TW201716435A - 融合分子 - Google Patents

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Abstract

本發明關於融合分子，其對綠膿桿菌螢光素I、II和III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合特異性並且可以在各種應用，包括診斷和/或治療應用中使用，例如以抑制或降低銅綠假單胞菌的生長和/或預防或治療銅綠假單胞菌生物膜感染以及與銅綠假單胞菌生物膜感染有關的疾病或病症。本發明還關於製造本文中描述的融合分子的方法以及包含此類融合分子的組合物和套組。本發明進一步關於編碼本文中描述的融合分子的核酸分子。

Description

融合分子
本發明關於融合分子，其對綠膿桿菌螢光素I、II和III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合特異性並且可以在各種應用，包括診斷和/或治療應用中使用，例如以抑制或降低銅綠假單胞菌的生長和/或預防或治療銅綠假單胞菌生物膜感染以及與銅綠假單胞菌生物膜感染有關的疾病或病症。本發明還關於製造本文中描述的融合分子的方法以及包含此類融合分子的組合物和套組。本發明進一步關於編碼本文中描述的融合分子的核酸分子。
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)是一種引起主要與組織損傷相關的急性感染的伺機性病原體。銅綠假單胞菌在留置裝置上以及在具有遺傳病症囊性纖維化病的患者的肺組織上形成生物膜。生物膜感染難以用常規的抗生素療法治療。然而，研究已經證明瞭鐵是銅綠假單胞菌的正確生物膜形成必需的，因此鐵攝取系統是抗假單胞菌療法的潛在標靶物。
銅綠假單胞菌能夠藉由使用分泌性鐵結合鐵載體綠膿桿菌螯鐵蛋白和綠膿桿菌螢光素從宿主環境中清除鐵。綠膿桿菌螢光素(Pvd)是一種肽連接的氧肟酸鹽和兒茶酚鹽(catecholate)型配體，而綠膿桿菌螯鐵蛋白(Pch)是 水楊酸鹽和兩個半胱胺酸分子的且具有酚、羧酸鹽和胺配體官能性的衍生化接合物。Pvd和Pch兩者都已經證明了在銅綠假單胞菌毒力中的作用，有協同作用的某種指示。不能生成任一種鐵載體的雙重缺陷突變體比僅不能生成兩種鐵載體之一的單一缺陷突變體在毒力上減弱得多得多(Takase等，Infection and immunity,Apr.2000,p.1834-1839)。此外，綠膿桿菌螢光素作用為信號傳導分子以控制幾種毒力因子及綠膿桿菌螢光素自身的生成；同時已經提出了除三價鐵外，綠膿桿菌螯鐵蛋白可以是用於獲得二價金屬，如二價鐵和鋅用於銅綠假單胞菌的致病性的系統的一部分(Visca等，1992)。
已經從幾種銅綠假單胞菌菌株：從銅綠假單胞菌ATCC 15692(Briskot等，1989,Liebigs Ann Chem,p.375-384)，從銅綠假單胞菌ATCC 27853(Tappe等，1993,J.Prakt-Chem.,335,p.83-87)以及從天然隔離群銅綠假單胞菌R(Gipp等，1991,Z.Naturforsch,46c,p.534-541)中鑑定出三種結構上不同的綠膿桿菌螢光素類型或群組。此外，對88株臨床隔離群和上文提及的兩個收集菌株的比較生物學調查根據下述參照菌株揭示了三種不同菌株特異性綠膿桿菌螢光素介導的鐵攝取系統(Cornells等，1989,Infect Immun.,57,p.3491-3497；Meyer等，1997,Microbiology,143,p.35-43)：銅綠假單胞菌ATCC 15692(I型Pvd或Pvd I)、銅綠假單胞菌ATCC 27853(II型Pvd或Pvd II)和臨床隔離群銅綠假單胞菌R和pa6(III型Pvd或Pvd III)。
每種綠膿桿菌螢光素類型具有作為琥珀醯基、琥珀酸醯胺基(succinamid)或α-酮戊二醯基的側鏈上有所不同的三種成員(亞型)，即Pvd I型琥珀醯基、Pvd I型琥珀酸醯胺基、Pvd I型α-酮戊二醯基、Pvd II型琥珀醯基、Pvd II型琥珀酸醯胺基、Pvd II型α-酮戊二醯基、Pvd III型琥珀醯基、Pvd III型琥珀酸醯胺基和Pvd III型α-酮戊二醯基。
每種銅綠假單胞菌菌株表現一種Pvd類型，即銅綠假單胞菌ATCC 15692表現I型Pvd，銅綠假單胞菌ATCC 27853表現II型Pvd，而銅綠假單胞菌R和pa6表現III型Pvd，從而每種Pvd類型包括相應類型的所有三種成員，並且每種菌株還表現綠膿桿菌螯鐵蛋白。
發明人已經將綠膿桿菌螢光素和綠膿桿菌螯鐵蛋白鑑定為對於銅綠假單胞菌的致病性至關重要的靶物，並且在不產生由常規抗生素造成的強選擇壓力的情況下開發出對於此類靶物，即對於每種Pvd類型，包括對於每種類型而言在側鏈上不同的三個成員(亞型)(Pvd I s，Pvd I sa，Pvd I αKG，Pvd II s，Pvd II sa，Pvd II αKG，Pvd III s，Pvd III sa，Pvd III αKG)以及對於Pch，並且在每種情況下針對游離的鐵載體及針對具有結合鐵的鐵載體的特異性抑制劑(還可參見EP 15 305 242.8)。
認為生長的生物膜模式對於持久的銅綠假單胞菌感染是至關重要的(Costerton等，1999；Singh等，2000)，並且Pvd和Pch基因的雙重表現對於正常的生物膜形成是必需的(Banin等，2005)。考慮到銅綠假單胞菌生成全部在其致病性中發揮作用的給人深刻印象的一批毒力因子，一種有效抑制銅綠假單胞菌毒力的優選策略是靶向幾種毒力因子。
在一個態樣，本發明關於對綠膿桿菌螢光素I、II和III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合特異性的融合分子，其包含：(a)第一多肽，其包含或組成為(consisting of)結合綠膿桿菌螢光素I型的人嗜中性細胞明膠酶相關脂籠蛋白(hNGAL)突變蛋白；(b)第二多肽，其包含或組成為結合綠膿桿菌螢光素II型的hNGAL突變蛋白； (c)第三多肽，其包含或組成為結合綠膿桿菌螢光素III型的hNGAL突變蛋白；和(d)第四多肽，其包含或組成為結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白；其中所述第一、第二、第三和第四多肽是共價連接的。
在一個具體實例中，所述hNGAL突變蛋白包含在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145對應的一個或多個位置處的突變胺基酸殘基。
在一個具體實例中，所述hNGAL突變蛋白以200nM或更低的解離常數KD分別結合綠膿桿菌螢光素I型、綠膿桿菌螢光素II型、綠膿桿菌螢光素III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白。
在一個具體實例中，所述第一、第二、第三和第四多肽經由接頭分子共價連接。
在一個具體實例中，接頭分子是肽接頭。
在一個具體實例中，融合分子進一步包含允許所述融合分子多聚化的多聚化域。
在一個具體實例中，多聚化域是允許所述融合分子二聚化的二聚化域。
在一個具體實例中，所述二聚化域選自由下列組成之群組：Fc域、IgE重鏈域2(EHD2)、IgM重鏈域2(MHD2)、IgG重鏈域3(GHD3)、IgA重鏈域3(AHD2)、IgD重鏈域3(DHD3)、IgE重鏈域4(EHD4)、IgM重鏈域4(MHD4)、子宮珠蛋白二聚化域和前述中任一者的變體或片段。
在一個具體實例中，Fc域是人IgG4-Fc域。
在一個具體實例中，融合分子具有選自由下列組成之群組的通式：N’-X1-L1-X2-L2-X3-L3-X4-C’ (I)，N’-X1-L1-X2-L2-X3-L3-X4-L4-MD-C’ (II)，N’-MD-L1-X1-L2-X2-L3-X3-L4-X4-C’ (III)，N’-X1-L1-X2-L2-MD-L3-X3-L4-X4-C’ (IV)，N’-X1-L1-MD-L2-X2-L3-X3-L4-X4-C’ (V)，和N’-X1-L1-X2-L2-X3-L3-MD-L4-X4-C’ (VI)
其中X1、X2、X3和X4在每次出現時選自由下列組成之群組：第一、第二、第三和第四多肽，條件是所述融合分子包含所述第一、第二、第三和第四多肽之每種；MD包含多聚化域；並且L1、L2、L3和L4在每次出現時獨立選自共價鍵和接頭分子。
在一個具體實例中，融合分子以多聚體(例如二聚體)複合物存在。
在一個具體實例中，融合分子進一步包含至少一種允許檢測和/或分離所述融合分子的標記物或標簽。
在一個具體實例中，融合分子進一步包含一個或多個增加所述融合分子的穩定性和/或延長所述融合分子的血清半衰期的修飾。
在一個具體實例中，融合分子抑制或降低銅綠假單胞菌經由綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠膿桿菌螢光素的鐵攝取。
在一個具體實例中，融合分子抑制或降低銅綠假單胞菌的毒力因子表現。
在一個具體實例中，融合分子抑制或降低綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠 膿桿菌螢光素介導的信號傳導。
在一個具體實例中，融合分子抑制或降低銅綠假單胞菌細菌生長。
在一個具體實例中，融合分子與藥學活性劑結合或接合/融合。
在一個具體實例中，藥學活性劑選自由下列組成之群組：抗生素、細胞抑制劑、毒素、金屬或金屬化合物/複合物、螯合劑、半抗原和抗體。
在別的態樣中，本發明關於核酸分子，其包含編碼如上文限定的融合分子的核苷酸序列。
在一個具體實例中，核酸分子與調節序列可操作連接以允許核酸分子的表現。
在一個具體實例中，核酸分子被包含在載體中。
在另一個態樣中，本發明關於宿主細胞，其包含如上文限定的核酸分子。
在又一個態樣中，本發明關於製造如上文限定的融合分子的方法，其中(i)藉由在允許融合分子表現的條件下培養如上文限定的宿主細胞並且藉由從宿主細胞或其培養基分離融合分子，或者藉由體外轉譯轉譯如上文限定的核酸分子而生成融合分子。
在別的態樣中，本發明關於醫藥組合物，其包含如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、或如上文限定的細胞。
在一個具體實例中，醫藥組合物進一步包含醫藥上可接受之載體和/或賦形劑。
在一個具體實例中，醫藥組合物進一步包含另外的藥學活性劑。
在一個具體實例中，另外的藥學活性劑選自由下列組成之群組：抗生素、細胞抑制劑、毒素、金屬或金屬化合物/複合物、螯合劑、半抗原和抗體。
在又一個態樣，本發明關於套組，其包含如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的細胞、或如上文限定的醫藥組合物。
在又一個態樣，本發明關於如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的細胞、或如上文限定的醫藥組合物，其用作藥物。
在又一個態樣，本發明關於如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的細胞、或如上文限定的醫藥組合物，用於在預防或治療受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染中的用途。
在又一個態樣，本發明關於如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的細胞、或如上文限定的醫藥組合物，用於在預防或治療受試者中的與銅綠假單胞菌生物膜感染有關或由銅綠假單胞菌生物膜感染引起的疾病或病症中的用途。
在又一個態樣，本發明涉及預防或治療受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染的方法，其包括對受試者投予有效量的如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的細胞、或如上文限定的醫藥組合物。
在又一個態樣，本發明涉及預防或治療受試者中的與銅綠假單胞菌生物膜感染有關或由銅綠假單胞菌生物膜感染引起的疾病或病症的方法，其包括對受試者投予有效量的如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的細胞、或如上文限定的醫藥組合物。
在一個具體實例中，銅綠假單胞菌生物膜感染是急性或慢性感染。
構築體構築體構築體構築體構築體構築體構築體構築體
【發明詳述】
雖然下文詳細描述了本發明，但是應當理解，本發明不限於本文中描述的具體方法、方案和試劑，因為這些可以有所變化。還應當理解，本文中使用的術語是僅為了描述具體的具體實例，並且並不意圖限制本發明的範圍，其僅會以所附申請專利範圍限制。除非另有規定，本文中使用的所有技術和科學術語與本領域普通技術人員的通常理解具有相同的意義。
在下文中，將描述本發明的要素。然而，這些要素在具體具體實例的情況下列出，應當理解，它們可以以任何方式和以任何數目組合以創建別的具體實例。各個描述的例子和優選的具體實例不應解釋為將本發明僅限於明確描述的具體實例。此描述應當理解為支持並涵蓋將明確描述的具體實例與具有任何數目的公開和/或優選的要素組合的具體實例。此外，應當認為本申請中的所有描述的要素的任何排列和組合被本申請的描述公開，除非上下文另有指示。
優選地，本文中使用的術語如“A multilingual glossary of biotechnological terms：(IUPAC Recommendations)(生物技術術語的多語言詞匯表：(IUPAC推薦))”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.Kölbl編，Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland,(1995)中描述的那樣定義。
除非另有指示，本發明的實施會採用化學、生物化學、細胞生物學、免疫學、和重組DNA技術的常規方法，其在本領域的文獻(Sambrook,J.等(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中解釋。
貫穿本說明書和所附的申請專利範圍，除非上下文另有要求，詞語“包含/包括”及變型應當理解為暗示包括敘述的成員、整數或步驟或成員、 整數或步驟的組，但是不排除任何其它成員、整數或步驟或成員、整數或步驟的組，儘管在一些具體實例中，可以排除此類其它成員、整數或步驟或成員、整數或步驟的組，即主題在於包括敘述的成員、整數或步驟或成員、整數或步驟的組。在描述本發明的背景中(尤其在申請專利範圍的背景中)使用的術語“一個”和“一種”和“所述/該”及類似的提及應當理解為覆蓋單數和複數兩者，除非本文中另有指示或者上下文明確矛盾。本文中的數值範圍的敘述僅僅意圖充當個別提及落入範圍內的每個單獨數值的速記法。除非本文中另有指示，每個單獨的數值併入說明書中，就像其在本文中個別敘述一樣。可以以任何合適的次序進行本文中描述的所有方法，除非本文中另有指示或者上下文另有明確矛盾。本文中提供的任何和所有例子，或者例示性語言(例如“如”)的使用僅僅意圖更好地例示本發明，並且不對另外要求保護的本發明的範圍造成限制。說明書中的語言不應解釋為指示對於本發明的實施必需的任何不要求保護的要素。
貫穿本說明書的文本引用幾個文件。本文(無論在上文還是在下文)中引用的每篇文獻(包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商的規格說明、用法說明等)在此藉由提述以其整體併入。本文中的無一內容解釋為承認由於在先發明，本發明沒有資格早於此類公開。
A.融合分子
本發明提供對綠膿桿菌螢光素I、II和III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合特異性的融合分子，其包含：(a)第一多肽，其包含或組成為結合綠膿桿菌螢光素I型的人嗜中性細胞明膠酶相關脂籠蛋白(hNGAL)突變蛋白；(b)第二多肽，其包含或組成為結合綠膿桿菌螢光素II型的hNGAL突變蛋白； (c)第三多肽，其包含或組成為結合綠膿桿菌螢光素III型的hNGAL突變蛋白；和(d)第四多肽，其包含或組成為結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白；其中所述第一、第二、第三和第四多肽是共價連接的。
術語“融合分子”一般指藉由連接兩個或更多個獨特的分子(例如(多)肽或蛋白質)，特別是頭-至-尾(例如N端至C端或反之亦然)，從而產生具有源自每個初始分子(例如(多)肽或蛋白質)的功能特性的單一分子而創建的分子。在一個具體實例中，融合分子是融合蛋白。
如本文中使用，術語“結合特異性”指配體(例如本發明的融合分子)區分靶物(例如綠膿桿菌螢光素I、II和III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白)和一種或多種參照靶物的能力，這是因為結合特異性不是絕對的，而是相對的特性。例如，可以根據Western印跡、ELISA、RIA、ECL、IRMA測試、FACS、IHC和肽掃描測定特異性結合。
如本文中使用，“綠膿桿菌螢光素”意指在鐵缺乏性生長條件下由革蘭氏陰性細菌銅綠假單胞菌生成並且對鐵具有高親和力的螢光鐵載體。綠膿桿菌螢光素由三個結構部分構成：二羥基喹啉生色團、側鏈和可變肽鏈。肽鏈模塊參與受體識別和結合。已經鑑定出三種不同Pvd(在其肽鏈上不同)(I-III型；圖1A-D)。綠膿桿菌螢光素類型的大小和胺基酸組成及綠膿桿菌螢光素識別特異性對於每種物種是獨特的。可以區別三種銅綠假單胞菌菌株，每種生成不同綠膿桿菌螢光素類型和關聯FpvA受體。每種類型具有在側鏈上不同的三個成員(亞型)，所述側鏈是琥珀醯基、琥珀酸醯胺基或α-酮戊二醯基，即Pvd I型琥珀醯基、Pvd I型琥珀酸醯胺基、Pvd I型α-酮戊二醯基、Pvd II型琥珀醯基、Pvd II型琥珀酸醯胺基、Pvd II型α-酮戊二醯 基、Pvd III型琥珀醯基、Pvd III型琥珀酸醯胺基和Pvd III型α-酮戊二醯基。
如本文中使用，“綠膿桿菌螯鐵蛋白”意指由銅綠假單胞菌生成並且溶解三價鐵的水楊酸鹽和兩個半胱胺酸分子的且具有酚、羧酸鹽和胺配體官能性的噻唑啉衍生化接合物。綠膿桿菌螯鐵蛋白是一種擁有酚鹽，而無氧肟酸鹽和兒茶酚鹽(catecholate)模塊的結構上獨特的鐵載體(參見圖1E)。
如本文中使用，術語“嗜中性細胞明膠酶相關脂籠蛋白(hNGAL)”(又稱為“人脂籠蛋白2”或“人Lcn 2”或“人NGAL”或僅“脂籠蛋白”)指具有SWISS-PROT/UniProt數據庫登錄號P80188的成熟人嗜中性細胞明膠酶相關脂籠蛋白(NGAL)。人NGAL(hNGAL)突變蛋白在本文中也可以稱為“脂籠蛋白突變蛋白”或僅“突變蛋白”。SWISS-PROT/UniProt數據庫登錄號P80188中顯示的胺基酸序列可以用作特定的“參照序列”。在一個具體實例中，SEQ ID NO：1中顯示的胺基酸序列用作參照序列。野生型hNGAL不結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白。野生型hNGAL的天然配體是腸菌素，其以高親和力對接於(dock into)hNGAL的萼器(calyx)中。
如本文中使用，“突變蛋白”、“突變”實體(無論是蛋白質還是核酸)、或“突變體”指與天然存在(野生型)核酸或蛋白質參照序列/支架相比一個或多個核苷酸或胺基酸的交換、缺失或插入。所述術語還包括如本文中描述的突變蛋白的片段和變體。優選地，在本發明的融合分子中使用的突變蛋白、其片段或變體保留結合如本文中描述的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的功能。
在一個具體實例中，由第一、第二、第三和第四多肽包含的hNGAL突變蛋白分別對綠膿桿菌螢光素I、II和III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白是特異性的或者特異性結合綠膿桿菌螢光素I、II和III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白。
在本文中在結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變 蛋白的語境中使用時，術語“對...特異性”包括突變蛋白分別針對綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白、結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白或者與綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白反應。如此，針對、結合或起反應包括突變蛋白分別特異性結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白。在此語境中的術語“特異性”意指突變蛋白與如本文中描述的綠膿桿菌螢光素蛋白或綠膿桿菌螯鐵蛋白蛋白，但是基本上不與另一種蛋白質反應。術語“另一種蛋白質”分別包括任何非綠膿桿菌螢光素或非綠膿桿菌螯鐵蛋白蛋白質，包括與本文中公開的突變蛋白針對的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白緊密相關或同源的蛋白質。然而，術語“另一種蛋白質”不排除來自除了人外的物種，如定義“受試者”的語境中描述的那些物種的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白蛋白質、片段和/或變體。術語“基本上不結合”意指本公開的突變蛋白不結合另一種蛋白質，即顯示小於30%，特別是20%，更特別是10%，甚至更特別是小於9、8、7、6或5%的交叉反應性。可以特別藉由將本公開的脂籠蛋白突變蛋白與綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的反應同所述突變蛋白與一種或多種其它蛋白質的反應進行比較而容易地測試突變蛋白是否特異性反應，如上文限定的。例如，也可以根據Western印跡、ELISA、RIA、ECL、IRMA測試、FACS、IHC和肽掃描來測定“特異性結合”。
在一個具體實例中，由第一、第二、第三和第四多肽包含的hNGAL突變蛋白分別以可檢測的親和力結合綠膿桿菌螢光素I、II和III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白。
如本文中使用的，“可檢出的親和力”意指以一般約10-5M以下，例如約10-6M以下或約10-7M以下的解離常數KD結合選定的靶物的能力。更低的親和力(即更高的KD值)一般用常見的方法，如ELJSA不再能測量到，因 此是次等重要的。
如本文中使用的，可以藉由本領域技術人員已知的多種方法測量公開內容的蛋白質(例如人脂籠蛋白(lipocalin)2的突變蛋白)對選定的靶物(在本案的情況中為綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白)的“結合親和力”(從而測定突變蛋白-配體的KD值)。此類方法包括但不限於螢光滴定、直接ELISA、競爭ELISA、量熱方法，如等溫滴定量熱學(ITC)和表面等離振子共振(Biacore)。此類方法是本領域中完善建立的，並且其例子也在下文詳述。
還注意到相應的結合劑和其配體之間的複合物形成受到許多不同因素影響，如相應結合配偶體的濃度、競爭劑的存在、使用的緩衝液系統的pH和離子強度、和用於測定解離常數KD的實驗方法(例如螢光滴定、直接ELISA、競爭ELISA或表面等離振子共振，僅舉幾例)或者甚至用於評估實驗數據的數學算法。
因此，技術人員還清楚的是，KD值(相應結合劑和其靶物/配體之間形成的複合物的解離常數)可以在某個實驗範圍內變化，這取決於用於測定特定突變蛋白對給定配體的親和力的方法和實驗設置。這意味著可以有測量的KD值的略微偏差或公差範圍，例如取決於是藉由表面等離振子共振(Biacore)，藉由競爭ELISA，還是藉由“直接ELISA”測定KD值。
在一些具體實例中，如本發明的融合分子中使用的對綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)特異性的突變蛋白能夠以200nM或更低，或約100nM或更低，或約50nM或更低，或約25nM或更低，或約15nM或更低的解離常數KD結合綠膿桿菌螢光素(分別為I、II或III型)。在一些具體實例中，如本發明的融合分子中使用的對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白能夠以200nM或更低，或約100nM或更低，或約50nM或更低，或約25nM或更低， 或約15nM或更低的解離常數KD結合綠膿桿菌螯鐵蛋白。在一些別的具體具體實例中，根據本發明的融合分子的突變蛋白分別以約10nM或更低，或約5nM或更低，或約2nM或更低，或約1nM或更低，或約0.1nM或更低，或約10pM或更低的對綠膿桿菌螢光素(分別為I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白的解離常數結合綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白。
在具體的具體實例中，本發明的融合分子以200nM或更低，或約100nM或更低，或約50nM或更低，或約25nM或更低，或約15nM或更低，或約10nM或更低，或約5nM或更低，或約2nM或更低，或約1nM或更低，或約0.1nM或更低，或約10pM或更低的相應解離常數KD結合綠膿桿菌螢光素(I、II和III型)和綠膿桿菌螯鐵蛋白。
在一個具體實例中，藉由表面等離振子共振(Biacore)，藉由競爭ELISA，或者藉由“直接ELISA”測定KD值。
在本發明的融合分子中使用的hNGAL突變蛋白以及其產生和鑑定的方法詳細公開/描述於EP 15 305 242.8和PCT/EP2016/053226以及下文的“hNGAL突變蛋白”部分中。
在一個具體的具體實例中，在SEQ ID NO：2-18中任一者(例如SEQ ID NO：16)中顯示對綠膿桿菌螢光素I型特異性的hNGAL突變蛋白。在一個具體的具體實例中，在SEQ ID NO：19-37中任一者(例如SEQ ID NO：36)中顯示對綠膿桿菌螢光素II型特異性的hNGAL突變蛋白。在一個具體的具體實例中，在SEQ ID NO：38-53中任一者(例如SEQ ID NO：53)中顯示對綠膿桿菌螢光素III型特異性的hNGAL突變蛋白。在一個具體的具體實例中，在SEQ ID NO：54-63中任一者(例如SEQ ID NO：62)中顯示對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的hNGAL突變蛋白。
如本文中使用，術語“共價連接”指經由共價鍵或者經由共價接頭分子的連接。在一個具體實例中，第一、第二、第三和第四多肽經由接頭分子共價連接。
如本文中使用，術語“接頭分子”指適合於聯接/連接蛋白質模塊，例如如本文中定義的第一、第二、第三和第四多肽的分子。根據本發明的接頭分子可以具有任何大小/長度。然而，優選地，它長得足以提供足夠的柔性程度以防止聯接/連接的模塊干擾彼此的活性，例如藉由位阻，並且以允許正確的蛋白質折疊；可是優選地，它短得足以提供在細胞中的穩定性(例如蛋白水解穩定性)。合適的接頭分子是本領域技術人員已知的，並且包括例如肽及非肽分子，例如合適長度的非肽寡聚物和多聚物。根據本發明，本文中描述的單一融合分子內的各種接頭分子可以是相同或不同的。
在一個具體實例中，接頭分子是肽接頭。根據本發明的肽接頭可以具有任何長度，即它可以包含任何數目的胺基酸殘基。然而，優選地，它長得足以提供足夠的柔性程度以防止聯接/連接的模塊干擾彼此的活性，例如藉由位阻，並且以允許正確的蛋白質折疊；可是優選地，它短得足以提供在細胞中的穩定性(例如蛋白水解穩定性)。在一些具體實例中，肽接頭具有1至30個胺基酸的長度，或1至25個胺基酸的長度，或1至20個胺基酸的長度，或1至15個胺基酸的長度，或1至12個胺基酸的長度或1至10個胺基酸的長度。如此，根據本發明，肽接頭可以由單個胺基酸殘基，例如甘胺酸(Gly，G)構成。
根據本發明的肽接頭的胺基酸可以選自所有天然或非天然存在的胺基酸，特別選自胺基酸甘胺酸(Gly，G)、絲胺酸(Ser，S)和蘇胺酸(Thr，T)。在一個具體實例中，肽接頭是富含甘胺酸-絲胺酸-蘇胺酸的接頭或富含甘胺酸-絲胺酸的接頭，其中至少50%、或至少60%、或至少70%、或至 少80%、或至少90%的胺基酸分別是甘胺酸或絲胺酸或蘇胺酸殘基或者甘胺酸或絲胺酸殘基。在另一個具體實例中，胺基酸選自甘胺酸、絲胺酸和蘇胺酸，即肽接頭僅由甘胺酸、絲胺酸和蘇胺酸殘基構成(稱為甘胺酸-絲胺酸-蘇胺酸接頭)。在又一個具體實例中，肽接頭僅由甘胺酸和絲胺酸殘基構成(稱為甘胺酸-絲胺酸接頭)。
在一個具體實例中，肽接頭是甘胺酸-絲胺酸接頭，並且具有1至30個胺基酸的長度，或1至25個胺基酸的長度，或1至20個胺基酸的長度，或1至15個胺基酸的長度，或1至12個胺基酸的長度或1至10個胺基酸的長度。根據本發明的具體的肽接頭具有通式(GGGGX)n，其中在每次出現時，X獨立選自S和T，並且n是選自1至5，或1至4，或1至3，或1和2的整數。在一個具體實例中，肽接頭具有SEQ ID NO：141的胺基酸序列。在另一個具體實例中，肽接頭具有SEQ ID NO：142的胺基酸序列。
在一個具體實例中，融合分子進一步包含允許融合分子的多聚化的多聚化域。可以藉由多個(例如2、3或4，特別是2或3，更特別是2個)多聚化域之間的非共價相互作用和/或共價相互作用，特別地經由一個或多個二硫鍵發生多聚化。
合適的多聚化域是本領域技術人員已知的，並且包括例如三聚化域，如腱糖蛋白三聚化基序(motif)、膠原凝集素(collectin)三聚化域和鏈黴親合素，和二聚化域，如Fc域、IgE重鏈域2(EHD2)、IgM重鏈域2(MHD2)、IgG重鏈域3(GHD3)、IgA重鏈域3(AHD2)、IgD重鏈域3(DHD3)、IgE重鏈域4(EHD4)、IgM重鏈域4(MHD4)、子宮珠蛋白二聚化域。在一個具體實例中，Fc域是人IgG4-Fc域，其在一個具體的具體實例中包含SEQ ID NO：140的胺基酸序列或者由SEQ ID NO：140的胺基酸序列組成。還包括任一種前述域的變體或片段，例如已經經過修飾以延長其半衰 期和/或增加其效力的域，只要它們仍允許融合分子的多聚化(例如二聚化)，即是功能性的。合適的修飾是本領域技術人員已知的，並且包括但不限於Fc域的提高其對FcRn的親和力的修飾，如記載於例如Zalevsky,J.等(2010),Nature Biotechnology,28(2)：157-9(例如N434S、V259I/V308F、M252Y/S254T/T256E、M428L/N434S和V259I/V308F/M428L)。
在一個具體實例中，融合分子具有選自由下列組成之群組的通式：N’-X1-L1-X2-L2-X3-L3-X4-C’ (I)，N’-X1-L1-X2-L2-X3-L3-X4-L4-MD-C’ (II)，N’-MD-L1-X1-L2-X2-L3-X3-L4-X4-C’ (III)，N’-X1-L1-X2-L2-MD-L3-X3-L4-X4-C’ (IV)，N’-X1-L1-MD-L2-X2-L3-X3-L4-X4-C’ (V)，和N’-X1-L1-X2-L2-X3-L3-MD-L4-X4-C’ (VI)
其中X1、X2、X3和X4在每次出現時選自由下列組成之群組：第一、第二、第三和第四多肽，條件是所述融合分子包含所述第一、第二、第三和第四多肽之每種；MD包含多聚化域；並且L1、L2、L3和L4在每次出現時獨立選自共價鍵和接頭分子。
根據本發明，L1、L2、L3和L4可以是相同或不同的。
在一個具體實例中，融合分子以多聚體(例如二聚體)複合物存在。
因此，在一個態樣中，本發明還提供多聚體(或多聚體複合物)，其包含兩個或更多個本文中描述的融合分子(例如二聚體或二聚體複合物)。此類複合物又可以稱為融合分子複合物。在一個具體實例中，兩個或更多個融合分子非共價或共價(例如經由二硫鍵)聯合以形成融合分子複合物。
在一個具體實例中，融合分子進一步包含至少一個允許檢測和/或分離融合分子的標記物或標簽。
“允許檢測和/或分離融合分子的標記物或標簽”意圖包括本領域中已知用於這些目的的任何標記物/標簽。它們包括親和標簽，如Strep-tag®或Strep-tag® II(Schmidt,T.G.M.等(1996)J.Mol.Biol.255,753-766)、myc標簽、FLAG標簽、His6標簽或HA標簽或蛋白質，如麥芽糖結合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)及其組合(例如Strep-tag®或Strep-tag® II和His-6標簽)。具有生色或螢光特性的蛋白質，如綠色螢光蛋白(GFP)或黃色螢光蛋白(YFP)也是合適的標記物。
(多)肽標記物或標簽的胺基酸序列可以在融合分子的胺基酸序列內的任何位置處引入，並且可以例如採取在編碼的蛋白質結構內的環形狀(例如在本文中描述的任何肽接頭內或者甚至在突變蛋白內，只要標記物/標簽不干擾其功能)，或者它可以是N端或C端融合的。標記物或標簽可以進一步含有允許從融合分子除去標記物或標簽的切割位點。類似地，可以在任何合適的位點處將非肽標記物或標簽，例如螢光染料與融合分子接合。
一般地，有可能用任何合適的化學物質或酶(其直接或間接產生可檢測的化合物或化學、物理、光學或酶反應的信號)標記本發明的融合分子。物理反應和同時光學反應/標記物的一個例子是當使用放射性標記物時X射線的照射或發射後的螢光發射。鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶和β-半乳糖苷酶是酶標記物(和同時光學標記物)的例子，其催化生色反應產物的形成。
融合分子還可以包含用於促進分子分泌的胺基酸序列，如N端分泌信號、或信號序列。本發明的融合分子可以進一步包含結合域，其用來例如增強對特定細胞類型的選擇性。這可以例如藉由提供結合域實現，所述結 合域結合所述細胞類型的表面上表現的特定抗原。
在一個具體實例中，融合分子進一步包含一個或多個增加融合分子的穩定性和/或延長融合分子的血清半衰期的修飾。
在一個具體實例中，融合分子的“穩定性”涉及融合分子的“半衰期”(例如體內)。“半衰期”涉及消除分子的活性、量或數目的一半需要的時間段。
在一些具體實例中，可以將融合分子與延長融合分子的血清半衰期的模塊接合(在這點上，還可見PCT公開文本WO 2006/56464 A2，其中參照對CTLA-4具有結合親和力的人嗜中性細胞明膠酶相關脂籠蛋白的突變蛋白描述了此類接合策略)。延長血清半衰期的模塊可以是聚亞烷基二醇分子、羥乙基澱粉、多唾液酸、脂肪酸分子，如棕櫚酸(Vajo & Duckworth 2000,Pharmacol.Rev.52,1-9)、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白結合肽、清蛋白結合蛋白、或運鐵蛋白，僅舉幾例。清蛋白結合蛋白可以是細菌清蛋白結合蛋白、抗體、抗體片段，包括域抗體(參見例如美國專利6,696,245)、或對清蛋白具有結合活性的突變蛋白。因而，適合於延長本發明的融合分子的半衰期的接合配偶體包括清蛋白結合蛋白，例如細菌清蛋白結合域，如鏈球菌蛋白G的一種(König,T.,& Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。可以用作接合配偶體的清蛋白結合肽的其它例子是例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列者，其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；並且Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如美國專利申請2003/0069395或Dennis等(Dennis,M.S.,Zhang,M.,Meng,Y.G.,Kadkhodayan,M.,Kirchhofer,D.,Combs,D.& Damico,L.A.(2002)J Biol Chem 277,35035-35043)中所述。
在其它具體實例中，清蛋白自身(Osborn,B.L.等，2002,J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548)，或清蛋白的生物學活性片段可以用作本發明的融合分子的接合配偶體。術語“清蛋白”包括所有哺乳動物清蛋白，如人血清清蛋白或牛血清清蛋白或大鼠清蛋白。可以重組生成清蛋白或其片段，如美國專利5,728,553或歐洲專利申請案EP 0 330 451和EP 0 361 991中所述。可以將重組人清蛋白(Recombumin®)Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)與本發明的融合分子接合或融合以延長融合分子的半衰期。
若清蛋白結合蛋白是抗體片段，則它可以是域抗體。域抗體(dAb)工程化改造為容許對生物物理特性和體內半衰期的精確控制以創建最佳安全性和效力產物概況。例如，域抗體可購自Domantis Ltd.(Cambridge,UK和MA,USA)。
使用轉鐵蛋白作為模塊來延長本發明的融合分子的血清半衰期，融合分子可以遺傳上融合於非糖基化轉鐵蛋白的N或C端或兩者。非糖基化轉鐵蛋白具有14-17天的半衰期，並且類似地，轉鐵蛋白融合蛋白會具有延長的半衰期。轉鐵蛋白載體還提供高生物利用度、生物分佈和循環穩定性。此技術可購自BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation,PA,USA)。用作蛋白質穩定劑/半衰期延長配偶體的重組人轉鐵蛋白(DeltaFerrinTM)也可購自Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)。
若為了延長本發明的突變蛋白的血清半衰期而使用免疫球蛋白的Fc部分，可以使用可購自Syntonix Pharmaceuticals,Inc(MA,USA)的SynFusionTM技術。此Fc-融合技術的使用容許創建更長效的生物藥物，並且可以例如由與抗體的Fc區連接的至少四種突變蛋白之每種的兩個拷貝組成以改善藥動學、溶解度和生成效率。
延長本發明的融合分子的半衰期的又一種備選是於融合分子的N或C 端融合長的、非結構化的、柔性的富含甘胺酸的序列(例如具有約20至80個連續甘胺酸殘基的多聚甘胺酸)。例如，WO2007/038619中公開的此方法也已經稱作“rPEG”(重組PEG)。
若使用聚亞烷基二醇作為接合配偶體，則聚亞烷基二醇可以是取代的、未取代的、線性或分支的。它也可以是活化的聚亞烷基衍生物。合適的化合物的例子是聚乙二醇(PEG)分子，如WO 99/64016，美國專利6,177,074或涉及干擾素的美國專利6,403,564中所述，或如對其它蛋白質所述，如經PEG修飾的門冬醯胺酶，PEG-腺苷脫氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(參見例如Fuertges等(1990)The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J.Control.Release 11,139-148)。此類聚合物(如聚乙二醇)的分子量的範圍可以為約300至約70.000道爾頓，包括例如具有約10.000，約20.000，約30.000或約40.000道爾頓的分子量的聚乙二醇。此外，如例如美國專利6,500,930或6,620,413中所述，為了血清半衰期延長，可以將碳水化合物寡聚物和聚合物，如澱粉或羥乙基澱粉(HES)與本發明的融合分子接合。
在一個具體實例中，本發明的融合分子在其N端和/或其C端融合於融合配偶體，所述融合配偶是延長融合分子的血清半衰期的蛋白質域。在別的具體的具體實例中，蛋白質域是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白結合肽、或清蛋白結合蛋白。
在另一個具體實例中，將本發明的融合分子與延長融合分子的血清半衰期的化合物接合。更具體地，將突變蛋白與選自由下列組成之群組的化合物接合：聚亞烷基二醇分子、羥乙基澱粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白結合肽、和清蛋白結合蛋白。
在一個具體實例中，融合分子抑制或降低銅綠假單胞菌經由綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠膿桿菌螢光素的鐵攝取。
在一個具體實例中，融合分子降低銅綠假單胞菌的毒力因子表現。
在一個具體實例中，融合分子抑制或降低銅綠假單胞菌細菌生長。
在一個具體實例中，融合分子與藥學活性劑結合或接合/融合。可以藉由本領域中公知的方法生成此類接合物。
在一個具體實例中，藥學活性劑選自由下列組成之群組：抗生素、細胞抑制劑、毒素、酶、金屬或金屬化合物/複合物、螯合劑、放射性核素、小有機分子、治療活性肽、治療活性核酸分子、半抗原和抗體。
合適的抗生素包括妥布黴素、阿奇黴素(Azithromycin)、氨曲南(Aztreonam)、黏菌素(Colistin)和碳青黴烯(carbapenems)。
合適的金屬或金屬化合物/複合物是鎵、鎵化合物和基於鎵的複合物。
如本文中使用，術語“小有機分子”指包含至少兩個碳原子，但是優選不超過7或12個可旋轉的碳鍵，具有100-2000道爾頓，特別是100-1000道爾頓，或<900道爾頓的範圍的分子量，並且任選地包含一個或多個金屬原子的有機分子。
術語“治療活性肽”指例如作用為細胞表面受體的激動劑/拮抗劑的肽或競爭給定細胞靶物上的蛋白質結合位點的肽。
術語“治療活性核酸分子”指例如反義核酸分子、小干擾RNA、微小RNA或核酶。
具體的藥學活性劑包括阿法鏈道酶(Dornase alfa)、皮質類固醇、白三烯修飾劑、N-乙醯半胱胺酸、吸入的谷胱甘肽、抗膽鹼藥、布洛芬和β2-腎上腺素能受體激動劑。
在一個具體實例中，融合分子包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：134至139和SEQ ID NO：143至186，其中在具體的具體實例中，SEQ ID NO：144至186的胺基酸序列缺乏(C端)Strep-tag® II和His6標簽。在一個具體實例中，融合分子包含SEQ ID NO：134或SEQ ID NO：136的胺基酸序列或由SEQ ID NO：134或SEQ ID NO：136的胺基酸序列組成。
B.用於在本發明的融合分子中使用的hNGAL突變蛋白
在一些具體實例中，結合綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白可以包含天然的半胱胺酸殘基(例如人NGAL的線性多肽序列SEQ ID NO：1的第87位的半胱胺酸殘基)被另一種胺基酸(例如絲胺酸殘基)的至少一個胺基酸取代。在一些其它具體實例中，結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的突變蛋白可以包含取代野生型hNGAL的一個或多個胺基酸的一個或多個非天然半胱胺酸殘基。在一個別的具體的具體實例中，根據本公開內容的hNGAL突變蛋白包含天然胺基酸被半胱胺酸殘基的至少兩個胺基酸取代，從而形成一個或多個半胱胺酸橋。在一些具體實例中，所述半胱胺酸橋可以連接至少兩個環區。本文中根據Flower(Flower,1996，見上文，Flower，等，2000，見上文)和Breustedt等(2005，見上文)使用這些區域的定義。
在一些具體實例中，本揭示內容的hNGAL突變蛋白不結合於腸菌素。
在一個態樣中，本揭示內容包括各種hNGAL突變蛋白，其例如以至少可檢測的親和力結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白。在此意義上，認為綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白是參照野生型hNGAL的非天然配體，其中“非天然配體”指在生理學條件下不結合野生型人脂籠蛋白2的 化合物。藉由將野生型hNGAL工程化改造為在某些序列位置處具有一個或多個突變，本發明人已經證明了對於非天然配體(綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白)的高親和力和高特異性是可能的。在一些具體實例中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多個編碼野生型I人脂籠蛋白2上的某些序列位置的核苷酸三聯體(triplets)，可以經由藉由核苷酸三聯體的亞組在這些位置處的取代進行隨機誘變。
本揭示內容的突變蛋白可以具有與hNGAL的線性多肽序列的某些序列位置(如人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145)對應的序列位置的任何一處或多處，包括至少在任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12處的突變胺基酸殘基。在一些具體實例中，突變胺基酸殘基代表保守或非保守取代。在一些具體實例中，hNGAL突變蛋白包含在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、54、65和87對應的一個或多個位置的突變胺基酸殘基。
公開內容的突變蛋白可以包含在突變胺基酸序列位置外部的“親本”蛋白質支架(如hNGAL)的野生型(天然)胺基酸序列。在一些具體實例中，根據公開內容的hNGAL突變蛋白還可以攜帶一個或多個序列位置處的一個或多個胺基酸突變，只要此類突變至少基本上不阻礙或不干擾突變蛋白的結合活性和折疊。可以在DNA水平上使用建立的標準方法(Sambrook,J.等(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)非常容易地實現此類突變。胺基酸序列的改變的例示性例子是插入或缺失以及胺基酸取代。此類取代可以是保守的，即胺基酸殘基被替換為化學相似特性(特別就極性及大小而言) 的胺基酸殘基。保守取代的例子是以下組的成員間的替換：1)丙胺酸、絲胺酸和蘇胺酸；2)天冬胺酸和谷胺酸；3)天冬醯胺和穀氨醯胺；4)精胺酸和賴胺酸；5)異亮胺酸、亮胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸；和6)苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸。另一態樣，也有可能在胺基酸序列中引入非保守變化。另外，代替替換單一胺基酸殘基，也有可能插入或缺失人脂籠蛋白2的一級結構的一個或多個連續胺基酸，只要這些缺失或插入導致穩定的折疊/功能突變蛋白(例如具有截短的N和C端的hNGAL突變蛋白)。在此類突變蛋白中，例如，在多肽的N或C端添加或缺失一個或多個胺基酸殘基。一般地，此類突變蛋白可以與成熟hNGAL的胺基酸序列具有約至少70%，包括至少約80%，如至少約85%胺基酸序列同一性。作為一個說明性的例子，本公開內容還涵蓋如上文限定的hNGAL突變蛋白，其中成熟hNGAL的線性多肽序列的4個胺基酸殘基(G-N-I-K；位置95-98；SEQ ID NO：130)已經被缺失(例如SEQ ID NO：46)。
當同與其它脂籠蛋白的序列同一性比較時，本文中公開的hNGAL突變蛋白的胺基酸序列具有與成熟hNGAL(SEQ ID NO：1)的高序列同一性。在此一般語境中，公開內容的突變蛋白的胺基酸序列與天然野生型hNGAL的胺基酸序列是至少基本上相似的，例如條件是比對中可能有作為胺基酸的添加或缺失的結果的缺口(如下文定義)。在一些具體實例中，與成熟hNGAL的序列基本上相似的公開內容的突變蛋白的相應序列與成熟hNGAL的序列具有至少70%同一性或序列同源性、至少75%同一性或序列同源性、至少80%同一性或序列同源性、至少82%同一性或序列同源性、至少85%同一性或序列同源性、至少87%同一性或序列同源性、至少90%同一性或序列同源性，包括至少95%同一性或序列同源性，例如條件是改變的位置或序列得到保留，並且一個或多個缺口是可能的。
a)對綠膿桿菌螢光素特異性的hNGAL突變蛋白
在一個態樣中，本揭示內容涉及對一類綠膿桿菌螢光素，如Pvd I型、Pvd II型或Pvd III型特異性的特異性結合人脂籠蛋白2(人Lcn2或hNGAL)突變蛋白。
本揭示內容的一個具體實例涉及突變蛋白，其能夠例如以可檢測的親和力，如藉由約200nM或更低，如約150nM或更低的KD測量的親和力結合一類綠膿桿菌螢光素。
在一個態樣中，本揭示內容提供hNGAL突變蛋白，其能夠以約20nM或更低，如15nM或更低的KD結合與鐵複合的Pvd I型，例如在基本上在實例6中描述的測定法中藉由Biacore T200儀測量時。
在一些別的具體實例中，本揭示內容的一個或多個hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的Pvd I型琥珀醯基、Pvd I型琥珀酸醯胺基和Pvd I型α-酮戊二醯基，例如在基本上在實例5中描述的ELISA測定法中測量時。
在一些具體實例中，突變蛋白能夠以約150nM或更低的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素I型琥珀醯基介導的鐵攝取，例如在基本上在實例7中描述的競爭ELISA形式中。
在一些具體實例中，突變蛋白能夠抑制Pvd I菌株的細菌生長，例如在基本上在實例8中描述的測定法中。
在這方面上，本揭示內容涉及多肽(例如如本文中提及的第一多肽)，其中所述多肽包含hNGAL突變蛋白或由hNGAL突變蛋白組成，並且所述hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含序列位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136處的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多個突變胺基酸殘基，並且其中所述多肽結合Pvd I型，包括Pvd I型琥珀醯基、Pvd I型琥珀酸醯胺基和Pvd I型α-酮戊二醯基。
在一些具體實例中，本揭示內容的Pvd I型結合hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一處或多處包含以下突變胺基酸殘基中的一個或多個：Leu 36→Asn,Thr,Val,Trp或Phe；Ala 40→Gly,Asn,Thr或Phe；Ile 41→Arg,Ala,Thr,Phe或Trp；Gln 49→Ile,Leu,Val,Ala或Pro；Tyr 52→Met,Trp或Pro；Ser 68→Asp,Val或Glu；Leu 70→Gln,Trp,Asp或Thr；Arg 72→Trp,Ala,Ser,Leu,Pro或Glu；Lys 73→Asp,Leu,Ala,Glu或Asn；Asp 77→Arg,Leu,Tyr,Ser,Gln,Thr,Ile或Asn；Trp 79→Gln,Asp,Ser,Arg,Met或Glu；Arg 81→Gln,Gly,Ile,Glu,His或Asp；Asn 96→His,Ile,Gly,Tyr或Asp；Tyr 100→Lys,Glu,Asn,Ser,Phe或Tyr；Leu 103→Lys,Pro,Gln,His,Asp,Tyr,Glu,Trp或Asn；Tyr 106→His,Gln或Phe；Lys 125→Arg,Ser,Trp,Tyr,Val或Gly；Ser 127→Trp,Asn,Ala,Thr,Tyr,His,Ile,Val或Asp；Tyr 132→Trp,Asn,Gly或Lys；和Lys 134→Asn,His,Trp,Gly,Gln或Asp。在一些具體實例中，公開內容的hNGAL突變蛋白包含成熟hNGAL的這些序列位置處的兩個或更多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多或所有突變胺基酸殘基。
另外，根據本揭示內容的Pvd I型結合hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比還可以包含一個或多個或所有下述取代：Gln 28→His；Lys 46→Glu；Thr 54→Val或Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp或Gln；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser或Asn；和Thr 136→ Ala。
在一些別的具體實例中，本揭示內容之結合Pvd I型的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下胺基酸替換：(a)Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Gln；Arg 72→Trp；Lys 73→Asp；Asp 77→Leu；Trp 79→Gln；Arg 81→Gln；Cys 87→Ser；Asn 96→His；Tyr 100→Lys；Leu 103→His；Tyr 106→His；Lys 125→Arg；Ser 127→Trp；Tyr 132→Trp；Lys 134→Asp；(b)Gln 28→His；Leu 36→Thr；Ala 40→Gly；Ile 41→Phe；Gln 49→Leu；Tyr 52→Trp；Leu 70→Trp；Arg 72→Ala；Lys 73→Leu；Asp 77→Tyr；Trp 79→Asp；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Glu；Leu 103→His；Tyr 106→Gln；Lys 125→Trp；Ser 127→Asn；Tyr 132→Asn；Lys 134→Gln；(c)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Lys；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ala；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(d)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Asn；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Met；Ser 68→Asp；Leu 70→Thr；Arg 72→Glu；Lys 73→Ala；Asp 77→Arg；Trp 79→Arg；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Tyr 100→Lys；Leu 103→Pro；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ser；Ser 127→Thr；Tyr 132→Trp；Lys 134→Gly；(e)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Phe；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；(f)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Phe；Ile 41→Phe；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Trp；Arg 72→Leu；Lys 73→Asn；Asp 77→Gln；Trp 79→Glu；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Leu 103→Tyr；Tyr 106→His；Lys 125→Val；Ser 127→His；Tyr 132→Lys；Lys 134→Trp；(g)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(h)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Asp；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Val；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(i)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Thr；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Asn；Leu 103→Glu；Tyr 106→His；Lys 125 →Tyr；Ser 127→Asp；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(j)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Val；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Asn；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Val；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(k)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；(l)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(m)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His； (n)Leu 36→Trp；Asn 39→Asp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Atg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；(o)Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Ala；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；(p)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Atg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；或(q)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Gln；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→ Ser；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His。
在殘留的區域(即與序列位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136不同的區域)中，本揭示內容的hNGAL突變蛋白可以包含在突變胺基酸序列位置外部的野生型(天然)胺基酸序列。
在別的具體的具體實例中，根據本揭示內容的突變蛋白包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：2-18或其片段或變體。
本揭示內容的Pvd I型結合hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與選自由下列組成之群組的序列可以具有高序列同一性，如至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性：SEQ ID NO：2-18。
本揭示內容還包括具有選自由下列組成之群組的胺基酸序列的hNGAL突變蛋白的結構同源物：SEQ ID NO：2-18，所述結構同源物相對於所述hNGAL突變蛋白具有超過約60%，特別是超過65%、超過70%、超過75%、超過80%、超過85%、超過90%、超過92%並且更特別地超過95%的胺基酸序列同源性或序列同一性。
可以依靠人脂籠蛋白2的天然存在形式的誘變獲得根據本公開內容的Pvd I型結合hNGAL突變蛋白。在誘變的一些具體實例中，取代(或替換)是保守取代。不過，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下述例示性取代的一個或多個)，只要突變蛋白保留其結合Pvd I型的能力，和/或它與然後取代的序列具有的同一性在於它與成熟人脂籠蛋白2的胺基酸序列(SWISS-PROT數據庫登錄號P80188)具有至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高的同一性。
在另一個態樣中，本揭示內容提供hNGAL突變蛋白，其以約20nM或更低，如5nM或更低的KD結合與鐵複合的Pvd II型，例如在基本上在實例6中描述的測定法中藉由Biacore T200儀測量時。
在又一些別的具體實例中，本揭示內容的一個或多個hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的Pvd II型琥珀醯基、Pvd II型琥珀酸醯胺基和Pvd II型α-酮戊二醯基，例如在基本上在實例5中描述的ELISA測定法中測量時。
在一些具體實例中，突變蛋白能夠以約150nM或更低的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素II型琥珀醯基介導的鐵攝取，例如在基本上在實例7中描述的競爭ELISA形式中。
在一些具體實例中，突變蛋白能夠抑制Pvd II菌株的細菌生長，例如在基本上在實例8中描述的測定法中。
在一些其它具體實例中，突變蛋白能夠抑制或減輕表現綠膿桿菌螢光素II型的銅綠假單胞菌菌株的生長，例如在基本上在實例10中描述的測定法中。
在這點上，公開內容涉及多肽(例如如本文中提及的第二多肽)，其中所述多肽包含hNGAL突變蛋白或由hNGAL突變蛋白組成，並且所述hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含序列位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134處的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多個突變胺基酸殘基，並且其中所述多肽結合Pvd II型。
在一些具體實例中，本揭示內容的Pvd II型結合hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置36、40-41、49、52、 68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一處或多處包含以下突變胺基酸殘基中的一個或多個：Leu 36→Asn,Ile或Val；Ala 40→Glu,Gly,Asn,Thr或His；Ile 41→Arg,Val或Thr；Gln 49→Gly,Ala或Pro；Tyr 52→Asn,Gly,Trp或Pro；Ser 68→Asp,Arg或Glu；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His,Ile,Ala,Ser或Gly；Lys 73→Asn,Met,Pro,Phe,Gln或Arg；Asp 77→His,Ile,Met,Lys,Gly或Asn；Trp 79→Ser,Tyr,Ala,Asp,Phe或Trp；Arg 81→Glu,Ser,Tyr或Asp；Asn 96→Met,Ile,Arg,Asp,Lys,Asn或Ala；Tyr 100→Lys,Glu,Asn,Ser,Phe或Tyr；Leu 103→Thr,Ile,Gln,Gly,Met,His,Trp或Val；Tyr 106→Met,Gln,Ala,Ile,Asn,Gly,Met或Phe；Lys 125→Ala,Ile或Asn；Ser 127→Lys,Arg,Ser,Met,Asp或Asn；Tyr 132→Met,Phe,Asn,Ala,Ile,Gly或Val；和Lys 134→Trp或Tyr。在一些具體實例中，本揭示內容的hNGAL突變蛋白包含成熟hNGAL的這些序列位置處的兩個或更多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多或所有突變胺基酸殘基。
另外，根據公開內容的Pvd II型結合hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比還可以包含一個或多個或所有下述取代：Gln 28→His；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp或Gln和Cys 87→Ser。
在一些別的具體實例中，本揭示內容之結合Pvd II型的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下胺基酸替換：(a)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys； Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；(b)Gln 28→His；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Met；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Met；Lys 134→Trp；(c)Gln 28→His；Leu 36→Ile；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Pro；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gly；Tyr 106→Ala；Lys 125→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；(d)Gln 28→His；Ala 40→Asn；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ser；Lys 73→Gln；Asp 77→Met；Trp 79→Ala；Arg 81→Tyr；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Pro；Leu 103→Thr；Tyr 106→Ile；Lys 125→Lys；Ser 127→Met；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(e)Gln 28→His；Ala 40→His；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Asp；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Asp；Leu 103→Met；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ala；Ser 127→Asp；Tyr 132→Asn；Lys 134→Trp；(f)Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Ser 68→Arg；Leu 70→Trp；Arg 72→Asn；Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Glu；Cys 87→ Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Thr；Leu 103→Trp；Tyr 106→Asn；Lys 125→Asn；Ser 127→Met；Tyr 132→Ile；Lys 134→Tyr；(g)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gly；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→Gly；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Trp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Gly；Lys 125→Lys；Ser 127→Asn；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；(h)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；(i)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；(j)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ls；Tyr 100→His；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Ala；Lys 134→Trp；(k)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Gly；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His； Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；(l)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Phe；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Met；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；(m)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；(n)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；(o)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Gln；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→ Trp；(p)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；(q)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；(r)Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；或(s)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp。
在殘留的區域(即與序列位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134不同的區域)中，本揭示內容的hNGAL突變蛋白可以包含在突變胺基酸序 列位置外部的野生型(天然)胺基酸序列。
在別的具體的具體實例中，根據本揭示內容的突變蛋白包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：19-37或其片段或變體。
本揭示內容的Pvd II型結合hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與選自由下列組成之群組的序列可以具有高序列同一性，如至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性：SEQ ID NO：19-37。
本揭示內容還包括具有選自由下列組成之群組的胺基酸序列的hNGAL突變蛋白的結構同源物：SEQ ID NO：19-37，所述結構同源物相對於所述hNGAL突變蛋白具有超過約60%，特別是超過65%、超過70%、超過75%、超過80%、超過85%、超過90%、超過92%並且最特別地超過95%的胺基酸序列同源性或序列同一性。
可以依靠人脂籠蛋白2的天然存在形式的誘變獲得根據本揭示內容的Pvd II型結合hNGAL突變蛋白。在誘變的一些具體實例中，取代(或替換)是保守取代。不過，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下述例示性取代的一個或多個)，只要突變蛋白保留其結合Pvd II型的能力，和/或它與然後取代的序列具有的同一性在於它與成熟人脂籠蛋白2的胺基酸序列(SWISS-PROT數據庫登錄號P80188)具有至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高的同一性。
在又一個態樣中，本揭示內容提供hNGAL突變蛋白，其能夠以約20nM或更低，如10nM或更低的KD結合與鐵複合的Pvd III型，例如在基本上在實例6中描述的測定法中藉由Biacore T200儀測量時。
在又一些別的具體實例中，本揭示內容的一個或多個hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合 鐵的Pvd III型琥珀醯基、Pvd III型琥珀酸醯胺基和Pvd III型α-酮戊二醯基，例如在基本上在實例5中描述的ELISA測定法中測量時。
在一些具體實例中，突變蛋白能夠以約150nM或更低的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素III型介導的鐵攝取，例如在基本上在實例7中描述的競爭ELISA形式中。
在一些具體實例中，突變蛋白能夠抑制Pvd III菌株的細菌生長，例如在基本上在實例8中描述的測定法中。
在這點上，本揭示內容涉及多肽(例如如本文中提及的第三多肽)，其中所述多肽包含hNGAL突變蛋白或由hNGAL突變蛋白組成，並且所述hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含序列位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、105-106、125、127、132、134和145處的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多個突變胺基酸殘基，並且其中所述多肽結合Pvd III型。
在一些具體實例中，本揭示內容的Pvd III型結合hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一處或多處包含以下突變胺基酸殘基中的一個或多個：Leu 36→Phe或Glu；Ala 40→Trp,Leu或Arg；Ile 41→Met,Arg,Ala,Leu或Trp；Gln 49→His,Ile,Arg,Lys,Met或Pro；Tyr 52→Asn,Tyr,Arg,Ser或Met；Ser 68→Asp,Asn,Glu或Gln；Leu 70→Lys,Asn或Arg；Arg 72→Leu,Arg,Gln或Tyr；Lys 73→His,Leu,Ala,Pro,Gln或Tyr；Asp 77→Ala,Ile,Lys,Gln或Arg；Trp 79→Ser或Asp；Arg 81→His,Ala,Ser或Val；Asn 96→Met,Ile,Arg,Gly,Leu或Val；Tyr 100→Ala,Ile,Asn,Pro或Asp；Leu 103→Gln,Gly,Phe或Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp或Thr；Ser 127→Val,His,Ile,Phe或Ala；Tyr 132→Phe；和Lys 134→Trp,Gln或Glu。在一些具體實例中，本揭示內容的hNGAL突變蛋白包含成熟hNGAL的這些序列位置處的兩個或更多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多或所有突變胺基酸殘基。
另外，根據本揭示內容的Pvd III型結合hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比還可以包含一個或多個或所有下述取代：Gln 28→His；Leu 42→Arg；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Asp 47→Asn；Asn 65→Asp；Cys 87→Ser；Ser 105→Pro和Thr 145→Pro。
在一些別的具體實例中，本揭示內容之結合Pvd III型的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下胺基酸替換：(a)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Met；Gln 49→His；Tyr 52→Asn；Ser 68→Glu；Leu 70→Lys；Arg 72→Gln；Lys 73→Ala；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→His；Tyr 132→Phe；Lys 134→Gln；(b)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Arg；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Tyr；Ser 68→Gln；Leu 70→Asn；Arg 72→Trp；Lys 73→Leu；Asp 77→Ala；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Ile；Leu 103→Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Thr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；(c)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Leu；Ile 41→Leu；Gln 49→Arg；Tyr 52→Arg；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Leu；Lys 73→Tyr；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ala；Cys 87→ Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ala；Leu 103→Phe；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Ala；Lys 134→Glu；(d)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Pro；Asp 77→Arg；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Pro；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；(e)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Ala；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(f)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(g)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Thr；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Arg；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Val；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(h)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His； Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(i)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Tyr；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→-；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(j)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(k)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；(l)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→ Trp；(m)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(n)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；(o)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；或(p)Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp。
在殘留的區域(即與序列位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、105-106、125、127、132、134和145不同的區域)中，本揭示內容的hNGAL突變蛋白可以包含在突變胺基酸序列位置外部的野生型(天然)胺基酸序列。
在別的具體的具體實例中，根據本揭示內容的突變蛋白包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：38-53或其片段或變體。
本揭示內容的Pvd III型結合hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與選自由下列組成之群組的序列可以具有高序列同一性，如至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性：SEQ ID NO：38-53。
本揭示內容還包括具有選自由下列組成之群組的胺基酸序列的hNGAL突變蛋白的結構同源物：SEQ ID NO：38-53，所述結構同源物相對於所述hNGAL突變蛋白具有超過約60%，特別是超過65%、超過70%、超過75%、超過80%、超過85%、超過90%、超過92%並且最特別地超過95%的胺基酸序列同源性或序列同一性。
可以依靠人脂籠蛋白2的天然存在形式的誘變獲得根據本揭示內容的Pvd III型結合hNGAL突變蛋白。在誘變的一些具體實例中，取代(或替換)是保守取代。不過，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下述例示性取代的一個或多個)，只要突變蛋白保留其結合Pvd I型的能力，和/或它與然後取代的序列具有的同一性在於它與成熟人脂籠蛋白2的胺基酸序列(SWISS-PROT數據庫登錄號P80188)具有至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高的同一性。
b)對綠膿桿菌螢光素特異性的突變蛋白的應用
因此，醫學中存在公開內容的綠膿桿菌螢光素結合突變蛋白的許多 可能的應用。在一個別的態樣中，本揭示內容涉及本文中公開的綠膿桿菌螢光素結合突變蛋白用於檢測樣品中的綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)的用途以及相應的診斷方法。
本揭示內容還關於如描述的一種或多種綠膿桿菌螢光素結合突變蛋白用於與綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)形成複合物的用途。
因此，在本揭示內容的另一個態樣中，公開的突變蛋白用於檢測綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)。此類用途可以包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與懷疑含有綠膿桿菌螢光素的樣品接觸，從而允許形成突變蛋白和綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)之間的複合物，並且藉由合適的信號檢測複合物。
可檢測信號可以藉由如上文解釋的標記物，或者藉由由於結合(即複合物形成)自身所致的物理特性的變化引起。一個例子是表面等離振子共振，其數值在結合配偶體的結合期間變化，來自所述結合配偶體的一個在表面如金箔上固定化。
本文中公開的綠膿桿菌螢光素結合突變蛋白也可以用於分離綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)。此類用途可以包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與假設含有綠膿桿菌螢光素(I、II和/或III型)的樣品接觸，從而允許形成突變蛋白和綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)之間的複合物，並且分開複合物與樣品。
在揭示的突變蛋白用於檢測綠膿桿菌螢光素以及分開綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)的用途中，可以在合適的固相上固定化突變蛋白和/或綠膿桿菌螢光素或其域或片段。
在又一個態樣中，本揭示內容特徵在於診斷或分析套組，其包含根據公開內容的綠膿桿菌螢光素結合突變蛋白。
在其在診斷學中的用途外，在又一個態樣，本揭示內容涵蓋公開內容的綠膿桿菌螢光素結合突變蛋白或包含此類突變蛋白的組合物用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)和/或抑制或減輕受試者中的銅綠假單胞菌生長的用途。
在又一個態樣中，本揭示內容特徵在於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)的方法，所述方法包括對所述受試者投予有效量的公開內容的一種或多種綠膿桿菌螢光素結合突變蛋白或包含此類突變蛋白的一種或多種組合物。
在又一個態樣中，本揭示內容牽涉用於抑制或減輕受試者中的銅綠假單胞菌的生長的方法，所述方法包括對所述受試者投予有效量的公開內容的一種或多種綠膿桿菌螢光素結合突變蛋白或包含此類突變蛋白的一種或多種組合物。
c)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的hNGAL突變蛋白
在一個態樣中，本公開內容涉及hNGAL突變蛋白，其以約20nM或更低，如1nM或更低的KD結合與鐵複合的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實例6中描述的測定法中藉由Biacore T200儀測量時。
在又一些別的具體實例中，本公開內容的一個或多個hNGAL突變蛋白能夠以藉由約500nM或更低的IC50值測量的親和力結合具有複合鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實例5中描述的ELISA測定法中測量時。
在又一些別的具體實例中，本公開內容的一個或多個hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合沒有複合鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實例5中描述的ELISA測定法中測量時。
在又一些別的具體實例中，本公開內容的一個或多個hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合 鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實例5中描述的ELISA測定法中測量時。
在一些具體實例中，突變蛋白能夠以約150nM或更低的IC50值抑制由綠膿桿菌螯鐵蛋白介導的鐵攝取，例如在基本上在實例7中描述的競爭ELISA形式中。
在一些具體實例中，突變蛋白能夠抑制Pvd I敲除(△pvdA)的細菌生長，例如在基本上在實例8中描述的測定法中。
在這點上，本揭示內容涉及多肽(例如如本文中提及的第四多肽)，其中所述多肽包含hNGAL突變蛋白或由hNGAL突變蛋白組成，並且所述hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含序列位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141處的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多個突變胺基酸殘基，並且其中所述多肽結合綠膿桿菌螯鐵蛋白。
在一些具體實例中，本揭示內容的綠膿桿菌螯鐵蛋白結合hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一處或多處包含以下突變胺基酸殘基中的一個或多個：Leu 36→His,Met或Val；Ala 40→Ile,Gln,Tyr或Phe；Ile 41→Leu,His或Trp；Gln 49→His,Arg,Ser或Ala；Tyr 52→Leu,Trp或Pro；Ser 68→Asp或His；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His,Ile,Ala,Ser或Gly；Lys 73→Asn,Met,Pro,Phe,Gln或Arg；Asp 77→Arg,Thr,Pro或Asp；Trp 79→Ala,Arg,Lys或Asp；Arg 81→Thr,Ile或Trp；Asn 96→ Met,Asn,Pro或Ala；Tyr 100→Gly,His或Glu；Leu 103→Gly,Met,His或Gln；Tyr 106→Met,Gly,Arg或Trp；Lys 125→Trp,Phe,Gly或Leu；Ser 127→Arg,Trp,Asp或Ile；Tyr 132→Ala,Glu或Thr；和Lys 134→Leu,Val,Asn或Phe。在一些具體實例中，公開內容的hNGAL突變蛋白包含成熟hNGAL的這些序列位置處的兩個或更多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多或所有突變胺基酸殘基。
另外，根據公開內容的綠膿桿菌螯鐵蛋白結合hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比還可以包含一個或多個或所有下述取代：Gln 28→His；Val 34→Leu；Glu 44→Gly；Asp 45→Gly；Lys→Arg或Tyr；Asn 65→Asp；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Val 108→Ala；Phe 123→Ser和Thr 141→Ala。
在一些別的具體實例中，本揭示內容之結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下胺基酸替換：(a)Gln 28→His；Ala 40→Ile；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Leu；Ser 68→His；Leu 70→Thr；Arg 72→Lys；Lys 73→Trp；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Lys 125→Trp；Ser 127→Asp；Tyr 132→Glu；Lys 134→Leu；(b)Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe； (c)Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；(d)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Ala；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Arg；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Pro；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Arg；Lys 125→Leu；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ala；Lys 134→Asn；(e)Gln 28→His；Val 34→Leu；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Thr 141→Ala；(f)Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；(g)Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp； Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；(h)Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Glu 44→Gly；Lys 46→Tyr；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Lys 74→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Val 108→Ala；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；或(i)Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe。
在殘留的區域(即與序列位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141不同的區域)中，本揭示內容的hNGAL突變蛋白可以包含在突變胺基酸序列位置外部的野生型(天然)胺基酸序列。
在別的具體的具體實例中，根據本揭示內容的突變蛋白包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：54-63或其片段或變體。
本揭示內容的綠膿桿菌螯鐵蛋白結合hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與選自由下列組成之群組的序列可以具有高序列同一性，如至少70%、至 少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性：SEQ ID NO：54-63。
本揭示內容還包括具有選自由下列組成之群組的胺基酸序列的hNGAL突變蛋白的結構同源物：SEQ ID NO：54-63，所述結構同源物相對於所述hNGAL突變蛋白具有超過約60%，特別是超過65%、超過70%、超過75%、超過80%、超過85%、超過90%、超過92%並且最特別地超過95%的胺基酸序列同源性或序列同一性。
可以依靠人脂籠蛋白2的天然存在形式的誘變獲得根據本揭示內容的綠膿桿菌螯鐵蛋白結合hNGAL突變蛋白。在誘變的一些具體實例中，取代(或替換)是保守取代。不過，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下述例示性取代的一個或多個)，只要突變蛋白保留其結合Pvd I型的能力，和/或它與然後取代的序列具有的同一性在於它與成熟人脂籠蛋白2的胺基酸序列(SWISS-PROT數據庫登錄號P80188)具有至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高的同一性。
d)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白的應用
因此，醫學中存在揭示內容的對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的突變蛋白的許多可能的應用。在一個別的態樣中，本揭示內容涉及本文中公開的此類突變蛋白用於檢測樣品中的綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途以及相應的診斷方法。
本揭示內容還牽涉如描述的一種或多種對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的突變蛋白用於與綠膿桿菌螯鐵蛋白形成複合物的用途。
因此，在本揭示內容的另一個態樣中，揭示的突變蛋白用於檢測綠膿桿菌螯鐵蛋白。此類用途可以包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與懷疑含有綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，從而允許形 成突變蛋白和綠膿桿菌螯鐵蛋白之間的複合物，並且藉由合適的信號檢測複合物。
可檢測信號可以藉由如上文解釋的標記物，或者藉由由於結合(即複合物形成)自身所致的物理特性的變化引起。一個例子是表面等離振子共振，其數值在結合配偶體的結合期間變化，來自所述結合配偶體的一個在表面如金箔上固定化。
本文中揭示的突變蛋白也可以用於分離突變蛋白。此類用途可以包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與假設含有綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，從而允許形成突變蛋白和綠膿桿菌螯鐵蛋白之間的複合物，並且分開複合物與樣品。
在揭示的突變蛋白用於檢測綠膿桿菌螯鐵蛋白以及分開綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途中，可以在合適的固相上固定化突變蛋白和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白或其域或片段。
因而，可以測定分子，如綠膿桿菌螯鐵蛋白的存在或缺乏(例如在樣品中)以及其濃度或水平。
在又一個態樣中，本揭示內容特徵在於診斷或分析套組，其包含根據公開內容的對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的突變蛋白。
在其在診斷學中的用途外，在又一個態樣，本揭示內容涵蓋所揭示內容的此類突變蛋白或包含此類突變蛋白的組合物用於結合受試者中的綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或抑制或減輕受試者中的銅綠假單胞菌生長的用途。
在又一個態樣中，本揭示內容特徵在於結合受試者中的綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法，所述方法包括對所述受試者投予有效量的公開內容的一種或多種對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的突變蛋白或包含此類突變蛋白的一種或多種組合物。
在又一個態樣中，本揭示內容牽涉用於抑制或減輕受試者中的銅綠假單胞菌的生長的方法，所述方法包括對所述受試者投予有效量的揭示內容的一種或多種對綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合親和力的突變蛋白或包含此類突變蛋白的一種或多種組合物。
e)包含綠膿桿菌螢光素結合突變蛋白和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白結合突變蛋白的組合物和突變蛋白的組合
本揭示內容涵蓋(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途。此類用途包括對受試者投予有效量的(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽的步驟。本揭示內容還涵蓋(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽用於在受試者中防止或降低銅綠假單胞菌經由綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠膿桿菌螢光素的鐵攝取的用途。類似地，本揭示內容公開了(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽用於治療或減輕受試者中的銅綠假單胞菌感染和/或生物膜形成的用途。在一些別的 具體實例中，銅綠假單胞菌感染可以是急性或慢性感染。
可以組合投予第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽，包括同時、伴隨或連續。在一些具體實例中，可以在可投予的組合物中包含第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽。組合物可以包含與至少一種醫藥上可接受之佐劑、稀釋劑或載體聯合的有效量的作為活性成分的第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽。第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽也可以彼此獨立投予，包括在獨立的時間點時以單獨的時間間隔。
在一些具體實例中，如本揭示內容中使用的對綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)特異性的突變蛋白能夠例如以可檢測的親和力，即以約200nM或更低，或約100nM或更低，或約50nM或更低，或約25nM或更低，或約15nM或更低的解離常數結合綠膿桿菌螢光素(分別為I、II或III型)。在一些具體實例中，如本揭示內容中使用的對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白能夠例如以可檢測的親和力，即以約200nM或更低，或約100nM或更低，或約50nM或更低，或約25nM或更低，或約15nM或更低的解離常數結合綠膿桿菌螯鐵蛋白。在一些別的優選的具體實例中，根據公開內容的組合的突變蛋白以約10nM或更低，或約1nM或更低，或約0.1nM或更低，或約10pM或更低的對綠膿桿菌螢光素(分別為I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白的解離常數分別結合綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白。因此，本揭示內容提供(i)結合綠膿桿菌螢光素I型(Pvd I s、sa、αKG+/-Fe)的hNGAL突變蛋白，(ii)結合綠膿桿菌螢光素II型(Pvd II s、sa、αKG+/-Fe)的hNGAL突變蛋白，(iii)結合綠膿桿菌螢光素III型(Pvd III s、sa、αKG+/-Fe)的hNGAL突變蛋白和/或(iv)結合綠膿桿菌螯鐵蛋白(Pch+/-Fe)的hNGAL突變蛋白的組合。
關於結合綠膿桿菌螢光素的hNGAL突變蛋白的更多詳情可以參見本揭示內容的上述部分a)。
在一個具體的具體實例中，在SEQ ID NO：2-18中的任一者中顯示了對綠膿桿菌螢光素I型特異性的突變蛋白。在一個具體的具體實例中，在SEQ ID NO：19-37中的任一者中顯示了對綠膿桿菌螢光素II型特異性的突變蛋白。在一個具體的具體實例中，在SEQ ID NO：38-53中的任一者中顯示了對綠膿桿菌螢光素III型特異性的突變蛋白。
結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白的更多詳情已經公開於本揭示內容的上述部分c)中。
在一個具體的具體實例中，在SEQ ID NO：54-63中的任一者中顯示了對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白。
本揭示內容還涉及包含下列至少一種的組合物：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽，所述組合物可以用於結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法中。
本揭示內容涉及第一突變蛋白或其多肽或組合物、第二突變蛋白或其多肽或組合物、第三突變蛋白或其多肽或組合物、和/或第四突變蛋白或其多肽或組合物的組合。這些突變蛋白之一能結合作為給定的非天然靶物的綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)，例如以可檢測的親和力。這些突變蛋白之一能結合作為給定的非天然靶物的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如以可檢測的親和力。因此，相應的突變蛋白分別結合作為給定的非天然靶物的綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白。術語“非天然靶物”指在生理學 條件下不結合相應的脂籠蛋白(野生型hNGAL)的化合物。例如，第一突變蛋白或其多肽或組合物可以結合一類綠膿桿菌螢光素(I、II或III型)或綠膿桿菌螯鐵蛋白，並且第二、第三或第四突變蛋白或其多肽或組合物可以分別結合綠膿桿菌螯鐵蛋白或另一類綠膿桿菌螢光素，或者反之亦然。可以以各種形式和取向提供第一、第二、第三和/或第四突變蛋白或其多肽或組合物的組合。
在又一個態樣中，本揭示內容特徵在於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法，所述方法包括對所述受試者投予有效量的包含下列至少一種的組合物：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的突變蛋白或其多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白或其多肽。在一些具體實例中，此類組合物包含(i)-(iv)的兩種或更多種，例如三種或甚至全部。
在又一個態樣中，本揭示內容牽涉用於抑制或減輕受試者中的銅綠假單胞菌的生長的方法，所述方法包括對所述受試者投予有效量的包含下列至少一種的組合物：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的突變蛋白或其多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白或其多肽。在一些具體實例中，此類組合物包含(i)-(iv)的兩種或更多種，例如三種或甚至全部。
本揭示內容還牽涉(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或其多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或其多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或其多肽，和/或(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或其多肽用於與綠膿桿菌螢光素I、II、 III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白形成複合物的用途。
因此，在本揭示內容的另一個態樣中，揭示的突變蛋白或多肽可以用於檢測綠膿桿菌螢光素和綠膿桿菌螯鐵蛋白。此類用途可以包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白或多肽與懷疑含有綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，從而分別允許形成突變蛋白或多肽和綠膿桿菌螢光素之間和/或突變蛋白和綠膿桿菌螯鐵蛋白之間的複合物，並且藉由合適的信號檢測複合物。
可檢測信號可以藉由如上文解釋的標記物，或者藉由由於結合(即複合物形成)自身所致的物理特性的變化引起。一個例子是表面等離振子共振，其數值在結合配偶體的結合期間變化，來自所述結合配偶體的一個在表面如金箔上固定化。
本文中揭示的突變蛋白或多肽也可以用於分離綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白。此類用途可以包括下述步驟：在合適的條件下使一種或多種所述突變蛋白與假設含有綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，由此分別允許形成突變蛋白和綠膿桿菌螢光素之間和/或突變蛋白和綠膿桿菌螯鐵蛋白之間的複合物，並且分開複合物與樣品。
在揭示的突變蛋白或多肽用於檢測綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白以及分開綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途中，可以在合適的固相上固定化突變蛋白和/或綠膿桿菌螢光素和綠膿桿菌螯鐵蛋白或其域或片段。
因而，可以測定綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋的存在或缺乏(例如在樣品中)以及其濃度或水平。
在另一個態樣中，本揭示內容提供成套套組。套組在一個或多個容器中分開或在混合物中包含對綠膿桿菌螢光素I型特異性的突變蛋白或多肽 或其組合物、對綠膿桿菌螢光素II型特異性的突變蛋白或多肽或其組合物、對綠膿桿菌螢光素III型特異性的突變蛋白或多肽或其組合物、和/或對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的突變蛋白或多肽或其組合物。在一些別的優選的具體實例中，套組包括包含對綠膿桿菌螢光素I型特異性的第一突變蛋白或多肽或其組合物的第一容器、包含對綠膿桿菌螢光素II型特異性的第二突變蛋白或多肽或其組合物的第二容器、包含對綠膿桿菌螢光素III型特異性的第三突變蛋白或多肽或其組合物的第三容器、和/或包含對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的第四突變蛋白或多肽或其組合物的第四容器。在一些具體實例中，套組進一步以與其整合方式或作為一個或多個分開的文件包含屬內容物或套組和突變蛋白或其多肽的用途的信息。在一些具體實例中，套組可以包含一種或多種組合物，所述組合物配製用於在稀釋劑中重建。此類稀釋劑(例如無菌稀釋劑)也可以包含在套組中，例如在容器內。
f)hNGAL突變蛋白及其變體和片段
當同與另一種脂籠蛋白的序列同一性比較時，根據本揭示內容的突變蛋白的胺基酸序列與人脂籠蛋白2具有高序列同一性(還可參見上文)。在此一般語境中，根據公開內容的組合的突變蛋白的胺基酸序列與相應的脂籠蛋白(野生型hNGAL)的胺基酸序列是至少基本上相似的。根據本揭示內容的組合的突變蛋白的相應序列與成熟的hNGAL的序列是基本上相似的，如與成熟的hNGAL的序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性。在這點上，比較而言，本揭示內容的突變蛋白當然可以含有如本文中描述的取代，其使突變蛋白能夠分別結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白。通常，相對於hNGAL的天然序列，hNGAL的突變蛋白在hNGAL的配體結合位點的開放末端處的四個環中包含一個或多個胺基 酸突變。如上文解釋，這些區域在確定突變蛋白對綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的結合特異性方面是必需的。突變蛋白衍生的hNGAL或其同源物在N端區中和/或在β-桶結構末端排列的三個肽環BC、DE、和FG中的任何序列位置處可以具有1、2、3、4或更多個突變胺基酸殘基，所述β-桶結構位於與天然結合袋相對。
與相應的天然hNGAL相比，根據本揭示內容的突變蛋白包含一個或多個，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或甚至20個取代，只要此類突變蛋白應當能夠分別結合綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白。例如，突變蛋白可以在與hNGAL的獨特位置對應的位置處(即在相應位置處)具有取代。在一些具體實例中，根據本揭示內容的組合的突變蛋白包含至少兩個胺基酸取代，包括2、3、4、5、或甚至更多個由精胺酸殘基對天然胺基酸的胺基酸取代。因而，以產生能夠分別結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的突變蛋白為目的，對如本文中描述的蛋白質“參照”支架的核酸進行誘變。
還有，本文中公開的突變蛋白可以包含在其N或C端，特別是在其C端的異源胺基酸序列，如Strep-tag®，例如Strep-tag® II，而不影響突變蛋白的生物學活性(分別結合其靶物，例如綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白)。
具體地，為了測定與野生型hNGAL不同的突變蛋白的胺基酸序列的胺基酸殘基是否對應於野生型hNGAL的胺基酸序列中的某個位置，熟練技術人員可以手動或藉由使用計算機程序，如BLAST2.0(其代表基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)或ClustalW或適合於產生序列比對的任何其它合適的程序使用本領域中公知的手段和方法，例如比對。因而，野生型hNGAL可以充當“主題序列”或“參照序列”，而與本文中 描述的野生型hNGAL不同的突變蛋白的胺基酸序列充當“查詢序列”。術語“參照序列”和“野生型序列”在本文中可互換使用。
在一些具體實例中，取代(或替換)是保守取代。不過，涵蓋任何取代(包括非保守取代或來自下文列出的例示性取代的一個或多個)，只要突變蛋白保留其分別結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的能力，和/或它與然後取代的序列具有的同一性在於它與“初始”序列是至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%相同或更高。
保守取代一般是根據要突變的胺基酸列出的以下取代，所述胺基酸後面各有一個或多個可以認為保守的替換：Ala→Gly,Ser,Val；Arg→Lys；Asn→Gln,His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg,Asn,Gln；Ile→Leu,Val；Leu→Ile,Val；Lys→Arg,Gln,Glu；Met→Leu,Tyr,Ile；Phe→Met,Leu,Tyr；Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp,Phe；Val→Ile,Leu。其它取代也是可允許的，並且可以憑經驗或者與其它已知的保守或非保守取代一致確定。作為進一步的方向，以下八組各含有通常可以認為為限定彼此的保守取代的胺基酸：a.丙胺酸(Ala)，甘胺酸(Gly)；b.天冬胺酸(Asp)，谷胺酸(Glu)；c.天冬醯胺(Asn)，穀氨醯胺(Gln)；d.精胺酸(Arg)，賴胺酸(Lys)；e.異亮胺酸(Ile)，亮胺酸(Leu)，甲硫胺酸(Met)，纈胺酸(Val)；f.苯丙胺酸(Phe)，酪胺酸(Tyr)，色胺酸(Trp)；g.絲胺酸(Ser)，蘇胺酸(Thr)；和 h.半胱胺酸(Cys)，甲硫胺酸(Met)
若此類取代導致生物學活性的變化，則可以引入更多的實質性變化，如下列各項，或者如下文參照胺基酸類進一步描述的，並且對產物篩選期望的特徵。此類更多的實質性變化的例子是：Ala→Leu,Ile；Arg→Gln；Asn→Asp,Lys,Arg,His；Asp→Asn；Cys→Ala；Gln→Glu；Glu→Gln；His→Lys；Ile→Met,Ala,Phe；Leu→Ala,Met，正亮胺酸；Lys→Asn；Met→Phe；Phe→Val,Ile,Ala；Trp→Phe；Tyr→Thr,Ser；Val→Met,Phe,Ala。
藉由選擇取代實現hNGAL的生物學特性的實質性修飾，所述取代在其對維持下列各項的影響上顯著不同：(a)取代區域中的多肽主鏈的結構，例如如片層或螺旋構象，(b)靶位點處的分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積。基於共同的側鏈特性，將天然存在的殘基分成組：(1)疏水性：正亮胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸；(2)中性親水性：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；(3)酸性：天冬胺酸、谷胺酸；(4)鹼性：天冬醯胺、穀氨醯胺、組胺酸、賴胺酸、精胺酸；(5)影響鏈取向的殘基：甘胺酸、脯胺酸；和(6)芳香族：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。
非保守取代將引起用這些類之一的成員交換另一類。不參與維持hNGAL的正確構象的任何半胱胺酸殘基一般也可以用絲胺酸取代以改善分子的氧化穩定性，並且防止異常交聯。相反，可以添加半胱胺酸間以改善其穩定性。
可以使用建立的標準方法在核酸，例如DNA水平上非常容易地實現任何突變，包括如上文討論的插入。胺基酸序列的變化的例示性例子是插入或缺失或胺基酸取代。此類取代可以是保守的，即胺基酸殘基用化學相似特性(特別就極性及大小而言)的胺基酸殘基替換。保守取代的例子是下 組的成員間的替換：1)丙胺酸、絲胺酸、和蘇胺酸；2)天冬胺酸和谷胺酸；3)天冬醯胺和穀氨醯胺；4)精胺酸和賴胺酸；5)異亮胺酸、亮胺酸、甲硫胺酸、和纈胺酸；和6)苯丙胺酸、酪胺酸、和色胺酸。另一方面，也有可能在胺基酸序列中引入非保守變化。另外，代替替換單一胺基酸殘基，也有可能插入或缺失hNGAL的一級結構的一個或多個連續胺基酸，只要這些缺失或插入導致穩定折疊的/功能性突變蛋白。
胺基酸序列的修飾包括單一胺基酸位置的定向誘變以藉由摻入用於某些限制酶的切割位點來簡化突變hNGAL基因或其部分的亞選殖。另外，也可以摻入這些突變以進一步改善突變蛋白對給定靶物，如綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的親和力。此外，可以引入突變以調控突變蛋白的某些特徵，如改善折疊穩定性、血清穩定性、蛋白質抗性或水溶解度或者降低聚集趨勢(若必要的話)。例如，可以將天然存在的半胱胺酸殘基突變為其它胺基酸以防止二硫化物橋形成。還有可能有意突變其它胺基酸序列位置為半胱胺酸以引入新的反應性基團，例如用於與其它化合物，如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、生物素、肽或蛋白質接合，或者用於形成非天然存在的二硫化物連接。可以使用產生的硫醇模塊來使突變蛋白PEG化或HES化，例如以延長相應的突變蛋白的血清半衰期。
還有可能突變其它胺基酸序列位置為半胱胺酸以引入新的反應性基團，例如用於與其它化合物，如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、生物素、肽或蛋白質接合，或者用於形成非天然存在的二硫化物連接。
在一些具體實例中，若將上述模塊之一與公開內容的突變蛋白接合，則與胺基酸側鏈的接合可以是有利的。合適的胺基酸側鏈可以在hNGAL的胺基酸序列中天然發生或者可以藉由誘變引入。若經由誘變引入合適的結合位點，則一種可能性是合適位置處的胺基酸被半胱胺酸殘基替 換。
就人脂籠蛋白2的突變蛋白而言，此類突變的例示性可能性將半胱胺酸殘基引入脂籠蛋白，包括人脂籠蛋白2突變蛋白的胺基酸序列中以包括至少在與人NGAL的野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158對應的序列位置之一處引入半胱胺酸(Cys)殘基。在一些具體實例中，其中本揭示內容的人脂籠蛋白2突變蛋白具有與SWISS-PROT/UniProt數據庫登錄號P80188的序列相比半胱胺酸已經被另一個胺基酸殘基替換的序列，可以將相應的半胱胺酸再引入序列中。作為一個說明性的例子，可在此類情況中藉由恢復為如最初存在於SWISS-PROT登錄No P80188的序列中的半胱胺酸而引入胺基酸位置87處的半胱胺酸殘基。可使用胺基酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146和/或158中任一個的側面產生的硫醇模塊來使突變蛋白PEG化或HES化，例如以延長相應的人脂籠蛋白2突變蛋白的血清半衰期。
在另一個具體實例中，為了提供適合於接合上述化合物之一與根據本揭示內容的突變蛋白的胺基酸側鏈，可以藉由誘變引入人工胺基酸。一般地，此類人工胺基酸設計為更具反應性，並且因此促進與期望的化合物的接合。可以經由人工tRNA引入的此類人工胺基酸的一個例子是對-乙醯基-苯丙胺酸。
對於本文中揭示的突變蛋白的幾種應用，有利的是以融合蛋白形式使用它們。在一些具體實例中，將公開內容的突變蛋白在其N端或其C端與蛋白質、蛋白質域或肽，例如信號序列和/或親和標簽融合，如本文中與本發明的融合分子相關的描述。本揭示內容的突變蛋白也可以與延長突變蛋白的血清半衰期的模塊接合，如本文中與本發明的融合分子相關的描述。本揭示內容的突變蛋白也可以與藥學活性劑接合/融合，如本文中與本發明 的融合分子相關的描述。
一般地，通常用於抗體的所有標記物(除了那些僅與免疫球蛋白的Fc部分的糖模塊一起使用的標記物外)也可以用於與公開內容的突變蛋白接合。公開內容的突變蛋白也可以與任何合適的治療活性劑接合，例如用於將此類藥劑靶向遞送到給定的細胞、組織或器官或者用於選擇性靶向細胞，例如腫瘤細胞而不影響周圍的正常細胞。此類治療活性劑的例子包括放射性核素、毒素、小有機分子、和治療肽(如充當細胞表面受體的激動劑/拮抗劑的肽或競爭給定細胞靶物上的蛋白質結合位點的肽)。然而，公開內容的突變蛋白也可以與治療活性核酸，如反義核酸分子、小干擾RNA、微小RNA或核酶接合。可以藉由本領域中公知的方法生成此類接合物。
另外，本文中揭示的突變蛋白可以與模塊融合，所述模塊可以對公開內容的突變蛋白賦予新的特徵，如酶促活性或對其它分子的結合親和力。合適的融合配偶體的例子是鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、蛋白G的清蛋白結合域、蛋白A、抗體片段、寡聚化域或毒素。
特別地，可以有可能融合本文中揭示的突變蛋白與分開的酶活性位點，使得所得的融合蛋白的兩個“組分”一起作用於給定的治療靶物。突變蛋白的結合域附接於致病性靶物，這允許酶域消除靶物的生物學功能。
在公開內容的一個具體實例中，方法包括使核酸分子在核苷酸三聯體處進行誘變，所述核苷酸三聯體編碼與人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145對應的序列位置的至少一個，或甚至更多個。
本揭示內容還包括編碼所揭示內容的突變蛋白的核酸分子，其包含在實驗誘變的指定序列位置外部的額外突變。此類突變經常是容許的或者 可以證明是有利的，例如在它們促成突變蛋白的改善的折疊效率、血清穩定性、熱穩定性或配體結合親和力的情況下。
如本文中結合揭示內容的突變蛋白使用的，術語“片段”指N端和/或C端縮短，即缺乏至少一個N端和/或C端胺基酸的源自全長成熟人脂籠蛋白2的蛋白質或肽。此類片段可以包括成熟人脂籠蛋白2的一級序列的至少10，更多，如20或30或更多個連續胺基酸，並且在成熟人脂籠蛋白2的免疫測定法中通常可檢出。一般地，如本文中就揭示內容的突變蛋白的相應蛋白質配體或根據揭示內容的組合的相應蛋白質配體或本文中描述的融合蛋白的相應蛋白質配體而言使用的，術語“片段”指N端和/或C端縮短的蛋白質或肽配體，其保留全長配體被根據本揭示內容的突變蛋白識別和/或結合的能力。
如本文中使用的，術語“誘變”意指實驗條件選擇為使得成熟人脂籠蛋白2的給定序列位置處天然存在的胺基酸可以由至少一種不存在於相應天然多肽序列中的此特定位置處的胺基酸替換。術語“誘變”還包括藉由缺失或插入一個或多個胺基酸所致的序列區段長度的(額外)修飾。因此，在揭示內容的範圍內的是例如選定序列位置處的一個胺基酸由三個隨機突變的區段替換，導致與野生型蛋白質的相應區段的長度相比兩個胺基酸殘基的插入。可以在能進行公開內容中的誘變的任何肽區段中彼此獨立引入此類插入或缺失。
術語“隨機誘變”意指某個序列位置處不存在預先確定的單個胺基酸(突變)，而是可以在誘變期間在預先確定的序列位置處以某種概率摻入至少兩個胺基酸。
“同一性”是測量序列的相似性或關係的序列特性。如本揭示內容中使用的，術語“序列同一性”或“同一性”意指成對相同殘基(公開內容的多肽的 序列與所討論的序列的(同源)比對後)相對於這兩個序列中的較長者中的殘基數目的百分比。藉由用相同胺基酸殘基的數目除以殘基的總數，並且將結果乘以100測量序列同一性。
術語“同源性”在本文中以其通常的意義使用，包括相同胺基酸及在公開內容的多肽(例如本揭示內容的任何突變蛋白)的線性胺基酸序列中的等同位置處視為保守取代(例如用天冬胺酸殘基替換谷胺酸殘基)的胺基酸。
在本文中可以例如使用程序BLASTP，版本blastp 2.2.5(2002年11月16日；參見Altschul,S.F.等(1997)Nucl.AcidsRes.25,3389-3402)測定序列同源性或序列同一性的百分比。在此具體實例中，同源性百分比基於比對整個多肽序列(矩陣：BLOSUM 62；缺口代價：11.1；截留值設置為10-3)，包括前肽序列，優選在逐對比較中使用野生型蛋白質支架作為參照。它以BLASTP程序輸出中作為結果指示的“正”(同源胺基酸)數目除以由比對程序選擇的胺基酸總數的百分比計算。
具體地，為了確定與野生型人脂籠蛋白2不同的突變蛋白的胺基酸序列的胺基酸殘基是否對應於野生型人脂籠蛋白2的胺基酸序列中的某個位置，熟練技術人員可以手動或藉由使用計算機程序，如BLAST2.0(其代表基本局部比對搜索工具)或ClustalW或適合於產生序列比對的任何其它合適的程序使用本領域中公知的手段和方法，例如比對。因而，野生型人脂籠蛋白2可以充當“主題序列”或“參照序列”，而與本文中描述的野生型人脂籠蛋白2不同的突變蛋白的胺基酸序列充當“查詢序列”。術語“參照序列”和“野生型序列”在本文中可互換使用。
“缺口”是作為胺基酸添加或缺失的結果的比對中的空格。因此，完全相同的序列的兩個拷貝具有100%同一性，但是不太高度保守，並且具有缺失、添加或替換的序列可以具有較低程度的序列同一性。本領域技術人員 會認可幾種計算機程序可用於使用標準參數測定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402)，Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215,403-410)和Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147,195-197)。
如本揭示內容中使用的，術語“變體”指包含胺基酸序列的修飾(例如藉由取代、缺失、插入或化學修飾)的蛋白質或肽的衍生物。在一些具體實例中，此類修飾不降低蛋白質或肽的功能性。此類變體包括蛋白質，其中一個或多個胺基酸已經藉由其相應的D-立體異構體或藉由除了天然存在的20種胺基酸外的胺基酸，如例如鳥胺酸、羥脯胺酸、瓜胺酸、高絲胺酸、羥賴胺酸、正纈胺酸替換。然而，此類取代也可以是保守的，即胺基酸殘基用化學類似的胺基酸殘基替換。保守取代的例子是下組的成員間的替換：1)丙胺酸、絲胺酸和蘇胺酸；2)天冬胺酸和谷胺酸；3)天冬醯胺和穀氨醯胺；4)精胺酸和賴胺酸；5)異亮胺酸、亮胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸；和6)苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸。
“天然序列”人脂籠蛋白2意指與源自自然的相應多肽具有相同胺基酸序列的人脂籠蛋白2。因此，天然序列人脂籠蛋白2可以具有相應的天然存在的人脂籠蛋白2的胺基酸序列。此類天然序列多肽可以從自然界中分離或者可以藉由重組或合成手段生成。術語“天然序列”多肽明確涵蓋人脂籠蛋白2的天然存在的截短或分泌形式，人脂籠蛋白2的天然存在的變體形式，如可替換的剪接形式和天然存在的等位變體。多肽“變體”意指與天然序列多肽具有至少約50%、60%、70%、80%或至少約85%胺基酸序列同一性的生物學活性多肽。此類變體包括例如下述多肽，其中在多肽的N或C端添加或缺失一個或多個胺基酸殘基。一般地，變體與天然序列多肽具有至少約70%，包括至少約80%，如至少約85%胺基酸序列同一性，包括至少 約90%胺基酸序列同一性或至少約95%胺基酸序列同一性。
術語“位置”在根據本揭示內容使用時意指本文中描述的胺基酸序列內的胺基酸的位置或本文中描述的核酸序列內的核苷酸的位置。為了理解如本文中在一種或多種突變蛋白的胺基酸序列位置的上下文中使用的術語“對應”，對應位置不僅由前述核苷酸/胺基酸的編號確定。因而，可以取代的根據公開內容的給定胺基酸的位置可以由於(突變體或野生型)人脂籠蛋白2中別處的胺基酸缺失或添加而有所變化。類似地，可以取代的根據本揭示內容的給定核苷酸的位置可以由於突變蛋白或野生型人脂籠蛋白2 5’-非轉譯區(UTR)中別處的缺失或額外的核苷酸而有所變化，所述5’-非轉譯區(UTR)包括啟動子和/或任何其它調節序列或基因(包括外顯子和內含子)。
因此，對於根據本揭示內容的相應位置，優選地應當理解核苷酸/胺基酸的位置可以在指定的編號上不同於類似的相鄰核苷酸/胺基酸，但是一個或多個相應的位置也包括所述相鄰的核苷酸/胺基酸(其可以被交換、缺失或添加)。
另外，對於基於根據本揭示內容的參照支架的突變蛋白中的相應位置，優選理解的是核苷酸/胺基酸的位置在結構上對應於突變蛋白或野生型人脂籠蛋白2中別處的位置，即使它們可以在指定的編號上不同。
g)涉及hNGAL突變蛋白和包含它們的多肽(例如用於本發明的融合分子)的具體具體實例
1.一種對綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白具有結合特異性的多肽，其中所述多肽包含例如以可檢測的親和力結合綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白。
2.具體實例1的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白包含成熟hNGAL的 線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145對應的一個或多個位置處的突變胺基酸殘基。
3.具體實例1的多肽，其中所述突變蛋白能夠以約20nM或更低的KD結合與鐵複合的綠膿桿菌螢光素I型，例如在基本上在實例6中描述的測定法中藉由Biacore T200儀測量時。
4.具體實例1的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的Pvd I型琥珀醯基、Pvd I型琥珀酸醯胺基和Pvd I型α-酮戊二醯基，例如在基本上在實例5中描述的ELISA測定法中測量時。
5.具體實例3的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM或更低的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素I型介導的鐵攝取。
6.具體實例3的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實例8中描述的測定法中抑制Pvd I菌株的細菌生長。
7.根據前述具體實例3至6中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136對應的一個或多個位置處包含突變胺基酸殘基。
8.具體實例3-7中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下突變胺基酸殘基中的至少一個：Leu 36→Asn,Thr,Val,Trp或Phe；Ala 40→Gly,Asn,Thr或 Phe；Ile 41→Arg,Ala,Thr,Phe或Trp；Gln 49→Ile,Leu,Val,Ala或Pro；Tyr 52→Met,Trp或Pro；Ser 68→Asp,Val或Glu；Leu 70→Gln,Trp,Asp或Thr；Arg 72→Trp,Ala,Ser,Leu,Pro或Glu；Lys 73→Asp,Leu,Ala,Glu或Asn；Asp 77→Arg,Leu,Tyr,Ser,Gln,Thr,Ile或Asn；Trp 79→Gln,Asp,Ser,Arg,Met或Glu；Arg 81→Gln,Gly,Ile,Glu,His或Asp；Asn 96→His,Ile,Gly,Tyr或Asp；Tyr 100→Lys,Glu,Asn,Ser,Phe或Tyr；Leu 103→Lys,Pro,Gln,His,Asp,Tyr,Glu,Trp或Asn；Tyr 106→His,Gln或Phe；Lys 125→Arg,Ser,Trp,Tyr,Val或Gly；Ser 127→Trp,Asn,Ala,Thr,Tyr,His,Ile,Val或Asp；Tyr 132→Trp,Asn,Gly或Lys；和Lys 134→Asn,His,Trp,Gly,Gln或Asp。
9.具體實例3-8中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下取代：Gln 28→His；Lys 46→Glu；Thr 54→Val或Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp或Gln；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser或Asn；和Thr 136→Ala。
10.根據前述具體實例3-8中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白在成熟人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個突變胺基酸殘基。
11.根據前述具體實例3-10中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含胺基酸取代的以下組之一：(a)Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Gln；Arg 72→Trp；Lys 73→Asp；Asp 77→Leu；Trp 79→Gln；Arg 81→Gln；Cys 87→Ser；Asn 96→His；Tyr 100→Lys；Leu 103→His；Tyr 106→His；Lys 125→Arg；Ser 127→Trp；Tyr 132→Trp；Lys 134→Asp；(b)Gln 28→His；Leu 36→Thr；Ala 40→Gly；Ile 41→Phe；Gln 49→Leu；Tyr 52→Trp；Leu 70→Trp；Arg 72→Ala；Lys 73→Leu；Asp 77→Tyr；Trp 79→Asp；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Glu；Leu 103→His；Tyr 106→Gln；Lys 125→Trp；Ser 127→Asn；Tyr 132→Asn；Lys 134→Gln；(c)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Lys；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ala；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(d)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Asn；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Met；Ser 68→Asp；Leu 70→Thr；Arg 72→Glu；Lys 73→Ala；Asp 77→Arg；Trp 79→Arg；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Tyr 100→Lys；Leu 103→Pro；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ser；Ser 127→Thr；Tyr 132→Trp；Lys 134→Gly；(e)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Phe；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His； (f)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Phe；Ile 41→Phe；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Trp；Arg 72→Leu；Lys 73→Asn；Asp 77→Gln；Trp 79→Glu；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Leu 103→Tyr；Tyr 106→His；Lys 125→Val；Ser 127→His；Tyr 132→Lys；Lys 134→Trp；(g)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(h)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Asp；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Val；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(i)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Thr；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Asn；Leu 103→Glu；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Asp；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(j)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Val；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser； Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Asn；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Val；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(k)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；(l)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；(m)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；(n)Leu 36→Trp；Asn 39→Asp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→ Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；(o)Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Ala；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；(p)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；或(q)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Gln；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His。
12.根據具體實例3-11中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：2-18或其片段或變 體。
13.具體實例1的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠以約20nM或更低的KD結合與鐵複合的綠膿桿菌螢光素II型，例如在基本上在實例6中描述的測定法中藉由Biacore T200儀測量時。
14.具體實例1的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的Pvd II型琥珀醯基、Pvd II型琥珀酸醯胺基和Pvd II型α-酮戊二醯基，例如在基本上在實例5中描述的ELISA測定法中測量時。
15.具體實例13的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM或更低的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素II型介導的鐵攝取。
16.具體實例13的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實例8中描述的測定法中抑制Pvd II菌株的細菌生長。
17.具體實例13的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實例9中描述的測定法中抑制表現綠膿桿菌螢光素II型的銅綠假單胞菌菌株的生長。
18.根據前述具體實例13至17中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134對應的一個或多個位置處包含突變胺基酸殘基。
19.具體實例13-18中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下突變胺基酸殘基中的至少一個：Leu 36→Asn,Ile或Val；Ala 40→Glu,Gly,Asn,Thr或 His；Ile 41→Arg,Val或Thr；Gln 49→Gly,Ala或Pro；Tyr 52→Asn,Gly,Trp或Pro；Ser 68→Asp,Arg或Glu；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His,Ile,Ala,Ser或Gly；Lys 73→Asn,Met,Pro,Phe,Gln或Arg；Asp 77→His,Ile,Met,Lys,Gly或Asn；Trp 79→Ser,Tyr,Ala,Asp,Phe或Trp；Arg 81→Glu,Ser,Tyr或Asp；Asn 96→Met,Ile,Arg,Asp,Lys,Asn或Ala；Tyr 100→Lys,Glu,Asn,Ser,Phe或Tyr；Leu 103→Thr,Ile,Gln,Gly,Met,His,Trp或Val；Tyr 106→Met,Gln,Ala,Ile,Asn,Gly,Met或Phe；Lys 125→Ala,Ile或Asn；Ser 127→Lys,Arg,Ser,Met,Asp或Asn；Tyr 132→Met,Phe,Asn,Ala,Ile,Gly或Val；和Lys 134→Trp或Tyr。
20.具體實例13-19中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下取代：Gln 28→His；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp或Gln和Cys 87→Ser。
21.根據前述具體實例13-20中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白在成熟人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個突變胺基酸殘基。
22.根據前述具體實例13-21中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白與天然野生型hNGAL的線性多肽序列相比包含胺基酸取代的以下組之一：(a)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→ Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；(b)Gln 28→His；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Met；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Met；Lys 134→Trp；(c)Gln 28→His；Leu 36→Ile；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Pro；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gly；Tyr 106→Ala；Lys 125→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；(d)Gln 28→His；Ala 40→Asn；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ser；Lys 73→Gln；Asp 77→Met；Trp 79→Ala；Arg 81→Tyr；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Pro；Leu 103→Thr；Tyr 106→Ile；Lys 125→Lys；Ser 127→Met；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(e)Gln 28→His；Ala 40→His；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Asp；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Asp；Leu 103→Met；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ala；Ser 127→Asp；Tyr 132→Asn；Lys 134→Trp；(f)Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Ser 68→Arg；Leu 70→Trp；Arg 72→Asn； Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Thr；Leu 103→Trp；Tyr 106→Asn；Lys 125→Asn；Ser 127→Met；Tyr 132→Ile；Lys 134→Tyr；(g)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gly；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→Gly；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Trp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Gly；Lys 125→Lys；Ser 127→Asn；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；(h)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；(i)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；(j)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ls；Tyr 100→His；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Ala；Lys 134→Trp；(k)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Gly；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；(l)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Phe；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Met；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；(m)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→Hs；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；(n)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；(o)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Gln；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；(p)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；(q)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；(r)Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；或(s)Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp。
23.根據具體實例13至22中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：19-37或其片段 或變體。
24.具體實例1的多肽，其中所述突變蛋白能夠以約20nM或更低的KD結合與鐵複合的綠膿桿菌螢光素III型，例如在基本上在實例6中描述的測定法中藉由Biacore T200儀測量時。
25.具體實例1的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的Pvd III型琥珀醯基、Pvd III型琥珀酸醯胺基和Pvd III型α-酮戊二醯基，例如在基本上在實例5中描述的測定法中測量時。
26.具體實例24的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM或更低的IC50值抑制由綠膿桿菌螢光素III型介導的鐵攝取。
27.具體實例24的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實例8中描述的測定法中抑制Pvd III菌株的細菌生長。
28.根據前述具體實例24至27中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、105-106、125、127、132、134和145對應的一個或多個位置處包含突變胺基酸殘基。
29.具體實例24-28中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下突變胺基酸殘基中的至少一個：Leu 36→Phe或Glu；Ala 40→Trp,Leu或Arg；Ile 41→Met,Arg,Ala,Leu或Trp；Gln 49→His,Ile,Arg,Lys,Met或Pro；Tyr 52→Asn,Tyr,Arg,Ser或Met；Ser 68→Asp,Asn,Glu或Gln；Leu 70→Lys,Asn或Arg；Arg 72→Leu,Arg,Gln或Tyr；Lys 73→His,Leu,Ala,Pro,Gln或 Tyr；Asp 77→Ala,Ile,Lys,Gln或Arg；Trp 79→Ser或Asp；Arg 81→His,Ala,Ser或Val；Asn 96→Met,Ile,Arg,Gly,Leu或Val；Tyr 100→Ala,Ile,Asn,Pro或Asp；Leu 103→Gln,Gly,Phe或Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp或Thr；Ser 127→Val,His,Ile,Phe或Ala；Tyr 132→Phe；和Lys 134→Trp,Gln或Glu。
30.具體實例24-29中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下取代：Gln 28→His；Leu 42→Arg；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Asp 47→Asn；Asn 65→Asp；Cys 87→Ser；Ser 105→Pro和Thr 145→Pro。
31.根據前述具體實例24-30中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白在成熟人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28，36，40-42，45-47，49，52，65，68，70，72-73，77，79，81，87，96，100，103，105-106，125，127，132，134和145處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個突變胺基酸殘基。
32.根據前述具體實例24-31中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含胺基酸取代的以下組之一：(a)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Met；Gln 49→His；Tyr 52→Asn；Ser 68→Glu；Leu 70→Lys；Arg 72→Gln；Lys 73→Ala；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→His；Tyr 132→Phe；Lys 134→Gln；(b)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Arg；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Tyr；Ser 68→Gln；Leu 70→Asn；Arg 72→Trp；Lys 73→Leu；Asp 77→Ala；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Ile；Leu 103→Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Thr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；(c)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Leu；Ile 41→Leu；Gln 49→Arg；Tyr 52→Arg；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Leu；Lys 73→Tyr；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ala；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ala；Leu 103→Phe；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Ala；Lys 134→Glu；(d)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Pro；Asp 77→Arg；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Pro；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；(e)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Ala；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(f)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp； (g)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Thr；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Arg；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Val；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(h)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(i)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Tyr；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→-；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(j)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(k)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；(l)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(m)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；(n)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；(o)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp； Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；或(p)Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp。
33.根據前述具體實例24至32中任一項的多肽，其包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：38-53或其片段或變體。
34.具體實例1的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠以約20nM或更低的KD結合與鐵複合的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實例6中描述的測定法中藉由Biacore T200儀測量時。
35.具體實例1的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠以藉由約500nMI或更低的IC50值測量的親和力結合具有複合鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實例5中描述的測定法中測量時。
36.具體實例1的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合沒有複合鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實例5中描述的測定法中測量時。
37.具體實例1的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠以藉由約200nM或更低的IC50值測量的親和力結合具有和沒有複合鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白，例如在基本上在實例5中描述的測定法中測量時。
38.具體實例34的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實例7中描述的競爭ELISA形式中以約150nM或更低的IC50值抑制由綠膿桿菌螯鐵蛋白介導的鐵攝取。
39.具體實例34的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白能夠在基本上在實例8中描述的測定法中抑制Pvd I敲除(△pvdA)的細菌生長。
40.根據前述具體實例34至39中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141對應的一個或多個位置處包含突變胺基酸殘基。
41.具體實例34-40中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下突變胺基酸殘基中的至少一個：Leu 36→His,Met或Val；Ala 40→Ile,Gln,Tyr或Phe；Ile 41→Leu,His或Trp；Gln 49→His,Arg,Ser或Ala；Tyr 52→Leu,Trp或Pro；Ser 68→Asp或His；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His,Ile,Ala,Ser或Gly；Lys 73→Asn,Met,Pro,Phe,Gln或Arg；Asp 77→Arg,Thr,Pro或Asp；Trp 79→Ala,Arg,Lys或Asp；Arg 81→Thr,Ile或Trp；Asn 96→Met,Asn,Pro或Ala；Tyr 100→Gly,His或Glu；Leu 103→Gly,Met,His或Gln；Tyr 106→Met,Gly,Arg或Trp；Lys 125→Trp,Phe,Gly或Leu；Ser 127→Arg,Trp,Asp或Ile；Tyr 132→Ala,Glu或Thr；和Lys 134→Leu,Val,Asn或Phe。
42.具體實例34-41中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白的胺基酸序列與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含以下取代：Gln 28→His；Val 34→Leu；Glu 44→Gly；Asp 45→Gly；Lys→Arg或Tyr；Asn 65→Asp；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Val 108→Ala；Phe 123→Ser和Thr 141→Ala。
43.根據前述具體實例34-42中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變 蛋白在成熟人NGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的序列位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個突變胺基酸殘基。
44.根據前述具體實例34-43中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白與所述成熟hNGAL的線性多肽序列相比包含胺基酸取代的以下組之一：(a)Gln 28→His；Ala 40→Ile；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Leu；Ser 68→His；Leu 70→Thr；Arg 72→Lys；Lys 73→Trp；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Lys 125→Trp；Ser 127→Asp；Tyr 132→Glu；Lys 134→Leu；(b)Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；(c)Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；(d)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Ala；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Arg；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Pro；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Arg；Lys 125→Leu；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ala；Lys 134→Asn；(e)Gln 28→His；Val34→Leu；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Thr 141→Ala；(f)Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；(g)Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；(h)Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Glu 44→Gly；Lys 46→Tyr；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp； Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Lys 74→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Val 108→Ala；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；或(i)Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe。
45.根據前述具體實例34至44中任一項的多肽，其包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：54-63或其片段或變體。
46.根據具體實例1的多肽，其包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：2-63或其片段或變體。
47.具體實例1-46中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白包含取代野生型hNGAL的一個或多個胺基酸的一個或多個非天然半胱胺酸殘基。
48.具體實例1-46中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白包含天然半胱胺酸殘基被另一種胺基酸的至少一個胺基酸取代。
49.具體實例48的多肽，其中所述另一種胺基酸是絲胺酸殘基。
50.具體實例1-46中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白與選自由下列組成之群組的化合物接合：有機分子、酶標記物、放射性標記物、有色標記物、螢光標記物、生色標記物、發光標記物、半抗原、洋地黃毒苷、生物素、細胞抑制劑、毒素、金屬複合物、金屬、和膠體金。
51.具體實例1-46中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白在其N 端和/或其C端與融合配偶體融合，所述融合配偶體是蛋白質、或蛋白質域或肽。
52.具體實例1-46中任一項的多肽，其中所述hNGAL突變蛋白與延長多肽的血清半衰期的化合物接合。
53.具體實例52的多肽，其中所述延長血清半衰期的化合物選自由下列組成之群組：聚亞烷基二醇分子、羥乙基澱粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白結合肽、和清蛋白結合蛋白。
54.具體實例53的多肽，其中所述聚亞烷基二醇分子是聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物。
55.一種核酸分子，其包含編碼具體實例1-54中任一項的多肽的核苷酸序列。
56.具體實例55的核酸分子，其中所述核酸分子與調節序列可操作連接以允許所述核酸分子的表現。
57.具體實例55或56的核酸分子，其中所述核酸分子被包含在載體中或在噬菌體載體中。
58.一種宿主細胞，其包含具體實例55至57中任一項的核酸分子。
59.一種生成根據具體實例1-54中任一項的多肽的方法，其中依靠遺傳工程方法，從編碼所述多肽的核酸開始生成所述多肽。
60.具體實例59的方法，其中在細菌或真核宿主生物體中生成所述多肽，並且從此宿主生物體或其培養物分離。
61.一種組合物，其包含選自由下列組成之群組的一種或多種多肽：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白 特異性的多肽。
62.具體實例61的組合物，其包含兩種或更多種選自由下列組成之群組的多肽：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的多肽。
63.具體實例62的組合物，其包含三種或四種選自由下列組成之群組的多肽：(i)對綠膿桿菌螢光素I型特異性的多肽，(ii)對綠膿桿菌螢光素II型特異性的多肽，(iii)對綠膿桿菌螢光素III型特異性的多肽和(iv)對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的多肽。
64.具體實例61-63中任一項的組合物，其中所述對綠膿桿菌螢光素I型特異性的多肽是根據具體實例3-11中任一項的多肽。
65.具體實例61-63中任一項的組合物，其中所述對綠膿桿菌螢光素II型特異性的多肽是根據具體實例12-21中任一項的多肽。
66.具體實例61-63中任一項的組合物，其中所述對綠膿桿菌螢光素III型特異性的多肽是根據具體實例22-30中任一項的多肽。
67.具體實例61-63中任一項的組合物，其中所述對綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性的多肽是根據具體實例31-41中任一項的多肽。
68.具體實例61-67中任一項的組合物，其中所述組合物進一步包含至少一種醫藥上可接受之佐劑、稀釋劑或載體。
69.一種結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法，其包括對所述受試者投予有效量的具體實例61-67中任一項的組合物。
70.一種用於抑制或減輕受試者中的銅綠假單胞菌生長的方法，其包括對所述受試者投予有效量的具體實例61-67中任一項的組合物。
71.一種套組，其在一個或多個容器中分開或混合包含具體實例61-67中任一項的組合物。
72.(i)根據具體實例3-11中任一項的第一多肽，(ii)根據具體實例12-21中任一項的第二多肽，(iii)根據具體實例22-30中任一項的第三多肽和/或(iv)根據具體實例31-41中任一項的第四多肽用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素I、II、III型和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途。
73.(i)根據具體實例3-12中任一項的第一多肽，(ii)根據具體實例13-23中任一項的第二多肽，(iii)根據具體實例24-33中任一項的第三多肽和/或(iv)根據具體實例34-45中任一項的第四多肽用於在受試者中防止或降低銅綠假單胞菌經由綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠膿桿菌螢光素的鐵攝取的用途。
74.(i)根據具體實例3-12中任一項的第一多肽，(ii)根據具體實例13-23中任一項的第二多肽，(iii)根據具體實例24-33中任一項的第三多肽和/或(iv)根據具體實例34-45中任一項的第四多肽用於治療或減輕受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染的用途。
75.具體實例74的用途，其中所述銅綠假單胞菌生物膜感染是急性或慢性感染。
76.具體實例72-75的用途，其中組合投予所述第一、第二、第三和/或第四多肽，包括同時、伴隨或連續。
77.具體實例72-75的用途，其中所述第一、第二、第三和/或第四多肽彼此獨立投予，包括在獨立的時間點時以單獨的時間間隔。
78.(i)根據具體實例3-11中任一項的多肽，(ii)根據具體實例12-21中任一項的多肽，(iii)根據具體實例22-30中任一項的多肽和/或(iv)根據具體實例31-41中任一項的多肽的組合。
C.核酸分子
本發明還涉及核酸分子(DNA和RNA)，其包含編碼本發明的融合分子的核苷酸序列。由於遺傳密碼的簡並性允許某些密碼子被規定相同胺基酸的另一個密碼子的取代，本發明不限於編碼如本文中描述的融合分子的具體核酸分子，而是涵蓋包含編碼功能性融合分子的核苷酸序列的所有核酸分子。
本申請案中揭示的核酸分子可以與一種或多種調節序列“可操作連接”以容許此核酸分子的表現。
若核酸分子包含含有關於轉錄和/或轉譯調節的信息的序列元件，並且此類序列與編碼多肽的核苷酸序列“可操作連接”，則它(如DNA)稱為“能夠表現核酸分子”或能夠“容許表現核苷酸序列”。可操作連接是調節序列元件和要表現的序列以實現基因表現的方式相連的連接。對於基因表現必需的調節區的精確性質可以在物種間變化，但是一般地，這些區域包含啟動子，其在原核生物中含有啟動子本身(即指導轉錄的啟動的DNA元件)以及在轉錄成RNA時會對轉譯啟動發信號的DNA元件兩者。此類啟動子區通常包含參與轉錄和轉譯啟動的5’非編碼序列，如原核生物中的-35/-10框和Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA框、CAAT序列和5’加帽元件。這些區域還可以包含增強子或阻抑物元件以及轉譯的信號和前導序列，用於將天然多肽靶向到宿主細胞的特定區室。
在一些具體實例中，本申請案中揭示的核酸分子，如DNA可以與揭示內容的另一種核酸分子“可操作連接”以允許公開內容的融合蛋白的表現。在這點上，可操作連接是第一核酸分子的序列元件和第二核酸分子的序列元件以使融合蛋白能夠作為單一多肽表現的方式相連的連接。
另外，3’非編碼序列可以含有參與轉錄終止、多聚腺苷酸化等的調節元件。然而，如果這些終止序列在特定的宿主細胞中沒有令人滿意的功 能，那麼它們可以用在所述細胞中功能性的信號取代。
因此，本發明的核酸分子可以包含調節序列，如啟動子序列。在一些具體實例中，本發明的核酸分子包含啟動子序列和轉錄終止序列。合適的原核啟動子是例如tet啟動子、lacUV5啟動子或T7啟動子。可用於在原核細胞中表現的啟動子的例子是SV40啟動子或CMV啟動子。
在一個具體實例中，核酸分子被包含在載體中。如本文中使用，術語“載體”包括技術人員已知的任何載體，包括質體載體，黏粒載體，噬菌體載體，如λ噬菌體，噬菌體或質體，病毒載體，如腺病毒或杆狀病毒，或人工染色體載體，如細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、或P1人工染色體(PAC)。所述載體包含表現以及選殖載體。表現載體包含質體及病毒載體，並且一般含有期望的編碼序列和對於可操作連接的編碼序列在特定宿主生物體(例如細菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動物)中或在體外表現系統中的表現必需的合適的DNA序列。選殖載體一般用於工程化改造並擴增某個期望的DNA片段，並且可以缺乏期望的DNA片段的表現所需的功能序列。大量的合適的表現和選殖載體是本領域中已知的，並且是市面上可得者。
在一個具體實例中，質體中包含核酸分子。質體載體意指編碼與感興趣cDNA融合的Temperent噬菌體(如M13或f1)的基因間區域，或其功能性部分的載體。在用此類噬菌體載體和合適的輔助噬菌體(例如M13K07、VCS-M13或R408)二重感染細菌宿主細胞後，生成完整的噬菌體顆粒，從而實現編碼的異源cDNA與其在噬菌體表面上展示的相應多肽的物理偶聯(參見例如Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401-424，或Rodi,D.J.,and Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87-93)。
可以將編碼如本文中描述的融合分子的DNA分子，和特別是含有此類融合分子的編碼序列的載體轉化或轉染到能夠表現基因的宿主細胞中。可以使用標準技術進行轉化或轉染。如此，本發明還涉及含有如本文中公開的核酸分子的宿主細胞。
在一個具體實例中，術語“細胞”或“宿主細胞”指完整的細胞，即尚未釋放其正常胞內組分，如酶、細胞器或遺傳物質的具有完整膜的細胞。在一個具體實例中，完整的細胞是活細胞，即能夠實施其正常代謝功能的活細胞。在一個具體實例中，根據本發明，所述術語指可以用外源核酸轉染或轉化的任何細胞。在一個具體實例中，在用外源核酸轉染或轉化並且轉移到接受者時的細胞能在接受者中表現核酸。術語“細胞”包括原核細胞，如細菌細胞，和真核細胞，如酵母細胞，真菌細胞或哺乳動物細胞。合適的細菌細胞包括來自革蘭氏陰性細菌菌株，如大腸桿菌(Escherichia coli)，變形菌屬(Proteus)，和假單胞菌屬(Pseudomonas)的菌株，和革蘭氏陽性細菌菌株，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，鏈黴菌屬(Streptomyces)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，和乳球菌屬(Lactococcus)的菌株的細胞。合適的真菌細胞包括來自木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)、和麯黴屬(Aspergillus)物種的細胞。合適的酵母細胞包括來自酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))、和漢遜酵母屬(Hansenula)物種的細胞。合適的哺乳動物細胞包括原代哺乳動物細胞或永生化哺乳動物細胞系，如CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞、293 HEK等。然而，也可以使用兩棲動物細胞、昆蟲細胞(例如SF9或High5)、植物細胞、和本領域中用於表現異 源蛋白質的任何其它細胞。
本發明還涉及用於生成如本文中描述的融合分子的方法，其中依靠遺傳工程方法從編碼融合分子的核酸開始生成融合蛋白。該方法可以在體內實施，融合分子可以例如在細菌或真核宿主生物體/細胞中生成，然後從此宿主生物體/細胞或其培養物中分離。也可以在體外生成蛋白質，例如藉由使用體外轉譯系統。
在體內生成融合分子時，依靠重組DNA技術(如上文已經概述)將編碼此類融合分子的核酸導入合適的細菌或真核宿主生物體/細胞中。為此目的，首先使用建立的標準方法用包含編碼如本文中描述的融合分子的核酸分子的選殖載體轉化宿主細胞。然後，在容許異源DNA表現和如此合成相應多肽的條件下培養宿主細胞。隨後，從細胞中或從培養基中回收多肽。
在一些具體實例中，可以在融合分子中使用的hNGAL突變蛋白中除去Cys 76和Cys 175之間的天然存在的二硫鍵。因而，可以在具有還原性氧化還原環境的細胞區室中，例如在革蘭氏陰性菌的細胞質中生成此類突變蛋白。
若本發明的融合分子包含分子內二硫鍵，則可以優選使用合適的信號序列將新生多肽引導到具有氧化性氧化還原環境的細胞區室中。此類氧化性環境可以由革蘭氏陰性細菌(如大腸桿菌)的周質，在革蘭氏陽性細菌的胞外環境中或者在真核細胞的內質網的腔室中提供，並且通常有利於結構性二硫鍵的形成。
然而，也可以在宿主細胞(特別是大腸桿菌)的胞質溶膠中生成本發明的融合分子。在此情況中，融合分子可以直接以可溶且折疊的狀態獲得或者以包含體形式回收，接著在體外複性。進一步的選項是使用具有氧化性胞內環境的特定宿主菌株，其如此可以容許在胞質溶膠中形成二硫鍵 (Venturi等(2002)J.Mol.Biol.315,1-8.)。
然而，如本文中描述的融合分子可以不一定僅藉由使用遺傳工程生成或產生。確切而言，也可以藉由化學合成(如Merrifield固相多肽合成)或者藉由體外轉錄和轉譯獲得此類融合分子。用於蛋白質的固相和/或溶液相合成的方法是本領域中公知的(參見例如Bruckdorfer,T.等(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43)，並且用於體外轉錄/轉譯的方法也是這樣。還可能的是，使用分子建模鑑定有希望的突變，然後在體外合成想要的(設計的)多肽，並且調查對綠膿桿菌螢光素I、II、III型或綠膿桿菌螯鐵蛋白的結合活性。用於蛋白質的固相和/或溶液相合成的方法是本領域中公知的(參見例如Bruckdorfer,T.等(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43)。
熟練技術人員會領會可用於製備融合分子的方法，所述融合分子由本發明涵蓋，但是其蛋白質或核酸序列在本文中沒有明確公開。作為一個概述，胺基酸序列的此類修飾包括例如單個胺基酸位置的定向誘變以藉由摻入某些限制酶的切割位點來簡化hNGAL突變蛋白基因或其部分的亞選殖。另外，也可以摻入這些突變以進一步改善突變蛋白對給定靶物(如分別為綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白)的親和力。此外，可以引入突變以調控突變蛋白和融合分子的某些特徵，從而改善折疊穩定性、血清穩定性、蛋白質抗性或水溶解度或降低聚集趨勢(若必要的話)。例如，可以將天然存在的半胱胺酸殘基突變成其它胺基酸以阻止二硫化物橋形成。
本揭示內容還涉及核酸分子，其包含編碼本文中揭示的突變蛋白的核苷酸序列。在這點上，本揭示內容提供編碼公開內容的一些突變蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：65-126中顯示。由於遺傳密碼子的簡並性允許某些密碼子被規定相同胺基酸的其它密碼子的取代，揭示內容不限於編碼如本文中描述的突變蛋白的具體核酸分子，而是涵蓋包含編碼功能性突變 蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。揭示內容進一步涵蓋含有所述核酸分子的宿主細胞。涉及結合本發明的融合分子公開的核酸分子和(宿主)細胞的所有態樣和具體實例也適用於單一突變蛋白及其組合。這適用於其生成方法。
D.組合物和套組
在別的態樣中，本發明涉及醫藥組合物，其包含如本文中限定的融合分子、如本文中限定的核酸分子、或如本文中限定的細胞。
在一些具體實例中，本發明的醫藥組合物是無菌的和/或含有有效量的本文中描述的融合分子、核酸分子或細胞以產生期望的反應或期望的效果。
如貫穿描述使用，術語“有效量”指足以實現有益或期望的結果的量，其中可以在一次或多次投予中投予有效量。在治療特定疾病或特定狀況的情況下，有益或期望的結果特別涉及抑制疾病的過程。這包括減緩疾病的進展，並且特別是中斷或反轉疾病的進展。治療疾病或狀況中的有益或期望的結果也可以是所述疾病或所述狀況的發作延遲或發作預防。本文中描述的藥劑或組合物的有效量會取決於要治療的病況、疾病的嚴重性、受試者的個體參數，包括年齡、生理學狀況、體格和重量、治療的持續時間、伴隨療法(若存在的話)的類型、特定的投予路徑和類似的因素。因而，本文中描述的藥劑的投予劑量可以取決於各種此類參數。在受試者中的反應用初始劑量不足的情況下，可以使用更高的劑量(或者藉由不同的更局部化的投予路徑實現的有效更高的劑量)。
醫藥組合物通常以一致的劑量形式提供，並且可以以本身已知的方式製備。例如，醫藥組合物可以為溶液或懸浮液的形式。
醫藥組合物可以進一步包含一種或多種載體和/或賦形劑，在具體的 具體實例中，它們全部是藥學可接受的。如本文中使用，術語“藥學可接受”指材料的無毒性，在具體的具體實例中，所述材料不與醫藥組合物的活性劑的作用相互作用。
術語“載劑”指組合活性成分以促進、增強或實現應用的天然或合成性質的有機或無機組分。根據本發明，術語“載劑”還包括一種或多種相容的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質，其適合於對受試者投予。
適合於胃腸外投予的醫藥組合物通常包含活性化合物的無菌水性或非水性製劑，其在一個具體的具體實例中與接受者的血液等張。用於胃腸外投予的相容載體/溶劑/稀釋劑的例子是例如無菌水、林格(Ringer)溶液、林格乳酸鹽、等張氯化鈉溶液、聚亞烷基二醇、氫化萘和特別是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。另外，通常使用無菌不揮發性油作為溶液或懸浮介質。
如本文中使用，術語“賦形劑”意圖包括可以存在於醫藥組合物中並且不是活性成分的所有物質，如鹽、黏合劑、潤滑劑、增稠劑、表面活性劑、防腐劑、乳化劑、緩衝物質、調味劑或著色劑。
非醫藥上可接受之鹽可以用於製備醫藥上可接受之鹽，並且包括在本發明中。此種類的醫藥上可接受之鹽以非限制的方式包含那些從以下酸製備的鹽：氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。醫藥上可接受之鹽也可以製備為鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
在醫藥組合物中使用的合適的防腐劑包括苯紮氯銨、氯丁醇(chlorobutanol)、對羥苯甲酸酯和硫柳汞。
在醫藥組合物中使用的合適的緩衝物質包括鹽中的乙酸、鹽中的檸檬酸、鹽中的硼酸和鹽中的磷酸。
醫藥組合物還可以包含一種或多種醫藥上可接受之佐劑。
在一個具體實例中，醫藥組合物配製用於系統投予，特別是胃腸外(例如皮下)投予。在另一個具體實例中，醫藥組合物配製用於吸入。
在一個具體實例中，醫藥組合物進一步包含另外的藥學活性劑。
在一個具體實例中，另外的藥學活性劑選自由下列組成之群組：抗生素、細胞抑制劑、毒素、酶、金屬或金屬化合物/複合物、螯合劑、放射性核素、小有機分子、治療活性肽、治療活性核酸分子、半抗原和抗體。合適的抗生素包括妥布黴素、阿奇黴素、氨曲南(Aztreonam)、黏菌素和碳青黴烯。
合適的金屬或金屬化合物/複合物是鎵、鎵化合物和基於鎵的複合物。
如本文中使用，術語“小有機分子”指包含至少兩個碳原子，但是優選不超過7或12個可旋轉的碳鍵，具有範圍為100-2000道爾頓，特別是100-1000道爾頓，或<900道爾頓的分子量，並且任選包含一個或兩個金屬原子的有機分子。
術語“治療活性肽”指例如作用為細胞表面受體的激動劑/拮抗劑的肽或競爭給定細胞靶物上的蛋白質結合位點的肽。
術語“治療活性核酸分子”指例如反義核酸分子、小干擾RNA、微小RNA或核酶。
可以與本發明的融合分子組合的具體的另外的藥學活性劑包括阿法鏈道酶、皮質類固醇、白三烯修飾劑、N-乙醯半胱胺酸、吸入的谷胱甘肽、抗膽鹼藥、布洛芬和β2-腎上腺素能受體激動劑。
在又一個態樣，本發明涉及套組，其包含如本文中限定的融合分子、如本文中限定的核酸分子、如本文中限定的細胞、或如本文中限定的 醫藥組合物。套組可以是診斷或分析套組。
如本文中使用，術語“成套套組(簡言之：套組)”指包含一個或多個容器和任選地，數據載體的製品。所述一個或多個容器可以充滿本文中公開的手段或試劑中的一種或多種。套組中可以包含別的容器，所述套組含有例如稀釋劑、緩衝劑和別的試劑。所述數據載體可以是非電子數據載體，例如圖形數據載體，如信息傳單、信息單、條形碼或存取碼、或電子數據載體，如光碟(CD)、數位多功能語音光碟(DVD)、微晶片或另一種基於半導體的電子數據載體。存取碼可以允許訪問數據庫，例如因特網數據庫，集中式或分散式數據庫。所述數據載體可以包含關於使用本發明的融合分子、核酸分子、細胞和/或醫藥組合物的用法說明。
涉及結合本發明的融合分子揭示的組合物和套組的所有態樣和具體實例也適用於單一突變蛋白及其組合。
E.診斷和治療應用
綠膿桿菌螢光素是假單胞菌屬，如銅綠假單胞菌的主要鐵載體。體外實驗指示銅綠假單胞菌綠膿桿菌螢光素在從鐵轉鐵蛋白釋放鐵中的潛在作用，但是最近僅證明綠膿桿菌螢光素在體內競爭鐵的能力(Meyer等，1996,Infection and Immunity,64,p.518-523)。使用燒傷小鼠模型觀察到自有毒力的親本菌株製備的突變體中綠膿桿菌螢光素生成的缺乏與這些突變體的毒力喪失相關聯，並且毒力在補充源自野生型菌株的同源綠膿桿菌螢光素時恢復。此外，補充異源綠膿桿菌螢光素沒有恢復後一種突變體的毒力。如此，對感染期間由給定銅綠假單胞菌隔離群使用的綠膿桿菌螢光素介導的鐵攝取系統的精確瞭解看起來是開發經由細菌鐵代謝(例如藉由阻斷綠膿桿菌螢光素生物合成或綠膿桿菌螢光素介導的鐵轉運)治療銅綠假單胞菌感染的新方式的前提。
綠膿桿菌螯鐵蛋白(Pch)是由銅綠假單胞菌生成並分泌以同化鐵的兩種主要的鐵載體之一。它螯合胞外介質中的鐵，並且經由特定的外膜轉運蛋白FptA將它轉運到細胞中。Pch強烈螯合二價金屬，如Zn(II)(於p[H]7.4，pZn=11.8)和Cu(II)(於p[H]7.4，pCu=14.9)，並且主要形成1：2(M2+/Pch)複合物。鐵載體不僅專用於鐵(III)穿梭，而且更可能在微生物中的微妙金屬穩態中展現其它特定的生物學作用。
因此，醫學中存在對於本發明的綠膿桿菌螢光素/綠膿桿菌螯鐵蛋白結合融合分子的許多可能的應用。
在一個態樣中，本發明涉及如本文中限定的融合分子、如本文中限定的核酸分子、如本文中限定的細胞、或如本文中限定的醫藥組合物，其用作藥物。
如本文中使用，術語“藥物”指療法中，即疾病治療中使用的物質/組合物。
如本文中使用，術語“疾病的治療”包括治癒疾病或其症狀，縮短疾病或其症狀的持續時間，改善、預防疾病或其症狀，減緩或抑制疾病或其症狀的進展或惡化、或者防止或延遲疾病或其症狀的發作。
根據本發明，術語“疾病”指任何病理學狀態，特別是與受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染有關或由受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染引起的疾病或病症。
在另一個態樣中，本發明涉及如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的細胞，或如本文中限定的醫藥組合物，其用於預防或治療受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染。
如遍及本說明書使用的，根據本發明，術語“受試者”意指用於治療或診斷的受試者，特別是患病受試者(又稱為“患者”)或預期/假設/有風險患病 的受試者。“受試者”是脊椎動物，特別是哺乳動物。術語“哺乳動物”在本文中用於指分類為哺乳動物的任何動物，包括不限於人、家畜和農場動物，和動物園、運動、或寵物動物，如羊、犬、馬、貓、牛、大鼠、豬、猿，如獼猴等，僅舉幾個說明性的例子。在一個具體的具體實例中，哺乳動物是人。
在又一個態樣，本發明涉及如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的細胞，或如本文中限定的醫藥組合物，其用於預防或治療受試者中的與銅綠假單胞菌生物膜感染有關或由銅綠假單胞菌生物膜感染引起的疾病或病症。
在又一個態樣，本發明涉及預防或治療受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染的方法，其包括對受試者投予有效量的如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的細胞，或如本文中限定的醫藥組合物。
在又一個態樣，本發明涉及預防或治療與受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染有關或由受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染引起的疾病或病症的方法，其包括對受試者投予有效量的如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的細胞，或如本文中限定的醫藥組合物。
在一個具體實例中，銅綠假單胞菌生物膜感染是急性或慢性感染。
在一個具體實例中，與銅綠假單胞菌生物膜感染有關或由銅綠假單胞菌生物膜感染引起的疾病或病症選自：囊性纖維化、醫院獲得性肺炎、通風裝置相關的肺炎、尿路感染、眼感染、耳感染和燒傷創面感染。
在又一個態樣，本發明涉及如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的細胞，或如本文中限定的醫藥組合物，其 用於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素(I、II和/或III型)和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或抑制或減輕受試者中的銅綠假單胞菌生長。
在又一個態樣中，本發明特徵在於結合受試者中的綠膿桿菌螢光素(I、II和/或III型)和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的方法，所述方法包括對所述受試者投予有效量的如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的細胞，或如本文中限定的醫藥組合物。
在又一個態樣中，本發明特徵在於用於抑制或減輕受試者中的銅綠假單胞菌生長的方法，所述方法包括對所述受試者投予有效量的如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的細胞，或如本文中限定的醫藥組合物。
在又一個態樣中，本發明涉及如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的細胞，或如本文中限定的醫藥組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於(i)預防或治療受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染，(ii)預防或治療受試者中的與銅綠假單胞菌生物膜感染有關或由銅綠假單胞菌生物膜感染引起的疾病或病症，或者(iii)抑制或減輕受試者中的銅綠假單胞菌生長。
可以經由任何常規的路徑，如藉由表面或系統性(即腸或胃腸外)投予來投予本文中描述的藥劑和組合物。胃腸外投予包括注射或輸注，例如靜脈內，動脈內，皮下，皮內或肌肉內。表面投予包括吸入以及滴眼劑和滴耳劑。在具體的具體實例中，藉由吸入(融合分子)或系統性，例如皮下(Fc-融合分子構築體)投予本發明的融合分子。
本發明進一步涉及本文中揭示的融合分子用於檢測樣品中的綠膿桿菌螢光素(I、II和/或III型)和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途以及相應診斷方法。
如本文中使用，術語“檢測”或“可檢測”在定量和定性水平兩者及其組合上理解。因此，它包括感興趣的分子的定量、半定量和定性測量。
此類用途可以包括以下步驟：在合適的條件下使一種或多種融合分子與懷疑含有綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，從而允許形成融合分子和綠膿桿菌螢光素(I、II和/或III型)和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白之間的複合物，並且藉由合適的信號檢測複合物。信號可以藉由如上文解釋的標記物，或者藉由由於結合(即複合物形成)自身所致的物理特性的變化引起。一個例子是表面等離振子共振，其數值在結合配偶體的結合期間變化，來自所述結合配偶體的一個在表面如金箔上固定化。
本文中公開的融合分子也可以用於分離綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白。此類用途可以包括以下步驟：在合適的條件下使此類融合分子與假設含有綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的樣品接觸，從而分別允許形成融合分子和綠膿桿菌螢光素之間和/或融合分子和綠膿桿菌螯鐵蛋白之間的複合物，並且分開複合物與樣品。
在公開的融合分子用於檢測綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白以及分離綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的用途中，可以在合適的固相上固定化融合分子和/或綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白或其域或片段。
因而，可以測定綠膿桿菌螢光素和/或綠膿桿菌螯鐵蛋白的存在或缺乏(例如在樣品中)以及其濃度或水平。
“樣品”定義為從任何受試者中採集的生物樣品。生物樣品包括但不限於血液、血清、尿液、糞便、精液或組織。
本文中描述的融合分子可以在與抗體或其片段相似的許多領域中使用。例如，融合分子可以用於用酶、抗體、放射性物質或任何其它具有生 物化學活性或限定結合特徵的基團標記。藉由這樣做，可以檢測其相應的靶物或使其相應的靶物與它們接觸。另外，本發明的融合分子可以用來依靠建立的分析方法(例如ELISA或Western印跡)或者藉由顯微術或免疫傳感學檢測化學結構。在這點上，可以藉由使用合適的融合分子接合物直接產生或者藉由經由抗體的免疫化學檢測結合的融合分子間接產生檢測信號。
涉及結合本發明的融合分子公開的診斷和治療應用的所有態樣和具體實例也適用於單一突變蛋白及其組合。
本發明的其它目的、優點和特徵在檢查下述實例及其附圖後對於本領域技術人員會變得明顯，所述實例及其附圖並不意圖是限制性的。如此，應當理解，雖然藉由例示性的具體實例和任選的特徵具體公開本發明，但是本領域技術人員可以採用本文中體現的公開內容的修改和變型，並且認為此類修改和變型在本發明的範圍內。特別地，結合本發明的融合分子公開的所有態樣和具體實例也適用於本文中公開的單一突變蛋白以及其組合，並且反之亦然。
圖1：顯示銅綠假單胞菌鐵載體的結構。圖1A-C顯示三種銅綠假單胞菌綠膿桿菌螢光素的結構。圖1A：Pvd I型的結構(參見Birskot等，1989)；圖1B：Pvd II型的結構(參見Birskot等，1989)；圖1C：Pvd III型的結構(Gipp等，1991)；圖1D：附接於生色團部分的R可以是琥珀醯基、琥珀酸醯胺基(succinamid)或α-酮戊二醯基側鏈；和圖1E：綠膿桿菌螯鐵蛋白的結構(Brandel等，2011)。
圖2：提供藉由表面等離振子共振對於Pvd I s(+Fe)對脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：16的結合(A)、Pvd II s(+Fe)對脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：36的結合(B)、Pvd III(+Fe)對脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：53的結合(C)和綠膿桿菌螯鐵蛋白(+Fe)對SEQ ID NO：62的結合(D)的結合速率和解離速率的典型測量。另外，圖2E-H中顯示缺乏1200nM(對於綠膿桿菌螯鐵蛋白為200nM)的相應鐵載體對陰性對照SEQ ID NO：64的結合。
圖3：顯示如藉由表面等離振子共振測定的脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：35的例示性特異性和交叉反應性概況。證明了對綠膿桿菌螢光素II琥珀醯基、琥珀酸醯胺基和α-酮戊二醯基的特異性結合，同時顯示了缺乏對I型和III型綠膿桿菌螢光素、綠膿桿菌螯鐵蛋白、腸菌素和去鐵胺(desferoxamin)的結合。對於所有分析物，使用2μM的高濃度。
圖4：顯示來自生長抑制測定法的例示性數據。圖4A：與在沒有突變蛋白情況下生長的對照培養物相比，Pvd I特異性突變蛋白SEQ ID NO：16顯示了Pvd I特異性銅綠假單胞菌菌株(ATCC27853)的生長抑制。圖4B：與在沒有突變蛋白情況下生長的對照培養物相比，Pvd II特異性突變蛋白SEQ ID NO：19和36顯示Pvd II特異性銅綠假單胞菌菌株(ATCC15692)的生長抑制。SEQ ID NO：36與SEQ ID NO：19相比具有更高的結合親和力並且顯示更大的生長抑制。圖4C：與在沒有突變蛋白情況下生長的對照培養物相比，Pvd III特異性突變蛋白SEQ ID NO：53顯示Pvd III特異性銅綠假單胞菌菌株(ATCC33360)的生長抑制。圖4D：與在沒有突變蛋白情況下生長的對照培養物相比，Pch特異性突變蛋白SEQ ID NO：62顯示依賴於Pch攝取鐵的Pvd I敲除銅綠假單胞菌菌株(ATCC15692△pvdA)的生長抑制。在測定法中應用10μM脂籠蛋白突變蛋白。
圖5：在小鼠中的銅綠假單胞菌誘導的肺感染模型中顯示在細菌攻擊前1小時和細菌攻擊之時，SEQ ID NO：19的投予以劑量依賴性方式防止小鼠中的感染形成。從200μg/小鼠的SEQ ID NO：19開始觀察到顯著的預防效 果，在2000μg/小鼠有最大效果。
圖6：顯示表現用於結晶的胺基酸序列(SEQ ID NO：129)，包括第1位的開始甲硫胺酸、第2位的賴胺酸、第3-8位的六組胺酸標簽、第9-15位的胺基酸DYDIPTT的接頭區(SEQ ID NO：132)、第16-22位的煙草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶切割位點ENLYFQG(SEQ ID NO：133)，接著是從第23位起的感興趣的突變蛋白的胺基酸序列。
圖7：顯示SEQ ID NO：31-Pvd-Fe複合物結構。顯示來自不對稱單元的兩個SEQ ID NO：31分子，即鏈A和鏈B的覆蓋。
圖8：顯示SEQ ID NO：31和Pvd-Fe相互作用。覆蓋來自不對稱單元的兩個分子。描繪與Pvd-Fe相互作用的側鏈。
圖9：顯示Pvd組成。參與鐵結合的氧原子是框示的。
圖10A：顯示根據本發明的融合分子的結構。經由接頭分子(這裡：序列(G4S)2的肽接頭；參見SEQ ID NO：141)遺傳融合脂籠蛋白突變蛋白1、2、3和4(LM 1、2、3、4)，其中LM 1(SEQ ID NO：34或36)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素II組鐵載體，LM 2(SEQ ID NO：16或17)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素I組鐵載體，LM 3(SEQ ID NO：50或53)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素III組鐵載體，且LM 4(SEQ ID NO：62或63)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螯鐵蛋白鐵載體。融合分子構築體(SEQ ID NO：134或135)在一個分子中包含對所有銅綠假單胞菌鐵載體的結合能力，並且具有對於每個Pvd組的一個結合模塊和對於綠膿桿菌螯鐵蛋白的一個結合模塊。
圖10B；顯示根據本發明的Fc-融合分子構築體的結構。經由接頭分子(這裡：序列(G4S)2的肽接頭；參見SEQ ID NO：141)將脂籠蛋白突變蛋白 1、2、3和4(LM 1、2、3、4)與人IgG4-Fc域(hu IgG4-Fc；SEQ ID NO：140)的N端遺傳融合，其中LM 1(SEQ ID NO：34或36)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素II組鐵載體，LM 2(SEQ ID NO：16或17)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素I組鐵載體，LM 3(SEQ ID NO：50或53)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素III組鐵載體，並且LM 4(SEQ ID NO：62或63)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螯鐵蛋白鐵載體。Fc-融合分子構築體(SEQ ID NO：136或137)在一個分子中包含對所有銅綠假單胞菌鐵載體的結合能力，並且具有對於每個Pvd組和對於綠膿桿菌螯鐵蛋白的兩個結合模塊。
圖10C：顯示根據本發明的Fc-融合分子構築體的結構。經由接頭分子(這裡：序列(G4S)2的肽接頭；參見SEQ ID NO：141)將脂籠蛋白突變蛋白1、2、3和4(LM 1、2、3、4)與人IgG4-Fc域(hu IgG4-Fc；SEQ ID NO：140)的C端遺傳融合，其中LM 1(SEQ ID NO：34)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素II組鐵載體，LM 2(SEQ ID NO：17)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素I組鐵載體，LM 3(SEQ ID NO：50)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素III組鐵載體，並且LM 4(SEQ ID NO：63)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螯鐵蛋白鐵載體。Fc-融合分子構築體(SEQ ID NO：138)在一個分子中包含對所有銅綠假單胞菌鐵載體的結合能力，並且具有對於每個Pvd組和對於綠膿桿菌螯鐵蛋白的兩個結合模塊。
圖10D：顯示根據本發明的Fc-融合分子構築體的結構。經由接頭分子(這裡：序列(G4S)2的肽接頭；參見SEQ ID NO：141)遺傳融合脂籠蛋白突變蛋白1、2、3和4(LM 1、2、3、4)。將LM 1和LM 2遺傳融合於人IgG4- Fc域(hu IgG4-Fc；SEQ ID NO：140)的N端，並且將LM 3和LM 4遺傳融合於人IgG4-Fc域(hu IgG4-Fc；SEQ ID NO：140)的C端，其中LM 1(SEQ ID NO：34)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素II組鐵載體，LM 2(SEQ ID NO：17)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素I組鐵載體，LM 3(SEQ ID NO：50)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螢光素III組鐵載體，並且LM 4(SEQ ID NO：63)結合具有結合的鐵離子和沒有複合的鐵離子的綠膿桿菌螯鐵蛋白鐵載體。Fc-融合分子構築體(SEQ ID NO：139)在一個分子中包含對所有銅綠假單胞菌鐵載體的結合能力，並且具有對於每個Pvd組和對於綠膿桿菌螯鐵蛋白的兩個結合模塊。
圖11：顯示純化的融合分子(這裡：SEQ ID NO：134)的考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
圖12：顯示SEQ ID NO：137、138和139的不同Fc-融合分子構築體和SEQ ID NO：17、34、50和63的相應單一脂籠蛋白突變蛋白對溶液中的不同綠膿桿菌螢光素組的加載有鐵的琥珀醯基變體和加載有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白的結合，如在基於ELISA的測定法中測定。所有Fc-融合分子形式在結合於單一靶物中是有活性的，並且具有與單一脂籠蛋白突變蛋白的IC50值相當的IC50值。
圖13：顯示融合分子(這裡：SEQ ID NO：134)能夠同時結合綠膿桿菌螢光素和綠膿桿菌螯鐵蛋白。在經中性親合素(neutravidin)塗覆的MSD板上捕獲具有琥珀醯基殘基的來自每個相應組(I、II和III)的生物素化的綠膿桿菌螢光素，並且允許融合分子結合。經由經Sulfo標簽標記的綠膿桿菌螯鐵蛋白檢測結合的融合分子。
圖14：顯示融合分子(這裡：SEQ ID NO：134)能夠在鐵限制培養基中 抑制生成Pvd I(A)、Pvd II(B)或Pvd III(C)的菌株，或△pvdA PvdII敲除菌株(D)的生長。
圖15：顯示融合分子(這裡：SEQ ID NO：134，稱為RA10680550)在第3天在單劑後顯著降低慢性感染模型中的銅綠假單胞菌肺負荷(CFU/克肺組織)，並且直至第15天不發生復發。進一步顯示融合分子不拮抗妥布黴素(Tobramycin)活性，並且在聯合療法中，兩種活性協同。每種處理的幾何平均值負荷以水平棒標示。在每個柱形之上，記錄了與運載體相比所述處理組的Log10降低(LogR)(LOD=檢測限)。
圖16：顯示融合分子(這裡：SEQ ID NO：134，又稱為RA10680550)阻斷感染大鼠的肺中的總白細胞計數的增加，並且由此增加感染的清除。相對於每種單一處理，妥布黴素/融合分子組合顯示清楚的益處。感染後第3、5、7、9和15天的絕對BAL白細胞(單核細胞和嗜中性細胞)計數均值+SD(每ml BAL的細胞)(對數標度)。
圖17：顯示融合分子在定居的早期階段(A)或建立的定居(B)期間降低毒力因子表現。SEQ ID NO：134的測試融合分子顯示對銅綠假單胞菌的rhlI的毒力基因表現的顯著影響。rhlI參與藉由生成N-丁醯高絲胺酸內酯(BHL)的群體感應(quorum sensing)。BHL結合其受體RhlR，由此誘導基因(包括其自身基因座)的互補物的表現(完成自身誘導回路)。
圖18：顯示融合分子的結合能力不受分開四種脂籠蛋白突變蛋白的接頭分子的長度影響。測試的接頭分子是甘胺酸、GSGGSG(SEQ ID NO：142)和(G4S)2(SEQ ID NO：141)。
圖19：顯示Fc-融合分子防止鐵饑餓培養基中指數生長的細菌的綠膿桿菌螢光素生成。對於銅綠假單胞菌菌株ATCC27853(A和B)，菌株ATCC15692(C和D)和菌株ATCC33360(E和F)顯示了用Fc-融合分子(SEQ ID NO：136)或對照Fc-融合分子處理後cfu/ml和螢光任意單位數值的均值和s.e.m.。
圖20：顯示Fc-融合分子防止鐵饑餓培養基中指數生長的細菌的綠膿桿菌螢光素生成(還可參見圖20)。對於菌株ATCC27853(A)、ATCC15692(B)和ATCC33360(C)顯示了用Fc-融合分子(SEQ ID NO：136)或對照Fc-融合分子處理後綠膿桿菌螢光素螢光的標準化相對量。
圖21：顯示圖19和20中顯示的效果是綠膿桿菌螢光素特異性的。菌株ATCC27853的培養物中及ATCC27853的pvdA/pchD雙重突變體菌株中的螢光的均值數值顯示了不能合成這些鐵載體的突變體菌株沒有展現出任何螢光信號。
圖22：顯示圖19和20中顯示的效果是綠膿桿菌螢光素特異性的(還可參見圖21)。為了標準化螢光信號，在螢光信號獲取前使用獲自野生型ATCC27853的上清液的純化的綠膿桿菌螢光素II以摻入培養物，並且獲得校正曲線。
圖23：顯示在存在Fc-融合分子的情況下的螢光信號下降不是由於化合物對綠膿桿菌螢光素結合後的螢光猝滅所致。對含有綠膿桿菌螢光素的培養上清液(用ATCC27853的過濾的24小時培養物獲得)臨時添加Fc-融合分子(SEQ ID NO：136)，並且立即和在24h後讀取螢光。如藉由此實驗中觀察到的螢光的均值數值顯示，未能檢出螢光猝滅。
圖24：顯示Fc-融合分子影響細菌生長的動力學。用Fc-融合分子(SEQ ID NO：136)的1mg/mL處理對菌株ATCC15692和ATCC33360的影響在(A)和(B)中分別顯示為cfu/mL的均值和s.e.m.。
圖25：顯示鐵濃度對Ppchd轉錄活性的影響。觀察到的發光的均值和s.e.m.顯示了pchD啟動子表現在沒有鐵添加的C-MS培養基中誘導，並且藉 由鐵添加阻抑，從而確認報告融合物的功能性。
圖26：顯示用Fc-融合分子(SEQ ID NO：136)的處理在存在各種量的補充鐵的情況下對Ppchd轉錄活性的影響。觀察到的發光的均值和s.e.m.顯示了啟動子活性在存在Fc-融合分子的情況下被消除，而不管補充鐵的量如何，而對照Fc-融合分子沒有效果。
圖27：顯示一定範圍的劑量的Fc-融合分子(SEQ ID NO：136)對在沒有鐵補充物的情況下測試的PpchD轉錄活性的影響。觀察到的發光的均值點和s.e.m.擬合於標準劑量響應曲線，並且對於Fc-融合分子產生0.03mg/mL的IC50值(95% CI：0.02-0.05)，而它對於同型對照Fc-融合分子未限定。
實例1：銅綠假單胞菌鐵載體的純化和生物素化
銅綠假單胞菌生成三組綠膿桿菌螢光素，即綠膿桿菌螢光素I型、綠膿桿菌螢光素II型和綠膿桿菌螢光素III型。每組具有在作為琥珀醯基、琥珀酸醯胺基或α-酮戊二醯基的側鏈上不同的三種形式。另外，銅綠假單胞菌生成綠膿桿菌螯鐵蛋白。所有10種鐵載體可以複合作為Fe3+的鐵。
為了選擇和篩選感興趣的突變蛋白，可以將鐵載體進行生物素化。對綠膿桿菌螢光素I琥珀醯基變體在琥珀醯基側鏈，對綠膿桿菌螢光素II琥珀醯基變體在L-鳥胺酸側鏈以及對綠膿桿菌螢光素III琥珀醯基變體主要在甘胺酸側鏈上進行生物素化。在酚環上生物素化綠膿桿菌螯鐵蛋白。
實例2：選擇特異性結合銅綠假單胞菌鐵載體的突變蛋白
使用藉由隨機誘變成熟hNGAL生成的基於hNGAL的文庫來選擇特異性結合銅綠假單胞菌的不同鐵載體的突變蛋白。在獨立的噬菌體展示和選擇過程中使用生物素化且加載有鐵的Pvd I琥珀醯基、Pvd II琥珀醯基和Pvd III琥珀醯基及生物素化的非加載有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白。
將2x1012個來自這些文庫的噬菌體與200nM或500nM或1μM生物素化的靶物一起溫育。使用用中性親合素或鏈黴親合素塗覆的順磁性珠捕捉靶物/噬菌體複合物，隨後，將其用磁體分離。藉由用PBST或PBS清洗珠除去未結合的噬菌體。首先，用300μl 70mM三乙胺洗脫結合的噬菌體10分鐘，接著用100μl 1M Tris-Cl pH 6.0立即中和上清液。在一次立即清洗循環後，用100mM甘胺酸pH2.2洗脫剩餘的噬菌體10分鐘，接著用50μl 0.5M Tris-堿立即中和。將這兩個洗脫級份合併，並且用於感染4ml大腸桿菌XL1-blue培養物(OD550 0.45-0.6)以進行再擴增。在攪拌下溫育30分鐘後，藉由以5000xg離心2分鐘收集細菌，在1ml 2xYT培養基中重懸，並且在三個大LB/Amp瓊脂板(10g/l細菌用胰蛋白腖，5g/l酵母提取物，5g/l NaCl，pH 7.5，15g/l瓊脂，100μg/ml氨苄青黴素)上鋪板。於32℃將板溫育過夜。使用50ml補充有100μg/ml氨苄青黴素的2xYT培養基(2xYT/Amp)從瓊脂板刮下經感染的細胞。用合適體積的細菌懸浮液接種50ml 2xYT/Amp培養基以達到0.08的OD550。於37℃在搖動器(160rpm)上溫育培養物，直到達到0.5的OD550，然後用輔助噬菌體(1.5x1011pfu)藉由於37℃在溫和攪拌的情況下溫育15分鐘且在搖動器上溫育45分鐘感染。隨後，將卡那黴素添加到終濃度70μg/ml以選擇被輔助噬菌體感染的細菌。最後，藉由添加25ng/ml無水四環素誘導pIII-hNGAL突變蛋白的表現。
在於24℃溫育15小時後，藉由離心(5000xg持續20分鐘)使培養物的上清液澄清。隨後，將20ml上清液藉由具有0.22μm孔徑的聚醚碸膜。對濾液添加5ml含有水中的20%(w/v)PEG-8000和15%(w/v)NaCl的溶液，並且溫和混合。在冰上溫育溶液30分鐘，之後於4℃和5000xg離心20分鐘。在含有200mM硼酸、160mM NaCl和1mM EDTA的1ml緩衝液中溶解含有噬 菌體的團粒。藉由離心(5000xg持續5分鐘)除去不溶性顆粒。將上清液轉移到新管，並且與含有水中的20%(w/v)PEG-8000和15%(w/v)NaCl的200μl溶液混合。在冰上溫育溶液30分鐘，隨後藉由離心(5000xg持續5分鐘)收集沉澱的噬菌體。在補充有50mM苯甲脒的PBS中重懸噬菌體，並且用於下一輪噬菌體選擇。
進行連續的4輪選擇。應用不同清洗條件：i)在所有4個選擇輪次中對於每個清洗步驟，8次與1ml PBS/T溫育5分鐘，ii)從輪次1至4增加的清洗循環的數目，iii)用5分鐘溫育清洗步驟改變快速清洗步驟，並且清洗步驟的數目逐輪增加。
從用第四次選擇輪次的輸出感染的大腸桿菌細胞中製備噬菌體，並且藉由用BstX1消化DNA，隨後使用標準方法(Sambrook等，(1989)Molecular cloning：a laboratory manual)經由瓊脂糖凝膠電泳純化分離hNGAL突變蛋白盒。將hNGAL突變蛋白盒插入同樣切割的載體，其容許在四環素啟動子的控制下的hNGAL突變蛋白的細菌生成。用連接混合物轉化CaCl2感受態TG1-F’細胞，並且在LB/Amp板上鋪板。
為了優化Pvd I、Pvd II、Pvd III和Pch特異性突變蛋白，基於突變蛋白SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和隨後SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：45產生別的文庫。使用選定位置的偏愛隨機化或基於易錯聚合酶鏈式反應(PCR)的方法產生文庫。突變蛋白的選擇如描述的那樣，但是以增加的嚴格性進行。
為了促進在真核細胞中表現，除去潛在的N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr)。
此外，引入突變以進一步優化穩定性。
實例3：使用高通量ELISA篩選鑑定特異性結合相應的銅綠假單胞菌鐵載體的突變蛋白
使用個別的菌落接種2xYT/Amp培養基，並且培養過夜(14-18h)至靜止期。隨後，從靜止期培養物中接種50μl 2xYT/Amp，並且於37℃溫育3h，然後轉變成22℃，直到達到0.6-0.8的OD595。藉由添加補充有1.2μg/ml無水四環素的10μl 2xYT/Amp誘導突變蛋白的生成。於22℃溫育培養物到翌日。在添加PBS/T中的40μl 5%(w/v)BSA並且於25℃溫育1h後，培養物準備好用於篩選測定法。
藉由在微量滴定板上於4℃塗覆中性親合素和鏈黴親合素(在PBS中的5μg/ml)的1：1混合物過夜測試分離的突變蛋白對相應的鐵載體靶物的特異性結合。在用PBST中的2% BSA封閉板1h後，在經塗覆的微量滴定板上以PBS/T中的1.5-2.5μg/ml的濃度捕獲用於選擇的相應的生物素化的鐵載體靶物。在篩選中使用用生物素化的醛固酮以相同的方式塗覆的板作為陰性對照靶物。隨後，將20μl經BSA封閉的培養物添加到含有捕獲的靶物或醛固酮的經塗覆的微量滴定板，並且於25℃溫育1h。在用與辣根過氧化物酶接合的抗T7抗體(Merck KgaA,Darmstadt)或與辣根過氧化物酶接合的抗-Strep標簽®抗體(IBA,Boettingen)溫育1h後檢測結合的突變蛋白。為了量化，添加20μl QuantaBlu螢光過氧化物底物，並且在320nm的激發波長和430nm的發射波長測定螢光。然後，對特異性結合相應鐵載體靶物的突變蛋白測序。
為了選擇具有增加的親和力的突變蛋白，並且如下進行穩定性篩選：i)降低的抗原濃度和/或ii)與未生物素化的靶物競爭和/或iii)在添加到目標板前於65℃或70℃溫育篩選上清液和/或iv)使用反向篩選形式，在用抗Strep標簽®抗體塗覆的微量滴定板上經由Strep標簽®捕捉突變蛋白，並且 添加不同濃度的生物素化的靶物，並且經由Extravidin-HRP(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)檢測。
實例4：突變蛋白的表現
在2YT-Amp培養基中在大腸桿菌中表現具有C端序列SAWSHPQFEK(SEQ ID NO：127；包括SA接頭和Strep-tag® II，WSHPQFEK(SEQ ID NO：128))的獨特突變蛋白以在表現後使用Streptactin親和層析純化突變蛋白，並且製備型大小排阻層析是適用的。
實例5：在基於ELISA的背景中測定的突變蛋白對可溶性銅綠假單胞菌鐵載體的親和力
藉由“溶液結合ELISA”測定突變蛋白的溶液結合，所述溶液結合ELISA的原理如下：將恒定濃度的測試突變蛋白與可變濃度的配體(Pvd I s、sa、aKG+/-Fe/Pvd II s、sa、aKG+/-Fe/Pvd III s、sa、aKG+/-Fe/Pch+/-Fe)一起溫育1h。在溶液中進行此預溫育後，將突變蛋白/配體混合物的等分試樣轉移到經由中性親合素固定化的生物素化的Pvd I s(+Fe)、Pvd II s(+Fe)、Pvd III s(+Fe)或Pch的ELISA板以測量游離突變蛋白的剩餘濃度。經由定量ELISA設置測定游離(非配體結合)突變蛋白的濃度。
詳細地，於4C以在PBS中的5μg/ml濃度用20μl中性親合素塗覆適合於螢光測量的384孔板(Greiner FLUOTRACTM 600，黑色平底，高結合)過夜。在清洗後，於室溫用100μl含有0,1% Tween 20和2% BSA的封閉緩衝液(PBS-T/BSA)封閉經中性親合素塗覆的孔1h。再次清洗後，於室溫添加1μg/mL濃度的封閉緩衝液中的20μl生物素化的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白達1h，並且除去過多的試劑。
在溶液中將固定濃度的突變蛋白與不同濃度的配體(Pvd I s、sa、aKG+/-Fe/Pvd II s、sa、aKG+/-Fe/Pvd III s、sa、aKG+/-Fe/Pch+/-Fe)(使用 合適的起始濃度，其以1：3比率在PBS-T/BSA中連續向下稀釋到皮莫耳範圍)一起溫育。於室溫溫育1h後，於RT將20μl反應混合物轉移到其上固定化有生物素化的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋的384孔板以捕捉未結合的(游離)突變蛋白達20分鐘。為了容許將ELISA讀出結果轉化成絕對游離突變蛋白濃度，在PBS-T/BSA中製備含有不同濃度的突變蛋白的標準曲線，並且也在相同的ELISA板上溫育20分鐘。
棄去殘留的上清液，並且以PBS-T/BSA中的預先確定的最佳濃度添加20μl經HRP標記的抗hNGAL抗體，並且於RT溫育1h。已經藉由用突變蛋白的混合物免疫兔獲得抗hNGAL抗體，隨後使用套組(EZ-link Plus Activated Peroxidase,Thermo Scientific)根據製造商的用法說明將抗hNGAL抗體與HRP偶聯以獲得抗體-HRP接合物。在清洗後，將20μl螢光HRP底物(QuantaBlu,Thermo)添加到每孔，並且容許反應進行15至60分鐘。使用螢光微板閱讀器(Tecan或Molecular Devices)讀出板上的每孔的螢光強度。為了評估數據，基於標準曲線結果計算游離的突變蛋白濃度c(突變蛋白)游離，並且相對於配體濃度c(配體)繪圖。為了獲得配體/突變蛋白複合物的形成被阻斷50%的配體濃度(IC50)，藉由用單位點結合模型的非線性回歸根據c(突變蛋白)游離=c(突變蛋白)tot/(1+c(配體)/IC50))擬合曲線，其中總共示蹤劑濃度c(突變蛋白)tot和IC50值為自由參數。使用GraphPad Prism 4軟件進行曲線擬合。
表1A-D中匯總了所得的IC50值。針對生物素化的且加載有鐵的Pvd I琥珀醯基、Pvd II琥珀醯基和Pvd III琥珀醯基選擇的突變蛋白分別結合相應Pvd組的所有亞型，即針對生物素化的且加載有鐵的Pvd I琥珀醯基選擇的突變蛋白以相似的親和力結合具有或沒有複合鐵離子的Pvd I琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基，針對生物素化的且加載有鐵的Pvd II琥珀 醯基選擇的突變蛋白以相似的親和力結合具有或沒有複合鐵離子的Pvd II琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基，並且針對生物素化的且加載有鐵的Pvd III琥珀醯基選擇的突變蛋白以相似的親和力結合具有或沒有複合鐵離子的Pvd III琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基。大多數選擇的突變蛋白以相當的親和力結合具有或沒有複合鐵離子的的相應組的所有亞型。
針對生物素化的非加載有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白的選擇導致優選結合非加載有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白的脂籠蛋白突變蛋白，諸如以二位數至三位數nM親和力結合加載有鐵的Pch和以弱親和力或根本不結合非加載有鐵的Pch的脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：56和57，和脂籠蛋白突變蛋白，諸如優選結合加載鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白的SEQ ID NO：55。
SEQ ID NO：56的親和力優化產生以改善的親和力結合非加載有鐵的Pch並且仍以無或弱親和力結合加載有鐵的Pch的脂籠蛋白突變蛋白，而SEQ ID NO：55的親和力優化產生以超過75倍改善的親和力結合非加載有鐵的Pch，而且還以單位數nM親和力結合加載有鐵的Pch的脂籠蛋白突變蛋白。
如此，藉由脂籠蛋白突變蛋白選擇和優化，實現了僅四種不同突變蛋白足以結合具有和沒有複合鐵離子的銅綠假單胞菌鐵載體的所有10種亞型(Pvd I s、sa、αKG+/-Fe；Pvd II s、sa、αKG+/-Fe；Pvd III s、sa、αKG+/-Fe；Pch+/-Fe)。
表1A：突變蛋白對溶液中的銅綠假單胞菌鐵載體綠膿桿菌螢光素I琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基+/-Fe3+的結合
表1C：突變蛋白對溶液中的銅綠假單胞菌鐵載體綠膿桿菌螢光素III琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基+/-Fe3+的結合
對於高通量親和力排序，然而以差異不大的配體濃度使用相同測定法。
實例6：Biacore中測定的突變蛋白結合銅綠假單胞菌鐵載體的親和力
在基於表面等離振子共振(SPR)的測定法中，使用Biacore T200儀(GE Healthcare)測量突變蛋白對具有複合鐵離子的綠膿桿菌螢光素I琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基或者對具有複合鐵離子的綠膿桿菌螢光素II 琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基或對具有複合鐵離子的綠膿桿菌螢光素III琥珀醯基、-琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基的結合親和力。應用適當過量的EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo,Cat# 21329)，接著使用Zeba Spin Desalting Plate(Thermo,Cat# 21329)根據製造商的用法說明分開非起反應的生物素，於室溫將在結合綠膿桿菌螢光素和陰性對照(SEQ ID NO：64)方面選擇的突變蛋白生物素化2h。
在SPR親和力測定法中，使用生物素捕捉套組(GE Healthcare)在傳感器芯片CAP上捕捉生物素化的突變蛋白和陰性對照：傳感器芯片CAP預先固定化有ssDNA寡聚物。以2μl/min的流速應用未稀釋的生物素捕捉試劑(與互補的ss-DNA寡聚物接合的鏈黴親合素)達300s。隨後，以5μl/min的流速應用1μg/ml至100μg/mL生物素化的突變蛋白或陰性對照300s。僅用生物素捕捉試劑加載參照通道。
為了測定結合親和力，在HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare)中應用範圍為5-2000nM的濃度的相應Pvd代表(Pvd I、II、III，包括琥珀醯基、琥珀酸醯胺基、-α-酮戊二醯基+Fe)的4至5個稀釋，並且應用到製備好的芯片表面，應用30μl/min的流速，以120-180s的樣品接觸時間和900-2400s的解離時間使用單個循環或多個循環動力學方法。使用高濃度(例如1200nM)的相應Pvd確認對陰性對照SEQ ID NO：64的結合的缺乏。在配體固定化後，為了使用單一循環動力學分析，在監測解離前，以上升次序連續應用Pvd的所有4-5個濃度。為了使用多循環動力學分析，應用Pvd的4個稀釋，各自接著解離階段。於25℃進行所有測量。藉由注射6M Gua-HCl及0.25M NaOH，接著是用運行緩衝液的額外清洗和120s的穩定期實現傳感器芯片CAP表面的再生。用Biacore T200評估軟件(V 1.0)評估數據。使用雙重參照。使用1：1結合模型來擬合原始數據。
表2A-C中匯總了用於選擇脂籠蛋白突變蛋白的所得動力學常數。可以對每個Pvd組生成脂籠蛋白突變蛋白，其以亞nM至較低的單位數nM範圍結合相應Pvd組的所有亞型。然而，Pvd特異性脂籠蛋白突變蛋白不結合野生型hNGAL Fe-腸菌素的天然配體。
另外，使用上文描述的測定法藉由對固定化突變蛋白應用高濃度(1μM)的下述分析物確認對不屬相應綠膿桿菌螢光素亞組(I、II、III)的各種鐵載體及對MMP-9的結合的缺乏：Fe-腸菌素、去鐵胺、綠膿桿菌螯鐵蛋白、來自相應的其它亞組的綠膿桿菌螢光素、MMP-9原形(proform)和活化的MMP-9。表3中提供了此分析的概述。
為了測定突變蛋白SEQ ID NO：62與Pch+Fe的相互作用的動力學常數和所得的KD，使用標準胺化學將突變蛋白或陰性對照SEQ ID NO：64在CM5芯片的表面上固定化。使用EDC和NHS活化芯片的表面。隨後，以10μl/min的流速應用10mM乙酸鹽pH 4.0中的5μg/mL突變蛋白或陰性對照溶液，直到實現約2000RU的高固定化水平。用乙醇胺淬滅殘留的活化基團。在乙醇胺後用EDC/NHS處理參照通道(空白固定化)。
為了測定親和力，在HBS-P+緩衝液中製備綠膿桿菌螯鐵蛋白(+Fe)的5個稀釋，並且應用到準備好的芯片表面。以接觸時間180s，解離時間1200-1800s並且應用30μl/min的流速進行結合測定法。於25℃進行測量。藉由三次連續注射10mM Gly-HCl pH 1.5(120s)，接著是用運行緩衝液的額外清洗和穩定期實現固定化突變蛋白表面的再生。用Biacore T200 Evaluation軟件(V 1.0)評估數據。使用雙重參照。使用1：1結合模型擬合原始數據。
表2D中顯示了SEQ ID NO：62所得的動力學常數。
使用相同測定法，藉由對固定化突變蛋白SEQ ID NO：62應用高濃度(1μM)下述分析物確認對來自綠膿桿菌螯鐵蛋白的鐵載體及對MMP-9的結合的缺乏：Fe-腸菌素、去鐵胺、綠膿桿菌螢光素、MMP-9原形和活化的MMP-9。表3中顯示了結果的概述。
表2D：綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性脂籠蛋白突變蛋白SEQ ID NO：62對 複合有Fe3+的綠膿桿菌螯鐵蛋白的動力學常數。
實例7：結合銅綠假單胞菌鐵載體的突變蛋白的功能性測試；抑制鐵攝取
為了測定活細菌中的功能性鐵攝取抑制，一定劑量範圍濃度的結合銅綠假單胞菌鐵載體的脂籠蛋白突變蛋白與Tris.HCl 50mM pH 8.0緩衝液中的100nM加載有放射性鐵的鐵載體溫育1小時，之後與96孔板中於595nm終濃度為OD=1的細菌一起溫育30分鐘。隨後，將細菌用細胞收穫器過濾藉由與5%的聚乙烯亞胺溶液預溫育的96孔板GF/B濾器，並且用Tris緩衝液清洗3次。在過濾和乾燥後，剛好在計數前在每個濾器中添加30μl閃爍體混合物。對於鐵加載綠膿桿菌螢光素，將鐵載體在200μM最終溶液中以4比1的綠膿桿菌螢光素與鐵的比率與Tris緩衝液中的55Fe-Cl3一起溫育15分 鐘。對於用放射性鐵加載綠膿桿菌螯鐵蛋白，將HCl 0.5N中的40μl 0.25mM的55FeCl3溶液添加到1mM的綠膿桿菌螯鐵蛋白的甲醇溶液。在15分鐘溫育時間後，添加940μl Tris HCl 50mM pH 8.0以獲得具有綠膿桿菌螯鐵蛋白與鐵之間的2比1比率的20μM 55Fe-Pch溶液。如下製備細菌：將接種有分離的選殖體的Mueller Hinton培養基中的10ml過夜培養物離心，並且在25ml琥珀酸鹽培養基中重懸清洗過的團粒，並且在搖動下溫育2小時。平行地，給20ml Mueller Hinton培養基接種5ml過夜培養物，並且在搖動下溫育2小時以用作背景鐵攝取水平。然後，離心25ml細菌培養物，並且用相應的培養基清洗，之後將團粒在Tris.HCL 50mM pH8.0緩衝液中重懸，並且測量595nm的OD以在測定法中具有OD=1的終濃度。
對每個濃度點計算摻入百分比，並且用內部軟件計算抑制。對於此計算，鐵攝取的最大水平基於沒有任何脂籠蛋白突變蛋白的基本琥珀酸鹽培養基中獲得的數值，並且在不表現鐵載體受體的豐富的Mueller Hinton培養基中獲得背景數值。
實例8：結合銅綠假單胞菌鐵載體的突變蛋白的功能性測試；生長抑制
藉由在具有透明底部的黑色96孔板中將補充有痕量元素溶液和0.1 mg/ml BSA的經Chelex處理的琥珀酸鹽培養基中的結合銅綠假單胞菌鐵載體的突變蛋白與在595nm稀釋為0.05的最終OD的MS細菌培養物一起溫育測定細菌生長抑制。於37℃將板溫育過夜，每20分鐘搖動，並且在來自Thermo Labsystem的IEMS閱讀器中於595nm讀出OD。生長抑制在圖4A中對Pvd I菌株和Pvd I特異性突變蛋白SEQ ID NO：16，在圖4B中對Pvd II菌株和Pvd II特異性突變蛋白SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：36，在圖4C中對Pvd III菌株和Pvd III特異性突變蛋白SEQ ID NO：53以及在圖4D中對依賴綠膿桿菌螯鐵蛋白攝取鐵以生長的Pvd I敲除(△pvdA)菌株和綠膿桿菌螯鐵蛋白特異性突變蛋白SEQ ID NO：62例示性顯示。對照是沒有脂籠蛋白突變蛋白情況下的細菌生長。
實例9：突變蛋白的穩定性評估
為了測定熔解溫度作為總體穩定性的一般指示，使用毛細管nanoDSC儀(CSC 6300,TA Instruments)以1℃/min掃描PBS(Gibco)中蛋白質濃度為1mg/ml的鐵載體特異性突變蛋白(SEQ ID NO：13-18；26，31-36；47-53；58-62)(25-100℃)。使用整合的Nano Analyze軟件從顯示的熱分析圖計算熔解溫度(Tm)。
下文表5A-D中列出了脂籠蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：13-18；26，31-36；47-53；58-62)的所得熔解溫度以及熔解的開始。對於所有Pvd組以及對於具有70℃的範圍中的Tm的pch脂籠蛋白突變蛋白，可以選擇範圍為68至74℃的針對每種Pvd類型和pch的最佳脂籠蛋白突變蛋白，指示良好的分子穩定性。
表5A：如藉由Pvd I特異性脂籠蛋白突變蛋白的nanoDSC測定的Tm和熔解的開始
為了評估貯存和冷凍/融化穩定性，將PBS中濃度1mg/ml的突變蛋白 於37℃溫育1周或者進行3個冷凍/融化循環。在定量ELISA背景中測量活性突變蛋白。在分析型大小排阻層析中測量單體蛋白質。表6中顯示了SEQ ID NO：16、36、53、62的例示性數據。
為了測定蛋白質活性，應用下述ELISA：於4℃用PBS中5μg/ml濃度的20μL中性親合素(Thermo Scientific)塗覆適合於螢光測量的384孔板(Greiner FLUOTRACTM 600，黑色平底，高結合)過夜。在清洗後，用100μl封閉緩衝液(含有0.1% v/v Tween-20的PBS中的2% w/v BSA)將經中性親合素塗覆的孔封閉1h。再次清洗後，添加封閉緩衝液中的1μg/ml濃度的20μl生物素化的且加載有鐵的綠膿桿菌螢光素I琥珀醯基、綠膿桿菌螢光素II琥珀醯基、綠膿桿菌螢光素III琥珀醯基或生物素化的綠膿桿菌螯鐵蛋白。清洗板，並且將20μl適當稀釋的蛋白質標準品，非強調(unstressed)參照樣品或強調(stressed)樣品轉移到ELISA板，並溫育。為了定量板結合的蛋白質，清洗ELISA板，棄去殘留的上清液，並且在封閉緩衝液中以預先確定的最佳濃度添加20μl經HRP標記的抗hNGAL抗體，並溫育。在清洗後，將20μl螢光HRP底物(QuantaBlu,Pierce)添加到每孔，並且容許反應進行20-30分鐘。使用螢光微板閱讀器(Tecan)閱讀孔上的每孔的螢光強度。
除了另有敘述，於室溫進行所有溫育步驟1h，並且在每個溫育步驟後，使用Biotek ELx405 select CW清洗器用100μl PBS-T緩衝液(PBS,0.05% Tween 20)將板清洗5次。
對於上文描述的ELISA，製備校正曲線，包括通常範圍為0.008-500ng/mL的11個稀釋，並且對每個樣品製備校正曲線的線性範圍內的三個不同的獨立稀釋。使用任選補充有1%人或鼠血漿的封閉緩衝液進行稀釋。
使用4參數邏輯(4PL)非線性回歸模型擬合校正曲線，並且用於計算測試樣品的活性蛋白濃度。相對於在相同濃度並且在相同基質中貯存的非強 調樣品參照測定的活性蛋白濃度。
以0.3mL/min的流速使用PBS(Gibco)作為洗脫劑，在具有成排的兩個Superdex 75 5/150 GL柱(GE Healthcare)的Agilent HPLC系統上進行分析大小排阻層析。
為了評估血漿中的貯存穩定性，於37℃在人、小鼠和大鼠血漿中溫育0.5mg/ml濃度的突變蛋白1周。在如描述的定量ELISA背景中測量活性突變蛋白。
證明了所有測試的脂籠蛋白突變蛋白在所有測試條件下是穩定的。
實例10：小鼠模型中的脂籠蛋白突變蛋白的體內效力
研究靜脈內(i.v.)投予後的SEQ ID NO：19在小鼠的銅綠假單胞菌誘導 的肺感染中的預防效果。
感染前1小時和感染時投予SEQ ID NO：19。在感染後24h評估肺細菌載量。
本研究中使用的菌株是銅綠假單胞菌(ATCC27853)。從於-80℃貯存於PBS/15%甘油中的銅綠假單胞菌開始，於37℃在搖動下在Mueller-Hinton培養基中進行過夜培養，並且接著進行額外的傳代培養(100μl過夜培養物+100ml MHB)，直到對數生長期結束。將培養物清洗兩次，並且在磷酸鹽緩衝液鹽水中重懸，之後以1E+09CFU/ml冷凍。對於每個實驗，融化新的管形瓶，並且藉由活菌計數確認接種物。
在使用前容許購自Janvier laboratories,(Route des chênes secs,53940 Le Genest Saint Ile,France)的7至8周齡雄性Swiss小鼠(5只動物/組)馴化至少5天。於22±2℃的溫度以40-70%的相對濕度和12-15空氣新鮮交換/小時維持動物。光週期12/12小時：光照7a.m.至7p.m.(正常週期)。連續記錄溫度和相對濕度偏差。每籠容納5只動物，並且容許它們任意獲得水和標準飲食(AO4 C標準飲食(SAFE))。所有實驗在得到Sanofi R&D(CEPAL)的倫理委員會批准下進行。
藉由用50μl NaCl 0.9%中的1.E+07CFU/小鼠的銅綠假單胞菌皮內攻擊雄性Swiss小鼠誘導肺感染。
在感染前1h和感染時藉由靜脈內推注投予200、400、1000或2000μg/小鼠濃度的SEQ ID NO：19。
感染後24小時，對動物實施安樂死，並且測定來自肺勻漿物的細菌計數，並且以log10CFU/ml表示為均值±sem。
使用SAS v9.2進行統計學分析。Excel軟件2003用於圖呈現。SEQ ID NO：19劑量與媒介物的比較用單因素方差分析，接著是Dunnett檢驗評估 (ZAR J.H.,«Biostatistical Analysis»,Prentice Hall International Editions,4ème édition,1999.；C.W.Dunnett,“A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control”,J.Amer.Statist.Assoc.,50(1955),pp.1096-1121,1955)。
在銅綠假單胞菌誘導的小鼠肺感染模型中，在細菌攻擊前1小時和當時投予SEQ ID NO：19，並且SEQ ID NO：19以劑量依賴性方式阻止小鼠中的感染形成。從200μg/小鼠開始，對SEQ ID NO：19觀察到顯著的預防效果，最大效果在2000μg/小鼠。
實例11：結晶
為了測定與Pvd-Fe複合的SEQID NO：31蛋白質的三維結構，應用下述方法。
在pET-24a質體中選殖圖6中描繪的蛋白質序列，並且以有N端標簽的6His-TEV蛋白酶識別位點構築體表現。
使用質體來轉化BL21(DE3)Star大腸桿菌細胞，並且將所得的選殖體在Overnight Express Instant TB培養基(Novagen)中接種，並且於18℃以200RPM攪拌溫育47小時後在最終OD600 4.7時收穫細胞。在含有500mM NaCl、10mM咪唑、1mM MgCl2、1mM TCEP、5%甘油和20mM Tris pH7.4的緩衝液中重懸細胞團粒，並且藉由標準超聲處理方法裂解該細胞團粒。藉由低速度離心使所得的提取物澄清，並且將上清液過濾藉由22nm膜，之後加載到用100mM NaCl、10mM咪唑、100mM HEPES pH 8緩衝液預先平衡的Ni NTA(Qiagen)5ml柱。藉由咪唑10mM至300mM的線性梯度洗脫蛋白質，並且進一步過夜透析到100mM NaCl、10mM咪唑、100mM HEPES pH 8緩衝液。將蛋白質濃縮到20mg/ml，並且加載到凝膠過濾Superdex 75柱(GE)。在存在TEV蛋白酶(1/50比率)的情況下將所得的蛋白 質過夜透析到100mM NaCl、10mM HEPES pH 8緩衝液以除去6His N-端標簽，接著進行如上文描述的負Ni NTA純化步驟以分開經切割的蛋白質。將最終的蛋白質在100mM NaCl,50mM HEPES pH 7.5中濃縮到12mg/ml，等分取樣，在液氮中速凍，並且於-80℃貯存以進一步使用。
對於結晶，將蛋白質與高10x倍的莫耳濃度的Pvd-Fe一起溫育過夜，並且鋪板以在SBS形式板中進行結晶篩選，其中在蒸汽擴散坐滴形式實驗中於20℃和4℃混合100nL蛋白質液滴與100nL結晶篩選溶液。檢出許多結晶命中，並且進一步優化結晶條件以獲得完全衍射x-射線質量晶體。
使用同步加速器x-射線源評估晶體衍射質量，並且在20% PEG3350和0.2M LiSO4條件下於20℃獲得最佳衍射晶體。藉由將PEG3350濃度提高到35%低溫保護最佳晶體，然後在液氮中速凍，並且在100K溫度收集1.8Å數據集。
藉由MOSFLM處理X-射線數據，並且藉由使用pdb 1LKE作為搜索工具的分子替換方法測定蛋白質結構，並且將結構模型進一步精修到P41212中的R自由=0.233-R=0.200質量，每個不對稱單元具有2個三重蛋白質複合物。
蛋白質結構呈現具有與不對稱單元中存在的兩個突變蛋白蛋白質結合的Pvd-Fe的經典脂籠蛋白支架，圖7。圖8中分析並呈現了參與Pvd-Fe結合的胺基酸殘基。圖9中鑑定並呈現了直接結合Fe的Pvd的氧。
實例12：融合分子構築體的生成
藉由基因合成遺傳融合4個單一脂籠蛋白突變蛋白以形成融合分子(參見圖10A)。藉由接頭，如(G4S)2將脂籠蛋白突變蛋白彼此分開，除去潛在的N-糖基化位點(N-X-S/T)，並且隨後將所得的構築體亞選殖到附加體表現載體pXL(由Durocher等(2002),Nucl.Acids Res.30(2)描述的pTT載體的類 似物)中。藉由遺傳融合SEQ ID NO：36、16、53和62的脂籠蛋白突變蛋白產生SEQ ID NO：134的融合分子。藉由遺傳融合SEQ ID NO：34、17、50和63的脂籠蛋白突變蛋白產生SEQ ID NO：135的融合分子。
藉由將以(G4S)2接頭分開的4個單一脂籠蛋白突變蛋白與人IgG4的Fc域(SEQ ID NO：140)融合產生所謂的Fc-融合分子構築體。藉由將以(G4S)2接頭分開的SEQ ID NO：36、16、53和62的脂籠蛋白突變蛋白與人IgG4 Fc域(SEQ ID NO：140)的N端遺傳融合產生SEQ ID NO：136。藉由將以(G4S)2接頭分開的SEQ ID NO：34、17、50和63的脂籠蛋白突變蛋白與人IgG4 Fc域(SEQ ID NO：140)的N端遺傳融合產生SEQ ID NO：137。藉由將以(G4S)2接頭分開的SEQ ID NO：34、17、50和63的脂籠蛋白突變蛋白與人IgG4 Fc域(SEQ ID NO：140)的C端遺傳融合產生SEQ ID NO：138。藉由將以(G4S)2接頭分開的SEQ ID NO：34和17的脂籠蛋白突變蛋白與人IgG4 Fc域(SEQ ID NO：140)的N端和將以(G4S)2接頭分開的SEQ ID NO：50和63的脂籠蛋白突變蛋白與人IgG4 Fc域(SEQ ID NO：140)的C端遺傳融合產生SEQ ID NO：139。圖10B至D中顯示了這些Fc-融合分子構築體的總體結構。
別的例示性融合分子構築體是SEQ ID NO：143至186的構築體。
注意到序列表中的突變蛋白和融合蛋白構築體使用的內部參照與參照序列，即野生型hNGAL的序列(例如SEQ ID NO：1)相比不一定反映突變或所有突變。可以藉由比較突變蛋白/融合分子序列與參照序列容易地確定實際的突變。
實例13：融合分子構築體的表現和質量控制
在大腸桿菌中增殖用於轉染的表現質體，並且使用來自Qiagen的EndoFree Mega套組製備。藉由在來自Life Technologies的FreeStyle F17表現培養基中生長的HEK293細胞的瞬時轉染生成融合分子。於37℃在Kuehner ISF1-X培養箱搖動器中以110rpm在8% CO2的情況下培養細胞。在轉染後6至7天藉由以4500g離心20分鐘除去細胞。經由0.2μm膜過濾上清液以除去剩餘的顆粒。
藉由在來自GE Healthcare的HisTrap柱上的親和層析純化加有His標簽的蛋白質。為了避免非特異性結合，在捕捉捕捉前添加20mM咪唑。用MES緩衝液(50mM MES,1M NaCl,pH 6.5)和Tris緩衝液(50mM Tris,50mM NaCl pH 8)清洗蛋白質，並且用直至Tris緩衝液中的500mM咪唑(imidamidazol)的梯度洗脫。
藉由在來自GE Healthcare的HiTrap蛋白A柱上的親和層析純化FC變體。用PBS緩衝液(Life Technologies)清洗蛋白質，接著用100mM檸檬酸鹽緩衝液pH3洗脫，並且用Tris緩衝液pH 9中和。加有His標簽的蛋白質和FC變體的精製(polishing)步驟由用PBS(Life Technologies)使用Superdex 200(GE Healthcare)的大小排阻層析(SEC)組成。在藉由超濾濃縮後，將融合分子無菌過濾(0.2μm)，等分取樣，並且於-80℃貯存。藉由測量280nm的吸光度測定蛋白質濃度。
藉由分析SEC、SDS-PAGE(參見圖11)和質譜術完成進一步的質量控制。使用裝備有TSKgel3000SWXL(7.8x300mm,Tosoh)及保護柱(7.8x50mm,Tosoh)或MabPac SEC-1柱(4x300mm,Thermo)和MabPac SEC-1保護柱(4x50mm,Thermo Fisher)的BioSECcurity HPLC(PSS)進行分析SEC。在以280nm和260nm檢測的情況下使用250mM NaCl，100mM磷酸鈉pH 6.7以1ml/min(對於TSKgel柱)或0.25ml/min(對於MabPac柱)運行分析。將5μg蛋白質(為D-PBS中的1mg/ml)應用到柱上。為了評估分子大小，使用凝膠過濾標準混合物(凝膠過濾套組MWGF-1000，SIGMA Aldrich和蛋白質套組，PSS)校準柱。使用WinGPC軟件v5.11(PSS)進行數據評 估。下文表7中顯示了一個融合分子和一個Fc-融合分子構築體的結果。
使用裝備有雙重ESI離子源的6540 UHD Accurate Mass Q-TOF LC-MS系統(Agilent)進行準確質量分析。在陽離子模式中以延伸的質量範圍(2GHz)完成測量。在D-PBS中將樣品稀釋到0.5mg/ml的濃度。為了測量被還原的樣品，添加10mM TCEP。在將250個單位的PNGaseF(NEB)添加到12.5μg蛋白質並且在37℃溫育18小時後用D-PBS中的0.5mg/ml的樣品完成天然條件下的去糖基化。將2μg蛋白質應用到於40℃運行的具有保護柱(Narrow bore Poroshell 300SB-C8,2.1x12.5mm,5μm,Agilent)的Poroshell 300SB-C8柱(0.5x75mm,5μm,Agilent)上。洗脫液A是具有0.1%甲酸的LC水；洗脫液B是具有0.1%甲酸的90%乙腈。用在7分鐘中從5% B至100% B的線性梯度和180μl/min的流速實現分離。使用MassHunter定性分析軟件第B.06版完成數據處理和分析。下文表8中顯示了一個融合分子和一個Fc-融合分子構築體的結果。
實例14：單一脂籠蛋白突變蛋白的表現
在大腸桿菌中增殖用於轉染的表現質體，並且使用來自Qiagen的EndoFree Mega套組製備。藉由在來自Life Technologies的FreeStyle F17表現培養基中生長的HEK293細胞的瞬時轉染生成脂籠蛋白突變蛋白。於37℃在Kuehner ISF1-X培養箱搖動器中以110rpm在8% CO2的情況下培養細胞。在轉染後6至7天藉由以4500g離心20分鐘除去細胞。經由0.2μm膜過濾上清液以除去剩餘的顆粒。藉由在來自GE Healthcare的HisTrap柱上的親和層析純化加有His標簽的蛋白質。為了避免非特異性結合，在捕捉步驟前添加20mM咪唑。用MES緩衝液(50mM MES,1M NaCl,pH 6.5)和Tris緩衝液(50mM Tris,50mM NaCl pH 8)清洗蛋白質，並且用直至Tris緩衝液中的500mM咪唑的梯度洗脫。拋光步驟由用PBS(Life Technologies)使用Superdex 75(GE Healthcare)的大小排阻層析(SEC)組成。在藉由超濾濃縮後，將蛋白質無菌過濾(0.2μm)，等分取樣，並且於-80℃貯存。藉由測量280nm的吸光度測定蛋白質濃度。藉由分析SEC、SDS-PAGE和質譜術完成進一步的質量控制。
實例15：融合分子的穩定性評估
為了測定熔解溫度作為總體穩定性的一般指標，以PBS(Gibco)中的1mg/ml蛋白質濃度使用SEQ ID NO：134的鐵載體特異性融合分子和單一脂籠蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：16、36、53和62)，並且使用毛細管nanoDSC儀(CSC 6300,TA Instruments)以1℃/min的增量在25-100℃的溫度範圍中掃描。使用集成Nano Analyze軟件從展示的熱分析圖計算熔解溫度(Tm)。下文表9中列出了所得的熔解溫度及熔解的開始。
熔解的開始對於單一脂籠蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：16、36、53和62)為61-67℃，並且對於融合分子(SEQ ID NO：134)為57℃。熔解溫度對於單一脂籠蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：16、36、53和62)為66-76℃，並且對於融合分子(SEQ ID NO：134)為64/66℃。雖然與單一脂籠蛋白突變蛋白相比，熔解的開始和熔解溫度對於融合分子略低，但是它在融合分子和單一脂籠蛋白突變蛋白之間是相當的，並且指示蛋白質的良好穩定性。
為了評估貯存和冷凍/融化穩定性，將PBS中的1mg/ml濃度的SEQ ID NO：134的融合分子或SEQ ID NO：136的Fc-融合分子在37℃或42℃溫育1周或者經歷三個冷凍/融化循環。在定量ECL測定背景中測量活性融合分子濃度。採用如實例8中描述的三種不同同時結合形式來檢查同時結合每種綠膿桿菌螢光素(I、II和III)和綠膿桿菌螯鐵蛋白的能力。在分析大小排阻層析中測量單體蛋白質的峰面積。
對於如實例9中描述的定量ECL-測定法，製備包括通常範圍為0.1+5000ng/mL的11個稀釋度的校正曲線，並且對於每個樣品，製備在校正曲線的線性範圍內的三個不同的獨立稀釋度。使用任選補充有1%人血漿的封閉緩衝液進行稀釋。使用4參數邏輯斯諦(4PL)非線性回歸模型擬合校正曲線，並且用於計算測試樣品的活性蛋白質濃度。相對於在相同濃度並且在相同基質中貯存的非應激樣品(unstressed sample)參照測定的活性蛋白質濃度。
以0.3mL/min的流速使用PBS(Gibco)作為洗脫液在具有成行的兩個Superdex 75 5/150 GL柱(GE Healthcare)的Agilent HPLC系統上進行分析大 小排阻層析。使用WinGPC Unichrom GPC/SEC軟件(PSS：Polymer Standards Service-USA Inc.)計算應激樣品和非應激參照的單體峰面積。以回收率=單體峰面積樣品/單體峰面積參照計算單體峰面積的回收率。為了評估血漿中的貯存穩定性，將0.5mg/ml濃度的融合分子和Fc-融合分子在人血漿中於37℃溫育1周。在如上文描述的定量ECL測定背景中測量活性融合分子的濃度。
下文表10中顯示了SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：136的構築體的數據。融合分子和Fc-融合分子構築體在所有測試條件下展現出高穩定性。
實例16：在基於ELISA的背景中測定的融合分子對銅綠假單胞菌鐵載體的親和力
藉由“溶液結合ELISA”測定個別的突變蛋白、融合分子或Fc-融合分子的溶液結合，所述溶液結合ELISA的原理如下：將恒定濃度的測試的個別突變蛋白或融合分子構築體與各個濃度的配體(Pvd I s、sa、aKG+/-Fe/Pvd II s、sa、aKG+/-Fe/Pvd III s、sa、aKG+/-Fe/Pch+/-Fe)一起溫育1小時。在溶液中的此預溫育後，將突變蛋白/配體混合物的等分試樣轉移到具有經由中性親合素固定化的生物素化的Pvd I s(+Fe)、Pvd II s(+Fe)、Pvd III s(+Fe)或Pch的ELISA板以測量剩餘濃度的游離的突變蛋白或融合分子構築體。經由定量ELISA設置測定游離的(非配體結合的)突變蛋白或融合分子構築體的濃度。
詳細地，於4℃用20μl在PBS中的5μg/ml濃度的中性親合素塗覆適合於螢光測量的384孔板(Greiner FLUOTRACTM 600，黑色平底，高結合)過夜。在清洗後，在室溫用100μl含有0.1% Tween 20和2% BSA的封閉緩衝液(PBS-T/BSA)封閉經中性親合素塗覆的孔達1小時。再次清洗後，在室溫添加20μl在封閉緩衝液中的濃度1μg/mL的生物素化的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白達1小時，並且除去過量的試劑。將固定濃度的突變蛋白或融合分子構築體與使用合適的起始濃度的不同濃度的配體(Pvd I s、sa、aKG+/-Fe/Pvd II s、sa、aKG+/-Fe/Pvd III s、sa、aKG+/-Fe/Pch+/-Fe)在溶液中一起溫育，所述合適的起始濃度以1：3比率在PBS-T/BSA中連續向下稀釋到微微莫耳濃度範圍。在室溫溫育1小時後，將20μl反應混合物轉移到384孔板，所述384孔板上固定化生物素化的綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白以在RT捕捉未結合的(游離的)突變蛋白或融合分子構築體達20分鐘。為了允許將ELISA讀出結果轉化為絕對游離突變蛋白/融合分子構 築體濃度，在PBS-T/BSA中製備含有不同濃度的突變蛋白/融合分子構築體的標準曲線，並且也在相同ELISA板上溫育20分鐘。
棄去殘留的上清液，並且以PBS-T/BSA中的預先確定的最佳濃度添加20μl經HRP標記的抗hNGAL抗體，並且在RT溫育1小時。已經藉由用突變蛋白的混合物免疫兔獲得抗hNGAL抗體，隨後使用套組(EZ-link Plus Activated Peroxidase,Thermo Scientific)根據製造商的用法說明與HRP偶聯，以獲得抗體-HRP接合物。在清洗後，對每個孔添加20μl螢光HRP底物(QuantaBlu,Thermo)，並且允許反應進行15至60分鐘。使用螢光微板讀板儀(Tecan或Molecular Devices)讀取板上的每個孔的螢光強度。為了評估數據，游離的突變蛋白或融合分子構築體濃度，c(突變蛋白/融合分子)游離基於標準曲線結果計算，並且相對於配體濃度，c(配體)繪圖。藉由用單一位點結合模型的非線性回歸擬合IC50值。使用GraphPad Prism 4軟件進行曲線擬合。
表11中匯總了所得的IC50值。融合分子和Fc-融合分子與個別的突變蛋白以實際上相同的親和力結合所有相應的鐵載體。
表11：融合分子、具有與Fc域的N端融合的脂籠蛋白突變蛋白的Fc-融合分子蛋白、和單一脂籠蛋白突變蛋白對溶液中的靶物的結合。使用追蹤濃度的0.1nM脂籠蛋白突變蛋白或融合分子(對於SEQ ID NO：16為0.2nM)，因此，測定法靈敏性不受限制。Pvdx：Pvd I、Pvd II、Pvd III。
融合分子和Fc-融合分子構築體以subnM或2nM範圍中的IC50值結合Pvd靶物，以IC50<10nM結合加載有鐵的Pch，並且以IC50<50nM結合沒有鐵的Pch，這與相應的單一脂籠蛋白突變蛋白的IC50值相當，如對Pvdx s(+Fe)和綠膿桿菌螯鐵蛋白(+/-Fe)例示性顯示，證明了個別脂籠蛋白突變蛋白的結合效力在融合分子形式中完全保持。
實例17：在基於ELISA的背景中測定的不同融合分子形式的結合效力的比較
在與實例5中描述的測定法相當的溶液結合測定法中測試與含有的個別的脂籠蛋白突變蛋白(SEQ ID NO：34、17、50和63)相比SEQ ID NO：137、138和139的Fc-融合分子構築體(參見實例1和圖10B、C和D)對溶液中的相應的鐵載體組(Pvd Is(+Fe)、Pvd IIs(+Fe)、Pvd IIIs(+Fe)和Pch)的結合。
如表12和圖12中顯示，對於個別的脂籠蛋白突變蛋白和不同的Fc-融合分子形式，所得的IC50值是相當的。
表12：Fc-融合分子蛋白和單一脂籠蛋白突變蛋白對溶液中的相應靶物的結合。使用示蹤濃度的0.1nM或0.2nM Fc-融合分子或脂籠蛋白突變蛋白，因此，測定法靈敏性不受限制。使用Pvd I、Pvd II和Pvd III的加載有鐵的琥珀醯基變體作為相應綠膿桿菌螢光素組的代表。
實例18：在Biacore測定法中測定的融合分子結合銅綠假單胞菌鐵載體的親和力
在基於表面等離振子共振(SPR)的測定法中，使用Biacore T200儀器(GE Healthcare)測量個別的突變蛋白或融合分子對綠膿桿菌螢光素鐵載體(對具有複合鐵離子的綠膿桿菌螢光素I琥珀醯基、-琥珀酸醯胺、-α-酮戊二醯或對具有複合鐵離子的綠膿桿菌螢光素II琥珀醯基、-琥珀酸醯胺、-α-酮戊二醯或對具有複合鐵離子的綠膿桿菌螢光素III琥珀醯基、-琥珀酸醯胺、-α-酮戊二醯)的結合親和力。為此，應用適當過量的EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo,Cat# 21329)，在室溫將為了結合綠膿桿菌螢光素選擇的突變蛋白(SEQ ID NO：16、36、53)、融合分子(SEQ ID NO：134)和陰性對照(SEQ ID NO：64)生物素化2小時，接著使用Zeba旋轉脫鹽板(Thermo,Cat# 21329)根據製造商的用法說明分離未反應的生物素。
在SPR親和測定法中，使用Biotin CAPture套組(GE Healthcare)在傳感器芯片CAP上捕捉生物素化的突變蛋白和陰性對照，其中傳感器芯片CAP預先固定化有ssDNA寡聚物。以2μl/min的流速應用未稀釋的生物素CAPture試劑(與互補的ss-DNA寡聚物接合的鏈黴親合素)達300s。隨後，以5μl/min的流速應用20μg/ml至100μg/mL生物素化的突變蛋白或融合分子陰性對照達300s。僅用生物素CAPture試劑加載參照通道。為了測定結合親和力，在HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare)中製備相應的Pvd的4個稀釋，並且應用於芯片表面。應用30μl/min的流速，以180s的樣品接觸時間 和1800-2400s的解離時間使用單一循環動力學方法。使用高濃度1200nM的相應Pvd確認對SEQ ID NO：64陰性對照結合的缺乏。在配體固定化後，在監測解離前以升序連續應用4個濃度的Pvd。在25℃進行所有測量。用6M Gua-HCl及0.25M NaOH的注射實現傳感器芯片表面的再生，接著是用運行緩衝液的額外清洗和120s的穩定期。用Biacore T200評估軟件(V 1.0)評估數據。進行雙重參照。使用1：1結合模型擬合原始數據。另外，藉由將高濃度(1μM)的以下分析物應用於固定化融合分子使用上文描述的測定法確認對不由銅綠假單胞菌生成的各種鐵載體和對MMP-9的結合的缺乏：Fe-腸菌素、去鐵胺、MMP-9原形和活化的MMP-9。
用於測定脂籠蛋白突變蛋白對綠膿桿菌螯鐵蛋白的親和力的Biacore分析
為了測定突變蛋白SEQ ID NO：62與pch+Fe的相互作用的動力學常數和所得的KD，使用標準胺化學將突變蛋白或陰性對照(SEQ ID NO：64)固定化到CM5芯片的表面：使用EDC和NHS活化芯片的表面。隨後，以10μl/min的流速應用10mM乙酸鹽pH 4.0中的5μg/mL突變蛋白或陰性對照溶液，直至達到約2000RU的高固定化水平。用乙醇胺淬滅殘留的活化基團。在乙醇胺後用EDC/NHS處理參照通道(空白固定化)。為了測定親和力，在HBS-P+緩衝液中製備綠膿桿菌螯鐵蛋白(+/-Fe)的4至5個稀釋，並且應用於準備好的芯片表面。以180s的接觸時間，1500-1800s的解離時間並且應用30μl/min的流速實施結合測定法。在25℃進行測量。藉由連續三次注射10mM Gly-HCl pH 1.5(120s)實現固定化的突變蛋白表面的再生，接著是用運行緩衝液的額外清洗和穩定期。用Biacore T200評估軟件(V 1.0)評估數據。進行雙重參照。使用1：1結合模型擬合原始數據。使用相同測定法，藉由將高濃度(1μM)的以下分析物應用於固定化的SEQ ID NO：62的 突變蛋白確認對與綠膿桿菌螯鐵蛋白不同的鐵載體和對MMP-9的結合的缺乏：Fe-腸菌素、去鐵胺、綠膿桿菌螢光素、MMP-9原形和活化的MMP-9。
用於檢測融合分子對綠膿桿菌螯鐵蛋白的結合的Biacore分析。
使用Series S傳感器芯片NTA和NTA試劑套組(都是GE Healthcare)在基於SPR的測定法中清楚證明了綠膿桿菌螯鐵蛋白對捕獲的SEQ ID NO：134融合分子的特異性結合。經由加載有Ni2+的NTA捕捉加有His的融合分子(SEQ ID NO：134)和加有His標簽的脂籠蛋白突變蛋白(結合Pvd II的SEQ ID NO：16和結合PvdII的SEQ ID NO：53，兩者都用作陰性對照)。使用綠膿桿菌螯鐵蛋白作為分析物。雖然綠膿桿菌螯鐵蛋白(+/-Fe)的結合明顯可檢出，並且傳感圖與綠膿桿菌螯鐵蛋白對共價固定化突變蛋白SEQ ID NO：62的結合是相當可比的，但是由於製備的表面的不穩定性(捕獲的融合分子從鎳-NTA芯片解離)而不能測定動力學常數。
下文表13中匯總了融合分子和相應的單一脂籠蛋白突變蛋白的不同Biacore分析的結果。
在針對Pvd I s+Fe、Pvd II s+Fe和Pvd III s+Fe的融合分子和脂籠蛋白突變蛋白的Biacore測定法中測量的親和力是相當的。針對所有Pvd亞型的 SEQ ID NO：134融合分子的Biacore中測量的親和力在亞納莫耳至單數位納莫耳範圍中，並且也與實例5中描述的溶液結合ELISA中測定的IC50值相當。此外，對具有和沒有結合鐵的綠膿桿菌螢光素靶物的結合親和力是相似的。SEQ ID NO：134融合分子對綠膿桿菌螯鐵蛋白的結合在經由Ni-NTA捕捉加有His標簽的SEQ ID NO：134融合分子的Biacore測定法中可檢出，但是由於高漂移，不能測定準確的KD。設立SPR測定法以檢測對小有機靶物，如綠膿桿菌螯鐵蛋白的結合的考驗並不是預料不到的。特異性評估確認SEQ ID NO：134的融合分子和SEQ ID NO：16、36、53和62的單一脂籠蛋白突變蛋白特異性結合其靶物而不結合其它鐵載體，即Fe-腸菌素和去鐵胺或MMP-9蛋白。用作Fe-腸菌素陽性對照的SEQ ID NO：1和64的脂籠蛋白突變蛋白顯示對用作MMP-9陽性對照的天然配體Fe-腸菌素和MMP-9特異性抗體的結合，顯示對MMP-9的結合。SEQ ID NO：64沒有顯示對綠膿桿菌螢光素或綠膿桿菌螯鐵蛋白的結合(數據未顯示)。
實例19：融合分子對綠膿桿菌螢光素和綠膿桿菌螯鐵蛋白的同時結合
在Meso Scale發現(MSD)平臺上進行的電化學發光(ECL)測定法中顯示了融合分子(SEQ ID NO：134)一次對相應的4種相應的靶物組的兩種代表性靶物(綠膿桿菌螢光素I琥珀醯基(+Fe)和綠膿桿菌螯鐵蛋白、綠膿桿菌螢光素II琥珀醯基(+Fe)和綠膿桿菌螯鐵蛋白或綠膿桿菌螢光素III琥珀醯基(+Fe)和綠膿桿菌螯鐵蛋白)的同時結合。簡言之，經由中性親合素在MSD板上捕獲相應的生物素化的綠膿桿菌螢光素，並且添加可變濃度的融合分子。用經Sulfo-tag標記的綠膿桿菌螯鐵蛋白檢測結合的融合分子。
除非另有規定，在室溫在以300rpm搖動的情況下將所有溫育步驟進行1小時，並且在每個溫育步驟後使用Biotek ELx405 Select CW清洗器用80 μL PBST緩衝液(PBS pH7.4,0.05% Tween 20)清洗板5次。測定緩衝液是PBST/BSA(PBS pH7.4,0.1% Tween 20,2% BSA)。在4℃用PBS中的5μg/mL濃度的20μL中性親合素塗覆384孔MSD板(L25XA,Meso Scale Discovery)過夜。在清洗後，用60μL封閉緩衝液(PBST/BSA)封閉經塗覆的孔，並且添加0.2μg/mL濃度的生物素化的綠膿桿菌螢光素，並且在進一步清洗步驟後溫育。將融合分子的濃度調節到5μg/mL，然後以1：3比率在PBS-T/BSA中連續稀釋溶液。將20μL體積的稀釋液轉移到384孔板，並且允許結合1小時。在溫育後，棄去殘留的上清液，並且添加20μL在PBS-T/BSA中的0.1μg/mL的經Sulfo-tag標記的綠膿桿菌螯鐵蛋白，並且溫育1小時。在清洗後，添加35μL具有表面活性劑(R92TC,Meso Scale Discovery)的2x濃縮的MSD讀取緩衝液T，並且在15分鐘內在Sector Imager 2400讀取器(MSD)上測量板。相對於融合分子濃度繪圖ECL信號，並且使用Prism Graphpad 5中的單一位點結合模型擬合。對於結合親和力，所得的EC50值不是代表性的。
可以檢出融合分子對相應綠膿桿菌螢光素類型的代表(Pvd I s(+Fe)、Pvd II s(+Fe)和Pvd III s(+Fe))中的每個和綠膿桿菌螯鐵蛋白的同時結合。圖13中顯示了所得的結合曲線。
實例20：融合分子對銅綠假單胞菌鐵載體的結合的功能測試：抑制鐵攝取
為了測定活細菌中的功能性鐵攝取抑制，將劑量範圍濃度的SEQ ID NO：134融合分子與Tris-HCl 50mM pH 8.0緩衝液中的100nM加載有放射性鐵的鐵載體一起溫育1小時，之後在96孔板中與595nm終濃度OD=1的細菌一起溫育30分鐘。隨後，用細胞採集器將細菌過濾流過用5%聚乙烯亞胺溶液預溫育的96孔板GF/B濾器，並且用5% BSA溶液清洗3次。在過濾和乾燥 後，在計數前在每個濾器孔中添加30μl閃爍混合物。對加載有鐵的綠膿桿菌螢光素，以在200μM最終溶液中的4比1比率的綠膿桿菌螢光素和鐵將鐵載體與Tris緩衝液中的55Fe-Cl3一起溫育15分鐘。為了給綠膿桿菌螯鐵蛋白加載放射性鐵，將40μl在HCl 0.5N中的0.25mM 55FeCl3溶液添加到1mM的綠膿桿菌螯鐵蛋白的甲醇溶液。在15分鐘溫育時間後，添加940μl Tris HCl 50mM pH 8.0以獲得具有綠膿桿菌螯鐵蛋白和鐵之間的2比1比率的20μM 55Fe-Pch溶液。如下製備細菌：將10ml與分離的選殖體一起溫育的Mueller Hinton培養基中的過夜培養物離心，並且將清洗過的團粒在25ml琥珀酸鹽培養基中重懸，並且在搖動下溫育2小時。平行地，給20ml Mueller Hinton培養基接種5ml過夜培養物，並且在搖動下溫育2小時以用作背景鐵攝取水平。然後，離心25ml細菌培養物，並且用相應的培養基清洗，之後將團粒在Tris.HCL 50mM pH8.0緩衝液中重懸，並且測量595nm的OD以在測定法中具有OD=1的終濃度。對每個濃度點計算摻入百分比，並且用內部軟件計算抑制。對於此計算，鐵攝取的最大水平基於沒有任何融合分子的基本琥珀酸鹽培養基中獲得的數值，並且在不表現鐵載體受體的豐富的Mueller Hinton培養基中獲得背景數值。
融合分子在活細胞中有效阻斷鐵攝取(參見表14和表15)。它與單一脂籠蛋白突變蛋白顯示相當的對鐵攝取的抑制，並且IC50數值在100-200nM範圍中(表14)。單一脂籠蛋白突變蛋白僅可以阻斷表現相應綠膿桿菌螢光素組的銅綠假單胞菌菌株的鐵攝取，即SEQ ID NO：16僅可以阻斷表現組I的綠膿桿菌螢光素的銅綠假單胞菌菌株中的鐵攝取，SEQ ID NO：36僅可以阻斷表現組II的綠膿桿菌螢光素的銅綠假單胞菌菌株中的鐵攝取，並且SEQ ID NO：53僅可以阻斷表現組III的綠膿桿菌螢光素的銅綠假單胞菌菌株中的鐵攝取。SEQ ID NO：62僅可以阻斷由綠膿桿菌螯鐵蛋白介導的銅 綠假單胞菌菌株中的鐵攝取。然而，融合分子蛋白質可以阻斷所有銅綠假單胞菌菌株中的鐵攝取，即SEQ ID NO：134可以阻斷Pvd I、II和III表現菌株中的鐵攝取以及由綠膿桿菌螯鐵蛋白介導的鐵攝取。
實例21：融合分子對銅綠假單胞菌鐵載體的結合的功能測試：生長抑制
藉由在具有透明底部的黑色96孔板中將補充有痕量元素溶液和0.1mg/ml BSA的經Chelex處理的琥珀酸鹽培養基中的結合銅綠假單胞菌鐵載體的SEQ ID NO：134融合分子與以595nm的最終OD為0.05稀釋的MS細菌培養物一起溫育測定細菌生長抑制。於37℃將板溫育過夜，每20分鐘搖動，並且在來自Thermo Labsystem的IEMS讀取器MF中在595nm讀取OD。
在圖14A至D中，對不同綠膿桿菌螢光素類型銅綠假單胞菌菌株(Pvd I菌株、Pvd II菌株和Pvd III菌株)和對pvdA基因缺失的菌株例示性顯示生長抑制以證明對綠膿桿菌螯鐵蛋白介導的鐵攝取的抑制。對照是在缺乏脂籠蛋白突變蛋白的情況下的細菌生長。
融合分子能夠抑制測試的每個單一銅綠假單胞菌菌株的生長。
實例22：融合分子的體內效力
藉由傳代培養到新鮮的血液瓊脂板上並且在37℃溫育過夜從於-80℃的長期貯存恢復銅綠假單胞菌PA01。藉由從培養板挑出5-10個獨特的菌落製備接種物，接著在10mL Muller-Hinton培養液中懸浮。以300rpm和37℃在定軌搖動器上將培養物溫育18小時。在PBS中清洗培養物兩次，然後在PBS中重懸團粒，並且調節到600nm的光密度0.669(約1.2x109CFU/mL)。將這進一步稀釋以給出6x107CFU/mL的接種物濃度。將1mL此接種物添加到30mL細菌學瓊脂，用於製備瓊脂糖珠(Cash H.A.等，1979)。瓊脂糖珠中的PA01的終濃度是2 x 106CFU/mL(每50μL接種物為1 x 105CFU)。在主要研究前在3只大鼠中測試接種物的感染性，並且與先前的模型相似，在感染後48小時時實現5x106CFU/克肺組織的組織負荷。
本研究中使用的Sprague Dawley大鼠由Charles River Laboratories UK供應。大鼠在遞送時為200-225g，並且是無特定病原體的。在到達後，允許大鼠在開始研究前馴化至少7天。大鼠在開始研究時是250-300g。將大鼠按組收容在無菌個別通風的籠中，使動物一直暴露於經HEPA過濾的無菌空氣。大鼠自由獲取食物和水(無菌)，並且具有無菌白洋木屑襯墊(每3-4天或在適當時更換)。室溫是22℃±1℃，相對濕度為50-60%和最大背景噪音為56dB。以黎明/黃昏階段將大鼠暴露於12小時光照/黑暗循環。在UK內政部許可證下並且在地方倫理委員會許可的情況下進行所有動物研究。所有研究由技術人員進行，所述技術人員已經完成UK內政部個人許可證課程的1、2和3部分，並且持有目前的個人許可證。
以1 x 105CFU/大鼠用50μL PA01包埋珠在氣管內感染深度麻醉的大鼠。用無菌珠漿體接種未感染的對照大鼠。在感染後3天啟動處理，並且 在感染後第3天、第4天、第5天、第6天、第7天和第8天對動物給藥。一天兩次(一日二次，BD)靜脈內(IV)投予融合分子(SEQ ID NO：134；RA10680550)，兩劑之間有5小時時間間隔。以12小時時間間隔IV BD投予妥布黴素。在感染後第3、5、7、9和15天對動物實施安樂死。在第3天、第5天和第7天，在第一劑處理後4小時對動物實施安樂死。從第9天起，在已經給予第一劑處理時對動物實施安樂死。在安樂死後，收集支氣管肺泡灌洗(BAL)，並且取出肺，用於細菌菌落形成單位(CFU)和白細胞計數和細胞因子/炎性標誌物分析。
融合分子單一療法與相應的媒介物組相比顯示顯著的效力，並且在大多數情況中到感染後第7天清除組織負荷(圖15)。
20mg/kg/劑量的妥布黴素從感染後第5天開始清除感染。用融合分子和妥布黴素的聯合療法誘導加速的肺負荷清除，指示融合分子對妥布黴素活性沒有拮抗影響(圖15)。
融合分子單一療法顯示抗炎特性，降低總白細胞計數和單核細胞和嗜中性細胞的絕對數目兩者(圖16)。融合分子單一療法比媒介物或妥布黴素單一療法顯著更有效，提示了融合分子比妥布黴素更具抗炎性。在組合組中看到相似的結果，但是融合分子單一療法數據提示驅動由聯合療法引起的抗炎效果的是融合分子而非妥布黴素。
實例23：在銅綠假單胞菌的肺定居的小鼠模型中融合分子對群體感應轉錄物降低的體內效力。
於37℃在旋轉的搖動的水浴中在胰蛋白酶大豆培養液(Biomerieux Laboratories,Lyon,France)中培養銅綠假單胞菌PA01達8小時。藉由分光光度術將接種物校準為1x109個菌落形成單位(cfu)/ml，然後在瓊脂珠中俘獲病原體。
在受保護的單元中維持購自Charles River Laboratories(Domaine des oncins,L’Arbresle,France)的雄性C57BL/6小鼠(8周齡)。在裡爾機構動物護理和使用委員會(Lille Institutional Animal Care and Use Committee)的批准下進行所有實驗。用七氟醚吸入(Abbott,UK)麻醉小鼠，並且以背斜靠放置。使用24-G動物餵食針的經氣管插入滴注60μl瓊脂糖珠製備物(2x105cfu/小鼠)。
感染後1小時(定居的早期階段)或48小時(定居的晚期階段)啟動處理，並且以5小時時間間隔一天兩次腹膜內(ip)對動物給藥達2天。
感染後48小時(對於早期階段)或96小時(對於晚期階段)時，對小鼠實施安樂死，並且收集肺以提取RNA。在逆轉錄後，藉由qPCR分析進行ExoA、Alginate和RhL的基因表現。
融合分子(SEQ ID NO：134；RA10680550)防止細菌抵抗宿主免疫應答的能力，從而阻斷毒力因子表現。融合分子處理在定居的早期階段期間誘導群體感應的三種主要基因的顯著降低(圖17A)。對於rhII，此效應即使在建立的定居中也得到維持(圖17B)。這些數據證明了融合分子防止細菌抵抗宿主免疫應答的能力，從而阻斷毒力因子表現的效力。
實例24：接頭分子長度對融合分子的結合能力的影響
對於融合分子設計，測試不同接頭分子長度和接頭分子組成。更具體地，測試範圍為(G4S)2肽接頭(10個胺基酸)下到作為接頭的單一甘胺酸的接頭長度，並且發現對單一靶物的結合沒有影響或僅具有微小的影響(圖18)。可以假設長度為超過10個胺基酸的肽接頭對融合分子的結合能力也將沒有負面影響。
實例25：菌株、化合物、培養基和生長條件
銅綠假單胞菌菌株ATCC15692/PA01(綠膿桿菌螢光素I鐵型 (siderotype)),ATCC27853(綠膿桿菌螢光素II鐵型和ATCC33360(綠膿桿菌螢光素III鐵型)從美國典型培養物保藏中心獲得，並且按指示維持。測試的化合物是SEQ ID NO：136的Fc-融合分子(又稱為SAR439349或RA10680578)或非結合對照Fc-融合分子(RA11043715)。除非另有規定，在如下製備的經Chelex®處理的琥珀酸鹽培養基(C-MS)中培養細菌：用K2HPO4：6g/L，KH2PO4：3g/l，(NH4)2SO4：1g/L，MgSO4.7H2O：0.2g/L，和琥珀酸鈉：4g/L製備琥珀酸鹽培養基；然後在室溫以50g/L添加Chelex®-100(Biorad)達5小時，之後使用0.22μM膜過濾。
對於每個實驗，在搖動的情況下於37℃在C-MS中在細胞培養管中過夜培養從胰蛋白酶大豆瓊脂板挑出的銅綠假單胞菌的各種菌株的單菌落。離心過夜培養物以消除存在於生長培養基中的綠膿桿菌螢光素。然後，重懸細菌團粒，並且在新鮮的C-MS培養基中稀釋為5.105cfu/mL的密度，並且在96孔板中在搖動的情況下在37℃培養箱中一式兩份或一式三份培養。使用以下公式從600nm的光密度(OD600nm)接近cfu/mL的數值：0.125OD600nm單位=1.5x108cfu/mL。
實例26：在存在Fc-融合分子的情況下綠膿桿菌螢光素生成的動力學
單獨(未處理對照)或在存在各個劑量的Fc-融合分子(SEQ ID NO：136)或對照Fc-融合分子的情況下在總體積200μL中一式兩份在96孔板中培養如實例25中描述的那樣製備的細菌達24小時。在各個時間時，以405nm的激發波長和460nm的發射波長使用微板讀板儀(Enspire,Perkin Elmer Instruments)在板中直接測量培養物中的綠膿桿菌螢光素螢光，如之前描述(Wilderman等，2001,Infect Immun.,69(9),p.5385-94)。同時，藉由測量OD600nm(其被轉化為cfu/mL)評估細菌生物量。用銅綠假單胞菌的ATCC15692、ATCC27853和ATCC33360菌株中的每種將實驗再現至少5 次。
為了呈現原始數據，對於ATCC27853，分別在圖19A和19B中；對於ATCC15692，分別在圖19C和19D中和對於ATCC33360，分別在圖19E和19F中對未處理的對照和用兩種化合物的處理(用劑量-響應)給出代表性實驗的cfu/ml和螢光任意單位數值的均值和s.e.m.。為了說明化合物對生物量的影響(其可以解釋綠膿桿菌螢光素水平的差異)，用每個時間點時綠膿桿菌螢光素的螢光的平均量除以相應的平均值OD600nm。然後，相對於未處理對照的綠膿桿菌螢光素螢光的相對量標準化這些相對量。對於ATCC27853、ATCC15692和ATCC33360，圖20A、20B、20C中分別顯示了標準化的相對量。一式三份進行實驗兩次，並且代表均值和s.e.m.。進行相對於未處理對照的單因素ANOVA和Dunnett後檢驗以確定用Fc-融合分子的處理的影響(* p<0.05,** p^>0.01,*** p<0.001)。另外，將點擬合到標準劑量-響應曲線，並且對於ATCC27853、ATCC15692和ATCC33360分別產生0.04mg/mL、0.11mg/mL和0.8mg/mL的IC50值。
藉由測量菌株ATCC27853的培養物的螢光，和如實例25中描述的那樣培養的ATCC27853的pvdA/pchD雙重突變體菌株的培養物的螢光確認螢光信號對綠膿桿菌螢光素的特異性。作為圖21中顯示的此實驗中獲得的螢光的均值數值，不能合成這些鐵載體的突變體菌株沒有展現出任何螢光信號。為了標準化螢光信號，在螢光信號採集前使用從野生型ATCC27853的上清液獲得的純化的綠膿桿菌螢光素II摻入培養物，並且獲得校正曲線，如圖22中藉由此實驗中獲得的螢光的均值數值顯示。另外，為了確認在存在Fc-融合分子的情況下螢光信號的下降不是由於化合物結合綠膿桿菌螢光素後的螢光淬滅所致，將Fc-融合分子即時添加到含有綠膿桿菌螢光素的培養上清液(用ATCC27853的過濾的24小時培養物獲得)，並且立即和在24小 時後讀取螢光。如具有此實驗中觀察到的螢光的均值數值的圖23中顯示，沒有觀察到螢光淬滅。
總之，這些實驗顯示了測量的螢光明確是由於綠膿桿菌螢光素存在所致，並且用Fc-融合分子處理後觀察到的螢光的下降是由於化合物阻止鐵饑餓培養基中指數生長的細菌的綠膿桿菌螢光素生成。此外，此現象是穩健的，並且在所有三種鐵型的代表性菌株中看到。
實例27：在存在Fc-融合分子的情況下的生長動力學
單獨(未處理對照)或在存在0.1或1mg/mL Fc-融合分子(SEQ ID NO：136)或非結合對照Fc-融合分子的情況下在總體積200μL中一式兩份在96孔板中培養如實例25中描述的那樣製備的細菌達24小時。每30分鐘，在板中直接測量OD600nm，並且轉化為cfu/mL。用各種銅綠假單胞菌菌株將實驗再現5次，並且圖24A和24B中以cfu/mL的均值和s.e.m.分別顯示了例示1mg/mL處理對ATCC15692和ATCC33360的影響的代表性實驗。計算生長曲線的指數階段的生長速率，並且在表16中呈現為△cfu.mL-1.△h-1。
總體上，這些結果顯示了Fc-融合分子特異性減慢了鐵饑餓培養基中的細菌的指數生長，並且在所有三種鐵型的代表性菌株中看到此現象。
還針對銅綠假單胞菌的5種新近的VAP臨床隔離群，測試了10μM的另一種融合分子(RA10680550；SEQ ID NO：134)對C-MS培養基中的細菌生 長的影響，並且在所有5種情況中，觀察到指數生長的斜率的降低。
實例28：Fc-融合分子對pchD啟動子活性的影響
已經顯示了綠膿桿菌螯鐵蛋白生物合成基因表現受到結合有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白正調節，所述結合有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白在轉錄水平上經由PchR調節物起作用(Heinrichs等，1996,J Bacteriol.,178(9),p.2586-92)。為了測試Fc-融合分子對綠膿桿菌螯鐵蛋白生物合成基因表現的影響，在pchD啟動子的控制下選殖合成luxCDABE操縱子，並且在ATCC33360的染色體中插入PpchD：：lux融合物。
為了測量pchD啟動子活性，單獨(未處理對照)或在存在0.1或1mg/mL Fc-融合分子(SEQ ID NO：136)或非結合對照Fc-融合分子的情況下和在存在各種量的FeCl3的情況下在總體積200μL中一式兩份在96孔板中在搖動的情況下在37℃培養箱中培養攜帶PpchD：：lux融合物的ATCC33360達24小時。在24小時生長後，使用微板讀板儀(Enspire,Perkin Elmer Instruments)在板中直接測量發光。
在一式三份進行的3個獨立實驗中評估鐵濃度對Ppchd轉錄活性的影響，並且代表性實驗在圖25中以觀察到的發光的均值和s.e.m.顯示。如預期，pchD啟動子表現在沒有鐵添加的C-MS培養基中被誘導，並且藉由鐵添加抑制。這確認報告物融合物的功能性。
在一式三份進行的單一實驗中評估在存在各種量的補充鐵的情況下Fc-融合分子處理對Ppchd轉錄活性的影響，並且在圖26中以觀察到的發光的均值和s.e.m.顯示了結果。它顯示了此啟動子活性的活性在存在Fc-融合分子的情況下被消除，不管補充的鐵的量如何，而對照Fc-融合分子沒有影響。
測試了一定劑量範圍的Fc-融合分子或對照Fc-融合分子對PpchD轉錄 活性的影響，在一式三份進行的3個實驗中沒有補充鐵。在每個實驗中，相對於未處理的對照標準化螢光素酶活性的量。在圖27中顯示了這3個實驗中獲得的觀察到的發光的均值和s.e.m.。將點擬合到標準劑量-響應曲線，並且對於Fc-融合分子產生0.03mg/mL的IC50值(95% CI：0.02-0.05)，並且對於同型對照Fc-融合分子未限定。
總體上，這些結果顯示了Fc-融合分子明確在鐵饑餓培養基中防止通常由結合有鐵的綠膿桿菌螯鐵蛋白轉導的信號。這應當導致減少的此鐵載體的量，如用綠膿桿菌螢光素觀察到的。相反，由於已經顯示了綠膿桿菌螢光素自身對綠膿桿菌螢光素合成的相似的正調節(Lamont等，2000,Proc Natl Acad Sci U S A,99(10),p.7072-7)，吸引人的是推測上文看到的Fc-融合分子對綠膿桿菌螢光素生成的影響是由於阻斷綠膿桿菌螢光素介導的信號傳導。還知道鐵載體介導的信號傳導影響毒力因子的合成(Lamont等，2000,Proc Natl Acad Sci U S A,99(10),p.7072-7)，並且因此預期Fc-融合分子會影響毒力。
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<223> S0455.04F09
<400> 119
<210> 120
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S0455.04M08
<400> 120
<210> 121
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S0522.15K24
<400> 121
<210> 122
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S0527.05N11
<400> 122
<210> 123
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S0522.05A05
<400> 123
<210> 124
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S0522.05M06
<400> 124
<210> 125
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S0522.05A05_H28Q_N65D
<400> 125
<210> 126
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S0522.05M06_N65D
<400> 126
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變蛋白的C端序列
<400> 127
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SA接頭和Strep標簽II
<400> 128
<210> 129
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表達的蛋白質氨基酸序列
<400> 129
<210> 130
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 位置95-98
<400> 130
<210> 131
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 清蛋白結合肽的例子
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是Asp,Asn,Ser,Thr，或Trp中的任一種
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是Asn,Gln,His,Ile,Leu，或Lys中的任一種
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是Ala,Asp,Phe,Trp，或Tyr中的任一種
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是Asp,Gly,Leu,Phe,Ser，或Thr中的任一種
<400> 131
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭
<400> 132
<210> 133
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 133
<210> 134
<211> 742
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22_H28Q_T54A_N65D_(G4S)2S0544.04C04_H28Q_N65D_(G4S)2 S0530.07G09_H28Q_N65D_(G4S)2 S0522.05A05_H28Q_N65D
<400> 134
<210> 135
<211> 742
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22_T54A_N65D_(G4S)2S0530.04N16_N65D_(G4S)2 S0530.07G09_N65D_(G4S)2 S0522.05M06_N65D
<400> 135
<210> 136
<211> 980
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22_H28Q_T54A_N65D(G4S)2S0544.04C04_H28Q_N65D(G4S)2 S0530.07G09_H28Q_N65D_(G4S)2 S0522.05A05_H28Q_N65D_(G4S)2 huIgG4Fc
<400> 136
<210> 137
<211> 980
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22_T54A_N65D_(G4S)2 S0530.04N16_N65D_(G4S)2_S0530.07G09_N65D_(G4S)2_S0522.05M06_N65D_(G4S)2_hIgG4Fc
<400> 137
<210> 138
<211> 980
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgG4Fc_(G4S)2_S0474.01H22_T54A_N65D_(G4S)2S0530.04N16_N65D_(G4S)2_S0530.07G09_N65D_(G4S)2_S0522.05M06_N65D
<400> 138
<210> 139
<211> 980
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22_T54A_N65D_(G4S)2S0530.04N16_N65D_(G4S)2_hIgG4Fc_S0530.07G09_N65D_(G4S)2 S0522.05M06_N65D
<400> 139
<210> 140
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4-Fc
<400> 140
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭
<400> 141
<210> 142
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭
<400> 142
<210> 143
<211> 980
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(H28Q；T54A；N65D)(G4S)2 S0544.04C04(H28Q；N65D)(G4S)2(FC；HuIgG4)(G4S)2 S0530.07G09(H28Q；N65D)(G4S)2 S0522.05A05(H28Q；N65D)
<400> 143
<210> 144
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(T54A；N65D)GQPKAAPS S0530.04N16(N65D)GQPKAAPS S0530.07G09(N65Q)GQPKAAPS S0522.05A05(N65D)Cterm StrepII 6His
<400> 144
<210> 145
<211> 746
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(T54A；N65D)GSGGSG S0530.04N16(N65D)GSGGSG S0530.07G09(N65Q)GSGGSG S0522.05A05(N65D)Cterm StreDII 6His
<400> 145
<210> 146
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(T54A；N65D)(G4S)2 S0530.04N16(N65D)(G4S)2 S0530.07G09(N65Q)(G4S)2 S0522.05A05(N65D)Cterm StrepII 6His
<400> 146
<210> 147
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)(G4S)2 S0530.04N16(N65Q)(G4S)2 S0530.07K20(N65Q)(G4S)2 S0522.15K24(N65Q)Cterm StrepII His
<400> 147
<210> 148
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)(G4S)2 S0530.04N16(N65Q)(G4S)2 S0530.07K20(N65Q)(G4S)2 S0522.05M06(N65Q)Cterm StrepII His
<400> 148
<210> 149
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)(G4S)2 S0530.04N16(N65Q)(G4S)2 S0530.07G09(N65Q)(G4S)2 S0522.15K24(N65Q)Cterm StrepII His
<400> 149
<210> 150
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0530.04N16(N65D)(G4S)2 S0530.07K20(N65D)(G4S)2 S0522.15K24(N65D)Cterm StreDII His
<400> 150
<210> 151
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0530.04N16(N65D)(G4S)2 S0530.07K20(N65D)(G4S)2 S0522.05M06(N65D)Cterm StrepII His
<400> 151
<210> 152
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0530.04N16(N65D)(G4S)2 S0530.07G09(N65D)(G4S)2 50522.15K24(N65D)Cterm StrepII His
<400> 152
<210> 153
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0530.04N16(N65D)(G4S)2 S0530.07G09(N65D)(G4S)2 S0522.05M06(N65D)Cterm StrepII His
<400> 153
<210> 154
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)GQPKAAPS S0466.09E05(N65Q)GQPKAAPS S0466.13C10(N65Q)GQPKAAPS S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 154
<210> 155
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)GQPKAAPS S0466.09E05(N65Q)GQPKAAPS S0466.13C10(N65Q)GQPKAAPS S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 155
<210> 156
<211> 746
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)ASTKGP S0466.09E05(N65Q)ASTKGP S0466.13C10(N65Q)ASTKGP S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 156
<210> 157
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)ASTKGPS S0466.09E05(N65Q)ASTKGPS S0466.13C10(N65Q)ASTKGPS S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 157
<210> 158
<211> 746
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)QPKAAP S0466.09E05(N65Q)QPKAAP S0466.13C10(N65Q)QPKAAP S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 158
<210> 159
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)GQPKAAP S0466.09E05(N65Q)GQPKAAP S0466.13C10(N65Q)GQPKAAP S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 159
<210> 160
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)GQPKAAPS S0466.09E05(N65Q)GQPKAAPS S0466.13C10(N65Q)GQPKAAPS S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 160
<210> 161
<211> 743
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)GGSGG S0466.09E05(N65Q)GGSGG S0466.13C10(N65Q)GGSGG S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 161
<210> 162
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)SGGSG S0466.09E05(N65Q)SGGSG S0466.13C10(N65Q)SGGSG S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 162
<210> 163
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)GGGSGGG S0466.09E05(N65Q)GGGSGGG S0466.13C10(N65Q)GGGSGGG S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 163
<210> 164
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)GGSGGSGG S0466.09E05(N65Q)GGSGGSGG S0466.13C10(N65Q)GGSGGSGG S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 164
<210> 165
<211> 755
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)GGGSGGSGGG S0466.09E05(N65Q)GGGSGGSGGG S0466.13C10(N65Q)GGGSGGSGGG S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 165
<210> 166
<211> 755
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)GGGSGGSGGG S0466.09E05(N65Q)GGGSGGSGGG S0466.13C10(N65Q)GGGSGGSGGG S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 166
<210> 167
<211> 728
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)S0510.05H10(N65D)S0510,11H24(N65D)S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 167
<210> 168
<211> 731
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G)S0510.05H10(N65D)(G)S0510.11H24(N65D)(G)S0455.04F09(N65D)StreDII His標簽
<400> 168
<210> 169
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G)3 S0510.05H10(N65D)(G)3 S0510.11H24(N65D)(G)3 S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 169
<210> 170
<211> 743
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(GSGSG)S0510.05H10(N65D)(GSGSG)S0510.11H24(N65D)(GSGSG)S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 170
<210> 171
<211> 743
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G2SG2)S0510.05H10(N65D)(G2SG2)S0510.11H24(N65D)(G2SG2)S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 171
<210> 172
<211> 746
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(GSG2SG)S0510.05H10(N65D)(GSG2SG)S0510.11H24(N65D)(GSG2SG)S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 172
<210> 173
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G2SGSG2)S0510.05H10(N65D)(G2SGSG2)S0510.11H24(N65D)(G2SGSG2)S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 173
<210> 174
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G3SG3)S0510.05H10(N65D)(G3SG3)S0510.11H24(N65D)(G3SG3)S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 174
<210> 175
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G2SG2SG2)S0510.05H10(N65D)(G2SG2SG2)S0510.11H24(N65D)(G2SG2SG2)S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 175
<210> 176
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G3SG2SG3)S0510.05H10(N65D)(G3SG2SG3)S0510.11H24(N65D)(G3SG2SG3)S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 176
<210> 177
<211> 754
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0512.17L07(N39S_N65D_T136A)(G4S)2 S0510.10A04_stop103Q(N65D)(G4S)2-S0455.04F23(N65D)StrepII His標簽
<400> 177
<210> 178
<211> 754
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0512.17L07(N39S_N65D_T136A)(G4S)2-S0510.10A04_stop103Q(N65D)(G4S)2-S0455.04F09(N65D)StrepIIHis標簽
<400> 178
<210> 179
<211> 754
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0510.05H10(N65D)(G4S)2 S0510.10A04_st.op103Q(N65D)(G4S)2 S0455.04F23(N65D)StrepII His標簽
<400> 179
<210> 180
<211> 754
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2-S0510.05H10(N65D)(G4S)2 S0510.10A04_stop103Q(N65D)(G4S)2-S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 180
<210> 181
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0512.17L07(N39S_N65D_T136A)(G4S)2 S0510.11H24(N65D)(G4S)2 S0455.04F23(N65D)StrepII His標簽
<400> 181
<210> 182
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0512.17L07(N39S_N65D_T136A)(G4S)2-S0510.11H24(N65D)(G4S)2-S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 182
<210> 183
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D)；T54A)(G4S)2 S0510.05H10(N65D)(G4S)2 S0510.11H24(N65D)(G4S)2 S0455.04F23(N65D)StrepII His標簽
<400> 183
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<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65D；T54A)(G4S)2 S0510.05H10(N65D)(G4S)2 S0510.11H24(N65D)(G4S)2 S0455.04F09(N65D)StrepII His標簽
<400> 184
<210> 185
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0474.01H22(N65Q；T54A)(G4S)2 S0466.09E05(N65Q)(G4S)2 S0466.13C10(N65Q)(G4S)2 S0455.04F09(N65Q)StrepII,His6
<400> 185
<210> 186
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S0475.06L06(N65Q；S79F)(G4S)2 S0466.09E05(N65Q)(G4S)2 S0466.13C10(N65Q)(G4S)2 S0455.04F09(N65Q)StrepII His標簽
<400> 186

Claims (17)

  1. 一種對綠膿桿菌螢光素(pyoverdine)I、II和III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白(pyochelin)具有結合特異性的融合分子，其包含：(a)第一多肽，其包含結合綠膿桿菌螢光素I型的人嗜中性細胞明膠酶相關脂籠蛋白(hNGAL)突變蛋白；(b)第二多肽，其包含結合綠膿桿菌螢光素II型的hNGAL突變蛋白；(c)第三多肽，其包含結合綠膿桿菌螢光素III型的hNGAL突變蛋白；和(d)第四多肽，其包含結合綠膿桿菌螯鐵蛋白的hNGAL突變蛋白；其中該第一、第二、第三和第四多肽是共價連接的。
  2. 如請求項1的融合分子，其中該hNGAL突變蛋白包含在與成熟hNGAL的線性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145對應的一個或多個位置處的突變胺基酸殘基。
  3. 如請求項1或2的融合分子，其中該hNGAL突變蛋白以200nM或更低的解離常數KD分別結合綠膿桿菌螢光素I型、綠膿桿菌螢光素II型、綠膿桿菌螢光素III型和綠膿桿菌螯鐵蛋白。
  4. 如請求項1至3中任一項的融合分子，其中該第一、第二、第三和第四多肽經由接頭分子，特別是肽接頭共價連接。
  5. 如請求項1至4中任一項的融合分子，其進一步包含允許該融合分子多聚化的多聚化域，特別是允許該融合分子二聚化的二聚化域。
  6. 如請求項5的融合分子，其中該二聚化域選自由下列組成之群組：Fc域、IgE重鏈域2(EHD2)、IgM重鏈域2(MHD2)、IgG重鏈域3(GHD3)、IgA重鏈域3(AHD2)、IgD重鏈域3(DHD3)、IgE重鏈域4(EHD4)、IgM重鏈域4 (MHD4)、子宮珠蛋白(uteroglobin)二聚化域和前述任一項的變體或片段，其中特別地，所述Fc域是人IgG4-Fc域。
  7. 如請求項1至6中任一項的融合分子，其具有選自由下列組成之群組的通式：N’-X1-L1-X2-L2-X3-L3-X4-C’ (I)，N’-X1-L1-X2-L2-X3-L3-X4-L4-MD-C’ (II)，N’-MD-L1-X1-L2-X2-L3-X3-L4-X4-C’ (III)，N’-X1-L1-X2-L2-MD-L3-X3-L4-X4-C’ (IV)，N’-X1-L1-MD-L2-X2-L3-X3-L4-X4-C’ (V)，和N’-X1-L1-X2-L2-X3-L3-MD-L4-X4-C’ (VI)其中X1、X2、X3和X4在每次出現時選自由下列組成之群組：第一、第二、第三和第四多肽，條件是該融合分子包含該第一、第二、第三和第四多肽之每種；MD包含多聚化域；並且L1、L2、L3和L4在每次出現時獨立選自共價鍵和接頭分子。
  8. 如請求項1至7中任一項的融合分子，其以多聚體(例如二聚體)複合物存在。
  9. 如請求項1至8中任一項的融合分子，其中該融合分子具有下列一項或多項性質：(i)其進一步包含至少一種允許檢測和/或分離該融合分子的標記物或標簽；(ii)其進一步包含一個或多個增加該融合分子的穩定性和/或延長該融合分子的血清半衰期的修飾； (iii)其抑制或降低銅綠假單胞菌經由綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠膿桿菌螢光素的鐵攝取；(iv)其抑制或降低銅綠假單胞菌的毒力因子表現；(v)其抑制或降低綠膿桿菌螯鐵蛋白和/或綠膿桿菌螢光素介導的信號傳導；(vi)其抑制或降低銅綠假單胞菌細菌生長；並且(vii)其與藥學活性劑結合或接合/融合，其中特別地，該藥學活性劑選自由下列組成之群組：抗生素、細胞抑制劑、毒素、金屬或金屬化合物/複合物、螯合劑、半抗原和抗體。
  10. 一種核酸分子，其包含編碼如請求項1至9中任一項的融合分子的核苷酸序列。
  11. 一種宿主細胞，其含有如請求項10的核酸分子。
  12. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項的融合分子、如請求項10的核酸分子、或如請求項11的細胞。
  13. 一種套組，其包含如請求項1至9中任一項的融合分子、如請求項10的核酸分子、如請求項11的細胞、或如請求項12的醫藥組合物。
  14. 如請求項1至9中任一項的融合分子、如請求項10的核酸分子、如請求項11的細胞、或如請求項12的醫藥組合物，其用作藥物。
  15. 如請求項1至9中任一項的融合分子、如請求項10的核酸分子、如請求項11的細胞、或如請求項12的醫藥組合物，其用於預防或治療受試者中的銅綠假單胞菌生物膜感染。
  16. 如請求項1至9中任一項的融合分子、如請求項10的核酸分子、如請求項11的細胞、或如請求項12的醫藥組合物，其用於預防或治療受試者中的與銅綠假單胞菌生物膜感染有關或由銅綠假單胞菌生物膜感染引起的疾 病或病症。
  17. 用於如請求項15或16的用途的融合分子、核酸分子、細胞或醫藥組合物，其中該銅綠假單胞菌生物膜感染是急性或慢性感染。
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