TW201524994A - Ｐｃｓｋ９新穎結合蛋白 - Google Patents

Abstract

本發明涉及與PCSK9結合的新穎脂質運載蛋白突變蛋白。本發明亦提供編碼脂質運載蛋白突變蛋白的對應核酸分子，以及產生脂質運載蛋白突變蛋白以及其編碼核酸分子的方法。

Description

PCSK9新穎結合蛋白

本發明涉及與PCSK9結合的新穎脂質運載蛋白突變蛋白。

人類前蛋白轉換酶枯草桿菌蛋白酶/kexin蛋白酶第9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是一種主要表現於腎臟、肝臟與腸內的分泌蛋白。其具有三個結構域：一抑制型前結構域(第1-152個胺基酸；包括一位於第1-30個胺基酸的訊息序列)、一絲胺酸蛋白酶結構域(或催化結構域；位於第153-448個胺基酸)，以及一長度為210個胺基酸殘基(位於第449-692個胺基酸)的C端結構域(或富含半胱胺酸/組胺酸的結構域)，其富含半胱胺酸殘基。合成PCSK9以作為在內質網內的該前結構域與催化結構域之間歷經自催化裂解的酶原。該前結構域與裂解後的成熟蛋白結合，且該複合物會被分泌。該富含半胱胺酸的結構域可能扮演類似於其他Furin蛋白酶/kexin蛋白酶/枯草桿菌蛋白酶樣的絲胺酸蛋白酶的P-(加工)結構域，其似乎對於該活化的蛋白酶的摺疊與調節而言是必需的。

PCSK9為絲胺酸蛋白酶的蛋白酶K分泌枯草桿菌蛋白酶樣的次家族成員之一(Naureckiene等人，2003年，生物化學與生物物理資料庫期刊，第420卷：第55-67頁)，且其作用為一肝低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptors，LDL-R)的強負調節者。PCSK9在經由控制在血流中循環的低密度脂蛋白(LDL)顆粒的膽固醇代謝作用中具有重要的作用。PCSK9 含量的上升已被證實在肝臟中降低低密度脂蛋白受體(LDL-R)的含量，從而導致在血漿中具有高含量的低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-c)且對冠狀動脈疾病的感受性增加。(Peterson等人，脂質研究期刊，第49卷第7期：第1595-9頁，2008年)。

低密度脂蛋白受體(LDL-R)透過清除在血流中的低密度脂蛋白(LDL)來預防動脈粥狀硬化與高膽固醇血症。LDL-R在轉譯後的含量由PCSK9所調節。PCSK9基因剔除鼠顯現出在血漿中的LDL-c的含量減少約50%且增加對他汀類藥物(statins)在減少血漿中LDL-c含量的感受性(Rashid S等人，2005年，美國國家科學院院刊，第102卷：第5374-5379頁)。人類的基因資料也支持PCSK9在體內恆定的作用。PCSK9的突變與血漿中LDL-c含量的異常有關(Horton等人，2006年，生物化學科學趨勢，第32卷第2期：第71-77頁)。最近被辨識出的兩個突變據推測是PCSK9「喪失功能」的突變。帶有這些突變的個體在血漿中的LDL-c含量減少約40%，其換算後為減少約50-90%的冠狀心臟疾病。

因此，製造對PCSK9活性造成拮抗且阻斷或減少在各種病理狀態中PCSK9所具有的相關作用之PCSK9的抑制劑將會是非常有利的。

定義：下表定義整個說明書中使用的術語、用語，以及縮寫。所有在本文中列出及定義術語係用以含括所有文法形式。

如本文所用，「脂質運載蛋白」乙詞意指以其超級二級結構所定義的多胜肽，即圓柱狀β褶板超級二級結構區域，包含由在一端的四個環而成對結合的八個β鏈從而定義一結合口袋。脂質運載蛋白(Pervaiz與 Brew，FASEB期刊，第1卷(1987年)，第209-214頁)為一個小的家族，通常為單體分泌蛋白，其已經在不同生物體中被分離出來(Flower，生物化學期刊，第318卷(1996年)，第1-12頁)。脂質運載蛋白承受相對小的相對序列相似度，且首先經由X-射線結構分析闡明其屬於同一蛋白結構家族(Sawyer等人，自然期刊，第327卷(1987年)，第659頁)。

在這方面，如本文所用之一「脂質運載蛋白突變蛋白」意指一衍生自一脂質運載蛋白且具有一圓柱狀β褶板超級二級結構區域，包含由在一端的四個環而成對結合的八個β鏈從而定義一結合口袋的突變蛋白，其中至少三個所述的四個環中的每一個環的至少一胺基酸已經突變(見，例如，PCT公開本WO 1999/16873)。在某些特定具體實施例中，所述脂質運載蛋白突變蛋白可能衍生自人類淚液脂質運載蛋白。然而，在某些其他特定具體實施例中，所述脂質運載蛋白突變蛋白可能衍生自一人類淚液脂質運載蛋白以外的脂質運載蛋白。

如本文所用，「個體」乙詞包括任何脊椎動物如，哺乳動物。哺乳動物包括，但不限於，家畜(如，乳牛、綿羊、貓、狗，以及馬)、靈長類動物(如，人類與非人類靈長類動物例如猴子)、兔，以及嚙齒類動物(如，小鼠與大鼠)。在某些具體實施例中，該個體或受試者為人類。

如本文所用之「前蛋白轉換酶枯草桿菌蛋白酶kexin蛋白酶第9型」(「PCSK9」可與「NARC-1」互換使用)意指來自任何脊椎動物來源的任何天然的PCSK9，包括哺乳動物例如靈長類動物(如人類)與嚙齒類動物(如，小鼠與大鼠)，除非另有說明。該術語涵蓋「全長」未加工的PCSK9，以及在細胞內加工所造成的任何形式的PCSK9，或任何其片段。該術語也 涵蓋PCSK9自然發生的變異體，如剪接變異體或等位基因變異體。

如本文所用之「載體」乙詞意指能夠增殖其他與其連接之核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入將其引入到的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導其被操作性連結的核酸序列的表現。這類載體在本文中稱為「表現載體」。

圖1：提供了以表面電漿子共振以測量脂質運載蛋白突變蛋白序列辨識碼(SEQ ID NO)：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6以及SEQ ID NO：11的結合速率與解離速率之典型測量。所得之對人類PCSK9(「hPCSK9」)(SEQ ID NO：34)的解離常數(K_D)、關聯速率(k_on)，以及該解離速率(k_off)係摘要於實施例6的表1中。

圖2：證明脂質運載蛋白突變蛋白SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8能夠阻斷PCSK9與其受體LDL-R之間的交互作用。無論是生物素化的hPCSK9(圖2A)或生物素化的hPCSK9_D374Y突變蛋白(圖2B)以可變濃度的所述突變蛋白預先培養，且在一ELISA盤上以固定化的可溶LDL-R定量未中和的PCSK9。負對照組SEQ ID NO：2不具有競爭效果。數據係配合一單點結合模型。所得之IC50值係摘要於實施例7的表2中。

圖3：顯示以一ELISA形式測量SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：9的脂質運載蛋白突變蛋白的交叉反應概況。脂質運載蛋白突變蛋白對 hPCSK9_D374Y突變體以及對石蟹獼猴PCSK9的完整交叉反應由幾乎相同的K_D值所顯現(見表3)。在測試的濃度範圍內，對小鼠PCSK9也具有交叉反應，但親和力較低。負對照組(SEQ ID NO：2)則未偵測到結合反應。數據係配合一單點結合模型。

圖4：闡釋了在一以細胞為基礎的分析中，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8的脂質運載蛋白突變蛋白能有效的阻斷hPCSK9與其受體LDL-R的結合。該分析係基於在HepG2細胞上由PCSK9誘導的LDL-R的內化作用而導致螢光標定的Dil-LDL的胞內吸收減少。細胞係與一固定濃度(100nM)的hPCSK9培養，且以該脂質運載蛋白突變蛋白進行滴定分析。將使用一BMG PheraStar讀取儀在485/535nm波長下測量的胞內Dil-LDL的標準化螢光訊號對脂質運載蛋白突變蛋白的濃度繪製成圖。所得之SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8的脂質運載蛋白突變蛋白IC50值列於表4中。脂質運載蛋白突變蛋白對PCSK9的結合恢復了由PCSK9調解還原的Dil-LDL攝取至細胞內，而SEQ ID NO：2的負對照組則無影響。藉由GraphPad Prism 4軟體，以非線性迴歸”S型劑量-反應、可變斜率”模型擬合曲線(5PL擬合)。以PCSK9刺激及未刺激細胞的值進行數據標準化。

圖5：提供了以表面電漿子共振以測量SEQ ID NO：13(圖5C)、SEQ ID NO：20(圖5A)以及SEQ ID NO：21(圖5B)的脂質運載蛋白突變蛋白對hPCSK9的結合與未結合之結合速率與解離速率之典型測量。所得之解離常數(K_Ds)係摘要於表5中(見實施例10)。

圖6：提供了以表面電漿子共振以測量脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：20)對各種PCSK9物種的結合與未結合之結合速率與解離速率之典型測量。所得之脂質運載蛋白突變蛋白SEQ ID NO：20以及其他突變蛋白的解離常數(K_D)係摘要於表6中(見實施例11)。

圖7：證明了SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31以及SEQ ID NO：32的PEG化版本的脂質運載蛋白突變蛋白能夠與hPCSK9結合，且其IC50值分別為0.19、0.53以及0.37nM，相似於SEQ ID NO：13的未修飾之脂質運載蛋白突變蛋白，其IC50值為0.16nM。生物素化的hPCSK9以可變濃度的脂質轉載蛋白突變蛋白預先培養，且在一ELISA盤上以一固定之基準抗體(其輕鏈係以SEQ ID NO：29表示，而其重鏈係以SEQ ID NO：33表示)定量未中和的PCSK9，其被用於作為正對照組以與脂質轉載蛋白突變蛋白競爭與hPCSK9的結合。數據係配合一單點結合模型。

圖8：證明在一以細胞為基礎的LDL-R消耗分析中，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：13以及SEQ ID NO：20的脂質運載蛋白突變蛋白及其各別之PEG化的變異體SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31以及SEQ ID NO：32能夠阻斷hPCSK9的生物活性。在LDL匱乏的HepG2細胞上將連續稀釋的受測之脂質運載蛋白突變蛋白以及SEQ ID NO：2的負對照組與一恆定濃度的hPCSK9共同培養。使用一特定之山羊抗-hLDL-R抗體(R&D型號AF2148)分析在該HepG2表面上的LDL-R含量。由PCSK9誘導之最大LDL-R內化作用被設定為100%。脂質運載蛋白突變蛋白的加入以依賴劑量的方式阻斷PCSK9的活性。就此而言，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：13以及SEQ ID NO：20的脂質運載蛋白突變蛋白的IC50值分別為76nM、103nM以及91nM。因此，PEG化作用並不影響脂質運載蛋白突變蛋白的阻斷能力，因為該PEG化的脂 質運載蛋白突變蛋白的IC50值(分別包含SEQ ID NOs：30-32，其代表本發明之三個脂質運載蛋白突變蛋白的變異體之胺基酸序列，但不包括該聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)分子的序列)與其各自未PEG化的形式(分別為SEQ ID NOs：13、20以及22)並無不同。SEQ ID NO：2的負對照組對PCSK9的活性則無影響。總之，該脂質運載蛋白突變蛋白抑制PCSK9的生物活性，因此恢復了在該細胞表面的LDL-R。數據係配合一S型劑量反應模型。

圖9：顯示編碼一含有OmpA訊號序列(OmpA)與一人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白接著該Strep標記II的融合蛋白之表現載體pTLPC26(亦稱為pTlc26)。標示用於選殖該突變基因匣的兩個BstXI限制酶切位以及位於該結構基因側翼的限制酶切位。在四環黴素啟動子/操縱子(tet^p/o)的控制下表現基因。轉錄作用終止於該脂蛋白轉錄作用終止子(t_lpp)。該載體進一步包含一複製起始點(ori)、絲狀噬菌體f1的基因間區域(f1-IG)、胺苄青黴素抗性基因(amp)以及四環黴素抑制基因(tetR)。pTLPC26的核酸序列的一相關片段列於SEQ ID NO：35。該片段始於該XbaI限制酶切位且終於該HindIII限制酶切位。在該區域外的載體元素與載體pASK75相同，其完整的核苷酸序列示於德國專利公開本DE 44 17 598 A1中。

圖10：描述某些以人類淚液脂質運載蛋白為基礎的突變蛋白的胺基酸序列(列於SEQ ID NOs：2-28)與成熟人類淚液脂質運載蛋白的多胜肽序列(SEQ ID NO：1)比較的序列排列。

圖11：圖11A提供實施例3中胺基酸編碼的預期分佈。注意，為了清楚起見，具有少於1%的頻率的所有胺基酸皆省略；因為在此噬菌體展示過程中使用一密碼子抑制因子菌株TG1 F，故琥珀終止密碼子(TAG)被當作編碼 麩醯胺酸。此外，自成熟基因庫(圖11B與圖11C)的定序得到的實驗數據顯示，預期與實驗的分佈之間具有良好的吻合，儘管絲胺酸的頻率高出預期，反映出不論是透過PCR進行的寡核苷酸合成或寡核苷酸組裝的偏差。與此發現一致的是，實驗獲得的二個基因庫(圖11E與圖11F)的突變分佈頻率與理論上預期的分佈(圖11D)接近，但移向一較低之頻率。

圖12：描述一代表脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：13以及SEQ ID NOs：63-65)的熔解曲線疊加圖的溫度記錄圖，係獲自使用一毛細管nanoDSC儀(Q2000，TA儀器公司)進行一奈米差異化掃描熱量計(“nanoDSC”)測量。與SEQ ID NO：13相較，熱穩定之衍生物(SEQ ID NOs：63-65)的熔解曲線顯著地位移。

圖13：提供了以表面電漿子共振以測量脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NOs：62-71)的結合速率與解離速率之典型測量。圖13A-圖13J分別對應於SEQ ID NOs：62-71。所得之對人類PCSK9(「hPCSK9」)(SEQ ID NO：34)的解離常數(KD)、關聯速率(kon)，以及該解離速率(koff)係摘要於實施例17的表10中。

圖14：描述某些以人類淚液脂質運載蛋白為基礎的突變蛋白的胺基酸序列(列於SEQ ID NOs：13、22、62-71)與成熟人類淚液脂質運載蛋白的多胜肽序列(SEQ ID NO：1)比較的序列排列。

在一方面，本發明提供與前蛋白轉換酶枯草桿菌蛋白酶 /kexin蛋白酶第9型或PCSK9結合的人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白。在某些具體實施例中，該脂質運載蛋白突變蛋白對PCSK9具有高親和力。作 為本發明之突變蛋白的目標的PCSK9一般而言為一哺乳動物蛋白，例如，一非人類靈長類動物蛋白或一人類蛋白。全長人類PCSK9具有如SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列。

本發明之脂質運載蛋白突變蛋白亦能夠與PCKS9的免疫原性片段結合。PCKS9的免疫原性片段為具有一或多個抗原決定位、模擬抗原表位或其他抗原決定子的片段，且因此可以誘發免疫反應或提升對抗其之抗體。該免疫原性片段可包括單一抗原決定位或可具有複數個抗原決定位。因為一抗原呈現系統，如一載體蛋白，可被用於提供被一免疫系統辨識所需的尺寸，因此沒有具體的尺寸限制適用於該免疫原性片段。因此，該免疫原性片段亦可為一「半抗原」，亦即一本身不需具有抗原性或可能具有低免疫原性的片段，具體而言因為該片段的小分子量以及相對應之尺寸。一般而言，一免疫原性片段可以單獨或當於一載體上呈現時，由一免疫球蛋白結合。PCSK9的免疫原性片段一般可與LDL-R交互作用，從而調節在血流中循環的低密度脂蛋白(LDL)顆粒。在某些具體實施例中，PCSK9的免疫原性片段保留了其全長配體被根據本發明之一脂質運載蛋白突變蛋白辨識及/或結合的能力。例如，該免疫原性片段可為一N端及/或C端縮短的蛋白或胜肽。

在不同的具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可以與一非人類靈長類動物的PCSK9(例如，石蟹獼猴PCSK9或黑猩猩PCSK9)或其具有可偵測之親和力，亦即具有至少200nM的解離常數(K_D)，的免疫原性片段結合。在某些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可與一非人類靈長類動物的PCSK9或其具有一解離常數(K_D)等於或小 於約10nM、約1nM或約0.3nM的免疫原性片段結合。在不同的具體實施例中，抗原結合部分與小鼠的PCSK9或其具有一解離常數(K_D)等於或小於約10nM、約1nM或約0.5nM的免疫原性片段結合。

在不同的具體實施例中，本發明之一或多個脂質運載蛋白突變蛋白可以與一人類的PCSK9或其具有可偵測之親和力，亦即具有至少200nM的解離常數(K_D)，的免疫原性片段結合。在某些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可與一人類的PCSK9或其具有一解離常數(K_D)等於或小於約10nM、約1nM、約0.1nM、約0.5nM、約0.25nM、約10pM或甚至更少的免疫原性片段結合。

在某些進一步的具體實施例中，與人類的PCSK9或其免疫原性片段結合的一或多個脂質運載蛋白突變蛋白的結合親和力已被發現具有低於0.1nM的解離常數(K_D)，且在某些具體實施例中，該解離常數(K_D)等於或小於約1皮莫耳(picomolar，pM)(見圖7)。

脂質運載蛋白突變蛋白對一選定之目標，在本例中為PCSK9，的結合親和力可以被測量，從而以本領域技術人員已知的多種方法決定一突變蛋白配體複合物的解離常數(K_D)值。這些方法包括，但不限於，螢光滴定、競爭性ELISA、量熱法，例如等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry，ITC)，以及表面電漿子共振(BIAcore)。這些方法的實施例詳述如下(見，如，實施例7)。

在一具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可作為PCSK9的拮抗劑。如本文所用，「PCSK9的拮抗劑」乙詞意指能夠干擾PCSK9與LDL-R之間的結合的試劑。在某些情況下，PCSK9的拮抗劑可由其完全 或部分抑制PCSK9與LDL-R之間的結合的能力而被辨識。

此外，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可與LDL-R競爭與PCSK9的結合(見實施例7)。

此外，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可與含有SEQ ID NO：29以及SEQ ID NO：33的單株抗體競爭與PCSK9的結合(見實施例12)。

在另一具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白能夠完全或部分抑制由PCSK9調解的LDL-R的表現向下調控。與存在一對照組或缺乏本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的情況下由PCSK9調解的LDL-R的表現向下調控相比，當暴露於本發明之脂質運載蛋白突變蛋白時，抑制的發生，例如，由PCSK9調解的LDL-R的表現向下調控，為至少低於約10%，例如至少低於約25%、50%、75%，或完全地抑制。在某些進一步的具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白能夠以劑量依賴的方式來抑制由PCSK9調解的LDL-R的表現向下調控。在某些進一步的具體實施例中，由PCSK9調解的LDL-R的表現向下調控的抑制可在一以HEPG2細胞為基礎的分析中被證實，如實施例13中實質地描述。

在另一具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可在PCSK9存在的情況下恢復LDL的攝取。在某些進一步的具體實施例中，在PCSK9存在的情況下LDL攝取的恢復可在一以HEPG2細胞為基礎的分析中被證實，如實施例11中本質地描述。在某些進一步的具體實施例中，為了設定該分析，HEPG2細胞可與固定濃度的hPCSK9(如100nM)一同培養，然後可與一或多個脂質運載蛋白突變蛋白進行滴定。

PCSK9可用於定義人類淚液脂質運載蛋白的一非天然配 體。「非天然配體」乙詞意指一化合物，在生理條件下其不與成熟人類淚液脂質運載蛋白結合。如本文所使用，「人類淚液脂質運載蛋白」乙詞意指對應於SWISS-PROT資料庫登錄號P31025的蛋白的成熟人類淚液脂質運載蛋白，而該成熟人類淚液脂質運載蛋白(SEQ ID NO：1)並不包括含括在該SWISS-PROT登錄號P31025的序列之N端訊號胜肽。

本發明之突變蛋白的胺基酸序列與成熟人類淚液脂質運載蛋白(SEQ ID NO：1)具有高序列辨識度。在此背景下，本發明之突變蛋白的胺基酸序列可實質上相似於成熟人類淚液脂質運載蛋白的胺基酸序列。本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的相應序列，與成熟人類淚液脂質運載蛋白的序列實質上相似，在不同的具體實施例中，可具有與成熟人類淚液脂質運載蛋白的序列至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%或至少90%的辨識度，包括至少95%的辨識度(見，例如，圖10與圖14)，其條件是保留改變的位置或序列。

透過「辨識度」意指序列的一屬性，其係測量序列的相似度或關係。藉由將相同殘基的數目除以殘基總數再乘以100來計算辨識度。如兩個示例性的實施例所示，SEQ ID NO：3的突變蛋白具有與成熟人類淚液脂質運載蛋白的胺基酸序列82.28%辨識度的序列，且SEQ ID NO：7的突變蛋白具有與成熟人類淚液脂質運載蛋白83.54%辨識度的胺基酸序列。

「間隔」為序列排列比對中的空隙，其係由於增加或減少胺基酸所造成的結果。因此，完全相同的序列的兩個副本具有100%的辨識度，但不那麼高度保守的序列，以及具有刪除、增加，或置換胺基酸的序列則有較低程度的辨識度。本領域技術人員將認識到，數種電腦程式可用於使 用標準參數來決定序列辨識度，例如Blast(Altschul等人(1997年)，核酸研究期刊，第25卷，第3389-3402頁)、Blast2(Altschul等人(1990年)，分子生物學期刊，第215卷，第403-410頁)，以及Smith-Waterman(Smith等人(1981年)，分子生物學期刊，第147卷，第195-197頁)。

參照本發明之核酸或多胜肽之「突變」或「突變蛋白」等詞分別意指交換、刪除，或插入一或多個核苷酸或胺基酸，相較於天然存在的核酸或多胜肽。與對應之天然人類淚液脂質運載蛋白相比，本發明之突變蛋白包括至少三個替換。

在某些具體實施例中，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白，在成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列(SEQ ID NO：1)的第26-34、56-58、80、83、104-106以及108序列位置中任一個位置上，包括至少2個，包括3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、17或18個突變的胺基酸殘基。位置26-34包括在AB環上，位置56-58包括在CD環上。位置80位於一α螺旋區中。位置83為在此一α螺旋區以及一β摺疊片(βF)之間的單一環定義胺基酸。位置104-106以及108包括在淚液脂質運載蛋白的β桶結構的開放端上結合位置內的GH環內。本文所用之這些區域的定義係根據Flower(Flower，1996年，同上，Flower等人，2000年，同上)以及Breustedt等人(2005年，同上)而來。

在某些具體實施例中，根據本發明之人類脂質運載蛋白突變蛋白可進一步包括將位置61及/或153上的天然半胱胺酸殘基以絲胺酸殘基替換。在此背景下，值得注意的是，已發現將成熟人類淚液脂質運載蛋白的結構雙硫鍵移除(在對應天然核酸庫的程度上)，其中該雙硫鍵係由半胱胺 酸殘基61與153所形成(比照Breustedt等人，2005年，同上)，不只提供了人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白穩定地摺疊，也能夠使其以高親和力與給定的非天然配體結合。不希望受到理論的束縛，據信消除結構雙硫鍵提供進一步的優點，可使非天然人造雙硫鍵(自發性的)產生或故意引入本發明之突變蛋白(見實施例)，例如，從而增加了該突變蛋白的穩定性。然而，與PCSK9結合以及在半胱胺酸(Cys)61與半胱胺酸(Cys)153之間具有形成之雙硫鍵的人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白亦為本發明的一部份。

在某些具體實施例中，本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基：半胱胺酸(Cys)61→丙胺酸(Ala)、苯丙胺酸(Phe)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、蘇胺酸(Thr)、天門冬醯酸(Asn)、酪胺酸(Tyr)、甲硫胺酸(Met)、絲胺酸(Ser)、脯胺酸(Pro)或色胺酸(Trp)及/或半胱胺酸(Cys)153→絲胺酸(Ser)或丙胺酸(Ala).

在某些具體實施例中，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括將位置101上的天然半胱胺酸殘基以一絲胺酸殘基取代。另外，在某些具體實施例中，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括將位置111上的天然精胺酸殘基以一脯胺酸殘基取代。在某些具體實施例中，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括將位置114上的天然離胺酸殘基以一色胺酸殘基取代。

在某些具體實施例中，本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括至少一胺基酸取代基，其可為一額外的胺基酸取代基，選自於精胺酸(Arg)111→脯胺酸(Pro)以及離胺酸(Lys)114→色胺酸(Trp)。本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白可進一步包括以另一胺基酸取代在成熟 人類淚液脂質運載蛋白序列位置101上的半胱胺酸。這一取代基可能，例如，為突變半胱胺酸(Cys)101→絲胺酸(Ser)或半胱胺酸(Cys)101→脯胺酸(Pro)。

在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括一或多個以下胺基酸取代基：精胺酸(Arg)26→絲胺酸(Ser)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、組胺酸(His)或蘇胺酸(Thr)、麩胺酸(Glu)34→天門冬醯酸(Asn)、蘇胺酸(Thr)、精胺酸(Arg)或甘胺酸(Gly)、白胺酸(Leu)56→甲硫胺酸(Met)、絲胺酸(Ser)、麩醯胺酸(Gln)、苯丙胺酸(Phe)、組胺酸(His)或天門冬醯酸(Asn)以及絲胺酸(Ser)58→離胺酸(Lys)、丙胺酸(Ala)、精胺酸(Arg)、色胺酸(Trp)或脯胺酸(Pro)。

在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代基：甲硫胺酸(Met)31→丙胺酸(Ala)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、脯胺酸(Pro)、絲胺酸(Ser)Aps、麩胺酸(Glu)或麩醯胺酸(Gln)、白胺酸(Leu)33→酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)或丙胺酸(Ala)、絲胺酸(Ser)61→色胺酸(Trp)或苯丙胺酸(Phe)、天門冬胺酸(Asp)80→絲胺酸(Ser)、甲硫胺酸(Met)、脯胺酸(Pro)、異白胺酸(Ile)、麩醯胺酸(Gln)、酪胺酸(Tyr)、絲胺酸(Ser)、纈胺酸(Val)或蘇胺酸(Thr)、麩胺酸(Glu)104→白胺酸(Leu)、脯胺酸(Pro)、絲胺酸(Ser)、丙胺酸(Ala)、天門冬醯酸(Asn)、蘇胺酸(Thr)、離胺酸(Lys)或天門冬胺酸(Asp)、組胺酸(His)106→脯胺酸(Pro)、麩醯胺酸(Gln)、甘胺酸(Gly)、精胺酸(Arg)、纈胺酸 (Val)、蘇胺酸(Thr)、天門冬醯酸(Asn)或白胺酸(Leu)以及離胺酸(Lys)108→麩醯胺酸(Gln)、丙胺酸(Ala)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、精胺酸(Arg)、天門冬胺酸(Asp)、天門冬醯酸(Asn)、絲胺酸(Ser)、麩胺酸(Glu)或蘇胺酸(Thr)。

在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括一或多個以下胺基酸取代基：麩胺酸(Glu)27→精胺酸(Arg)、絲胺酸(Ser)、麩醯胺酸(Gln)、蘇胺酸(Thr)、苯丙胺酸(Phe)、離胺酸(Lys)、丙胺酸(Ala)或精胺酸(Arg)、脯胺酸(Pro)29→甘胺酸(Gly)、天門冬胺酸(Asp)、天門冬醯酸(Asn)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)或甲硫胺酸(Met)、天門冬醯酸(Asn)32→異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、酪胺酸(Tyr)、甲硫胺酸(Met)或色胺酸(Trp)以及白胺酸(Leu)105→半胱胺酸(Cys)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)、麩胺酸(Glu)、精胺酸(Arg)、絲胺酸(Ser)、組胺酸(His)、丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、天門冬胺酸(Asp)、脯胺酸(Pro)、甘胺酸(Gly)或離胺酸(Lys)。

在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代基：苯丙胺酸(Phe)28→半胱胺酸(Cys)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、色胺酸(Trp)、天門冬胺酸(Asp)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、白胺酸(Leu)或天門冬醯酸(Asn)、麩胺酸(Glu)30→精胺酸(Arg)、天門冬胺酸(Asp)、蘇胺酸(Thr)、絲胺酸(Ser)、甘胺酸(Gly)、丙胺酸(Ala)或天門冬醯酸(Asn)、異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)、組胺酸(His)、麩醯胺酸(Gln)、蘇胺酸(Thr)或精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)83→精胺酸(Arg)、絲胺酸(Ser)、麩醯胺酸(Gln)、蘇胺酸(Thr)或麩胺酸(Glu)。

在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：精胺酸(Arg)26→苯丙胺酸(Phe)；天門冬醯酸(Asn)32→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→甲硫胺酸(Met)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)及離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)。在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：精胺酸(Arg)26→色胺酸(Trp)；天門冬醯酸(Asn)32→白胺酸(Leu)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→絲胺酸(Ser)以及絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)。在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：精胺酸(Arg)26→組胺酸(His)；天門冬醯酸(Asn)32→酪胺酸(Tyr)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→絲胺酸(Ser)；絲胺酸(Ser)58→精胺酸(Arg)以及離胺酸(Lys)83→麩醯胺酸(Gln)。在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：精胺酸(Arg)26→苯丙胺酸(Phe)；天門冬醯酸(Asn)32→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→麩醯胺酸(Gln)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)以及離胺酸(Lys)83→蘇胺酸(Thr)。在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→精胺酸(Arg)；白胺酸(Leu)56→天門冬醯酸(Asn)；絲胺酸(Ser) 58→色胺酸(Trp)以及離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)。在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：精胺酸(Arg)26→苯丙胺酸(Phe)；天門冬醯酸(Asn)32→白胺酸(Leu)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→苯丙胺酸(Phe)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)以及離胺酸(Lys)83→精胺酸(Arg)。在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：精胺酸(Arg)26→蘇胺酸(Thr)；天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→天門冬醯酸(Asn)；白胺酸(Leu)56→組胺酸(His)；絲胺酸(Ser)58→脯胺酸(Pro)以及離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)。在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→天門冬醯酸(Asn)；白胺酸(Leu)56→苯丙胺酸(Phe)；絲胺酸(Ser)58→精胺酸(Arg)以及離胺酸(Lys)83→麩胺酸(Glu)。在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：精胺酸(Arg)26→色胺酸(Trp)；天門冬醯酸(Asn)32→白胺酸(Leu)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→甲硫胺酸(Met)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)及離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)。在某些具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→甘胺酸(Gly)； 白胺酸(Leu)56→麩醯胺酸(Gln)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)以及離胺酸(Lys)83→麩醯胺酸(Gln)。

在某些具體實施例中，本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括一組以下胺基酸取代基：(1)麩胺酸(Glu)27→絲胺酸(Ser)；苯丙胺酸(Phe)28→精胺酸(Arg)；脯胺酸(Pro)29→甘胺酸(Gly)；麩胺酸(Glu)30→天門冬胺酸(Asp)；甲硫胺酸(Met)31→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)104→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)105→酪胺酸(Tyr)；組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)；離胺酸(Lys)108→丙胺酸(Ala)，(2)麩胺酸(Glu)27→麩醯胺酸(Gln)；苯丙胺酸(Phe)28→半胱胺酸(Cys)；脯胺酸(Pro)29→天門冬胺酸(Asp)；麩胺酸(Glu)30→蘇胺酸(Thr)；甲硫胺酸(Met)31→甘胺酸(Gly)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；白胺酸(Leu)105→半胱胺酸(Cys)；組胺酸(His)106→甘胺酸(Gly)；離胺酸(Lys)108→色胺酸(Trp)，(3)麩胺酸(Glu)27→麩胺酸(Glu)；苯丙胺酸(Phe)28→色胺酸(Trp)；脯胺酸(Pro)29→天門冬醯酸(Asn)；麩胺酸(Glu)30→甘胺酸(Gly)；甲硫胺酸(Met)31→組胺酸(His)；白胺酸(Leu)33→酪胺酸(Tyr)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→脯胺酸(Pro)；麩胺酸(Glu)104→絲胺酸(Ser)；白胺酸(Leu)105→色 胺酸(Trp)；組胺酸(His)106→脯胺酸(Pro)；離胺酸(Lys)108→酪胺酸(Tyr)，(4)麩胺酸(Glu)27→蘇胺酸(Thr)；苯丙胺酸(Phe)28→天門冬胺酸(Asp)；脯胺酸(Pro)29→天門冬醯酸(Asn)；麩胺酸(Glu)30→絲胺酸(Ser)；甲硫胺酸(Met)31→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)33→苯丙胺酸(Phe)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)104→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)105→麩胺酸(Glu)；組胺酸(His)106→精胺酸(Arg)；離胺酸(Lys)108→精胺酸(Arg)，(5)麩胺酸(Glu)27→苯丙胺酸(Phe)；苯丙胺酸(Phe)28→離胺酸(Lys)；脯胺酸(Pro)29→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)30→丙胺酸(Ala)；甲硫胺酸(Met)31→絲胺酸(Ser)；白胺酸(Leu)33→脯胺酸(Pro)；異白胺酸(Ile)57→色胺酸(Trp)；天門冬胺酸(Asp)80→麩醯胺酸(Gln)；麩胺酸(Glu)104→天門冬醯酸(Asn)；白胺酸(Leu)105→精胺酸(Arg)；組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)；離胺酸(Lys)108→天門冬胺酸(Asp)，(6)麩胺酸(Glu)27→離胺酸(Lys)；苯丙胺酸(Phe)28→甘胺酸(Gly)；脯胺酸(Pro)29→脯胺酸(Pro)；麩胺酸(Glu)30→蘇胺酸(Thr)；甲硫胺酸(Met)31→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→組胺酸(His)；天門冬胺酸(Asp)80→酪胺酸(Tyr)；麩胺酸(Glu)104→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)105→絲胺酸(Ser)；組胺酸(His)106→纈胺酸(Val)；離胺酸(Lys)108→天 門冬醯酸(Asn)，(7)麩胺酸(Glu)27→麩胺酸(Glu)；苯丙胺酸(Phe)28→組胺酸(His)；脯胺酸(Pro)29→白胺酸(Leu)；麩胺酸(Glu)30→丙胺酸(Ala)；甲硫胺酸(Met)31→天門冬胺酸(Asp)；白胺酸(Leu)33→丙胺酸(Ala)；異白胺酸(Ile)57→麩醯胺酸(Gln)；天門冬胺酸(Asp)80→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)104→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)105→酪胺酸(Tyr)；組胺酸(His)106→脯胺酸(Pro)；離胺酸(Lys)108→絲胺酸(Ser)，(8)麩胺酸(Glu)27→丙胺酸(Ala)；苯丙胺酸(Phe)28→天門冬胺酸(Asp)；脯胺酸(Pro)29→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)30→甘胺酸(Gly)；甲硫胺酸(Met)31→天門冬胺酸(Asp)；白胺酸(Leu)33→脯胺酸(Pro)；異白胺酸(Ile)57→蘇胺酸(Thr)；天門冬胺酸(Asp)80→蘇胺酸(Thr)；麩胺酸(Glu)104→蘇胺酸(Thr)；組胺酸(His)106→蘇胺酸(Thr)；離胺酸(Lys)108→精胺酸(Arg)，(9)麩胺酸(Glu)27→精胺酸(Arg)；苯丙胺酸(Phe)28→白胺酸(Leu)；脯胺酸(Pro)29→天門冬胺酸(Asp)；麩胺酸(Glu)30→天門冬醯酸(Asn)；甲硫胺酸(Met)31→麩胺酸(Glu)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→麩醯胺酸(Gln)；麩胺酸(Glu)104→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)105→精胺酸(Arg)；組胺酸(His)106→天門冬醯酸(Asn)；離胺酸(Lys)108→丙胺酸(Ala)，(10)麩胺酸(Glu)27→離胺酸(Lys)；苯丙胺酸(Phe)28→天門 冬醯酸(Asn)；脯胺酸(Pro)29→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)30→甘胺酸(Gly)；甲硫胺酸(Met)31→麩醯胺酸(Gln)；白胺酸(Leu)33→脯胺酸(Pro)；異白胺酸(Ile)57→精胺酸(Arg)；天門冬胺酸(Asp)80→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)104→天門冬胺酸(Asp)；白胺酸(Leu)105→精胺酸(Arg)；組胺酸(His)106→白胺酸(Leu)；離胺酸(Lys)108→蘇胺酸(Thr)，或(11)麩胺酸(Glu)27→絲胺酸(Ser)；苯丙胺酸(Phe)28→精胺酸(Arg)；脯胺酸(Pro)29→甘胺酸(Gly)；麩胺酸(Glu)30→天門冬胺酸(Asp)；甲硫胺酸(Met)31→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)104→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)105→甘胺酸(Gly)；組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)；離胺酸(Lys)108→丙胺酸(Ala)。

在一特定具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基的組合：精胺酸(Arg)26→苯丙胺酸(Phe)；麩胺酸(Glu)27→絲胺酸(Ser)；苯丙胺酸(Phe)28→精胺酸(Arg)；脯胺酸(Pro)29→甘胺酸(Gly)；麩胺酸(Glu)30→天門冬胺酸(Asp)；甲硫胺酸(Met)31→丙胺酸(Ala)；天門冬醯酸(Asn)32→異白胺酸(Ile)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→甲硫胺酸(Met)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)；離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)；麩胺酸(Glu)104→脯胺酸(Pro)以及離胺酸(Lys)108→蘇胺酸 (Thr)。在另一具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，該人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括一或多個以下胺基酸取代基：蘇胺酸(Thr)43→異白胺酸(Ile)或丙胺酸(Ala)、麩胺酸(Glu)45→甘胺酸(Gly)、天門冬醯酸(Asn)48→甘胺酸(Gly)、麩胺酸(Glu)63→甘胺酸(Gly)、丙胺酸(Ala)66→纈胺酸(Vla)、麩胺酸(Glu)69→纈胺酸(Vla)、離胺酸(Lys)70→精胺酸(Arg)、丙胺酸(Ala)79→蘇胺酸(Thr)、甲硫胺酸(Met)或纈胺酸(Vla)、天門冬胺酸(Asp)80→甲硫胺酸(Met)或絲胺酸(Ser)、甘胺酸(Gly)82→絲胺酸(Ser)、組胺酸(His)84→麩醯胺酸(Gln)、纈胺酸(Vla)85→甘胺酸(Gly)、酪胺酸(Tyr)87→絲胺酸(Ser)、異白胺酸(Ile)88→蘇胺酸(Thr)或白胺酸(Leu)、組胺酸(His)92→脯胺酸(Pro)、白胺酸(Leu)105→組胺酸(His)、甘胺酸(Gly)或酪胺酸(Tyr)及組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)或精胺酸(Arg)。

在另一特定具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括以下胺基酸取代基之組合：麩胺酸(Glu)27→苯丙胺酸(Phe)；苯丙胺酸(Phe)28→離胺酸(Lys)；脯胺酸(Pro)29→異白胺酸(Ile)；天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；白胺酸(Leu)33→脯胺酸(Pro)；麩胺酸(Glu)34→精胺酸(Arg)；白胺酸(Leu)56→天門冬醯酸(Asn)；異白胺酸(Ile)57→色胺酸(Trp)；組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)以及離胺酸(Lys)108→麩胺酸(Glu)。在又一特定具體實施例中，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較，該人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括一或多個以下胺基酸取代基：麩胺酸(Glu)43→甘胺酸(Gly)或丙胺酸(Ala)、麩胺酸(Glu)45→甘胺酸(Gly)、絲胺酸(Ser)58 →色胺酸(Trp)或精胺酸(Arg)、麩胺酸(Glu)63→天門冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)69→甘胺酸(Gly)、離胺酸(Lys)70→精胺酸(Arg)、天門冬胺酸(Asp)80→麩醯胺酸(Gln)、纈胺酸(Val)或蘇胺酸(Thr)、甘胺酸(Gly)82→天門冬胺酸(Asp)、離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)或精胺酸(Arg)、丙胺酸(Ala)86→麩胺酸(Glu)或絲胺酸(Ser)、苯丙胺酸(Phe)99→白胺酸(Leu)、麩胺酸(Glu)102→離胺酸(Lys)或纈胺酸(Val)、麩胺酸(Glu)104→天門冬醯酸(Asn)或離胺酸(Lys)以及脯胺酸(Pro)106→蘇胺酸(Thr)。

在某些進一步的具體實施例中，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白，在成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的第79、92以及105個胺基酸序列位置上的任一個上包含一或多個突變的胺基酸殘基。例如，本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白可包括下列胺基酸取代基：丙胺酸(Ala)79→甲硫胺酸(Met)、蘇胺酸(Thr)或纈胺酸(Val)、組胺酸(His)92→脯胺酸(Pro)及/或白胺酸(Leu)105→丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、天門冬胺酸(Asp)、脯胺酸(Pro)、精胺酸(Arg)、甘胺酸(Gly)、離胺酸(Lys)或組胺酸(His)。

如上所定義，本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白包括至少一個胺基酸取代基，其係位於成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列(SEQ ID NO：1)的第26、27、28、30、31、33、34、57、61、80、83、104-106以及108個序列位置上。在某些具體實施例中，本發明之突變蛋白包括成熟人類淚液脂質運載蛋白的這些序列位置上的二或多個，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個胺基酸取代基。在一特定具體實施例中，該突變蛋白在該成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序 列的第26、27、28、30、31、33、53、57、61、64、66、80、83、104-106以及108個每個序列位置上具有一突變胺基酸殘基(見，例如，圖10與圖14)。

在某些具體實施例中，本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白可能亦包括關於成熟人類淚液脂質運載蛋白的胺基酸序列一或多個，包括至少二個、至少三個或至少四個胺基酸取代基，在成熟人類淚液脂質運載蛋白的環區域之內的任何位置上，將天然胺基酸殘基以半胱胺酸殘基取代。在某些具體實施例中，根據本發明之突變蛋白包括一天然胺基酸的胺基酸取代基，在有關成熟人類淚液脂質運載蛋白的胺基酸序列第28或105個位置上以半胱胺酸殘基取代。

在剩餘區域，亦即序列位置26-34、56-58、80、83、104-106以及108以外的區域，本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白在突變的胺基酸序列位置之外可包括野生型(天然的)胺基酸序列。在某些具體實施例中，根據本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白亦可在一序列位置/多個位置上攜帶一或多個胺基酸突變，只要這樣的突變至少基本上不會妨礙或干擾該突變蛋白的結合活性與摺疊。這樣的突變可以藉由使用已建立的標準方法在DNA層次上輕易地達成。改變胺基酸序列的示例性實施例為插入或刪除，以及胺基酸取代。這種取代可為保守性的，亦即以具有相似化學特性的胺基酸殘基替換一胺基酸殘基，具體而言是關於極性與尺寸。保守性取代的實施例為以下族群的成員之間的替換：1)丙胺酸、絲胺酸以及蘇胺酸；2)天門冬胺酸以及麩胺酸；3)天門冬醯酸以及麩醯胺酸；4)精胺酸以及離胺酸；5)異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸以及纈胺酸；以及6)苯丙胺酸、酪胺酸以及色胺酸。另一方面，亦可能在該胺基酸序列中引入非 保守性的改變。此外，除了替換單一胺基酸殘基外，亦可能插入或刪除一或多個連續的淚液脂質運載蛋白的一級結構的胺基酸，只要這些刪除或插入造成一個穩定的摺疊/功能性突變蛋白(見，例如，產生截斷N與C端的突變蛋白的實驗部分)。

該胺基酸序列的這種修飾包括直接產生單一胺基酸位置的突變，為了簡化該突變脂質運載蛋白基因或其部分的次選殖，引入某些限制酶的切位。此外，這些突變亦可被併入以進一步促進一脂質運載蛋白突變蛋白對一給定的目標的親和力。再者，若需要的話，突變可被引入以調節某些該突變蛋白的特性，例如改善摺疊穩定性、血清穩定性、蛋白質抗性或水溶性，或是減少聚集傾向。例如，天然存在的半胱胺酸殘基可被突變為其他胺基酸以防止雙硫鍵形成。亦可能故意將其他胺基酸序列位置突變成為半胱胺酸以引入新的反應基團，例如，為了與其他化合物結合，例如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(hydroxyethyl starch，HES)、生物素、胜肽或蛋白質，或是為了形成非天然存在的雙硫連結。這樣的突變的示例性的可能性為將一半胱胺酸殘基引入一人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列，包括以下取代基：蘇胺酸(Thr)40→半胱胺酸(Cys)、麩胺酸(Glu)73→半胱胺酸(Cys)、精胺酸(Arg)90→半胱胺酸(Cys)、天門冬胺酸(Asp)95→半胱胺酸(Cys)以及麩胺酸(Glu)131→半胱胺酸(Cys)。在胺基酸位置40、73、90、95及/或131的任何位置的一側產生的巰基部分可被用來聚二乙醇化(PEGylate)或羥乙基澱粉化(HESylate)突變蛋白，例如，為了增加一相應淚液脂質運載蛋白突變蛋白的血清半衰期。

本發明亦包含如上所定義的突變蛋白，其中成熟人類淚液脂 質運載蛋白的序列的N端的前四個胺基酸殘基(組胺酸(His)-組胺酸(His)-白胺酸(Leu)-白胺酸(Leu)；位置1-4)及/或成熟人類淚液脂質運載蛋白的序列的C端最後二個胺基酸殘基(在位置157的絲胺酸(Ser)以及在位置158的天門冬胺酸(Asp))已被刪除(見圖10與圖14)。該野生型序列的另一可能的突變是將序列位置5至7的胺基酸序列(丙胺酸(Ala)絲胺酸(Ser)天門冬胺酸(Asp))改變為甘胺酸(Gly)甘胺酸(Gly)天門冬胺酸(Asp)，如PCT公開號WO 2005/019256所述。

本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白可包括，基本上由SEQ ID NOs：3-28、62-71以及82所述的任一胺基酸序列或其片段或變異所組成，或由這些序列所組成。

如本文所使用，與本發明之脂質運載蛋白突變蛋白有關的「片段」乙詞涉及衍生自其N端及/或C端截短的全長成熟脂質運載蛋白，亦即缺乏該N端及/或C端胺基酸至少一種，的蛋白質或胜肽。這樣的片段可包括該成熟脂質運載蛋白的一級序列的至少10個，更多例如20或30個或更多連續的胺基酸，且通常在該成熟脂質運載蛋白的免疫分析中可偵測到。

本發明所使用之「變異」乙詞涉及本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的衍生物，其包括胺基酸序列的修飾，例如藉由替換、刪除、插入或化學修飾。這樣的修飾在某些具體實施例中並不減少該突變蛋白的功能性。例如，為了產生這樣的變異，本發明之突變蛋白的一或多個胺基酸可被其各自的D立體異構物或被天然存在的20種胺基酸以外的胺基酸，例如鳥胺酸、羥脯胺酸、瓜胺酸、高絲胺酸、羥基賴胺酸、正纈胺酸，所替換。然而，這樣的取代也可能是保守性的，亦即一胺基酸殘基係由化學上相似 的胺基酸殘基所替換。保守性取代的實例為以下族群的成員之間的替換：1)丙胺酸、絲胺酸以及蘇胺酸；2)天門冬胺酸以及麩胺酸；3)天門冬醯酸以及麩醯胺酸；4)精胺酸以及離胺酸；5)異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、以及纈胺酸；以及6)苯丙胺酸、酪胺酸以及色胺酸。

本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可能存在作為一單體蛋白。在某些具體實施例中，根據本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可能能夠自發性地二聚化或寡聚化。使用形成穩定單體的脂質運載蛋白突變蛋白可能在某些應用上具有優勢，例如，因為較快的擴散與較佳的組織滲透性。在其他具體實施例中，使用自發地形成穩定同質二聚體或多聚體的脂質運載蛋白突變蛋白可能具有優勢，因為這樣的多聚體可提供(進一步)增加對一給定的目標的親和力及/或結合性。此外，脂質運載蛋白突變蛋白的寡聚體的形式可能具有較慢的解離速率或延長血清半衰期。若形成穩定的單體的突變蛋白需要二聚化或多聚化，這可以藉由例如將各別寡聚體區域，例如jun-fos區域或白胺酸拉鏈區域，融合至本發明之突變蛋白或藉由使用「Duocalins」來達成(參見下文)。

根據本發明之淚液脂質運載蛋白突變蛋白可藉由人類淚液脂質運載蛋白的天然存在形式的誘發突變方法而獲得。如本文所使用，「誘發突變」乙詞意指選擇實驗條件，如在人類淚液脂質運載蛋白(Swiss-Prot資料庫條目P31025)的一個給定的序列位置上天然存在的胺基酸可被至少一個不存在於各自天然多胜肽序列裡的此一特定位置上的胺基酸所替換。「誘發突變」乙詞亦包括藉由刪除或插入一或多個胺基酸而(附加的)修飾序列段的長度。因此，例如，在選定序列位置上的一胺基酸被一整個三個隨機的 突變所替換，造成與野生型蛋白的對應段長度比較時，插入了兩個胺基酸殘基，這樣的情況是包含在本發明之範圍內的。這樣的插入或刪除可能被獨立地由本發明中可被誘發突變的任何胜肽段中互相引入。在本發明的一個示例性的具體實施例中，數個突變的插入可被引入所選定的脂質運載蛋白支架的AB環內(參見PCT公開號WO 2005/019256，其係以參考文獻的形式將其整體內容併入本文中)。「隨機誘發突變」乙詞意指沒有預定單一胺基酸(突變)存在於一定的序列位置，但在誘發突變時有一定的機率至少二個胺基酸可以被併入一預定的序列位置上。

人類淚液脂質運載蛋白的編碼序列(Redl,B.等人(1992年)，生物化學期刊，第267卷，第20282-20287頁)被用來作為在本發明中選定的胜肽段的誘發突變的起始點。對於列舉的胺基酸位置的誘發突變，本領域技術人員可用各種已經建立的定點誘發突變標準方法。常用的技術為藉由聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)的方法引入突變，使用合成的寡核苷酸混合物，其在所要的序列位置上具有退化性鹼基組合物。例如，使用密碼子NNK或NNS(其中N=腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；K=鳥嘌呤或胸腺嘧啶；S=腺嘌呤或胞嘧啶)在誘發突變時可併入所有20種胺基酸加上琥珀終止密碼子，而密碼子VVS(其中V=腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶)則將可能併入的胺基酸數目限制為12個，因為其將胺基酸半胱胺酸(Cys)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、纈胺酸(Val)自併入該多胜肽序列所選的位置中排除；例如，使用密碼子NMS(其中M=腺嘌呤或胞嘧啶)則將在所選的序列位置上可能的胺基酸數目限縮至11個，因為將胺基酸精胺酸(Arg)、半胱胺酸 (Cys)、甘胺酸(Gly)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、纈胺酸(Val)自併入該所選的序列位置中排除。在這方面應該注意的是，其他胺基酸(非常規20種天然存在的胺基酸)的密碼子，例如硒代半胱胺酸或吡咯賴胺酸亦可被併入一突變蛋白的核酸中。亦有可能，如Wang,L.等人所描述(Wang,L.等人(2001年)，科學期刊，第292卷，第498-500頁，或Wang,L.以及Schultz,P.G.(2002年)，化學通訊期刊，第1卷，第1-11頁)使用「人工的」密碼子例如UAG，其通常辨識作為終止密碼子，以插入其他不常見的胺基酸，例如，鄰-甲基-L-酪胺酸或對-胺基苯丙胺酸。

利用核苷酸構築塊以及降低鹼基對特異性，例如肌苷、8-氧代-2’去氧鳥苷或6(2’-去氧-β-D-呋喃核糖基)-3,4-二氫-8H-pyrimindo-1,2-惡嗪-7-酮(Zaccolo等人(1996年)分子生物學期刊，第255卷，第589-603頁)，是另一種將突變引入所選序列段的選擇。

另一種可能性是所謂的三線態-誘發突變。此方法使用不同的核苷酸三聯體的混合物，其中每一個編碼一種胺基酸，用以併入該編碼序列(Virnekäs B等人(1994年)，核酸研究期刊，第22卷，第5600-5607頁)。

一種可能用來將突變引入各別多胜肽的選定區域的策略是基於使用四個寡核苷酸，其中每一個係部分衍生自將要被突變的對應序列段之一。當合成這些寡核苷酸時，本領域技術人員可以利用核苷酸構築塊的混合物以合成那些對應於將要被突變的胺基酸位置的核苷酸三聯體，如此編碼所有天然的胺基酸密碼子隨機地出現，其最後造成一脂質運載蛋白胜肽庫的產生。例如，在其序列的第一寡核苷酸對應於-除了突變的位置 上-在該脂質運載蛋白多胜肽的最N端的位置上將要被突變的胜肽段的編碼鏈。因此，第二寡核苷酸對應於在該多胜肽序列後面的第二序列段的非編碼鏈。第三寡核苷酸依序對應於相應的第三序列段的編碼鏈。最後，第四寡核苷酸對應於該第四序列段的非編碼鏈。聚合酶連鎖反應可各別與第一及第二寡核苷酸進行，若需要的話，也可分別各別與第三及第四寡核苷酸進行。

這兩種反應的擴增產物皆可藉由各種已知的方法與包括來自該第一至第四序列段的序列的單一核酸組合，其中在選定的位置上已引入突變。為此，這兩個產物皆可例如進行新的聚合酶連鎖反應，使用側翼的寡核苷酸以及一個或多個介體的核酸分子，其在該第二與第三序列段之間的序列作出貢獻。在用於誘發突變的寡核苷酸序列中的數目和排列的選擇上，本領域技術人員可使用各種替代方案。

如上文所定義之核酸分子可以藉由與編碼脂質運載蛋白多胜肽及/或該載體的核酸的缺失的5'-和3'-序列接合而被結合，且可以被選殖到已知的宿主生物體中。有許多以建立的程序可供接合與選殖。例如，亦存在於該選殖載體的序列中的限制內切酶所辨識的序列可以被改造至該合成的寡核苷酸的序列中。因此，在相應的PCR產物擴增以及酶切後，所得到的片段可以使用相應的辨識序列而輕易地被選殖。

在編碼選擇要誘發突變的蛋白質的基因內較長的序列段也可以透過已知方法來隨機誘發突變，例如，藉由在增加誤差率的條件下進行聚合酶連鎖反應、藉由化學誘發突變，或藉由使用細菌突變株。這樣的方法也可以用於進一步優化一脂質運載蛋白突變蛋白的目標親和性或特異 性。在實驗誘發突變的片段之外可能發生的突變通常是可以被容忍的，或甚至證實是有利的，例如，其對促進該脂質運載蛋白突變蛋白的折疊效率或折疊穩定性具有貢獻。

根據本發明的一個示例性方法中，將編碼人類淚液脂質運載蛋白的一核酸分子，在成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列第26-34、56-58、80、83、104-106以及108個位置上一或多個位置進行誘發突變。在某些具體實施例中，該核酸分子進一步在該成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的胺基酸序列第61、101、111、114以及153個位置上一或多個位置進行誘發突變。

在本發明的一個具體實施例中，產生人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白的方法包括，使成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的胺基酸序列第26-34、56-58、80、83、104-106以及108個任何位置上產生至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、或17個密碼子突變。在一具體實施例中，成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的胺基酸序列第26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106以及108個位置上的所有18個密碼子皆突變。

在本發明的另一具體實施例中，根據本發明之方法包括在成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列(SEQ ID NO：1)中在第61以及153個位置上編碼半胱胺酸的兩個密碼子皆突變。在一具體實施例中，第61個位置被突變為編碼一丙胺酸、苯丙胺酸、離胺酸、精胺酸、蘇胺酸、天門冬醯酸、酪胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、脯胺酸或色胺酸的殘基，僅舉出幾種可能性而已。在第153個位置被突變的具體實施例中，一胺基酸例如絲 胺酸或丙胺酸可以被引入第153個位置上。

如本文所述，在本發明的另一具體實施例中，編碼成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的第111及/或114個位置的胺基酸序列的密碼子被突變為編碼例如在位置111上為一精胺酸以及在位置114上為一色胺酸。

本發明之方法的另一具體實施例包含將編碼成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的第101個位置上的半胱胺酸的密碼子誘發突變，使該密碼子編碼任何其他的胺基酸。在一具體實施例中，該編碼第101個位置的突變的密碼子編碼一絲胺酸。因此，在某些具體實施例中，在第61、101以及153個位置上的二或所有三個半胱胺酸密碼子皆被另一個胺基酸的密碼子所取代。

根據本發明之方法，脂質運載蛋白突變蛋白的獲得開始於編碼人類淚液脂質運載蛋白的核酸分子。這樣的核酸分子被誘發突變，且藉由重組DNA技術被引入到適當的細菌或真核生物宿主生物體中。使用本領域已知的任何適合的技術獲得脂質運載蛋白突變蛋白的核酸序列庫，以產生具有抗體樣的特性之脂質運載蛋白突變蛋白，亦即對一給定的目標具有親和力的突變蛋白。這種組合方法的實例係詳述於例如，PCT公開號WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471、WO 03/029462、WO 03/029463、WO 2005/019254、WO 2005/019255、WO 2005/019256、或WO 2006/56464。每個這些專利申請案的內容皆以引用的方式將其整體內容併入本文中。將受到誘發突變的核酸序列在適當的宿主中表現之後，攜帶多個與給定目標結合的相應脂質運載蛋白突變蛋白之基因資訊的選殖系可自該序列庫中篩 選而得。習知技術可用於篩選這些選殖系，例如噬菌體呈現技術(在Kay,B.K.等人(1996年)同上；Lowman,H.B.(1997年)同上，或Rodi,D.J.以及Makowski,L.(1999年)同上的回顧)、選殖系篩選(在Pini,A.等人(2002年)Comb.Chem.High Throughput Screen.期刊，第5卷，第503-510頁中的回顧)、核醣體呈現技術(在Amstutz,P.等人(2001年)Curr.Opin.Biotechnol.期刊，第12卷，第400-405頁回顧)或在Wilson,D.S.等人(2001年)美國國家科學院院刊，第98卷，第3750-3755頁中所報告的mRNA呈現技術，或在WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471、WO 03/029462、WO 03/029463、WO 2005/019254、WO 2005/019255、WO 2005/019256、或WO 2006/56464中所特定描述的方法。

得到之編碼一或多個本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的核酸分子可使用任何適當的表現系統被表現。得到的一個脂質運載蛋白突變蛋白或多個脂質運載蛋白突變蛋白可以被進一步篩選。篩選可在例如競爭的環境下進行。如本文所用之競爭的環境意指脂質運載蛋白突變蛋白的篩選包含至少一個步驟，其中該脂質運載蛋白突變蛋白與給定的野生型脂質運載蛋白的非天然配體被帶到與一額外的配體存在的情況下接觸，該額外的配體係與該突變蛋白競爭與該非天然配體結合。此一額外的配體可為該目標的生理配體、過量的該目標本身，或任何其他該目標的非生理配體，其係與至少一重疊的抗原決定位結合到被本發明之突變蛋白辨識的抗原決定位上，因此干擾該突變蛋白的目標結合。可替代地，該額外的配體與該突變蛋白的結合競爭，係藉由將與該突變蛋白的結合位置不同的抗原決定位以變構效應錯合至該目標來競爭。

使用溫和的M13噬菌體的噬菌體呈現技術的一個具體實施例(在Kay,B.K.等人(1996年)同上；Lowman,H.B.(1997年)同上，或Rodi,D.J.以及Makowski,L.(1999年)同上的回顧)被給定作為可用於本發明之一選定方法的一個實例。可用來篩選本發明突變蛋白的噬菌體呈現技術的另一個具體實施例為Broders等人所描述的超級噬菌體技術(Broders等人，(2003年)「超級噬菌體，在噬菌體呈現技術中提高抗體的呈現」，分子生物學方法期刊，第205卷：第295-302頁)。其他溫和噬菌體例如f1，或裂解性噬菌體例如T7亦可被採用。針對示例性篩選方法，產生M13噬質體可使突變脂質運載蛋白的核酸序列表現為其N端帶有訊號序列的融合蛋白，例如OmpA-訊號序列，且帶有該M13噬菌體的殼體蛋白pIII或其能夠在C端被併入該噬菌體殼體蛋白的片段。包括野生型序列的第217至406個胺基酸的該噬菌體殼體蛋白的C端片段△pIII可被用來製造該融合蛋白。在一具體實施例中，使用pIII的一C端片段，其中在第201個位置上的半胱胺酸殘基丟失或是被其他胺基酸所替換。

據此，本發明之方法的一個進一步的具體實施例包含操作性地融合一編碼該一或多個脂質運載蛋白突變蛋白的核酸分子，且起因於在3’端誘發突變帶有編碼該M13家族的一絲狀噬菌體的殼體蛋白pIII或該殼體蛋白的一片段的基因，以篩選至少一個突變蛋白與一給定的配體結合。

該融合蛋白可包括額外的組成分例如一親和力標記，其可使該融合蛋白或其部分固定、偵測及/或純化。此外，一終止密碼子可位於編碼該脂質運載蛋白或其突變蛋白的序列區域以及該噬菌體殼體基因或其片段之間，其中該終止密碼子，例如一琥珀終止密碼子，在一適當抑制株中 轉譯期間係至少部分被轉譯為一胺基酸。

例如，該噬質體載體pTLPC27(見，例如，PCT公開號WO 2008/015239的圖20與SEQ ID NO：9)，亦稱為pTlc27，可被用於製備編碼人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白的噬質體基因庫。本發明之編碼該淚液脂質運載蛋白突變蛋白的核酸分子可使用二個BstXI限制酶切位而被插入該載體中。連接作用之後，一適當的宿主品系例如E.coli XL1-Blue與所得之核酸混合物進行轉型作用以得到大量的獨立選殖株。若需要的話，可產生一相應的載體以製備一超級噬菌體基因庫。

所得之基因庫接著於一液體培養物中以一適當的M13-輔助噬菌體或一超級噬菌體進行超級感染以產生功能性噬質體。該重組噬質體在其表面呈現該脂質運載蛋白突變蛋白，作為與該殼體蛋白pIII或其片段的融合物，而該融合蛋白的N端訊號序列則被正常地切除。另一方面，其也帶有一或多個拷貝數的由該輔助噬菌體所供應的該天然殼體蛋白pIII，因此能夠感染一接受者，一般而言為一帶有一F-或F’質體的菌株。在超級噬菌體呈現的情況下，該超級噬菌體在其表面呈現該脂質運載蛋白突變蛋白，作為與該感染性殼體蛋白pIII的融合物，但不具有天然的殼體蛋白。在感染輔助噬菌體或超級噬菌體期間或之後，介於該脂質運載蛋白突變蛋白與該殼體蛋白pIII之間的融合蛋白的基因表現可被誘導，例如藉由添加無水四環黴素。選擇誘導條件使該獲得的噬質體的一主要部分在其表面上呈現至少一脂質運載蛋白突變蛋白。在超級噬菌體呈現的情況下，誘導條件導致一群帶有三與五條間由該脂質運載蛋白突變蛋白與該殼體蛋白pIII組成的融合蛋白之超級噬質體。已知各種分離該噬質體的方法，例如以聚乙二醇沈澱。 分離通常是在培養6-8小時後進行。

分離之噬質體接著可藉由與所要之目標物培養以進行篩選，其中該目標物係以允許至少暫時固定帶有突變蛋白與所欲之結合活性在其殼體上作為融合蛋白的噬質體形式呈現。本發明技術領域中之技藝者已知之各種具體實施例中，該目標物可為，例如，與一載體蛋白例如血清白蛋白結合，且透過該載體蛋白與一蛋白結合表面，例如聚苯乙烯，結合。適用於ELISA技術或所謂的「免疫黏附」的微量滴定盤可用於例如固定該目標物。可選地，該目標物與其他結合基團，例如生物素，的結合亦可被使用。該目標物接著被固定於一選擇性地結合該基團的表面上，例如微量滴定盤或塗覆鏈霉親和素、中性親和素或抗生物素蛋白的順磁粒子。若該目標物與一免疫球蛋白的Fc部分融合，固定作用亦可於一表面上達成，例如微量滴定盤或塗覆蛋白A或蛋白G的順磁粒子。

呈現於表面的非特異性噬質體結合位置可以阻隔溶液使其飽和，如同已知用於ELISA的方法。該噬質體之後一般與固定於存在一生理緩衝液表面上的目標物接觸。未結合的噬質體以多次清洗來移除。留在該表面上的噬質體粒子接著被流洗下來。數種方法可用於流洗。例如，該噬質體可以添加蛋白酶或存在酸、鹼、清潔劑或離散鹽類或者在適度變性的條件下進行流洗。一種這樣的方法為使用pH 2.2的緩衝液流洗，其中該流洗液隨後被中和。另一種方式為，可添加一不含目標物的溶液以與該固定的目標物競爭與該噬質體的結合，或者目標物特異性的噬質體可藉由與免疫球蛋白或與有興趣之目標物特異性結合的天然配體蛋白競爭而被流洗下來。

之後，將該流洗的噬質體感染大腸桿菌細胞。另一種方法為，該核酸序列可由該流洗的噬質體中萃取而來，且可被用於定序分析、擴增或以另一種方式進行細胞轉型。從由此方法得到的大腸桿菌選殖系開始，新鮮的噬質體或超級噬質體再次藉由根據上述之方法與M13輔助噬菌體或超級噬菌體重複感染而被製造，且以此方法擴增的噬質體再次地在固定的目標物上進行篩選。為了得到帶有具有最佳化形式的本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的噬質體，多重篩選週期通常是必要的。在某些具體實施例中，選擇篩選週期的數目係以在其後功能分析中至少0.1%的被研究的選殖系產生帶有可被偵測與該給定之目標物具有親和力的突變蛋白的標準來選定。根據尺寸的不同，即所用之基因庫的複雜度，一般需要2至8個週期以達到此目標。

針對所篩選之突變蛋白的功能性分析，以得自該篩選週期的噬質體感染一大腸桿菌菌株，且分離相對應之雙股噬質體DNA。由此噬質體DNA開始，或亦由萃取自該噬質體的單股DNA開始，本發明所篩選之突變蛋白的核酸序列可以本領域已知的方法來決定，且其胺基酸序列可自其中以推斷方式得到。該突變的區域或整個脂質運載蛋白突變蛋白的序列可被次選殖至另一表現載體上，且在一適當的宿主生物體中表現。例如，載體pTLPC26(如圖9中的描述所述)，亦稱為pTlc26，可被用於在大腸桿菌菌株例如E.coli TG1中表現。由此所製得之脂質運載蛋白突變蛋白可由各種生物化學方法純化，例如藉由pTlc26所製得的脂質運載蛋白突變蛋白，可攜帶一具有親和力的胜肽，一種所謂的親和力標記，例如在其C端，且因此可以藉由親和色層分析法來加以純化。親和力標記的實例包括，但不限於生物 素、鏈霉素標記、鏈霉素標記II(Schmidt等人，同上)、寡聚組胺酸、聚組胺酸、一免疫球蛋白區域、麥芽糖結合蛋白、穀胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)或鈣調節結合胜肽(calmodulin binding peptide，CBP)。

某些親和力標記為半抗原，例如但不限於，二硝基酚與長葉毛地黃配質。某些親和力標記為抗原決定位標記，例如FLAG^®-胜肽(天門冬胺酸(Asp)-酪胺酸(Tyr)-離胺酸(Lys)-天門冬胺酸(Asp)-天門冬胺酸(Asp)-天門冬胺酸(Asp)-天門冬胺酸(Asp)-離胺酸(Lys)-甘胺酸(Gly))、T7抗原決定位(丙胺酸(Ala)-絲胺酸(Ser)-甲硫胺酸(Met)-蘇胺酸(Thr)-甘胺酸(Gly)-甘胺酸(Gly)-麩醯胺酸(Gln)-麩醯胺酸(Gln)-甲硫胺酸(Met)-甘胺酸(Gly))、麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein，MBP)、單純皰疹病毒糖蛋白D的麩醯胺酸(Gln)-脯胺酸(Pro)-麩胺酸(Glu)-白胺酸(Leu)-丙胺酸(Ala)-脯胺酸(Pro)-麩胺酸(Glu)-天門冬胺酸(Asp)-脯胺酸(Pro)-麩胺酸(Glu)-天門冬胺酸(Asp)序列的HSV抗原決定位、序列酪胺酸(Tyr)-脯胺酸(Pro)-酪胺酸(Tyr)-天門冬胺酸(Asp)-纈胺酸(Val)-脯胺酸(Pro)-天門冬胺酸(Asp)-酪胺酸(Tyr)-丙胺酸(Ala)的血凝素(hemagglutinin，HA)抗原決定位、水泡性口炎病毒糖蛋白的VSV-G抗原決定位(半胱胺酸(Cys)-酪胺酸(Tyr)-The-天門冬胺酸(Asp)-異白胺酸(Ile)-麩胺酸(Glu)-甲硫胺酸(Met)-天門冬醯酸(Asn)-精胺酸(Arg)-白胺酸(Leu)-離胺酸(Lys))、序列甘胺酸(Gly)-丙胺酸(Ala)-脯胺酸(Pro)-纈胺酸(Val)-脯胺酸(Pro)-酪胺酸(Tyr)-脯胺酸(Pro)-天門冬胺酸(Asp)-脯胺酸(Pro)-白胺酸(Leu)-麩胺酸(Glu)-脯胺酸(Pro)-精胺酸(Arg)的E抗原決定位標記、序列甘胺酸(Gly)-纈胺酸(Val)-絲胺酸(Ser)-絲胺酸(Ser)-蘇胺酸(Thr)-絲胺酸(Ser)-絲胺 酸(Ser)-天門冬胺酸(Asp)-苯丙胺酸(Phe)-精胺酸(Arg)-天門冬胺酸(Asp)-精胺酸(Arg)的E2抗原決定位標記、哺乳動物MAPK/ERK激酶的C端序列麩胺酸(Glu)-麩胺酸(Glu)-蘇胺酸(Thr)-丙胺酸(Ala)-精胺酸(Arg)-苯丙胺酸(Phe)-麩醯胺酸(Gln)-脯胺酸(Pro)-甘胺酸(Gly)-酪胺酸(Tyr)-精胺酸(Arg)-絲胺酸(Ser)的標記-100抗原決定位標記、序列離胺酸(Lys)-麩胺酸(Glu)-蘇胺酸(Thr)-丙胺酸(Ala)-丙胺酸(Ala)-丙胺酸(Ala)-離胺酸(Lys)-苯丙胺酸(Phe)-麩胺酸(Glu)-精胺酸(Arg)-麩醯胺酸(Gln)-組胺酸(His)-甲硫胺酸(Met)-天門冬胺酸(Asp)-絲胺酸(Ser)的S-標記、轉錄因子c-myc的序列麩胺酸(Glu)-麩醯胺酸(Gln)-離胺酸(Lys)-白胺酸(Leu)-異白胺酸(Ile)-絲胺酸(Ser)-麩胺酸(Glu)-麩胺酸(Glu)-天門冬胺酸(Asp)-白胺酸(Leu)的「myc」抗原決定位，以及猿猴病毒5的副黏病毒的P與V蛋白上的小V5抗原決定位(甘胺酸(Gly)-離胺酸(Lys)-脯胺酸(Pro)-異白胺酸(Ile)-脯胺酸(Pro)-天門冬醯酸(Asn)-脯胺酸(Pro)-白胺酸(Leu)-白胺酸(Leu)-甘胺酸(Gly)-白胺酸(Leu)-天門冬胺酸(Asp)-絲胺酸(Ser)-蘇胺酸(Thr))。此外，但一般不作為單一標記，一增加可溶性的標記例如NusA、硫氧還原蛋白(thioredoxin，TRX)、小泛素樣修飾劑(small ubiquitin-like modifier，SUMO)，以及泛素(ubiquitin，Ub)可被使用。半抗原與抗原決定位標記可被用於與一對應抗體或一抗體樣的蛋白質分子結合作為結合配偶體。序列離胺酸(Lys)-麩胺酸(Glu)-蘇胺酸(Thr)-丙胺酸(Ala)-丙胺酸(Ala)-丙胺酸(Ala)-離胺酸(Lys)-苯丙胺酸(Phe)-麩胺酸(Glu)-精胺酸(Arg)-麩醯胺酸(Gln)-組胺酸(His)-甲硫胺酸(Met)-天門冬胺酸(Asp)-絲胺酸(Ser)的S-胜肽抗原決定位可被用來作為與一對應抗體結合或與一S-蛋白結合的抗原決定位標記以作為結合配偶體(Hackbarth,JS，等人，生物技術期刊(2004 年)，第37卷，第5期，第835-839頁)。

篩選也可以其他方式進行。許多相應的具體實施例為本領域技藝者所知，或是描述於文獻之中。此外，也可應用方法的組合。例如，篩選的選殖系或至少以「噬菌體呈現」增強者可額外進行「選殖系篩選」。此程序的優點為可以直接分離出可製造帶有可偵測與目標物結合親和力的脂質運載蛋白突變蛋白的個別選殖系。

除了使用大腸桿菌在「噬菌體呈現」技術或「選殖系篩選」方法中作為宿主生物體之外，其他細菌菌株、酵母菌或昆蟲細胞或哺乳動物細胞亦可被用於此目的。進一步對自一如上所述之隨機基因庫中篩選一脂質運載蛋白突變蛋白，亦可應用包括限制誘發突變之演進的方法，以在重複篩選週期之後對該目標物的親和力或特異性方面優化已經對該目標物具有某些結合活性的突變蛋白。

對本領域技藝者而言很明顯的是，複雜的形成是根據許多因素而定，例如結合配偶體的濃度、競爭者的存在、緩衝系統的離子強度等。篩選與增強一般則是在可使脂質運載蛋白突變蛋白的分離具有，在與所欲之目標物複合下，一至少200nM的解離常數的情形下進行。然而，清洗與流洗步驟可在不同的嚴格度下進行。與該動力學特性有關的篩選也是可能發生的。例如，篩選可在有利於該目標物與突變蛋白形成複合物，且顯現出自該目標物緩慢解離，或換句話說具有低k_off速率的情形下進行。另一種方法為，篩選可在有利於該突變蛋白與該目標物之間複合物的快速形成，或換句話說具有高k_on速率的情形下進行。作為進一步示例性的替代方法，篩選可在篩選該突變蛋白之增進的熱穩定性(相較於野生型脂質運載蛋白或 已對一預先篩選的目標物具有親和力的突變蛋白)的情形下進行。

一旦對一給定的目標物具有親和力的脂質運載蛋白突變蛋白被篩選出來，另外也可能對這樣的突變蛋白進行另一次的誘發突變，以隨後篩選具有甚至更高親和力的變異株或具有增進特性的變異株，例如較高的熱穩定性、增進的血清穩定性、熱力學穩定性、增進的溶解度、增進的單體行為、增進抗熱變性、化學變性、蛋白水解或清潔劑的抗性等。此一進一步的誘發突變，其中在目標為較高親和力可被視為體外「親和力成熟作用」的情況下，可藉由基於合理設計之位置特異性突變或隨機突變來達成。為獲得較高親和力或增進的特性的另一可能之方法為使用易錯PCR，其造成在該脂質運載蛋白突變蛋白的序列位置的一選定範圍之間的點突變。易錯PCR可根據任何已知的實驗方法來進行，例如由Zaccolo等人，(1996年)於分子生物學期刊，第255卷，第589-603頁中所描述者。適用於此一目的之隨機誘發突變的其他方法包括如Murakami,H.等人(2002年)於自然生物科技期刊，第20卷，第76-81頁中所述之隨機插入/刪除(random insertion/deletion，RID)誘發突變，或者Bittker,J.A.等人(2002年)於自然生物科技期刊，第20卷，第1024-1029頁中所述之非同源隨機重組(nonhomologous random recombination，NRR)。如果需要的話，親和力突變亦可根據如專利公開號WO 00/75308或Schlehuber,S.等人(2000年)於分子生物學期刊，第297卷，第1105-1120頁中所描述之程序進行，其中得到對長葉毛地黃配質具有高親和力的膽色素結合蛋白之突變蛋白。

在這方面，對本領域技藝者而言很清楚的是，親和力的K_D值(在各突變蛋白與其配體之間形成的複合物的解離常數)可能在一定實驗 範圍內變化，取決於用來決定一特定脂質運載蛋白突變蛋白對一給定配體的親和力的方法與實驗計劃。這表示，在測量的K_D值中可能有輕微的偏差，或取決於，例如，該K_D值是否由表面電漿子共振(Biacore)或由競爭性ELISA所取決之容忍範圍。

另外也包括在本發明的範圍中的是上述突變蛋白的形式，其中個別突變蛋白在其潛在的免疫性方面已被改變或修飾。

細胞毒性T-細胞辨識在與第I類主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex，MHC)分子有關的抗原呈現細胞的細胞表面上的胜肽抗原。該胜肽與MHC分子結合的能力與其免疫原性為對偶基因特異的且為相關的。為了減少一給定蛋白質的免疫原性，預測在一蛋白質中的哪些胜肽具有與一給定的MHC分子結合的潛力之能力是很有價值的。採用計算線程方式以確認潛在的T-細胞抗原決定位的方法在先前已被描述以預測一給定之胜肽序列與MHC第I類分子的結合(Altuvia等人(1995年)，分子生物學期刊，第249卷，第244-250頁)。

這種方法也可用於確定在本發明之突變蛋白中的潛在的T細胞抗原決定位，並根據其使用目的，在其預測的免疫原性的基礎上進行一特定突變蛋白的篩選。亦可能進一步的將已預測包含T-細胞抗原決定位的胜肽區域進行額外的誘發突變，以減少或消除這些T-細胞抗原決定位，從而將免疫原性最小化。將雙性抗原決定位自基因工程改造的抗體中移除已被描述(Mateo等人(2000年)，融合瘤期刊，第19卷，第6期，第463-471頁)，且可適用於本發明之突變蛋白。

由此獲得之突變蛋白可能具有最小化的免疫原性，這對於將 之使用於如下所述之治療與診斷的應用上來說是所要的。

對於本文所揭露之脂質運載蛋白突變蛋白的數種應用，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可為與一部分，其可為一蛋白質，一蛋白區域或一胜肽例如一訊號序列及/或一親和力標記，例如在其N端或其C端，融合。

親和力標記如Strep-tag^®或Strep-tag^® II(Schmidt,T.G.M.等人(1996年)，分子生物學期刊，第255卷，第753-766頁)、myc-標記、FLAG-標記、His₆-標記或HA-標記或蛋白質，例如穀胱甘肽-S-轉移酶，亦可輕易偵測及/或純化重組蛋白，係為適合的融合配偶體的進一步實例。最後，帶有色原體或螢光特性，如綠色螢光蛋白(green fluorescent protein,，GFP)或黃色螢光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)的蛋白質亦為適合於本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的融合配偶體。例如，當用於以下實施例中所述的實驗，本文所揭露之脂質運載蛋白突變蛋白攜帶一由10個胺基酸(SAWSHPQFEK)所組成的C端Strep-Tag®II純化標記(IBA GmbH公司)。

對於某些應用，以標記形式採用本發明之突變蛋白也是有用的。據此，本發明亦涉及與選自於由酵素標記、放射線標記、顏色標記、螢光標記、色原體標記、發光標記、半抗原、長葉毛地黃配質、生物素、金屬複合物、金屬、膠體金組成之群組的標記部分連結之脂質運載蛋白突變蛋白。該突變蛋白亦可與一低分子量之有機化合物連結。如本文所用，「低分子量之有機化合物」乙詞意指一單體碳基化合物，其可具有脂肪族、脂環族及/或芳香族部分。在典型的具體實施例中，該低分子量之有機化合物為一具有至少二個碳原子的主鏈的有機化合物，且在某些具體實施例中不超過7或12個可旋轉的碳鍵。這樣的化合物的分子量在從約100至約2000道 爾頓，例如從約100至約1000道爾頓的範圍內。其可任選地包括一或二個金屬原子。

一般而言，可以任何合適的化學物質或酵素標記脂質運載蛋白突變蛋白，其係以一化學、物理、光學或酵素反應方式，直接或間接產生可偵測之化合物或訊號。針對物理反應同時為光學反應/標記物的一個實例為當使用一放射線標記時，螢光發散至照射或x-射線的發散。鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶和β-半乳糖苷酶為酵素標記的實例(並同時為光學標記)，其催化顯色反應產物的形成。一般而言，通常用於抗體的所有標記(那些專門用於與免疫球蛋白的Fc部分內的糖部分的除外)，也可用於與本發明之突變蛋白連接。本發明之突變蛋白也可以與任何合適的治療活性劑連接，例如，用於將這些試劑標的性遞送到給定的細胞、組織、器官，或者用於選擇性鎖定細胞，例如，在不影響周圍正常細胞下的腫瘤細胞。這樣的治療活性劑的實例包括放射性核素、毒素、有機小分子，以及治療性胜肽(例如作為細胞表面受體的激動劑/拮抗劑之胜肽，或者在一個給定的細胞標的上競爭蛋白結合位點的胜肽)。然而，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可能，也可以連接有治療活性的核酸分子，例如反義核酸分子、小干擾RNA、微小RNA或核糖酵素。這樣的連接物可由本領域習知之方法來製備。

在一個具體實施例中，本發明之突變蛋白也可以被耦合到一個部分，其可鎖定一特定身體區域、生物體、組織、器官或一個體體內的細胞，以遞送本發明之突變蛋白至所欲之身體區域、生物體、組織、器官或該個體的細胞。所要的這樣的修改之內的一個實例可為血腦屏障的交 叉。為了穿越血腦屏障，本發明之突變蛋白可以耦合至協助穿越此屏障的主動轉運的蛋白部分(見Gaillard PJ等人，白喉毒素受體標的腦藥物的遞送，國際會議系列，2005年，1277，第185-198頁，或Gaillard PJ等人，穿越血腦屏障的標的性遞送，藥物遞送專家意見，2005年，第2卷，第299-309頁。這樣的蛋白部分為例如以商品名2B-Trans^TM販售可得(至BBB技術BV，萊頓，荷蘭)。

如上所指出者，在某些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可以連接至可延長該突變蛋白之血清半衰期的蛋白部分(這方面也參見PCT專利公開號WO 2006/56464，其中這樣的連接策略係描述於參考對CTLA-4具有結合親和力的人類嗜中性粒細胞明膠酶相關的脂質運載蛋白的突變蛋白)。在本說明書中所使用的術語「連接物」或「連接」包括一蛋白部分係由一化學試劑的方式連接到一脂質運載蛋白突變蛋白，該化學試劑例如為一個交聯劑或將一蛋白部分耦合至一胺基酸或類似物的側基團上的試劑。此外，當用於本文時，該術語應當被理解為包括一蛋白部分係在任一末端以形成共價鍵的方式以基因融合至一脂質運載蛋白突變蛋白，例如藉由轉譯方式融合一可將半衰期延伸至一脂質運載戴白突變蛋白的蛋白部分。本領域技藝者應當自使用該術語的內容中理解到是否使用一化學試劑以連接或者是否以轉譯方式融合意指藉由遺傳工程來達到目的。可延伸血清半衰期的蛋白部分可以是一聚亞烷基二醇分子、羥乙基澱粉、脂肪酸分子，例如棕櫚酸(Vajo與Duckworth(2000年)，藥理學研究期刊，第52卷，第1-9頁)、一免疫球蛋白的Fc部分、一免疫球蛋白的CH3結構域、一免疫球蛋白的CH4結構域、白蛋白或其片段、一白蛋白結合胜肽，或白蛋 白結合蛋白、轉鐵蛋白等，僅舉幾個例子而已。該白蛋白結合蛋白可為細菌白蛋白結合蛋白、白蛋白結合胜肽、工程化的白蛋白結合多胜肽、抗體、包括區域抗體的抗體片段(參見例如美國專利號6,696,245)，或與白蛋白具有結合活性的脂質運載蛋白突變蛋白。據此，用於延長本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的半衰期之適合的共軛配偶體包括白蛋白(Osborn,BL等人(2002年)，藥理學試驗性治療期刊，第303卷，第540-548頁)，或白蛋白結合蛋白，例如，細菌白蛋白結合區域，如鏈球菌蛋白G的區域(König T.與Skerra A.(1998年)，免疫學方法期刊，第218卷，第73-83頁)。可被用作結合配偶體的白蛋白結合胜肽的實例為，例如，那些具有一半胱胺酸(Cys)-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-半胱胺酸(Cys)共同序列，其中Xaa_1為天門冬胺酸(Asp)，天門冬醯酸(Asn)，絲胺酸(Ser)，蘇胺酸(Thr)或色胺酸(Trp)；Xaa_2為天門冬醯酸(Asn)，麩醯胺酸(Gln)，組胺酸(His)，異白胺酸(Ile)，白胺酸(Leu)或離胺酸(Lys)；Xaa_3為丙胺酸(Ala)，天門冬胺酸(Asp)，苯丙胺酸(Phe)，色胺酸(Trp)或酪胺酸(Tyr)；以及Xaa_4為天門冬胺酸(Asp)，甘胺酸(Gly)，白胺酸(Leu)，苯丙胺酸(Phe)，絲胺酸(Ser)或蘇胺酸(Thr)，如美國專利申請案公開號2003/0069395或Dennis等人所述者(Dennis,M.S.,Zhang,M.,Meng,Y.G.,Kadkhodayan,M.,Kirchhofer,D.,Combs,D.與Damico,L.A.(2002年)，生物化學期刊，第277卷，第35035-35043頁)。

鏈球菌G蛋白(Streptococcal protein G, SpG)為存在於數種鏈球菌菌株表面上的雙官能受體，且其能夠與IgG和血清白蛋白兩者結合(Bjorck等人，分子免疫學期刊，第24卷：第1113頁，1987年)。該結構與數個結構上與功能上不同的區域高度重複(Guss等人，歐洲分子生物學組織期 刊，第5卷：第1567頁，1986年)，更確切地說，是三個免疫球蛋白結合區域和三個血清白蛋白結合區域(Olsson等人，生物化學歐洲期刊，第168卷：第319頁，1987年)。在SpG中該三個血清白蛋白結合區域之一的結構已被確定，顯示一個三螺旋束摺疊(Kraulis等人，FEBS快報，第378卷：第190頁，1996年；Johansson等人，生物化學期刊，第277卷：第81期，第14-20頁，2002年)。一個46個胺基酸模體被定義為ABD(白蛋白結合區域，albumin binding domain)，且隨後也被命名為G148-GA(GA為G蛋白相關的白蛋白結合)。例如，在PCT公開號WO2009/016043中，揭露了該46個胺基酸模體ABD的白蛋白結合變體。

除了在G蛋白中的那些區域之外，其它細菌白蛋白結合區域也已確定，其中一些在結構上相似於G蛋白的那些區域。含有這樣的白蛋白結合區域的蛋白質的實例為PAB、PPL、MAG與ZAG蛋白(Rozak等人，生物化學期刊，第45卷：第3263-3271頁，2006年)。這樣的白蛋白結合區域的結構與功能的研究已經進行並，如由Johansson及其同僚所報導(Johansson等人，分子生物學期刊，第266卷：第859-865頁，1997年)。此外，Rozak等人報導了G148-GA3的人工變異體的創造，其被選中並就不同的物種的特異性與穩定性進行研究(Rozak等人，生物化學期刊，第45卷：第3263-3271頁，2006年)，而Jonsson等人發展了對人血清白蛋白具有非常大改善的親和力的G148-GA3人工變異體(Jonsson等人，蛋白質工程、設計、篩選期刊，第21卷：第515-27頁，2008年)。對於某些變異體而言，具有更高的親和力的代價是降低熱穩定性。

除了上述含有該三螺旋的蛋白質之外，也有其他結合白蛋白 的不相關的細菌蛋白質。

最近，在鏈球菌G蛋白菌株148(G148)的白蛋白結合區域內進行實驗識別出一些T-與B-細胞抗原決定位(Goetsch等人，臨床與診斷之實驗室免疫學期刊，第10卷：第125-32頁，2003年)。該研究的作者對利用G148的T細胞抗原決定位有興趣，亦即利用該白蛋白結合區域的固有的免疫刺激特性。Goetsch等人還發現了一個B細胞抗原決定位，亦即在免疫後在G148的序列中與抗體結合的一區域。

然而，在對人類給藥的藥物組合物中，需要的是無免疫反應。因此，該白蛋白結合區域G148是因為這樣而不適合用於此類組合物，因為其上述的免疫刺激特性。這些缺點和缺陷可由，例如，在PCT公開號WO2012/004384中揭露的工程化的白蛋白結合多胜肽來克服或減緩，其係通過引用的方式將其整體併入本文中。

在這方面，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可與一白蛋白結合蛋白結合，其係透過一或多個胜肽鍵連接子，例如GGG與KLGGGG作為非限定的實例，與人類血清白蛋白(“HSA”)結合。在某些具體實施例中，如白蛋白結合蛋白可能是一種白蛋白結合區域，例如鏈球菌G蛋白菌株148(G148)。在某些其他的具體實施例中，白蛋白結合蛋白可能是一個工程化的白蛋白結合多胜肽。例如，該白蛋白結合多胜肽可以具有包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列。SEQ ID NO：85的白蛋白結合多胜肽可在某些具體實施例中從而具有額外的胺基酸殘基，其係附著在任一末端，如三個胺基酸KLN。在這方面，本發明提供了示例性的共軛脂質運載蛋白突變蛋白，其包含如SEQ ID NO：83-84任一項所述之胺基酸序列。

在其它具體實施例中，白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段可以用來作為本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的結合配偶體。術語「白蛋白」包括所有哺乳動物白蛋白，例如人類血清白蛋白(“HSA”)或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可以重組方式產生，如美國專利號5,728,553或歐洲專利申請號EP 0 330 451與EP 0 361 991中描述者。作為一個代表性的實例，重組人類白蛋白(Recombumin®)Novozymes Delta有限公司(諾丁漢，英國)可與一脂質運載蛋白突變蛋白共軛結合或融合以延長該突變蛋白的半衰期。

若白蛋白結合蛋白是一抗體片段，其也可以是一區域抗體。工程化的區域抗體可精確地控制生物物理特性與體內半衰期，以建立最佳的安全性和與效性的產品概況。區域抗體係例如購自Domantis有限公司(劍橋，英國以及麻州，美國)。

使用轉鐵蛋白作為一蛋白部分來擴展本發明之突變蛋白的血清半衰期，該突變蛋白可以遺傳融合至非糖基化轉鐵蛋白的N或C端或兩端。非糖基化轉鐵蛋白具有14-17天的半衰期，且轉鐵蛋白的融合蛋白也將具有相似的延長的半衰期。轉鐵載體也提供高生物利用度、生物分佈與循環穩定性。這種技術可自BioRexis公司購得(BioRexis製藥公司，賓州，美國)。作為蛋白質穩定劑/半衰期延長配偶體的重組人類轉鐵蛋白(DeltaFerrin^TM)也是購自Novozymes Delta有限公司(諾丁漢，英國)。

若一免疫球蛋白的Fc部分被用於延長本發明之突變蛋白的血清半衰期之目的上，則可使用購自Syntonix藥廠(麻州，美國)的SynFusion ^TM技術。使用此Fc融合技術可創造長效生物製藥，且可例如包括 連接到一抗體的Fc區的突變蛋白的兩個拷貝，以提高藥物動力學、溶解度和生產效率。

然而，延長本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的半衰期的另一替代方案為，將長的、非結構化的、彈性的富含甘胺酸的序列(例如，聚-甘胺酸與大約20至80個連續甘胺酸殘基)融合至本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的N-或C-端。此方法揭露於例如，WO2007/038619中，也稱為術語“rPEG”(重組PEG)。

若聚亞烷基二醇分子被用於延長本發明之突變蛋白的血清半衰期之目的上，則聚亞烷基二醇可為被取代、未被取代、直鏈或支鏈的。它也可以是一種活化的聚亞烷基衍生物。適合的化合物的實例為聚乙二醇(PEG)分子或其活化的衍生物，如在WO 99/64016、在美國專利6,177,074或美國專利6,403,564中有關干擾素的描述，或描述其他蛋白質例如經PEG修飾的天門冬醯胺酶、PEG-腺苷脫氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(見例如，Fuertges等人(1990年)，聚(乙二醇)修飾的蛋白質的臨床療效，控制釋放期刊，第11卷，第139-148頁)。這樣的聚合物，例如聚乙二醇，的分子量可為約300至約70000道爾頓，包括，例如，聚乙二醇具有大約10,000的分子量，為約20,000、約30,000或約40000道爾頓。此外，由於例如在美國專利號6,500,930或6,620,413中所述，碳水化合物寡-與聚合物，如澱粉或羥乙基澱粉(HES)，可與本發明之突變蛋白共軛連接以達到延長血清半衰期的目的。在某些進一步的具體實施例中，為了延長本發明之突變蛋白的血清半衰期，建議使用PEG30或PEG40，其在動物/人類可進行正常腎過濾，而非較短的PEG，因為，亦即更快的消除PEG12或PEG20可能 會限制本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的PEG-共軛連接(聚乙二醇化)的效力和效期。在這方面，本發明提供了示例性的可與PEG-共軛連接的如SEQ ID NO：30-32所示之脂質運載蛋白突變蛋白。

在另一個具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可融合到一或多個蛋白部分，其可賦予該融合物新特性，例如酵素活性或與其它分子的結合親和力。這類適合的蛋白部分的實例為鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、穀胱甘肽-S-轉移酶、G蛋白的白蛋白結合區域、蛋白A、抗體片段、寡聚化區域、相同或不同的結合特異性的脂質運載蛋白突變蛋白(其導致形成"Duocalins"，參見Schlehuber S.與Skerra A.(2001年)，Duocalins，衍生自脂質運載蛋白折疊的具有雙特異性的工程化的配體結合蛋白，生物化學期刊，第382卷，第1335-1342頁)或毒素。

特別是，可將本發明之脂質運載蛋白突變蛋白與一單獨的酵素活性位點融合，使產生的融合物的兩個「部件」可以一起作用於一個給定的治療標的上。例如，當融合在一起時，脂質運載蛋白突變蛋白的結合區域可附於一致病目標上，從而使該酵素區域消除該標的物的生物學功能。

若上述蛋白部分之一與本發明之人類淚液脂質運載蛋白突變蛋白共軛連接，共軛連接至胺基酸側鏈是有利的。適合的胺基酸側鏈可以天然存在於人類淚液脂質運載蛋白的胺基酸序列中，或可透過誘發突變將其引入。在適合的結合位置是以誘發突變的方式被引入的情況下，一種可能性是在一適當的位置上將一胺基酸置換為一半胱胺酸殘基。在一具體實施例中，這樣的突變包括至少一個蘇胺酸(Thr)40→半胱胺酸(Cys)，麩胺 酸(Glu)73→半胱胺酸(Cys)，精胺酸(Arg)90→半胱胺酸(Cys)，天門冬胺酸(Asp)95→半胱胺酸(Cys)或麩胺酸(Glu)131→半胱胺酸(Cys)的替換。在任意位置的新創造之半胱胺酸殘基可在以下被用於共軛連接該突變蛋白與延長該突變蛋白的血清半衰期之蛋白部分，例如PEG或其活化的衍生物。

在另一具體實施例中，為了提供適合的胺基酸側鏈以將上述蛋白部分之一與本發明之突變蛋白共軛連接，人造胺基酸可藉由誘發突變的方式引入。一般而言，這樣的人造胺基酸被設計成更具反應性，從而有助於與所需的蛋白部分共軛連接。這種可透過一人造tRNA被引入的人造胺基酸的一個實例為對-乙醯基-苯丙胺酸。

在某些具體實施例中，根據本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可包含一訊號序列。在一多胜肽的N端的訊號序列將這個多胜肽引導至一特定的細胞腔室內，例如大腸桿菌的胞外質或真核細胞的內質網。許多訊號序列為本領域已知的。用於將一多胜肽分泌至大腸桿菌的胞外質的示例性訊號序列為OmpA-訊號序列。

本發明還涉及包括編碼如本文所述之突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子(DAN與RNA)。由於遺傳密碼子的簡並性允許某些密碼子以其他指定相同胺基酸的密碼子所取代，本發明並不限於特定編碼本發明之突變蛋白的核酸分子，而是包括所有包含編碼一功能性突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子。在這方面，本發明提供編碼本發明之某些脂質運載蛋白突變蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO：36-61、72-81與86-89所示)。

因此，本發明包括編碼根據本發明之突變蛋白的核酸序列，其具有在成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的胺基酸位置 26-34、56-58、80、83、104-106以及108上至少一個密碼子的突變，其中編碼在該成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的胺基酸位置61與153上的半胱胺酸殘基之至少一者的密碼子被突變為編碼任何其他的胺基酸殘基。在某些進一步的具體實施例中，編碼根據本發明之突變蛋白的核酸序列在該成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的胺基酸位置79、92與105上的任一位置上俱有至少一個密碼子的突變。

如本文所揭露的內容也包括編碼本發明之淚液脂質運載蛋白突變蛋白的核酸分子，其包括試驗誘發突變所指示的序列位置之外的額外的突變。這種突變通常可被容忍，甚至被證明是有利的，例如，若其對於該突變蛋白的改進折疊效率、血清穩定性、熱穩定性或配體結合親和力具有貢獻的話。

在本申請中所揭露的核酸分子可被「可操作地連接」至一調控序列(或調控序列群)，以表現該核酸分子。

如果一核酸分子包括含有關於轉錄及/或轉譯調控的序列元素，且這樣的序列為「可操縱地連結」至編碼該多胜肽的核苷酸序列，該核酸分子，如DNA，則被稱為「可表達一核酸分子」或有能力「使核苷酸序列表達」。一可操作的連接為一連接子，其中其調節序列元件與被表達的序列以使基因表達的方式連接。基因表達所需之調節區域的確切性質在不同物種之間有所不同，但一般而言，這些區域包括一個啟動子，其在原核生物中，包含啟動子本身，亦即指導轉錄作用啟動的DNA分子，以及DNA元件其中，當轉錄成RNA時，將發出轉譯起始的訊號。這樣的啟動子區域通常包括涉及轉錄與轉譯起始的5'非編碼序列，如該-35/-10區塊以及在原 核生物中的Shine-Dalgarno元件或在真核生物中的TAIA區塊、CAAT序列，以及5'-加帽元件。這些區域還可以包括增強子或抑制子元件，以及用於將天然多胜肽定位至一宿主細胞的特定腔室的轉譯訊號以及前導序列。

此外，在3'端非編碼序列可以含有參與轉錄終止、聚腺苷酸化或類似的調控元件。然而，如果這些終止序列不是在特定宿主細胞中具有令人滿意的功能，那麼它們可以在該細胞中被替換為具有信號功能者。

因此，本發明之核酸分子可以包括調節序列，如啟動子序列。在某些具體實施例中，本發明之核酸分子包括一啟動子序列以及一轉錄終止序列。適合的原核啟動子為，例如，tet啟動子、lacUV5啟動子或T7啟動子。在真核細胞中表現用的啟動子的實例為SV40啟動子或CMV啟動子。

本發明之核酸分子也可以是一個載體或任何其他類型的選殖載體，如質體、噬質體、噬菌體、桿狀病毒、黏質體或人工染色體的一部分。

在一具體實施例中，該核酸分子包含在噬質體中。一噬質體載體是指編碼一溫和噬菌體，如M13或f1，或與目標cDNA融合的該功能部分的基因間隔區的載體。將這樣的噬質體載體以及一適當的輔助噬菌體(例如M13K07、VCS-M13或R408)與該細菌宿主細胞進行超感染後，產生完整的噬菌體粒子，從而使編碼的異源cDNA與呈現於該噬菌體表面的相應之多胜肽進行物理耦合(見例如，Lowman HB(1997年)，生物物理學與生物分子結構年度回顧期刊，第26卷，第401-424頁，或Rodi,D.J.與Makowski L. (1999年)，生物技術當代意見期刊，第10卷，第87-93頁)。

這樣的選殖載體可包括，除了上述的調控序列以及編碼本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的核酸序列之外，衍生自與用於表現及篩選賦予轉化或轉染的細胞可選擇的表型之標記物的宿主細胞相容的物種的複製及控制序列。許多適合的選殖載體為本領域已知的，並且是市售的。

編碼本發明之脂質運載蛋白突變蛋白的DNA分子，特別是含有編碼這樣的脂質運載蛋白突變蛋白的序列的選殖載體可被轉化為能表現該基因的宿主細胞。轉化可透過使用標準技術來進行。因此，本發明還涉及包含如本文所揭露之核酸分子的宿主細胞。

轉型的宿主細胞是在適合表現編碼本發明之融合蛋白的核苷酸序列的條件下培養的。適合的宿主細胞可以是原核細胞，如大腸桿菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌，或真核細胞，例如釀酒酵母、畢赤酵母、SF9或High5昆蟲細胞、永生化的哺乳動物細胞株(如HeLa細胞或CHO細胞)或初代哺乳動物細胞。

本發明還涉及一種製造本發明之突變蛋白的方法，其中該突變蛋白、該突變蛋白的片段或該突變蛋白的融合蛋白以及其他多胜肽，係透過遺傳工程方法的手段自編碼該突變蛋白的核酸開始製造的。該方法可以在活體內進行，該突變蛋白可以例如在細菌或真核宿主生物體中製造，然後從該宿主生物體或其培養物中分離。亦可以藉由例如使用體外轉譯系統而在體外製造蛋白。

當在活體內製造該突變蛋白時，編碼本發明之突變蛋白的核酸係以透過重組DNA技術的手段(如上面已經概述的)被引入一適合的細菌 或真核宿主生物體中。為了這個目的，該宿主細胞首先使用已建立的標準方法，與一含有編碼本發明之突變蛋白的核酸分子的選殖載體進行轉型。該宿主細胞接著在可使該異質DNA表現的條件下培養，從而合成其相應之多胜肽。隨後，自該細胞或自該培養基中回收該多胜肽。

在本發明之某些淚液脂質運載蛋白突變蛋白中，該介於半胱胺酸(Cys)61與半胱胺酸(Cys)153之間天然存在的雙硫鍵被移除。據此，這樣的突變蛋白(或任何其它不包含分子內雙硫鍵的淚液脂質運載蛋白突變蛋白)可以在具有還原氧化環境的細胞隔間中被製造，例如，在革蘭氏陰性菌的細胞質中。在本發明的脂質運載蛋白突變蛋白含有分子內雙硫鍵的情況下，可能期望使用適當的訊號序列將新生的多胜肽望引導至一具有氧化還原環境的細胞隔間中。這種氧化環境可由革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌，的胞外質、在革蘭氏陽性細菌的細胞外環境，或在真核細胞的內質網的內腔中所提供，並且通常有利於結構的二硫鍵的形成。然而，也可能在宿主細胞中，例如大腸桿菌，的細胞質中製造本發明之突變蛋白。在這種情況下，該多胜肽可以是直接獲得可溶且折疊的狀態，或者以包涵體的形式恢復，隨後在體外復性。另一種選擇是使用具有氧化性的細胞內環境之特定宿主菌株，因此其可在細胞質中形成雙硫鍵(Venturi M等人(2002年)，分子生物學期刊，第315卷，第1-6頁)。

然而，並不是一定要透過使用基因工程技術來生產或製造本發明之脂質運載蛋白突變蛋白。相反的，脂質運載蛋白突變蛋白也可透過化學合成，如Merrifield固相多胜肽合成法或藉由體外轉錄與轉譯而獲得。例如，可能是使用分子建模來識別有希望的突變，然後在體外合成所 要的(設計的)多胜肽，並調查其與一給定的目標物的結合活性。蛋白質的固相及/或溶液相合成的方法為本領域所習知的(見例如Bruckdorfer T.等人(2004年)，當代醫藥生物技術期刊，第5卷，第29-43頁)。

在另一具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可使用本領域技藝者所知悉的行之有效的方法藉由在體外轉錄/轉譯而被製造。

如上面的揭露而明顯的，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白或其融合蛋白或其共軛連結物因此可以用於許多應用中。一般而言，本文所揭露之突變蛋白及其衍生物可以因此被用於許多類似抗體或其片段的領域中。因此，在醫學上存在本發明之突變蛋白的眾多可能的應用。

例如，本發明涵蓋使用本發明之一或多種脂質運載蛋白突變蛋白或一或多個包含這種突變蛋白的組合物，以在一個體中與PCSK9結合及/或在一個體中抑制PCSK9與低密度脂蛋白受體(LDL-R)的結合。在某些具體實施例中，這種使用方法包括向該個體施用有效量的本發明之一或多個突變蛋白或一或多個包含這種突變蛋白的組合物。在這方面，本申請還揭露了與PCSK9結合以及在一個體中抑制PCSK9對LDL-R的結合的方法，包括施予該個體一有效量的本發明之一或多種脂質運載蛋白突變蛋白或一或多個包含這種突變蛋白的組合物。

在本發明的另一方面，本發明涉及使用本發明之脂質運載蛋白突變蛋白而與PCSK9形成複合物。在這方面，還應該指出，各個突變蛋白及其配體之間的複合物的形成受到許多不同的因素影響，例如各自的結合配偶體的濃度、競爭者的存在下、所用之緩衝系統的pH值與離子強度，以及用於確定K_D(例如螢光滴定、競爭性ELISA或表面電漿子共振， 僅舉幾例)的實驗方法，或者甚至是用於評估實驗數據的數學演算法。

在某些具體實施例中，本文所揭露之本發明脂質運載蛋白突變蛋白可被用來偵測PCSK9。這樣的使用可包括在適合的條件下，將該突變蛋白與一懷疑含有給定的配體的樣品接觸，從而形成該突變蛋白與該給定的配體之間的複合物，以及藉由一適合的訊號偵測該複合物突變蛋白之步驟。

該可偵測的訊號可藉由一標記而被引起，如上所解釋者，或藉由因為，即該複合物本身結合的原因而造成之物理性質的改變。一個實例為表面電漿子共振，其值在來自被固定在一表面上，如金箔，其中之一的結合配偶體的結合期間而改變。

在另一方面中，本發明提供了包含本發明之至少一種突變蛋白的套組，以及一或多個針對使用該套組的操作手冊。

在某些具體實施例中，該套組進一步包括一體或與其作為一個或多個單獨的文件、關於內容或該套組以及本發明之一或多個突變蛋白的使用的資訊。該套組可包括本發明之一或多個突變蛋白，其係在一稀釋劑中被配製以用於重建。這樣的稀釋劑，例如無菌稀釋劑，也可包括在該套組中，例如在一容器內。

本文所揭露之脂質運載蛋白突變蛋白也可用於PCSK9的分離。這樣的使用可包括在適當的條件下將該突變蛋白與一應當含有該配體的樣品接觸，從而形成該突變蛋白與該配體之間的複合物，且自該樣品中分離該突變蛋白/配體複合物之步驟。

在將本發明之突變蛋白用於偵測PCSK9以及分離PCSK9的 使用上，該突變蛋白及/或PCSK9可被固定在一個適合的固相上。

在某些具體實施例中，本發明之一或多個脂質運載蛋白突變蛋白也可被用於將一化合物對準至一預選要以該化合物處理的生物體、組織、器官或細胞，其中PCSK9存在於這樣的生物體、組織、器官或細胞中。對於這樣的目的，該突變蛋白與有興趣之化合物接觸，以形成複合物。然後，包括該突變蛋白與有興趣之化合物的複合物被遞送到該預選的生物體、組織、器官或細胞中。這種使用特別適合，但並不限於，用於遞送藥物(選擇性)至一預選的生物體、組織、器官或細胞，例如受感染的身體部位，其應該要以該藥物治療。除了形成突變蛋白與有興趣之化合物之間的複合物之外，該突變蛋白也可以與給定的化合物進行反應，以得到突變蛋白和化合物的共軛連結物。類似於上述複合物，這種共軛連結物可以適合於遞送該化合物至該預選的生物體、組織、器官或細胞。這種突變蛋白與化合物的共軛連結物還可以包括彼此共價連接突變蛋白與化合物的連接子。任選地，這樣的連接子在血液中是穩定的，但在細胞環境中是可切割的。

對本領域技藝者而言，經審查以下之實施例及其所附之圖式，其並非意圖用以限制，本發明之額外的目的、優點，以及特徵將變得明顯。因此，應當理解的是，雖然本發明藉由示例性具體實施例以及任選的特徵進行特定的揭露，但修改以及本文所揭露於其中的公開內容的變化可以訴諸本領域技藝者，且這樣的修改及變化被認為在本發明的範圍之內。

實施例

實施例1：重組人類PCSK9與人類PCSK9突變的製造與特性描述

包含一個C-端FLAG標記的人類PCSK9(SEQ ID NO：34)在轉染的HEK293F細胞中表現。600ml的轉染細胞被培養於DMEM/TS/0.05% BSA培養基中6天，且回收含有該hPCSK9的上清液。hPCSK9與FLAG M2樹脂結合，以50CV洗滌緩衝液(10mM Tris/HCL pH7.4，150ml NaCl，2mM CaCl₂，10%甘油)清洗，並以含有100μg/ml 3×FLAG胜肽的5CV洗滌緩衝液流洗。流洗的蛋白通過使用Superdex 200 16/60管柱(GE Healthcare公司)的凝膠過濾進一步純化。使用HepG2細胞以LDL-R細胞ELIAS進行功能測試。

針對有興趣之脂質運載蛋白突變蛋白的選擇與篩選，hPCSK9可被生物素化。在室溫下以5倍莫爾過量的EZ-Link的NHS-生物素的顯色試劑(Thermo Scientific公司)培養hPCSK9 1小時。去除過量的生物素且被生物素化的蛋白質以超過濾進行濃縮。以Streptacin下拉檢測確認生物素化作用。

以相同方法製造並定性獲得之功能性hPCSK9_D374Y突變、食蟹獼猴的PCSK9以及小鼠PCSK9。

實施例2：具有2x10 ¹⁰ 個獨立脂質運載蛋白突變蛋白的基因庫的產生以及抗PCSK9的脂質運載蛋白突變蛋白的噬質體篩選

以成熟人類淚液脂質運載蛋白的隨機誘發突變產生具有高度多樣性的2x10¹⁰個脂質運載蛋白突變蛋白的隨機基因庫(見，例如，WO2007/107563)。為了篩選對PCSK9特異性的脂質運載蛋白突變蛋白，來 自該基因庫的2x10¹²個噬質體與200nM生物素化的人類及/或食蟹獼猴的PCSK9培養。塗覆中性親和素或鏈霉親和素的順磁性磁珠被用來捕捉PCSK9/噬質體複合物，其隨後以磁鐵分離之。以1ml PBS/T清洗該磁珠8次以去除未結合的噬質體。結合的噬質體則先以三乙胺流洗一次，然後再以0.1M甘胺酸pH2.2流洗一次。進行連續4輪的篩選。

使用標準方法(Sambrook等人(1989年)分子選殖：實驗室手冊)以BstX1進行DNA酶切且隨後透過瓊脂凝膠電泳純化以分離噬菌體呈現篩選後所得到的噬質體製備物的誘導突變中央匣。將DNA插入到經過同樣酶切的載體pTlc10中，其在四環黴素啟動子的控制下可使細菌製造突變蛋白。以氯化鈣處理之勝任TG1-F’細胞與連接混合物進行轉型，並接種於LB/Amp平板培養基上。取單顆菌落接種於2xYT/Amp培養基並培養整夜(14-18小時)至穩定期。隨後，自穩定期培養物中取出50μl 2xYT/Amp進行接種並於37℃下培養3小時，然後轉移到22℃下繼續培養，直到OD₅₉₅吸光值達到0.6-0.8。以添加10μl 2xYT/Amp並補充1.2μg/ml無水四環黴素以誘導抗運載蛋白的產生。培養物於22℃下培養至隔天。將40μl的5%(重量/體積)BSA加入PBS/T中，並於25℃下陪養1小時後，培養物準備用於篩選測定。

針對脂質運載蛋白突變蛋白的篩選，人類與石蟹獼猴的PCSK9(1μg/ml於PBS/T中)，其皆帶有FLAG標記，以抗FLAG標記抗體(Sigma Aldrich公司，聖路易斯，密蘇里州)的方法，該抗體以在PBS中5μg/ml的最終濃度在前一天被塗覆於一微量滴定板上，以將PCSK9捕獲於該微量滴定板上。抗Flag標記抗體單獨作為負對照組。接著，添加20μl的 BSA阻隔培養物，並於25℃下培養1小時。以1：10000稀釋的與辣根過氧化物酶共軛結合的抗-T7抗體(“HRP”，默克集團，達姆施塔特)在PBS/T中偵測結合的突變蛋白。針對定量，加入20μl QuantaBlu螢光過氧化物酶基質，並於激發波長320nm以及發散波長430nm下測量。

實施例3：PCSK9特異性脂質運載蛋白突變蛋白的優化偏置成熟基因庫的產生

對於從上述實施例2中的脂質運載蛋白基因庫中鑑定的PCSK9特異性突變蛋白的優化，基於脂質運載蛋白突變蛋白SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：7(在此實施例中，以下簡稱為「母選殖系」)，分別生成額外的基因庫。以造成只有所選位置的偏隨機方式產生該些基因庫。該設計被製成，使得對於每一個所選擇的位置中，在相應的母選殖系的胺基酸中可找到該對應胺基酸編碼的機率為70%，而其為一個不同的胺基酸的機率為30%。每個選殖系交換的最大可能數目為N x(1-B)，其中N為目標位置的數目且B為偏差。例如，在母選殖系的胺基酸具有70%的偏差，如果有20個胺基酸位置被部分隨機化，這將導致在突變基因庫整體平均含有6個突變，與母選殖系相比，但僅在目標位置上而已。然而，並非所有的選殖系都會有6個交換：每個選殖系突變的頻率將遵循二項式分佈，如在圖11D中所描繪。

為了組裝這樣的基因庫，使用在聚合酶連鎖反應(“PCR”)(Stemmer等人，(1995年)，基因期刊，第164卷：第49-53頁)中進行寡核苷酸的遞歸裝配反應。以標準亞磷醯胺化學產生寡核苷酸(Beaucage等人，(1981年)，四面體通訊期刊，第22卷，第1859-62頁；McBride等人， (1983年)，四面體通訊期刊，第24卷，第245-8頁)。為了允許一個70%偏差的編碼，我們為該20種經典胺基酸的核苷酸三聯體的每一個位置計算了優化的混合物。例如，編碼絲胺酸的混合物具有70%的偏差，並允許在剩餘的30%中有各種不同的胺基酸，是由核苷亞磷醯胺塊"abc"的混合物產生的，其中a對應於85%的胸腺嘧啶核苷的混合物，以及各5%的亞胺基二甲胺、胞嘧啶以及腺苷，b對應於85%的胞嘧啶混合物與各5%的其它核苷，以及c對應於50%的亞胺基二甲胺與50%的胸腺嘧啶核苷的混合物(見圖11)。

使用上述的技術，所述基於SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：7的基因庫分別以遞歸PCR產生。隨後，將生成的脂質運載蛋白突變蛋白以高效率地選殖進入一基本上如描述的噬質體載體中(見，例如，Kim等人，(2009年)，美國化學協會期刊，第131(10)卷：第3565-76頁)。該基因庫的大小為7x10⁹至11x10⁹個突變體。這些基因庫被用於隨後的噬菌體篩選(見實施例4)。

實施例4：優化的抗PCSK9脂質運載蛋白突變蛋白的噬質體篩選

為了篩選優化的PCSK9特異性脂質運載蛋白突變蛋白，使用自實施例3中描述的基因庫的2x10¹²個噬質體。噬質體被溶解在補充有0.1% Tween-20(體積/體積)、50mM芐脒與1%(重量/體積)酪蛋白的PBS中(亦即PBS/T)。為了篩選具有增加的親和力的脂質運載蛋白突變蛋白，噬質體與降低濃度介於0.01-10nM的生物素化的PCSK9蛋白一同培養。在某些情況下，噬質體在65℃下培養10分鐘以篩選具有增加熱耐受性的突變蛋白。阻 隔的噬質體與生物素化的PCSK9蛋白培養40分鐘，之後加入0.3mM脫硫生物素到該溶液中，以飽和游離的鏈霉親和素結合位點，並繼續培養20分鐘。接著，阻隔(1%(重量/體積)酪蛋白在PBS/T中)，且加入消耗的順磁珠，其塗覆鏈霉親和素或中性親和素，20分鐘來捕獲PCSK9-噬質體複合體。使用1ml PBS/T清洗磁珠八次以去除未複合的噬質體，透過徹底的再懸浮隨後以磁鐵收集珠子。為了特定地篩選具有降低的k_off率的突變蛋白，在第一輪之後以更嚴格的清洗程序進行額外5次清洗步驟，第2輪之後10次，第3輪之後15次，以及第4輪之後20次，或者將突變蛋白-PCSK9複合物與不同量(10nM-5μM)的純化親本突變蛋白(如SEQ ID NOs：3、4或7)一起培養，使優化的與親本脂質運載蛋白突變蛋白之間競爭PCSK9結合。此外，這兩種方法的組合被應用。結合的噬質體首先以300μl 70mM三乙胺流洗10分鐘，隨後立即以100μl 1M Tris-Cl pH6.0中和上清液。經過一個中間清洗的循環之後，剩餘的噬質體以100mM甘胺酸pH 2.2流洗10分鐘，隨後立即以50μl 0.5M Tris-base中和。流洗部分被匯集，並用於感染4ml對數期的大腸桿菌培養物(OD₅₅₀ 0.45-0.6)以進行再擴增。在攪拌的條件下培養30分鐘後，以5000xg離心2分鐘收集細菌，再懸浮於1ml的2×YT培養基中，並接種在3個大的LB/Amp瓊脂平板上(10g/l細菌用胰蛋白腖、5g/l酵母萃取物、5g/l氯化鈉，pH 7.5，15g/l瓊脂、100μg/ml氨芐青黴素)。平板於32℃下培養整夜。感染的細胞以補充有100μg/ml氨芐青黴素的50ml 2xYT培養基(2xYT/Amp)從瓊脂平板上刮下。將適當體積的細菌懸浮液接種於50ml 2xYT/Amp培養基中，使OD₅₅₀達到0.08。該培養物在37℃下於一振盪器上(160rpm)培養直到OD₅₅₀達到0.5，然後以溫和攪拌培養15分鐘且於37℃下於一振盪器上培養45分鐘以感 染輔助噬菌體(1.5x10¹¹pfu)。隨後，加入卡那黴素至70μg/ml的終濃度以篩選感染輔助噬菌體的細菌。最後，加入25ng/ml無水四環黴素以誘導pIII-脂質運載蛋白的表現。

實施例5：以篩選來進行PCSK9特異性薄層層析突變蛋白的鑑定

如實施例4中所述，使用標準方法(Sambrook等人，1989年)以BstX1進行DNA酶切且隨後透過瓊脂凝膠電泳純化以分離噬菌體呈現篩選後所得到的噬質體製備物的誘導突變中央匣。將DNA插入到經過同樣酶切的載體中，其在四環霉素啟動子的控制下可使細菌製造突變蛋白。以氯化鈣處理之勝任TG1-F’細胞與連接混合物進行轉型，並接種於LB/Amp平板培養基上。取單顆菌落接種於2xYT/Amp培養基並培養整夜(14-18小時)至穩定期。隨後，自穩定期培養物中取出50μl 2xYT/Amp進行接種並於37℃下培養3小時，然後轉移到22℃下繼續培養，直到OD₅₉₅吸光值達到0.6-0.8。以添加補充有1.2μg/ml無水四環黴素的10μl 2xYT/Amp以誘導脂質運載蛋白突變蛋白的產生。培養物於22℃下培養至隔天。將40μl的5%(重量/體積)BSA加入PBS/T中，並於25℃下陪養1小時後，培養物準備用於篩選測定。

針對脂質運載蛋白突變蛋白的篩選，人類與石蟹獼猴的PCSK9(1μg/ml於PBS/T中)，以及hPCSK9-D374Y突變體，其皆帶有FLAG標記，以抗FLAG標記抗體(Sigma Aldrich公司，聖路易斯，密蘇里州)的方法，該抗體以在PBS中5μg/ml的最終濃度在前一天被塗覆於一微量滴定板上，以將PCSK9捕獲於該微量滴定板上。接著，添加20μl的BSA阻隔培養 物，並於25℃下培養1小時。以1：10000稀釋的與HRP共軛結合的抗-T7抗體(默克集團，達姆施塔特)在PBS/T中偵測結合的脂質運載蛋白突變蛋白。針對定量，加入20μl QuantaBlu螢光過氧化物酶基質，並於激發波長320nm以及發散波長430nm下測量。

對於脂質運載蛋白突變蛋白的親和力排名，在PBS中的抗Strep-標記抗體(IBA公司，哥廷根)包被於微量滴定盤上，並加入20μl BSA阻隔培養物，其可使脂質運載蛋白突變蛋白在該盤上被特異性捕獲。加入不同濃度(0.5-5nM)的生物素化的PCSK9蛋白，並在廣泛的清洗後以extravidin-HRP(Sigma Aldrich公司，聖路易斯，密蘇里州)偵測特異性結合的PCSK9蛋白。針對定量，加入20μl QuantaBlu，並於激發波長320nm以及發散波長430nm下測量。

以塗覆在微量滴定盤上的抗FLAG標記(5μg/ml在PBS中)進行競爭性脂質運載蛋白突變蛋白的篩選，隨後並捕獲hPCSK9-D374Y突變體(1μg/ml在PBS/T中)。將阻隔的培養物調整為30nM純化的LDL受體，且將之加入滴定盤中72小時以捕獲hPCSK9-D374Y突變體。這造成該系統的平衡以及競爭性突變蛋白的可靠篩選。以與HRP共軛連結的抗-組胺酸(His)標記抗體(1μg/ml在PBS/T中；Abcam公司，劍橋，英國)偵測結合的受體。針對定量，加入20μl QuantaBlu螢光過氧化物酶基質，並於激發波長320nm以及發散波長430nm下測量。

實施例6：有代表性的脂質運載蛋白突變蛋白對PCSK9的親和力

為了測量一具有有代表性群體的脂質運載蛋白突變蛋白對 生物素化的PCSK9的結合親和力，使用以表面電漿子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)為基礎的分析並利用Biacore T200儀器(GE Healthcare公司)。針對SPR親和力分析(圖1)，使用生物素捕捉套組(GE Healthcare公司)。

在每個測量週期中，將生物素捕捉試劑(GE Healthcare公司)以2μl/分鐘的流速施加到感應器晶片CAP(GE Healthcare公司)上的參考與測量通道持續5分鐘。以4μg/ml的濃度將生物素化的PCSK9以10μl/分鐘的流速注射該測量通道持續2分鐘。為了確定親和力，三至四個稀釋的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11以及SEQ ID NO：12在HBS-EP+(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M氯化鈉，3mM EDTA，0.005%界面活性劑P20)緩衝液中製備，並施加到該晶片表面，針對SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、及SEQ ID NO：12使用500、125、31與8nM的濃度，針對SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9以及SEQ ID NO：10使用300、75、19與5nM的濃度，且針對SEQ ID NO：7使用75、19與5nM的濃度。結合分析於3分鐘的接觸時間、20分鐘的解離時間以及施加30μl/分鐘的流速下進行。所有測量均在25℃下進行。感應器晶片表面CAP的再生作用係以注射6M的亞胺基甲二胺-鹽酸以及0.25M氫氧化鈉(2分鐘)，接著以運行緩衝液進行額外清洗並以2分鐘的穩定期來達成。在此測量之前，進行了由三個連續的再生作用步驟組成的一個調整週期。數據係以Biacore T200評估軟體(1.0版)來進行評估。使用雙重參照。使用1：1的結合模型以配合原始數據。

針對SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6以及SEQ ID NO：11所得到的擬合曲線分別如圖1(A-D)所示。例如，該數據顯示，SEQ ID NO：3(圖1A)對PCSK9的結合具有高親和力(K_D=0.85nM)。結合速率常數k_a或k_on、解離速率常數k_d或k_off以及為所有脂質運載蛋白突變蛋白所得到的解離常數K_D摘要於如下表1中。

實施例7：具有代表性的脂質運載蛋白突變蛋白對PCSK9作用的競爭模式

在體外使用競爭性ELISA形式測試在實施例6所揭露的脂質運載蛋白突變蛋白是否以競爭模式與PCSK9結合。在該實驗中，固定濃度的人類PCSK9(SEQ ID NO：34)或人類PCSK9_D374Y突變體係以不同濃度的脂質運載蛋白突變蛋白培養1小時。於溶液中此預培養中之後，將脂質運載蛋白突變蛋白/PCSK9混合物的等分試樣轉移至塗覆人類LDL-R的ELISA盤上，以測量未被阻隔而與hLDL-R結合的hPCSK9的濃度。

所有的培養步驟皆在300rpm震盪下執行，並且在每個培養步驟後以100μl PBS-T緩衝液(PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)，0.05% Tween 20)清洗培養盤5次，並使用Biotek ELx405選擇CW清洗機。在第一步驟中，以20μl的重組人類LDL-R(R&D Systems公司，型號2148-LD/CF)在PBS中以5μg/ml的濃度於4℃下靜置整夜以塗覆384孔螢光盤。清洗後，將LDL-R塗覆的孔以100μl PBS-T/BSA(2% BSA(牛血清白蛋白)在含有0.05% Tween 20的PBS中)於室溫(“RT”)下阻隔1小時。

固定濃度的25nM人類PCSK9或0.25nM人類PCSK9_D374Y突變體培養於溶液與(i)不同濃度的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：29以及SEQ ID NO：33的基準抗體，或者與(ii)SEQ ID NO：2作為負對照組，採用300nM的起始濃度，其係以1：3的比例連續稀釋下降至在PBS-T/BSA緩衝液中濃度為5pM。於室溫下培養1小時後，將20μl的反應混合物轉移到LDL-R-包覆的ELISA盤，在室溫下20分鐘以捕獲未結合(游離的)或非競爭性結合的PCSK9。為了將ELISA讀出結果轉化為游離的hPCSK9濃度(參見下文)，含有不同濃度的hPCSK9或hPCSK9_D374Y突變體的標準曲線，起始濃度為25/50nM(以1：3連續稀釋11次)，於PBS-T/BSA中製備，且在一MSD(MesoScaleDiscovery)盤上培養20分鐘。

為了偵測並定量結合的PCSK9，移除殘餘的上清液，且加入1：5000稀釋於PBS-T/BSA的20μl小鼠抗Flag M2-辣根過氧化物酶(“HRP”)(Sigma-Aldrich公司)，並於室溫下培養1小時。清洗後，將20μl QuantaBlu的螢光過氧化物酶基質加入到每個孔中，並在15分鐘後使用GENios Plus讀 取儀(Tecan公司)在320nm的激發波長與430nm的發散波長下測量螢光。

評估進行如下：游離的hPCSK9或hPCSK9_D374Y突變體濃度c(hPCSK9)游離/c(hPCSK9_D374Y)游離係自相對螢光訊號中計算，使用在平行測定的標準曲線，並對脂質運載蛋白突變蛋白濃度c繪圖(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：29與SEQ ID NO：33的基準抗體)。為了獲得50%的PCSK9/LDL-R複合物被阻斷時該脂質運載蛋白突變蛋白的濃度(IC50)，該曲線係以非線性回歸與單點結合模型進行擬合，根據c(PCSK9)游離=c(PCSK9)tot/(1+c(脂質運載蛋白突變蛋白)/IC50))，且總追蹤物濃度c(PCSK9)tot與上面獲得的IC50值為自由參數。使用GraphPad Prism4軟體進行曲線擬合。

綜上所述，SEQ ID NO：2的負對照組不與PCSK9結合；相反地，當與hLDL-R競爭時，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8顯現出對hPCSK9與hPCSK9_D374Y突變體的強競爭性結合。擬合的IC50值如下表2以及圖2(A與B)所示。脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NOs：3、4以及6-9)的競爭性模式作用顯示出有二個，野生型與突變體PCSK9。在競爭性ELISA中使用hPCSK9的IC50值單獨受到25nM的固定濃度影響。在競爭性ELISA中使用0.25nM hPCSK9_D374Y突變體，IC50值受到脂質運載蛋白突變蛋白的親和力，以及該固定突變體的濃度影響。

表2：

實施例8：具有代表性的脂質運載蛋白突變蛋白對PCSK9的特異性與物種交叉反應

脂質運載蛋白突變蛋白的特異性和物種交叉反應(圖3(A-D))係以結合ELISA進行測定，其原理如下：生物素化的配體(人類PCSK9、人類PCSK9_D374Y、小鼠PCSK9，以及食蟹獼猴PCSK9)被捕捉於以中性親和素包覆的ELISA盤上，並且加入可變濃度的脂質運載蛋白突變蛋白。以兔抗Streptag II抗體(GenScript公司，型號：A00626)與HRP標記的抗兔IgG抗體(Jackson ImmunoResearch公司，型號：211-035-109)來偵測結合的脂質運載蛋白突變蛋白。

在下面詳細的實驗方案中，培養與清洗步驟以上面實施例7中所述的競爭性ELISA方案來執行。以20μl的中和親和素在PBS中以5μg/ml的濃度於4℃下靜置整夜以塗覆一適合用於螢光測量的384孔盤(Greiner公司，FLUOTRAC^TM600，黑色平底、高結合)。清洗後，將中和親和素塗覆的孔以100μl阻隔緩衝液(PBS-T/BSA)於室溫下阻隔1小時。再次清洗後，20μl生物素化的配體，無論是人類PCSK9、人類PCSK9_D374Y、小鼠PCSK9或食蟹獼猴PCSK9，加入在PBS-T/BSA中1μg/ml的濃度，並於室溫下放置1小時。過量的配位體以進一步的清洗步驟去除。

將脂質運載蛋白突變蛋白的濃度調整至100nM，接著溶液係以1：3的比例連續稀釋下降至在PBS-T/BSA緩衝液中的濃度為2nM。將體積為20μl的稀釋物轉移到該384孔盤上，使其在室溫下結合1小時。

培養之後，移除殘餘的上清液，且加入1：5.000稀釋於PBS-T/BSA的20μl抗StreptagII抗體，並於室溫下培養1小時。再次移除上清液。為了偵測結合的抗StreptagII抗體，加入20μl的小鼠抗兔IgG-HRP抗體，並於室溫下培養1小時。清洗後，20μl螢光辣根過氧化物酶基質(Quantablue公司，皮爾斯)加入到每個孔中，並進行反應15分鐘。使用Safire微量盤讀取儀(Tecan公司)讀取在該盤上每個孔的螢光強度的相對螢光單位(relative fluorescence units，RFU)。為了得知脂質運載蛋白突變蛋白在何濃度下最大螢光訊號可達到50%(EC50)，該曲線係以非線性回歸與單點結合模型進行擬合，根據RFU=RFUmax．c(脂質運載蛋白突變蛋白)/(EC50+c(脂質運載蛋白突變蛋白))，且最大相對螢光RFUmax與EC50值為自由參數。使用GraphPad Prism4軟體進行曲線擬合。

綜上所述，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：9與人類PCSK9、人類PCSK9_D374Y突變體、小鼠PCSK9或食蟹獼猴PCSK9的結合可被偵測到，而SEQ ID NO：2的負對照組則顯示不與任何這些目標物結合。擬合的EC50值如下表3所示。人類PCSK9以及食蟹獼猴PCSK9的EC50值相當，顯示脂質運載蛋白突變蛋白與食蟹獼猴PCSK9完全交叉反應。對小鼠PCSK9的親和力則相似或最多低10倍，而對人類PCSK9_D374Y突變體的EC50值則與在人類PCSK9獲得的值相似。

實施例9：在以細胞為基礎的分析中由脂質運載蛋白突變蛋白介導恢復的Dil-標記的LDL攝取的向下調節

採用一以細胞為基礎的分析來證明PCSK9結合的脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ NO：3、SEQ NO：4、SEQ NO：6、SEQ NO：7及SEQ NO：8)的能力，以中和PCSK9介導的還原表面LDL-R分子的數量，以及導致在HepG2細胞中恢復向下調節的LDL的攝取。SEQ ID NO：2作為負對照組。

在這方面，將HepG2細胞在含有10% FCS(胎牛血清)的100μl/孔DMEM培養基(PAN P04-04510)中以60,000個細胞/孔的密度接種至一96孔聚-d-賴氨酸包覆的盤上(Greiner公司，955946)。24小時後，將培養基轉換為含1% FCS的DMEM培養基(100μl/孔)。18小時後，除去培養基並換成(不含清洗步驟)含有20μg/ml LDL-Bodipy® FL(Invitrogen公司，L3483)但不含FCS的50μl DMEM培養基。以起始濃度為4000nM的脂質運載蛋白突變蛋白進行1：2連續稀釋。以含有15μg/ml PCSK9的DMEM培養基進行一稀釋系列，另一個稀釋系列則以純的DMEM培養基進行以作為對照組。脂質運載蛋白突變蛋白與PCSK9預先在室溫下培養30分鐘，然後將50μl加入 到細胞中，使得PCSK9的最終濃度為100nM。在盤上的總樣本量為100μl，且所有樣本以5倍重複測定。在不含LDL與PCSK9的DMEM培養基中、在含LDL與PCSK9的DMEM培養基中，以及在含LDL但不含PCSK9的DMEM培養基中的細胞作為對照組。

在細胞以PBS清洗之前，將帶有樣本的盤於37℃下培養6小時。盤上的孔裝有100μl PBS，且使用BMG PheraStar讀取儀在波長485/535nm下讀取細胞的螢光。

為了確定IC50值，排除5重複中最高值與最低值，且計算每個剩餘的數據點的平均值與標準差。該曲線以GraphPad Prism 4擬合，並採用非線性回歸「S形劑量-反應、可變斜率」的模型(5PL擬合)。以受刺激及未被刺激的細胞(細胞有/無PCSK9)將數據標準化。擬合的曲線如圖4所示，且計算後的IC50值被摘要於以下表4中。

實施例10：額外的脂質運載蛋白突變蛋白對PCSK9的親和力

為了測量額外的脂質運載蛋白突變蛋白對生物素化人類PCSK9(hPCSK9-Bio)的結合親和力，進行以表面電漿子共振(SPR)為基礎 的分析，並使用Biacore T200儀器(GE Healthcare公司)。針對SPR親和力分析(圖5(A-C))，使用生物素捕捉套組(GE Healthcare公司)。

在每個測量週期中，將循環生物素捕捉試劑(GE Healthcare公司)以2μl/分鐘的流速施加到感應器晶片CAP(GE Healthcare公司)上的參考與測量通道持續5分鐘。以1μg/ml的濃度將hPCSK9-Bio以10μl/分鐘的流速注射該測量通道持續2分鐘。為了確定親和力，三至四個稀釋的SEQ ID NOs：13-28的脂質運載蛋白突變蛋白(見表5)在HBS-EP+緩衝液中製備，並施加到該晶片表面，針對該突變蛋白使用128、32、8與2nM的濃度。結合分析於3分鐘的接觸時間、15分鐘的解離時間以及施加30μl/分鐘的流速下進行。所有測量均在25℃下進行。感應器晶片表面CAP的再生作用係以注射6M的亞胺基甲二胺-鹽酸以及0.25M氫氧化鈉(2分鐘)，接著以運行緩衝液進行額外清洗並以2分鐘的穩定期來達成。在此測量之前，進行了由三個連續的再生作用步驟組成的一個調整週期。數據係以Biacore T200評估軟體(1.0版)來進行評估。使用雙重參照。使用1：1的結合模型以配合原始數據。

針對一些脂質運載蛋白突變蛋白所得到的擬合曲線如圖5所示。亦即SEQ ID NO：13(圖5C)、SEQ ID NO：20(圖5A)，以及SEQ ID NO：22(圖5B)與人類PCSK9的結合具有高親和力。結合速率常數k_a或k_on、解離速率常數K_d或k_off以及針對所有突變蛋白所得到的解離常數K_D摘要於如下表5中。

實施例11：額外的脂質運載蛋白突變蛋白對PCSK9物種交叉反應

為了測量脂質運載蛋白突變蛋白SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20以及SEQ ID NO：22對生物素化人類、石蟹獼猴以及小鼠PCSK9的結合親和力，進行以表面電漿子共振(SPR)為基礎的分析，並使用Biacore T200儀器(GE Healthcare公司)。針對SPR親和力分析(圖6(A-C))，使用生物素捕捉套組(GE Healthcare公司)。

在下面的實驗方案中，捕捉、樣本結合與再生步驟，以及數據評估都依照上述實施例10中所描述的進行。為了確定親和力，四個稀釋的該突變蛋白在HBS-EP+緩衝液中製備，並施加到該晶片表面，分別使用128、32、8與2nM的濃度。

針對SEQ ID NO：20所得到的擬合曲線如圖6所示。數據顯示SEQ ID NO：20與人類PCSK9(圖6A)以及對石蟹獼猴PCSK9(圖6B)的結合具有高親和力。與小鼠PCSK9(圖6C)的結合親和力則低。結合速率常數k_a或k_on、解離速率常數K_d或k_off以及所得到的解離常數K_D摘要於如下表6中。

實施例12：額外的脂質運載蛋白突變蛋白在溶液中結合PCSK9

在溶液中，脂質運載蛋白突變蛋白及其聚乙二醇化的變異體(此處，具有支鏈PEG40)對生物素化的人類PCSK9(hPCSK9-Bio)的結合在 活體外使用競爭性電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)分析形式進行測試(圖7)。在該實驗中，恆定濃度的hPCSK9-Bio與可變濃度的脂質運載蛋白突變蛋白SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20以及SEQ ID NO：22以及聚乙二醇化的變體SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31以及SEQ ID NO：32培養1小時。在溶液中預培養之後，將脂質運載蛋白突變蛋白/PCSK9混合物的等分試樣轉移至塗覆單株基準抗體(包含SEQ ID NO：29的輕鏈與SEQ ID NO：33的重鏈)的ECL盤上，以測量未被脂質運載蛋白突變蛋白(聚乙二醇化以及非聚乙二醇化的形式)阻隔而因此能與該抗體結合的hPCSK9的濃度(圖7)。對於那些脂質運載蛋白突變蛋白作用的競爭性模式則以hPCSK9-Bio顯示。

所有的培養步驟皆在300rpm震盪下執行，並且在每個培養步驟後以80μl PBS-T緩衝液(PBS，0.05% Tween 20)清洗培養盤5次，並使用Biotek ELx405選擇CW清洗機。在第一步驟中，以20μl的基準抗體在PBS中以5μg/ml的濃度於4℃下靜置整夜以塗覆384孔MSD盤。清洗後，將LDL-R塗覆的孔以60μl PBS-T/BSA(2% BSA在含有0.05% Tween 20的PBS中)於室溫下進行阻隔作用1小時。

固定濃度的10pM人類PCSK9-Bio與不同濃度的該突變蛋白培養於溶液中，採用100nM的起始濃度，其係以1：3的比例連續稀釋下降至在PBS-T/BSA緩衝液中濃度為1.7pM。於室溫下培養1小時後，將20μl的反應混合物轉移到包覆抗體的ELISA盤，在室溫下20分鐘以捕獲未結合(游離的)的PCSK9。為了將ELISA讀出結果轉化為游離的hPCSK9濃度(參見以下偵測與量化結合的hPCSK9-Bio)，含有不同濃度的hPCSK9-Bio的標準曲線，起始濃度為10nM(以1：3連續稀釋11次)，於PBS-T/BSA中製備，且在一 MSD盤(MesoScaleDiscovery公司)上培養20分鐘。

為了偵測與量化結合的hPCSK9-Bio，去除殘留的上清液，並以在PBS-T/BSA溶液中1μg/ml的濃度加入20μl Sulfo-標記標定的鏈霉親和素(Meso Scale Discovery公司)，並於室溫下培養1小時。清洗後，將35μl 2×MSD讀取緩衝液與介面活性劑(Meso Scale Discovery公司)加入到每個孔中，在15分鐘內使用SECTOR Imager 2400儀器(Meso Scale Discovery公司)測量電化學發光(ECL)訊號。

評估進行如下：游離的PCSK9濃度c(PCSK9)_free係自ECL訊號中計算，使用在平行測定的標準曲線，並對脂質運載蛋白突變蛋白濃度c(脂質運載蛋白突變蛋白)繪圖。為了獲得50%的PCSK9/基準抗體複合物的形成被阻斷時該脂質運載蛋白突變蛋白的濃度(IC50)，該曲線係以非線性回歸與單點結合模型進行擬合，根據c(PCSK9)_free=c(PCSK9)_tot/(1+c(脂質運載蛋白突變蛋白)/IC50))，且總追蹤物濃度c(PCSK9)_tot與該IC50值為自由參數。使用GraphPad Prism4軟體進行曲線擬合。

綜上所述，脂質運載蛋白突變蛋白SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20與SEQ ID NO：22以及聚乙二醇化的變異體SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31與SEQ ID NO：32表現出較強的競爭性結合到hPCSK9-Bio，當與基準抗體競爭時(包含SEQ ID NOs：29以及33)。擬合的IC 50值摘要於以下表7中。

實施例13：由額外的脂質運載蛋白突變蛋白抑制LDL-R的由PCSK9介導的向下調節

人類PCSK9誘導LDL-R的內在化，因此LDL-R從細胞表面耗盡。在此分析中，LDL-R的表現在如實施例12所述的脂質運載蛋白突變蛋白(聚乙二醇化的(此處，具有支鏈PEG40)以及非聚乙二醇化的形式)的存在下進行分析，以確定脂質運載蛋白突變蛋白在抑制PCSK9調節LDL-R細胞表面耗盡的活性的潛力，而SEQ ID NO：2則用來作為負對照組。

HEPG2細胞(10,000個細胞/孔)在預先塗覆100μg/ml聚-d-離胺酸的384孔MSD盤(Mesoscale Discovery公司)中進行貼附作用24小時。接著將全培養基(含有1mg/ml G418以及10% FBS的DMEM培養基)轉換為缺乏血清或含10%脂質運載蛋白-缺乏血清的DMEM培養基，使LDL-R在細胞表面上可以有最大的表現。細胞接著以PBS清洗，且在100nM PCSK9的存在下連續稀釋的脂質運載蛋白突變蛋白在37℃下培養6小時。然後將混合物以輕輕敲擊的方式移除，接著加入Roti®-Histofix在室溫下進行細胞固定20分鐘。細胞以PBS清洗二次且以阻隔緩衝液(PBS/FCS 4%/BSA 2%)在4℃下整夜培養。輕輕地去除緩衝液，並以含有1μg/ml的山羊抗hLDL-R (R&D systems公司，型號AF2148)以及2μg/ml的驢抗山羊-Sulfotag(MSD公司，型號R32AG-1)的阻隔緩衝液在室溫下培養1小時。細胞接著以PBS輕輕地清洗二次，並加入不含有介面活性劑的讀取緩衝液(MSD公司)。使用SECTOR Imager 2400儀器(MSD)測量ECL訊號。評估進行如下：藉由在缺乏競爭者(此處為脂質運載蛋白突變蛋白)的情況下設定測量PCSK9活性為100% PCSK9活性的訊號，以轉換ECL訊號。數據以S形劑量-反應模型具有共享斜率使用GraphPad Prism 4軟體進行擬合(圖8)。得到的IC50與IC90值被摘要於以下表8中。

實施例14：以位置飽和誘發突變產生熱穩定的PCSK9特異性脂質運載蛋白突變蛋白

針對改進PCSK9特異性突變蛋白的熱穩定性，在具有SEQ ID NO：13的脂質運載蛋白突變蛋白的第79與105個位置上突變(如圖14所示)。SEQ ID NO：13的熱穩定衍生物的基因庫係以導致上述位置飽和隨機化的方式產生，不論是自己產生的還是在聚合酶連鎖反應中使用NNK寡核苷酸遞歸組裝的組合產生的(見，例如，WO2007/107563)。為了同樣的目的，具有SEQ ID NO：22的脂質運載蛋白突變蛋白在第92個位置上自組胺酸突 變為脯胺酸(如圖14所示)。

實施例15：以篩選來鑑定熱穩定化的PCSK9特異性突變蛋白

PCR組裝後得到的基因庫製備物的誘導突變中央匣，如實施例14所述，被插入到一個載體中，其在四環黴素啟動子的控制下可使細菌製造脂質運載蛋白突變蛋白(如實施例5所述)。

對於脂質運載蛋白突變蛋白的親和力排名，稀釋於PBS中的抗Strep-標記抗體(IBA公司，哥廷根)包被於微量滴定盤上，並加入20μl BSA阻隔培養物，其可使脂質運載蛋白突變蛋白在該盤上被特異性捕獲。加入不同濃度(0.5-5nM)的生物素化的PCSK9蛋白，並在廣泛的清洗後以extravidin-HRP(Sigma Aldrich公司，聖路易斯，密蘇里州)偵測特異性結合的PCSK9蛋白。針對定量，加入20μl QuantaBlu，並於激發波長320nm以及發散波長430nm下測量。

以前述之相同方法進行熱穩定性脂質運載蛋白突變蛋白的篩選，其中的差別僅在於與PCSK9目標培養之前，將含脂質運載蛋白突變蛋白的細菌萃取物加熱至65℃並歷時30min。比較加熱步驟之後與未加熱的樣本，並選擇結合訊號未受影響的突變蛋白進行定序。

實施例16：優化的PCSK9特異性突變蛋白的熔解溫度的測量

為了確定PCSK9特異性突變蛋白的熔融溫度，使用毛細管nanoDSC儀器(Q2000，TA儀器公司)在1C/分鐘下掃描(25-100℃)在PBS(Gibco公司)中蛋白質濃度為1mg/ml的樣品。整合軟體從所呈現的溫譜圖計 算出該熔融溫度(melting temperature，Tm)。

自二個脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：22以及SEQ ID NO：13)得到的熔融溫度與來自其的優化衍生物(SEQ ID NO：62-71)一起摘要於以下表9中。例如，該數據顯示，相較於SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64與SEQ ID NO：65的熔融溫度顯著較高，且熔融開始就被往上位移13℃(圖12)。

實施例17：優化的脂質運載蛋白衍生物對PCSK9的親和力

為了測量一具有有代表性群體的脂質運載蛋白突變蛋白對生物素化的人類PCSK9的結合親和力，使用以表面電漿子共振(SPR)為基礎的分析並利用Biacore T200儀器(GE Healthcare公司)。針對SPR親和力分析，使用生物素捕捉套組(GE Healthcare公司)。

在每個測量週期中，將生物素捕捉試劑(GE Healthcare公司)以2μl/分鐘的流速施加到感應器晶片CAP(GE Healthcare公司)上的參考 與測量通道持續5分鐘。以4μg/ml的濃度將生物素化的PCSK9以10μl/分鐘的流速注射該測量通道持續2分鐘。為了確定親和力，三至四個稀釋的SEQ ID NOs：62-71在HBS-EP+(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M氯化鈉，3mM EDTA，0.005%界面活性劑P20)緩衝液中製備，並施加到該晶片表面，使用128nM、32nM、8nM與4nM的濃度。結合分析於3分鐘的接觸時間、20分鐘的解離時間以及施加30μl/分鐘的流速下進行。所有測量均在25℃下進行。感應器晶片表面CAP的再生作用係以注射6M的亞胺基甲二胺-鹽酸以及0.25M氫氧化鈉(2分鐘)，接著以運行緩衝液進行額外清洗並以2分鐘的穩定期來達成。在此測量之前，進行了由三個連續的再生作用步驟組成的一個調整週期。數據係以Biacore T200評估軟體(1.0版)來進行評估。使用雙重參照。使用1：1的結合模型以配合原始數據。

針對SEQ ID NOs：62-71所得到的擬合曲線分別如圖13(A-J)所示。該數據顯示，相較於具有SEQ ID NO：13以及SEQ ID NO：22的脂質運載蛋白突變蛋白，熱穩定脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NOs：62-71)的親和力完全保留。結合速率常數k_a或k_on、解離速率常數k_d或k_off以及針對所述脂質運載蛋白突變蛋白所得到的解離常數K_D摘要於如下表10中。

實施例18：在大腸桿菌中生產PCSK9特異性薄層層析突變蛋白

在大腸桿菌中表現PCSK9-特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NOs：62、82、83以及84)。將編碼每個脂質運載蛋白突變蛋白(分別為SEQ ID NOs：86、87、88以及89)的DNA插入到經過同樣酶切的載體中，其在T5啟動子(在SEQ ID NOs：62、82以及84的情況下)或是T7A3啟動子(在SEQ ID NO：83的情況下)的控制下可使細菌製造突變蛋白。該突變蛋白從細胞裂解液中透過使用陰離子交換管柱、苯基瓊脂管柱、凝膠過濾管柱以及螯合管柱(在SEQ ID NOs：82以及84的情況下)等管柱色層分析法的組合進行純化。純化的突變蛋白最後溶解於PBS中。

實施例19：Biacore分析

所有與Biacore T200(GE Healthcare公司)的程序均在25℃下進行。以HBS-EP+緩衝液(10mM HEPES，pH 7.4，0.15M氯化鈉，3mM EDTA，及0.05%介面活性劑P20)作為運行緩衝液。使用一標記試劑、EZ-Link磺基-NHS-LC-LC-生物素(Thermo Scientific公司)，以一般方法進行PCSK9蛋白的生物素化，且未反應的試劑以去鹽離心管柱去除。生物素捕捉套組(GE Healthcare公司)用於將生物素化的PCSK9配體固定到感應器晶片。在該CAP感應器晶片上的流動細胞，預先以一單股寡DNA固定，係與一與鏈黴親和素共軛連結的互補單股寡DNA進行雜交作用，並接著進行生物素化的配體注射。

針對捕捉實驗，將鏈黴親和素-DNA共軛連接物注射到二個流動細胞持續20秒，且生物素化的PCSK9樣本在該運行緩衝液中稀釋為1ng/μl，然後注射到一個流動細胞中以10μl/分鐘速度持續1分鐘，而另一個流動細胞則留下來未以捕捉樣本處理，以提供一參考表面。設計捕捉步驟是為了要產生配體樣本的捕捉濃度，造成Rmax值不超過20RU。

針對每個動力學實驗，製備自0.03nM至100nM的不同濃度的純化的PCSK9特異性脂質運載蛋白突變蛋白作為分析物，並以30μl/分鐘速度注射持續300秒，隨後解離30分鐘。捕捉與參考表面以2分鐘脈衝的6M鹽酸亞胺基甲二胺在0.25M氫氧化鈉中進行再生作用。

解離常數(KDs)以1：1 Langmuir結合模型來計算。原始數據集係以Biacore T200評估軟體(1.0版，GE Healthcare公司)來進行分析，且參考流動細胞的感應曲線圖係自該樣本-捕捉流動細胞的感應曲線圖減去。

實施例20：無細胞的PCSK9-LDLR TR-FRET分析

分泌的PCSK9有利於肝LDLR的降解，從而導致增加血清LDL-C的含量。因此，干擾PCSK9與LDLR之間的相互作用的PCSK9特異性 脂質運載蛋白突變蛋白，造成增強LDLR循環至細胞膜，其激活LDL-C的攝入量，且最終降低了循環的LDL-C的含量。

使用無細胞的TR-FRET分析來確定的脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83以及SEQ ID NO：84)對PCSK9與LDLR之間結合的抑制效果。用於本試驗中的生物素標記的hPCSK9(生物素-hPCSK9)係以5倍摩爾過量的EZ-Link NHSChromogenic生物素試劑(Thermo Scientific公司)在室溫下培養1小時以製備，並將過量的生物素以illustra NAP管柱(GE Healthcare生命科學公司)去除。銪標記的LDLR(Eu-LDLR)係以先前的報告中所描述的方法製備(Fisher TS等人，生物化學期刊(2007年)第282(28)卷，第20502-20512頁)。

在384孔盤進行無細胞的PCSK9-LDLR TR-FRET檢測。在34mg/ml的人類血清白蛋白存在或缺乏的情況下，終濃度為20nM的生物素-hPCSK9與數種濃度的受測脂質運載蛋白突變蛋白在結合緩衝液(10mM HEPES，pH 7.4，150mM氯化鈉，0.1mM氯化鈣以及0.05%(w/v)BSA)中於室溫下培養2小時。然後10μl的上述生物素-hPCSK9-脂質運載蛋白溶液與10μl的Eu-LDLR/Alexa-SA溶液(1.0nM的Eu-LDLR、80nM的鏈霉親和素/Alexa Fluor 647共軛連接物(Invitrogen公司)、10mM的HEPES，pH值7.4、150mM氯化鈉、0.1mM的氯化鈣、0.05%(重量/體積)牛血清白蛋白)溶液在孔中混合，並在室溫下黑暗中培養2小時，接著於冰箱中靜置整夜。使用BMG Lab Systems Rubystar讀取儀讀取樣本，設定讀取20次/孔以及50微秒整合延遲與200微秒整合時間，總讀取時間為1100ms/孔。以在665/620nm波長下的發射率測量FRET。以下列方程式計算TR-FRET比例。

TR-FRET比例=(在665nm波長下的計數/在620nm波長下的計數)x 10,000

為了獲得50%的PCSK9/LDL-R複合物被阻斷時該脂質運載蛋白突變蛋白的濃度(IC50)，該曲線係以非線性回歸與單點結合模型進行擬合。使用Kaleida Graph 4.1.1版本軟體進行曲線擬合(Synergy Software公司)。

得到計算的IC50值摘要於以下實施例21下面的表11。

實施例21：PCSK9特異性脂質運載蛋白突變蛋白的體內血漿半衰期

脂質運載蛋白突變蛋白與一可以在一個體體內對準一特定身體區域、生物體、組織、器官或細胞為目標的蛋白部分結合，以延長脂質運載蛋白突變蛋白在體內的半衰期。例如，人類血清白蛋白(HSA)的半衰期據報告為約19天(Biochimica et Biophysica Acta期刊，第1830卷，第5526-5534頁，2013年)，因此PCSK9特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：62以及SEQ ID NO：82)與一結合到HSA的白蛋白結合蛋白(如G148以及SEQ ID NO：85)共軛連結，因此，可以在體內表現出長半衰期的脂質運載蛋白突變蛋白。

為了觀察與白蛋白結合蛋白共軛連結的效果，以及確定PCSK9特異性脂質運載蛋白突變蛋白的血漿長半衰期，數種受測脂質運載蛋白突變蛋白以靜脈內給藥至正常大鼠，並以三明治ELISA測量該脂質運載蛋白突變蛋白的血漿濃度。用來決定血漿半衰期的血液採樣在不同時間點進行，接著給予受測脂質運載蛋白突變蛋白。

針對該四個脂質運載蛋白突變蛋白所得到的血漿半衰期摘要於以下之表11中。例如，該數據顯示，相較於單獨的脂質運載蛋白突變蛋白，與一可與HSA結合的蛋白部分共軛連接的脂質運載蛋白突變蛋白具有較長的半衰期。

本文說明性所描述的具體實施例可以適當地實施在沒有任何要素或多種要素、一種或多種限制、本文中未具體公開的情況下。因此，例如，術語「包含」、「包括」、「含有」等應被寬泛地解讀且無限制。另外，本文所採用的術語及表達被用作為描述的術語而非限制條件，並且無意圖，在使用這些術語及表現時，排除掉任何顯示與描述之特徵的均等物或其部分，但其認識到，各種修改可能在本發明要求保護的範圍之 內。因此，應當理解的是，雖然這些具體實施例已藉由優選之具體實施例與任選特徵而被具體公開，其修改與變化可以訴諸本領域技藝者，並且這樣的修改和變化被認為是在本發明的範圍之內。本文所述的所有專利、專利申請、教科書以及同行評審出版物的內容皆透過引用的方式將其整體併入本文中。此外，當在參考文獻中所使用或定義的術語，其係以引用方式併入本文，與本文所提供該術語的定義不一致或相反時，適用本文所提供之該術語的定義，而不適用該參考文獻中該術語的定義。每個較窄種類和亞屬分組落入一般性公開範圍內的也構成本發明的一部分。這包括本發明的一般說明，其具有一個條件或負面限制從該屬中除去任何主題，而不管該切除的材料是否在本文中具體敘述。此外，當特徵是以馬庫西群組的形式來描述時，本領域技藝者將認識到，本發明還由此在馬庫西群組的成員的任何單個成員或亞群組的形式來描述。自以下的申請專利範圍中進一步的具體實施例將變得明顯。

<110> 皮里斯股份有限公司 第一三共股份有限公司

<120> PCSK9新穎結合蛋白

<130> SWK0003TW(PIE14726PCT)

<150> US 61/781,511

<151> 2013-03-14

<150> EP13175023.4

<151> 2013-07-04

<160> 89

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 158

<212> PRT

<213> 人類

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白

<400> 1

<210> 2

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 2

<210> 3

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 3

<210> 4

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 4

<210> 5

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 5

<210> 6

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 6

<210> 7

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 7

<210> 8

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 8

<210> 9

<211> 152

<212> PRT

<213> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 9

<210> 10

<211> 152

<212> PRT

<213> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 10

<210> 11

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 11

<210> 12

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 12

<210> 13

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 13

<210> 14

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 14

<210> 15

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 15

<210> 16

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 16

<210> 17

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 17

<210> 18

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 18

<210> 19

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 19

<210> 20

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 20

<210> 21

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 21

<210> 22

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 22

<210> 23

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 23

<210> 24

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 24

<210> 25

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 25

<210> 26

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 26

<210> 27

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 27

<210> 28

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 28

<210> 29

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體31H4的輕鏈的胺基酸序列

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)..(20)

<400> 29

<210> 30

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：22的突變蛋白的變異體

<400> 30

<210> 31

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：13的突變蛋白的變異體

<400> 31

<210> 32

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：20的突變蛋白的變異體

<400> 32

<210> 33

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體31H4的重鏈的胺基酸序列

<220>

<221> 訊號

<222> (1)..(19)

<400> 33

<210> 34

<211> 692

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據SWISS PROT資料庫登錄號Q8NBP7之全長人類前蛋白轉換酶枯草桿菌蛋白酶/kexin蛋白酶第9型(PCSK9)

<400> 34

<210> 35

<211> 580

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pTLPC26(XbaI-HindIII)

<400> 35

<210> 36

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：3的突變蛋白的DNA序列

<400> 36

<210> 37

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：4的突變蛋白的DNA序列

<400> 37

<210> 38

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：5的突變蛋白的DNA序列

<400> 38

<210> 39

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：6的突變蛋白的DNA序列

<400> 39

<210> 40

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：7的突變蛋白的DNA序列

<400> 40

<210> 41

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：8的突變蛋白的DNA序列

<400> 41

<210> 42

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：9的突變蛋白的DNA序列

<400> 42

<210> 43

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：10的突變蛋白的DNA序列

<400> 43

<210> 44

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：11的突變蛋白的DNA序列

<400> 44

<210> 45

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：12的突變蛋白的DNA序列

<400> 45

<210> 46

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：13的突變蛋白的DNA序列

<400> 46

<210> 47

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：14的突變蛋白的DNA序列

<400> 47

<210> 48

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：15的突變蛋白的DNA序列

<400> 48

<210> 49

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：16的突變蛋白的DNA序列

<400> 49

<210> 50

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：17的突變蛋白的DNA序列

<400> 50

<210> 51

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：18的突變蛋白的DNA序列

<400> 51

<210> 52

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：19的突變蛋白的DNA序列

<400> 52

<210> 53

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：20的突變蛋白的DNA序列

<400> 53

<210> 54

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：21的突變蛋白的DNA序列

<400> 54

<210> 55

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：22的突變蛋白的DNA序列

<400> 55

<210> 56

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：23的突變蛋白的DNA序列

<400> 56

<210> 57

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：24的突變蛋白的DNA序列

<400> 57

<210> 58

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：25的突變蛋白的DNA序列

<400> 58

<210> 59

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：26的突變蛋白的DNA序列

<400> 59

<210> 60

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：27的突變蛋白的DNA序列

<400> 60

<210> 61

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ IDNO：28的突變蛋白的DNA序列

<400> 61

<210> 62

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 62

<210> 63

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 63

<210> 64

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 64

<210> 65

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 65

<210> 66

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 66

<210> 67

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 67

<210> 68

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 68

<210> 69

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 69

<210> 70

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 70

<210> 71

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 71

<210> 72

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：62的突變蛋白的DNA序列

<400> 72

<210> 73

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：63的突變蛋白的DNA序列

<400> 73

<210> 74

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：64的突變蛋白的DNA序列

<400> 74

<210> 75

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：65的突變蛋白的DNA序列

<400> 75

<210> 76

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：66的突變蛋白的DNA序列

<400> 76

<210> 77

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：67的突變蛋白的DNA序列

<400> 77

<210> 78

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ IDNO：68的突變蛋白的DNA序列

<400> 78

<210> 79

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：69的突變蛋白的DNA序列

<400> 79

<210> 80

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：70的突變蛋白的DNA序列

<400> 80

<210> 81

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：71的突變蛋白的DNA序列

<400> 81

<210> 82

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 82

<210> 83

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 83

<210> 84

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白

<400> 84

<210> 85

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 白蛋白結合區域(ABD)

<400> 85

<210> 86

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：62的突變蛋白的DNA序列

<400> 86

<210> 87

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：82的突變蛋白的DNA序列

<400> 87

<210> 88

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：83的突變蛋白的DNA序列

<400> 88

<210> 89

<211> 630

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 顯示於SEQ ID NO：84的突變蛋白的DNA序列

<400> 89

Claims (63)

1. 一種人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白，其中該突變蛋白包含：(a)在該成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的第26-34、56-58、80、83、104-106以及108個序列位置上的任何一個以上的突變胺基酸殘基；以及(b)在該成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的第61、101、111、114以及153個序列位置上的任何一個以上的突變胺基酸殘基，及其中該突變蛋白特異性結合PCSK9。
2. 一種脂質運載蛋白突變蛋白，其係PCSK9的拮抗劑。
3. 一種脂質運載蛋白突變蛋白，其係與LDL-R對PCSK9的結合競爭。
4. 一種脂質運載蛋白突變蛋白，其係對於包括SEQ ID NO：29以及SEQ ID NO：33的單株抗體對PCSK9的結合有競爭性。
5. 一種脂質運載蛋白突變蛋白，其能夠完全或部分抑制由PCSK9調節的LDL-R的表現向下調控。
6. 一種脂質運載蛋白突變蛋白，其能夠在PCSK9的存在下恢復LDL的攝取。
7. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之脂質運載蛋白突變蛋白，其中該突變蛋白與非人類靈長類的PCSK9或其免疫原性片段結合，且其解離常數(dissociation constant，K_D)等於或小於10nM。
8. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之脂質運載蛋白突變蛋白，其中該突變蛋白與小鼠的PCSK9或其免疫原性片段結合，且其解離常數(K_D)等 於或小於10nM。
9. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之脂質運載蛋白突變蛋白，其中該突變蛋白與人類的PCSK9或其片段結合，且其解離常數(K_D)等於或小於10nM。
10. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之脂質運載蛋白突變蛋白，其中該突變蛋白與人類的PCSK9或其片段結合，且其解離常數(K_D)等於或小於1nM。
11. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之脂質運載蛋白突變蛋白，其中該突變蛋白與人類的PCSK9或其片段結合，且其解離常數(K_D)等於或小於0.1nM。
12. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之脂質運載蛋白突變蛋白，其中該突變蛋白與人類的PCSK9或其片段結合，且其解離常數(K_D)等於或小於1pM。
13. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：精胺酸(Arg)26→絲胺酸(Ser)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、組胺酸(His)或蘇胺酸(Thr)。
14. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：麩胺酸(Glu)34→天門冬醯酸(Asn)、蘇胺酸(Thr)、精胺酸(Arg)或甘胺酸(Gly)，白胺酸(Leu)56→甲硫胺酸(Met)、絲胺酸(Ser)、麩醯胺酸(Gln)、苯丙胺酸(Phe)、組胺酸(His)或天門冬醯酸(Asn)。
15. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：絲胺酸(Ser)58→離胺酸(Lys)、丙胺酸(Ala)、精胺酸(Arg)、色胺酸(Trp)或脯胺酸(Pro)。
16. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：甲硫胺酸(Met)31→丙胺酸(Ala)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、脯胺酸(Pro)、絲胺酸(Ser)Aps、麩胺酸(Glu)或麩醯胺酸(Gln)。
17. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：白胺酸(Leu)33→酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)或丙胺酸(Ala)。
18. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：絲胺酸(Ser)61→色胺酸(Trp)或苯丙胺酸(Phe)、天門冬胺酸(Asp)80→絲胺酸(Ser)、甲硫胺酸(Met)、脯胺酸(Pro)、異白胺酸(Ile)、麩醯胺酸(Gln)、酪胺酸(Tyr)、絲胺酸(Ser)、纈胺酸(Val)或蘇胺酸(Thr)。
19. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：麩胺酸(Glu)104→白胺酸(Leu)、脯胺酸(Pro)、絲胺酸(Ser)、丙胺酸(Ala)、天門冬醯酸(Asn)、蘇胺酸(Thr)、離胺酸(Lys)或天門冬胺酸(Asp)。
20. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：組胺酸(His)106→脯胺酸(Pro)、麩醯胺酸(Gln)、甘胺酸(Gly)、精胺酸(Arg)、纈胺酸(Val)、蘇胺酸(Thr)、天門冬醯酸(Asn)或白胺酸(Leu)。
21. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：離胺酸(Lys)108→麩醯胺酸(Gln)、丙胺酸(Ala)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、精胺酸(Arg)、天門冬胺酸(Asp)、天門冬醯酸(Asn)、絲胺酸(Ser)、麩胺酸(Glu)或蘇胺酸(Thr)。
22. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：麩胺酸(Glu)27→精胺酸(Arg)、絲胺酸(Ser)、麩醯胺酸(Gln)、蘇胺酸(Thr)、苯丙胺酸(Phe)、離胺酸(Lys)、丙胺酸(Ala)或精胺酸(Arg)。
23. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：脯胺酸(Pro)29→甘胺酸(Gly)、天門冬胺酸(Asp)、天門冬醯酸(Asn)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)或甲硫胺酸(Met)。
24. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：天門冬醯酸(Asn)32→異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、酪胺酸(Tyr)、甲硫胺酸(Met)或色胺酸(Trp)。
25. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：白胺酸(Leu)105→半胱胺酸(Cys)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)、麩胺酸(Glu)、精胺酸(Arg)、絲胺酸(Ser)、組胺酸(His)、丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、天門冬胺酸(Asp)、脯胺酸(Pro)、甘胺酸(Gly)或離胺酸(Lys)。
26. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：苯丙胺酸(Phe)28→半胱胺酸(Cys)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、色胺酸(Trp)、天門冬胺酸(Asp)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、白胺酸(Leu)或天門冬醯酸(Asn)。
27. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：麩胺酸(Glu)30→精胺酸(Arg)、天門冬胺酸(Asp)、蘇胺酸(Thr)、絲胺酸(Ser)、甘胺酸(Gly)、丙胺酸(Ala)或天門冬醯酸(Asn)。
28. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)、組胺酸(His)、麩醯胺酸(Gln)、蘇胺酸(Thr)或精胺酸(Arg)。
29. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，該突變蛋白包含至少一個以下胺基酸取代物：離胺酸(Lys)83→精胺酸(Arg)、絲胺酸(Ser)、麩醯胺酸(Gln)、 蘇胺酸(Thr)或麩胺酸(Glu)。
30. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，包含一組以下胺基酸取代物：(a)精胺酸(Arg)26→苯丙胺酸(Phe)；天門冬醯酸(Asn)32→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→甲硫胺酸(Met)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)以及離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)；(b)精胺酸(Arg)26→色胺酸(Trp)；天門冬醯酸(Asn)32→白胺酸(Leu)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→絲胺酸(Ser)以及絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)；(c)精胺酸(Arg)26→組胺酸(His)；天門冬醯酸(Asn)32→酪胺酸(Tyr)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→絲胺酸(Ser)；絲胺酸(Ser)58→精胺酸(Arg)以及離胺酸(Lys)83→麩醯胺酸(Gln)；(d)精胺酸(Arg)26→苯丙胺酸(Phe)；天門冬醯酸(Asn)32→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→麩醯胺酸(Gln)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)以及離胺酸(Lys)83→蘇胺酸(Thr)；(e)天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→精胺酸(Arg)；白胺酸(Leu)56→天門冬醯酸(Asn)；絲胺酸(Ser)58→色胺酸(Trp)以及離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)； (f)精胺酸(Arg)26→苯丙胺酸(Phe)；天門冬醯酸(Asn)32→白胺酸(Leu)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→苯丙胺酸(Phe)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)以及離胺酸(Lys)83→精胺酸(Arg)；(g)精胺酸(Arg)26→蘇胺酸(Thr)；天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→天門冬醯酸(Asn)；白胺酸(Leu)56→組胺酸(His)；絲胺酸(Ser)58→脯胺酸(Pro)以及離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)；(h)天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→天門冬醯酸(Asn)；白胺酸(Leu)56→苯丙胺酸(Phe)；絲胺酸(Ser)58→精胺酸(Arg)以及離胺酸(Lys)83→麩胺酸(Glu)；(i)精胺酸(Arg)26→色胺酸(Trp)；天門冬醯酸(Asn)32→白胺酸(Leu)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→甲硫胺酸(Met)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)以及離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)；或(j)天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→甘胺酸(Gly)；白胺酸(Leu)56→麩醯胺酸(Gln)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)以及離胺酸(Lys)83→麩醯胺酸(Gln)。
31. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，包含以下胺基酸取代物之其中之一者：(a)麩胺酸(Glu)27→絲胺酸(Ser)；苯丙胺酸(Phe)28→精胺酸 (Arg)；脯胺酸(Pro)29→甘胺酸(Gly)；麩胺酸(Glu)30→天門冬胺酸(Asp)；甲硫胺酸(Met)31→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)104→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)105→酪胺酸(Tyr)；組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)；離胺酸(Lys)108→丙胺酸(Ala)；(b)麩胺酸(Glu)27→麩醯胺酸(Gln)；苯丙胺酸(Phe)28→半胱胺酸(Cys)；脯胺酸(Pro)29→天門冬胺酸(Asp)；麩胺酸(Glu)30→蘇胺酸(Thr)；甲硫胺酸(Met)31→甘胺酸(Gly)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；白胺酸(Leu)105→半胱胺酸(Cys)；組胺酸(His)106→甘胺酸(Gly)；離胺酸(Lys)108→色胺酸(Trp)；(c)麩胺酸(Glu)27→麩胺酸(Glu)；苯丙胺酸(Phe)28→色胺酸(Trp)；脯胺酸(Pro)29→天門冬醯酸(Asn)；麩胺酸(Glu)30→甘胺酸(Gly)；甲硫胺酸(Met)31→組胺酸(His)；白胺酸(Leu)33→酪胺酸(Tyr)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→脯胺酸(Pro)；麩胺酸(Glu)104→絲胺酸(Ser)；白胺酸(Leu)105→色胺酸(Trp)；組胺酸(His)106→脯胺酸(Pro)；離胺酸(Lys)108→酪胺酸(Tyr)；(d)麩胺酸(Glu)27→蘇胺酸(Thr)；苯丙胺酸(Phe)28→天門冬胺酸(Asp)；脯胺酸(Pro)29→天門冬醯酸(Asn)；麩胺酸(Glu)30→絲胺酸(Ser)；甲硫胺酸(Met)31→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)33 →苯丙胺酸(Phe)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)104→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)105→麩胺酸(Glu)；組胺酸(His)106→精胺酸(Arg)；離胺酸(Lys)108→精胺酸(Arg)；(e)麩胺酸(Glu)27→苯丙胺酸(Phe)；苯丙胺酸(Phe)28→離胺酸(Lys)；脯胺酸(Pro)29→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)30→丙胺酸(Ala)；甲硫胺酸(Met)31→絲胺酸(Ser)；白胺酸(Leu)33→.脯胺酸(Pro)；異白胺酸(Ile)57→色胺酸(Trp)；天門冬胺酸(Asp)80→麩醯胺酸(Gln)；麩胺酸(Glu)104→天門冬醯酸(Asn)；白胺酸(Leu)105→精胺酸(Arg)；組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)；離胺酸(Lys)108→天門冬胺酸(Asp)；(f)麩胺酸(Glu)27→離胺酸(Lys)；苯丙胺酸(Phe)28→甘胺酸(Gly)；脯胺酸(Pro)29→脯胺酸(Pro)；麩胺酸(Glu)30→蘇胺酸(Thr)；甲硫胺酸(Met)31→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→組胺酸(His)；天門冬胺酸(Asp)80→酪胺酸(Tyr)；麩胺酸(Glu)104→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)105→絲胺酸(Ser)；組胺酸(His)106→纈胺酸(Val)；離胺酸(Lys)108→天門冬醯酸(Asn)；(g)麩胺酸(Glu)27→麩胺酸(Glu)；苯丙胺酸(Phe)28→組胺酸(His)；脯胺酸(Pro)29→白胺酸(Leu)；麩胺酸(Glu)30→丙胺酸(Ala)；甲硫胺酸(Met)31→天門冬胺酸(Asp)；白胺酸(Leu)33→丙胺酸(Ala)；異白胺酸(Ile)57→麩醯胺酸(Gln)；天門冬胺 酸(Asp)80→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)104→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)105→酪胺酸(Tyr)；組胺酸(His)106→脯胺酸(Pro)；離胺酸(Lys)108→絲胺酸(Ser)；(h)麩胺酸(Glu)27→丙胺酸(Ala)；苯丙胺酸(Phe)28→天門冬胺酸(Asp)；脯胺酸(Pro)29→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)30→甘胺酸(Gly)；甲硫胺酸(Met)31→天門冬胺酸(Asp)；白胺酸(Leu)33→脯胺酸(Pro)；異白胺酸(Ile)57→蘇胺酸(Thr)；天門冬胺酸(Asp)80→蘇胺酸(Thr)；麩胺酸(Glu)104→蘇胺酸(Thr)；組胺酸(His)106→蘇胺酸(Thr)；離胺酸(Lys)108→精胺酸(Arg)；(i)麩胺酸(Glu)27→精胺酸(Arg)；苯丙胺酸(Phe)28→白胺酸(Leu)；脯胺酸(Pro)29→天門冬胺酸(Asp)；麩胺酸(Glu)30→天門冬醯酸(Asn)；甲硫胺酸(Met)31→麩胺酸(Glu)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→麩醯胺酸(Gln)；麩胺酸(Glu)104→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)105→精胺酸(Arg)；組胺酸(His)106→天門冬醯酸(Asn)；離胺酸(Lys)108→丙胺酸(Ala)；(j)麩胺酸(Glu)27→離胺酸(Lys)；苯丙胺酸(Phe)28→天門冬醯酸(Asn)；脯胺酸(Pro)29→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)30→甘胺酸(Gly)；甲硫胺酸(Met)31→麩醯胺酸(Gln)；白胺酸(Leu)33→脯胺酸(Pro)；異白胺酸(Ile)57→精胺酸(Arg)；天門冬胺酸(Asp)80→異白胺酸(Ile)；麩胺酸(Glu)104→天門冬胺酸 (Asp)；白胺酸(Leu)105→精胺酸(Arg)；組胺酸(His)106→白胺酸(Leu)；離胺酸(Lys)108→蘇胺酸(Thr)；或(k)麩胺酸(Glu)27→絲胺酸(Ser)；苯丙胺酸(Phe)28→精胺酸(Arg)；脯胺酸(Pro)29→甘胺酸(Gly)；麩胺酸(Glu)30→天門冬胺酸(Asp)；甲硫胺酸(Met)31→丙胺酸(Ala)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；天門冬胺酸(Asp)80→甲硫胺酸(Met)；麩胺酸(Glu)104→脯胺酸(Pro)；白胺酸(Leu)105→甘胺酸(Gly)；組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)；離胺酸(Lys)108→丙胺酸(Ala)。
32. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，包含以下胺基酸取代物的組合：精胺酸(Arg)26→苯丙胺酸(Phe)；麩胺酸(Glu)27→絲胺酸(Ser)；苯丙胺酸(Phe)28→精胺酸(Arg)；脯胺酸(Pro)29→甘胺酸(Gly)；麩胺酸(Glu)30→天門冬胺酸(Asp)；甲硫胺酸(Met)31→丙胺酸(Ala)；天門冬醯酸(Asn)32→異白胺酸(Ile)；白胺酸(Leu)33→色胺酸(Trp)；麩胺酸(Glu)34→蘇胺酸(Thr)；白胺酸(Leu)56→甲硫胺酸(Met)；異白胺酸(Ile)57→酪胺酸(Tyr)；絲胺酸(Ser)58→丙胺酸(Ala)；離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)；麩胺酸(Glu)104→脯胺酸(Pro)以及離胺酸(Lys)108→蘇胺酸(Thr)。
33. 如申請專利範圍第32項之突變蛋白，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，進一步包括至少一個以下胺基酸取代物：蘇胺酸(Thr)43→異白胺酸(Ile)或丙胺酸(Ala)，麩胺酸(Glu)45→甘胺酸(Gly)，天門冬醯 酸(Asn)48→甘胺酸(Gly)，麩胺酸(Glu)63→甘胺酸(Gly)，丙胺酸(Ala)66→纈胺酸(Val)，麩胺酸(Glu)69→纈胺酸(Val)，離胺酸(Lys)70→精胺酸(Arg)、丙胺酸(Ala)79→蘇胺酸(Thr)、甲硫胺酸(Met)或纈胺酸(Vla)，天門冬胺酸(Asp)80→甲硫胺酸(Met)或絲胺酸(Ser)，甘胺酸(Gly)82→絲胺酸(Ser)，組胺酸(His)84→麩醯胺酸(Gln)，纈胺酸(Val)85→甘胺酸(Gly)，酪胺酸(Tyr)87→絲胺酸(Ser)，異白胺酸(Ile)88→蘇胺酸(Thr)或白胺酸(Leu)，組胺酸(His)92→脯胺酸(Pro)，白胺酸(Leu)105→組胺酸(His)、甘胺酸(Gly)或酪胺酸(Tyr)以及組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)或精胺酸(Arg)。
34. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，包含以下胺基酸取代物的組合：麩胺酸(Glu)27→苯丙胺酸(Phe)；苯丙胺酸(Phe)28→離胺酸(Lys)；脯胺酸(Pro)29→異白胺酸(Ile)；天門冬醯酸(Asn)32→色胺酸(Trp)；白胺酸(Leu)33→脯胺酸(Pro)；麩胺酸(Glu)34→精胺酸(Arg)；白胺酸(Leu)56→天門冬醯酸(Asn)；異白胺酸(Ile)57→色胺酸(Trp)；組胺酸(His)106→麩醯胺酸(Gln)以及離胺酸(Lys)108→麩胺酸(Glu)。
35. 如申請專利範圍第34項中之突變蛋白，與成熟人類淚液脂質運載蛋白相較時，進一步包括至少一個以下胺基酸取代物：麩胺酸(Glu)43→甘胺酸(Gly)或丙胺酸(Ala)，麩胺酸(Glu)45→甘胺酸(Gly)，絲胺酸(Ser)58→色胺酸(Trp)或精胺酸(Arg)，麩胺酸(Glu)63→天門冬胺酸(Asp)，麩胺酸(Glu)69→甘胺酸(Gly)，離胺酸(Lys)70→精胺酸(Arg)，天門冬胺酸(Asp)80→麩醯胺酸(Gln)，纈胺酸(Val)或蘇胺酸 (Thr)，甘胺酸(Gly)82→天門冬胺酸(Asp)，離胺酸(Lys)83→絲胺酸(Ser)或精胺酸(Arg)，丙胺酸(Ala)86→麩胺酸(Glu)或絲胺酸(Ser)，苯丙胺酸(Phe)99→白胺酸(Leu)，麩胺酸(Glu)102→離胺酸(Lys)或纈胺酸(Val)，麩胺酸(Glu)104→天門冬醯酸(Asn)或離胺酸(Lys)以及脯胺酸(Pro)106→蘇胺酸(Thr)。
36. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白在相對於成熟人類淚液脂質運載蛋白第28或105位置上包含一天然胺基酸由半胱胺酸殘基取代的胺基酸取代物。
37. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白具有與成熟人類淚液脂質運載蛋白的序列至少75%的相似度。
38. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白具有任一如SEQ ID NOs：3-28、62-71以及82或其片段或變異體所示的胺基酸序列。
39. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白具有如SEQ ID NO：23或其片段或變異體所示的胺基酸序列。
40. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白具有如SEQ ID NO：13或其片段或變異體所示的胺基酸序列。
41. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白具有如SEQ ID NO：20或其片段或變異體所示的胺基酸序列。
42. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白具有如SEQ ID NO：22或其片段或變異體所示的胺基酸序列。
43. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與標記 部分結合。
44. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與可在個體體內對準特定身體區域、生物體、組織、器官或細胞為目標的部分結合。
45. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與可延長該突變蛋白的血清半衰期的部分結合。
46. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與聚乙二醇分子結合。
47. 如申請專利範圍第46項中之結合的突變蛋白，其中該結合的突變蛋白包含任一如SEQ ID NOs：30-32所示的胺基酸序列。
48. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與白蛋白結合蛋白結合。
49. 如申請專利範圍第48項中之結合的突變蛋白，其中該結合的突變蛋白包含任一如SEQ ID NOs：83-84所示的胺基酸序列。
50. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之突變蛋白，其中該突變蛋白與可賦予該融合物新特性的部分融合。
51. 一種產生一或多個人類淚液脂質運載蛋白的突變蛋白之方法，其中該一或多個突變蛋白與PCSK9結合，包含：(a)使編碼人類淚液脂質運載蛋白的核酸分子於以下位置產生突變：(i)該成熟人類淚液脂質運載蛋白的胺基酸序列中第26-34、56-58、80、83、104-106以及108個位置上的任何一個或多個，以及 (ii)該成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的胺基酸序列第61、101、111、114以及153個位置上的任何一個或多個位置，由此得到編碼一或多個人類淚液脂質運載蛋白之突變蛋白的一或多個核酸分子，(b)在表現系統中表現該在(a)中得到的一或多個核酸分子，由此得到一或多個人類淚液脂質運載蛋白之突變蛋白，以及(c)進一步篩選該在(b)中獲得的一或多個突變蛋白。
52. 如申請專利範圍第51項之方法，其中步驟(c)進一步包含：(ci)提供PCSK9或其免疫原性片段，(cii)將透過篩選獲得的該一或多個突變蛋白與該PCSK9或其免疫原性片段接觸，從而使該PCSK9或其免疫原性片段與該具有相同結合親和力的突變蛋白形成複合物，以及(ciii)去除不具有或不具有實質結合親和力的一或多個突變蛋白。
53. 如申請專利範圍第51或52項之方法，其中在步驟(c)中的篩選係於競爭條件下進行。
54. 如申請專利範圍第51或52項之方法，其中步驟(a)進一步包含：(a)(iii)使編碼人類淚液脂質運載蛋白的核酸分子在成熟人類淚液脂質運載蛋白的線性多胜肽序列的胺基酸序列第79、92以及105個位置上的任何一個或多個位置產生突變。
55. 一種核酸分子，包含編碼如申請專利範圍第1-50項中任一項之突變蛋白的核苷酸序列。
56. 一種在任一SEQ ID NOs：36-61、72-81以及86-89所示之核酸分子。
57. 一種含有如申請專利範圍第55或56項之核酸分子的宿主細胞。
58. 一種如申請專利範圍第1-50項中任一項所述之突變蛋白或一種包含在個體內用於結合PCSK9的該種突變蛋白之組合物的用途。
59. 一種如申請專利範圍第1-50項中任一項所述之突變蛋白或一種包含在個體內用於抑制PCSK9與LDL-R結合的該種突變蛋白之組合物的用途。
60. 一種如申請專利範圍第1-50項中任一項所述之突變蛋白於偵測PCSK9的用途，包含：(a)在適當條件下將該突變蛋白與疑似含有PCSK9的測試樣品接觸，從而使該突變蛋白與PCSK9或其區域或片段之間形成複合物，以及(b)藉由適當的訊號偵測該複合物。
61. 一種如申請專利範圍第1-50項中任一項所述之突變蛋白於分離PCSK9的用途，包含：(a)在適當條件下將該突變蛋白與疑似含有PCSK9的樣品接觸，從而使該突變蛋白與PCSK9或其區域或片段之間形成複合物，以及(b)在該樣品中分離該複合物。
62. 一種如申請專利範圍第1-50項中任一項所述之突變蛋白於將化合物作為標靶帶到預先選定要以該化合物處理的生物體、組織、器官或細胞內的用途，包含以下步驟： (a)將該突變蛋白與該化合物結合，以及(b)將該突變蛋白/化合物複合物運輸至該預先選定的生物體、組織、器官或細胞內。
63. 一種包含如申請專利範圍第1-50項中任一項所述之突變蛋白的套組。