ES2937273T3 - Biomarcadores relacionados con la función renal y métodos que implican su uso - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para diagnosticar en un sujeto una lesión renal aguda o un estado de enfermedad relacionado o análogo. El método comprende los pasos de a) proporcionar una muestra tomada del sujeto: b) analizar la muestra del sujeto para determinar el nivel de un biomarcador seleccionado de ciertas especies atómicas; yc) comparar el nivel del biomarcador en la muestra con un nivel de referencia del biomarcador que es característico de un sujeto sano, por ejemplo, un sujeto que tiene una función renal normal. Un nivel elevado del biomarcador en la muestra en relación con el nivel de referencia es indicativo de lesión renal aguda o un estado de enfermedad relacionado o análogo. La invención también se relaciona con el uso de una especie atómica seleccionada de las de la Tabla 1 como biomarcador para la lesión renal aguda o un estado de enfermedad relacionado o análogo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcadores relacionados con la función renal y métodos que implican su uso

Esta invención se refiere a biomarcadores relacionados con la función renal y, en particular, a biomarcadores útiles en el diagnóstico de lesión renal aguda o en el diagnóstico de un sujeto con función retrasada del injerto de un riñón trasplantado. La invención proporciona métodos que implican la detección de dichos biomarcadores, en particular en relación con el diagnóstico de lesión renal aguda o el diagnóstico en un sujeto con función retrasada del injerto de un riñón trasplantado. Los métodos de la invención también pueden ser útiles en relación con ciertos otros estados de enfermedad.

El riñón es responsable de la excreción de agua y solutos del cuerpo. Sus funciones incluyen el mantenimiento del equilibrio ácido-base, la regulación de las concentraciones de electrolitos, el control del volumen sanguíneo y la regulación de la presión arterial. Como tal, la pérdida de la función renal por lesión y/o enfermedad da como resultado una morbilidad y mortalidad sustanciales.

La lesión renal aguda (AKI) es un deterioro relativamente repentino de la función renal, durante horas o días (en contraste con una disminución lenta de la función renal durante meses y años, lo que se conoce como enfermedad renal crónica, CKD). La AKI tiene varias causas, siendo las más comunes en la población hospitalizada la hipovolemia (deshidratación por diarrea o vómitos, pérdida de sangre por traumatismo o cirugía), la isquemia (disminución del suministro de sangre a los riñones, por ejemplo, causada por cirugía, caída repentina de la presión arterial, etc.), sepsis (por ejemplo, como consecuencia de una infección grave tal como la neumonía) y nefrotoxinas (fármacos u otras sustancias que son tóxicas para los riñones, por ejemplo, ciertos tipos de quimioterapia, antibióticos y agentes de contraste utilizados en angiografías coronarias y algunos procedimientos radiológicos).

La AKI usualmente se identifica por un aumento proporcional en la creatinina sérica (SCr) durante un tiempo definido. También se puede definir por una caída en la producción de orina por hora, pero esto no se mide de forma rutinaria fuera de las unidades de cuidados intensivos o renales, por lo que en la práctica se utilizan los criterios de CrS. Se han publicado sistemas de clasificación internacionalmente aceptados para definir y estadificar la AKI. Hay 3 etapas, Etapas 1-3, de gravedad creciente. En una proporción de pacientes con AKI en etapa 3, puede ser necesaria una "terapia de reemplazo renal" (RRT - ya sea diálisis en la unidad renal o hemofiltración en la unidad de cuidados intensivos), si la función renal es inadecuada para la seguridad o la supervivencia.

Con un acuerdo relativamente reciente sobre la definición de AKI, ha quedado claro que la incidencia de AKI en la población hospitalizada es alta, probablemente del 10 al 20% para cualquier etapa de AKI. Los inventores han estudiado la incidencia y los resultados de AKI localmente y han establecido una incidencia local de aproximadamente el 16 % de todas las admisiones hospitalarias, que es similar a los estudios publicados de otros centros a nivel internacional.

La AKI tiene una serie de consecuencias clínicas importantes. En particular, la AKI se asocia con:

a) Aumento significativo de la mortalidad, tanto temprana como tardía.

b) Mayor duración de la estancia hospitalaria: a partir de datos locales, la duración media de la estancia de los pacientes sin AKI es de 3 días; para aquellos con ^a K ⁱ en Etapa 1, 2 y 3 es de aproximadamente 9 días, y para aquellos con Etapa '3R' (es decir, aquellos que requieren RRT) es de 22 días.

c) Mayor riesgo de desarrollar enfermedad renal crónica (CKD), o empeoramiento de la CKD preexistente. La propia CKD conduce a un mayor riesgo de morbilidad y mortalidad cardiovascular.

Además, AKI tiene consecuencias económicas sustanciales para los proveedores de servicios de salud. Se ha estimado que los costos marginales de AKI para el Servicio Nacional de Salud del Reino Unido son de aproximadamente £ 450-650 millones (alrededor de mil millones de dólares estadounidenses) por año. El aumento de la duración de la estancia es un problema importante para la mayoría de los hospitales de agudos, con implicaciones significativas en los costos, y el coste del tratamiento de la mayor incidencia de la CKD es enorme.

AKI se maneja mal en el Reino Unido (Investigación confidencial nacional sobre el resultado y la muerte del paciente, NCEPOD, 'Adding Insult to Injury' 2009). En particular, la detección de AKI es pobre. Una alta proporción de casos no se detectan o se detectan tarde. El informe consideró que aproximadamente el 30% de los casos estudiados eran potencialmente evitables.

Los estados de enfermedad análogos a AKI también pueden ocurrir en el trasplante renal, lo que implica un daño isquémico significativo en el riñón trasplantado. Otros órganos también, tal como el hígado, pueden estar sujetos a formas análogas de daño.

El método estándar actual para evaluar la función renal implica la medición de la creatinina sérica (SCr) y, de hecho, como se señaló anteriormente, la AKI se define por un aumento proporcional especificado en la SCr. Sin embargo, la CrS se reconoce como un mal marcador de daño renal. Los niveles de CrS son indicativos de la función de filtración del riñón, en lugar de daño al riñón (lo que podría conducir a una reducción de la función de filtración). Además, después de una lesión en el riñón (por ejemplo, reducción temporal del suministro de sangre durante una cirugía mayor), la SCr probablemente no aumente durante 24 horas o más, incluso en pacientes que desarrollan AKI grave (por ejemplo, aquellos que requieren RRT). Por lo tanto, la SCr no identifica a las personas con riesgo de AKI en una etapa muy temprana. La SCr también está influenciada por muchos factores, tal como el estado de hidratación, la dieta y la masa muscular.

En los últimos años, ha habido un gran interés en la identificación de un biomarcador sensible y específico para AKI. Un biomarcador ideal sería:

a) sensible y específico;

b) detectable poco después de la lesión renal;

c) predictivo de AKI (e idealmente su gravedad);

d) fácil de medir (a partir de sangre u orina), que implique una fácil preparación de la muestra y estabilidad en el tránsito a un laboratorio de medición, o idealmente que se pueda medir en la propia clínica (es decir, como una 'Prueba en el punto de atención'); y

e) económico.

Se han informado y desarrollado varios biomarcadores putativos de AKI nuevos. La mayoría de las mejores son proteínas, medidas mediante pruebas tipo ELISA. Sin embargo, hasta la fecha, ninguno ha parecido ser claramente superior a los demás. Ejemplos de biomarcadores que se han establecido relativamente bien en los últimos años son: a. NGAL (lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos): medida en sangre u orina; sensible pero no muy específico; los niveles comienzan a aumentar después de 2 horas y alcanzan su pico a aproximadamente a las 4 horas. b. KIM-1 (molécula de lesión renal 1): medida en orina; los niveles aumentan más tarde y alcanzan su pico aproximadamente 10 horas después de la lesión; más específico que NGAL.

c. IL-18 (interleucina 18): medido en orina; sube y alcanza su pico más tarde.

d. L-FABP (proteína de unión a ácidos grasos de tipo hepático).

Dado que ninguno de estos biomarcadores es ideal, se ha sugerido que la especificidad y la sensibilidad podrían mejorarse combinándolos como un panel de biomarcadores, por ejemplo, NGAL para la detección sensible temprana, luego KIM-1 para aumentar la especificidad. Claramente, sin embargo, tal enfoque conduce a una mayor complejidad y coste, y no conduce a los resultados deseados de especificidad y rapidez.

Por tanto, existe una importante necesidad clínica no satisfecha de una prueba sensible, precisa, específica y rápida que proporcione una indicación fiable de la aparición de AKI.

KRITTAPOOM AKRAWINTHAWONG ET AL: "Urine Catalytic Iron and Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin as Companion Early Markers of Acute Kidney Injury after Cardiac Surgery: A Prospective Pilot Study", CARDIORENAL MEDICINE, vol. 3, no. 1, 1 de enero de 2013 (2013-01-01), páginas 7-16 divulga el uso de hierro catalítico en la orina como biomarcador para la lesión renal aguda.

El documento WO 2008/066862 A2 divulga métodos para predecir y diagnosticar la toxicidad del gadolinio midiendo el estado de hierro de un paciente, y métodos para aliviar la toxicidad del gadolinio administrando a un paciente un quelante de metales antes, simultáneamente o después de la exposición al gadolinio.

El documento WO 03/077901 A1 divulga agentes efectivos para reducir el contenido de valores de cobre del cuerpo del paciente lo suficiente como para mejorar la reparación del tejido.

El documento WO 2009/039298 A2 divulga sensores que comprenden transistores de alta movilidad de electrones (HEMT) de AlGaN/GaN con funcionalización en una superficie de compuerta con: una fina capa de oro y anticuerpos unidos; una fina capa de oro y agentes quelantes; un dieléctrico de compuerta no nativo, o nanovarillas de un dieléctrico no nativo con una enzima inmovilizada. Las realizaciones son métodos de uso de los sensores para detectar lesiones renales.

El documento WO 2010/057184 A2 divulga métodos y kits que comprenden el uso de agentes dirigidos contra la lesión renal aguda y biomarcadores para facilitar y mejorar el diagnóstico de AKI.

FERRARO PIETRO MANUEL ET AL: "Low level exposure to cadmium increases the risk of chronic kidney disease: analysis of the NHANES 1999-2006",BMC PUBLIC HEAL TH, BIOMED CENTRAL, LONDON, GB, vol. 10, no. 1, 3 de junio de 2010 (2010-06-03), página 304 es un artículo de investigación que analiza la asociación de la exposición a niveles bajos de cadmio con el riesgo de CKD.

Podracka L ET AL: "[Relation between metabolism of trace elements and the antioxidant defense system in chronic nephropathies]. -PubMed - NCBI", 24 de mayo de 1999 (2999-05-24)) describe un estudio relacionado con la asociación de elementos traza con enzimas antioxidantes.

Los inventores han desarrollado un modelo porcino de AKI y, sorprendentemente, han descubierto que los niveles de ciertas especies atómicas, presentes en niveles muy bajos en los fluidos corporales tales como la orina, aumentan en la orina pronto (típicamente dentro de aproximadamente una hora) después de la lesión renal, y luego caen a las concentraciones de línea base en el transcurso de varias horas. La presente invención se basa en el uso de estas especies atómicas como biomarcadores de AKI.

Las especies atómicas útiles como biomarcadores de acuerdo con la presente invención son cadmio o cobre o zinc.

En la Tabla 1 a continuación se muestra una forma redactada de la Tabla Periódica, que muestra los elementos de utilidad de acuerdo con la presente invención, cadmio, cobre y zinc, y también muestra ejemplos de otros elementos de utilidad potencial, que no están incluidos en la presente invención.

Los elementos que son de utilidad en la presente invención, cadmio, cobre y zinc, y otros elementos de utilidad potencial, que no están realizados en la presente invención, son metales de transición. Por "metales de transición" se entiende en este contexto cualquier elemento en el bloque d de la Tabla Periódica, que incluye los grupos 3 a 12 de la Tabla Periódica, así como las series de lantánidos y actínidos del bloque f, aunque este último puede ser de menor utilidad en la práctica. En este contexto, los "metales de transición" también incluyen los elementos zinc, cadmio y mercurio que, debido a que, a diferencia de otros metales de transición, no tienen una capa D incompleta en su configuración electrónica, a veces se denominan "metales posteriores a la transición".

Los metales de transición para uso en la presente invención, cadmio, cobre y zinc, y otros elementos de utilidad potencial, que no son realizados en la presente invención, son los de los Períodos 4, 5 y 6 y los Grupos 3 a 12 de la Tabla Periódica, es decir los elementos establecidos en la Tabla 2:

Tabla 2

Otro subconjunto de elementos para uso en la presente invención, a saber, cadmio, cobre y zinc, y de otros elementos de utilidad potencial, que no están incluidos en la presente invención, son los de los Períodos 4 y 5, y los Grupos 3 a 17, de la Tabla Periódica, es decir, aquellos elementos establecidos en la Tabla 3:

Tabla 3

Los biomarcadores de acuerdo con la presente invención, a saber, cadmio, cobre y zinc, y otros elementos de utilidad potencial, que no están incluidos en la presente invención, son los denominados comúnmente como "metales pesados", cuyo término abarca cualquier metal o metaloide de preocupación ambiental. Aunque originalmente se usó en relación con el cadmio, el mercurio y el plomo, todos los cuales tienen efectos nocivos y son más densos que el hierro, el término ahora se aplica a cualquier otro metal o metaloide igualmente tóxico, independientemente de su densidad. Los metales pesados comúnmente encontrados que se utilizan en la presente invención, a saber, cadmio, cobre y zinc, y otros elementos de utilidad potencial, que no están incluidos en la presente invención, son los que se exponen en la Tabla 4:

Tabla 4

Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que el cadmio, el cobre y el zinc pueden acumularse en las células epiteliales que recubren los túbulos renales a través de los cuales fluye la orina cuando el riñón la produce y ajusta. En el caso de AKI, esas células epiteliales tubulares pueden dañarse y, por lo tanto, las especies elementales acumuladas se liberan en la orina. Por lo tanto, los niveles elevados de los elementos en cuestión pueden ser por lo tanto indicativos de AKI.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para diagnosticar en un sujeto una lesión renal aguda, o diagnosticar en un sujeto la función retrasada del injerto de un riñón trasplantado, método que comprende las etapas de

a) analizar una muestra de orina obtenida de un sujeto para determinar el nivel de un biomarcador seleccionado entre cadmio, cobre o zinc; y

b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra con un nivel de referencia del biomarcador que es característico de un sujeto sano, por ejemplo, un sujeto que tiene una función renal normal;

en el que un nivel elevado del biomarcador en la muestra en relación con el nivel de referencia es indicativo de una lesión renal aguda o una función retrasada del injerto de un riñón trasplantado.

El método de la invención se puede aplicar a un sujeto que muestra síntomas de AKI u otro estado de enfermedad, o a un sujeto al que se le aplican uno o más factores de riesgo asociados con AKI u otro estado de enfermedad. Alternativamente, en vista de la prevalencia de AKI en la población hospitalizada, el método puede aplicarse de forma rutinaria para la detección de todos los pacientes.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona el uso de cadmio o cobre o zinc como un biomarcador para la lesión renal aguda o un biomarcador para la función retrasada del injerto de un riñón trasplantado.

La invención puede realizarse utilizando un aparato que comprende un elemento analítico sensible a la presencia y/o concentración, en una muestra tomada del sujeto, de un biomarcador seleccionado entre cadmio, cobre y zinc.

El aparato también puede comprender medios para recibir la muestra o para poner la muestra en contacto con el elemento analítico que es sensible a la presencia y/o concentración del biomarcador en la muestra. El elemento analítico puede comprender, sin limitación, una guía de ondas ópticas o una celda electroquímica, o puede ser una tira de prueba o tira reactiva o similar que, en uso, se sumerge en la muestra.

El aparato también puede comprender medios para comparar el nivel del biomarcador en la muestra con un nivel de referencia del biomarcador que es característico de un sujeto sano, por ejemplo, un sujeto que tiene una función renal normal.

El aparato puede configurarse como una prueba en el punto de atención (POCT).

La invención puede realizarse utilizando un kit de prueba que comprende un elemento analítico sensible a la presencia y/o concentración, en una muestra tomada de un sujeto, de un biomarcador seleccionado entre cadmio, cobre y zinc, junto con instrucciones de uso del elemento analítico. en un método para diagnosticar en un sujeto la lesión renal aguda o diagnosticar en un sujeto la función retrasada del injerto de un riñón trasplantado.

El uso de cadmio, cobre y zinc como biomarcadores es ventajoso porque la concentración del biomarcador es estable en la muestra tomada del sujeto, ya que el biomarcador no está sujeto a degradación como podría ser el caso de un biomarcador orgánico más complejo. El análisis de la muestra puede llevarse a cabo con precisión usando equipo analítico apropiado, y para muchas de esas especies atómicas, las concentraciones pueden determinarse usando equipo portátil y/o lo suficientemente simple para que lo use personal relativamente no capacitado en el punto de atención. Además, las investigaciones de los inventores indican que los niveles de estas especies se elevan muy pronto después de la lesión renal, lo que proporciona una indicación muy temprana de AKI, lo que conduce a una intervención temprana y optimización de la atención, con los correspondientes beneficios clínicos y económicos.

Los métodos de la invención pueden ser particularmente beneficiosos en relación con los sujetos mayores, que tienen más probabilidades de sufrir AKI, ya que es probable que las concentraciones de los biomarcadores en los riñones de dichos sujetos sean mayores que las de los sujetos más jóvenes, debido a un período más prolongado de exposición ambiental inadvertida a estas especies atómicas y, por lo tanto, una mayor acumulación.

La muestra se puede utilizar en la forma en que se obtiene del sujeto, o se puede someter a un pretratamiento antes del análisis, por ejemplo, dilución, concentración, fraccionamiento, reacción con uno o más reactivos químicos u otros pretratamientos físicos o químicos.

La muestra es una muestra de orina, y lo más preferiblemente la muestra de orina se analiza sin ningún pretratamiento físico o químico.

La muestra se puede recoger por medios convencionales. La muestra de orina se puede recolectar en una taza de orina estándar u otro recipiente, con o sin el uso de cateterismo urinario.

El nivel de referencia con el que se compara el nivel del biomarcador en la muestra en los métodos de la invención puede ser un nivel de referencia estándar que se considera normal en la población en general, o en un subconjunto de la población a la que pertenece el sujeto. Tal subconjunto puede definirse en términos de, por ejemplo, género, edad, peso, índice de masa corporal, parámetros de salud particulares o cualquier combinación de tales características. Los niveles de línea base estándar pueden establecerse mediante la medición rutinaria de los biomarcadores en grandes grupos de sujetos, por ejemplo, en todos o algunos pacientes ingresados en hospitales.

Alternativamente, el nivel de referencia puede ser un nivel de referencia medido en el sujeto antes de un evento que pueda causar AKI. Por ejemplo, el nivel de referencia puede establecerse midiendo el nivel del biomarcador antes de que el sujeto se someta a un procedimiento quirúrgico con el potencial de causar AKI.

El nivel del biomarcador se puede determinar en una sola medición. Por ejemplo, a un sujeto que va a someterse a un procedimiento quirúrgico se le puede medir el nivel del biomarcador antes de la cirugía y de nuevo un tiempo predeterminado después del procedimiento quirúrgico. Alternativamente, y más comúnmente, se realizan una serie de mediciones del nivel del biomarcador, en función del tiempo. La escala de tiempo en la que se realizan las mediciones, o el tiempo específico en el que se realiza una sola medición, estará determinado por el comportamiento típico del nivel del biomarcador después de un evento que causa AKI. Las investigaciones de los inventores indican que los niveles del biomarcador alcanzan un pico en 1 a 4 horas y vuelven a los valores de referencia en un período de tiempo de 12 a 48 horas. Por lo tanto, los métodos de la invención normalmente comprenden el análisis de una muestra tomada del sujeto en un momento dentro de las cuatro horas posteriores a un evento que puede inducir AKI, y más típicamente el análisis de muestras tomadas del sujeto en una pluralidad de veces dentro de las cuatro horas. de tal evento, y opcionalmente uno o más tiempos mayores a cuatro horas. Como se indicó anteriormente, los métodos también pueden comprender el análisis de una o más muestras tomadas del sujeto antes del evento.

Los métodos de la invención pueden implicar la medición del nivel de un único biomarcador seleccionado entre cadmio, cobre y zinc, o los métodos pueden implicar la medición de los niveles de un panel de dos o más de tales biomarcadores. Los métodos de la invención también pueden implicar la medición del nivel de al menos uno de dichos biomarcadores y también el nivel de al menos otro biomarcador, por ejemplo, uno o más biomarcadores conocidos para AKI tales como NGAL, KIM-1, IL-18 o L-FABP.

El análisis de la muestra puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica analítica adecuada. Un ejemplo es la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), que es capaz de detectar metales y ciertas especies no metálicas en concentraciones muy bajas. Esto se logra ionizando la muestra con plasma acoplado inductivamente y luego utilizando un espectrómetro de masas para separar y cuantificar las especies ionizadas. Los iones del plasma se introducen en el espectrómetro de masas y se separan en función de la relación masa-carga. El detector del espectrómetro de masas recibe una señal que es proporcional a la concentración de las especies atómicas en la muestra.

ICP-MS se puede utilizar en combinación con otras técnicas, tal como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o el fraccionamiento de flujo de campo (FFF).

ICP-MS tiene la capacidad de cuantificar más de un elemento simultáneamente y, por lo tanto, esta técnica puede ofrecer beneficios particulares cuando se usa más de un biomarcador en un método de la invención, por ejemplo, cuando se utiliza un panel de biomarcadores seleccionados de cadmio, cobre y zinc.

Sin embargo, cuando solo se utiliza un único biomarcador, pueden ser viables otras técnicas, en particular técnicas de absorción atómica tal como la espectroscopia de absorción atómica, en la que se atomiza la muestra y se utiliza la absorción de radiación, usualmente luz visible, por parte de los átomos libres para cuantificar la concentración de las especies atómicas de interés.

Si bien el análisis de la muestra puede llevarse a cabo utilizando equipo y metodología de laboratorio como los descritos anteriormente, es posible que dichos métodos no estén disponibles en todos los hospitales y/o pueden requerir equipo especializado y personal altamente capacitado. En general, por lo tanto, puede ser preferible que el análisis se lleve a cabo como una "Prueba en el punto de atención" (POCT), que puede realizar el personal clínico inmediatamente después de la recolección de una muestra.

Están disponibles métodos para la determinación rutinaria de ciertas especies atómicas de utilidad en la presente invención, que se han utilizado previamente en relación con, por ejemplo, la determinación de tales especies en suministros de agua domésticos. Dichos métodos pueden adaptarse para su uso en los métodos de la presente invención.

Las concentraciones de cadmio, por ejemplo, se pueden medir mediante métodos que involucran el contacto de una muestra con ditizona, que produce un color de rosa a rojo que se puede extraer con cloroformo. La medición fotométrica y la comparación con una curva de calibración preparada a partir de soluciones estándar de cadmio tratadas de la misma manera que la muestra pueden usarse para derivar la concentración de cadmio en la muestra. En kits de prueba simples, el análisis puede implicar simplemente la comparación visual de una solución coloreada, obtenida por reacción de la muestra con un reactivo como la ditizona, con una tabla de colores.

Otra tecnología que se puede utilizar en los métodos según la invención implica la voltametría de desprendimiento anódico o catódico, que son métodos voltamperométricos para la determinación cuantitativa de especies iónicas específicas. En la voltametría de desprendimiento anódico, el analito de interés se electrodeposita en un electrodo de trabajo durante una etapa de deposición y se oxida del electrodo durante la etapa de desprendimiento. La corriente se mide durante la etapa de desprendimiento. La oxidación de las especies se registra como un pico en la señal actual al potencial en el que la especie comienza a oxidarse.

El equipo de voltametría de desprendimiento anódico usualmente incorpora tres electrodos: un electrodo de trabajo, un electrodo auxiliar y un electrodo de referencia. La solución que se analiza usualmente tiene un electrolito agregado. Para la mayoría de las pruebas estándar, el electrodo de trabajo es un electrodo de película de bismuto o mercurio. La película de mercurio forma una amalgama con el analito de interés, que tras la oxidación da como resultado un pico nítido, mejorando la resolución entre los analitos. La película de mercurio se forma sobre un electrodo de carbón vitreo. En los casos en que el analito de interés tenga un potencial oxidante superior al del mercurio, o cuando un electrodo de mercurio no sea adecuado, también se puede usar un metal sólido e inerte, como plata, oro o platino.

La voltametría de desprendimiento catódico es similar a la voltametría de desprendimiento anódico, excepto que, para la etapa de recubrimiento, el potencial se mantiene en un potencial oxidante y las especies oxidadas se eliminan del electrodo mediante un barrido positivo del potencial.

En otras realizaciones, el análisis puede realizarse utilizando un biosensor. Dicho sistema típicamente incluye una celda de muestra que tiene una superficie que es sensible a la presencia del biomarcador que se va a detectar. Por ejemplo, la superficie se puede recubrir con biomoléculas unidas a ligandos que se unen competitivamente con el biomarcador, de modo que los ligandos se disocian de la superficie si, y en la medida en que, el ligando está presente en la muestra. Si los ligandos están marcados, por ejemplo, con un marcador fluorescente, entonces se puede detectar y cuantificar la disociación del ligando de la superficie.

A modo de ejemplo, pueden usarse sensores basados en ADN para detectar iones metálicos en virtud de la capacidad de ciertos iones metálicos para unirse selectivamente a algunas bases de nucleótidos para formar dúplex estables de ADN mediados por metales. Se han propuesto biosensores de ADN de cambio de estructura para la detección de varios iones metálicos, usando varios métodos de detección que incluyen fluorescencia, espectroscopía Raman de superficie mejorada, dispersión de resonancia, colorimetría, métodos electroquímicos y técnicas ópticas de onda evanescente. En tales biosensores, el cambio de estructura es inducido por la formación de enlaces no covalentes débiles, que generalmente es específico de la interacción de interés y no se ve afectado por otras especies presentes en la muestra. El cambio se produce rápidamente, por lo que dichos dispositivos son adecuados para la monitorización inmediata in situ (POCT) de objetivos específicos.

En una forma de aparato que puede ser adecuado para llevar a cabo los métodos de la invención, se usa un biosensor óptico de onda evanescente. Cuando la luz se propaga a través de una fibra óptica o una guía de ondas por reflexión interna total, se genera un campo electromagnético o una onda evanescente que decae rápidamente. La onda evanescente decae exponencialmente desde la interfaz, con una profundidad de penetración típica del orden de los 100 nm. La onda evanescente puede excitar la fluorescencia en los fluoróforos ubicados dentro de ella, pero la profundidad limitada de la onda evanescente permite diferenciar entre los fluoróforos que están unidos a la interfase, dentro de la onda evanescente, y los que no están unidos, en la muestra en volumen.

Se pueden utilizar metodologías análogas para la determinación de otros biomarcadores según la invención.

Se cree que los biomarcadores de la presente invención son biomarcadores fiables, sensibles y específicos para AKI. Como tal, existe el potencial para el uso frecuente y generalizado de los métodos de la presente invención en hospitales de enfermedades agudas a nivel internacional. Cualquier paciente con riesgo de AKI podría someterse a una o más de estas pruebas. Los factores de riesgo específicos para AKI incluyen: edad avanzada (por ejemplo, >65 años), CKD, AKI anterior, enfermedad hepática, insuficiencia cardíaca, sepsis, malignidad hematológica, deterioro neurológico. En consecuencia, los pacientes admitidos que no se encuentran bien, con cualquiera de estos factores de riesgo, podrían ser examinados con el ensayo de biomarcadores. De manera similar, los pacientes que se someten a cualquiera de los siguientes procedimientos pueden ser evaluados para identificar aquellos en riesgo de desarrollar AKI posteriormente:

Cirugía mayor, incluyendo, sin limitación, cirugía cardíaca;

Angiografía coronaria o angioplastia;

Investigaciones radiológicas que requieren la inyección de agentes de contraste (riesgo de "AKI inducida por el agente de contraste");

Trauma;

Quemaduras;

Quimioterapia.

Los métodos de la invención también pueden ser de utilidad en la exploración rutinaria de cualquier paciente ingresado en unidades de cuidados intensivos o de cuidados coronarios. Del mismo modo, como la AKI puede ocurrir después del embarazo, los biomarcadores se pueden medir de forma rutinaria antes y después del parto en las unidades de maternidad.

Aparte de la detección de AKI, los métodos de la invención se utilizan en relación con el trasplante renal, que implica un daño isquémico significativo al riñón trasplantado, especialmente cuando hay un riñón de donante fallecido, pero también para riñones de donante vivo. El riñón a menudo tarda en comenzar a funcionar después de la implantación en el receptor ("función retrasada del injerto"), o funciona inicialmente pero luego desarrolla el equivalente de AKI después de unos días. Los biomarcadores de la invención pueden estar elevados en una muestra de orina tomada de un posible donante antes de la recolección de un riñón para el trasplante, y esto puede ser indicativo de un riesgo de la función retrasada del injerto. De manera similar, los biomarcadores de la invención pueden estar elevados en la orina del receptor (si orinan), lo que podría permitir estimar el riesgo de que el riñón trasplantado desarrolle el equivalente de AKI. Esta información puede ser útil de varias maneras, incluida la decisión sobre cuándo dar de alta al paciente, si realizar una biopsia renal y/o si cambiar los fármacos inmunosupresores.

Además de lo anterior, los métodos de la presente invención pueden ser útiles en relación con el daño hepático agudo. Se sabe que el hígado también acumula cadmio, por lo que es posible que, en caso de daño hepático agudo (toxicidad por fármacos, hepatitis), los niveles de cadmio en sangre puedan aumentar.

Aunque lo más probable es que el sujeto sea un sujeto humano, es de esperar que las especies atómicas de cadmio, cobre o zinc sean biomarcadores de AKI en otros mamíferos. Así, los métodos de la invención pueden tener utilidad en el campo veterinario.

La invención se ilustrará ahora, solo a modo de ejemplo, con referencia a las Figuras adjuntas, en las que los elementos para usar en la presente invención son cadmio, cobre y zinc, y los ejemplos ilustrados de otros elementos de utilidad potencial no están realizados por la presente invención.

La Figura 1a muestra el cambio en el cadmio urinario (normalizado a niveles de creatinina) con el tiempo en un cerdo de peso similar al de un humano adulto (50-70 kg), después de inducir un grado conocido de lesión renal (lesión inducida por isquemia-reperfusión (IR)). en el tiempo cero).

La Figura 1b es similar a la Figura la, pero con los datos mostrados sin normalización a los niveles de creatinina. La Figura 2a muestra el cambio en el cobre urinario (normalizado a niveles de creatinina) con el tiempo en un cerdo de peso similar a un humano adulto (50-70 kg), después de inducir un grado conocido de lesión renal (lesión inducida por isquemia-reperfusión (IR)). en el tiempo cero).

La Figura 2b es similar a la Figura 2a, pero los datos se muestran sin normalización a los niveles de creatinina. La Figura 3a muestra el cambio en el hierro urinario con el tiempo en un cerdo de peso similar a un ser humano adulto (50-70 kg), después de inducir un grado conocido de lesión renal (lesión inducida por isquemia-reperfusión (IR) en el tiempo cero).

La Figura 3b es similar a la Figura 3a, pero los datos se muestran sin normalización a los niveles de creatinina. La Figura 4 es una curva de características operativas del receptor (ROC) para el cadmio urinario como marcador de AKI.

La Figura 5 es una curva de características operativas del receptor (ROC) para el cobre urinario como marcador de AKI.

La Figura 6 es una curva de características operativas del receptor (ROC) para el hierro urinario como marcador de AKI.

La Figura 7 es un gráfico de las estimaciones derivadas de ROC para la sensibilidad (eje y izquierdo) y la especificidad (eje y derecho) contra el cadmio urinario (eje x en una escala de log™), que indica el punto de corte para la predicción positiva de la enfermedad.

La Figura 8 es un gráfico de las estimaciones derivadas de ROC para la sensibilidad (eje y izquierdo) y la especificidad (eje y derecho) contra el cobre urinario (eje x en una escala de log™), que indica el punto de corte para la predicción positiva de la enfermedad.

La Figura 9 es un gráfico de las estimaciones derivadas de ROC para la sensibilidad (eje y izquierdo) y la especificidad (eje y derecho) contra el hierro urinario (eje x en una escala de logi⁰), que indica el punto de corte para la predicción positiva de la enfermedad.

La Figura 10 muestra la concentración de cadmio (panel superior), cobre (panel central) y hierro (panel inferior) en riñones porcinos medida 5 semanas después de la lesión por IR.

La Figura 11 muestra los niveles de línea base de cadmio urinario (panel superior), cobre (panel central) y hierro (panel inferior) en voluntarios sanos de edad avanzada.

Protocolo Clínico

Se desarrolló un modelo porcino de AKI. El cerdo es un modelo excelente para la enfermedad renal humana porque la anatomía y la fisiología de los riñones humanos y porcinos son similares.

Los cerdos se anestesian para cirugía general, se intuban y se someten a una laparotomía en la línea media para revelar los riñones derecho e izquierdo, cada uno de los cuales se pinza completamente durante tiempos variables (20-180 minutos), después de lo cual se retiran las pinzas y se cierra el sitio de la incisión. Se inserta un catéter vesical (12 Fr) para la recolección de orina y los cerdos se recuperan en un corral.

Por lo tanto, el modelo implica pinzar la arteria renal durante un tiempo definido (hasta 180 minutos) y luego reperfundir para causar una lesión inducida por isquemia-reperfusión (IR), que es un tipo extremo de daño al riñón.

Las muestras de orina se recogen antes del pinzamiento de la arteria renal (línea de base), inmediatamente después de la reperfusión (t=0) y en varios intervalos de tiempo a partir de entonces (hasta 48 horas).

La concentración de varios biomarcadores en las muestras de orina se mide mediante ICP-MS.

Concentración de cadmio urinario

La Figura 1a muestra (en una escala logarítmica) la concentración de cadmio en la orina de los cerdos antes y en varios puntos de tiempo después de varios grados de lesión renal inducida por IR, dependiendo el grado de lesión de la duración de pinzamiento de la arteria renal (20, 40 o 60 minutos). Como control, también se realizaron mediciones en cerdos que se sometieron a cirugía pero sin pinzamiento de la arteria renal para inducir daño al riñón ("Simulación"). Se puede ver que las concentraciones de cadmio de línea base (antes de la lesión) para cada grupo de sujetos fueron similares, y para el grupo de Simulación la concentración de cadmio se mantuvo dentro del rango basal.

Para los cerdos que sufrieron lesión en el riñón, se observó un aumento en la concentración de cadmio, siendo la magnitud del aumento proporcional a la duración del pinzamiento de la arteria renal y, por lo tanto, a la gravedad de la lesión. También se muestra que el tiempo que tarda la concentración de cadmio en volver al rango basal es proporcional a la duración del pinzamiento de la arteria renal y, por lo tanto, a la gravedad de la lesión (el regreso a la línea base fue de aproximadamente 6 horas, 24 horas y 48 horas para IR-20, IR-40 e IR-60 respectivamente).

Los resultados indican que el cadmio urinario es un excelente biomarcador temprano (dentro de las primeras 24 horas posteriores a la lesión) de AKI.

En la Figura la, la concentración de cadmio se ajusta a la creatinina en orina (14,256 pmol/L), para compensar las posibles variaciones debidas a las grandes diferencias en el volumen de orina expulsado por diferentes sujetos. Sin embargo, los datos no ajustados para la creatinina de esa manera se muestran en la Figura 1b; se puede ver que el comportamiento observado es cualitativamente muy similar al representado en la Figura la.

Concentración de cobre urinario y hierro urinario

Las Figuras 2a y 2b, y 3a y 3b muestran datos similares a la Figura 1, pero para cobre y hierro (respectivamente), en lugar de cadmio.

Los resultados observados son cualitativamente muy similares a los del cadmio (Figuras 1a y 1b), con un marcado aumento del cobre y el hierro urinarios después de la lesión.

Los resultados indican que el cobre y el hierro urinarios son excelentes biomarcadores tempranos (dentro de las primeras 24 horas posteriores a la lesión) de AKI.

Curvas características operativas del receptor

Una curva de características operativas del receptor (ROC) es un gráfico que ilustra el rendimiento de un sistema clasificador binario a medida que varía su umbral de discriminación. La curva se crea trazando la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) contra la tasa de falsos positivos en diversas configuraciones de umbral.

Las Figuras 4, 5 y 6 muestran las curvas ROC para todos los datos generados en relación con los controles y sujetos con lesión inducida por IR para cadmio (Figura 4), cobre (Figura 5) y hierro (Figura 6). El área bajo la curva (AUC) es una medida de la confiabilidad de la prueba para identificar individuos con o sin el estado de enfermedad en consideración, es decir, AKI. Un AUC de 0.75 o más es una indicación de que la prueba es muy buena.

Para el cadmio, el AUC fue de 0.81, con un intervalo de confianza del 95 % de 0.76-0.86.

Para el cobre, el AUC fue de 0.77, con un intervalo de confianza del 95 % de 0.71-0.83.

Para el hierro, el AUC fue de 0.75, con un intervalo de confianza del 95 % de 0.69-0.81.

Por lo tanto, el cadmio, el cobre y el hierro están indicados como muy buenos biomarcadores para AKI.

Punto de corte para la predicción positiva de la enfermedad

Representación gráfica de las estimaciones derivadas de ROC para la sensibilidad (eje y izquierdo) y la especificidad (eje y derecho) frente a la concentración de biomarcadores urinarios (eje x en una escal de log™) indica el punto de corte para la predicción positiva de AKI con > 80% de confianza basado en la medición puntual del biomarcador urinario.

Por lo tanto, la Figura 7 es un gráfico de las estimaciones derivadas de ROC para la sensibilidad (eje y izquierdo) y la especificidad (eje y derecho) contra el cadmio urinario (eje x en un logaritmo¹⁰ escala) e indica que el punto de corte para la predicción positiva de AKI con >80% de confianza basado en la medición puntual de cadmio en orina es >0.26 pg/L.

Las Figuras 8 y 9 son las mismas gráficas para el cobre y el hierro, respectivamente.

Los puntos de corte indicados para la predicción positiva de la enfermedad aguda son >57 pg/L para el cobre y >65 pg/L para el hierro.

Concentración de diversos elementos en riñones porcinos y de rata.

La composición elemental del tejido renal se midió en cerdos jóvenes sanos (n=20), cerdos viejos sanos (n=8) y, con fines comparativos, ratas de laboratorio jóvenes sanas (n=12). Los elementos principales y traza se midieron en una masa conocida de tejido secado por congelación después de la hidrólisis con ácido nítrico usando espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Se muestran concentraciones medias ± 1 D.E. en la Tabla 5 a continuación, expresadas en pg/g de materia seca (DM). Los cerdos jóvenes tenían 3-4 meses de edad, los cerdos viejos tenían 5-6 años y las ratas jóvenes (Wistar) tenían 10-12 semanas de edad. Todos los cerdos eran animales comerciales mestizos (landrace/large white/duroc).

Tabla 5

Se muestra que la composición elemental es muy similar para cerdos jóvenes y viejos y ratas de laboratorio jóvenes. Sin embargo, cabe destacar, y de acuerdo con la literatura publicada a partir de material cadavérico, que la concentración de cadmio, cobre y hierro aumenta con la edad, reforzando la noción de bioacumulación de estos elementos en la principal ruta de eliminación de toxinas hidrosolubles y desechos metabólicos.

La Figura 10 muestra los resultados de un estudio adicional en el que se midió la concentración de cadmio, cobre y hierro en riñones porcinos 5 semanas después de la lesión por IR (Control, n=3; IR-AKI, n=3). Los datos se presentan como un diagrama de puntos (línea en la media geométrica) de la concentración en pg/g de materia seca (DM). Todos los gráficos y las estadísticas de la curva ROC se generaron en Graphpad Prism 6 (Graphpad Software Inc, Ca, EE. UU.). REML analizó datos cuantitativos de series de tiempo con tratamiento (Control vs, IR) como un efecto fijo y el tiempo como una medida repetida dentro del animal (Genstat v16, Rothampsted, Reino Unido). Los datos elementales eran log-io transformados antes del análisis. Se aceptó la significación estadística en P<0,05.

La concentración de cadmio y hierro en el tejido renal en particular se había reducido, en consonancia con la pérdida de células epiteliales tubulares proximales que acumulan específicamente estos elementos en la concentración más alta. Se supone que los resultados para el cobre pueden estar distorsionados por el contenido de cobre en el agua potable y/o en los alimentos, y por la misma razón se puede esperar cierto grado de variabilidad en las concentraciones de hierro en el tejido renal.

Concentración de cadmio, cobre y hierro en orina en voluntarios sanos

Los elementos principales y traza se midieron en muestras puntuales de orina de voluntarios machos y hembras jóvenes y sanos (n=12 machos, n=12 hembras), y para comparar cerdos cateterizados pero sanos (n=24-53, muestra de orina de referencia) , por espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Los resultados que se muestran en la Tabla 6 a continuación son valores medios de concentración (1er y 3er rango intercuartílico (RIC)). Los cerdos jóvenes tenían 3-4 meses de edad (50-60 kg). Los datos se compararon mediante ANOVA de una vía, con la creatinina urinaria como covariable.

Tabla 6

Las concentraciones de cadmio, cobre y hierro en la orina son similares entre voluntarios jóvenes sanos de sexo masculino y femenino y están por debajo de todos los puntos de corte establecidos a partir del modelo animal preclínico (porcino) (como referencia, véase las Figuras 7-9). El perfil de elementos traza urinarios obtenido de la cohorte de cerdos también fue muy similar, y cualquier diferencia probablemente refleje diferencias en las fuentes dietéticas (por ejemplo, bajo contenido de aluminio, alto contenido de selenio).

También se midieron los perfiles de elementos traza en orina de voluntarios de edad avanzada (> 65 años), hombres y mujeres sanos, y también estuvieron por debajo de todos los puntos de corte establecidos a partir del modelo animal preclínico (porcino), con la excepción de un aumento en la línea de base de cadmio. Los resultados para cadmio, cobre y hierro se muestran en la Figura 11. Los elementos se determinaron en muestras puntuales mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). El rango basal (área sombreada horizontal) se determinó a partir de estadísticas de resumen (1er y 3er cuartil) de todas las determinaciones de línea base para cada elemento. Los gráficos se generaron en Graphpad Prism 6 (Graphpad Software Inc, Ca, EE. UU.).

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar en un sujeto una lesión renal aguda, o diagnosticar en un sujeto la función retrasada del injerto de un riñón trasplantado, método que comprende las etapas de

a) analizar una muestra de orina obtenida de un sujeto para determinar el nivel de un biomarcador seleccionado de cadmio, cobre o zinc; y

b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra con un nivel de referencia del biomarcador que es característico de un sujeto sano, por ejemplo, un sujeto que tiene una función renal normal;

en el que un nivel elevado del biomarcador en la muestra en relación con el nivel de referencia es indicativo de una lesión renal aguda o una función retrasada del injerto de un riñón trasplantado.

2. El uso de cadmio, cobre o zinc como biomarcador para la lesión renal aguda o como biomarcador para la función retrasada del injerto de un riñón trasplantado.

3. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el nivel de referencia con el que se compara el nivel del biomarcador en la muestra es un nivel de referencia estándar que se considera normal en la población en general, o en un subconjunto de la población a la que pertenece el sujeto, o un nivel de línea base medido en el sujeto antes de un evento que pueda causar AKI o función retrasada del injerto de un riñón trasplantado.

4. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el nivel del biomarcador se determina en una sola medición, o se realizan una serie de mediciones del nivel del biomarcador, en función del tiempo.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que las mediciones se realizan en una muestra tomada del sujeto en un momento dentro de las cuatro horas de un evento que puede inducir AKI, y más típicamente el análisis de muestras tomadas del sujeto en una pluralidad de momentos dentro de las cuatro horas de tal evento, y opcionalmente uno o más momentos mayores a cuatro horas.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además el análisis de una o más muestras tomadas del sujeto antes del evento.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que implica la medición de los niveles de un panel de dos o más biomarcadores, comprendiendo el panel el dicho biomarcador y uno o más biomarcadores seleccionados de cadmio, cobre, zinc y hierro.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, que también implica la medición del nivel de al menos otro biomarcador, por ejemplo, uno o más biomarcadores conocidos para AKI tales como NGAL, KIM-1, IL-18 o L-FABP.

9. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el análisis de la muestra se lleva a cabo mediante ICP-MS, una técnica de absorción atómica tal como espectroscopia de absorción atómica, voltametría de desprendimiento anódico o catódico, o utilizando un biosensor.

10. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el método comprende proporcionar una pluralidad de muestras, al menos una muestra que se toma dentro de las 4 horas posteriores a un evento que puede inducir AKI, y al menos una muestra que se toma después de 4 horas a partir de un evento que puede inducir AKI.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra se toma dentro de las 24 horas de un evento que puede inducir AKI.