WO2023079706A1 - 糖尿病性腎症の判定方法 - Google Patents

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stage
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diabetic nephropathy
diabetic
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高明 阿部
洋太郎 松本
晃一 菊地
智洋 中村
涼太 鯨井
淳 和田
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国立大学法人東北大学
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine

Definitions

  • the present invention is useful for determining whether or not people currently suffer from diabetic nephropathy from an early stage or whether they will suffer from it in the future, for determining the stage of present or future diabetic nephropathy, and for determining diabetes in the future.
  • the present invention relates to a method for determining an increase in an onset marker of nephropathy (specifically, albuminuria), and the like.
  • Diabetes is known to cause various chronic vascular complications, and its prognosis depends on the complications. Among them, diabetic nephropathy is important for life prognosis, so it is desired to diagnose the disease at an early stage and prevent its progression.
  • the diagnosis of the stage of diabetic nephropathy is based on a history of diabetes, changes in urinary findings (detection of proteinuria and microalbuminuria), a decrease in the estimated glomerular filtration rate (eGFR), and fundus examination. It was performed based on findings (observation of fundus vascular lesions).
  • these diagnoses are problematic in that they are insufficient to distinguish them from other renal diseases other than diabetic nephropathy.
  • Non-Patent Document 1 SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization)-time of flight mass spectrometry (TOFMS) has been used to report urinary proteins useful for distinguishing diabetic nephropathy patients from type 2 diabetes patients.
  • Non-Patent Document 2 SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization)-time of flight mass spectrometry
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • the inventions described in these documents do not relate to biomarkers capable of determining the disease stage of diabetic nephropathy.
  • An object of the present invention is to provide a method for determining whether or not a patient currently suffers from diabetic nephropathy or will suffer from it in the future from an early stage, and for determining the current or future disease stage of diabetic nephropathy. That's what it is.
  • the ratio of the urinary PS concentration to the urinary creatinine concentration correlates with the urinary albumin/creatinine ratio (ACR), which is an index of early diabetic nephropathy.
  • ACR urinary albumin/creatinine ratio
  • a method for determining diabetic nephropathy comprising the following steps (a) and (b). Step (a) of measuring the concentration of phenylsulfuric acid or a salt thereof and the concentration of creatinine in a biological sample collected from a subject; step (b) of calculating the ratio between the concentration of phenyl sulfate or a salt thereof measured in step (a) and the concentration of creatinine measured in step (a); [2] The determination method according to [1] above, wherein the biological sample is urine.
  • the subject may: The determination method according to the above [1] or [2], which indicates that any one of (1) to (3) is likely.
  • step (b) suffering from diabetic nephropathy after the early nephropathy stage; (2) suffering from diabetic nephropathy after the early nephropathy stage; (3) pre-nephropathy diabetic and elevated albuminuria; [4]
  • the ratio calculated in step (b) is the ratio of the concentration of phenylsulfuric acid or a salt thereof to the concentration of creatinine and is greater than the ratio in diabetic patients in the early nephropathy stage
  • the subject The determination method according to any one of [1] to [3] above, which indicates that any one of (1′) to (3′) is likely.
  • step (a) suffering from diabetic nephropathy after the overt nephropathy stage; (2') suffering from diabetic nephropathy after the overt nephropathy stage; (3′) suffering from early nephropathy stage diabetic nephropathy and elevated albuminuria; [5]
  • the determination method of the present invention is a method for assisting a doctor in diagnosing diabetic nephropathy, and does not include the act of diagnosis by a doctor.
  • Another aspect of the determination method is a method of collecting and/or creating data for diagnosing diabetic nephropathy, including steps (a) and (b). More specifically, such a method further comprises step (c-1) of collecting and/or creating data for diagnosing diabetic nephropathy in a subject using the ratio calculated in step (b) as an index.
  • a method comprising:
  • another embodiment of the present invention includes a method for diagnosing diabetic nephropathy, including the steps (a) and (b).
  • a diagnostic method include a method further comprising a step (c-2) of diagnosing diabetic nephropathy in a subject using the ratio calculated in step (b) as an index.
  • diabetic nephropathy e.g., diabetic nephropathy after early nephropathy stage, diabetic nephropathy after overt nephropathy stage
  • subjects (patients) diagnosed with a high possibility of increased albuminuria are administered drugs that can prevent the progression of diabetic nephropathy stage and/or worsening of diabetic nephropathy symptoms.
  • Those further comprising a step are preferred.
  • Diabetic nephropathy screening person such as regular medical examination necessary for early detection of diabetic nephropathy It is also expected to prevent progression to renal dysfunction and renal failure, improve QOL (Quality of Life), and reduce medical costs.
  • FIG. 1A is a graph showing the results of analyzing the correlation between urinary PS concentration (horizontal axis) and urinary ACR (vertical axis) in diabetic patients.
  • FIG. 1B is a graph showing the results of analyzing the correlation between the corrected urinary PS/Cr value (horizontal axis) and the urinary ACR (vertical axis) in diabetic patients.
  • the urinary PS concentration Fig. 2A
  • the corrected urinary PS / Cr value Fig.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of multiple logistic regression analysis performed.
  • phenyl sulfate or a salt thereof in a biological sample collected from a subject (also referred to as a donor) ) concentration and creatinine concentration in the biological sample, step (a) of quantifying these concentrations as necessary; Any method including the step (b) of calculating the ratio with the value of the creatinine concentration measured in a); is not particularly limited, and more specifically, the ratio calculated in step (b) (hereinafter sometimes referred to as "correction value of phenyl sulfates and creatinine in the subject”) is used as an index, and the subject has diabetic nephropathy A method further comprising a step (c) of determining
  • determining (diagnosing) diabetic nephropathy includes determining (diagnosing) whether or not currently suffering from diabetic nephropathy; suffering from diabetic nephropathy in the future Determining (diagnosing) whether or not; Determining (diagnosing) the current stage of diabetic nephropathy; Determining (diagnosing) the future stage of diabetic nephropathy and determining (diagnosing) an increase in the onset marker of diabetic nephropathy (specifically, albuminuria) in the future.
  • the diabetic nephropathy can be classified into disease stages based on ACR, which is an index of early diabetic nephropathy, and estimated glomerular filtration rate (eGFR).
  • ACR is an index of early diabetic nephropathy, and estimated glomerular filtration rate (eGFR).
  • eGFR estimated glomerular filtration rate
  • a diabetic patient with eGFR of 30 (mL/min/1.73 m 2 ) or higher is classified as stage 2 (early nephropathy stage) and has an overt urinary ACR of 300 (mg/g) or higher.
  • Patients with diabetes who have albuminuria or persistent proteinuria of 0.5 (g/gCr) or more and eGFR of 30 (mL/min/1.73m 2 ) or more are in stage 3 (overt nephropathy stage), and eGFR is less than 30 (mL/min/1.73m 2 ) (preferably overt albuminuria with urinary ACR of 300 [mg/g] or more, or persistent proteinuria
  • Stage 4 renal failure stage
  • diabetic patients undergoing dialysis therapy are classified into stage 5 (dialysis therapy stage).
  • afflicted with diabetic nephropathy means a state of diabetic nephropathy after the second stage (early nephropathy stage) in which microalbuminuria is detected. That is, the first stage (early nephropathy) corresponds to before the onset of diabetic nephropathy, and the second stage (early nephropathy stage) to the fourth stage (renal failure stage) is the onset of diabetic nephropathy. It corresponds to after (onset).
  • saccharging from diabetic nephropathy means suffering from diabetic nephropathy at the time of implementation of the present determination method
  • “suffering from diabetic nephropathy "Will” means suffering from diabetic nephropathy in the near future (for example, at least 1 to 3 years later, preferably at least 2 years later; hereinafter the same) after performing the present determination method.
  • Examples of the above subjects include subjects not suffering from diabetic nephropathy (not developing diabetic nephropathy) (e.g., subjects unknown whether they are suffering from diabetes, diabetic patients), diabetes Subjects suffering from nephropathy (diabetic nephropathy) can be mentioned.
  • diabetic nephropathy patients include diabetic nephropathy patients whose disease stage (advancement) is unknown, and such diabetic nephropathy patients whose disease stage is unknown have had diabetic nephropathy in the past Patients with diabetic nephropathy whose disease stage (advancement) is unknown at the time of study are also included.
  • the biological sample examples include non-liquid samples such as tissues, cells, and organs, and liquid samples such as blood (plasma, serum), urine, and saliva. Among these, urine is preferred.
  • the phenyl sulfate to be detected is the following compound (molecular weight: 174.17).
  • the phenyl sulfates to be detected include metal salts generated from aluminum, calcium, lithium, magnesium, potassium, sodium, and zinc, N,N'-dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, choline, and diethanolamine. , ethylenediamine, N-methylglucamine, lysine, organic salts produced from procaine, and the like.
  • any method for measuring the concentration of phenyl sulfates and creatinine can be used as long as it can detect phenyl sulfates and creatinine and, if necessary, quantify their concentrations. It may be a method, and specific examples thereof include mass spectrometry using a mass spectrometer (MS) and immunological measurement, and among these, mass spectrometry is preferred.
  • MS mass spectrometer
  • MS mass spectrometer
  • LC/MS liquid chromatograph mass spectrometer
  • LC/MS/MS liquid chromatograph tandem mass spectrometer
  • GC/MS gas chromatograph mass spectrometer
  • CE-MS Capillary Electrophoresis Mass Spectrometer
  • SELDI Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization
  • TOFMS Time of Flight Mass Spectrometer
  • Examples of the immunological measurement method include, for example, an antibody that specifically binds to phenyl sulfates (see, for example, JP-A-2018-102211) and an immunohistochemical staining method using an antibody that specifically binds to creatinine. , ELISA, EIA, RIA, western blotting, flow cytometry, and the like.
  • kits e.g., ELISA kit for measuring urinary creatinine [manufactured by Medical Chemical Discovery Co., Ltd.], "Creatinine, Assay Kit, Colorimetric, for Serum Sample” [manufactured by Caymanchemical]
  • ELISA kit for measuring urinary creatinine Manufactured by Medical Chemical Discovery Co., Ltd.
  • Creatinine, Assay Kit, Colorimetric, for Serum Sample [manufactured by Caymanchemical]
  • step (b) of the present determination method as a method for calculating the ratio between the phenyl sulfate concentration measured in step (a) and the creatinine concentration measured in step (a), the value of the phenyl sulfate concentration is The ratio of phenyl sulfates concentration to creatinine concentration may be calculated by dividing by the concentration value, or the ratio of creatinine concentration to phenyl sulfates concentration may be calculated by dividing the creatinine concentration value by the phenyl sulfates concentration value. may be calculated, but it is preferable to calculate the ratio of the phenyl sulfate concentration to the creatinine concentration.
  • the phenyl sulfates/creatinine correction value in the subject is the ratio of the phenyl sulfates concentration to the creatinine concentration and is greater than the ratio in diabetic patients in the early stage of nephropathy, the subject Has or is likely to have diabetic nephropathy at a later stage (i.e., early nephropathy stage, overt nephropathy stage, or renal insufficiency stage), or is diabetic in prenephropathy , And indicates that albuminuria is likely to increase, the phenyl sulfates/creatinine correction value in the subject is the ratio of the phenyl sulfates concentration to the creatinine concentration, and the ratio in prenephropathy diabetic patients is also not greater, it indicates that the subject has or is unlikely to have diabetic nephropathy beyond the early stage of nephropathy or is unlikely to have elevated albuminuria.
  • the phenyl sulfates/creatinine correction value in the subject is the ratio of the creatinine concentration to the phenyl sulfates concentration and is smaller than the ratio in diabetic patients in the early stage of nephropathy, the subject Suffering from or likely to suffer from diabetic nephropathy after the early nephropathy stage, or is a diabetic patient in the early stage of nephropathy and is likely to increase albuminuria, in the subject If the phenyl sulfates/creatinine correction value is the ratio of the creatinine concentration to the phenyl sulfates concentration and is not less than the ratio in prenephropathy diabetic patients, such subjects are diabetic after the early nephropathy stage It indicates that you have or are unlikely to have nephropathy, or that you are unlikely to have increased albuminuria.
  • the phenyl sulfates/creatinine correction values in diabetic patients in the early stage of nephropathy correspond to the phenyl sulfates/creatinine correction values in subjects (for example, the phenyl sulfates/creatinine correction value in subjects
  • the phenyl sulfates/creatinine correction value in diabetic patients in the early stage of nephropathy is also the ratio of the phenyl sulfates concentration to the creatinine concentration).
  • the corrected values of phenyl sulfates and creatinine in diabetic patients with prenephropathy were the same as the biological samples collected from the subject, and the same biological samples were collected from the diabetic patients with prenephropathy. is preferably treated.
  • the phenyl sulfates/creatinine correction value in the subject is the ratio of the phenyl sulfates concentration to the creatinine concentration and is greater than the ratio in diabetic patients in the early nephropathy stage, such subjects , have or are likely to have diabetic nephropathy in the overt or later stage (i.e., overt nephropathy stage or renal insufficiency stage), or have diabetic nephropathy in the early stage Indicating that the disease is likely to increase albuminuria, the phenyl sulfates/creatinine correction value in the subject is the ratio of the phenyl sulfates concentration to the creatinine concentration, and diabetes in the early nephropathy stage If not greater than that proportion in patients, such subjects have or are unlikely to have diabetic nephropathy after the overt nephropathy stage or are unlikely to have elevated albuminuria. show.
  • the phenyl sulfates/creatinine correction value in the subject is the ratio of the creatinine concentration to the phenyl sulfates concentration and is smaller than the ratio in diabetic patients in the early nephropathy stage, such subjects , have or are likely to have diabetic nephropathy after the overt nephropathy stage, or have diabetic nephropathy in the early stage and are likely to have elevated albuminuria is high
  • the phenyl sulfates/creatinine correction value in the subject is the ratio of creatinine concentration to phenyl sulfate concentration, and is not less than the ratio in diabetic patients in the early nephropathy stage, such subjects It indicates that the patient has or is unlikely to have diabetic nephropathy after the overt nephropathy stage, or that albuminuria is unlikely to increase.
  • the phenyl sulfates/creatinine correction value in diabetic patients in the early nephropathy stage corresponds to the phenyl sulfates/creatinine correction value in the subject (for example, the phenyl sulfates/creatinine correction value in the subject is the phenyl
  • the phenyl sulfate/creatinine corrected value in diabetic patients in the early nephropathy stage is also the ratio of phenyl sulfate concentration to creatinine concentration).
  • the phenyl sulfates and creatinine correction values in diabetic patients in the early nephropathy stage were obtained by collecting the same biological samples as those collected from the subjects, and comparing them with the biological samples collected from the subjects. Those subjected to the same treatment are preferable.
  • phenyl sulfates and creatinine corrected value As the above “percentage of diabetic patients in the early stage of nephropathy (i.e., phenyl sulfates and creatinine corrected value)" and “percentage of diabetic patients in the early stage of nephropathy (i.e., phenyl sulfates and creatinine corrected value)” may be set.
  • the phenyl sulfates/creatinine correction value is "mass of urinary phenyl sulfates/mass of urinary creatinine”
  • such predetermined threshold values are, for example, about 61 (mg/g), about 70 (mg/g ), about 79 (mg/g), and the like.
  • the range of "about” is usually within the range of ⁇ 6 (mg/g), preferably within the range of ⁇ 5 (mg/g), more preferably within the range of ⁇ 4 (mg/g), and more preferably within the range of ⁇ 4 (mg/g). means within ⁇ 3 (mg/g), even more preferably within ⁇ 2 (mg/g), most preferably within ⁇ 1 (mg/g).
  • the predetermined threshold is a diabetic nephropathy patient (early nephropathy stage diabetic nephropathy patient, overt nephropathy stage diabetic nephropathy patient, and/or renal failure stage diabetic nephropathy patient), renal It can be calculated according to a standard method based on data on the concentration of phenyl sulfates in biological samples collected from prediabetic patients, non-diabetic patients, healthy subjects, and the like.
  • the blood or urine albumin/creatinine ratio (ACR), SuPAR (soluble urokinase-type plasminogen activator receptor), estimated glomerular filtration rate value (eGFR), age, sex, duration of diabetes, BMI (Body Mass Index), SBP (Systolic Blood Pressure), HbA1c (hemoglobin A1c) (NGSP value), DBP (diastolic blood pressure), ALT (alanine aminotransferase) , TC (Total Cholesterol), TG (triglyceride), HDL (high density lipoprotein) cholesterol, and UA (uremic acid) may include a step of further measuring one or more values selected from, When determining whether or not the patient is suffering from diabetic nephropathy and the stage of diabetic nephropathy at the time of implementation of the present determination method, it is preferable to further include the step of measuring the urinary
  • the progression of the stage of diabetic nephropathy or the onset marker of diabetic nephropathy specifically, albuminuria
  • SuPAR onset marker of diabetic nephropathy
  • age, sex, diabetes Preferred are those that further comprise the step of measuring disease duration, BMI, SBP, HbA1c (NGSP value), eGFR, DBP, ALT, TC, TG, HDL cholesterol, and UA. These values can be measured by known methods.
  • Plasma samples and urine samples were collected from 362 diabetic patients, SuPAR and eGFR were examined, and phenyl sulfate (PS) and creatinine (Cre) concentrations in urine were measured by LC/MS/ Measured using MS, urinary albumin / creatinine ratio (ACR) (mg / g) and the ratio of urinary PS concentration to urinary creatinine concentration (i.e., urinary PS / urinary creatinine [hereinafter, " The urinary PS/Cr corrected value] (mg/g) was calculated, and the correlation between the two was analyzed.
  • PS phenyl sulfate
  • Cre creatinine
  • a urine sample was diluted 100-fold with ultrapure water in advance and used. When the lower limit of the standard curve range was exceeded, a 100-fold diluted urine sample was prepared again and used. Take 10 ⁇ L of the diluted urine sample in a 1.5 mL microtube, add 30 ⁇ L of the internal standard solution and 100 ⁇ L of 2-propanol solution containing 0.1% formic acid, mix, and then sonicate for 10 minutes and centrifuge for 15 minutes (16 , 500 ⁇ g, 4° C.) were performed. 100 ⁇ L of the supernatant after centrifugation was taken in another microtube, and the solvent was distilled off under reduced pressure using a centrifugal vacuum concentrator (2,000 rpm, 60° C.). 20 ⁇ L of ammonium formate (1 M)/formic acid/water (0.25:0.1:99.65) solution was added to the concentrated residue to re-dissolve and subjected to LC/MS/MS.
  • LC conditions are as follows: flow rate (A+B) 400 ⁇ L/min, (C) 600 ⁇ L/min; column temperature 40° C.; elution gradient 0% (B) (0.0-1.0 min), 0- 20% (B) (1.0-2.0min), 20-100% (B) (2.0-4.0min), 100% (B) (4.0-6.0min), 0% ( B) (6.0-7.5 min); MS/MS feed 0.6-4.4 min; sample injection 5 ⁇ L. Under these conditions, PS was detected in 3.3 min and Cre in 0.9 min.
  • TSQ Endura manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • Thermo Fisher Scientific was used as the MS device.
  • the positive (Cre)/negative (PS) ion ESI method was used as the ionization method, and the selected reaction monitoring (SRM) was used as the scan mode.
  • Measured transitions are m/z 173.0-93.0 (PS), 179.0-99.1 (PS- 13 C 6 ), 114.1-44.0 (Cre), 117.1-47.0 (Cre-D 3 ).
  • Other MS conditions are as follows: source voltage 1000 V; sheath gas pressure 60 Arb; auxiliary gas pressure 20 Arb; ion transfer tube temperature 250 °C; vaporizer temperature 300 °C; a collision voltage of 20 eV;
  • the threshold value of the urinary PS/Cr corrected value was determined in order to determine whether or not the onset of diabetic nephropathy and the stage of diabetic nephropathy can be determined.
  • Three types 61 [mg / g], 70 [mg / g], and 79 [mg / g]) are set, and three types of diabetes patients exceeding this threshold (diabetic patients in the early stage of nephropathy, early nephropathy stage diabetic patients, and diabetic patients in the overt nephropathy stage) were calculated.
  • the proportion of patients exceeding the threshold value of corrected urinary PS/Cr increased in patients with advanced overt nephropathy than in patients with early nephropathy (see Table 1). ).
  • This result indicates that the disease stage of diabetic nephropathy (especially progression from early nephropathy stage to overt nephropathy stage) can be determined using the corrected urinary PS/Cr value as an index.
  • test-positive patients were evaluated for urinary PS concentration or urinary PS/Cr correction value, and 14 types of test values (SuPAR, age, sex, duration of diabetes, BMI, SBP, HbA1c (NGSP value), Accuracy when discriminated using eGFR, DBP, ALT, TC, TG, HDL cholesterol, and UA) values was performed by multiple logistic regression analysis.
  • 14 types of test values SuPAR, age, sex, duration of diabetes, BMI, SBP, HbA1c (NGSP value), Accuracy when discriminated using eGFR, DBP, ALT, TC, TG, HDL cholesterol, and UA
  • the AUC (Area Under Curve) value in the created ROC (Receiver Operating Characteristic) curve was 0.708, whereas in addition to the above 14 types of test values Therefore, when judged based on the urinary PS concentration, the AUC value rather decreased to 0.695.
  • the AUC value increased to 0.744 when determined based on the urinary PS/Cr correction value in addition to the above 14 test values.
  • urinary It is shown that the determination using the medium PS/Cr correction value as an index improves the accuracy as compared with the determination using only the 14 types of inspection values as the index.
  • the present invention contributes to early detection and early treatment of diabetic nephropathy.

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Abstract

本発明は、初期の段階から糖尿病性腎症に現在罹患している又は将来罹患するか否を判定したり、現在又は将来の糖尿病性腎症の病期を判定する方法を提供することを課題とする。　被験者から採取された生体試料、好ましくは、尿中フェニル硫酸又はその塩（フェニル硫酸類）濃度及び尿中クレアチニン濃度を測定し、これら濃度の割合を算出し、算出した割合を指標とすると、前記被験者が、現在糖尿病性腎症に罹患している又は将来糖尿病性腎症に罹患するか否かや、前記被験者における、現在若しくは将来の糖尿病性腎症の病期、又は前記被験者におけるアルブミン尿が将来上昇するか否かを、精度よく判定できる。

Description

糖尿病性腎症の判定方法
　本発明は、初期の段階から糖尿病性腎症に現在罹患している又は将来罹患するか否かを判定したり、現在又は将来の糖尿病性腎症の病期を判定したり、将来における、糖尿病性腎症の発症マーカー（具体的には、アルブミン尿）の上昇を判定する方法等に関する。
　糖尿病は種々の慢性血管合併症を起こすことが知られており、その予後はその合併症により左右される。中でも糖尿病性腎症は生命予後にとって重要であるため、その罹患を早期に診断し進行を阻止することが望まれている。
　従来、糖尿病性腎症の病期の診断は、糖尿病の既往に加え、尿所見の変化（タンパク尿・微量アルブミン尿の検出）や、推算糸球体濾過量値（ｅＧＦＲ）の低下や、眼底検査所見（眼底血管病変の観察）に基づいて行っていた。しかし、これら診断では、糖尿病性腎症以外の他の腎疾患と区別するためには不十分であることが問題とされていた。
　一方、近年、尿又は血中の新規バイオマーカーの探索研究も行われている。例えば、ＳＥＬＤＩ（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization）－飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）を用いて、２型糖尿病患者の中から糖尿病性腎症患者を識別するために有用な尿中タンパク質を報告している（非特許文献１）。また、キャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ－ＭＳ）を用いて、尿中ポリペプチドをプロファイリングし、健常者と２型糖尿病患者を識別し得るパターンを見出している（非特許文献２）。しかし、これら文献記載の発明は、糖尿病性腎症の病期を判定できるバイオマーカーに関するものではない。また、ＣＥ－ＴＯＦＭＳを用いて、糖尿病性腎症の早期識別を可能にするバイオマーカーが同定されたことが報告されている（特許文献１）。しかし、同定されたバイオマーカー（化合物）の濃度は、異なる病期間で統計学的有意差は示されているものの、その差は少なく、実用化可能なものであるか不明である。
　最近、本発明者らは、生体試料中のフェニル硫酸塩（ＰＳ；phenyl sulfate）濃度の増加を指標として、糖尿病性腎症の発症リスクや病期を判定できることを報告している（特許文献２）。しかしながら、尿中において、クレアチニン濃度に対するＰＳ濃度の割合を指標にすると、ＰＳ濃度それ自体の値を指標とした場合と比べ、糖尿病性腎症の判定精度が向上することについては知られていなかった。
特開２０１４－３２０４６号公報 国際公開第２０１７／０５６４９８号パンフレット
Dihazi, H. et al, Clin Chem 2007, 53:1636-1645. Mischak, H. et al, Clin Sci (Lond) 2004, 107:485-495.
　本発明の課題は、初期の段階から糖尿病性腎症に現在罹患している又は将来罹患するか否かを判定したり、現在又は将来の糖尿病性腎症の病期を判定する方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、尿中のＰＳ濃度それ自体ではなく、尿中クレアチニン濃度に対する尿中ＰＳ濃度の割合が、早期の糖尿病性腎症の指標である尿中アルブミン／クレアチニン比（ＡＣＲ）と相関することを見出した。さらに、尿中において、クレアチニン濃度に対するＰＳ濃度の割合を指標として、早期腎症期の糖尿病性腎症に現在罹患している又は将来罹患するか否かや、現在若しくは将来の糖尿病性腎症の病期（特に、早期腎症期から顕性腎症期への進行）又は将来のアルブミン尿の上昇を判定できることを確認した。本発明はこれらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、糖尿病性腎症の判定方法。
被験者から採取された生体試料中のフェニル硫酸又はその塩の濃度と、クレアチニン濃度とを測定する工程（ａ）；
工程（ａ）で測定したフェニル硫酸又はその塩の濃度と、工程（ａ）で測定したクレアチニン濃度との割合を算出する工程（ｂ）；
［２］生体試料が尿である、上記［１］に記載の判定方法。
［３］工程（ｂ）で算出した割合が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸又はその塩の濃度の割合であり、かつ、腎症前期の糖尿病患者における当該割合よりも大きい場合、前記被験者は、以下の（１）～（３）のいずれかの可能性が高いことを示す、上記［１］又は［２］に記載の判定方法。
（１）早期腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している；
（２）早期腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患する；
（３）腎症前期の糖尿病患者であり、かつアルブミン尿が上昇する；
［４］工程（ｂ）で算出した割合が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸又はその塩の濃度の割合であり、かつ、早期腎症期の糖尿病患者における当該割合よりも大きい場合、前記被験者は、以下の（１’）～（３’）のいずれかの可能性が高いことを示す、上記［１］～［３］のいずれかに記載の判定方法。
（１’）顕性腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している；
（２’）顕性腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患する；
（３’）早期腎症期の糖尿病性腎症に罹患しており、かつアルブミン尿が上昇する；
［５］工程（ａ）において、フェニル硫酸又はその塩の濃度と、クレアチニン濃度を質量分析法により測定する、上記［１］～［４］のいずれかに記載の判定方法。
　上記本発明の判定方法は、医師による糖尿病性腎症の診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。また、上記判定方法のその他の態様としては、上記工程（ａ）及び（ｂ）を含む、糖尿病性腎症を診断するためのデータを収集及び／又は作成する方法を挙げることができる。かかる方法としては、より具体的には、工程（ｂ）で算出した割合を指標として、被験者について糖尿病性腎症を診断するためのデータを収集及び／又は作成する工程（ｃ－１）をさらに含む方法を挙げることができる。
　また、本発明の実施の他の形態として、上記工程（ａ）及び（ｂ）を含む、糖尿病性腎症の診断方法を挙げることができる。かかる診断方法としては、工程（ｂ）で算出した割合を指標として、被験者について糖尿病性腎症を診断する工程（ｃ－２）をさらに含む方法を挙げることができる。また、かかる診断方法としては、糖尿病性腎症（例えば、早期腎症期以降の糖尿病性腎症、顕性腎症期以降の糖尿病性腎症）に罹患している又は罹患する可能性が高い、あるいはアルブミン尿が上昇する可能性が高いと診断された被験者（患者）に対して、糖尿病性腎症の病期の進行及び／又は糖尿病性腎症の症状の悪化を予防できる薬を投与するステップをさらに含むものが好ましい。
　本発明によると、現在糖尿病性腎症に罹患している又は将来糖尿病性腎症に罹患するか否かや、現在又は将来の糖尿病性腎症の病期（特に、早期腎症期から顕性腎症期への進行）や、将来アルブミン尿が上昇するか否かを精度よく判定することができるため、糖尿病性腎症の早期発見に必要な定期健診等の糖尿病性腎症の検診者の増加が期待される他、腎機能障害や腎不全への進行を防ぎ、ＱＯＬ（Quality of Life）の向上や医療費削減等の効果が期待される。
図１Ａは、糖尿病患者における尿中ＰＳ濃度（横軸）及び尿中ＡＣＲ（縦軸）の相関関係を解析した結果を示す図である。図１Ｂは、糖尿病患者における尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値（横軸）及び尿中ＡＣＲ（縦軸）の相関関係を解析した結果を示す図である。 早期腎症期の糖尿病患者について、２年後に顕性腎症期へ病期が進行した患者を検査陽性とし、尿中ＰＳ濃度（図２Ａ）又は尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値（図２Ｂ）と、１４種類の検査値（ＳｕＰＡＲ、年齢、性別、糖尿病の罹患期間、ＢＭＩ、ＳＢＰ、ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ値）、ｅＧＦＲ、ＤＢＰ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＨＤＬコレステロール、及びＵＡ）の値を独立変数とした多重ロジスティック回帰分析を行った結果を示す図である。
　本発明の糖尿病性腎症の判定方法としては、被験者（提供者ともいう）から採取された生体試料中のフェニル硫酸又はその塩（以下、これらを総称して「フェニル硫酸類」ということがある）濃度と、当該生体試料中のクレアチニン濃度とを測定し、必要に応じてこれらの濃度を定量する工程（ａ）；及び、工程（ａ）で測定したフェニル硫酸類濃度の値と、工程（ａ）で測定したクレアチニン濃度の値との割合を算出する工程（ｂ）；を順次含む方法（但し、医師による診断行為を除く。）（以下、「本件判定方法」ということがある）であれば特に制限されず、より具体的には、工程（ｂ）で算出した割合（以下、「被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値」ということがある）を指標として、前記被験者について糖尿病性腎症を判定する工程（ｃ）をさらに含む方法を挙げることができる。
　本明細書において、「糖尿病性腎症を判定（診断）する」には、現在、糖尿病性腎症に罹患しているか否かを判定（診断）すること；将来、糖尿病性腎症に罹患するか否かを判定（診断）すること；現在における糖尿病性腎症の病期（ステージ）を判定（診断）すること；将来における、糖尿病性腎症の病期（ステージ）を判定（診断）すること；及び、将来における、糖尿病性腎症の発症マーカー（具体的には、アルブミン尿）の上昇を判定（診断）すること；が含まれる。
　上記糖尿病性腎症は、早期の糖尿病性腎症の指標であるＡＣＲや、推算糸球体濾過量値（ｅＧＦＲ）を基に、各病期（ステージ）に分類することができる。例えば、糖尿病性腎症合同委員会による２０１３年１２月付で改訂された糖尿病性腎症病期分類に基づき分類した場合、尿中ＡＣＲが３０（ｍｇ／ｇ）未満の正常アルブミン尿であり、かつｅＧＦＲが３０（ｍＬ／分／１．７３ｍ２）以上を示す糖尿病患者は、第１期（腎症前期）に分類され、尿中ＡＣＲが３０～２９９（ｍｇ／ｇ）の微量アルブミン尿であり、かつｅＧＦＲが３０（ｍＬ／分／１．７３ｍ２）以上を示す糖尿病患者は、第２期（早期腎症期）に分類され、尿中ＡＣＲが３００（ｍｇ／ｇ）以上の顕性アルブミン尿、又は持続性蛋白尿が０．５（ｇ／ｇＣｒ）以上であり、かつｅＧＦＲが３０（ｍＬ／分／１．７３ｍ２）以上を示す糖尿病患者は、第３期（顕性腎症期）に分類され、ｅＧＦＲが３０（ｍＬ／分／１．７３ｍ２）未満を示す糖尿病患者（好ましくは尿中ＡＣＲが３００［ｍｇ／ｇ］以上の顕性アルブミン尿、又は持続性蛋白尿が０．５［ｇ／ｇＣｒ］以上を示す糖尿病患者）は、第４期（腎不全期）に分類され、透析療法中の糖尿病患者は、第５期（透析療法期）に分類される。
　本明細書において、「糖尿病性腎症の罹患」とは、微量アルブミン尿が検出される、第２期（早期腎症期）以降の糖尿病性腎症に罹患した状態を意味する。すなわち、第１期（腎症前期）は糖尿病性腎症の罹患（発症）前に相当し、第２期（早期腎症期）～第４期（腎不全期）は糖尿病性腎症の罹患（発症）後に相当する。また、本明細書において、「糖尿病性腎症に罹患している」とは、本件判定方法の実施時点において、糖尿病性腎症に罹患していることを意味し、「糖尿病性腎症に罹患する」とは、本件判定方法の実施後、近い将来（例えば、少なくとも１～３年後、好ましくは少なくとも２年後；以下同じ）に糖尿病性腎症に罹患することを意味する。
　上記被験者としては、例えば、糖尿病性腎症に罹患していない（糖尿病性腎症を発症していない）被験者（例えば、糖尿病に罹患しているか否かが不明な被験者、糖尿病患者）や、糖尿病性腎症に罹患している被験者（糖尿病性腎症患者）を挙げることができる。かかる糖尿病性腎症患者には、病期（進行度）が不明な糖尿病性腎症患者が含まれ、かかる病期が不明な糖尿病性腎症患者には、過去に糖尿病性腎症に罹患したことがあり、被験時に病期（進行度）が不明な糖尿病性腎症患者も含まれる。
　上記生体試料としては、組織、細胞、器官等の非液性試料や、血液（血漿、血清）、尿、唾液等の液性試料を挙げることができ、これらの中でも尿が好ましい。
　本件判定方法において、検出対象のフェニル硫酸は下記の化合物（分子量１７４．１７）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本件判定方法において、検出対象のフェニル硫酸塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛から生成された金属塩や、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、リジン、プロカイン等から生成された有機塩などが含まれる。
　本件判定方法の工程（ａ）において、フェニル硫酸類濃度及びクレアチニン濃度を測定する方法としては、フェニル硫酸類及びクレアチニンを検出でき、必要に応じてこれらの濃度を定量できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、質量分析計（ＭＳ）を用いた質量分析法や、免疫学的測定法を挙げることができ、これらの中でも、質量分析法が好ましい。
　上記質量分析計（ＭＳ）としては、例えば、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフタンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）、キャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ－ＭＳ）、ＳＥＬＤＩ（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization）－飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）を挙げることができる。
　上記免疫学的測定法としては、例えば、フェニル硫酸類に特異的に結合する抗体（例えば、特開２０１８－１０２２１１号公報参照）及びクレアチニンに特異的に結合する抗体を用いた免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリー等の方法を挙げることができる。また、フェニル硫酸類濃度及びクレアチニン濃度の測定には、市販されているキット（例えば、尿中クレアチニン測定用ＥＬＩＳＡキット［医化学創薬社製］、「Creatinine, Assay Kit, Colorimetric, for Serum Sample」［Caymanchemical社製］）を利用することができる。
　本件判定方法の工程（ｂ）において、工程（ａ）で測定したフェニル硫酸類濃度と、工程（ａ）で測定したクレアチニン濃度との割合を算出する方法としては、フェニル硫酸類濃度の値をクレアチニン濃度の値で割ることにより、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合を算出してもよいし、クレアチニン濃度の値をフェニル硫酸類濃度の値で割ることにより、フェニル硫酸類濃度に対するクレアチニン濃度の割合を算出してもよいが、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合を算出することが好ましい。
　本件判定方法において、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合であり、かつ、腎症前期の糖尿病患者における当該割合よりも大きい場合、かかる被験者は、早期腎症期以降（すなわち、早期腎症期、顕性腎症期、又は腎不全期）の糖尿病性腎症に罹患している又は罹患する可能性が高い、あるいは、腎症前期の糖尿病患者であり、かつアルブミン尿が上昇する可能性が高いことを示し、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合であり、かつ、腎症前期の糖尿病患者における当該割合よりも大きくない場合、かかる被験者は、早期腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している又は罹患する可能性が低い、あるいはアルブミン尿が上昇する可能性が低いことを示す。
　また、本件判定方法において、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、フェニル硫酸類濃度に対するクレアチニン濃度の割合であり、かつ、腎症前期の糖尿病患者における当該割合よりも小さい場合、かかる被験者は、早期腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している又は罹患する可能性が高い、あるいは、腎症前期の糖尿病患者であり、かつアルブミン尿が上昇する可能性が高いことを示し、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、フェニル硫酸類濃度に対するクレアチニン濃度の割合であり、かつ、腎症前期の糖尿病患者における当該割合よりも小さくない場合、かかる被験者は、早期腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している又は罹患する可能性が低い、あるいはアルブミン尿が上昇する可能性が低いことを示す。
　なお、腎症前期の糖尿病患者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値は、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値と対応するもの（例えば、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合である場合、腎症前期の糖尿病患者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値についても同様に、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合である）である。また、腎症前期の糖尿病患者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値は、被験者から採取された生体試料と同じ生体試料を、腎症前期の糖尿病患者から採取し、被験者から採取された生体試料と同様の処理が施されたものが好ましい。
　また、本件判定方法において、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合であり、かつ、早期腎症期の糖尿病患者における当該割合よりも大きい場合、かかる被験者は、顕性腎症期以降（すなわち、顕性腎症期又は腎不全期）の糖尿病性腎症に罹患している又は罹患する可能性が高い、あるいは、早期腎症期の糖尿病性腎症に罹患しており、かつアルブミン尿が上昇する可能性が高いことを示し、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合であり、かつ、早期腎症期の糖尿病患者における当該割合よりも大きくない場合、かかる被験者は、顕性腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している又は罹患する可能性が低い、あるいはアルブミン尿が上昇する可能性が低いことを示す。
　また、本件判定方法において、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、フェニル硫酸類濃度に対するクレアチニン濃度の割合であり、かつ、早期腎症期の糖尿病患者における当該割合よりも小さい場合、かかる被験者は、顕性腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している又は罹患する可能性が高い、あるいは、早期腎症期の糖尿病性腎症に罹患しており、かつアルブミン尿が上昇する可能性が高いことを示し、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、フェニル硫酸類濃度に対するクレアチニン濃度の割合であり、かつ、早期腎症期の糖尿病患者における当該割合よりも小さくない場合、かかる被験者は顕性腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している又は罹患する可能性が低い、あるいはアルブミン尿が上昇する可能性が低いことを示す。
　なお、早期腎症期の糖尿病患者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値は、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値と対応するもの（例えば、被験者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合である場合、早期腎症期の糖尿病患者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値についても同様に、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸類濃度の割合である）である。また、早期腎症期の糖尿病患者におけるフェニル硫酸類・クレアチニン補正値は、被験者から採取された生体試料と同じ生体試料を、腎症前期の糖尿病患者から採取し、被験者から採取された生体試料と同様の処理が施されたものが好ましい。
　上記「腎症前期の糖尿病患者における当該割合（すなわち、フェニル硫酸類・クレアチニン補正値）」や「早期腎症期の糖尿病患者における当該割合（すなわち、フェニル硫酸類・クレアチニン補正値）」として、所定の閾値を設けてもよい。かかる所定の閾値としては、フェニル硫酸類・クレアチニン補正値が「尿中フェニル硫酸類の質量／尿中クレアチニンの質量」である場合、例えば、約６１（ｍｇ／ｇ）、約７０（ｍｇ／ｇ）、約７９（ｍｇ／ｇ）等を挙げることができる。
　上記「約」の範囲とは、通常±６（ｍｇ／ｇ）の範囲内、好ましくは±５（ｍｇ／ｇ）の範囲内、より好ましくは±４（ｍｇ／ｇ）の範囲内、さらに好ましくは±３（ｍｇ／ｇ）の範囲内、さらにより好ましくは±２（ｍｇ／ｇ）、最も好ましくは±１（ｍｇ／ｇ）の範囲内を意味する。
　上記所定の閾値は、糖尿病性腎症患者（早期腎症期の糖尿病性腎症患者、顕性腎症期の糖尿病性腎症患者、及び／又は腎不全期の糖尿病性腎症患者）、腎症前期の糖尿病患者、非糖尿病患者、健常者などから採取された生体試料中のフェニル硫酸類濃度のデータを基に、定法にしたがって算出することができる。
　本件判定方法としては、糖尿病性腎症の判定精度をより高めるために、被験者における血中又は尿中アルブミン／クレアチニン比（ＡＣＲ）、ＳｕＰＡＲ（soluble urokinase-type plasminogen activator receptor）、推算糸球体濾過量値（ｅＧＦＲ）、年齢、性別、糖尿病の罹患期間、ＢＭＩ（Body Mass Index）、ＳＢＰ（Systolic Blood Pressure）、ＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンＡ１ｃ）（ＮＧＳＰ値）、ＤＢＰ（diastolic blood pressure）、ＡＬＴ（alanine aminotransferase）、ＴＣ（Total Cholesterol）、ＴＧ（triglyceride）、ＨＤＬ（high density lipoprotein）コレステロール、及びＵＡ（uremic acid）から選択される１又は２以上の値をさらに測定する工程を含むものであってもよく、本件判定方法の実施時点において、糖尿病性腎症に罹患しているか否かや、糖尿病性腎症の病期を判定する場合、被験者における尿中ＡＣＲをさらに測定する工程を含むものが好ましく、本件判定方法の実施後、近い将来における、糖尿病性腎症の病期進行又は糖尿病性腎症の発症マーカー（具体的には、アルブミン尿）の上昇を判定する場合、ＳｕＰＡＲ、年齢、性別、糖尿病の罹患期間、ＢＭＩ、ＳＢＰ、ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ値）、ｅＧＦＲ、ＤＢＰ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＨＤＬコレステロール、及びＵＡをさらに測定する工程を含むものが好ましい。これら値は公知の方法により測定することができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
　糖尿病患者３６２名から血漿サンプル及び尿サンプルを採取し、ＳｕＰＡＲ及びｅＧＦＲを検査するとともに、尿中のフェニル硫酸塩（ＰＳ）濃度及びクレアチニン（Ｃｒｅ）濃度を、以下に示す方法に従い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定し、尿中アルブミン／クレアチニン比（ＡＣＲ）（ｍｇ／ｇ）と、尿中のクレアチニン濃度に対する尿中のＰＳ濃度の割合（すなわち、尿中ＰＳ／尿中クレアチニン［以下、「尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値」という］（ｍｇ／ｇ）を算出し、両者の相関関係を解析した。
１．方法
［検量線試料の作成］
　ＰＳ（Sundia MediTech Company社製)及びＣｒｅ（富士フイルム和光純薬社製）を超純水に溶解し、各々１０ｍＭのストック溶液を調製した。これらを混合し、さらに超純水で希釈し、２００μＭのＰＳ及び１０００μＭのＣｒｅを含むワーキングソリューションを調製した。続いてかかるワーキングソリューションを段階希釈し、１／１、１／２、１／５、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００、１／２００、１／５００、１／１０００、１／２０００、及び１／５０００の１２濃度点の検量線試料とした。各濃度の検量線試料１０μＬを内標準溶液（１０μＭのＰＳ－１３Ｃ６及び１０μＭのＣｒｅ－Ｄ３［Cayman Chemical Company社製］を含む超純水）３０μＬと混合し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供した。
［尿試料の前処理］
　尿試料は予め超純水で１００倍に希釈したものを用いた。検量線範囲の下限を下回った場合、１００倍希釈した尿試料を再度調製して用いた。希釈尿試料１０μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、上記内標準溶液３０μＬ及び０．１％ギ酸を含む２－プロパノール液１００μＬを加え、混合後、１０分間の超音波処理と１５分間の遠心処理（１６，５００×ｇ、４℃）を行った。遠心後の上清１００μＬを別のマイクロチューブにとり、遠心減圧濃縮器で溶媒を減圧留去した（２，０００ｒｐｍ、６０℃）。濃縮残渣にギ酸アンモニウム（１Ｍ）／ギ酸／水（０．２５：０．１：９９．６５）液２０μＬを加えて再溶解し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供した。
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定］
　ＬＣ装置にはACQUITY UPLC（Waters社製）、分析カラムにはCapcell pak ADME-HR（2.1×100 mm、2 μm particle size、大阪ソーダ社製）を用いた。移動相には、（Ａ）ギ酸アンモニウム（１Ｍ）／ギ酸／水（０．２５：０．１：９９．６５）液及び（Ｂ）メタノールを用いた。またポストカラム液に（Ｃ）２－プロパノールを用いた。その他のＬＣ条件は以下のとおりである：流速（Ａ＋Ｂ）４００μＬ／ｍｉｎ、（Ｃ）６００μＬ／ｍｉｎ；カラム温度４０℃；溶出グラジエント０％（Ｂ）（０．０－１．０ｍｉｎ）、０－２０％（Ｂ）（１．０－２．０ｍｉｎ）、２０－１００％（Ｂ）（２．０－４．０ｍｉｎ）、１００％（Ｂ）（４．０－６．０ｍｉｎ）、０％（Ｂ）（６．０－７．５ｍｉｎ）；ＭＳ／ＭＳ導液０．６－４．４ｍｉｎ；試料注入５μＬ。本条件下でＰＳは３．３ｍｉｎ、Ｃｒｅは０．９ｍｉｎで検出した。
　ＭＳ装置にはTSQ Endura（Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。イオン化法には正（Ｃｒｅ）／負（ＰＳ）両イオンのＥＳＩ法、スキャンモードには選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を用いた。測定対象遷移はｍ／ｚ１７３．０－９３．０（ＰＳ）、１７９．０－９９．１（ＰＳ－１３Ｃ６）、１１４．１－４４．０（Ｃｒｅ）、１１７．１－４７．０（Ｃｒｅ－Ｄ３）に設定した。その他のＭＳ条件は以下のとおりである：ソース電圧１０００Ｖ；シースガス圧６０Ａｒｂ；オグジュアリーガス圧２０Ａｒｂ；イオントランスファーチューブ温度２５０℃；ヴェイポライザー温度３００℃；ＲＦレンズ電圧８０Ｖ；コリジョンガス圧２．０ｍＴｏｒｒ；コリジョン電圧２０ｅＶ。
［データ解析］
　取得したデータの解析には、Xcalibur（Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。検量線作成及びＱＣ評価は、「医薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法のバリデーションに関するガイドライン」に従って実施した。
２．結果
　早期の糖尿病性腎症の指標である尿中ＡＣＲ値及び尿中ＰＳ値の間では、相関関係が認められなかったのに対して（ｐ＝０．６４６１）（図１Ａ参照）、尿中ＡＣＲ値及び尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値の間では、有意な相関関係が認められた（ｐ＝０．００６）（図１Ｂ参照）。
　この結果は、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値を用いた方が、尿中ＰＳ値を用いた場合と比べ、早期の糖尿病性腎症を精度よく判定できることを示している。なお、腎機能の指標であるＳｕＰＡＲ値又はｅＧＦＲ値と、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値との間では相関関係は認められなかった（それぞれｐ＝０．５０４、及びｐ＝０．４４９）。
　次に、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無や、糖尿病性腎症の病期を判定できるかどうか検討するために、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値の閾値を３種類（６１［ｍｇ／ｇ］、７０［ｍｇ／ｇ］、及び７９［ｍｇ／ｇ］）設定し、この閾値を超える３種類の糖尿病患者（腎症前期の糖尿病患者、早期腎症期の糖尿病患者、及び顕性腎症期の糖尿病患者）の割合を算出した。
　その結果、糖尿病性腎症の発症前である腎症前期の糖尿病患者よりも、糖尿病性腎症の発症初期である早期腎症期の糖尿病患者の方が、いずれの閾値を設定した場合でも、閾値を超える患者の割合が増加することが示された（表１参照）。
　この結果は、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値を指標として、初期の段階である早期腎症期の糖尿病性腎症に罹患しているか否かを判定できることを示している。
　また、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値の閾値を超える患者の割合は、早期腎症期の糖尿病患者よりも、病期が進行した顕性腎症期の糖尿病患者の方が増加した（表１参照）。
　この結果は、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値を指標として、糖尿病性腎症の病期（特に、早期腎症期から顕性腎症期への進行）を判定できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次に、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値を指標として糖尿病性腎症の病期進行を判定できるかどうかを検討した。まず、早期腎症期の糖尿病患者（ｎ＝８７）について、２年後に、顕性腎症期へ病期が進行するか、あるいはＡＣＲが２倍以上に上昇した患者を検査陽性とし、検査陽性患者と、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値との相関関係を調べたところ、有意に相関することが確認された（ｐ＝０．０４５）。次に、上記検査陽性患者を、尿中ＰＳ濃度又は尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値と、１４種類の検査値（ＳｕＰＡＲ、年齢、性別、糖尿病の罹患期間、ＢＭＩ、ＳＢＰ、ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ値）、ｅＧＦＲ、ＤＢＰ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＨＤＬコレステロール、及びＵＡ）の値とを用いて判別した場合の精度を、多重ロジスティック回帰分析により行った。
　その結果、上記１４種類の検査値のみでは、作成したＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線におけるＡＵＣ（Area Under Curve）値は、０．７０８であったのに対して、上記１４種類の検査値に加えて、尿中ＰＳ濃度を基に判別すると、ＡＵＣ値はむしろ０．６９５に低下した。一方、上記１４種類の検査値に加えて、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値を基に判別すると、ＡＵＣ値は０．７４４に上昇した。
　この結果は、早期腎症期の糖尿病患者が、将来、顕性腎症期へ病期が進行するか、あるいはアルブミン尿が上昇するか否かを、上記１４種類の検査値に加えて、尿中ＰＳ・Ｃｒ補正値を指標として判定した方が、上記１４種類の検査値のみを指標として判定した場合よりも、精度が向上することを示している。
　本発明は、糖尿病性腎症の早期発見及び早期治療に資するものである。
 

Claims (5)

  1. 　以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、糖尿病性腎症の判定方法。
    被験者から採取された生体試料中のフェニル硫酸又はその塩の濃度と、クレアチニン濃度とを測定する工程（ａ）；
    工程（ａ）で測定したフェニル硫酸又はその塩の濃度と、工程（ａ）で測定したクレアチニン濃度との割合を算出する工程（ｂ）；
  2. 　生体試料が尿である、請求項１に記載の判定方法。
  3. 　工程（ｂ）で算出した割合が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸又はその塩の濃度の割合であり、かつ、腎症前期の糖尿病患者における当該割合よりも大きい場合、前記被験者は、以下の（１）～（３）のいずれかの可能性が高いことを示す、請求項１又は２に記載の判定方法。
    （１）早期腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している；
    （２）早期腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患する；
    （３）腎症前期の糖尿病患者であり、かつアルブミン尿が上昇する；
  4. 　工程（ｂ）で算出した割合が、クレアチニン濃度に対するフェニル硫酸又はその塩の濃度の割合であり、かつ、早期腎症期の糖尿病患者における当該割合よりも大きい場合、前記被験者は、以下の（１’）～（３’）のいずれかの可能性が高いことを示す、請求項１～３のいずれかに記載の判定方法。
    （１’）顕性腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患している；
    （２’）顕性腎症期以降の糖尿病性腎症に罹患する；
    （３’）早期腎症期の糖尿病性腎症に罹患しており、かつアルブミン尿が上昇する；
  5. 　工程（ａ）において、フェニル硫酸又はその塩の濃度と、クレアチニン濃度を質量分析法により測定する、請求項１～４のいずれかに記載の判定方法。
     
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