結合Pvd I型的能力，和/或由於它與成熟人脂籠蛋白2的胺基酸序列(SWISS-PROT數據庫登錄號P80188)是至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高的同一性，它與然後取代的序列具有同一性。

在另一個方面中，本揭示內容提供了hNGAL突變蛋白，其以約20nM以下，如10nM以下的K_D結合與鐵複合的Pvd III型，例如在基本上在實施例6中描述的測定法中通過Biacore T200儀測量時。

在又一些實施方案中，本揭示內容的一種或多種hNGAL突變蛋白能夠以通過約200nM以下的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合的鐵的Pvd III型琥珀醯基、Pvd III型琥珀酸醯胺基和Pvd III型a-酮戊二醯基，例如在基本上在實施例5中描述的ELISA測定法中測量時。

在一些實施方案中，突變蛋白能夠在基本上在實施例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM以下的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素III型介導的鐵攝取。

在一些實施方案中，突變蛋白能夠在基本上在實施例8中描述的測定法中抑制Pvd III菌株的細菌生長。

在這點上，揭示內容涉及多肽，其中所述多肽包含hNGAL突變蛋白，並且所述hNGAL與成熟hNGAL的線性多肽序列相比在序列位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、 103、105-106、125、127、132、134和145處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或甚至更多個突變的胺基酸殘基，且其中所述多肽結合Pvd III型。

在一些實施方案中，揭示內容的結合Pvd III型的hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一個或多個包括下列突變的胺基酸殘基中的一個或多個：Leu 36→Phe或Glu；Ala 40→Trp、Leu或Arg；Ile 41→Met、Arg、Ala、Leu或Trp；Gln 49→His、Ile、Arg、Lys、Met或Pro；Tyr 52→Asn、Tyr、Arg、Ser或Met；Ser 68→Asp、Asn、Glu或Gln；Leu 70→Lys、Asn或Arg；Arg 72→Leu、Arg、Gln或Tyr；Lys 73→His、Leu、Ala、Pro、Gln或Tyr；Asp 77→Ala、Ile、Lys、Gln或Arg；Trp 79→Ser或Asp；Arg 81→His、Ala、Ser或Val；Asn 96→Met、Ile、Arg、Gly、Leu或Val；Tyr 100→Ala、Ile、Asn、Pro或Asp；Leu 103→Gln、Gly、Phe或Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp或Thr；Ser 127→Val、His、Ile、Phe或Ala；Tyr 132→Phe；和Lys 134→Trp、Gln或Glu。在一些實施方案中，揭示內容的hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的這些序列位置處包含兩個或更多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多個或所有突變的胺基酸殘基。

另外，根據揭示內容的結合Pvd III型的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比還可以包含下述取代：Gln 28→His；Leu 42→Arg；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Asp 47→Asn；Asn 65→Asp；Cys 87→Ser；Ser 105→Pro和Thr 145→Pro。

在一些其它實施方案中，揭示內容的結合Pvd III型的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下述胺基酸替換：Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Met；Gln 49→ His；Tyr 52→Asn；Ser 68→Glu；Leu 70→Lys；Arg 72→Gln；Lys 73→Ala；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→His；Tyr 132→Phe；Lys 134→Gln；Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Arg；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Tyr；Ser 68→Gln；Leu 70→Asn；Arg 72→Trp；Lys 73→Leu；Asp 77→Ala；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Ile；Leu 103→Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Thr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Leu；Ile 41→Leu；Gln 49→Arg；Tyr 52→Arg；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Leu；Lys 73→Tyr；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ala；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ala；Leu 103→Phe；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Ala；Lys 134→Glu；Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Pro；Asp 77→Arg；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Pro；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Ala；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→ Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Thr；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Arg；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Vla；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Tyr；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→-；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→ Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→ Trp；或Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp。

在殘留區(即與序列位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、105-106、125、127、132、134和145不同的區域)中，揭示內容的hNGAL突變蛋白可以包含突變的胺基酸序列位置外部的野生型(天然)胺基酸序列。

在另外的具體實施方案中，根據本揭示內容的突變蛋白包含選自SEQ ID NO：38-53的胺基酸序列或其片段或變體。

揭示內容的結合Pvd III型的hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與選自SEQ ID NO：38-53的序列可以具有高序列同一性，如至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性。

揭示內容還包括具有選自SEQ ID NO：38-53的胺基酸序列的hNGAL突變蛋白的結構同源物，該結構同源物相對於所述hNGAL突變蛋白具有超過約60%，優選超過65%，超過70%，超過75%，超過80%，超過85%，超過90%，超過92%且最優選超過95%的胺基酸序列同源性或序列同一性。

可通過誘變人脂籠蛋白2的天然存在形式獲得根據本揭示內容的結合Pvd III型的hNGAL突變蛋白。在誘變的一些實施方案中，取代(或替換)是保守取代。雖然如此，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下文的例示性取代的一種或多種)，只要突變蛋白保留其結合Pvd I型的能力，和/或由於它與成熟人脂籠蛋白2的胺基酸序列(SWISS-PROT數據庫登錄號P80188)是至少 60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高的同一性，它與然後取代的序列具有同一性。

對綠膿桿菌螢光素特異性的突變蛋白的應用

綠膿桿菌螢光素是假單胞菌屬，如綠膿桿菌的主要鐵載體。體外實驗指示綠膿桿菌綠膿桿菌螢光素在從鐵轉鐵蛋白釋放鐵中的潛在作用，但是綠膿桿菌螢光素在體內競爭鐵的能力最近才得到證明(Meyer等，1996,Infection and Immunity,64,p.518-523)。使用燒傷小鼠模型觀察到自有毒力的親本菌株產生的突變體中綠膿桿菌螢光素生成的缺乏與這些突變體的毒力喪失相關聯，並且毒力在補充源自野生型菌株的同源綠膿桿菌螢光素時恢復。此外，補充異源綠膿桿菌螢光素沒有恢復後一種突變體的毒力。如此，對感染期間由給定綠膿桿菌隔離群使用的綠膿桿菌螢光素介導的鐵攝取系統的精確知識看起來是開發經由細菌鐵代謝(例如通過阻斷綠膿桿菌螢光素生物合成或綠膿桿菌螢光素介導的鐵轉運)治療綠膿桿菌感染的新方式的前提。

因此，醫學中存在本揭示內容的結合綠膿桿菌螢光素的突變蛋白的許多可能的應用。在一個另外的方面中，揭示內容涉及本文中揭示的結合綠膿桿菌螢光素的突變蛋白用於檢測樣品中的綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)的用途以及相應的診斷方法。

本揭示內容還牽涉如描述的一種或多種結合綠膿桿菌螢光素的突變蛋白用於與綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)形成複合物的用途。

因此，在揭示內容的另一個方面中，使用揭示的突變蛋白檢測綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)。此類用途可包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與懷疑含有綠膿桿菌螢光素的樣品接觸，由此允許在突變蛋白和綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)之間形成複合物，並通過合適的信號檢測複合物。

可檢測信號可為通過如上文解釋的標記物，或者通過由於自身結合(即複合物形成)所致的物理性質變化引起的。一個例子是表面等離振子共振，其數值在結合配偶體的結合期間是變化的，所述結合配偶體中的一種固定化在表面(如金箔)上。

本文中揭示的結合綠膿桿菌螢光素的突變蛋白也可用於分離綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)。此類用途可包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與認為含有綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)的樣品接觸，由此允許形成突變蛋白和綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)之間的複合物，並自樣品分離複合物。

在揭示的突變蛋白用於檢測綠膿桿菌螢光素及分離綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)的用途中，突變蛋白和/或綠膿桿菌螢光素或其域或片段可以在合適的固相上固定化。

在又一個方面中，本揭示內容特徵在於診斷或分析套盒，其包含根據揭示內容的結合綠膿桿菌螢光素的突變蛋白。

除了它們在診斷學中的用途外，在又一個方面中，揭示內容涵蓋揭示內容的結合綠膿桿菌螢光素的突變蛋白或包含此類突變蛋白的組合物用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)和/或抑制或降低受試者中的綠膿桿菌生長的用途。

在又一個方面中，本揭示內容特徵在於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)的方法，其包括對所述受試者施用有效量的揭示內容的一種或多種結合綠膿桿菌螢光素的突變蛋白或包含此類突變蛋白的一種或多種組合物。

在又一個方面中，本揭示內容牽涉用於抑制或降低受試者中的綠膿桿菌生長的方法，其包括對所述受試者施用有效量的揭示內容的一種或多種結合綠膿桿菌螢光素的突變蛋白或包含此類突變蛋白的一種或多種組合物。

對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白

另外，本揭示內容滿足下述需要：通過提供結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白得到的綠膿桿菌螯鐵蛋白的備選抑制劑及其有用的應用。因而，揭示內容還提供了生成和使用本文中描述的結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的突變蛋白的方法以及可在檢測樣品中的綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法中或在結合受試者中的綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法中使用的組合物。先前尚未描述具有伴隨由本揭示內容提供的用途的這些特徵的此類hNGAL突變蛋白。

對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的例示性突變蛋白

在一個方面，本揭示內容涉及hNGAL突變蛋白，其以約20nM以下，如1nM以下的K_D結合與鐵複合的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如，例如在通過基本上在實施例6中描述的測定法中的Biacore T200儀測量時。

在又一些另外的實施方案中，本揭示內容的一種或多種hNGAL突變蛋白能夠以由約500nM以下的IC50值測量的親和力結合具有複合的鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實施例5中描述的ELISA測定法中測量時。

在又一些其它實施方案中，本揭示內容的一種或多種hNGAL突變蛋白能夠以由約200nM以下的IC50值測量的親和力結合沒有複合的鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實施例5中描述的ELISA測定法中測量時。

在又一些其它實施方案中，本揭示內容的一種或多種hNGAL突變蛋白能夠以由約200nM以下的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合的鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實施例5中描述的ELISA測定法中測量時。

在一些實施方案中，突變蛋白能夠在基本上在實施例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM以下的IC50值抑制由綠膿桿菌螯鐵蛋白介導的鐵攝取。

在一些實施方案中，突變蛋白能夠在基本上在實施例8中描述的測定法中抑制Pvd I剔除(△pvdA)的細菌生長。

在這點上，揭示內容涉及多肽，其中所述多肽包含hNGAL突變蛋白，並且所述hNGAL與成熟hNGAL的線性多肽序列相比在序列位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或甚至更多個突變的胺基酸殘基，且其中所述多肽結合綠膿桿菌螯鐵蛋白。

在一些實施方案中，揭示內容的結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一處或多處包含下述突變胺基酸殘基中的一個或多個：Leu 36→His、Met或Val；Ala 40→Ile、Gln、Tyr或Phe；Ile 41→Leu、His或Trp；Gln 49→His、Arg、Ser或Ala；Tyr 52→Leu、Trp或Pro；Ser 68→Asp或His；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His、Ile、Ala、Ser或Gly；Lys 73→Asn、Met、Pro、Phe、Gln或Arg；Asp 77→Arg、Thr、Pro或Asp；Trp 79→Ala、Arg、Lys或Asp；Arg 81→Thr、Ile或Trp；Asn 96→Met、Asn、Pro或Ala；Tyr 100→Gly、His或Glu；Leu 103→Gly、Met、His或Gln；Tyr 106→Met、Gly、Arg或Trp；Lys 125→Trp、Phe、Gly或Leu；Ser 127→Arg、Trp、Asp或Ile；Tyr 132→Ala、Glu或Thr；和Lys 134→Leu、Val、Asn或Phe。在一些實施方案中，揭示內容的hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的這些序列位置處包含兩個或更多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多個或所有突變的胺基酸殘基。

此外，根據揭示內容的結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比還可以包含下述取代：Gln 28→His；Val 34 →Leu；Glu 44→Gly；Asp 45→Gly；Lys→Arg或Tyr；Asn 65→Asp；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Val 108→Ala；Phe 123→Ser和Thr 141→Ala。

在一些額外的實施方案中，揭示內容的結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下述胺基酸替換：Gln 28→His；Ala 40→Ile；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Leu；Ser 68→His；Leu 70→Thr；Arg 72→Lys；Lys 73→Trp；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Lys 125→Trp；Ser 127→Asp；Tyr 132→Glu；Lys 134→Leu；Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Ala；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Arg；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Pro；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Arg；Lys 125→Leu；Ser 127→Arg；Tyr 132→ Ala；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Vla 34→Leu；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Thr 141→Ala；Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Glu 44→Gly；Lys 46→Tyr；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Lys 74→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Val 108→Ala；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；或Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70 →Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe。

在殘留區(即與序列位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141不同的區域)中，揭示內容的hNGAL突變蛋白可包含突變的胺基酸序列位置外部的野生型(天然)胺基酸序列。

在其它具體的實施方案中，根據本揭示內容的突變蛋白包含選自SEQ ID NO：54-63的胺基酸序列或其片段或變體。

揭示內容的結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白的胺基酸序列可與選自SEQ ID NO：54-63的序列具有高序列同一性，如至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性。

揭示內容還包括具有選自SEQ ID NO：54-63的胺基酸序列的hNGAL突變蛋白的結構同源物，該結構同源物相對於所述hNGAL突變蛋白具有超過約60%，優選超過65%，超過70%，超過75%，超過80%，超過85%，超過90%，超過92%，且最優選超過95%的胺基酸序列同源性或序列同一性。

可通過誘變人脂籠蛋白2的天然存在形式獲得根據本揭示內容的結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白。在誘變的一些實施方案中，取代(或替換)是保守取代。雖然如此，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下文的例示性取代的一種或多種)，只要突變蛋白保留其結合Pvd I型的能力，和/或由於它與成熟人脂籠蛋白2的胺基酸序列(SWISS-PROT數據庫登錄號P80188)是至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高的同一性，它與然後取代的序列具有同一性。

2.對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白的應用

綠膿桿菌螯鐵蛋白(Pch)是由綠膿桿菌生成並分泌的以同化鐵的兩種主要的鐵載體之一。它螯合胞外介質中的鐵，並且經由特定的外膜轉運蛋白FptA將它轉運到細胞中。Pch強烈螯合二價金屬，如Zn(II)(於p[H]7.4，pZn=11.8)和Cu(II)(於p[H]7.4，pCu=14.9)，並且主要形成1：2(M²⁺/Pch)複合物。鐵載體不僅專用於鐵(III)穿梭，而且更可能在微生物中的微妙金屬穩態中展現其它特定的生物學作用。

因此，醫學中存在揭示內容的對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的突變蛋白的許多可能的應用。在一個另外的方面中，揭示內容涉及本文中揭示的此類突變蛋白用於檢測樣品中的綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途以及相應的診斷方法。

本揭示內容還牽涉如描述的對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的一種或多種突變蛋白用於與綠膿桿菌螯鐵蛋白形成複合物的用途。

因此，在揭示內容的另一個方面中，使用揭示的突變蛋白來檢測綠膿桿菌螯鐵蛋白。此類用途可以包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與懷疑含有綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，由此允許在突變蛋白和綠膿桿菌螯鐵蛋白之間形成複合物，並通過合適的信號檢測複合物。

可檢測信號可以是通過如上文解釋的標記物，或者通過由於自身結合(即複合物形成)所致的物理性質變化引起。一個例子是表面等離振子共振，其數值在結合配偶體的結合期間是變化的，所述結合配偶體中的一種固定化在表面(如金箔)上。

也可以使用本文中揭示的突變蛋白來分離綠膿桿菌螯鐵蛋白。此類用途可以包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與認為含有綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，由此允許在突變蛋白和綠膿桿菌螯鐵蛋白之間形成複合物，並自樣品分離複合物。

在揭示的突變蛋白用於檢測綠膿桿菌螯鐵蛋白以及分離綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途中，突變蛋白和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白或其域或片段可以在合適的固相上固定化。

因而，可測定例如樣品中的分子(如綠膿桿菌螯鐵蛋白)的存在或缺乏及其濃度或水準。

在又一個方面中，本揭示內容特徵在於診斷或分析套盒，其包含根據揭示內容的對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的突變蛋白。

除了它們在診斷學中的用途外，在又一個方面中，揭示內容涵蓋揭示內容的此類突變蛋白或包含此類突變蛋白的組合物用於結合受試者中的綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或抑制或降低受試者中的綠膿桿菌生長的用途。

在又一個方面中，本揭示內容特徵在於結合受試者中的綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法，其包括對所述受試者施用有效量的揭示內容的對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的一種或多種突變蛋白或包含此類突變蛋白的一種或多種組合物。

在又一個方面中，本揭示內容牽涉用於抑制或降低受試者中的綠膿桿菌生長的方法，其包括對所述受試者施用有效量的揭示內容的對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的一種或多種突變蛋白或包含此類突變蛋白的一種或多種組合物。

C.包含結合綠膿桿菌螢光素的突變蛋白和/或結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的突變蛋白以及突變蛋白的組合的組合物

綠膿桿菌是一種細菌物種，其廣泛分佈於環境中，並且能夠在具有素因病況(如囊性纖維化)的患者中引起非常嚴重的感染。綠膿桿菌合成兩種主要鐵載體，即綠膿桿菌螢光素(Pvd)和綠膿桿菌螯鐵蛋白(Pch)，以覆蓋其對鐵(III)的需要。認為生長的生物膜模式對於持續性綠膿桿菌感染是關鍵的(Costerton等，1999；Singh等，2000)，並且Pvd和Pch基因的雙重表達對於正常生物膜形成是必需的(Banin等，2005)。

考慮到綠膿桿菌生成可觀的一批毒力因數(均在其致病性中發揮作用)，有效抑制綠膿桿菌毒力的優選策略是靶向幾種毒力因數。

為此目的，本揭示內容涵蓋(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途。此類用途包括下述步驟：對受試者施用有效量的(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽。本揭示內容還涵蓋(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽用於在受試者中防止或降低綠膿桿菌經由綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠膿桿菌螢光素攝取鐵的用途。類似地，本揭示內容揭示了(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽用於治療或減輕受試者中的綠膿桿菌感染和/或生物膜形成的用途。在一些另外的實施方案中，綠膿桿菌感染可以是急性或慢性感染。

可組合施用第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽，包括同時(concurrently)、伴隨(concomitantly)或連續(in series)。在一些實施方案中，可以在可施用的組合物中包含第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽。組合物可包含結合至少一種藥學可接受佐劑、稀釋劑或載體的有效量的作為活性成分的第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽。第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽也可彼此獨立施用，包括在獨立的時間點時以個別的時間間隔。

在一些實施方案中，如本揭示內容中使用的對綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)特異性的突變蛋白能夠以可檢出的親和力，即以至少200nM，包括約100nM、約50nM、約25nM或約15nM的解離常數結合綠膿桿菌螢光素(分別為I、II或III型)。在一些實施方案中，如本揭示內容中使用的對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白能夠以可檢出的親和力，即以至少200nM，包括約100nM、約50nM、約25nM或約15nM的解離常數結合綠膿桿菌螯鐵蛋白。在一些另外的優選實施方案中，根據揭示內容的組合的突變蛋白分別以至少約10nM、約1nM、約0.1nM、約10pM或甚至更低的對綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白的解離常數結合綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白。如此，本揭示內容提供了(i)對綠膿桿菌螢光素I型(Pvd I s、sa、aKG +/-Fe)具有可檢出的親和力的hNGAL突變蛋白，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型(Pvd II s、sa、aKG +/-Fe)具有可檢出的親和力的hNGAL突變蛋白，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型(Pvd III s、sa、aKG +/-Fe)具有可檢出的親和力的hNGAL突變蛋白和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白(Pch +/- Fe)具有可檢出的親和力的hNGAL突變蛋白的組合。

關於對綠膿桿菌螢光素具有可檢出的親和力的hNGAL突變蛋白的更多詳情可參見本揭示內容的A部分中。

在一個特別優選的實施方案中，對綠膿桿菌螢光素I型特異性的突變蛋白在SEQ ID NO：2-18中的任一項中顯示。在一個特別優選的實施方案中，對綠膿桿菌螢光素II型特異性的突變蛋白在SEQ ID NO：19-37中的任一項中顯示。在一個特別優選的實施方案中，對綠膿桿菌螢光素III型特異性的突變蛋白在SEQ ID NO：38-53中的任一項中顯示。

對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有可檢出的親和力的hNGAL突變蛋白的更多詳情已經在本揭示內容的B部分中揭示。

在一個特別優選的實施方案中，對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白在SEQ ID NO：54-63中任一項中顯示。

本揭示內容還涉及組合物，其包含下列至少一項：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽，該組合物可以在結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法中使用。

本揭示內容涉及第一突變蛋白或其多肽或組合物、第二突變蛋白或其多肽或組合物、第三突變蛋白或其多肽或組合物和/或第四突變蛋白或其多肽或組合物的組合。這些突變蛋白之一可以以可檢出的親和力結合作為給定的非天然靶物的綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)。這些突變蛋白之一可以以可檢出的親和力結合作為給定的非天然靶物的綠膿桿菌螯鐵蛋白。如此，相應的突變蛋白分別結合作為給定的非天然靶物的綠膿桿菌螢光素I、II或III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白。術語「非天然靶物」指在生理學條件下不結合相應的脂籠蛋白(野生型hNGAL)的化合物。例如，第一突變蛋白或其多肽或組合物可以結合一類綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白，並且第二、第三或第四突變蛋白或其多肽或組合物可以分別結合綠膿桿菌螯鐵蛋白或另一類綠膿桿菌螢光素，或者反之亦然。可以以各種形式和取向提供第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽或組合物的組合。

在又一個方面中，本揭示內容特徵在於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法，其包括對所述受試者施用有效量的包含下列至少一項的組合物：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽。在一些實施方案中，此類組合物包含(i)-(iv)的兩種或更多種，例如三種或甚至全部。

在又一個方面中，本揭示內容牽涉抑制或降低受試者中的綠膿桿菌生長的方法，其包括對所述受試者施用有效量的包含下列至少一項的組合物：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽。在一些實施方案中，此類組合物包含(i)-(iv)的兩種或更多種，例如三種或甚至全部。

本揭示內容還牽涉(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽用於與綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白形成複合物的用途。

因此，在揭示內容的另一個方面中，可使用揭示的突變蛋白或多肽檢測綠膿桿菌螢光素和綠膿桿菌螯鐵蛋白。此類用途可包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白或多肽與懷疑含有綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，由此分別允許在突變蛋白或多肽和綠膿桿菌螢光素之間和/或在突變蛋白和綠膿桿菌螯鐵蛋白之間形成複合物，並通過合適的信號檢測複合物。

可檢測信號可以是通過如上文解釋的標記物，或者通過由於自身結合(即複合物形成)所致的物理性質變化引起的。一個例子是表面等離振子共振，其數值在結合配偶體的結合期間是變化的，所述結合配偶體中的一種固定化在表面(如金箔)上。

本文中揭示的突變蛋白或多肽也可以用於分離綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白。此類用途可以包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與認為含有綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，由此分別允許在突變蛋白和綠膿桿菌螢光素之間和/或在突變蛋白和綠膿桿菌螯鐵蛋白之間形成複合物，並自樣品分離複合物。

在揭示的突變蛋白或多肽用於檢測綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白以及分離綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途中，可在合適的固相上固定化突變蛋白和/或綠膿桿菌螢光素和綠膿桿菌螯鐵蛋白或其域或片段。

因而，可測定例如樣品中的綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的存在或缺乏以及其濃度或水準。

在另一個方面中，揭示內容提供了多個部分的套盒(kit)。套盒在一個或多個容器中分開或混合包含對綠膿桿菌螢光素I型特異性的突變蛋白或多肽或其組合物、對綠膿桿菌螢光素II型特異性的突變蛋白或多肽或其組合物、對綠膿桿菌螢光素III型特異性的突變蛋白或多肽或其組合物、和/或對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白或多肽或其組合物。在一些進一步優選的實施方案中，套盒包含包括對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或多肽或其組合物的第一容器、包括對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或多肽或其組合物的第二容器、包括對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或多肽或其組合物的第三容器、和/或包括對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或多肽或其組合物的第四容器。在一些實施方案中，套盒進一步與其整合地或作為一個或多個分開檔包含關於內容物或套盒和突變蛋白或其多肽的用途的信息。在一些實施方案中，套盒可包含一種或多種經配製以在稀釋劑中重構的組合物。此類稀釋劑(例如無菌稀釋劑)也可以包含在套盒中，例如在容器內。

D.揭示內容的突變蛋白

當本文中在本揭示內容的結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的突變蛋白的語境使用時，術語「對...特異性」包括突變蛋白分別為針對、結合於或者與綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白起反應。如此，針對、結合或起反應包括突變蛋白分別特異性結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白。術語「特異(性)地」在此語境中意指突變蛋白與如本文中描述的綠膿桿菌螢光素蛋白或綠膿桿菌螯鐵蛋白蛋白質起反應，而基本上不與另一種蛋白質起反應。術語「另一種蛋白質」分別包括任何非綠膿桿菌螢光素或非綠膿桿菌螯鐵蛋白蛋白質，包括與本文中揭示的突變蛋白所針對的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白緊密相關或同源的蛋白質。然而，術語「另一種蛋白質」不排除來自除了人外的物種(如定義「受試者」的語境中描述的那些物種)的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白蛋白質、片段和/或變體。術語「基本上不結合」意指本揭示內容的突變蛋白不結合另一種蛋白質，即顯示小於30%，優選20%，更優選10%，特別優選小於9、8、7、6或5%的交叉反應性。特別是可通過比較本揭示內容的脂籠蛋白突變蛋白與綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的反應和所述突變蛋白與其它蛋白質的反應而容易地測試突變蛋白是否特異性起反應，如上文描述的。例如也可以根據Western印跡、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-測試、FACS、IHC和肽掃描測定「特異性結合」。

根據揭示內容的突變蛋白的胺基酸序列當與同另一種脂籠蛋白的序列同一性相比時與人脂籠蛋白2具有高序列同一性(還可參見上文)。在此一般語境中，根據揭示內容的組合的突變蛋白的胺基酸序列與相應脂籠蛋白(野生型hNGAL)的胺基酸序列是至少基本上相似的。根據揭示內容的組合的突變蛋白的相應序列與成熟hNGAL的序列基本上相似，如與成熟hNGAL的序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性。在這點上，比較而言，揭示內容的突變蛋白當然可含有如本文中描述的取代，其使突變蛋白能夠分別結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白。通常，相對于hNGAL的天然序列，hNGAL的突變蛋白包含hNGAL的配體結合位點的開放末端處的4個環中的胺基酸的一個或多個突變。如上文解釋，這些區域在決定突變蛋白對綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的結合特異性中是必需的。突變蛋白衍生hNGAL或其同源物可在N端區中和/或在位於天然結合袋(natural binding pocket)對面的β-桶結構末端安排的3個肽環BC、DE和FG中的任何序列位置處具有1、2、3、4或更多個突變的胺基酸殘基。

根據揭示內容的突變蛋白與相應的天然hNGAL相比包含一個或多個，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或甚至20個取代，條件是此類突變蛋白應當能夠分別結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白。例如，突變蛋白可在與hNGAL的獨特位置對應的位置處(即在相應的位置處)具有取代。在一些實施方案中，根據揭示內容的組合的突變蛋白包含至少兩個胺基酸取代，包括2、3、4、5或甚至更多個由精胺酸殘基對天然胺基酸的胺基酸取代。因而，如本文中描述的蛋白質「參照」支架的核酸經受誘變，目的在於生成能夠分別結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的突變蛋白。

還有，本揭示內容的突變蛋白可包含在其N或C端，優選C端的異源胺基酸序列，如Strep-標簽，例如Strep II標簽，而不影響突變蛋白的生物學活性(分別結合其靶物，例如綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白)。

具體地，為了測定與野生型hNGAL不同的突變蛋白的胺基酸序列的胺基酸殘基是否對應於野生型hNGAL的胺基酸序列中的某個位置，熟練技術人員可使用本領域中公知的手段和方法，例如比對，手動或通過使用計算機程式，如BLAST2.0，其代表基本局部比對搜索工具或ClustalW或適合於產生序列比對的任何其它合適的程式。因而，野生型hNGAL可充當「主題序列」或「參照序列」，而與本文中描述的野生型hNGAL不同的突變蛋白的胺基酸序列充當「查詢序列」。術語「參照序列」和「野生型序列」在本文中可互換使用。

在一些實施方案中，取代(或替換)是保守取代。雖然如此，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下文列出的例示性取代的一種或多種)，只要突變蛋白保留其分別結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的能力和/或由於它與「初始」序列是至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高相同，它與然後取代的序列具有同一性。

保守取代一般是根據要突變的胺基酸列出的下列取代，每個後面為可理解為保守的一個或多個替換：Ala→Gly、Ser、Val；Arg→Lys；Asn→Gln、His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg、Asn、Gln；Ile→Leu、Val；Leu→Ile、Val；Lys→Arg、Gln、Glu；Met→Leu、Tyr、Ile；Phe→Met、Leu、Tyr；Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp、Phe；Val→Ile、Leu。其它取代也是可允許的，並且可以憑經驗或者根據其它已知的保守或非保守取代確定。作為進一步的方向，下述8組各含有通常可以理解為限定彼此保守取代的胺基酸：丙胺酸(Ala)，甘胺酸(Gly)；天冬胺酸(Asp)，谷胺酸(Glu)；天冬醯胺(Asn)，穀胺醯胺(Gln)；精胺酸(Arg)，賴胺酸(Lys)；異亮胺酸(Ile)，亮胺酸(Leu)，甲硫胺酸(Met)，纈胺酸(Val)；苯丙胺酸(Phe)，酪胺酸(Tyr)，色胺酸(Trp)；絲胺酸(Ser)，蘇胺酸(Thr)；和半胱胺酸(Cys)，甲硫胺酸(Met)。

若此類取代導致生物學活性的變化，則可以引入更多實質性變化，如下述，或如下文參照胺基酸類別進一步描述，並且對產物篩選期望的特徵。此類更多實質性變化的例子是：Ala→Leu、Ile；Arg→Gln；Asn→Asp、Lys、Arg、His；Asp→Asn；Cys→Ala；Gln→Glu；Glu→Gln；His→Lys；Ile→Met、Ala、Phe；Leu→Ala、Met、正亮胺酸；Lys→Asn；Met→Phe；Phe→Val、Ile、Ala；Trp→Phe；Tyr→Thr、Ser；Val→Met、Phe、Ala。

通過選擇取代實現hNGAL的生物學特性的實質性修飾，所述取代在它們對維持(a)取代區中的多肽主鏈的結構(例如作為片層或螺旋構象)，(b)靶位點處的分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積(bulk)的作用上顯著不同。基於共同的側鏈特性，將天然存在的殘基分為下組：(1)疏水性：正亮胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸；(2)中性親水性：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；(3)酸性：天冬胺酸、谷胺酸；(4)鹼性：天冬醯胺、穀胺醯胺、組胺酸、賴胺酸、精胺酸；(5)影響鏈取向的殘基：甘胺酸、脯胺酸；和(6)芳香族：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。

非保守取代會需要用這些類別之一的成員替代另一類。不參與維持hNGAL的正確構象的任何半胱胺酸殘基也可以一般用絲胺酸取代以改善分子的氧化穩定性並阻止異常交聯。相反，可添加半胱胺酸鍵以改善其穩定性。

可使用建立的標準方法在核酸(例如DNA水準)上非常容易地實現任何突變，包括如上文討論的插入。胺基酸序列的改變的例示性例子是插入或缺失以及胺基酸取代。此類取代可以是保守的，即胺基酸殘基用化學上相似特性(特別就極性及大小而言)的胺基酸殘基替換。保守替代的例子是下組成員間的替換：1)丙胺酸、絲胺酸和蘇胺酸；2)天冬胺酸和谷胺酸；3)天冬醯胺和穀胺醯胺；4)精胺酸和賴胺酸；5)異亮胺酸、亮胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸；和6)苯丙胺酸、酪胺酸、和色胺酸。另一方面，也可在胺基酸序列中引入非保守改變。另外，替代替換單一胺基酸殘基，也可以插入或缺失hNGAL的一級結構的一個或多個連續胺基酸，只要這些缺失或插入產生穩定的折疊/功能性突變蛋白。

胺基酸序列的修飾包括單一胺基酸位置的定向誘變以通過摻入某些限制酶的切割位點而簡化突變的hNGAL基因或其部分的次選殖株。另外，也可摻入這些突變以進一步改善突變蛋白對給定靶物(如綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白)的親和力。此外，可引入突變以調控突變蛋白的某些特徵，從而改善折疊穩定性、血清穩定性、蛋白質抗性或水溶解度或降低聚集趨勢(若必要的話)。例如，可將天然存在的半胱胺酸殘基突變成其它胺基酸以阻止二硫化物橋形成。也可將其它胺基酸序列位置有意突變為半胱胺酸以引入新的反應性基團，例如用於與其它化合物(如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、生物素、肽或蛋白質)綴合或用於形成非天然存在的二硫化物連接。可使用生成的硫醇模塊來將突變蛋白進行PEG化或HES化，例如以提高相應突變蛋白的血清半衰期。

也可將其它胺基酸序列位置突變為半胱胺酸以引入新的反應性基團，例如用於與其它化合物(如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、生物素、肽或蛋白質)綴合或用於形成非天然存在的二硫化物連接。

在一些實施方案中，若將上述模塊之一與揭示內容的突變蛋白綴合，則與胺基酸側鏈的綴合可以是有利的。合適的胺基酸側鏈可以天然存在於hNGAL的胺基酸序列中或者可以通過誘變引入。在經由誘變引入合適的結合位點的情況中，一種可能性是用半胱胺酸殘基替換合適位置處的胺基酸。

就人脂籠蛋白2的突變蛋白而言，例示性的可能性是此類突變將半胱胺酸殘基引入脂籠蛋白(包括人脂籠蛋白2突變蛋白)的胺基酸序列中，以包括至少在與人NGAL的野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158對應的序列位置之一處引入半胱胺酸(Cys)殘基。在揭示內容的人脂籠蛋白2突變蛋白具有與SWISS-PROT/UniProt數據庫登錄號P80188的序列相比半胱胺酸已經用另一種胺基酸殘基替換的序列的一些實施方案中，可將相應的半胱胺酸再引入序列中。作為說明性例子，在此類情況中可通過恢復成半胱胺酸(如SWISS-PROT登錄號P80188的序列中最初存在的)引入胺基酸位置87處的半胱胺酸殘基。可使用胺基酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146和/或158中任一個的側鏈上生成的硫醇模塊來對突變蛋白進行PEG化或HES化，例如以延長相應人脂籠蛋白2突變蛋白的血清半衰期。

在另一個實施方案中，為了提供合適的胺基酸側鏈以將上述化合物之一與根據本揭示內容的突變蛋白綴合，可通過誘變引入人工胺基酸。一般地，此類人工胺基酸設計為更具反應性，並且因而促進與期望化合物的綴合。可經由人工tRNA引入的此類人工胺基酸的一個例子是對乙醯基苯丙胺酸。

對於本文中揭示的突變蛋白的幾個應用，可為有利的是以融合蛋白的形式使用它們。在一些實施方案中，揭示內容的突變蛋白在其N端或其C端與蛋白質、蛋白質域或肽，例如信號序列和/或親和標簽融合。

親和標簽，如Strep-tag®或Strep-tag® II(Schmidt,T.G.M.等(1996)J.Mol.Biol.255,753-766)、myc-標簽、FLAG-標簽、His₆-標簽或HA-標簽或蛋白質，如谷胱甘肽-S-轉移酶也允許容易檢測和/或純化重組蛋白，其是合適的融合配偶體的進一步例子。最後，具有生色或螢光特性的蛋白質，如綠色螢光蛋白(GFP)或黃色螢光蛋白(YFP)也是揭示內容的突變蛋白的合適的融合配偶體。

一般地，可用任何合適的化學物質或酶標記揭示內容的突變蛋白，所述化學物質或酶在化學、物理、光學或酶促反應中直接或間接產生可檢測的化合物或信號。物理反應和同時光學反應/標記物的一個例子是在使用放射性標記物時在X射線照射或發射後的螢光發射。鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶和β-半乳糖苷酶是催化生色反應產物形成的酶標記物(和同時的光學標記物)的例子。一般地，通常用於抗體的所有標記物(除專門與免疫球蛋白的Fc部分中的糖模塊一起使用的那些標記物外)也可用於與揭示內容的突變蛋白綴合。揭示內容的突變蛋白也可與任何合適的治療活性劑綴合，例如以將此類藥劑靶向遞送到給定細胞、組織或器官或選擇性靶向細胞(例如腫瘤細胞)而不影響周圍的正常細胞。此類治療活性劑的例子包括放射性核素、毒素、小有機分子、和治療肽(如作用為細胞表面受體的激動劑/拮抗劑的肽或競爭給定細胞靶物上的蛋白質結合位點的肽)。然而，揭示內容的突變蛋白也可與治療活性核酸，如反義核酸分子、小干擾RNA、微小RNA或核酶綴合。可通過本領域中公知的方法生成此類綴合物。

如上文指示，在一些實施方案中，揭示內容的突變蛋白可與延長突變蛋白的血清半衰期的模塊綴合(在這點上，還可參見PCT揭示文本WO 2006/56464，其中通過提及對CTLA-4具有結合親和力的人嗜中性粒細胞明膠酶相關的脂籠蛋白的突變蛋白描述了此類綴合策略)。延長血清半衰期的模塊可為聚亞烷基二醇分子、羥乙基澱粉、脂肪酸分子，如棕櫚酸(Vajo & Duckworth 2000,Pharmacol.Rev.52,1-9)、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白結合肽、或清蛋白結合蛋白、轉鐵蛋白等等。清蛋白結合蛋白可為細菌清蛋白結合蛋白、抗體、抗體片段，包括域抗體(例如，參見美國專利6,696,245)、或對清蛋白具有結合活性的突變蛋白。因而，適合於延長揭示內容的突變蛋白的半衰期的綴合配偶體包括清蛋白結合蛋白，例如細菌清蛋白結合域，如鏈球菌蛋白G的(König,T.,& Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。可用作綴合配偶體的清蛋白結合肽的其它例子是例如具有Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cys共有序列的那些，其中Xaa₁是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa₂是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa₃是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；並且Xaa₄是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如記載於美國專利申請2003/0069395或Dennis等(SEQ ID NO：131；Dennis,M.S.,Zhang,M.,Meng,Y.G.,Kadkhodayan,M.,Kirchhofer,D.,Combs,D.& Damico,L.A.(2002)J Biol Chem 277,35035-35043)。

在其它實施方案中，清蛋白自身(Osborn,B.L.等，2002,J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548)，或清蛋白的生物學活性片段可以用作揭示內容的突變蛋白的綴合配偶體。術語「清蛋白」包括所有哺乳動物清蛋白，如人血清清蛋白或牛血清清蛋白或大鼠清蛋白。可以重組生成清蛋白或其片段，如記載於美國專利5,728,553或歐洲專利申請EP 0 330 451和EP 0 361 991。可以將重組人清蛋白(Recombumin®)Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)與揭示內容的突變蛋白綴合或融合以延長突變蛋白的半衰期。

若清蛋白結合蛋白是抗體片段，則它可為域抗體。域抗體(dAb)工程化改造為允許對生物物理特性和體內半衰期的精確控制以創建最佳安全性和效力產物概貌。例如，域抗體可購自Domantis Ltd.(Cambridge,UK and MA,USA)。

使用轉鐵蛋白作為模塊來延長揭示內容的突變蛋白的血清半衰期，突變蛋白可以與非糖基化轉鐵蛋白的N或C端或兩者在遺傳上融合。非糖基化轉鐵蛋白具有14-17天的半衰期，並且類似地，轉鐵蛋白融合蛋白會具有延長的半衰期。轉鐵蛋白載體還提供高生物利用度、生物分佈和循環穩定性。此技術可購自BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation,PA,USA)。用作蛋白質穩定劑/半衰期延長配偶體的重組人轉鐵蛋白(DeltaFerrin^TM)也可購自Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)。

若為了延長揭示內容的突變蛋白的血清半衰期而使用免疫球蛋白的Fc部分，可以使用可購自Syntonix Pharmaceuticals,Inc(MA,USA)的SynFusion^TM技術。此Fc-融合技術的使用允許創建更長效生物藥物，並且可以例如由與抗體的Fc區連接的兩個拷貝的突變蛋白組成以改善藥動學、溶解度和生成效率。

延長揭示內容的突變蛋白的半衰期的又一種備選是與突變蛋白的N或C端融合長的、非結構化的、柔性的富含甘胺酸的序列(例如具有約20至80個連續甘胺酸殘基的多聚甘胺酸)。例如，WO2007/038619中揭示的此方法也已經稱作「rPEG」(重組PEG)。

若使用聚亞烷基二醇作為綴合配偶體，則聚亞烷基二醇可以是取代的、未取代的、線性或分支的。它也可以是活化的聚亞烷基衍生物。合適的化合物的例子是聚乙二醇(PEG)分子，如記載於WO 99/64016，美國專利6,177,074或涉及干擾素的美國專利6,403,564，或如對其它蛋白質描述，如經PEG修飾的門冬醯胺酶，PEG-腺苷脫胺酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(參見例如Fuertges等(1990)The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J.Control.Release 11,139-148)。此類聚合物(如聚乙二醇)的分子量的範圍可以為約300至約70.000道爾頓，包括例如具有約10.000，約20.000，約30.000或約40.000道爾頓的分子量的聚乙二醇。此外，如例如記載於美國專利6,500,930或6,620,413，為了血清半衰期延長，可以將碳水化合物寡聚物和聚合物，如澱粉或羥乙基澱粉(HES)與揭示內容的突變蛋白綴合。

另外，本文中揭示的突變蛋白可以與模塊融合，其可以對揭示內容的突變蛋白賦予新的特徵，如酶促活性或對其它分子的結合親和力。合適的融合配偶體的例子是鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、蛋白G的清蛋白結合域、蛋白A、抗體片段、寡聚化域或毒素。

特別地，可將本文中揭示的突變蛋白與分開的酶活性位點融合，從而所得的融合蛋白的這兩種「組分」一起作用於給定的治療靶物。突變蛋白的結合域附著於致病性靶物，從而允許酶域消除靶物的生物學功能。

本揭示內容還涉及核酸分子(DNA和RNA)，其包含編碼揭示內容的突變蛋白的核苷酸序列。由於遺傳密碼的簡並性允許某些密碼子被詳明同一胺基酸的其它密碼子取代，揭示內容不限於編碼如本文中描述的突變蛋白的具體核酸分子，而是涵蓋包括編碼功能性突變蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。在這點上，本揭示內容提供了編碼揭示內容的一些突變蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：65-126中所示。

在揭示內容的一個實施方案中，方法包括在核苷酸三聯體處使核酸分子經受誘變，所示核苷酸三聯體編碼與人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：2)的序列位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145對應的至少一個或甚至更多個序列位置。

揭示內容還包括編碼揭示內容的突變蛋白的核酸分子，其包括在實驗誘變的指示序列位置外部的額外突變。此類突變經常是允許的或者甚至可以證明是有利的，例如如果它們有助於突變蛋白的改善的折疊效率、血清穩定性、熱穩定性或配體結合親和力。

本申請中揭示的核酸分子可以與一個或多個調節序列「可操作連接」以允許此核酸分子的表達。

若核酸分子包含含有關於轉錄和/或翻譯調節的資訊的序列元件，並且此類序列與編碼多肽的核苷酸序列「可操作連接」，則它(如DNA)稱為「能夠表達核酸分子」或能夠「允許表達核苷酸序列」。可操作連接是調節序列元件和要表達的序列以實現基因表達的方式相連的連接。對於基因表達必需的調節區的精確性質可以在物種間變化，但是一般地，這些區域包含啟動子，其在原核生物中含有啟動子本身(即指導轉錄的啟動的DNA元件)以及在轉錄成RNA時會對翻譯啟動發信號的DNA元件兩者。此類啟動子區通常包含參與轉錄和翻譯啟動的5’非編碼序列，如原核生物中的-35/-10框和Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA框、CAAT序列和5’加帽元件。這些區域還可以包含增強子或阻抑物元件以及翻譯的信號和前導序列，用於將天然多肽靶向到宿主細胞的特定區室。

另外，3’非編碼序列可以含有參與轉錄終止、多聚腺苷酸化等的調節元件。然而，如果這些終止序列在特定的宿主細胞中沒有令人滿意的功能，那麼它們可以用在所述細胞中功能性的信號取代。

因此，揭示內容的核酸分子可以包含調節序列，如啟動子序列。在一些實施方案中，揭示內容的核酸分子包含啟動子序列和轉錄終止序列。合適的原核啟動子是例如tet啟動子、lacUV5啟動子或T7啟動子。可用於在真核細胞中表達的啟動子的例子是SV40啟動子或CMV啟動子。

揭示內容的核酸分子也可以是載體的一部分或者任何其它種類的克隆運載體，如質粒、噬菌粒、噬菌體、杆狀病毒、粘粒或人工染色體。

在一個實施方案中，質粒中包含核酸分子。質粒載體意指編碼與感興趣cDNA融合的調和的(temperent)噬菌體(如M13或f1)的基因間區域，或其功能性部分的載體。在用此類噬菌粒載體和合適的輔助噬菌體(例如M13K07、VCS-M13或R408)二重感染細菌宿主細胞後，生成完整的噬菌體顆粒，由此實現編碼的異源cDNA與其在噬菌體表面上展示的相應多肽的物理偶聯(參見例如Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401-424，或Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87-93)。

除了上文描述的調節序列和編碼如本文中描述的突變蛋白的核酸序列外，此類選殖運載體可以包含源自與用於表達的宿主細胞相容的物種的複製和控制序列及對經轉化或轉染的細胞賦予選擇性表型的選擇標誌物。大量的合適的選殖載體是本領域中已知的，並且是商品化的。

可以將編碼如本文中描述的突變蛋白的DNA分子，和特別是含有此類突變蛋白的編碼序列的選殖載體轉化到能夠表達基因的宿主細胞中。可以使用標準技術進行轉化。如此，揭示內容還涉及含有如本文中揭示的核酸分子的宿主細胞。

在適合於表達編碼揭示內容的融合蛋白的核苷酸序列的條件下培養經轉化的宿主細胞。合適的宿主細胞可以是原核的，如大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，或真核的，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆蟲細胞、永生化哺乳動物細胞系(例如HeLa細胞或CHO細胞)或原代哺乳動物細胞。

揭示內容還涉及用於生成如本文中描述的突變蛋白或其多肽的方法，其中依靠遺傳工程方法從編碼突變蛋白或多肽的核酸開始生成突變蛋白或多肽、突變蛋白的片段或多肽或突變蛋白或多肽和另一種多肽的融合蛋白。該方法可以在體內實施，突變蛋白或多肽可以例如在細菌或真核宿主生物體中生成，然後從此宿主生物體或其培養物中分離。也可以在體外生成蛋白質，例如通過使用體外翻譯系統。

在體內生成突變蛋白或其多肽時，依靠重組DNA技術(如上文已經概述)將編碼此類突變蛋白或多肽的核酸導入合適的細菌或真核宿主生物體中。為此目的，首先使用建立的標準方法用包含編碼如本文中描述的突變蛋白的核酸分子的選殖載體轉化宿主細胞。然後，在允許異源DNA表達和由此合成相應多肽的條件下培養宿主細胞。隨後，從細胞中或從培養基中回收多肽。

在一些實施方案中，本申請中揭示的核酸分子(如DNA)可以與揭示內容的另一種核酸分子「可操作連接」以允許表達揭示內容的融合蛋白。在這點上，可操作連接是第一核酸分子的序列元件和第二核酸分子的序列元件以使融合蛋白能夠作為單一多肽表達的方式相連的連接。

另外，在一些實施方案中，可以在揭示內容的hNGAL突變蛋白中除去Cys 76和Cys 175之間的天然存在的二硫鍵。因而，可以在具有還原性氧化還原環境的細胞區室中，例如在革蘭氏陰性菌的細胞質中生成此類突變蛋白。

若揭示內容的突變蛋白包含分子內二硫鍵，則可優選使用合適的信號序列將新生多肽引導到具有氧化性氧化還原環境的細胞區室中。此類氧化性環境可由革蘭氏陰性細菌(如大腸桿菌)的周質，在革蘭氏陽性細菌的胞外環境中或者在真核細胞的內質網的腔室中提供，並且通常有利於結構性二硫鍵的形成。

然而，也可以在宿主細胞(優選大腸桿菌)的胞質溶膠(cytosol)中生成揭示內容的突變蛋白或其多肽。在此情況中，突變蛋白或多肽可以直接以可溶且折疊的狀態獲得或者以包含體形式回收，接著在體外複性。進一步的選項是使用具有氧化性胞內環境的特定宿主菌株，其由此可以允許在胞質溶膠中形成二硫鍵(Venturi等(2002)J.Mol.Biol.315,1-8.)。

然而，如本文中描述的突變蛋白或多肽可不一定僅通過使用遺傳工程生成或產生。相反，也可以通過化學合成(如Merrifield固相多肽合成)或者通過體外轉錄和翻譯而獲得此類突變蛋白或多肽。例如，可能的是使用分子建模鑒定有希望的突變，然後在體外合成想要的(設計的)多肽，並且調查對綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的結合活性。用於蛋白質的固相和/或溶液相合成的方法是本領域中公知的(參見例如Bruckdorfer,T.等(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43)。

在另一個實施方案中，可以採用本領域技術人員已知的完善建立的方法通過體外轉錄/翻譯生成揭示內容的突變蛋白或多肽。

技術人員會理解可用於製備由本揭示內容涵蓋但是其蛋白質或核酸序列在本文中沒有明確揭示的突變蛋白或其多肽的方法。作為概述，胺基酸序列的此類修飾包括例如單個胺基酸位置的定向誘變以通過併入某些限制酶的切割位點簡化突變hNGAL基因或其部分的次選殖株。另外，也可併入這些突變以進一步改善突變蛋白對其靶物(如綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白)的親和力。此外，可引入突變以調控突變蛋白的某些特徵，從而改善折疊穩定性、血清穩定性、蛋白質抗性或水溶解度或降低聚集趨勢(若必要的話)。例如，可以將天然存在的半胱胺酸殘基突變成其它胺基酸以阻止二硫化物橋形成。

本文中揭示的突變蛋白或其多肽及其衍生物可以在與抗體或其片段類似的許多領域中使用。例如，突變蛋白可以用於用酶、抗體、放射性物質或任何其它具有生物化學活性或限定結合特徵的基團標記。通過這樣做，可檢測其相應的靶物或其綴合物或融合蛋白或使其相應的靶物或其綴合物或融合蛋白與它們接觸。另外，揭示內容的突變蛋白或其多肽可用來依靠建立的分析方法(例如ELJSA或Western印跡)或者通過顯微術或免疫傳感學檢測化學結構。在這點上，可通過使用合適的突變蛋白綴合物或融合蛋白直接產生或者通過經由抗體免疫化學檢測結合的突變蛋白間接產生檢測信號。

本揭示內容的其它目的、優點和特徵在檢查下述實施例及其附圖後對於本領域技術人員會變得明顯，所述實施例及其附圖並不意圖是限制性的。因此，應當理解的是雖然本揭示內容由例示性的實施方案明確揭示，本領域技術人員可以訴諸于本文中揭示的其中體現的揭示內容的任選特徵、修改和變型，並且認為此類修改和變型在本揭示內容的範圍內。

圖1：顯示綠膿桿菌鐵載體的結構。圖1A-C顯示三種綠膿桿菌綠膿桿菌螢光素的結構，圖1A：Pvd I型的結構(參見Birskot等，1989)；圖1B：Pvd II型的結構(參見Birskot等，1989)；圖1C：Pvd III型的結構(Gipp等，1991)；圖1D：與生色團部分附接的R可以是琥珀醯基、琥珀酸醯胺基或α-酮戊二醯基側鏈；和圖1E：綠膿桿菌螯鐵蛋白的結構(Brandel等，2011)。

圖2：提供通過表面等離振子共振對Pvd I s(+Fe)結合脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：16(圖2A)，Pvd II s(+Fe)結合脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：36(圖2B)，Pvd III(+Fe)結合脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：53(圖2C)和綠膿桿菌螯鐵蛋白(+Fe)結合SEQ ID NO：62(圖2D)的結合速率(on-rate)和解離速率(off-rate)的典型測量。另外，圖2E-H中顯示了1200nM(對於綠膿桿菌螯鐵蛋白為200nM)的相應鐵載體對陰性對照脂籠蛋白SEQ ID NO：64的結合的缺乏。

圖3：顯示脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：35的例示性特異性和交叉反應性概貌，如通過表面等離振子共振測定的。證明瞭對綠膿桿菌螢光素II琥珀醯基、琥珀酸醯胺基和α-酮戊二醯基的特異性結合，而顯示了對I型和III型的綠膿桿菌螢光素、綠膿桿菌螯鐵蛋白、腸菌素(Enterobactin)和去鐵胺(Desferoxamin)的結合的缺乏。對於所有分析物，使用2μM的高濃度。

圖4：顯示來自生長抑制測定法的例示性數據。圖4A：與在沒有突變蛋白的情況下生長的對照培養物相比，Pvd I特異性突變蛋白SEQ ID NO：16顯示Pvd I特異性綠膿桿菌菌株(ATCC27853)的生長抑制。圖4B：與在沒有突變蛋白的情況下生長的對照培養物相比，Pvd II特異性突變蛋白SEQ ID NO：19和36顯示Pvd II特異性綠膿桿菌菌株(ATCC15692)的生長抑制。SEQ ID NO：36與SEQ ID NO：19相比具有更高的結合親和力，並且顯示了更大的生長抑制。圖4C：與在沒有突變蛋白的情況下生長的對照培養物相比，Pvd III特異性突變蛋白SEQ ID NO：53顯示Pvd III特異性綠膿桿菌菌株(ATCC33360)的生長抑制。圖4D：與在沒有突變蛋白的情況下生長的對照培養物相比，Pch特異性突變蛋白SEQ ID NO：62顯示依賴Pch進行鐵攝取的Pvd I剔除綠膿桿菌菌株(ATCC15692 △pvdA)的生長抑制。在測定法中應用10μM脂籠蛋白突變蛋白。

圖5：在小鼠中綠膿桿菌誘導的肺感染模型中顯示在細菌攻擊前1小時和當時施用SEQ ID NO：19以劑量依賴性方式防止小鼠中感染的發生。在從200μg/小鼠的SEQ ID NO：19開始觀察到顯著的預防效果，在2000μg/小鼠具有最大效果。

圖6：顯示為了結晶表達的胺基酸序列，包括第1位的開始甲硫胺酸、第2位的賴胺酸、第3-8位的六組胺酸標簽、第9-15位的胺基酸DYDIPTT的接頭區(SEQ ID NO：132)、第16-22位的煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切割位點ENLYFQG(SEQ ID NO：133)，接著是從第23位向前的感興趣突變蛋白的胺基酸序列。

圖7：顯示SEQ ID NO：31-Pvd-Fe複合物結構。來自不對稱單位的兩個SEQ ID NO：31分子，即鏈A和鏈B的重疊(overlay)。

圖8：顯示SEQ ID NO：31和Pvd-Fe相互作用。來自不對稱單位的兩個分子重疊。描繪了與Pvd-Fe相互作用的側鏈。

圖9：顯示了Pvd組成。框示了參與鐵結合的氧原子。

實施例1：綠膿桿菌鐵載體的純化和生物素化

綠膿桿菌生成三組綠膿桿菌螢光素，即綠膿桿菌螢光素I型、綠膿桿菌螢光素II型和綠膿桿菌螢光素III型。每組具有在作為琥珀醯基、琥珀酸醯胺基或α-酮戊二醯基的側鏈上不同的三種形式。另外，綠膿桿菌生成綠膿桿菌螯鐵蛋白。所有10種鐵載體可複合作為Fe³⁺的鐵。

為了選擇和篩選感興趣的突變蛋白，可以將鐵載體進行生物素化。對綠膿桿菌螢光素I琥珀醯基變體在琥珀醯基側鏈，對綠膿桿菌螢光素II琥珀醯基變體在L-鳥胺酸側鏈以及對綠膿桿菌螢光素III琥珀醯基變體主要在甘胺酸側鏈上進行生物素化。綠膿桿菌螯鐵蛋白在酚環上生物素化。

實施例2：選擇特異性結合綠膿桿菌鐵載體的突變蛋白

使用通過隨機誘變成熟hNGAL生成的基於hNGAL的文庫來選擇特異性結合綠膿桿菌的不同鐵載體的突變蛋白。在獨立的噬菌體展示和選擇過程中使用生物素化且加載有鐵的Pvd I琥珀醯基、Pvd II琥珀醯基和Pvd III琥珀醯基及生物素化的非加載有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白。

將2x10¹²個來自這些文庫的噬菌粒與200nM或500nM或1μM生物素化的靶物一起培養。使用用中性親合素(neutravidin)或鏈黴親合素塗覆的順磁性珠捕捉靶物/噬菌粒複合物，隨後將其用磁體分離。通過用PBST或PBS清洗珠除去未結合的噬菌粒。首先，用300μl 70mM三乙胺洗脫結合的噬菌粒 10分鐘，接著用100μl 1M Tris-Cl pH 6.0立即中和上清液。在一次立即清洗循環後，用100mM甘胺酸pH2.2洗脫剩餘的噬菌粒10分鐘，接著用50μl 0.5M Tris-堿立即中和。將這兩個洗脫級份合併，並且用於感染4ml大腸桿菌XL1-blue培養物(OD₅₅₀ 0.45-0.6)以進行再擴增。在攪拌下培養30分鐘後，通過以5000xg離心2分鐘收集細菌，在1ml 2xYT培養基中重懸，並且在三個大LB/Amp瓊脂板(10g/l細菌用胰蛋白腖，5g/l酵母提取物，5g/l NaCl，pH 7.5，15g/l瓊脂，100μg/ml胺苄青黴素)上鋪板。於32℃將板培養過夜。使用50ml補充有100μg/ml胺苄青黴素的2xYT培養基(2xYT/Amp)從瓊脂板刮下經感染的細胞。用合適體積的細菌懸浮液接種50ml 2xYT/Amp培養基以達到0.08的OD₅₅₀。於37℃在搖動器(160rpm)上培養培養物，直到達到0.5的OD₅₅₀，然後用輔助噬菌體(1.5x10¹¹pfu)通過於37℃在溫和攪拌的情況下培養15分鐘，並且在搖動器上培養45分鐘感染。隨後，添加卡那黴素到終濃度70μg/ml以選擇被輔助噬菌體感染的細菌。最後，通過添加25ng/ml無水四環素誘導pIII-hNGAL突變蛋白的表達。

在於24℃培養15小時後，通過離心(5000xg持續20分鐘)使培養物的上清液澄清。隨後，將20ml上清液通過具有0.22μm孔徑的聚醚碸膜。對濾液添加5ml含有水中的20%(w/v)PEG-8000和15%(w/v)NaCl的溶液，並且溫和混合。在冰上培養溶液30分鐘，之後於4℃和5000xg離心20分鐘。在含有200mM硼酸、160mM NaCl和1mM EDTA的1ml緩衝液中溶解含有噬菌粒的糰粒。通過離心(5000xg持續5分鐘)除去不溶性顆粒。將上清液轉移到新鮮管，並且與含有水中的20%(w/v)PEG-8000和15%(w/v)NaCl的200μl溶液混合。在冰上培養溶液30分鐘，隨後通過離心(5000xg持續5分鐘)收集沉澱的噬菌粒。在補充有50mM苯甲脒的PBS中重懸噬菌粒，並且用於下一輪噬菌粒選擇。

進行連續的4輪選擇。應用不同清洗條件：i)在所有4個循環輪次中對於每個清洗步驟，8次與1ml PBS/T培養5分鐘，ii)從輪次1至4增加的清洗循環的數目，iii)用5分鐘培養清洗步驟改變快速清洗步驟，並且清洗步驟的數目在輪次之間增加。

由用第四次選擇輪次的輸出感染的大腸桿菌細胞製備噬菌粒DNA，並且通過用BstX1消化DNA和隨後使用標準方法(Sambrook等，(1989)Molecular cloning：a laboratory manual)經由瓊脂糖凝膠電泳純化分離hNGAL突變蛋白盒。將hNGAL突變蛋白盒插入類似切割的載體，其允許在四環素啟動子的控制下的hNGAL突變蛋白的細菌生成。用連接混合物轉化CaCl₂感受態TG1-F’細胞，並在LB/Amp板上鋪板。

為了優化Pvd I、Pvd II、Pvd III和Pch特異性突變蛋白，基於突變蛋白SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和隨後SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：45產生額外的文庫。使用選擇位置的偏愛隨機化或基於易錯聚合酶鏈式反應(PCR)的方法產生文庫。突變蛋白的選擇如所述但以增加的嚴格性進行。

為了促進在真核細胞中表達，除去潛在的N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr)。

此外，引入突變以進一步優化穩定性。

實施例3：使用高通量ELISA篩選鑒定特異性結合相應的綠膿桿菌鐵載體的突變蛋白

使用個別的菌落接種2xYT/Amp培養基，並且培養過夜(14-18小時)至靜止期。隨後，從靜止期培養物中接種50μl 2xYT/Amp，並且於37℃培養3小時，然後轉變成22℃，直到達到0.6-0.8的OD₅₉₅。通過添加補充有1.2μg/ml無水四環素的10μl 2xYT/Amp誘導突變蛋白的生成。於22℃培養培養物到次日。在添加PBS/T中的40μl 5%(w/v)BSA並且於25℃培養1小時後，培養物準備好用於篩選測定法。

通過在微量滴定板上於4℃塗覆中性親合素和鏈黴親合素(在PBS中的5μg/ml)的1：1混合物過夜來測試分離的突變蛋白對相應的鐵載體靶物的特異性結合。在用PBST中的2% BSA封閉板1小時後，在經塗覆的微量滴定板上以PBS/T中的1.5-2.5μg/ml的濃度捕獲用於選擇的相應的生物素化的鐵載體靶物。在篩選中使用用生物素化的醛固酮(aldosterone)以相同的方式塗覆的板作為陰性對照靶物。隨後，將20μl經BSA封閉的培養物添加到含有捕獲的靶物或醛固酮的經塗覆的微量滴定板，並且於25℃培養1小時。在用與辣根過氧化物酶綴合的抗T7抗體(Merck KgaA,Darmstadt)或與辣根過氧化物酶綴合的抗-Strep標簽抗體(IBA,Boettingen)培養1小時後檢測結合的突變蛋白。為了量化，添加20μl QuantaBlu螢光過氧化物酶底物，並且在320nm的激發波長和430nm的發射波長測定螢光。然後，對特異性結合相應鐵載體靶物的突變蛋白測序。

為了選擇具有增加的親和力的突變蛋白，並且如下進行穩定性篩選：i)降低的抗原濃度和/或ii)與未生物素化的靶物競爭和/或iii)在添加到靶物板前於65℃或70℃培養篩選上清液和/或iv)使用反向篩選形式，在用抗Strep標簽抗體塗覆的微量滴定板上經由Strep標簽捕捉突變蛋白，並且添加不同濃度的生物素化的靶物，並且經由Extravidin-HRP(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)檢測。

實施例4：突變蛋白的表達

在2YT-Amp培養基中在大腸桿菌中表達具有C端序列SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：127；包括SA接頭和Strep-tag® II，WSHPQFEK(SEQ ID NO：128))的獨特突变蛋白以在表達後使用Streptactin親和層析純化突變蛋白，並且製備型大小排阻層析是適用的。

實施例5：在基於ELISA的背景中測定的突變蛋白對可溶性綠膿桿菌鐵載體的親和力

通過「溶液結合ELISA」測定突變蛋白的溶液結合，所述溶液結合ELISA的原理如下：將恒定濃度的測試突變蛋白與可變濃度的配體(Pvd I s、sa、aKG +/-Fe/Pvd IIs、sa、aKG +/-Fe/Pvd III s、sa、aKG +/-Fe/Pch +/-Fe)一起培養1小時。在溶液中進行此預培養後，將突變蛋白/配體混合物的等分試樣轉移到經由中性親合素固定化的生物素化的Pvd I s(+Fe)、Pvd II s(+Fe)、Pvd III s(+Fe)或Pch的ELISA板以測量游離突變蛋白的剩餘濃度。經由定量ELISA設置測定游離(非配體結合)突變蛋白的濃度。

詳細地，於4C以在PBS中的5μg/ml的濃度用20μl中性親合素塗覆適合於螢光測量的384孔板(Greiner FLUOTRAC^TM 600，黑色平底，高結合)過夜。在清洗後，於室溫用100μl含有0,1% Tween 20和2% BSA的封閉緩衝液(PBS-T/BSA)封閉經中性親合素塗覆的孔1小時。再次清洗後，於室溫添加1μg/mL濃度的封閉緩衝液中的20μl生物素化的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白達1小時，並且除去過多的試劑。

在溶液中將固定濃度的突變蛋白與不同濃度的配體(Pvd I s、sa、aKG +/-Fe/Pvd IIs、sa、aKG +/-Fe/Pvd III s、sa、aKG +/-Fe/Pch +/-Fe)(使用合適的起始濃度，其以1：3比率在PBS-T/BSA中連續向下稀釋到皮摩爾範圍)一起培養。於室溫培養1小時後，於RT將20μl反應混合物轉移到其上固定化有生物素化的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋的384孔板以捕捉未結合的(游離)突變蛋白達20分鐘。為了允許將ELISA讀出結果轉化成絕對游離突變蛋白濃度，在PBS-T/BSA中製備含有不同濃度的突變蛋白的標準曲線，並且也在相同的ELISA板上培養20分鐘。

棄去殘留的上清液，並且以PBS-T/BSA中的預先確定的最佳濃度添加20μl經HRP標記的抗hNGAL抗體，並且於RT培養1小時。已經通過用突變蛋白的混合物免疫兔獲得抗hNGAL抗體，隨後使用套盒(EZ-link Plus Activated Peroxidase,Thermo Scientific)根據製造商的用法說明將抗hNGAL抗體與HRP偶聯以獲得抗體-HRP綴合物。在清洗後，將20μl螢光HRP底物(QuantaBlu,Thermo)添加到每孔，並且允許反應進行15至60分鐘。使用螢光微板閱讀器(Tecan或Molecular Devices)讀出板上的每孔的螢光強度。為了評估數據，基於標準曲線結果計算游離的突變蛋白濃度c(突變蛋白)游離，並且相對於配體濃度c(配體)繪圖。為了獲得配體/突變蛋白複合物的形成被阻斷50%的配體濃度(IC50)，通過用單位元點結合模型的非線性回歸根據c(突變蛋白)_游離=c(突變蛋白)_tot/(1+c(配體)/IC50))擬合曲線，其中總示蹤劑濃度c(突變蛋白)_tot和IC50值為自由參數。使用GraphPad Prism 4軟件進行曲線擬合。

表1A-D中匯總了所得的IC₅₀值。針對生物素化的且加載有鐵的Pvd I琥珀醯基、Pvd II琥珀醯基和Pvd III琥珀醯基選擇的突變蛋白分別結合相應Pvd組的所有亞型，即針對生物素化的且加載有鐵的Pvd I琥珀醯基選擇的突變蛋白以相似的親和力結合具有或沒有複合鐵離子的Pvd I琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基，針對生物素化的且加載有鐵的Pvd II琥珀醯基選擇的突變蛋白以相似的親和力結合具有或沒有複合鐵離子的Pvd II琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基，並且針對生物素化的且加載有鐵的Pvd III琥珀醯基選擇的突變蛋白以相似的親和力結合具有或沒有複合鐵離子的Pvd III琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基。大多數選擇的突變蛋白以相當的親和力結合具有或沒有複合鐵離子的相應組的所有亞型。

針對生物素化的非加載有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白的選擇導致優選結合非加載有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白的脂籠蛋白突變蛋白，如以二位數至三位數nM親和力結合加載有鐵的Pch而以弱親和力結合或根本不結合非加載有鐵的Pch的脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：56和57，和脂籠蛋白突變蛋白，如優選結合加載鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白的SEQ ID NO：55。

SEQ ID NO：56的親和力優化產生以改善的親和力結合非加載有鐵的Pch並且仍以無或弱親和力結合加載有鐵的Pch的脂籠蛋白突變蛋白，而SEQ ID NO：55的親和力優化產生以超過75倍改善的親和力結合非加載有鐵的Pch，而且還以單位數nM親和力結合加載有鐵的Pch的脂籠蛋白突變蛋白。

如此，通過脂籠蛋白突變蛋白選擇和優化，實現了僅四種不同突變蛋白足以結合具有和沒有複合鐵離子的綠膿桿菌鐵載體的所有10種亞型(Pvd Is、sa、αKG +/- Fe；Pvd II s、sa、αKG +/- Fe；Pvd III s、sa、αKG +/- Fe；Pch +/- Fe)。

對於高通量親和力排序，然而以差異不大的配體濃度使用相同測定法。

實施例6：Biacore中測定的突變蛋白結合綠膿桿菌鐵載體的親和力

在基於表面等離振子共振(SPR)的測定法中，使用Biacore T200儀器(GE Healthcare)測量突變蛋白對具有複合鐵離子的綠膿桿菌螢光素I琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基或者對具有複合鐵離子的綠膿桿菌螢光素II琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基或對具有複合鐵離子的綠膿桿菌螢光素III琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基的結合親和力。應用適當過量的EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo,Cat# 21329)於室溫將選擇用於結合綠膿桿菌螢光素和陰性對照(SEQ ID NO：64)的突變蛋白生物素化2小時，然後是使用Zeba Spin Desalting Plate(Thermo,Cat# 21329)根據製造商的說明分離非起反應的生物素。

在SPR親和力測定法中，使用生物素捕捉套盒(GE Healthcare)在傳感器晶片CAP上捕捉生物素化的突變蛋白和陰性對照：傳感器晶片CAP預先固定化有ssDNA寡聚物。以2μl/分鐘的流速應用未稀釋的生物素捕捉試劑(與互補的ss-DNA寡聚物綴合的鏈黴親合素)達300秒。隨後，以5μl/分鐘的流速應用1μg/ml至100μg/mL生物素化的突變蛋白或陰性對照300秒。僅用生物素捕捉試劑加載參照通道。

為了測定結合親和力，在HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare)中製備範圍為5-2000nM的濃度的相應Pvd代表(Pvd I、II、III，包括琥珀醯基、琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基+Fe)的4至5個稀釋，並且應用到製備的晶片表面，應用30μl/分鐘的流速，以120-180秒的樣品接觸時間和900-2400秒的解離時間使用單個循環或多個循環動力學方法。使用高濃度(例如1200nM)的相應Pvd確認對陰性對照SEQ ID NO：64的結合的缺乏。在配體固定化後，對於使用單一循環動力學分析，在監測解離前以上升次序連續應用Pvd的所有4-5個濃度。對於使用多循環動力學分析，應用Pvd的4個稀釋，各自接著解離階段。於25℃進行所有測量。通過注射6M Gua-HCl及0.25M NaOH，接著是用運行緩衝液的額外清洗和120秒的穩定期實現傳感器晶片CAP表面的再生。用Biacore T200評估軟件(V 1.0)評估數據。使用雙重參照。使用1：1結合模型來擬合原始數據。

表2A-C中匯總了用於選擇脂籠蛋白突變蛋白的所得動力學常數。可以對每個Pvd組生成脂籠蛋白突變蛋白，其以亞nM至低的個位數nM範圍結合相應Pvd組的所有亞型。然而，Pvd特異性脂籠蛋白突變蛋白不結合野生型 hNGAL的天然配體Fe-腸菌素。

另外，使用上文描述的測定法通過對固定化突變蛋白應用高濃度(1 μM)的下述分析物確認對不屬相應綠膿桿菌螢光素亞組(I、II、III)的各種鐵載體及對MMP-9的結合的缺乏：Fe-腸菌素、去鐵胺、綠膿桿菌螯鐵蛋白、來自相應的其它亞組的綠膿桿菌螢光素、MMP-9原形式(proform)和活化的MMP-9。表3中提供了此分析的概述。

為了測定突變蛋白SEQ ID NO：62與Pch +Fe的相互作用的動力學常數和所得的KD，使用標準胺化學將突變蛋白或陰性對照SEQ ID NO：64在CM5晶片的表面上固定化。使用EDC和NHS活化晶片的表面。隨後，以10μl/分鐘的流速應用10mM乙酸鹽pH 4.0中的5μg/mL突變蛋白或陰性對照溶液，直到實現約2000 RU的高固定化水準。用乙醇胺淬滅殘留的活化基團。在乙醇胺後用EDC/NHS處理參照通道(空白固定化)。

為了測定親和力，在HBS-P+緩衝液中製備綠膿桿菌螯鐵蛋白(+Fe)的5個稀釋，並且應用到準備好的晶片表面。以接觸時間180秒，解離時間1200-1800秒並且應用30μl/分鐘的流速進行結合測定法。於25℃進行測量。通過三次連續注射10 mM Gly-HCl pH 1.5(120秒)，接著是用運行緩衝液的額外清洗和穩定期實現固定化突變蛋白表面的再生。用Biacore T200 Evaluation軟件(V 1.0)評估數據。使用雙重參照。使用1：1結合模型擬合原始數據。

表2D中顯示了SEQ ID NO：62所得的動力學常數。

使用相同測定法，通過對固定化突變蛋白SEQ ID NO：62應用高濃度(1μM)下述分析物確認對不同於綠膿桿菌螯鐵蛋白的鐵載體及對MMP-9的結合的缺乏：Fe-腸菌素、去鐵胺、綠膿桿菌螢光素、MMP-9原形式和活化的MMP-9。表3中顯示了結果的概述。

表2D：綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：62對複合有Fe³⁺的綠膿桿菌螯鐵蛋白的動力學常數。

實施例7：結合綠膿桿菌鐵載體的突變蛋白的功能性測試；抑制鐵攝取

為了測定活細菌中的功能性鐵攝取抑制，一定劑量範圍濃度的結合綠膿桿菌鐵載體的脂籠蛋白突變蛋白與Tris.HCl 50mM pH 8.0緩衝液中的100nM加載有放射性鐵的鐵載體培養1小時，之後與96孔板中於595nm終濃度為OD=1的細菌一起培養30分鐘。隨後，將細菌用細胞收穫器過濾通過與5%的聚乙烯亞胺溶液預培養的96孔板GF/B濾器，並且用Tris緩衝液清洗3次。在過濾和乾燥後，在計數前在每個濾器中添加30μl閃爍體混合物。對於鐵加載綠膿桿菌螢光素，將鐵載體在200μM最終溶液中以4比1的綠膿桿菌螢光素和鐵的比率與Tris緩衝液中的55Fe-Cl3一起培養15分鐘。對於用放射性鐵加載綠膿桿菌螯鐵蛋白，將HCl 0.5N中的40μl 0.25mM的55FeCl3溶液添加到1mM的綠膿桿菌螯鐵蛋白的甲醇溶液。在15分鐘培養時間後，添加940μl Tris HCl 50mM pH 8.0以獲得具有綠膿桿菌螯鐵蛋白和鐵之間2比1比率的20μM 55Fe-Pch溶液。如下製備細菌：將接種有分離的選殖株的Mueller Hinton培養基中的10ml過夜培養物離心，並且在25ml琥珀酸鹽培養基中重懸清洗過的糰粒，並且在搖動下培養2小時。平行地，給20ml Mueller Hinton培養基接種5ml過夜培養物，並且在搖動下培養2小時以用作背景鐵攝取水準。然後，離心25ml細菌培養物，並且用相應的培養基清洗，然後將糰粒在Tris.HCL 50mM pH8.0緩衝液中重懸，並且測量595nm的OD以在測定法中具有OD=1的終濃度。

對每個濃度點計算摻入百分比，並且用內部軟件計算抑制。對於此計算，鐵攝取的最大水準基於沒有任何脂籠蛋白突變蛋白的基本琥珀酸鹽培養基中獲得的數值，並且在不表達鐵載體受體的富Mueller Hinton培養基中獲得背景數值。

實施例8：結合綠膿桿菌鐵載體的突變蛋白的功能性測試；生長抑制

通過在具有透明底部的黑色96孔板中將補充有痕量元素溶液和0.1mg/ml BSA的經Chelex處理的琥珀酸鹽培養基中的結合綠膿桿菌鐵載體的突變蛋白與在595nm稀釋為0.05的最終OD的MS細菌培養物一起培養測定細菌生長抑制。於37℃將板培養過夜，每20分鐘搖動，並且在來自Thermo Labsystem的IEMS閱讀器MF中於595nm讀出OD。生長抑制在圖4A中對Pvd I菌株和Pvd I特異性突變蛋白SEQ ID NO：16，在圖4B中對Pvd II菌株和Pvd II特異性突變蛋白SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：36，在圖4C中對Pvd III菌株和Pvd III特異性突變蛋白SEQ ID NO：53以及在圖4D中對依賴綠膿桿菌螯鐵蛋白攝取鐵以生長的Pvd I剔除(△pvdA)菌株和綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性突變蛋白SEQ ID NO：62例示性顯示。對照是沒有脂籠蛋白突變蛋白情況下的細菌生長。

實施例9：突變蛋白的穩定性評估

為測定熔解溫度作為總體穩定性的一般指示，於1℃/分鐘使用毛細管nanoDSC儀(CSC 6300,TA Instruments)掃描PBS(Gibco)中蛋白質濃度1mg/ml的鐵載體特異性突變蛋白(SEQ ID NO：13-18；26，31-36；47-53；58-62)(25-100℃)。使用整合的Nano Analyze軟件從顯示的熱分析圖計算熔解溫度(Tm)。

下文表5A-D中列出了脂籠蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：13-18；26，31-36；47-53；58-62)的所得熔解溫度以及熔解的開始。對於所有Pvd組以及對於具有70℃的範圍中的Tm的pch脂籠蛋白突變蛋白，可以選擇範圍為68至74℃的針對每種Pvd類型和pch的最佳脂籠蛋白突變蛋白，指示良好的分子穩定性。

為了評估貯存和冷凍/融化穩定性，將PBS中濃度1mg/ml的突變蛋白於37℃培養1周或者進行3個冷凍/融化循環。在定量ELISA背景中測量活性突變蛋白。在分析型大小排阻層析中測量單體蛋白質。表6中顯示了SEQ ID NO：16、36、53、62的例示性數據。

為了測定蛋白質活性，應用下述ELISA：於4℃用PBS中5μg/ml濃度的20μL中性親合素(Thermo Scientific)塗覆適合於螢光測量的384孔板(Greiner FLUOTRAC^TM 600，黑色平底，高結合)過夜。在清洗後，用100μl封閉緩衝液(含有0.1% v/v Tween-20的PBS中的2% w/v BSA)將經中性親合素塗覆的孔封閉1小時。再次清洗後，添加封閉緩衝液中的1μg/ml濃度的20μl生物素化的且加載有鐵的綠膿桿菌螢光素I琥珀醯基、綠膿桿菌螢光素II琥珀醯基、綠膿桿菌螢光素III琥珀醯基或生物素化的綠膿桿菌螯鐵蛋白。清洗板並將20μl適當稀釋的蛋白質標準品，非應激(unstressed)參照樣品或應激(stressed)樣品轉移到ELISA板，並培養。為了定量板結合的蛋白質，清洗ELISA板，棄去殘留的上清液，並且在封閉緩衝液中以預先確定的最佳濃度添加20μl經HRP標記的抗hNGAL抗體，並培養。在清洗後，將20μl發螢光的HRP底物(QuantaBlu,Pierce)添加到每孔，並且允許反應進行20-30分鐘。使用螢光微板閱讀器(Tecan)閱讀板上的每孔的螢光強度。

除了另有敘述，所有培養步驟於室溫進行1小時，並且在每個培養步驟後，使用Biotek ELx405 Select CW清洗器用100μl PBS-T緩衝液(PBS,0.05% Tween 20)將板清洗5次。

對於上文描述的ELISA，製備校正曲線，包括通常範圍為0.008-500ng/mL的11個稀釋，並且對每個樣品製備校正曲線的線性範圍內的三個不同的獨立稀釋。使用任選補充有1%人或鼠血漿的封閉緩衝液進行稀釋。

使用4參數邏輯(4PL)非線性回歸模型擬合校正曲線，並且用於計算測試樣品的活性蛋白濃度。相對於在相同濃度並且在相同基質中貯存的非應激樣品參照測定的活性蛋白濃度。

以0.3mL/分鐘的流速使用PBS(Gibco)作為洗脫劑，在具有成排的兩個 Superdex 75 5/150 GL柱(GE Healthcare)的Agilent HPLC系統上進行分析型大小排阻層析。

為了評估血漿中的貯存穩定性，於37℃在人、小鼠和大鼠血漿中培養0.5mg/ml濃度的突變蛋白1周。在如描述的定量ELISA背景中測量活性突變蛋白。

證明瞭所有測試的脂籠蛋白突變蛋白在所有測試條件下是穩定的。

實施例10：小鼠模型中的脂籠蛋白突變蛋白的體內效力

研究靜脈內(i.v.)施用後的SEQ ID NO：19在小鼠的綠膿桿菌誘導的肺感染中的預防效果。

感染前1小時和感染時施用SEQ ID NO：19。在感染後24小時評估肺細菌載量。

本研究中使用的菌株是綠膿桿菌(ATCC27853)。從於-80℃貯存於PBS/15%甘油中的綠膿桿菌開始，於37℃在搖動下在Mueller-Hinton培養基中進行過夜培養，並且接著進行額外的傳代培養(100μl過夜培養物+100ml MHB)，直到對數生長期結束。將培養物清洗兩次，並且在磷酸鹽緩衝液鹽水中重懸，之後以1E+09 CFU/ml冷凍。對於每個實驗，融化新的管形瓶，並且通過活菌計數確認接種物。

在使用前允許購自Janvier laboratories,(Route des chênes secs,53940 Le Genest Saint Ile,France)的7至8周齡雄性Swiss小鼠(5只動物/組)馴化至少5天。於22±2℃的溫度以40-70%的相對濕度和12-15空氣新鮮交換/小時維持動物。光週期12/12小時：光照7 a.m.至7 p.m.(正常週期)。連續記錄溫度和相對濕度偏差。每籠容納5只動物，並且允許它們任意獲得水和標準飲食(AO4 C標準飲食(SAFE))。所有實驗在得到Sanofi R&D(CEPAL)的倫理委員會批准下進行。

通過用50μl NaCl 0.9%中的1.E+07 CFU/小鼠的綠膿桿菌鼻內攻擊雄性Swiss小鼠誘導肺感染。

在感染前1小時和感染時通過i.v.推注施用200、400、1000或2000μg/小鼠濃度的SEQ ID NO：19。

感染後24小時，對動物實施安樂死，並且測定來自肺勻漿物的細菌計數，並且以log10 CFU/ml作為均值±sem表示。

使用SAS v9.2進行統計學分析。Excel軟件2003用於圖呈現。SEQ ID NO：19劑量與媒介物的比較用單因素方差分析，接著是Dunnett檢驗評估(ZAR J.H.,«Biostatistical Analysis»,Prentice Hall International Editions,4ème édition,1999.；C.W.Dunnett,“A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control”,J.Amer.Statist.Assoc.,50(1955),pp.1096-1121,1955)。

在綠膿桿菌誘導的小鼠肺感染模型中，在細菌攻擊前1小時和當時施用SEQ ID NO：19，並且SEQ ID NO：19以劑量依賴性方式阻止小鼠中的感染形成。從200μg/小鼠開始，對SEQ ID NO：19觀察到顯著的預防效果，最大效果在2000μg/小鼠。

實施例11：結晶

為測定與Pvd-Fe複合的SEQID NO：31蛋白質的三維結構，應用下述方法。

在pET-24a質粒中選殖圖6中描繪的蛋白質序列，並且以有N端標簽的6His-TEV蛋白酶識別位點構建體表達。

使用質粒來轉化BL21(DE3)Star大腸桿菌細胞，並且將所得的選殖株在Overnight Express Instant TB培養基(Novagen)中接種，並且於18℃以200RPM攪拌培養47小時後在最終OD600 4.7時收穫細胞。在含有500mM NaCl、10mM咪唑、1mM MgCl₂、1mM TCEP、5%甘油和20mM Tris pH7.4的緩衝液中重懸細胞糰粒，並且通過標準超聲處理方法裂解該細胞糰粒。通過低速度離心使所得的提取物澄清，並且將上清液過濾通過22nm膜，之後加載到用100mM NaCl、10mM咪唑、100mM HEPES pH 8緩衝液預先平衡的Ni NTA(Qiagen)5ml柱。通過咪唑10mM至300mM的線性梯度洗脫蛋白質，並且進一步過夜透析到100mM NaCl、10mM咪唑、100mM HEPES pH 8緩衝液。將蛋白質濃縮到20mg/ml，並且加載到凝膠過濾Superdex 75柱(GE)。在存在TEV蛋白酶(1/50比率)的情況下將所得的蛋白質過夜透析到100mM NaCl、10 mM HEPES pH 8緩衝液以除去6His N-端標簽，接著進行如上文描述的負Ni NTA純化步驟以分離切割的蛋白質。將最終的蛋白質在100mM NaCl,50mM HEPES pH 7.5中濃縮到12mg/ml，等分取樣，在液氮中速凍，並且於-80℃貯存以進一步使用。

對於結晶，將蛋白質與10x倍高的摩爾濃度的Pvd-Fe一起培養過夜，並且鋪板以在SBS形式板中進行結晶篩選，其中在蒸汽擴散坐滴形式實驗中於20℃和4℃混合100nL蛋白質液滴與100nL結晶篩選溶液。檢出許多結晶命中，並且進一步優化結晶條件以獲得完全衍射x-射線質量晶體。

使用同步加速器x-射線源評估晶體衍射質量，並且在20% PEG3350和0.2M LiSO4條件下於20℃獲得最佳衍射晶體。通過將PEG3350濃度提高到35%低溫保護最佳晶體，然後在液氮中速凍，並且在100K溫度收集1.8Å數據集。

通過MOSFLM處理X-射線數據，並且通過使用pdb 1LKE作為搜索工具的分子替換方法測定蛋白質結構，並且將結構模型進一步精修到P41212中的R自由=0.233-R=0.200質量，每個不對稱單元具有2個三重蛋白質複合物。

蛋白質結構呈現具有與不對稱單元中存在的兩個突變蛋白蛋白質結合的Pvd-Fe的經典脂籠蛋白支架，圖7。圖8中分析並呈現了參與Pvd-Fe結合的胺基酸殘基。圖9中鑒定並呈現了直接結合Fe的Pvd的氧。

本發明涉及對綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合特異性的多肽，其中多肽包含以可檢出的親和力結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白。

在一個實施方案中，hNGAL突變蛋白在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145對應的一個或多個位置處包含突變胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，所述突變蛋白能夠以約20nM以下的K_D結合與鐵複合的綠膿桿菌螢光素I型，例如在通過基本上在實施例6中描述的測定法中的Biacore T200儀器測量時。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突變蛋白能夠以由約200nM以下的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的PvdI型琥珀醯基、PvdI型琥珀酸醯胺基和PvdI型a-酮戊二醯基，在基本上在實施例5中描述的ELISA測定法中測量時。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實施例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM以下的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素I型介導的鐵攝取。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實施例8中描述的測定法中抑制Pvd I菌株的細菌生長。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136對應的一個或多個位置處包含突變胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含至少一種下述突變胺基酸殘基：Leu 36→Asn、Thr、Val、Trp或Phe；Ala 40→Gly、Asn、Thr或Phe；Ile 41→Arg、Ala、Thr、Phe或Trp；Gln 49→Ile、Leu、Vla、Ala或Pro；Tyr 52→Met、Trp或Pro；Ser 68→Asp、Vla或Glu；Leu 70→Gln、Trp、Asp或Thr；Arg 72→Trp、Ala、Ser、Leu、Pro或Glu；Lys 73→Asp、Leu、Ala、Glu或Asn；Asp 77→Arg、Leu、Tyr、Ser、Gln、Thr、Ile或Asn；Trp 79→Gln、Asp、SerArg、Met或Glu；Arg 81→Gln、Gly、Ile、Glu、His或Asp；Asn 96→His、Ile、Gly、Tyr或Asp；Tyr 100→Lys、Glu、Asn、Ser、Phe或Tyr；Leu 103→Lys、Pro、Gln、His、Asp、Tyr、Glu、Trp或Asn；Tyr 106→His、Gln或Phe；Lys 125→Arg、Ser、Trp、Tyr、Val或Gly；Ser 127→Trp、Asn、Ala、Thr、Tyr、His、Ile、Val或Asp；Tyr 132→Trp、Asn、Gly或Lys；和Lys 134→Asn、 His、Trp、Gly、Gln或Asp。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下述取代：Gln 28→His；Lys 46→Glu；Thr 54→Vla或Ala；Ile 55→Vla；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp或Gln；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser或Asn；和Thr 136→Ala。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白在成熟人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個突變胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下組胺基酸取代之一：Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Gln；Arg 72→Trp；Lys 73→Asp；Asp 77→Leu；Trp 79→Gln；Arg 81→Gln；Cys 87→Ser；Asn 96→His；Tyr 100→Lys；Leu 103→His；Tyr 106→His；Lys 125→Arg；Ser 127→Trp；Tyr 132→Trp；Lys 134→Asp；Gln 28→His；Leu 36→Thr；Ala 40→Gly；Ile 41→Phe；Gln 49→Leu；Tyr 52→Trp；Leu 70→Trp；Arg 72→Ala；Lys 73→Leu；Asp 77→Tyr；Trp 79→Asp；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Glu；Leu 103→His；Tyr 106→Gln；Lys 125→Trp；Ser 127→Asn；Tyr 132→Asn；Lys 134→Gln；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly； Tyr 100→Asn；Leu 103→Lys；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ala；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Asn；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Met；Ser 68→Asp；Leu 70→Thr；Arg 72→Glu；Lys 73→Ala；Asp 77→Arg；Trp 79→Arg；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Tyr 100→Lys；Leu 103→Pro；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ser；Ser 127→Thr；Tyr 132→Trp；Lys 134→Gly；Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Phe；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Phe；Ile 41→Phe；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Trp；Arg 72→Leu；Lys 73→Asn；Asp 77→Gln；Trp 79→Glu；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Leu 103→Tyr；Tyr 106→His；Lys 125→Val；Ser 127→His；Tyr 132→Lys；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly； Tyr 100→Asn；Leu 103→Asp；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Val；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Thr；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Asn；Leu 103→Glu；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Asp；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Val；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Asn；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Vla；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Vla；Lys 59→Arg；Ser 68→Val； Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；Leu 36→Trp；Asn 39→Asp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Ala；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Vla；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；或Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Vla；Lys 59→Arg；Asn 65→Gln；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu； Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白包含選自SEQ ID NO：2-18的胺基酸序列或其片段或變體。

在另一個實施方案中，所述突變蛋白能夠以約20nM以下的K_D結合與鐵複合的綠膿桿菌螢光素II型，例如在通過基本上在實施例6中描述的測定法中的Biacore T200儀器測量時。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突變蛋白能夠以由約200nM以下的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的PvdII型琥珀醯基、PvdII型琥珀酸醯胺基和PvdII型a-酮戊二醯基，在基本上在實施例5中描述的ELISA測定法中測量時。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實施例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM以下的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素II型介導的鐵攝取。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實施例8中描述的測定法中抑制Pvd II菌株的細菌生長。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突变蛋白能夠在基本上在實施例9中描述的測定法中抑制表達綠膿桿菌螢光素II型的綠膿桿菌菌株的生長。

在另一個實施方案中，hNGAL突变蛋白在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134對應的一個或多個位置處包含突變胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含至少一種下述突變胺基酸殘基：Leu 36→Asn、Ile 或Val；Ala 40→Glu、Gly、Asn、Thr或His；Ile 41→Arg、Val orThr；Gln 49→Gly、Ala或Pro；Tyr 52→Asn、Gly、Trp或Pro；Ser 68→Asp、Arg或Glu；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His、Ile、Ala、Ser或Gly；Lys 73→Asn、Met、Pro、Phe、Gln或Arg；Asp 77→His、Ile、Met、Lys、Gly或Asn；Trp 79→Ser、Tyr、Ala、Asp、Phe或Trp；Arg 81→Glu、Ser、Tyr或Asp；Asn 96→Met、Ile、Arg、Asp、Lys、Asn或Ala；Tyr 100→Lys、Glu、Asn、Ser、Phe或Tyr；Leu 103→Thr、Ile、Gln、Gly、Met、His、Trp或Val；Tyr 106→Met、Gln、Ala、Ile、Asn、Gly、Met或Phe；Lys 125→Ala、Ile或Asn；Ser 127→Lys、Arg、Ser、Met、Asp或Asn；Tyr 132→Met、Phe、Asn、Ala、Ile、Gly或Val；和Lys 134→Trp或Tyr。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下述取代：Gln 28→His；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp或Gln和Cys 87→Ser。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白在成熟人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個突變胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，hNGAL突变蛋白與天然野生型hNGAL的線性多肽序列相比包含下組胺基酸取代之一：Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp； Gln 28→His；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Met；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Met；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Ile；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Pro；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gly；Tyr 106→Ala；Lys 125→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Ala 40→Asn；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ser；Lys 73→Gln；Asp 77→Met；Trp 79→Ala；Arg 81→Tyr；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Pro；Leu 103→Thr；Tyr 106→Ile；Lys 125→Lys；Ser 127→Met；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Ala 40→His；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Asp；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Asp；Leu 103→Met；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ala；Ser 127→Asp；Tyr 132→Asn；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Ser 68→Arg；Leu 70→Trp；Arg 72→Asn；Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Thr；Leu 103→Trp；Tyr 106→Asn；Lys 125→Asn；Ser 127→Met；Tyr 132→Ile；Lys 134→Tyr； Gln 28→His；Leu 36→Vla；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gly；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→Gly；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Trp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Gly；Lys 125→Lys；Ser 127→Asn；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→His；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Ala；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Gly；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly； Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Phe；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Met；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Gln；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly； Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；或Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白包含選自SEQ ID NO：19-37的胺基酸序列或其片段或變體。

在另一個實施方案中，所述突變蛋白能夠以約20nM以下的K_D結合與鐵複合的綠膿桿菌螢光素III型，例如在通過基本上在實施例6中描述的測定法中的Biacore T200儀器測量時。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突變蛋白能夠以由約200nM以下的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的PvdIII型琥珀醯基、PvdIII型琥珀酸醯胺基和PvdIII型a-酮戊二醯基，在基本上在實施例5中描述的ELISA測定法中測量時。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實施例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM以下的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素III型介導的鐵攝取。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實施例8中描述的測定法中抑制Pvd III菌株的細菌生長。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、105-106、125、127、132、134和145對應的一個或多個位置處包含突變胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含至少一種下述突變胺基酸殘基：Leu 36→Phe或Glu；Ala 40→Trp、Leu或Arg；Ile 41→Met、Arg、Ala、Leu orTrp；Gln 49→His、Ile、Arg、Lys、Met或Pro；Tyr 52→Asn、Tyr、Arg、Ser或Met；Ser 68→Asp、Asn、Glu或Gln；Leu 70→Lys、Asn或Arg；Arg 72→Leu、Arg、Gln或Tyr；Lys 73→His、Leu、Ala、Pro、Gln或Tyr；Asp 77→Ala、Ile、Lys、Gln或Arg；Trp 79→Ser或Asp；Arg 81→His、Ala、Ser或Val；Asn 96→Met、Ile、Arg、Gly、Leu或Val；Tyr 100→Ala、Ile、Asn、Pro或Asp；Leu 103→Gln、Gly、Phe或Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp或Thr；Ser 127→Val、His、Ile、Phe或Ala；Tyr 132→Phe；and Lys 134→Trp、Gln或Glu。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下述取代：Gln 28→His；Leu 42→Arg；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Asp 47→Asn；Asn 65→Asp；Cys 87→Ser；Ser 105→Pro和Thr 145→Pro。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白在成熟人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、105-106、125、127、132、134和145處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20或21個突變胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下組胺基酸取代之一：Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Met；Gln 49→His；Tyr 52→Asn；Ser 68→Glu；Leu 70→Lys；Arg 72→Gln；Lys 73→Ala；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→His；Tyr 132→Phe；Lys 134→Gln；Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Arg；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Tyr；Ser 68→Gln；Leu 70→Asn；Arg 72→Trp；Lys 73→Leu；Asp 77→Ala；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Ile；Leu 103→Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Thr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Leu；Ile 41→Leu；Gln 49→Arg；Tyr 52→Arg；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Leu；Lys 73→Tyr；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ala；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ala；Leu 103→Phe；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Ala；Lys 134→Glu；Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Pro；Asp 77→Arg；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Pro；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→ Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Ala；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Thr；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Arg；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Vla；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Tyr；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→-；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73 →His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；Gln 28→His；Leu36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→ Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；或Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Vla；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白包含選自SEQ ID NO：38-53的胺基酸序列或其片段或變體。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突變蛋白能夠以約20nM以下的K_D結合與鐵複合的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在通過基本上在實施例6中描述的測定法中的Biacore T200儀器測量時。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突变蛋白能夠以由約500nM以下的IC50值測量的親和力結合具有複合鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，在基本上在實施例5中描述的測定法中測量時。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突变蛋白能夠以由約200nM以下的IC50值測量的親和力結合沒有複合鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，在基本上在實施例5中描述的測定法中測量時。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突變蛋白能夠以由約200nM以下的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，在基本上在實施例5中描述的測定法中測量時。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實施例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM以下的IC50值抑制由綠膿桿菌螯鐵蛋白介導的鐵攝取。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實施例8中描述的測定法中抑制Pvd I剔除(△pvdA)的細菌生長。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141對應的一個或多個位置處包含突變胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含至少一種下述突變胺基酸殘基：Leu 36→His、Met或Val；Ala 40→Ile、Gln、Tyr或Phe；Ile 41→Leu、His orTrp；Gln 49→His、Arg、Ser或Ala；Tyr 52→Leu、Trp或Pro；Ser 68→Asp或His；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His、Ile、Ala、Ser或Gly；Lys 73→Asn、Met、Pro、Phe、Gln或Arg；Asp 77→Arg、Thr、Pro或Asp；Trp 79→Ala、Arg、Lys或Asp；Arg 81→Thr、Ile或Trp；Asn 96→Met、Asn、Pro或Ala；Tyr 100→Gly、His或Glu；Leu 103→Gly、Met、His或Gln；Tyr 106→Met、Gly、Arg或Trp；Lys 125→Trp、Phe、Gly或Leu；Ser 127→Arg、Trp、Asp或Ile；Tyr 132→Ala、Glu或Thr；and Lys 134→Leu、Val、Asn或Phe。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下述取代：Gln 28→His；Val 34→Leu；Glu 44→Gly；Asp 45→Gly；Lys→Arg或Tyr；Asn 65→Asp；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Val 108→Ala；Phe 123→Ser和Thr 141→Ala。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白在成熟人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、 132、134和141處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個突變胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含下組胺基酸取代之一：Gln 28→His；Ala 40→Ile；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Leu；Ser 68→His；Leu 70→Thr；Arg 72→Lys；Lys 73→Trp；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Lys 125→Trp；Ser 127→Asp；Tyr 132→Glu；Lys 134→Leu；Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Ala；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Arg；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Pro；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Arg；Lys 125→Leu；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ala；Lys 134→Asn；Gln 28→His；Vla 34→Leu；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→ His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Thr 141→Ala；Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Glu 44→Gly；Lys 46→Tyr；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Lys 74→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Val 108→Ala；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；或Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly； Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe。

在另一個實施方案中，多肽包含選自SEQ ID NO：54-63的胺基酸序列或其片段或變體。

在另一個實施方案中，多肽包含選自SEQ ID NO：2-63的胺基酸序列或其片段或變體。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突變蛋白包含取代野生型hNGAL的一個或多個胺基酸的一個或多個非天然半胱胺酸殘基。

在另一個實施方案中，所述hNGAL突變蛋白包含天然半胱胺酸殘基被另一種胺基酸的至少一個胺基酸取代。

在另一個實施方案中，所述另一種胺基酸是絲胺酸殘基。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白與選自下組的化合物綴合：有機分子、酶標記物、放射性標記物、有色標記物、螢光標記物、生色標記物、發光標記物、半抗原、洋地黃毒苷(digoxigenin)、生物素、細胞抑制劑、毒素、金屬複合物、金屬、和膠體金。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白在其N端和/或其C端與融合配偶體融合，所述融合配偶體是蛋白質或蛋白質域或肽。

在另一個實施方案中，hNGAL突變蛋白與延長多肽的血清半衰期的化合物綴合。

在另一個實施方案中，多肽包含選自下組的延長血清半衰期的化合物：聚亞烷基二醇分子、羥乙基澱粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白結合肽、和清蛋白結合蛋白。

在另一個實施方案中，聚亞烷基二醇是聚乙烯(PEG)或其活化的衍生物。

在另一個實施方案中，涵蓋包含編碼本文中提及的任何多肽的核苷酸序列的核酸分子。

在另一個實施方案中，核酸分子與調節序列可操作連接以允許所述核酸分子的表達。

在另一個實施方案中，核酸分子包含于載體中或噬菌粒載體中。

在另一個實施方案中，涵蓋含有本文中提及的任一種核酸分子的宿主細胞。

在另一個實施方案中，涵蓋生成本文中描述的任何多肽的方法，其中依靠遺傳工程方法，從編碼多肽的核酸開始生成多肽。

在另一個實施方案中，在細菌或真核宿主生物體中生成多肽，並且從此宿主生物體或其培養物中分離多肽。

在另一個實施方案中，涵蓋組合物，其包含一個或多個選自下組的多肽：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的多肽、(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的多肽、(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的多肽。

在另一個實施方案中，組合物包含兩種以上選自下組的多肽：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的多肽、(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的多肽、(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的多肽。

在另一個實施方案中，組合物包含三種或四種選自下組的多肽：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的多肽、(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的多肽、(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的多肽。

在另一個實施方案中，組合物包含對綠膿桿菌螢光素I型特異性的多肽。

在另一個實施方案中，組合物包含對綠膿桿菌螢光素II型特異性的多肽。

在另一個實施方案中，組合物包含對綠膿桿菌螢光素III型特異性的多肽。

在另一個實施方案中，組合物包含對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的多肽。

在另一個實施方案中，所述組合物進一步包含至少一種藥學可接受佐劑、稀釋劑或載體。

在另一個實施方案中，結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法包括對所述受試者施用有效量的本文中提及的任何組合物。

在另一個實施方案中，涵蓋用於抑制或降低受試者中的綠膿桿菌生長的方法，包括對所述受試者施用有效量的本文中提及的任何組合物。

在另一個實施方案中，涵蓋套盒，其包含一個或多個容器(分開或混合)和本文中提及的任何組合物。

在另一個實施方案中，涵蓋(i)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素I型的本文中提及的任何多肽的多肽、(ii)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素II型的本文中提及的任何多肽的多肽、(iii)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素III型的本文中提及的任何多肽的多肽和/或(iv)根據能夠結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的本文中提及的任何多肽的多肽，用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途。

在另一個實施方案中，涵蓋(i)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素I型的本文中提及的任何多肽的多肽、(ii)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素II型的本文中提及的任何多肽的多肽、(iii)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素III型的本文中提及的任何多肽的多肽和/或(iv)根據能夠結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的本文中提及的任何多肽的多肽，用於防止或降低受試者中由綠膿桿菌經由綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠膿桿菌螢光素的鐵攝取的用途。

在另一個實施方案中，涵蓋(i)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素I型的本文中提及的任何多肽的多肽、(ii)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素II型的本文中提及的任何多肽的多肽、(iii)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素III型的本文中提及的任何多肽的多肽和/或(iv)根據能夠結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的本文中提及的任何多肽的多肽，用於治療或減輕受試者中的綠膿桿菌生物膜感染的用途。

在另一個實施方案中，铜绿假单胞菌生物膜感染是急性或慢性感染。

在另一個實施方案中，組合施用所述第一、第二、第三和/或第四多肽，包括同時、伴隨或連續。

在另一個實施方案中，所述第一、第二、第三和/或第四多肽彼此獨立施用，包括在獨立的時間點時以個別的時間間隔。

在另一個實施方案中，組合包含(i)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素I型的本文中提及的任何多肽的多肽、(ii)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素II型的本文中提及的任何多肽的多肽、(iii)根據能夠結合綠膿桿菌螢光素III型的本文中提及的任何多肽的多肽和/或(iv)根據能夠結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的本文中提及的任何多肽的多肽。

本文中例示性描述的實施方案可以在缺乏本文中沒有明確揭示的任何一種要素、限制的情況下適當實施。如此，例如，術語「包含」、「包括」、「含有」等應當廣泛且不受限閱讀。另外，本文中採用的術語和表述已經作為描述的術語使用而不是限制的，並且在使用此類術語和表述中不意圖排除顯示和描述的特徵或其部分的任何等同物，但是認可各種修改在要求保護的發明的範圍內是可能的。如此，應當理解，雖然本實施方案已經通過優選的實施方案具體揭示，本領域技術人員會訴諸于其任選的特徵、修改和變型，並且認為此類修改和變型在發明的範圍內。本文中描述的所有專利、專利申請、教科書和同行評審出版物在此通過提及完整併入。此外，在參考文獻(其通過提及收入本文)的定義和術語使用與本文中提供的該術語的定義不一致或衝突的情況下，適用本文中提供的該術語的定義，並且不適用參考文獻中的該術語的定義。落入一般揭示內的每個較窄的種類和子類分組也形成本發明的部分。這包括本發明的一般描述，具有從類別除去任何主題的條件或負面限制，不管本文中明確敘述除去的材料與否。另外，在特徵按馬庫斯組描述的情況下，本領域技術人員會認可揭示內容因此也按照馬庫斯組的任何個別成員或成員亞組描述。其它實施方案從所附申請專利範圍會變得明顯。

<110> 賽諾菲公司

<120> 對於螢光鐵載體及綠膿桿菌螯鐵蛋白具特異性之新穎蛋白

<130> DE2015/028

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<400> 99

<210> 100

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0474.01H22_N65Q

<400> 100

<210> 101

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.14D07

<400> 101

<210> 102

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.05N20

<400> 102

<210> 103

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.16B14

<400> 103

<210> 104

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.15E20

<400> 104

<210> 105

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.13C10

<400> 105

<210> 106

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0510.11H24

<400> 106

<210> 107

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.01M12_X103Q

<400> 107

<210> 108

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.01F10_X103Q

<400> 108

<210> 109

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0510.10A04_X103Q

<400> 109

<210> 110

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07G09

<400> 110

<210> 111

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07K20

<400> 111

<210> 112

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07K21

<400> 112

<210> 113

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07G09_N65D

<400> 113

<210> 114

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07K20_N65D

<400> 114

<210> 115

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07K21_N65D

<400> 115

<210> 116

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07G09_H28Q_N65D

<400> 116

<210> 117

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04F12

<400> 117

<210> 118

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04F23

<400> 118

<210> 119

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04F09

<400> 119

<210> 120

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04M08

<400> 120

<210> 121

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.15K24

<400> 121

<210> 122

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0527.05N11

<400> 122

<210> 123

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05A05

<400> 123

<210> 124

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05M06

<400> 124

<210> 125

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05A05_H28Q_N65D

<400> 125

<210> 126

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05M06_N65D

<400> 126

<210> 127

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變蛋白的C-末端序列

<400> 127

<210> 128

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SA接頭和Strep標簽II

<400> 128

<210> 129

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表達的蛋白氨基酸序列

<400> 129

<210> 130

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 位置95-98

<400> 130

<210> 131

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 清蛋白結合肽的例子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是下列任一種：Asp,Asn,Ser,Thr，或Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是下列任一種Asn,Gln,His,Ile,Leu，或Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是下列任一種：Ala,Asp,Phe,Trp，或Tyr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是下列任一種：Asp,Gly,Leu,Phe,Ser，或Thr

<400> 131

<210> 132

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接頭

<400> 132

<210> 133

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶切割位點

<400> 133

Claims

一種對綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合特異性的多肽，其中所述多肽包含以可檢出的親和力結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白。
根據請求項1的多肽，其中hNGAL突變蛋白包含在對應於下述位置的一個或多個位置處的突變胺基酸殘基：成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145。
一種核酸分子，其包含編碼根據請求項1的多肽的核苷酸序列。
一種宿主細胞，其含有根據請求項3的核酸分子。
一種產生根據請求項1或2中任一項的多肽的方法，其中依靠遺傳工程方法從編碼所述多肽的核酸開始產生所述多肽。
一種組合物，其包含一種或多種選自下組的多肽：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的多肽。
一種結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法，其包括對所述受試者施用有效量的根據請求項6的組合物。
一種試劑盒，其在一個或多個容器中分開或混合包含和根據請求項6的組合物。
一種(i)能夠結合綠膿桿菌螢光素I型的根據請求項1的多肽、(ii)能夠結合綠膿桿菌螢光素II型的根據請求項1的多肽、(iii)能夠結合綠膿桿菌螢光素III型的根據請求項1的多肽及/或(iv)能夠結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的根據請求項1的多肽的用途，其用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白。
一種(i)能夠結合綠膿桿菌螢光素I型的根據請求項1的多肽、(ii)能夠結合綠膿桿菌螢光素II型的根據請求項1的多肽、(iii)能夠結合綠膿桿菌螢光素III型的根據請求項1的多肽及/或(iv)能夠結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的根據請求項1的多肽的用途，其用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白以預防或降低受試者中由綠膿桿菌經由綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠膿桿菌螢光素的鐵攝取。
一種(i)能夠結合綠膿桿菌螢光素I型的根據請求項1的多肽、(ii)能夠結合綠膿桿菌螢光素II型的根據請求項1的多肽、(iii)能夠結合綠膿桿菌螢光素III型的根據請求項1的多肽和/或(iv)能夠結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的根據請求項1的多肽的用途，其用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白以治療或減輕受試者中的綠膿桿菌生物膜感染。
一種二或更多種根據請求項1或2中任一項的多肽的組合。