JP2018505407A - 検査方法、原子種の使用方法、検査装置、及び、テストキット - Google Patents

Abstract

【課題】被験者における急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状をｅｘ ｖｉｖｏで検査する方法を提供する。【解決手段】本発明の方法は、ａ）被験者から予め採取されたサンプルが提供されるステップと、 ｂ）被験者から採取されたサンプルを分析し、表１に挙げた原子種から選択されたバイオマーカーのレベルを決定するステップと、 ｃ）サンプル内のバイオマーカーのレベルと、通常の腎機能を有する健康な被験者に特有なバイオマーカーの基準レベルとを比較するステップと、を含む。基準レベルに対するサンプル内のバイオマーカーの上昇したレベルにより、急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状が示される。本発明はまた、原子種の使用方法、バイオマーカーに反応する分析手段を備える検査装置及びテストキットに関する。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、腎臓機能に関するバイオマーカーに関し、特に急性腎障害の検査に有用なバイオマーカーを使用し、被験者の急性腎障害又は関連する若しくは類似する病状をｅｘ ｖｉｖｏで検査する方法、原子種の使用方法、検査装置及びテストキットに関する。

腎臓は人体からの水及び溶質の排出に関与する。その機能は酸塩基平衡の維持、電解質濃度の調整、血液量の制御及び血圧の調整を含む。そのため、障害及び／又は病気を通した腎臓機能の欠如は結果的に実質的な疾病率及び死亡率につながる。
急性腎障害（Ａｃｕｔｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ：ＡＫＩ）は慢性腎疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＫＤ）として知られる何か月から何年にも亘る腎機能の緩やかな低下と対照的に、数時間から数日に亘る腎機能の比較的突然な劣化である。ＡＫＩは様々な原因があるが、一般的なものは、血液量減少（下痢又は嘔吐による脱水症、外傷又は手術による失血）、局所貧血（例えば手術、血圧の急な低下等の腎臓への血液供給の減少）、敗血症（例えば肺炎等の重傷感染症の結果として）及び腎毒素（例えば冠動脈造影図で使用されるある種類の化学療法、抗生物質及び造影剤、及びいくつかのＸ線検査等の腎臓に有毒な薬又は他の物質）等で入院している人々に発生する。

ＡＫＩは通常、規定時間に亘る血清中クレアチニン（Ｓｅｒｕｍ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ：ＳＣｒ）の比率上昇により発見される。時間単位の尿生産の低下によっても規定されるが、これは集中治療又は腎単位の外で定期的に計測されないため、実際にはＳＣｒ基準が使用される。国際的に受け入れられた分類システムがＡＫＩを規定し段階分けするために公開された。３つの段階があり、深刻さが増加するにつれてステージ１から３へと移行する。ステージ３のＡＫＩを有する一部の患者において、安全又は生存のために腎機能が不適切であれば、腎代替療法（Ｒｅｎａｌ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ：ＲＲＴ‐腎単位の透析法又は集中治療単位の血液ろ過）が必要となる。
近年、入院する人々のＡＫＩの発生率は高く、おそらくＡＫＩの何れかのステージの１０から２０％であることが明らかになった。発明者らは局所的なＡＫＩの発生率と転帰とを研究し、国際的な他の施設で公開された研究と同様に、全ての入院に対する発生率がおよそ１６％であることを明らかにした。

ＡＫＩは多数の重要な臨床的帰結を有する。特に、ＡＫＩは以下に列挙することに関連する。
ａ）初期及び末期の両方で、死亡率を大幅に増加させる。
ｂ）病院滞在期間を長くする。地方のデータによると、ＡＫＩでない患者の平均の滞在期間は３日であり、ステージ１、２、３のＡＫＩの患者は約９日、ステージ「３Ｒ」（即ち腎代替療法（ＲＲＴ）を必要とする）患者は２２日である。
ｃ）慢性腎疾患（ＣＫＤ）の進行の危険が高まる、又は前から存在するＣＫＤを悪化させる。ＣＫＤ自体は心臓血管疾病率及び死亡率の危険が高まる結果となる。
更に、ＡＫＩは公共医療サービスプロバイダに実質的な経済的影響を有する。ＡＫＩの英国国民保健サービスに対する限界費用は年におよそ４億５千万から６億５千万ポンド（約１０億ＵＳドル）であると推測された。滞在期間が長くなることは、著しいコスト関連事項と共にほとんどの急性期病院に対して重要な課題である。高まるＣＫＤの発生を治療するコストは膨大である。

ＡＫＩは英国で上手く管理されていない（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｔｉａｌ Ｅｎｑｕｉｒｙ ｉｎｔｏ ｐａｔｉｅｎｔ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ：ＮＣＥＰＯＤ 「Ａｄｄｉｎｇ Ｉｎｓｕｌｔ ｔｏ Ｉｎｊｕｒｙ ２００９年」参照）。高い割合の症例が検知されないか、検知が遅れる。報告書は、研究された症例の約３０％に回避できる可能性があったと認めた。
ＡＫＩに類似する病状は、移植された腎臓に対する著しい虚血性障害を含む腎臓移植においても発生し得る。例えば肝臓のような他の臓器も類似した形式の障害にかかりやすい。

腎臓機能を評価する現在の標準的な方法は血清中クレアチニン（ＳＣｒ）の計測を含み、実際、上記のように、ＡＫＩはＳＣｒの特定の比率上昇により規定される。しかし。ＳＣｒは腎臓の障害の指標とはならないと認められている。ＳＣｒのレベルは（これがその後、ろ過機能の低下につながるかもしれないが）腎臓の障害ではなく、腎臓のろ過機能を示す。更に、（例えば大手術の間の血液供給の一時的な低下等の）腎臓への障害の後、（例えばＲＲＴを要する）重症のＡＫＩを発症し続ける患者でも、ＳＣｒはおそらく２４時間以上上昇しない。よってＳＣｒではＡＫＩの危険性のある人々を早い段階で発見できない。ＳＣｒは、水和状態、食事及び筋肉量等の多くの要因にも影響される。

近年、ＡＫＩの感度及び特異度のあるバイオマーカーの発見に多大な興味が寄せられている。理想のバイオマーカーは以下のようである。
ａ）感度及び特異度がある、
ｂ）腎臓の障害のすぐ後に検知可能である、
ｃ）ＡＫＩを予測できる（及び理想的にはその重症度まで）、
ｄ）測定しやすく（血液又は尿から）、サンプル作成が容易及び測定研究所まで安定して輸送され、又は理想的には病院内で計測可能（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ：ＰＯＣＴ ポイント・オブ・ケア検査）、
ｅ）安価である。

いくつかの新たな予想されるＡＫＩバイオマーカーが報告されて発展してきた。より良いもののほとんどは、ＥＬＩＳＡ型検査で計測されるタンパク質である。しかし、今日まで、他より明らかに優るものが現れていない。近年比較的確立されたバイオマーカーの例は以下のようである。
ａ．ＮＧＡＬ（好中球ゼラチナーゼ結合性リポカン）：血液又は尿内で測定し、感度が高いが特異度はあまりない。レベルは２時間後に上昇し始め、約４時間でピークに達する。
ｂ．ＫＩＭ‐１（腎障害分子１）：尿中で測定し、レベルは後に上昇し、障害後約１０時間でピークに達する。ＮＧＡＬよりも特異度がある。
ｃ．ＩＬ‐１８（インターロイキン１８）：尿中で計測され、上昇及びピークが後になる。
ｄ．Ｌ‐ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合タンパク）

これらのバイオマーカーのどれも理想的ではないが、例えば初期の感度のある検知にＮＧＡＬ、その後特異度を向上するためＫＩＭ‐１を使用する等の、バイオマーカーのパネルとしてこれらを組合せることにより特異度と感度が向上する可能性はあると提案された。しかし明らかに、そのようなアプローチは複雑さとコストを増加させることになり、特異度と迅速さとが両立しない。
よってＡＫＩ発生の信頼性のある指標を提供可能な、感度が高く、正確で、特異度があり、かつ迅速な検査の臨床的な必要性が存在する。

本発明は、上記の課題に鑑みて創作されたものであり、その目的は、被験者における急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状をｅｘ ｖｉｖｏで検査する方法、原子種の使用方法、検査装置及びテストキットを提供することにある。

発明者らはＡＫＩの豚のモデルを開発し、驚くべきことに、例えば尿のような体液に大変低いレベルで存在するある原子種のレベルが腎臓の障害の後すぐに（通常約１時間後以内）尿内で上昇し、その後数時間経過するうちにベースライン濃度に低下することを発見した。本発明はこれらの原子種をＡＫＩのバイオマーカーとして使用することに基づく。

本発明によるバイオマーカーとして有用な原子種は一般的に周期表の第３族から第１７族の第３、４、５、６及び７周期の元素と、ランタノイド及びアクチニド系列の遷移金属である。
本発明による潜在的有用性のある元素を表１に示す。

本発明において有用な好ましい元素は遷移金属である。この文脈において「遷移金属」とは周期表のｄブロックにおける任意の元素を意味し、周期表の第３族から第１２族とランタノイド及びアクチノイド系列のｆブロックを含む。本出願において、「遷移金属」とは、他の遷移金属と違い電子配置において不完全なｄ殻を有していないためしばしば「遷移後金属」とも呼ばれる、亜鉛、カドミウム及び水銀の元素も含む。

本発明において使用される好ましい遷移金属は周期表の第４、５、６周期及び第３族から第１２族のものであり、即ち表２に示される元素である。

本発明において使用されるのに適切な他の元素は周期表の第４、５周期及び第３族から第１７族のものである。これらを表３に示す。

本発明によるバイオマーカーとしての使用のための特に好ましい元素は通常「重金属」と呼ばれるものであり、この用語は環境関連の任意の金属又は半金属を含む。元々はそれらの全てが有害な影響を与え鉄よりも密度が濃いカドミウム、水銀及び鉛に関連して使用されたが、この用語は現在密度に関係なく他の任意の同様の有害な金属又は半金属に適用される。本発明において有用である重金属は表４に示されるものである。

本発明による使用のための特に好ましい重金属は銅、カドミウム及び鉄である。
任意の理論に従うことを望まなければ、特に有害な影響を持つ上記に挙げた元素は、尿が生成され腎臓により調節された時に尿が流れる尿細管を整列させる上皮細胞に蓄積され得ると考えられる。ＡＫＩの場合にはこれらの管状の上皮細胞が損傷され得、よって蓄積された元素は尿に排出される。よって問題となる元素のレベルの上昇がＡＫＩを表し得る。

よって、本発明の第１の態様によると、被験者における急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状をｅｘ ｖｉｖｏで検査する方法であって、
ａ）被験者から予め採取されたサンプルが提供されるステップと、
ｂ）被験者から採取されたサンプルを分析し、表１に挙げた原子種から選択されたバイオマーカーのレベルを決定するステップと、
ｃ）サンプル内のバイオマーカーのレベルと、通常の腎機能を有する健康な被験者に特有なバイオマーカーの基準レベルとを比較するステップと、を含み、
基準レベルに対するサンプル内のバイオマーカーの上昇したレベルにより、急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状が示される方法が提供される。

本発明の方法はＡＫＩ又は他の病状の症状を示す被験者、又はＡＫＩ又は他の病状に関連した１つ以上の危険因子が適用される被験者に適用され得る。或いは、入院している人々におけるＡＫＩの有病率を考慮し、この方法は全ての患者を検査するのにごく普通に適用され得る。

関連する態様において、本発明は急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状のためのバイオマーカーとして上記の表１から選択された原子種を使用する原子種の使用方法を提供する。

本発明は更に、被験者における急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状を検査する方法に使用される装置であって、被験者から採取されたサンプルにおいて、上記の表１に挙げた原子種から選択されたバイオマーカーの存在又は濃度の少なくとも一方に反応する分析手段を備える検査装置を提供する。

本発明の検査装置は又、サンプルを受容し、又はサンプルをサンプル内のバイオマーカーの存在又は濃度の少なくとも一方に反応する分析手段と接触させる手段を更に含む。分析手段は、これに制限されないが、光導波路又は電気化学セル、又は使用時にサンプルに浸される試験紙や計深棒等を含んでいても良い。

本発明の検査装置は又、サンプル内のバイオマーカーのレベルを、通常の腎機能を有する健康な被験者に特有なバイオマーカーの基準レベルと比較する手段を更に含んでいても良い

本発明の検査装置は、ポイント・オブ・ケア検査（ＰＯＣＴ）として構成されても良い。

本発明は更に、被験者における急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状を検査する方法における分析手段の使用の指示と共に、被験者から採取されたサンプルにおいて、上記の表１に挙げた原子種から選択されたバイオマーカーの存在又は濃度の少なくとも一方に反応する分析手段を含むテストキットを提供する。

本発明の全ての態様において、バイオマーカーは表１、表２、表３又は表４に述べた原子種の１つである。
表１から表４に挙げた原子種のバイオマーカーとしての使用は、バイオマーカーがより複雑な有機バイオマーカーの場合に起こり得るように分解されないという理由で、バイオマーカーの濃度が被験者から採取されたサンプル内で安定する点で有利である。サンプルの分析は適切な分析機器を使用することにより正確に実行され、その様な原子種の濃度の多くは、持ち運び可能であり、被験者の目の前にいる比較的未熟な職員により使用されるのに十分簡単である機器を使用して決定され得る。更に発明者らの調査によると、これらの種のレベルは腎臓の障害の後間もなく上昇し、よってＡＫＩの大変初期の表示を提供し、早期の治療介入及びケアの最適化をもたらし、対応する臨床及び経済的利点を有する。
本発明の方法は、これらの原子種を不注意に環境に長い期間暴露して蓄積が多くなることにより、そのような被験者の腎臓におけるバイオマーカーの濃度が若い被験者のものより高くなると思われるため、ＡＫＩにより罹患しやすい老人の被験者に関して特に有益である。

被験者から採取されたサンプルは通常は体液のサンプルであり、例えば尿又は血液のような適切な体液のサンプルでも良い。サンプルは被験者から得られたままの形式で使用されても良いし、又は例えば希釈、濃縮、分別、１つ以上の化学試薬との反応、又は他の物理的若しくは化学的前処理等の分析前の前処理をされても良い。例えば、全体の血液のサンプルは例えば血漿交換により分別されても良く、分析は例えば血漿のサンプルのような適切な画分に実行されても良い。他のサンプルとされる体液は胆汁、胃液及び嘔吐物を含む。

他の実施形態において、サンプルは例えば排泄物及び組織のような固体又は半固体のサンプルであっても良い。
しかし、最も便利には、サンプルは尿サンプルであり、最も好ましくは、尿サンプルは物理的又は化学的前処理無しに分析される。

サンプルは従来の手段により集められても良い。尿サンプルは、尿路カテーテルの使用の有り無しに拘わらず、標準の尿コップ又は他の容器に集められても良い。血液サンプルは標準の瀉血技術により集められても良い。
サンプル内のバイオマーカーのレベルが比較される基準レベルは、一般の集団又は被験者が属する集団の部分集合において通常と見なされる標準の基準レベルであり得る。その様な部分集合は例えば、性別、年齢、体重、体格指数、特に健康パラメータ、又はそれらの特徴の任意の組合せにおいて規定され得る。標準の基準レベルは例えば病院で認められた全ての又は幾人かの患者等の大きな群の被験者におけるバイオマーカーの通常の測定により確立され得る。

或いは、基準レベルは、ＡＫＩを引き起こし得る事象の前に被験者において測定されるベースラインレベルであっても良い。例えば、基準レベルは被験者がＡＫＩを引き起こす可能性のある外科手術を受ける前にバイオマーカーのレベルを測定することにより確立され得る。

バイオマーカーのレベルは単一の測定において決定され得る。例えば、外科手術を受ける予定の被験者は外科手術前及び外科手術の後の一定時間後再び測定されるバイオマーカーのレベルを有しても良い。
又は、一般的にバイオマーカーのレベルの一連の測定は時間に応じてなされる。測定がなされる時間スケール、又は単一の測定がなされる特定の時間はＡＫＩを生じさせる事象に続くバイオマーカーのレベルの典型的な作用により決定される。発明者らの調査によると、バイオマーカーのレベルは１から４時間以内にピークまで上昇し、１２から４８時間の時間スケールでベースライン値に戻る。
よって本発明の方法は通常、ＡＫＩを誘導し得る事象の４時間以内に１回の被験者から採取されたサンプルの分析と、より典型的にはその様な事象の４時間以内に複数回、及び選択的に４時間より後の間に１回以上の被験者から採取されたサンプルの分析を含む。
上述のように、本発明の方法は、事象の前に被験者から採取された１つ以上のサンプルの分析も含む。

本発明の方法は表１（又は表２から表４の何れか）の原子種から選択された単一のバイオマーカーのレベルの測定を含み得、又はその様な２つ以上のバイオマーカーのパネルのレベルの測定を含み得る。
本発明の方法は、例えばＡＫＩのバイオマーカーととして知られたＮＧＡＬ、ＫＩＭ‐１、ＩＬ‐１８又はＬ‐ＦＡＢＰのうちの少なくとも１つのレベルの測定も含み得る。

サンプルの分析は任意の適切な分析技術により実行され得る。１つの例は、大変低い濃度で金属及び特定の非金属種を検知可能な誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ‐ＭＳ）である。これはサンプルを誘導結合プラズマでイオン化し、その後イオン化した種を分離及び数値化する質量分析計を使用することにより達成される。プラズマからのイオンは質量分析計に導入され、質量対電荷比に基づき分離される。質量分析計の検知器はサンプル内の原子種の濃度に比例する信号を受信する。

ＩＣＰ‐ＭＳは、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はフィールドフローフラクショネーション（ＦＦＦ）等の他の技術と組み合わされて使用されても良い。
ＩＣＰ‐ＭＳは１つ以上の元素を同時に数値化する能力を有し、よってこの技術は、例えば表１（又は表２から表４の何れか）の原子種から選択されたバイオマーカーのパネルが使用される場合等に、１つ以上のバイオマーカーが本発明の方法において使用されるという特別な利点を提供する。例えば一実施形態において、２つ以上のカドミウム、銅及び鉄のレベルが測定され得る。

しかし単一のバイオマーカーのみが使用される時は他の技術も実行可能であり、特に原子吸光分光学法のような原子吸光技術は、サンプルが原子化され、自由原子による通常は可視光である放射線の吸収が使用されて関連する原子種の濃度を数値化する。
サンプルの分析は上記のような実験装置及び方法論を使用して実施されても良いが、その様な方法は全ての病院で使用可能ではない又は特殊な機器及び熟練の職員を必要とし得る。よって一般的に、分析はサンプル集積の直後に臨床の人員によって行われ得る「ポイント・オブ・ケア検査」（ＰＯＣＴ）として実行されることが好ましい。

本発明において有用ないくらかの原子種を通常通りに決定する装置及び方法は、例えば家庭給水におけるその様な種の決定に関連して以前に使用されたことがあり、入手可能である。その様な装置及び方法は本発明の方法における使用に適合されても良い。
例えばカドミウムの濃度は、クロロホルムと共に抽出され得るピンクから赤色を生成するジチゾンを有するサンプルと接触することを含む方法により測定され得る。光度計測定及びサンプルと同じ方法で処理された標準のカドミウム溶液から作製された較正曲線との比較がサンプルのカドミウム濃度を導き出すために使用されても良い。簡単なテストキットにおいて、分析は、カラーチャートを使用して、サンプルとジチゾン等の試薬との反応により得られる色のついた溶液の単に目視による比較を含んでいても良い。

本発明による方法及び装置で使用され得る他の技術は、特定のイオン種の定量的決定のための電解電量計の方法である陽極又は陰極ストリッピングボルタンメトリーを含む。陽極ストリッピングボルタンメトリーでは、関連する被分析物は蒸着ステップの間に作用電極に電気めっきされ、除去ステップの間電極から酸化される。電流が除去ステップの間に計測される。種の酸化は種が酸化され始める電位での電流信号のピークとして登録される。

陽極ストリッピングボルタンメトリー装置は通常３つの電極を組み込む。作用電極、補助電極及び参照電極である。分析される溶液は通常、それに加えられる電解液を有する。最も標準的なテストにおいて、作用電極はビスマス膜又は水銀薄膜電極である。水銀薄膜は関連する被分析物と水銀合金を形成し、水銀合金は参加すると鋭いピークとなり、被分析物間の分解を促進する。水銀薄膜はガラス状炭素電極に形成される。関連する被分析物が水銀のものよりも高い酸化還元電位を有する場合、又は水銀電極が不適切である場合、例えば銀、金、又はプラチナ等の同じ材質で不活性の金属が使用されても良い。

陰極ストリッピングボルタンメトリーは、めっきするステップにおいて電位は酸化還元電位に保持され、酸化された種は電位を陽極に一掃することにより電極から除去されることを除いて、陽極ストリッピングボルタンメトリーと同様である。
他の実施形態において、分析はバイオセンサを使用して実行されても良い。その様なシステムは通常検知されるべきバイオマーカーの存在に反応する表面を有する試料セルを含む。例えば、表面はバイオマーカーと競合的に結合するリガンドに結合される生体分子でコートされても良く、その結果リガンドがサンプルに存在する場合はその範囲内において、リガンドは表面から分離する。リガンドが例えば蛍光標識で標識化されている場合、表面からのリガンドの分離は検知され数値化され得る。

例として、特定の金属イオンがいくつかのヌクレオチド塩基に選択的に結合して安定した金属媒介のＤＮＡ二本鎖を形成する能力のおかげで、ＤＮＡに基づくセンサが金属イオンを検知するのに使用され得る。例えば、水銀イオンはチミン（Ｔ）塩基を選択的に調整でき、安定したＴ‐Ｈｇ‐Ｔ錯体を形成し、銀イオンは特にシトシン‐シトシン（Ｃ‐Ｃ）ミスマッチと相互作用する。鉛依存ＤＮＡザイム及び鉛安定化グアニン四重鎖に基づき、鉛を検知するものも知られている。様々な金属イオンを検知するための構造スイッチングＤＮＡバイオセンサが、蛍光発光、表面増強ラマン分光法、共鳴散乱、比色分析、電気化学的方法及びエバネセント波光学的手法を含む様々な検知方法を使用して提案されてきた。そのようなバイオセンサにおいて、構造スイッチングは一般に関係のある相互作用に特有でありサンプル内の他の種により影響を受けない、弱い非共有結合の形成により誘導される。スイッチングは迅速に発生し、その結果装置は特定の目標の素早い現場の（ＰＯＣＴ）監視に適する。

本発明の方法を実行するのに適切であり得る装置の１つの形式において、エバネセント波光学バイオセンサが使用される。光が全反射により光ファイバ又は導波路を通して伝搬すると、迅速に減衰する電磁場又はエバネセント波が生成される。エバネセント波はインターフェースから指数関数的に減衰し、通常の侵入深さはほぼ１００ｎｍである。エバネセント波はその中に配置された蛍光色素分子内の蛍光を励起できるが、エバネセント波の制限された深さはエバネセント波内のインターフェースに結合された蛍光色素分子と大量のサンプル内の結合されていない蛍光色素分子との区別を可能にする。よって、サンプル内の水銀を測定するため、Ｔ‐Ｔミスマッチ構造を含む蛍光標識のあるｃＤＮＡを補完する短いＤＮＡプローブが光ファイバ導波路の表面に固定される。その後蛍光標識のあるｃＤＮＡは表面のＤＮＡプローブに結合され得る。その後表面が水銀イオンを含むサンプルと接触すると、蛍光標識のあるｃＤＮＡのいくつかは水銀イオンに結合し、表面に固定されたプローブから結合を解く。これは蛍光信号の減少につながり、その減少は水銀の濃度に比例する。

類似の方法論が本発明による他のバイオマーカーの決定に使用されても良い。
本発明のバイオマーカーはＡＫＩの感度と特異度のある信頼できるバイオマーカーであると考えられる。そのため、国際的に急性期病院において本発明の方法が頻繁で広範囲に使用される可能性がある。ＡＫＩの危険がある患者は、それらのテストの１つ以上で検査され得る。ＡＫＩの具体的な危険因子は、老人（例えば６５歳より上）、ＣＫＤ、既往ＡＫＩ、肝臓病、心不全、敗血症、悪性血液疾患、神経学的障害を含む。その結果、これらの危険因子の何れかを有して不調と認められた患者はバイオマーカー試験で検査され得る。同様に、以下に列挙する治療の何れかを受ける患者は後にＡＫＩを発症する危険にあることを見つけるため検査され得る。
１．心臓手術を含む大手術（心臓手術のみとは限らない）
２．冠動脈造影又は血管形成術
３．造影剤の注入を必要とする放射線調査（「造影剤によって誘発されるＡＫＩ」の危険性）
４．外傷
５．火傷
６．化学療法

本発明の方法は集中治療室又は冠疾患集中治療室に入ることを認められた任意の患者の通常の検査においても有用性がある。同様にＡＫＩは妊娠の後に発生し得るため、バイオマーカーは産科病棟の出生の前及び後に通常に計測されても良い。

ＡＫＩの検査とは別に、本発明の方法は腎臓移植に関連して使用されても良く、腎臓移植は、特に生体の提供腎だけでなく提供腎が少ない時、移植された腎臓への著しい虚血性傷害を含む。腎臓はしばしば受容者に移植後機能し始めるのが遅く（「移植片機能の遅延」）、又は最初は機能するが数日後にＡＫＩと同等のものを発症する。本発明のバイオマーカーは移植する腎臓を摘出する前に予想されるドナーから採取された尿サンプルにおいて高められ得、これは移植片機能の遅延の危険性を示し得る。同様に、本発明のバイオマーカーは（彼らが尿を渡せば）受容者の尿において高められ得、それはＡＫＩと同等のものを発症する移植された腎臓の危険性を推定可能とする。この情報はいつ患者を退院させるか、腎生検に取り掛かるべきかどうか、又は免疫抑制剤を変更すべきかどうかの決定を含む、様々な方法で有用であり得る。

上記に加え、本発明の方法は急性肝臓障害に関連して有用であり得る。肝臓もカドミウムを蓄積し、よって急性肝臓障害（薬物中毒、肝炎）において、血液におけるカドミウムのレベルが上昇する可能性があることが知られている。

被験者はたいがい人間の被験者であるが、表１（又は表２から表４の何れか）の原子種は他のほ乳類におけるＡＫＩのバイオマーカーとなることが期待される。よって、本発明の方法は獣医学の分野で有用性を持つ。

知られた程度の腎臓障害（ゼロ時間での虚血再灌流（ＩＲ）誘導障害）を誘導後、成人と同様の重さ（５０から７０ｋｇ）の豚の経時的な尿中カドミウム（クレアチニンレベルまで正常化された）の変化を示す図である。 図１Ａと同様であるが、クレアチニンレベルまで正常化せずに示されたデータの図である。 知られた程度の腎臓障害（ゼロ時間での虚血再灌流（ＩＲ）誘導障害）を誘導後、成人と同様の重さ（５０から７０ｋｇ）の豚の経時的な尿中銅（クレアチニンレベルまで正常化された）の変化を示す図である。 図２Ａと同様であるが、クレアチニンレベルまで正常化せずに示されたデータの図である。 知られた程度の腎臓障害（ゼロ時間での虚血再灌流（ＩＲ）誘導障害）を誘導後、成人と同様の重さ（５０から７０ｋｇ）の豚の経時的な尿中鉄の変化を示す図である。 図３Ａと同様であるが、クレアチニンレベルまで正常化せずに示されたデータの図である。 ＡＫＩのマーカーとしての尿中カドミウムの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。 ＡＫＩのマーカーとしての尿中銅の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。 ＡＫＩのマーカーとしての尿中鉄の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。 病気の陽性予測のためのカットオフを示す尿中カドミウム（対数スケールのｘ軸）に対する感度（左のｙ軸）及び特異度（右のｙ軸）のＲＯＣ派生推定を示す図である。 病気の陽性予測のためのカットオフを示す尿中銅（対数スケールのｘ軸）に対する感度（左のｙ軸）及び特異度（右のｙ軸）のＲＯＣ派生推定を示す図である。 病気の陽性予測のためのカットオフを示す尿中鉄（対数スケールのｘ軸）に対する感度（左のｙ軸）及び特異度（右のｙ軸）のＲＯＣ派生推定を示す図である。 ＩＲ障害後５週間で測定した豚の腎臓におけるカドミウム（上部パネル）、銅（中間パネル）及び鉄（下部パネル）の濃度を示す図である。 高齢の健康なボランティアの尿中カドミウム（上部パネル）、銅（中間パネル）及び鉄（下部パネル）のベースラインレベルを示す図である。

（臨床試験計画書）
ＡＫＩの豚のモデルが開発された。豚は、豚と人間の腎臓の生体構造及び生理が類似するため人間の腎臓の病気の優秀なモデルである。
豚は一般手術用の麻酔をされ、挿管されて正中線で開腹手術され、それぞれが可変の時間（２０から１８０分）完全に固定された右と左の腎臓を露にし、その後固定が外され切開部位が閉じられる。膀胱カテーテル（１２Ｆｒ）が尿を集めるために挿入され、豚は小屋に戻される。

よってモデルは規定の時間（１８０分まで）腎動脈を固定し、その後再灌流して腎臓への障害の極端な例である虚血再灌流（ＩＲ）誘導障害を生じさせることを含む。
尿サンプルは再灌流のすぐ後（ｔ＝０）の腎動脈（ベースライン）の固定の前に集められ、その後様々な時間間隔で集められる（４８時間まで）。
尿サンプルの様々なバイオマーカーの濃度はＩＣＰ‐ＭＳにより測定される。

（尿中カドミウムの濃度）
図１Ａは障害の程度が腎動脈の固定時間（２０、４０又は６０分）に依存する腎臓への様々な程度のＩＲ誘導障害の前、及びその後のいくつかの時点における豚の尿中のカドミウムの濃度（対数スケールによる）を示す。対照として、手術を行うが腎臓の障害を誘発する腎動脈の固定を行わない豚も測定された（「偽装」）。
それぞれのグループの被験者の、ベースラインの（障害前の）カドミウム濃度は同じであり、偽装グループのカドミウム濃度は基礎範囲内に留まることが見られた。

腎臓に障害を持つ豚においては、カドミウム濃度の上昇が見られ、増加の大きさは腎動脈の固定時間、よって障害の深刻さに比例していた。カドミウムの濃度が基礎範囲に戻るのにかかる時間も腎動脈の固定時間、よって障害の深刻さに比例すると示される（ベースラインへ戻るのはＩＲ‐２０、ＩＲ‐４０及びＩＲ‐６０のそれぞれにおいて約６時間、２４時間及び４８時間であった）。
この結果から、尿中カドミウムはＡＫＩについて、障害後２４時間以内の優秀で迅速なバイオマーカーであると示された。
図１Ａにおいて、カドミウム濃度は異なる被験者が渡した尿の量の違いが大きいことにより、可能性のある変化を相殺するため尿クレアチニン（１４，２５６ｍｏｌ／Ｌ）に調節される。しかし、その様にクレアチニンに調節されないデータが図１Ｂに示される。観察された性状は図１Ａに描かれたものと量的に大変類似することが見られる。

（尿中銅及び尿中鉄の濃度）
図２Ａ、２Ｂ及び図３Ａ、３Ｂは図１と同様のデータを示すが、カドミウムではなく銅と鉄（それぞれ）に対してである。
観察された結果はカドミウムの場合（図１Ａ及び図１Ｂ）と量的に大変類似し、障害後の尿中の銅及び鉄の増加が著しい。
この結果から、尿中銅及び尿中鉄はＡＫＩについて、障害後２４時間以内の優秀で迅速なバイオマーカーであると示された。

（受信者動作特定曲線）
受信者動作特定（ＲＯＣ）曲線はその区別閾値が変化した時に２項分類子システムの性能を示す図線である。曲線は様々な閾値設定において偽の陽性率に対する真の陽性率（感度）を描くことにより生成される。

図４、５及び６はカドミウム（図４）、銅（図５）及び鉄（図６）に対する対照及びＩＲ誘導障害の被験者に関連して生成された全てのデータのＲＯＣ曲線を示す。濃度曲線下面積（ＡＵＣ）は対象とする病状、即ちＡＫＩがある場合と無い場合に個人を特定する検査の信頼性の評価基準である。０．７５以上のＡＵＣは検査が大変良好であることの指標である。
カドミウムでは、ＡＵＣは０．８１であり、９５％信頼区間が０．７６から０．８６であった。
銅では、ＡＵＣは０．７７であり、９５％信頼区間が０．７１から０．８３であった。
鉄では、ＡＵＣは０．７５であり、９５％信頼区間が０．６９から０．８１であった。
よって、カドミウム、銅及び鉄はＡＫＩの大変良好なバイオマーカーであると示された。

（病気の陽性予測のカットオフ）
尿のバイオマーカー濃度（対数スケールのｘ軸）に対する感度（左のｙ軸）及び特異度（右のｙ軸）に対するＲＯＣ派生推定を描くことは、尿のバイオマーカーのランダム測定に基づく８０％より高い信頼度のＡＫＩの陽性予測のカットオフを示す。

よって、図７は尿中カドミウム（対数スケールのｘ軸）に対する感度（左のｙ軸）及び特異度（右のｙ軸）のＲＯＣ派生推定の図線であり、尿中カドミウムのランダム測定に基づく８０％より高い信頼度のＡＫＩの陽性予測のカットオフが０．２６μｇ／Ｌより大きいことを示す。
図８及び９は銅及び鉄それぞれの同じ図線である。
急性疾患の陽性予測のために示されたカットオフは銅で５７μｇ／Ｌより大きく、鉄で６５μｇ／Ｌより大きい。

（豚及びラットの腎臓の様々な元素の濃度）
腎臓組織の元素組成は若い健康な豚（ｎ＝２０）、老年の健康な豚（ｎ＝８）、及び比較の目的で、若い健康な実験用ラット（ｎ＝１２）で計測された。大量及び微量の元素が誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ‐ＭＳ）を使用して硝酸加水分解後の知られた質量の凍結乾燥組織において計測された。標準偏差が±１の中央値濃度が以下の表５に示され、μｇ／ｇの乾燥物質（ＤＭ）で表される。若い豚は３から４か月の年齢であり、老年の豚は５から６歳であり、若いラット（ウィスター系）は１０から１２週の年齢であった。全ての豚は混血の（在来種／ラージホワイト／デュロック）商業的家畜であった。

元素組成は若い及び年老いた豚と若い実験用のラットで大まかに同じであると示された。しかし、注目すべきは、死体材料からの公開された論文と一致するように、カドミウム、銅、鉄の濃度は年齢と共に増加し、水溶性の毒や代謝廃棄物の除去の主要な経路においてこれらの元素の生体蓄積の見解を強化することである。
図１０は豚の腎臓内のカドミウム、銅及び鉄の濃度がＩＲ障害後５週間で（対照実験はｎ＝３、ＩＲ‐ＡＫＩはｎ＝３）計測された追加の研究の結果を示す。データはμｇ／ｇ乾燥物質（ＤＭ）の濃度の点描（幾何平均は線）で表される。全てのグラフとＲＯＣ曲線の統計はグラフパッドプリズム６（米国カリフォルニア州、グラフパッドソフトウェア社）により生成された。量的な時系列データは母数効果としての治療（対照実験対ＩＲ）と動物内反復測定としての時間（英国ロザムステッド試験場、ゲンシュタットｖ１６）を使用して制限付き最尤法により分析された。元素のデータは分析の前に対数変換された。統計的優位性はＰ＜０．０５で受け入れられた。

特にカドミウムと鉄の腎臓組織濃度は、特にこれらの元素を最高の濃度で蓄積する近位の管状上皮細胞の欠如に一致して激減した。銅の結果は水又は食物を摂取する時の銅の含有により歪曲され得、腎臓組織の鉄濃度のある程度の変化は同じ理由で予期されると仮定される。
健康なボランティアにおける尿中カドミウム、尿中銅及び尿中鉄の濃度

大量及び微量の元素は誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ‐ＭＳ）により、若く健康な男性及び女性のボランティア（ｎ＝１２男性、ｎ＝１２女性）、及び比較のためカテーテルを挿入されているが健康な豚（ｎ＝２４から５３、ベースラインの尿サンプル）からの尿のランダム試料において計測された。以下の表６に示された結果は中央値濃度（第１四分位範囲から第３四分位範囲（ＩＱＲ））である。若い豚は３から４か月の年齢であった（５０から６０ｋｇ）。データは尿中クレアチニンを共変量として一元配置分散分析により比較された。

尿中カドミウム、尿中銅及び尿中鉄の濃度は若く健康な男性及び女性のボランティアの間で同様であり、前臨床動物（豚）モデルから確立された全てのカットオフより低い（参考のため図７から９を参照のこと）。豚の群から得られる尿中の微量の元素の分析結果は、飼料源の違いを反映すると思われる相違点を有して大まかに同じであった（例えばアルミニウムが少ない、セレニウムが多い）。

老人の（６５歳以上の）健康な男性及び女性のボランティアの尿中の微量の元素の統計データも測定され、ベースラインカドミウムの増加を除いて前臨床動物（豚）モデルから確立された全てのカットオフより低かった。カドミウム、銅、及び鉄の結果は図１１に示される。元素は誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ‐ＭＳ）によりランダム試料において決定された。基礎範囲（横線で影を付けた領域）は各元素の全てのベースライン決定の要約した統計（第１四分位値から第３四分位値）から決定された。グラフはグラフパッドプリズム６（米国カリフォルニア州、グラフパッドソフトウェア社）により生成された。

Claims (32)

1. 被験者における急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状をｅｘ ｖｉｖｏで検査する方法であって、
   ａ）被験者から予め採取されたサンプルが提供されるステップと、
   ｂ）被験者から採取された前記サンプルを分析し、［表１］欄に記載の表１に挙げた原子種から選択されたバイオマーカーのレベルを決定するステップと、
   ｃ）前記サンプル内の前記バイオマーカーのレベルと、通常の腎機能を有する健康な被験者に特有な前記バイオマーカーの基準レベルとを比較するステップと、
   を含み、
   前記基準レベルに対する前記サンプル内の前記バイオマーカーの上昇したレベルにより、急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状が示される方法。
   

   
2. 急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状のためのバイオマーカーとして［表２］欄に記載の表１から選択された原子種を使用する原子種の使用方法。
   

   
3. 被験者における急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状を検査する方法に使用される装置であって、
   被験者から採取されたサンプルにおいて、［表３］欄に記載の表１に挙げた原子種から選択されたバイオマーカーの存在又は濃度の少なくとも一方に反応する分析手段を備える検査装置。
   

   
4. 前記サンプルを受容し、又は前記サンプルを前記サンプル内の前記バイオマーカーの存在又は濃度の少なくとも一方に反応する前記分析手段と接触させる手段を更に備える、請求項３に記載の検査装置。
5. 前記サンプル内の前記バイオマーカーのレベルを、通常の腎機能を有する健康な被験者に特有な前記バイオマーカーの基準レベルと比較する手段を更に備える、請求項３又は４に記載の検査装置。
6. ポイント・オブ・ケア検査（ＰＯＣＴ）として構成される、請求項３から５の何れか一項に記載の検査装置。
7. 被験者における急性腎障害、又は関連する若しくは類似の病状を検査する方法における分析手段の使用の指示と共に、被験者から採取されたサンプルにおいて、［表４］欄に記載の表１に挙げた原子種から選択されたバイオマーカーの存在又は濃度の少なくとも一方に反応する分析手段を備えるテストキット。
   

   
8. 前記バイオマーカーは前記表１に挙げた原子種の１つである、請求項１に記載の方法。
9. 前記バイオマーカーは［表５］欄に記載の表２に挙げた原子種の１つである、請求項１に記載の方法。
   

   
10. 前記バイオマーカーは［表６］欄に記載の表３に挙げた原子種の１つである、請求項１に記載の方法。
    

    
11. 前記バイオマーカーは［表７］欄に記載の表４に挙げた原子種の１つである、請求項１に記載の方法。
    

    
12. 前記バイオマーカーはカドミウムである、請求項１、又は８から１１の何れか一項に記載の方法。
13. 前記バイオマーカーは銅である、請求項１、又は８から１１の何れか一項に記載の方法。
14. 前記バイオマーカーは鉄である、請求項１、又は８から１１の何れか一項に記載の方法。
15. 前記サンプルは尿サンプルである、請求項１、又は８から１４の何れか一項に記載の方法。
16. 前記サンプルは血液サンプルである、請求項１、又は８から１４の何れか一項に記載の方法。
17. 前記サンプル内の前記バイオマーカーのレベルが比較される基準レベルは、一般の集団又は前記被験者が属する集団の部分集合において通常と見なされる標準の基準レベルである、請求項１、又は８から１６の何れか一項に記載の方法。
18. 前記サンプル内の前記バイオマーカーのレベルが比較される基準レベルは、急性腎障害又は関連する若しくは類似の病状を引き起こし得る事象の前に前記被験者において測定されるベースラインレベルである、請求項１、又は８から１６の何れか一項に記載の方法。
19. 前記バイオマーカーのレベルは単一の測定において決定される、請求項１、又は８から１８の何れか一項に記載の方法。
20. 前記バイオマーカーのレベルの一連の測定は時間に応じてなされる、請求項１、又は８から１８の何れか一項に記載の方法。
21. 測定において、前記被験者から採取されたサンプルについて急性腎障害を誘導し得る事象の４時間以内に１回の分析がなされ、又は、前記事象の４時間以内に複数回、及び選択的に４時間より後の間に１回以上の分析がなされる、請求項２０に記載の方法。
22. 前記事象の前に前記被験者から採取された１つ以上のサンプルの分析を更に含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記表１、［表８］欄に記載の表２、［表９］欄に記載の表３、又は、［表１０］欄に記載の表４に挙げた原子種から選択された単一のバイオマーカーのレベルの測定を含む、請求項１、又は８から２２の何れか一項に記載の方法。
    

    

    

    
24. 前記表１、［表１１］欄に記載の表２、［表１２］欄に記載の表３、又は、［表１３］欄に記載の表４に挙げた原子種から選択された２つ以上のバイオマーカーのパネルのレベルの測定を含む、請求項１、又は８から２２の何れか一項に記載の方法。
    

    

    

    
25. 急性腎障害の他のバイオマーカーである、ＮＧＡＬ、ＫＩＭ‐１、ＩＬ‐１８又はＬ‐ＦＡＢＰのうちの少なくとも１つ以上のレベルの測定を含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
26. 前記サンプルの分析はＩＣＰ‐ＭＳにより実行される、請求項１、又は８から２５の何れか一項に記載の方法。
27. 前記サンプルの分析は原子吸光分光学法に基づく原子吸光技術により実行される、請求項１、又は８から２５の何れか一項に記載の方法。
28. 前記サンプルの分析は陽極又は陰極ストリッピングボルタンメトリーにより実行される、請求項１、又は８から２５の何れか一項に記載の方法。
29. 前記サンプルの分析はバイオセンサを使用して実行される、請求項１、又は８から２５の何れか一項に記載の方法。
30. 急性腎障害を検査するのに使用される、請求項３から６の何れか一項に記載の検査装置。
31. 移植された腎臓の障害を検査するのに使用される、請求項３から６の何れか一項に記載の検査装置。
32. 急性肝臓障害を検査するのに使用される、請求項３から６の何れか一項に記載の検査装置。

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