ES2667066T3 - Proteínas NGAL mutantes y usos de las mismas - Google Patents

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Jonathan Barasch
Andong Qiu
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Abstract

Proteína NGAL mutante que comprende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, en la que la proteína NGAL mutante (a) puede unirse a un sideróforo, y (b) se excreta en la orina.

Description

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aminoácidos que es al menos el 70%, o al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 85%, o al menos el 90%, o al menos el 95%, o al menos el 98% idéntica a la secuencia de NGAL humana WT (SEQ ID NO. 1), o un fragmento de la misma, en el que uno, dos, tres, cuatro o los cinco residuos de entre (R) 43, Arg(R) 72, Arg(R) 140, Lys(K) 142 y Lys(K) 157 se delecionan o se sustituyen por un aminoácido no cargado positivamente, tal como un 5 aminoácido cargado negativamente, y en el que el mutante de NGAL: (a) se excreta en la orina o presenta un mayor nivel de excreción en la orina que NGAL humana WT, y/o (b) no se reabsorbe en el túbulo proximal del riñón o presenta un nivel de reabsorción inferior en el túbulo proximal del riñón en comparación con NGAL humana WT, y/o
(c) no es un sustrato para la reabsorción en el riñón mediante un mecanismo mediado por receptor megalinacubilina, y/o (d) tiene afinidad reducida por el receptor megalina-cubilina en comparación con NGAL WT, y/o (e) tiene menos residuos cargados positivamente sobre su superficie accesible al disolvente en comparación con NGAL humana WT, y en el que el mutante de NGAL también (i) puede unirse a un sideróforo, y/o (ii) puede unirse a un sideróforo complejado con hierro, y/o (iii) tiene una estructura tridimensional conservada del bolsillo de unión a enteroquelina y/o (iv) tiene actividad bacteriostática. En realizaciones preferidas tales mutantes de NGAL no están mutados (es decir, tienen la misma secuencia de aminoácidos que NGAL humana WT), en uno o más, o más
15 preferiblemente todos, de los siguientes residuos de aminoácido que están implicados en la interacción NGALenteroquelina: asparagina 39, alanina 40, tirosina 52, serina 68, triptófano 79, arginina 81, tirosina 100, tirosina 106, fenilalanina 123, lisina 125, tirosina 132, fenilalanina 133 y lisina 134, o si están mutados en estos residuos sólo se realizan sustituciones conservativas.
En realizaciones adicionales los mutantes de NGAL descritos en esta sección que tienen mutaciones en uno o más de los cinco residuos de superficie positivos/básicos conservados, también pueden tener mutaciones en uno o más de los trece residuos de superficie positivos/básicos no conservados descritos en la sección previa de la Descripción detallada, o una o más de las otras mutaciones descritas en las siguientes secciones de esta Descripción detallada.
25 Residuos de superficie adicionales en NGAL
Los siguientes residuos de aminoácido están ubicados sobre la superficie de la proteína NGAL y pueden desempeñar un papel en la interacción de la proteína NGAL con la proteína megalina y/o en la reabsorción de NGAL en el riñón: residuos de aminoácido 1-15, 17-26, 40-50, 57-62, 71-82, 84-89, 96-105, 114-118, 128-131, 134, 140151, 157-165 y 170-174.
Se dan a conocer proteínas NGAL mutantes que comprenden, consisten en o consisten esencialmente en secuencias de aminoácidos que se basan en la secuencia de aminoácidos de NGAL humana, o un fragmento de la misma, pero que contienen mutaciones como en uno o más de los residuos de aminoácido individuales ubicados en 35 los residuos 1-15, 17-26, 40-50, 57-62, 71-82, 84-89, 96-105, 114-118, 128-131, 134, 140-151, 157-165 y/o 170-174 de NGAL humana WT. En una realización uno o más de los residuos de aminoácido mutados puede delecionarse. En otra realización uno o más de los residuos de aminoácido mutados puede sustituirse por un aminoácido no cargado positivamente, incluyendo, pero sin limitarse a un aminoácido cargado negativamente. En otra realización el mutante de NGAL puede comprender cualquier combinación de tales mutaciones, es decir cualquier combinación de deleciones, sustituciones por aminoácidos no cargados positivamente y/o sustituciones por aminoácidos cargados negativamente en uno cualquiera o más de los residuos de aminoácido enumerados anteriormente. La tabla 2 proporciona detalles de todas las posibles mutaciones de los residuos de superficie de NGAL, incluyendo los que contempla la presente invención. En realizaciones preferidas tales mutantes de NGAL no están mutados (es decir, tienen la misma secuencia de aminoácidos que NGAL humana WT), en uno o más, o más preferiblemente todos, de
45 los siguientes residuos de aminoácido que están implicados en la interacción NGAL-enteroquelina: asparagina 39, alanina 40, tirosina 52, serina 68, triptófano 79, arginina 81, tirosina 100, tirosina 106, fenilalanina 123, lisina 125, tirosina 132, fenilalanina 133 y lisina 134, o si están mutados en estos residuos sólo se realizan sustituciones conservativas.
Se da a conocer un mutante de NGAL que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70%, o al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 85%, o al menos el 90%, o al menos el 95%, o al menos el 98% idéntica a la secuencia de NGAL humana WT (SEQ ID NO. 1), o un fragmento de la misma, en el que uno o más de los residuos de aminoácido individuales ubicados en los residuos 115, 17-26, 40-50, 57-62, 71-82, 84-89, 96-105, 114-118, 128-131, 134, 140-151, 157-165 y/o 170-174 de NGAL 55 humana WT se deleciona o se sustituye por un aminoácido no cargado positivamente, tal como un aminoácido cargado negativamente, y en el que el mutante de NGAL: (a) se excreta en la orina o presenta un mayor nivel de excreción en la orina que NGAL humana WT, y/o (b) no se reabsorbe en el túbulo proximal del riñón o presenta un nivel de reabsorción inferior en el túbulo proximal del riñón en comparación con NGAL humana WT, y/o (c) no es un sustrato para la reabsorción en el riñón mediante un mecanismo mediado por receptor megalina-cubilina, y/o (d) tiene afinidad reducida por el receptor megalina-cubilina en comparación con NGAL WT, y/o (e) tiene menos residuos cargados positivamente sobre su superficie accesible al disolvente en comparación con NGAL humana WT, y en el que el mutante de NGAL (i) puede unirse a un sideróforo, y/o (ii) puede unirse a un sideróforo complejado con hierro, y/o (iii) tiene una estructura tridimensional conservada del bolsillo de unión a enteroquelina y/o (iv) tiene actividad bacteriostática. En realizaciones preferidas tales mutantes de NGAL no están mutados (es decir, tienen la 65 misma secuencia de aminoácidos que NGAL humana WT), en uno o más, o más preferiblemente todos, de los siguientes residuos de aminoácido que están implicados en la interacción NGAL-enteroquelina: asparagina 39,
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LIPOCALINAS DISTINTAS DE NGAL
Se dan a conocer mutantes de otras lipocalinas que, como los mutantes de NGAL descritos en el presente documento, tienen la capacidad de unirse a complejos de sideróforo-hierro pero no se reabsorben en el riñón. Se
5 espera que tales mutantes de lipocalina puedan usarse de manera similar a los mutantes de NGAL descritos en el presente documento para la circulación de hierro fuera del cuerpo y puedan usarse por tanto en el tratamiento de trastornos de sobrecarga de hierro. Se espera también que tales mutantes de lipocalina puedan usarse también para tratar infecciones bacterianas de las vías urinarias.
Hay aproximadamente 20 proteínas conocidas en la familia de lipocalina. Cualquier proteína lipocalina, u homólogo, variante, derivado, fragmento o mutante de la misma, que se una a un complejo de sideróforo-hierro puede mutarse con el fin de proporcionar un mutante de lipocalina de la invención. Los ejemplos de lipocalinas que pueden usarse según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, proteína de unión a retinol, alérgeno de lipocalina, afrodisina, alfa-2-microglobulina, prostaglandina D sintasa, beta-lactoglobulina, proteína de unión a bilina, las
15 nitroforinas, lipocalina 1, lipocalina 12 y lipocalina 13.
SIDERÓFOROS
Los sideróforos son compuestos de unión a hierro (por ejemplo Fe3+) de alta afinidad. La gran mayoría de los sideróforos conocidos los producen bacterias. Las bacterias liberan sideróforos al entorno circundante con el fin de eliminar o quelar hierro y transportar el hierro a las bacterias -un proceso necesario para la supervivencia de las bacterias. Los sideróforos que se conocen en la técnica incluyen, pero no se limitan a enteroquelina, TRENCAM, MECAM, TRENCAM-3,2-HOPO, parabactina, carboximicobactina, fusígeno, triacetilfusarinina, ferricromo, coprógeno, ácido rodotorúlico, ornibactina, exoquelina, ferrioxamina, desferrioxamina B, aerobactina, ferricromo,
25 rizoferrina, pioquelina, pioverdina. Las estructuras de estos compuestos se dan a conocer en Holmes et al., Structure, 2005, 13:29-41 y Flo et al., Nature, 2004, 432: 917-921, cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia.
Se sabe que varios de los sideróforos anteriores se unen a lipocalinas, incluyendo NGAL y se sabe que complejos de estos sideróforos y lipocalinas pueden secuestrar hierro (véanse por ejemplo, Holmes et al., Structure, 2005, 13:29-41 y Flo et al., Nature, 2004, 432: 917-921; Goetz et al, Molecular Cell, 2002, 10: 1033-1043 y Mori, et al., “Endocytic delivery of lipocalin-siderophore-iron complex rescues the kidney from ischemia-reperfusion injury”. J. Clin Invest., 2005, 115, 610-621). Las proteínas NGAL mutantes de la invención también pueden formar complejos con sideróforos y pueden de ese modo quelar y transportar hierro.
35 En algunos aspectos la presente invención proporciona complejos de una proteína NGAL mutante de la invención y un sideróforo, incluyendo, pero sin limitarse a, los sideróforos enumerados en el presente documento. En aspectos preferidos el sideróforo se selecciona del grupo que consiste en enteroquelina, pirogalol, carboximicobactina, catecol y variantes o derivados de los mismos. Puede usarse cualquier variante o derivado de tales sideróforos que conserve la capacidad de unirse a hierro (idealmente de una manera insensible al pH) y que conserve la capacidad para unirse a NGAL y/o uno o más de los mutantes de NGAL de la invención.
FABRICACIÓN DE PROTEÍNA NGAL MUTANTES Y COMPLEJOS CON SIDERÓFOROS
45 Las proteínas NGAL mutantes de la invención pueden fabricarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica para la fabricación de fármacos proteicos. Por ejemplo las proteínas NGAL mutantes pueden prepararse usando técnicas convencionales conocidas para la producción de proteínas recombinantes, por ejemplo suministrando a una célula, tal como una célula bacteriana o una célula de mamífero, un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un mutante de NGAL bajo el control de un promotor adecuado, y cultivando la célula en condiciones en las que la proteína se expresará. Se conocen bien en la técnica métodos para el cultivo a gran escala, el aislamiento y la purificación de proteínas recombinantes y pueden usarse en la fabricación de los mutantes de NGAL de la presente invención. De manera similar, se conocen en la técnica métodos de producción de péptidos y proteínas de manera sintética y pueden usarse en la fabricación de los mutantes de NGAL de la presente invención.
55 En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden los mutantes de NGAL de la invención y una o más “etiquetas” adicionales. Tales etiquetas adicionales pueden fusionarse al extremo N o C-terminal de los mutantes de NGAL, o pueden en algunos casos añadirse en una ubicación interna hasta el grado de que la inclusión de la etiqueta no afecte de manera adversa la función del mutante de NGAL. Las etiquetas adecuadas incluyen, pero no se limitan a glutatión-S-transferasa (GST), poli-histidina (His), fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa del rábano (HRP) y proteína fluorescente verde (GFP). Otras etiquetas adecuadas también resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Las etiquetas pueden ser útiles para varias aplicaciones, incluyendo para ayudar en el aislamiento y/o la purificación de los mutantes de NGAL y/o para facilitar su detección.
65 Se conoce en la técnica que muchas modificaciones químicas de las proteínas son útiles para mejorar las propiedades de fármacos basados en proteínas y tales modificaciones pueden usarse según la presente invención
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que la proteína NGAL de tipo natural (figura 4B), consecuente con su capacidad disminuida para la interacción electrostática con megalina, y su acumulación aumentada en la orina una vez introducida en ratones.
Tabla 1. Unión de proteínas Ngal mutantes a enteroquelina-55Fe3+ y acumulación de Ngal mutante-enteroquelina55Fe3+ en orina, riñón e hígado 3 horas tras la inyección i.p. en ratones C57BL/6.
Mutantes de Ngal
Unión de enterocalina-hierro (%) Acumulación 3 horas tras la inyección i.p. (%)
Orina
Riñón Hígado
A1
23,4 0,55 0,32 1,10
A2
22,6 0,18 0,37 1,11
A3
26,6 0,23 0,39 1,52
B1
20,7 0,22 0,26 1,30
B2
25,7 1,22 0,34 1,27
B3
26,9 0,30 0,26 1,01
B4
45,7 0,13 0,32 0,71
C1
26,2 0,72 0,21 1,15
C3
20,6 0,44 0,33 1,22
C5
21,9 0,26 0,44 0,85
D1
29,1 0,10 0,26 0,94
D2
18,1 0,11 0,16 0,60
F1
26,1 0,51 0,69 0,79
F2
21,5 0,11 0,40 0,51
F4
22,8 1,65 0,43 1,68
F5
27,7 1,23 0,29 1,61
G1
33,5 0,28 0,05 0,33
G3
26,9 0,17 0,58 0,30
H1
38,7 0,37 0,15 0,89
H2
36,1 0,27 0,12 1,06
H3
31,1 0,30 0,15 1,25
H5
38,6 0,24 0,09 1,07
I1
32,1 6,00 0,20 1,21
I3
42,8 6,90 0,27 0,55
I5
16,7 0,05 0,10 0,02
K1
21,2 1,90 0,76 0,82
K2
31,4 9,60 0,43 0,68
K3
22,9 19,60 0,27 0,40
K5
28,4 2,90 0,18 1,37
EJEMPLO 2
10 Los números en superíndice en este ejemplo se refieren a las referencias numeradas en la lista de referencias que sigue a este ejemplo. Los mutantes K1 -K8 a lo largo de todo el ejemplo 2, y las figuras 6-17, representan los mutantes D1-4, D1-4-1, D1-4-2-1, d1-4-2-1-1, d1-4-2-1-3, d1-4-2-1-4, WT-3 y D1-4-2 para los que se proporcionan las secuencias en el presente documento en la tabla 2.
15 El transporte de hierro supone un problema significativo puesto que el hierro férrico libre es insoluble (< 10-18 M) en disoluciones aerobias a pH fisiológico, mientras que tras la solubilización mediante algunos quelantes, se crea una
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SEQ ID NO: 1
NGAL WT imagen27
SEQ ID NO: 2
K-3 imagen28
SEQ ID NO: 3
K-2 imagen29
SEQ ID NO: 4
I-3 imagen30
SEQ ID NO: 5
I-1 imagen31
SEQ ID NO: 6
K-5 imagen32
SEQ ID NO: 7
K-1 imagen33
SEQ ID NO: 8
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SEQ ID NO: 9
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SEQ ID NO: 10
B-2 imagen36
SEQ ID NO: 11
EcNGAL imagen37
SEQ ID NO: 12
CfNGAL imagen38
SEQ ID NO: 13
SsNGAL imagen39
SEQ ID NO: 14
PtNGAL imagen40
SEQ ID NO: 15
MamNGAL imagen41
SEQ ID NO: 16
BtNGAL imagen42
SEQ ID NO: 17
MmNGAL imagen43
SEQ ID NO: 18
RnNGAL imagen44
SEQ ID NO: 19
Megalina Hs imagen45
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SEQ ID NO: 20
Megalina Mm imagen47
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SEQ ID NO: 21
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SEQ ID NO: 22
A-2 imagen50
SEQ ID NO: 23
A-3 imagen51
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SEQ ID NO: 24
B-1 imagen53
SEQ ID NO: 25
B-3 imagen54
SEQ ID NO: 26
B-4 imagen55
SEQ ID NO: 27
B-5 imagen56
SEQ ID NO: 28
C-1 imagen57
SEQ ID NO: 29
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SEQ ID NO: 30
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SEQ ID NO: 31
C-5 imagen60
SEQ ID NO: 32
D-1 imagen61
SEQ ID NO: 33
D-2 imagen62
SEQ ID NO: 34
E-2 imagen63
SEQ ID NO: 35
F-1 imagen64
SEQ ID NO: 36
F-2 imagen65
SEQ ID NO: 37
G-1 imagen66
SEQ ID NO: 38
G-2 imagen67
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SEQ ID NO: 39
G-3 imagen68
SEQ ID NO: 40
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SEQ ID NO: 41
H-2 imagen70
SEQ ID NO: 42
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SEQ ID NO: 43
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SEQ ID NO: 44
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SEQ ID NO: 45
I-5 imagen74
SEQ ID NO: 46
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SEQ ID NO: 47
L-2 imagen76
SEQ ID NO: 48
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SEQ ID NO: 49
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SEQ ID NO: 50
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SEQ ID NO: 51
WT-1 imagen80
SEQ ID NO: 52
WT-3 imagen81
SEQ ID NO: 53
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SEQ ID NO: 54
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SEQ ID NO: 55
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SEQ ID NO: 56
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SEQ ID NO: 57
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SEQ ID NO: 58
D1-4-1 imagen87
SEQ ID NO: 59
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SEQ ID NO: 60
D1-4-2-1 imagen89
SEQ ID NO: 61
D1-4-2-1-1 imagen90
SEQ ID NO: 62
D1-4-2-1-3 imagen91
SEQ ID NO: 63
D1-4-2-1-4 imagen92
SEQ ID NO: 64
D1-4-2-1-1-1 imagen93
SEQ ID NO: 65
D1-4-2-1-1-2 imagen94
SEQ ID NO: 66
D1-4-2-1-1-4 imagen95
SEQ ID NO: 67
K3-4 imagen96
SEQ ID NO: 68
K3-5 imagen97
SEQ ID NO: 69
Mutante de NGAL X1= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 70
Mutante de NGAL X2= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 71
Mutante de NGAL X3= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 72
Mutante de NGAL X4= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 73
Mutante de NGAL X5= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 74
Mutante de NGAL X6= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 75
Mutante de NGAL X7= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 76
Mutante de NGAL X8= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 77
Mutante de NGAL X9= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 78
Mutante de NGAL X10= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 79
Mutante de NGAL X11= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 80
Mutante de NGAL X12= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 81
Mutante de NGAL X13= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 82
Mutante de NGAL X14= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 83
Mutante de NGAL X15= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 84
Mutante de NGAL X16= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 85
Mutante de NGAL X17= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 86
Mutante de NGAL X18= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 87
Mutante de NGAL X19= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 88
Mutante de NGAL X20= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 89
Mutante de NGAL X21= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 90
Mutante de NGAL X22= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 91
Mutante de NGAL X23= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 92
Mutante de NGAL X24= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 93
Mutante de NGAL X25= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 94
Mutante de NGAL X26= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 95
Mutante de NGAL X27= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 96
Mutante de NGAL X28= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 97
Mutante de NGAL X29= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 98
Mutante de NGAL X30= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 99
Mutante de NGAL X31= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 100
Mutante de NGAL X32= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 101
Mutante de NGAL X33= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 102
Mutante de NGAL X34= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 103
Mutante de NGAL X35= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 104
Mutante de NGAL X36= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 105
Mutante de NGAL X37= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 106
Mutante de NGAL X38= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 107
Mutante de NGAL X39= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 108
Mutante de NGAL X40= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 109
Mutante de NGAL X41= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 110
Mutante de NGAL X42= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 111
Mutante de NGAL X43= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, R
SEQ ID NO: 112
Mutante de NGAL X44= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 113
Mutante de NGAL X45= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 114
Mutante de NGAL X46= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 115
Mutante de NGAL X47= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 116
Mutante de NGAL X48= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 117
Mutante de NGAL X49= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 118
Mutante de NGAL X50= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 119
Mutante de NGAL X51= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 120
Mutante de NGAL X52= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 121
Mutante de NGAL X53= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 122
Mutante de NGAL X54= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 123
Mutante de NGAL X55= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 124
Mutante de NGAL X56= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 125
Mutante de NGAL X57= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 126
Mutante de NGAL X58= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 127
Mutante de NGAL X59= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 128
Mutante de NGAL X60= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 129
Mutante de NGAL X61= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 130
Mutante de NGAL X62= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 131
Mutante de NGAL X63= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 132
Mutante de NGAL X64= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 133
Mutante de NGAL X65= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 134
Mutante de NGAL X66= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 135
Mutante de NGAL X67= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 136
Mutante de NGAL X68= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 137
Mutante de NGAL X69= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 138
Mutante de NGAL X70= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 139
Mutante de NGAL X71= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 140
Mutante de NGAL X72= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, R
SEQ ID NO: 141
Mutante de NGAL X73= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 142
Mutante de NGAL X74= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 143
Mutante de NGAL X75= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 144
Mutante de NGAL X76= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 145
Mutante de NGAL X77= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 146
Mutante de NGAL X78= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 147
Mutante de NGAL X79= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 148
Mutante de NGAL X8= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 149
Mutante de NGAL X81= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, R
SEQ ID NO: 150
Mutante de NGAL X82= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 151
Mutante de NGAL X83= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 152
Mutante de NGAL X84= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 153
Mutante de NGAL X85= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 154
Mutante de NGAL X86= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 155
Mutante de NGAL X87= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 156
Mutante de NGAL X88= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 157
Mutante de NGAL X89= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 158
Mutante de NGAL X90= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 159
Mutante de NGAL X91= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 160
Mutante de NGAL X92= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 161
Mutante de NGAL X93= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 162
Mutante de NGAL X94= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 163
Mutante de NGAL X95= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 164
Mutante de NGAL X96= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 165
Mutante de NGAL X97= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 166
Mutante de NGAL X98= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 167
Mutante de NGAL X99= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 168
Mutante de NGAL X100= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 169
Mutante de NGAL X101= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 170
Mutante de NGAL X102= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 171
Mutante de NGAL X103= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 172
Mutante de NGAL X104= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 173
Mutante de NGAL X105= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 174
Mutante de NGAL X106= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 175
Mutante de NGAL X107= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 176
Mutante de NGAL X108= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 177
Mutante de NGAL X109= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, R
SEQ ID NO: 178
Mutante de NGAL X110= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 179
Mutante de NGAL X111= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 180
Mutante de NGAL X112= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 181
Mutante de NGAL X113= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 182
Mutante de NGAL X114= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 183
Mutante de NGAL X115= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 184
Mutante de NGAL X116= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 185
Mutante de NGAL X117= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 186
Mutante de NGAL X118= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, H
SEQ ID NO: 187
Mutante de NGAL X119= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 188
Mutante de NGAL X120= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 189
Mutante de NGAL X121= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 190
Mutante de NGAL X122= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 191
Mutante de NGAL X123= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 192
Mutante de NGAL X124= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 193
Mutante de NGAL X125= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 194
Mutante de NGAL X126= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 195
Mutante de NGAL X127= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 196
Mutante de NGAL X128= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 197
Mutante de NGAL X129= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 198
Mutante de NGAL X130= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, R
SEQ ID NO: 199
Mutante de NGAL X131= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 200
Mutante de NGAL X132= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 201
Mutante de NGAL X133= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 202
Mutante de NGAL X134= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 203
Mutante de NGAL X135= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 204
Mutante de NGAL X136= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 205
Mutante de NGAL X137= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 206
Mutante de NGAL X138= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 207
Mutante de NGAL X139= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 208
Mutante de NGAL X140= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, R
SEQ ID NO: 209
Mutante de NGAL X141= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 210
Mutante de NGAL X142= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 211
Mutante de NGAL X143= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 212
Mutante de NGAL X144= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 213
Mutante de NGAL X145= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 214
Mutante de NGAL X146= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 215
Mutante de NGAL X147= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 216
Mutante de NGAL X148= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 217
Mutante de NGAL X149= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 218
Mutante de NGAL X150= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 219
Mutante de NGAL X151= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 220
Mutante de NGAL X152= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 221
Mutante de NGAL X153= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 222
Mutante de NGAL X154= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, R
SEQ ID NO: 223
Mutante de NGAL X155= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 224
Mutante de NGAL X156= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 225
Mutante de NGAL X157= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, K
SEQ ID NO: 226
Mutante de NGAL X158= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 227
Mutante de NGAL X159= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 228
Mutante de NGAL X160= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 229
Mutante de NGAL X161= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 230
Mutante de NGAL X162= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 231
Mutante de NGAL X163= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 232
Mutante de NGAL X164= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 233
Mutante de NGAL X165= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V, H
SEQ ID NO: 234
Mutante de NGAL X166= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 235
Mutante de NGAL X167= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 236
Mutante de NGAL X168= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 237
Mutante de NGAL X169= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 238
Mutante de NGAL X170= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 239
Mutante de NGAL X171= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 240
Mutante de NGAL X172= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 241
Mutante de NGAL X173= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 242
Mutante de NGAL X174= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 243
Mutante de NGAL X175= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 244
Mutante de NGAL X176= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 245
Mutante de NGAL X177= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 246
Mutante de NGAL X178= Q, A, N, D, C, E, G, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V
SEQ ID NO: 247
D1-4-2-1-4-2 imagen98
SEQ ID NO: 248
D1-4-2-1-4-3 imagen99
imagen100

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