TWI839361B - 腎病變小分子生物標記及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及生物標記、方法，以及分析套組，係用於鑑定及篩選腎病變並且監控腎病變的治療。

Description

腎病變小分子生物標記及其應用
相關申請案。本申請案主張根據美國專利法第119條(35U.S.C. §119)於2018年6月21日提出申請的美國臨時申請案第USSN 62/688,147之權益，其全部內容透過引用併入本文。
本發明涉及生物標記、方法，以及分析套組，係用於鑑定及篩選腎病變並且監控腎病變的進展。
腎損傷，也稱為腎病變，可由例如藥物毒性、發炎反應、高血壓，以及糖尿病所引起。腎臟疾病通常是一種進行性疾病，這表示腎臟的損害往往是永久性而無法回復的。因此，在損害發生前儘早發現腎臟疾病非常重要。如果在早期階段發現腎臟疾病，可以很有效地進行治療。慢性腎病變的治療著重於減緩腎臟損害的進展，通常是透過控制潛在的原因。慢性腎病變可發展為末期腎衰竭，若沒有人工過濾(透析，洗腎)或腎移植的話就會致命。特定而言，成人群體中糖尿病(diabetes mellitus，DM)的罹患率正在增加1,2 ，糖尿病腎病變(diabetic nephropathy，DN)仍是末期腎病變的主要原因3,4 。大約30-40%的洗腎患者罹患糖尿病(DM)以及相關的心血管合併症4 。這類患者的存活率低於罹患糖尿病的非洗腎患者或非糖尿病的洗腎患者的存活率5 。目前管理糖尿病(DM)的共識為認識到早期糖尿病腎病變(DN)檢測的重要性，因為它能夠早期啟動糖尿病腎病變患者的特定治療以及飲食限制，以阻止腎功能衰退進展為慢性腎病變(chronic kidney disease，CKD)甚至是末期腎衰竭6 。
通常，透過分析蛋白尿含量(例如，尿白蛋白的含量)或透過檢查腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)來診斷腎病變。其他相關參數包括例如收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、血紅素A1c (hemoglobin A1c，HbA1c)。然而，這些方法缺乏足夠的靈敏度及/或選擇性，尤其是在沒有明顯症狀發生時檢測早期腎病變。雖然腎病變也可透過腎活體組織切片來檢測，但是這種侵入性手術並不是理想的方法，因為大多數患者不願意這樣做，因此可能導致晚期診斷，直到臨床特徵外顯或已經發展疾病惡化。腎臟活體組織切片也可能導致嚴重出血併發症之風險。
需要開發一種用於檢測腎病變之方法，特別是用於一般篩檢、早期檢測，以及非侵入性之方法。
本發明出乎意料地發現，相較於對照(健康)無腎病變之個體的正常含量，在腎病變患者中，可以在個體的尿液中檢測到某些代謝物的含量的降低，包括N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸，或纈胺酸這種胺基酸的含量增加。因此，包括N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸，以及纈胺酸這種胺基酸在內的代謝產物可作為診斷腎病變的特異性生物標記，特別是用於早期診斷，也可用於在罹患腎病變的患者中監測腎病變的進展。
於一方面，本發明提供了一種用於檢測在個體中的腎病變之方法，該方法包括： (i) 提供從該待測個體中獲得之生物樣品； (ii) 進行第一檢測，其包括在該生物樣品中確定第一生物標記之含量以獲得第一檢測含量，將該第一檢測含量與該第一生物標記的第一參考含量進行比較以獲得第一比較結果，以及基於該第一比較結果評估該個體是否罹患腎病變或具有發展腎病變之風險，其中該第一生物標記係選自由N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷、組胺酸，以及其任何組合之群組，且相較於該第一參考含量，該第一檢測含量的降低表示該個體罹患腎病變或具有發展腎病變之風險；及/或 (iii) 進行第二檢測，其包括在該生物樣品中確定第二生物標記的含量以獲得第二檢測含量，將該第二檢測含量與該第二生物標記的第二參考含量進行比較以獲得第二比較結果，以及基於該第二比較結果評估該個體是否罹患腎病變或具有發展腎病變之風險，其中該第二生物標記為纈胺酸，且相較於該第二參考含量，該第二檢測含量的增加表示該個體罹患腎病變或具有發展腎病變之風險。
於另一方面，本發明提供一種用於在罹患腎病變的患者中監測腎病變進展之方法，該方法包括： (a) 於早期時間點從該患者提供早期生物樣品； (b) 於較晚時間點從該患者提供較晚生物樣品，其中該較晚時間點晚於該早期時間點； (c) 進行第一檢測，其包括分別在該早期生物樣品中以及該較晚生物樣品中確定第一生物標記的含量，以分別獲得該第一生物標記的早期檢測含量以及較晚檢測含量，比較該第一生物標記的該早期檢測含量與該較晚檢測含量以獲得第一比較結果，以及基於該第一比較結果評估該患者的腎病變進展，其中該第一生物標記選自由N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷、組胺酸，以及其任何組合所組成之群組，且相較於該第一生物標記的該早期檢測含量，該第一生物標記的該較晚檢測含量的下降表示該患者的腎病變進展；及/或 (d) 進行第二檢測，其包括分別在該早期生物樣品中以及該較晚生物樣品中確定第二生物標記的含量，以分別獲得該第二生物標記的早期檢測含量以及較晚檢測含量，比較該第二生物標記的該早期檢測含量與該較晚檢測含量以獲得第二比較結果，以及基於該第二比較結果評估該患者的腎病變進展，其中該第二生物標記為纈胺酸，且相較於該第二生物標記的該早期檢測含量，該第二生物標記的該較晚檢測含量的增加表示該患者的腎病變進展。
於一些具體實施例中，透過質譜法進行該檢測。
於一些具體實施例中，該生物樣品為尿液樣品。
於一些具體實施例中，如本文所述之方法進一步包括在該生物樣品中確定至少一種生理參數。該生理參數之實例包括，但不限於，年齡、性別、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、血紅素A1c (hemoglobin A1c，HbA1c)、糖尿病持續時間、肌酸酐、預估的腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、白蛋白尿、尿白蛋白與肌酸酐比(albumin to creatinine ratio，ACR)及其任何組合。
於一些具體實施例中，該待測個體為糖尿病患者。
於本發明之一些具體實施例中，該腎病變為慢性腎病變(CKD)。
於本發明之一些具體實施例中，該慢性腎病變(CKD)為早期慢性腎病變(CKD)，具體而言是第一階段或第二階段，或者該慢性腎病變(CKD)為第三階段或第四階段慢性腎病變(CKD)。
於一些具體實施例中，若確定該個體罹患腎病變，則對該個體進行治療腎病變之治療方法。
於另一方面，本發明提供一種用於實施如本文所述之方法之套組，以及使用該套組檢測如本文所述之生物標記的存在或含量之說明書。
還提供了特異性識別如本文所述之生物標記的試劑用於診斷腎病變或監測腎病變進展，或用於製備用於診斷腎病變或監測腎病變進展的套組或組合物的試劑之用途。
於以下之描述中闡述了本發明之一個或多個具體實施例之細節。從以下幾個具體實施例之詳細描述以及所附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將變得顯而易見。
為了提供對本發明之清楚並快速的理解，首先定義某些術語。在整個詳細描述中闡述了額外的定義。除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之技術人員通常理解的含義相同之含義。
如本文所用，冠詞「一」以及「一個」係指該冠詞的一個或多於一個(即，至少一個)語法對象。舉例來說，「一元素」表示一個元素或多於一個元素。
如本文所用，「約」或「近似」等詞係指本領域普通技術人員將理解的可接受偏差程度，這可能會有所不同，具體取決於使用它的環境。通常，「約」或「近似」可表示在引用值附近具有±10%範圍之數值。
如本文所用，「包含(動詞)」或「包含(動名詞)」等詞通常以包括(動詞)/包括(動名詞)的含義使用，其代表允許存在一種或多種特徵、成分或組成分。「包含(動詞)」或「包含(動名詞)」等詞包括「由......組成(動詞)」或「由......組成(動名詞)」等詞。
如本文所用，「受試者」、「個體」以及「患者」等詞係指需要診斷、預後、處理，或治療的任何哺乳動物個體，特別是人類。其他個體可包括牛、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等。
如本文所用，本文使用之「診斷」乙詞通常包括確定一個體是否可能受目標疾病、病症，或功能障礙之影響。本領域技術人員通常基於一種或多種診斷指標(即，標記)進行診斷，診斷該標記的存在、不存在，或其指示疾病、病症或功能障礙的存在或不存在的含量。本領域技術人員將理解，診斷並不表示以100%的準確度確定特定疾病的存在或不存在，而是在一個體中存在某種疾病的可能性增加。
如本文所用，「治療」乙詞係指將一種或多種活性劑應用或施用於一個體，該個體受一疾病、該疾病之一症狀或病症，或該疾病之進展的影響，目的在於治療、治癒、緩解、減輕、改變、補救、改善，促進，或影響該疾病、該疾病之症狀或病症，由該疾病引起之殘疾，或該疾病之進展或傾向。
如本文所用，「正常個體」可用於指一基本上處於健康狀態而沒有特定疾病(例如，腎病變)之個體，並且可以指單個正常個體或一群正常的個體。
如本文所用，「對照個體」乙詞可用於指未患有目標疾病(例如，腎病變)之個體，並且可以指單個對照個體或一群對照個體。於一些具體實施例中，一對照個體可以指正常/健康個體。於一些具體實施例中，一對照個體可以指未罹患腎病變之個體(或糖尿病患者)。
如本文所用，「異常量」係指相較於未患有目標疾病(例如，腎病變)的個體或參考量或對照量，增加或減少的指示劑的量。特定而言，例如，異常量可以比參考或對照量高出5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或100%或更多；或異常量可以比參考或對照量低5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或100%或更多。參考或對照量可指在正常個體或對照樣品(例如，不含目標疾病的組織或細胞或任何生物學樣品)中測量的量。於本領域中，透過使用常規檢測以及統計方法分析來自正常個體群體的樣品中標記的檢測量，可以獲得一範圍的正常量值。
如本文所用，如本文所用之生物標記的「低表現」以及「高表現」係指相對於樣品中發現的生物標記含量的相對術語。於一些具體實施例中，可透過比較對照組、未患病樣品中的生物標記表現含量，以確定低表現及高表現，其中低表現可指相對於對照、未患病樣品的表現含量的較低表現含量者，而高表現可指對相對於對照、未患病樣品中的表現含量的較高表現含量者。
如本文所用，生物學標記(生物標記)為客觀測量並評價的特徵(例如，蛋白質、胺基酸、代謝物、基因或遺傳表現)，作為正常或異常生物過程、疾病、致病過程，或對治療或治療干預的反應之指標。生物標記可包括存在或不存在指示特定生物過程的特徵或模式或特徵之集合。生物標記測量可增加或減少以指示某種生物事件或過程。標記主要用於診斷及預後目的。然而，其可用於本文所述之治療、監測、藥物篩選以及其他目的，包括評估治療劑之有效性。
如本文所用，待透過本文所述之任何方法分析的生物樣品可為從待診斷的個體獲得的任何類型之樣品。於一些具體實施例中，生物樣品可為體液樣品，例如血液樣品、尿液樣品，或腹水樣品。通常，生物樣品為尿液樣品。在其他具體實施例中，血液樣品可為全血或其部分，例如血清或血漿，進行肝素化或EDTA處理，以避免血液凝固。或者，該生物樣品可為組織樣品或從腎取得的活體組織切片樣品。
如本文所用，如本文所用之「生理參數」乙詞通常係指可被監測以確定與患者相關的一種或多種定量生理含量及/或活性的任何參數。生理參數之實例包括，但不限於，年齡、性別、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、空腹血糖(FBG)、血紅素A1c (HbA1c)、糖尿病持續時間，肌酸酐、預估的腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、白蛋白尿、尿白蛋白與肌酸酐比(ACR)及其任何組合。於某些特定具體實施例中，該生理參數包括空腹血糖(FBG)及/或舒張壓(DBP)。
如本文所用，「腎病變」乙詞係指其中發生腎損傷的生理狀況，其特異性地破壞其適當調節血液與尿液中溶質濃度的能力。腎病變可透過一種或多種病理學變化來描述特徵：腎小球大小、簇狀纖維化、鮑氏囊纖維化、擴張、微血管變窄、基底膜增厚、細胞增多(腎小球環間膜或內皮)、白血球浸潤、微血管血栓、腎小管萎縮、壞死、液泡及透明液滴變化、基底膜增厚、擴張、發炎細胞與管腔內的鑄型、間質纖維化、水腫、急性與慢性白血球浸潤、小動脈纖維化、血栓形成、透明變化及變窄。一般而言，在腎病變的早期階段，腎臟仍能很好地過濾掉血液中的廢棄物；在中期階段，腎臟可能需要更加努力地擺脫廢棄物；在晚期階段，腎臟可能會停止工作。通常且常規地，可以透過尿蛋白濃度來評估腎病變。腎病變的早期臨床特徵為尿液中白蛋白濃度低但異常 (白蛋白排泄率(albumin excretion rate，AER)：30-300 mg/24小時；或白蛋白對肌酸酐比(ACR)：30-300 mg/g)，稱為微量白蛋白尿，該患者患有初始腎病變(初期腎病變)。若未經過適當的治療，這樣的患者會發展為持續的微量白蛋白尿並轉變為嚴重的腎病變(明顯的腎病變)，也稱為大量白蛋白尿(白蛋白排泄率(AER) > 300 mg/24小時或白蛋白與肌酸酐比(ACR) > 300 mg/g)，最後進展為末期腎病變(end stage renal disease，ERSD)。預估的腎小球濾過率(eGFR)亦為腎病變之一指標。慢性腎病變(CKD)定義為：在帶有或沒有蛋白尿的患者中具有預估的腎小球濾過率(eGFR)低於60 ml/分鐘超過3個月。不論患者所具有的預估的腎小球濾過率(eGFR)含量低或高，只要該患者的蛋白尿超過3個月，還是會被認為是慢性腎病變(CKD)患者。還可以基於例如血清肌酸酐濃度、尿蛋白濃度、尿蛋白與肌酸酐比，或透過使用追蹤劑化合物如鄰苯二甲酸酯來評估腎病變。
於一些具體實施例中，慢性腎病變(CKD)可被認為包括五(5)個腎損傷階段，從階段1中的非常輕微的損傷到階段5中的完全腎衰竭。參見表A。
表A. 慢性腎病變(CKD)的不同階段。
慢性腎病變(CKD)的階段 特徵
階段1 預估的腎小球濾過率(eGFR)大於(且等於) 90 ml/分鐘。 腎臟的功能仍然良好。 通常，未發現任何症狀。 觀察到腎損傷的其他跡象(例如，蛋白尿)。
階段2 預估的腎小球濾過率(eGFR)介於60及89 ml/分鐘。 腎臟的功能仍然良好。 通常，未發現症狀。 觀察到腎損傷的其他跡象(例如，蛋白尿)。
階段3 預估的腎小球濾過率(eGFR) 介於30及59 ml/分鐘。 腎臟受到中度損傷，且未達到應有的功能。 大多數患者仍然沒有任何症狀，但有時會發現常見症狀，例如，手腳腫脹、背部疼痛，以及排尿多於或少於正常。
階段4 預估的腎小球濾過率(eGFR)介於15及29 ml/分鐘。 腎臟受到中度或嚴重的損傷，且未達到應有的功能。 更多患者具有症狀，例如，手腳腫脹、背部疼痛，以及排尿多於或少於正常。
階段5 預估的腎小球濾過率(eGFR)小於15 ml/分鐘。 腎臟嚴重受損，非常接近衰竭或完全衰竭。 患者具有更嚴重的症狀，例如，瘙癢、噁心、嘔吐、呼吸困難，由於腎功能衰竭及血液中毒素及廢棄物的積累所造成。
特定而言，如本文所述之慢性腎病變(CKD)的早期階段可包括如上所示的階段1與階段2，這些患者可具有相對較高(正常)的預估的腎小球濾過率(eGFR)但具有至少一個腎損傷跡象，例如微量白蛋白。
如本文所用，「糖尿病性腎病變」乙詞係指由糖尿病引起的腎病變。於某些具體實施例中，該糖尿病為第二型糖尿病。
本公開內容(至少部分地)基於一種或多種新穎可靠的腎病變生物標記之鑑定，亦即，該代謝物包括N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸，以及纈胺酸這種胺基酸。如以下實施例中所證明的，在罹患腎病變的個體的尿液樣品中發現某些代謝物的含量降低，包括N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸，或纈胺酸這種胺基酸的增加含量。因此，本文描述之腎病變檢測方法可鑑定個體是否患有、懷疑患有，或具有發展腎病變之風險。本文描述之檢測方法可應用於任何個體，尤其是作為初始、常規，以及經常性篩選的方法，以鑑定罹患腎病變或具有進展性腎病變風險的那些患者。
如本文所述之腎病變之生物標記如下： 表B
名稱 結構
N1-甲基鳥苷 2-胺基-9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥甲基)氧戊環-2-基]-1-甲基嘌呤-6-酮 C11 H15 N5 O5 分子量297.27 g/mol
7-甲基尿酸 7,9-二氫-7-甲基-1H-嘌呤-2,6,8(3H)-三酮 C6 H6 N4 O3 分子量182.14 g/mol
黃嘌呤核苷 9-[(2R ,3R ,4S ,5R )-3,4-二羥基-5-(羥甲基)氧戊環-2-基]-3H -嘌呤-2,6-二酮 C10 H12 N4 O6 分子量284.228 g/mol  
組胺酸 2-胺基-3-(1H -咪唑-4-基)丙酸 C6 H9 N3 O2 分子量155.1546 g/mol
纈胺酸 2-胺基-3-甲基丁酸 C5 H11 NO2 分子量117.148 g·mol−1
可透過常規技術確定生物樣品中如本文所述之代謝或胺基酸生物標記的存在以及含量。於一些具體實施例中，如本文所述之生物標記的存在及/或含量可透過質譜分析確定，其允許以高靈敏度以及具有再現性直接測量分析物。有許多質譜分析方法可供選擇。質譜分析的實例包括，但不限於，基質輔助雷射脫附電離/飛行時間質譜儀(matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight，MALDI-TOF)、表面增強雷射解吸電離/飛行時間質譜儀(surface-enhanced laser desorption ionisation/time of flight，SELDI-TOF)、液相色層分析-質譜儀(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、液相色層分析串聯質譜儀(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS-MS)，以及電噴霧電離質譜儀(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)。這種方法的一個特定實例為串聯質譜儀(tandem mass spectrometry，MS/MS)，其涉及質量選擇或分析的多個步驟，通常透過某種形式的碎片分開。
於其他具體實施例中，一生物標記的存在及/或含量可透過免疫分析來確定。免疫分析之實例包括，但不限於，西方墨點分析法、酵素聯結免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、放射免疫沉澱分析(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)、免疫螢光分析(immunofluorescence assay，IFA)、酵素聯結螢光免疫分析(enzyme-linked fluorescent immunoassay，ELFA)、電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)，以及毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis，CGE)。於一些實施例中，可使用特異性識別該生物標記的試劑來確定該生物標記的存在及/或含量，例如特異性結合該生物標記之抗體。
如本文所述，發現某些代謝物(包括N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸)的含量降低，或纈胺酸這種胺基酸的含量增加與腎病變的出現及進展相關。因此，本文所述之用於篩選腎病變患者以及監測腎病變進展之方法可以使用這些分子作為可靠的生物標記來進行。如上所述，本文所述之檢測方法可作為任何個體的早期篩選方法，以檢測其是否可能罹患腎病變(尤其是早期腎病變)。
為了進行本文所述之方法，於生物樣品中檢測或測量本文所述之生物標記的含量，該生物樣品取自有此需要的個體(例如，沒有任何腎病變症狀的人類患者，或患有、懷疑罹患腎病變或具有罹患腎病變風險的人類患者)透過本領域已知的任何方法進行，例如本文所述之那些方法，如質譜儀。通常，該生物樣品為尿液樣品。
於一些具體實施例中，可以將源自候選個體的樣品中的生物標記的含量與標準值進行比較以確定該候選個體是否患有或具有罹患腎病變之風險。標準值表示在該對照樣品中如本文所述之生物標記的含量。該對照樣品可取自未罹患腎病變的個體。另外，該對照樣品可取自一群這樣的個體的樣品之混合物。或者，該對照個體在例如年齡、性別及/或種族背景中與候選個體匹配。較佳地，該對照樣品與候選個體的生物樣品為相同物種之樣品。
於一些具體實施例中，如果第一組生物標記，亦即N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷、組胺酸被測量到具有低於標準值的量(例如，低於標準值約10%或更低)，則候選個體可被診斷為罹患、懷疑罹患或具有罹患腎病變之風險。於一些具體實施例中，如果一第二組生物標記，亦即纈胺酸被測量到具有高於標準值的量(例如，高於標準值約10%或更多)，則候選個體可被診斷為罹患、懷疑罹患或具有罹患腎病變之風險。
於一些具體實施例中，可測量源自該候選個體(例如，腎病變患者)的多個樣品中如本文所述之生物標記的含量以確定該疾病之進展。例如，至少兩種生物樣品，例如可以在不同時間點從該候選個體獲得尿液樣品。於某些具體實施例中，如果觀察到第一組生物標記，亦即N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸的趨勢隨時間降低(例如，N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸的量在較晚獲得的樣品中低於較早獲得的樣品中的量)，則該個體被診斷為罹患、懷疑罹患或具有罹患腎病變之風險。若該個體為一腎病變患者，則N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸的量的減少趨勢表示腎病變的進展(惡化)。於某些具體實施例中，若觀察到胺基酸生物標記纈胺酸的趨勢隨時間增加(例如，在較晚獲得的樣品中的纈胺酸的量高於較早獲得的樣品中的量)，則該個體被診斷為罹患、懷疑罹患或具有罹患腎病變之風險。若該個體為一腎病變患者，則纈胺酸量的增加趨勢表示腎病變的進展(惡化)。
當個體，例如人類患者，被診斷為患有、懷疑患有或具有罹患腎病變之風險時，該個體可進行進一步的測試(例如，常規物理測試，包括手術活體組織切片或成像方法，例如X-射線成像、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)或超音波)以確認疾病的發生及/或確定腎病變的階段與類型。
於一些具體實施例中，本文所述之方法可進一步包括治療該腎病變患者以至少緩解與該疾病相關之症狀。可以透過給予腎病變的常規藥物進行治療。此類藥物之實例包括，但不限於，(i) 用於減少白蛋白尿的藥物，例如磷酸二酯酶抑制劑，例如，雙嘧達莫以及己酮可可鹼；(ii) 抗高血壓藥物，如血管緊縮素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制劑，例如，咪達普利，以及血管緊縮素受體阻斷劑(angiotension receptor blocker，ARB)，例如，氯沙坦；(iii) 磷酸鹽結合劑，例如司維拉姆碳酸鹽，碳酸鑭，以及Al(OH)3 己糖醇錯合物；(iv) 鈣補充劑，如碳酸鈣、檸檬酸鈣，以及維生素D；(v) 抗貧血藥物，例如，促紅血球形成素(erythropoietin，EPO)以及鐵補充劑；(vi) 用於降低血脂的藥物，例如他汀類藥物，例如辛伐他汀、普伐他汀，以及阿托伐他汀；(vii) 降低尿酸的藥物，例如，異嘌呤醇、非布索坦，以及苯溴馬隆；(viii) 其他藥物，例如，皮質類固醇，如潑尼松龍、非甾體抗炎藥(non-steriodal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，以及N-乙醯半胱胺酸(用於預防造影劑引起的腎病變(contrast-induced nephropathy，CIN))。這些藥物可以一有效量給予一有需要的個體。腎病變的治療還可包括具有低蛋白質及/或低鹽飲食的食物療法。
如本文所用，「有效量」係指可以單獨或與一種或多種其他活性物質組合施用於該個體的每種活性物質的量，以賦予該個體治療效果。可變動該有效量且必須由本領域技術人員確定，這取決於給藥時的具體情況、病症的嚴重程度、患者的各個參數，包括年齡、性別、體重、身高、身體狀況、治療方案、平行治療的性質(如果有的話)、特定的給藥途徑，以及由醫務人員的知識和專業判斷的其他可能因素。這些因素為本領域普通技術人員所熟知的，並且無需進一步的常規實驗即可引入。
本發明還提供用於實施該方法之套組或組合物，其包括特異性識別如本文所述之生物標記的試劑(例如，抗體或標記試劑)。該套組可進一步包括使用該套組檢測本文所述之生物標記的存在或含量的說明書，進而檢測腎病變，並且還可以用於監測腎病變的進展。還提供了這樣的試劑用於在有需要的個體中進行腎病變的檢測之方法或者用於監測腎病變患者的腎病變進展之方法，或者用於製備用於實施所述方法的套組或組合物之方法。這種試劑包括特異性識別該第一生物標記的第一試劑及/或特異性識別該第二生物標記的第二試劑。於一些具體實施例中，此類試劑包括選自由下列所組成之群組的第一試劑：(i)特異性識別N1-甲基鳥苷的分子，(ii)特異性識別7-甲基尿酸的分子，(iii)特異性識別黃嘌呤核苷的分子，(iv)特異性識別組胺酸的分子，以及(v) (i)至(iv)的任何組合。於某些具體實施例中，此類試劑包括特異性識別纈胺酸的第二試劑。該試劑的實例可為抗體或含有可檢測標記(例如螢光標記)的標記試劑，其可特異性識別生物標記。該試劑可以與載體混合，例如醫藥上可接受之載體，以形成用於檢測或診斷目的之組合物。這種載體的實例包括可注射鹽水、可注射蒸餾水、可注射緩衝溶液及其類似物。
無需進一步詳細說明，相信本領域技術人員將能夠基於以上描述最大程度地應用本發明。因此，以下特定實施例的目的在於說明，而非以任何方式限制本發明之適用範圍。本文引用之所有文獻均透過引用併入本文。
實施例
代謝組學為一種系統生物學方法，用於鑑定及定量生物樣品中的總體代謝物。由於尿液為一種非侵入性樣品的來源，含有大部分身體的代謝終產物，因此尿液代謝組學被用於發現疾病的代謝物標記14,15 。
基於氣相色層分析-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)以及液相色層分析-質譜(LC-MS)的代謝組學方法已應用於尿液研究，以尋找早期檢測糖尿病(DM)16,17 以及糖尿病腎病變(DN)18-21 的標記。然而，這些研究中的大多數使用氣相色層分析-質譜儀(GC-MS)進行非標靶/標靶代謝組學分析，並使用液相色層分析-質譜儀(LC-MS)進行標靶代謝物檢測。由於液相色層分析-質譜(LC-MS)可以檢測到比氣相色層分析-質譜儀(GC-MS)更多樣化的代謝物，因此其為一種有前景的非標靶代謝組學方法，可能揭示糖尿病腎病變(DN)的新代謝標記。然而，據我們所知，尚無報導使用液相色層分析-質譜儀(LC-MS)非標靶代謝組學方法發現尿液中的第二型糖尿病腎病變(type 2 diabetic nephropathy，T2DN)標記。
於本文中，為了揭示新穎第二型糖尿病腎病變(T2DN)代謝標記，我們使用UPLC-MS對來自多個醫療中心的大量健康個體以及具有大量白蛋白尿的個體(macro組)、沒有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的尿液樣品進行非標靶代謝組學研究。鑑定並量化不同次群組之間具有顯著倍數變化的代謝物，並評估它們用於早期檢測第二型糖尿病腎病變(T2DN)之功效。
1. 材料與方法
1.1 化學品
所有化學品及溶劑均購自Sigma-Aldrich公司(聖路易斯市，密蘇里州，美國)。所有化學品均為分析等級。含有0.1%甲酸的水、乙腈，以及含有0.1%甲酸的水為Chromasolv等級。
1.2 研究人口及樣品
描述樣品採集、製備，以及分析的研究方案經中國醫藥大學附屬醫學院(台中，台灣)當地倫理委員會批准。所有個體在研究前都已給出了知情同意書。所有尿液樣品均來自台灣生物銀行(台灣台北中央研究院領導的全國樣品招募計劃)、中國醫藥大學附屬醫學院，以及台中榮民總醫院(台中，台灣)，自2012年1月至2017年12月止。根據臨床病程以及尿白蛋白排泄含量定義以下四組：具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM +micro，30 >白蛋白與肌酸酐比(ACR) > 300 mg/g)，不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM；白蛋白與肌酸酐比(ACR) > 30 mg/g)，由非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro；白蛋白與肌酸酐比(ACR) > 30 mg/g)，以及健康對照(白蛋白與肌酸酐比(ACR) > 30 mg/g)。
1.3 樣品製備
收集尿液樣品並透過離心(5,000 g，在4o C下30分鐘)除去細胞碎片。然後將樣品保持在-80o C下長期儲存。在質譜儀(MS)分析之前，將樣品於4o C下解凍24小時。排除患有腫瘤、發熱、心衰竭、尿路感染、血尿，或血壓調節失調的個體。
1.4 尿液代謝組學分析
來自健康個體(n = 14)以及非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組) (n = 22)、不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組) (n = 22)或具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)(n = 14)的個體的隨機與年齡配對的尿液樣品用於透過超性能液相色層分析四極桿飛行時間質譜儀(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry，UPLC-qTOF-MS)進行代謝組學分析，以發現潛在的代謝標記。在所有個體中測量肌酸酐，並獲得來自每個個體的一定體積的尿液以獲得50 µg肌酸酐。將尿液樣品真空乾燥並以500 µL的0.1%甲酸重新溶解，並將5 µL上述肌酸酐調節的尿液注入液相色層分析-質譜(LC-MS)裝置中。配備有一C18管柱(2.1 x 150 mm，3 µm，T3；Waters，Milford，麻州，美國)的UHPLC系統(Ultimate 3000；Dionex公司，蓋莫靈市，德國)與混合Q-TOF質譜儀結合(maXis影響，Bruker Daltonics公司，布萊梅市，德國)，具有正交電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)源。對於代謝組學分析，LC流速為0.25 mL/分鐘，使用溶劑A (5%乙腈與0.1%甲酸)以及溶劑B (乙腈與0.1%甲酸)。注入5 µL樣品體積後，將溶劑B保持在1% 4分鐘，然後在18分鐘內增加至45%，最後在2分鐘內增加至99%。保持2分鐘後，將溶劑B還原至1%並保持該濃度2.5分鐘。全掃描質量範圍在m/z 50-1000，1 Hz下以正離子或負離子模式操作。離子源的毛細管電壓設定為+3,600 V (正模式)以及-3,000 V (負模式)，端板偏移為500 V。噴霧器氣流為1 bar，乾燥氣體流量為8 L/分鐘。乾燥溫度設定為200o C。在分析之前，注射10個連續運行的品質控制(quality control，QC)樣品(從4組中隨機選擇的40個尿液樣品的合併樣品)以調節LC管柱。在每10次尿液樣品分析後，注入QC樣品以檢查整個分析過程中系統的穩定性。
對於進一步的數據探勘，使用ProfileAnalysis的生物資訊軟體(第2.1版)來計算LC流洗時間的分子特徵，從0.5到24分鐘，質量範圍從50 m/z到1000 m/z。化合物檢測參數設定如下：S/N > 3，相關係數閾值：0.7，最小化合物長度：7 光譜，光滑寬度：1。在儲存區生成中，使用高級儲存區，保留時間公差為0.5分鐘，質量公差為30 ppm。沒有使用訊號正常化。在儲存區過濾器中，儲存區的值計數以及儲存區內組屬性的值計數必須大於6。允許空組屬性，並為缺失值替換選擇「無」。對於主成分分析(PCA)(在95%信賴程度下沒有縮放演算法)以及火山圖分析，分別以正模式以及負模式呈現了總共1714以及4261個分子特徵。
1.5 透過 LC-ESI-Q-TOF-MS 定量代謝物標記
為了量化纈胺酸、7-甲基尿酸、N1-甲基鳥苷，以及黃嘌呤核苷，使用具有多反應監測功能的LC-ESI-Q-TOF系統。分析來自52位健康個體、53位非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)、86位不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，以及76位具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)個體的尿液樣品。以16 µL含有內部標準品的0.1%甲酸來稀釋4 µL尿液的等分試樣。
對於液相色層分析-質譜儀(LC-MS)分析，使用C18管柱(1.0 x 150 mm，3 µm，T3；Waters，Milford，麻州，美國)，流速為0.08 mL/分鐘，溶劑A (0.1%甲酸)以及溶劑B (含0.1%甲酸的乙腈) 的流動相。注入5 µL樣品體積後，溶劑B維持在0.5% 3分鐘，然後於2分鐘的時間內增加至95%，最後於2分鐘內增加至95%。保持2分鐘後，將溶劑B還原至0.5%並保持該濃度2分鐘。質譜儀以正模式操作，並以3 Hz掃描50-300的m/z範圍；在負模式下操作並在2 Hz下掃描50-500的m/z範圍。其他質譜儀(MS)設定與代謝組學分析方法中描述的相同。
為了測量組胺酸與纈胺酸，透過使用以下校準物繪製分析物以及內部標準品(internal standard，IS)(d3 -組胺酸)與對照尿液樣品中製備的標稱分析物濃度的峰面積比，在正交電噴霧電離(ESI)模式下構建校正曲線：0.125、0.25、0.5、1、2、4，以及8 ppm。
為了測量7-甲基尿酸、N1-甲基鳥苷，以及黃嘌呤核苷，濃度校正曲線以負交電噴霧電離(ESI)模式構建，且加入1-萘磺酸作為內部標準品(IS)。為了計算每種代謝物，從尿液樣品的分析物面積/內部標準品(IS)面積的比率中減去內源性峰面積除以空白尿液樣品的內部標準品(IS)峰面積的比率。纈胺酸、7-甲基尿酸、N1-甲基鳥苷，以及黃嘌呤核苷的前體離子/碎片離子(碰撞能)值分別為118.07/72.08 (10eV)、181.03/123.00 (30eV)、296.06/164.05 (20eV)，以及283.07/151.03 (20 eV)。
1.6 統計分析
臨床特徵的數值變量顯示為括號中的四分位數值(25%，75%)的中間值。無母數Mann-Whitney法(SigmaPlot，第11.0版)用於檢測兩組之間透過液相色層分析-質譜儀(LC-MS)定量的標記濃度的顯著差異。透過使用邏輯回歸分別評估生物標記以及每種結果之間的關聯。如果透過後向選擇方法顯著，那麼潛在的混雜因素(包括人口統計學以及臨床變量)將被包括在多變量模型中。在模型中使用自然對數(natural logarithm，LN)轉化或代謝物生物標記的中間值。生成接收者操作特徵(Receiver operating characteristic，ROC)曲線以量化模型的預測準確度，並且使用接收者操作特徵曲線下面積(area under the Receiver Operating Characteristic curve，AUC)來評估模型的辨別能力。計算代謝物生物標記以及具有臨床變量的代謝物生物標記的曲線下面積(AUC)值。所有統計分析均使用SPSS軟體，微軟Windows專用第21.0版(IBM公司，Armonk，紐約州，美國)進行。
2. 結果
2.1 患者特徵描述
相較於來自健康個體、不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)，非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)個體具有更高的血清肌酸酐，更低的預估的腎小球濾過率(eGFR)，更高的白蛋白尿，以及更高的尿白蛋白與肌酸酐比(ACR)。此外，來自不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的個體比健康個體組以及非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)的個體具有更高的空腹血糖以及糖化血紅素。具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)個體的白蛋白與肌酸酐比(ACR)值高於不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)以及健康個體組的個體(表1)。表 1. 健康個體、非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)、不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的臨床及生化參數。數據表示為中位數(25%/75%四分位數)。
  健康個體 (n=52) 大量 (n=53) T2DM (n=86) T2DM+micro (n=76) P 1 P 2 P 3
性別(M/F) 26/26 20/33 46/40 40/36 - - -
年齡(歲) 61.00 (53.00/66.00) 58.00 (52.00/77.00) 60.50 (56.00/66.00) 65.00 (53.50/74.00) 0.974 0.928 0.111
SBP (mmHg) 118.00 (110.00/130.00) 130.00 (118.50/142.00) 126.00 (117.50/133.00) 124.00 (103.00/132.00) 0.001 0.002 0.021
DBP (mmHg) 72.00 (60.00/79.50) 80.00 (72.00/85.50) 76.50 (71.75/82.00) 80.00 (73.00/91.00) >0.01 0.001 0.004
FBG (mg/dL) 84.00 (75.50/91.00) 100.00 (94.25/104.00) 128.00 (110.00/142.00) 133.00 (115.00/158.75) >0.001 >0.001 0.037
血紅素A1c (%) 5.40 (5.23/5.60) 5.80 (5.50/6.15) 6.70 (6.30/6.90) 6.90 (7.35/7.55) >0.001 >0.001 0.005
血紅素A1c (mmol/mol) 35.30 (33.59/37.69) 39.88 (36.60/43.70) 49.72 (45.34/51.90) 51.90 (45.89/59.01) >0.001 >0.001 0.005
罹患糖尿病時間(年) - - 6.00 (3.75/11.00) 8.00 (2.00/14.00) - - 0.452
肌酸酐(mg/dL) 0.80 (0.70/1.00) 1.07 (0.80/1.25) 0.80 (0.61/1.00) 0.90 (0.70/1.04) 0.001 0.214 0.082
預估的腎小球濾過率(ml/分鐘) 82.47 (71.51/95.42) 64.00 (50.75/85.50) 90.29 (74.75/107.00) 81.93 (64.25/103.50) >0.001 0.160 0.035
白蛋白尿(mg/L) 1.30 (0.43/7.55) 49.70 (21.80/124.20) 0.60 (0.30/1.20) 8.55 (5.63/16.15) >0.001 0.004 >0.001
尿ACR (mg/g) 4.81 (3.21/7.21) 292.71 (89.60/1639.52) 5.24 (3.25/8.69) 91.95 (55.37/130.79) >0.001 0.613 >0.001
M：男性；F：女性；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；FBG：空腹血糖；eGFR：預估的腎小球濾過率；ACR：白蛋白與肌酸酐比。Macro：非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者。T2DM：不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者。T2DM+micro：具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者。1 p 值為健康個體與macro組比較時Mann-Whitney U測試結果。2 p 值為健康個體與T2DM組比較時Mann-Whitney U測試結果。3 p 值為T2DM組與T2DM+micro組比較時Mann-Whitney U測試結果。
2.2 質量訊號的穩定性與準確性
透過QC樣品評估液相色層分析-質譜儀(LC-MS)訊號穩定性。選擇質量範圍為50-1000 m/z的S/N > 3的正峰值訊號，以在QC樣品中產生1706個特徵。其中約24%的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)值小於10%，其中13%的相對標準偏差(RSD)在10-20%之間，21%的相對標準偏差(RSD)為20-40%，表示長期連續液相色層分析-質譜儀(LC-MS)運行後MS訊號穩定性良好。
2.3 透過液相色層分析 - 質譜儀 (LC-MS) 分析進行代謝組學分析
對健康個體(n = 14)、非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)(n = 22)、不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組) (n = 22)，以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的年齡配對的尿液樣品進行分析，以透過使用非標靶液相色層分析-質譜儀(LC-MS)代謝組學分析方法發現潛在的代謝物標記。
以正模式以及負模式獲得尿液的典型基峰色層分析圖。在正模式以及負模式中檢測到~17,000個分子特徵。以主成分分析(PCA)分析液相色層分析-質譜儀(LC-MS)分析結果，並顯示於圖1A(正模式)以及圖1B(負模式)中。在正交電噴霧電離(ESI)模式中，難以區分的不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的組別可以與難以區分的健康個體組以及非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)的個體完全分離。然而，我們發現代謝組學譜分離主要透過在不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)中施用抗糖尿病藥物二甲雙胍來確定(圖1C)。除去二甲雙胍後，這四組在主成分分析(PCA)評分散點圖中是不可區分的(圖1D)。因為主成分分析(PCA)被設計為在組中找到最大方差並且適合於在不同組中找到最有影響的變量(強液相色層分析-質譜儀(LC-MS)訊號)，所以缺乏主成分分析(PCA)鑑別表示在這四組中主要的尿代謝物訊號是相似的。
為了發現可能較少但可能導致群體區分的可能峰值標記，火山圖是基於t -檢驗結果以及倍數變化值製作的。圖2A-2B所示為不同組的六個火山圖，其透過繪製y軸(基線10)上的P -值的對數以及兩個條件之間的倍數變化值的對數來構建。當使用倍數變化的對數時，兩個方向(向上以及向下)的變化與中心等距。在健康個體與非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)，健康個體與不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，以及不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)與具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+微量組)比較中分別發現85/232 (正離子/負離子數)、30/95，以及44/98峰候選物。在對這些潛在候選物進行人工檢查後，基於其可用的碎片離子以及更強的訊號選擇43個分子特徵離子。對於健康與非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)的比較，3個正離子以及6個負離子的差異超過兩倍(P > 0.05)。對於不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)與具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+微量組)比較，3個正離子的差異超過兩倍(P > 0.05)，2個負離子的差異超過兩倍(P > 0.05)。對於健康與不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)的比較，11個正離子(p > 0.01)以及18個負離子(P > 0.001)的差異超過兩倍。在搜索HMDB以及MassBank資料庫後，可以鑑定出43種候選物中的5種，二甲雙胍、纈胺酸、黃嘌呤核苷、N1-甲基鳥苷，以及7-甲基尿酸。透過比較它們與化學標準品的LC流洗時間、質譜(MS)、MS/MS譜的特徵進一步鑑定這些代謝物。
2.4 潛在標記之驗證
發現的代謝物標記纈胺酸、黃嘌呤核苷、N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸，並在更大量的健康個體(n = 52)、非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)(n = 53)、不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組) (n = 86)，以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+微量組)(n = 76)樣品中進一步量化。 (表1)
這些分析的結果顯示於表2以及圖3A-3D。表 2. 健康個體、非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)、不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的尿液樣品中四種代謝物的定量。數據表示為中位數(µg/mg肌酸酐)以及四分位範圍(第25至第75百分比)。
  健康個體 (n=52) macro (n=53) T2DM (n=86) T2DM+micro (n=76) P 1 P 2 P 3
纈胺酸 2.37 (1.84/3.81) 3.64 (2.59/6.07) 6.79 (4.25/9.40) 6.05 (3.32/8.77) 0.002 >0.001 0.093
N1-甲基鳥苷 1.74 (0.67/2.74) 0.13 (0.00/0.69) 1.22 (0.26/2.47) 0.35 (0.00/1.27) >0.001 0.130 0.001
7-甲基尿酸 1.27 (0.79/2.30) 0.57 (0.00/1.34) 0.91 (0.37/1.83) 0.62 (0.12/1.37) >0.01 0.008 0.062
黃嘌呤核苷 1.59 (0.49/2.24) 0.58 (0.02/1.16) 1.39 (0.58/2.66) 0.75 (0.10/1.76) 0.001 0.583 0.004
1 p 值為健康個體與WDM-NP比較時Mann-Whitney U測試結果。2 p 值為健康個體與DM-WNP比較時Mann-Whitney U測試結果。3 p 值為DM-WNP與DM-NP比較時Mann-Whitney U測試結果。
纈胺酸含量在非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)以及不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)中顯著高於健康個體組(p 值分別為0.002以及 > 0.001)。與健康個體組以及不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)的含量相比，非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的N1-甲基鳥苷含量較低(p 值分別 > 0.001以及0.001)。7-甲基尿酸在非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)、不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)中均低於健康個體組。相較於健康個體組中的黃嘌呤核苷含量，在非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)中黃嘌呤核苷含量顯著降低(p 值= 0.001)。相較於不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)中黃嘌呤核苷的含量也顯著降低(p 值= 0.004)。
2.5 胺基酸分析
因為胺基酸被認為是潛在的糖尿病腎病變(DN)標記，所以在本研究中測量了樣品群組的16個胺基酸含量(表1)。在不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)個體的尿液樣品中，發現大多數胺基酸(白胺酸、異白胺酸、色胺酸、酪胺酸、脯胺酸、天門冬胺酸、精胺酸、天門冬醯胺、蘇胺酸)的排泄含量顯著高於健康個體組的尿液樣品。甲硫胺酸、酪胺酸、脯胺酸，以及蘇胺酸在非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)中的排泄量高於健康個體組。
相較於健康個體組的組胺酸含量，非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)中的組胺酸含量顯著較低，但不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)中的組胺酸含量顯著較高(p 值分別為0.036以及> 0.001)。組胺酸在具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)中也明顯低於不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)(p 值= 0.021)。 (圖3E)(表3)天門冬胺酸在不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)顯著高於健康個體組(p 值= 0.003)，但在具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+微量組)中低於不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)(p 值= 0.012) (圖3F)(表3)。表 3 . 健康個體、非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)、不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的尿液樣品中天門冬胺酸以及組胺酸的量化。
  健康個體 非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組) P 值 (健康個體與非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)比較) 不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組) P 值 (健康個體與不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)比較) 具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組) P 值 (不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)與具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)比較)
天門冬胺酸 2.05 (1.35/3.13) 2.09 (0.94/3.36) 0.822 4.15 (1.9/7.6) 0.004 2.57 (1.209/4.01) 0.015
組胺酸 29.8 (21.7/50.0) 25.0 (13.6/39.0) 0.037 55.4 (31.2/105.5) >0.001 43.0 (20.1/76.1) 0.021
2.6 嘌呤分解代謝
由於N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸，以及黃嘌呤核苷參與嘌呤分解代謝，其樣品組(表1)中的五種主要代謝物 - 次黃嘌呤、黃嘌呤、鳥糞嘌呤核苷、鳥糞嘌呤，以及尿酸也被量化。結果表明，非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)中鳥糞嘌呤含量顯著低於健康個體組。不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)的次黃嘌呤以及鳥糞嘌呤核苷含量明顯高於健康個體組。然而，這5種代謝物的含量在不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)之間沒有顯著差異。
2.7 邏輯回歸以及接收者操作特徵 (ROC) 分析
邏輯回歸模型用於進一步檢查這些標記與疾病結果之間的關聯。發現較高含量的纈胺酸以及較低含量的黃嘌呤核苷、N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸，以及組胺酸與非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)顯著相關，優勢比(OR) (95%信賴區間)分別為3.04 (1.41-6.52)、4.00 (1.78- 9.01)、9.23 (3.81-22.40)、4.77 (2.09-10.87)，以及0.42 (0.21-0.83)。還進行了接收者操作特徵(ROC)分析以研究這些代謝物的含量是否可以區分健康個體組以及非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)，或不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)。為了區分健康個體以及非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)，與纈胺酸(0.678)、黃嘌呤核苷(0.667)以及7-甲基尿酸(0.686)的曲線下面積(AUC)值相比，N1-甲基鳥苷的曲線下面積(AUC)值最高為0.752。在將N1-甲基鳥苷的含量與7-甲基尿酸或黃嘌呤核苷組合後，組合的曲線下面積(AUC)值分別為0.668以及0.667 (表4以及圖5)。相較於不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，較低含量的N1-甲基鳥苷仍然與具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+微量組)風險顯著相關(優勢比(OR) (95%信賴區間) = 2.75 (1.46-5.21)，曲線下面積(AUC)值 = 0.624)。在將N1-甲基鳥苷的含量與7-甲基尿酸或黃嘌呤核苷組合後，組合的曲線下面積(AUC)值分別為0.640以及0.625 (表4以及圖5)。表 4 . 在單變量邏輯回歸模型中以不同代謝物生物標記預測腎病變的95%信賴區間以及曲線下面積(AUC)值的優勢比(OR)。
  健康個體比macro組 T2DM組比T2DM+micro組
  優勢比 95%信賴區間 P 值 曲線下面積 優勢比 95%信賴區間 P 值 曲線下面積
纈胺酸                
自然對數_纈胺酸 3.04 1.41-6.52 0.004 0.678 0.65 0.40-1.06 0.087 0.578
黃嘌呤核苷       0.667       0.612
中位數+ 參考 參考     參考 參考    
>中位數 4.00 1.78-9.01 0.001   2.48 1.32-4.67 0.005  
N1- 甲基鳥苷       0.752       0.624
中位數+ 參考 參考     參考 參考    
>中位數 9.23 3.81-22.40 8.88x10-7   2.75 1.46-5.21 0.02  
7 - 甲基尿酸       0.686       0.578
中位數+ 參考 參考     參考 參考    
>中位數 4.77 2.09-10.87 2.05x10-4   1.88 1.00-3.52 0.049  
組胺酸                
自然對數_組胺酸 0.42 0.21-0.83 0.013 0.627 0.66 0.45-0.96 0.031 0.612
天門冬胺酸       0.518       0.604
中位數+ 參考 參考     參考 參考    
>中位數 0.87 0.37-2.03 0.740   2.33 1.03-5.29 0.043  
結合 N1- 甲基鳥苷與 7- 甲基尿酸 0.668       0.640
第2組 參考 參考     參考 參考    
第1組 5.30 2.10-13.37 4.18x10-4   3.83 1.89-7.77 2.01x10-4  
結合 N1- 甲基鳥苷與黃嘌呤核苷 0.667       0.625
第2組 參考 參考     參考 參考    
第1組 4.23 1.84-9.72 0.001   2.85 1.50-5.43 0.001  
健康個體組對上非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者 (macro 組 ) ：黃嘌呤核苷的中位數為0.8024；N1-甲基鳥苷的中位數為0.6778；7-甲基尿酸的中位數為1.0107；天門冬胺酸的中位數為2.0788。不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者 (T2DM 組 ) 對上具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者 (T2DM+micro 組 ) ：黃嘌呤核苷的中位數為1.0102；N1-甲基鳥苷的中位數為0.7360；7-甲基尿酸的中位數為0.7993；天門冬胺酸的中位數為3.2213。結合 N1- 甲基鳥苷與 7- 甲基尿酸 第1組：N1-甲基鳥苷 > 中位數 且 7-甲基尿酸 > 中位數， 第2組：N1-甲基鳥苷 > 中位數 且 7-甲基尿酸 = 中位數+ ， N1-甲基鳥苷 = 中位數+ 且 7-甲基尿酸 > 中位數， N1-甲基鳥苷 = 中位數+ 且 7-甲基尿酸 = 中位數+ 結合 N1- 甲基鳥苷與黃嘌呤核苷 第1組：N1-甲基鳥苷 > 中位數 且 黃嘌呤核苷 > 中位數， 第2組：N1-甲基鳥苷 > 中位數 且 黃嘌呤核苷 = 中位數+ ， N1-甲基鳥苷 = 中位數+ 且 黃嘌呤核苷 > 中位數， N1-甲基鳥苷 = 中位數+ 且 黃嘌呤核苷酸 = 中位數+
2.8 與代謝物生物標記以及代謝物生物標記與臨床變量的模型比較
透過調整多變量模型中的臨床變量(收縮壓與舒張壓)來區分健康個體以及非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)，針對黃嘌呤核苷、N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸，以及黃嘌呤核苷與N1-甲基鳥苷的組合的曲線下面積(AUC)值分別為0.983 (95%信賴區間 = 0.96-1.00)、0.987 (95%信賴區間 = 0.97-1.00)、0.940 (95%信賴區間 = 0.89-0.99)，以及0.983 (95%信賴區間 = 0.97-1.00)(圖4)。對於不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)之間的辨別能力，針對N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及黃嘌呤核苷與N1-甲基鳥苷的組合調整後的曲線下面積(AUC)值分別為0.723 (95%信賴區間 = 0.64-0.81)、0.719 (95%信賴區間 = 0.64-0.80)、0.716 (95%信賴區間 = 0.64-0.80)，以及 0.734 (95%信賴區間 = 0.65-0.81)(圖5)。
3. 討論與結論
在臨床實作中，預估的腎小球濾過率(eGFR)與蛋白尿仍然是腎病變以及慢性腎病變(CKD)進展的常見標記。微量白蛋白尿被認為是進展為蛋白尿的預測因子22 。在本研究中，為了發現敏感的代謝物生物標記，我們的個體被分為健康的個體、非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)、不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)，以用於代謝物分析比較。據我們所知，我們目前的研究首次使用定量、非標靶液相色層分析-質譜儀(LC-MS)方法檢查第二型糖尿病患者(T2DM組)以及糖尿病腎病變(DN)患者的尿液代謝組。N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸，以及黃嘌呤核苷的含量分別具有0.752、0.686，以及0.667的較高曲線下面積(AUC)值，以區分健康個體以及來自非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)(具有大量白蛋白尿/微量白蛋白尿)。對於區分不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)，N1-甲基鳥苷具有最高曲線下面積(AUC)值0.624，是所有標記中最適合的。我們的橫斷面研究顯示，尿液代謝組學可能是臨床上有用的平台，可為糖尿病以及糖尿病腎病變患者提供代謝特徵以及新的生物化學見解。具體而言，纈胺酸、天門冬胺酸，以及組胺酸可以是預測糖尿病(DM)的代謝標記，因為它們在不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)中的含量顯著更高。黃嘌呤核苷以及N1-甲基鳥苷可能是預測不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)引起的腎病變發展的有潛力的標記。
我們的結果顯示，非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)的尿液中酪胺酸、脯胺酸，以及蘇胺酸的濃度高於健康個體。非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)的甲硫胺酸含量低於健康個體組。相較於不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，發現天門冬胺酸在具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)中顯著降低。據報導，從微量白蛋白尿到大量白蛋白尿期間，無微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)血漿中組胺酸含量以及尿中麩醯胺酸/酪胺酸含量較低21 。在我們的研究中，且相較於健康個體組，不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)的尿液組胺酸含量較高，而相較於健康個體組及不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的尿液組胺酸含量則較低(P >0.05)。血漿組胺酸的下調與慢性腎病變(CKD)患者的蛋白質-能量消耗、發炎、氧化壓力，以及死亡率相關23 。胺基酸的交替可能表示患者具有慢性炎症、氧化壓力，以及進行性腎功能21 。
已知嘌呤代謝增強在氧化壓力條件下，包括糖尿病，活化的線粒體防禦機制。最近，據報導黃嘌呤核苷在糖尿病個體的血漿中升高24 。在我們的研究結果中，糖尿病患者尿液中次黃嘌呤、黃嘌呤、鳥嘌呤核苷，以及黃嘌呤核苷的含量升高可能與線粒體抗氧化防禦過程有關。
非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)尿液中鳥糞嘌呤含量的降低，或非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)尿液中黃嘌呤核苷的降低可能歸因於線粒體功能的抑制，這已經由Sharma, K.等人所報導。20
相較於在健康個體以及不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)中的N1-甲基鳥苷含量，在非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)(P >0.001)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)(P >0.001)中的N1-甲基鳥苷濃度顯著降低。然而，我們發現在具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)以及不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)中鳥嘌呤核苷含量沒有顯著差異。
因為這些修飾的核苷為RNA的終產物，其不重新摻入新合成的RNA分子中，它們通常排泄到尿液中。因為據報導甲基化核苷在血清中升高25 ，所以非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)以及具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)的尿液中較低量的N1-甲基鳥苷可能是由於其腎清除率降低。
由黃嘌呤氧化酶催化甲基黃嘌呤形成甲基尿酸，並且存在四種甲基尿酸同種型：1-、3-、7-，以及9-甲基尿酸。在這項研究中，我們發現尿液中的7-甲基尿酸濃度在非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)上顯著低於健康個體。非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)尿液中7-甲基尿酸含量的降低也可能是由於腎清除率降低所致。
我們發現大多數胺基酸的含量在不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)的尿液中顯著改變。尿液中的一組胺基酸標記可用於評估糖尿病(DM)發展之風險。由於它們的高曲線下面積(AUC)值可區分具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)與無微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)，因此N1-甲基鳥苷以及黃嘌呤核苷可作為預測無微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)腎病變發展的標記。
總之，我們發現至少包括N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸，纈胺酸這種胺基酸等代謝物可作為檢測腎病變的特異性生物標記。因此，本發明提供了一種腎病變篩檢技術，該技術可特異性地檢測罹患腎病變、疑似罹患腎病變，或有腎病變風險的患者，並且可以在早期(即在發生任何症狀之前)作為指示劑。本發明之技術可以開發用於檢測腎病變的套組或技術平台，使用包括N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及組胺酸，以及纈胺酸這種胺基酸的代謝物作為篩選腎病變的生物標記。本發明之技術可以進一步組合本領域已知的生理參數的測量，以提高腎病變的檢出率以及準確性。本發明的技術可以識別包括早期(微量白蛋白尿，沒有明顯症狀)的不同階段的腎病變。它還可以作為監測腎病變進展的指標。可以定期且連續地追蹤患者的病情，從而可以及時調整治療計劃，以便患者避免或延緩惡化。參考資料 1.   Lipscombe, L. L.; Hux, J. E., Trends in diabetes prevalence, incidence, and mortality in Ontario, Canada 1995–2005: a population-based study.The Lancet 2007, 369, (9563), 750-756. 2.   Wild, S.; Roglic, G.; Green, A.; Sicree, R.; King, H., Global prevalence of diabetes estimates for the year 2000 and projections for 2030.Diabetes care 2004, 27, (5), 1047-1053. 3.   Hallan, S. I.; Coresh, J.; Astor, B. C.; Åsberg, A.; Powe, N. R.; Romundstad, S.; Hallan, H. 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無
為了說明本發明，以下說明具體實施例。然而，應該理解的是，本發明不限於所示之較佳具體實施例。
於圖式中：
圖1A-1D所示為尿液代謝組的主成分分析(principal component analysis，PCA)。圖1A，正模式。圖1B，負模式。圖1C，正模式的加載圖。圖1D，去除二甲雙胍離子後的正模式主成分分析(PCA)。
圖2A-2B所示為兩群組之間峰值變化的統計顯著性的火山圖。圖2A，正模式：健康個體與非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)之比較(P > 0.05；倍數變化 > 2)；健康個體與無微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)之比較(P > 0.01；倍數變化 > 2)；無微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)與具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+微量組)之比較(P > 0.05；倍數變化 > 2)。圖2B，負模式：健康個體與非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)之比較(P > 0.05；倍數變化 > 2)；健康個體與無微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)之比較(P > 0.001；倍數變化 > 2)；無微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)與具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)之比較(P > 0.05；倍數變化 > 2)。
圖3A-3F所示為尿液樣品中六種發現的生物標記的箱形圖。圖3A，黃嘌呤核苷；圖3B，纈胺酸；圖3C，7-甲基尿酸；圖3D，N1-甲基鳥糞嘌呤；圖3E，組胺酸；以及圖3F，天門冬胺酸(*P > 0.05；**P > 0.01；***P > 0.005；****P > 0.001)。
圖4A-4D所示為健康個體組以及非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(macro組)之間的代謝生物標記的辨別能力以及包括代謝生物標記、空腹血糖，以及舒張壓(DBP)的完整模型。代謝生物標記包含在每個模型中，圖4A，N1-甲基鳥苷；圖4B，7-甲基尿酸；圖4C，黃嘌呤核苷；以及圖4D，N1-甲基鳥苷與黃嘌呤核苷之組合。
圖5A-5D所示為無微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM組)與具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者(T2DM+micro組)之間的代謝生物標記的辨別能力以及包括代謝生物標記、空腹血糖，以及舒張壓(DBP)的完整模型。代謝生物標記包含在每個模型中，圖5A，N1-甲基鳥苷；圖5B，7-甲基尿酸；圖5C，黃嘌呤核苷；以及圖5D，N1-甲基鳥苷與黃嘌呤核苷之組合。
無

Claims (8)

  1. 一種用於檢測個體腎病變之方法，該方法包括：(i)提供從該待測個體中獲得之生物樣品；以及(ii)進行第一檢測，其包括在該生物樣品中確定第一生物標記之含量以獲得第一檢測含量，將該第一檢測含量與該第一生物標記的第一參考含量進行比較以獲得第一比較結果，以及基於該第一比較結果評估該個體是否罹患腎病變或具有發展腎病變之風險，其中該第一生物標記係選自由N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及其任何組合之群組，且相較於該第一參考含量，該第一檢測含量的降低表示該個體罹患腎病變或具有發展腎病變之風險，其中該生物樣品為尿液樣品。
  2. 如請求項1之方法，其中該檢測透過質譜法進行。
  3. 如請求項1之方法，其中該第一生物標記進一步包括組胺酸，及/或該方法進一步包括：(iii)進行第二檢測，其包括在該生物樣品中確定第二生物標記的含量以獲得第二檢測含量，將該第二檢測含量與該第二生物標記的第二參考含量進行比較以獲得第二比較結果，以及基於該第二比較結果評估該個體是否罹患腎病變或具有發展腎病變之風險，其中該第二生物標記為纈胺酸，且相較於該第二參考含量，該第二檢測含量的增加表示該個體罹患腎病變或具有發展腎病變之風險，其中該生物樣品為尿液樣品。
  4. 如請求項1之方法，其中該個體為糖尿病患者。
  5. 一種用於在罹患腎病變的患者中監測腎病變進展之方法，該方法包括：(a)提供於第一時間點從該患者獲得之第一時間點生物樣品；(b)提供於第二時間點從該患者獲得之第二時間點生物樣品，其中該第二時間點晚於該第一時間點；以及(c)進行第一檢測，其包括分別在該第一時間點生物樣品中以及該第二時間點生物樣品中確定第一生物標記的含量，以分別獲得該第一生物標記的第一時間點檢測含量以及第二時間點檢測含量，比較該第一生物標記的第一時間點檢測含量與第二時間點檢測含量以獲得第一比較結果，以及基於該第一比較結果評估該患者的腎病變進展，其中該第一生物標記選自由N1-甲基鳥苷、7-甲基尿酸、黃嘌呤核苷，以及其任何組合所組成之群組，且相較於該第一生物標記的第一時間點檢測含量，該第一生物標記的第二時間點檢測含量的下降表示該患者的腎病變進展，其中該生物樣品為尿液樣品。
  6. 如請求項5之方法，其中該檢測透過質譜法進行。
  7. 如請求項5之方法，其中該第一生物標記進一步包括組胺酸，及/或該方法進一步包括：(d)進行第二檢測，其包括分別在該第一時間點生物樣品中以及該第二時間點生物樣品中確定第二生物標記的含量，以分別獲得該第二生物標記的第一時間點檢測含量以及第二時間點檢測含量，比較該第二生物標記的第一時間點檢測含量與第二時間點檢測含量以獲得第二比較結果，以及基於該第二比 較結果評估該患者的腎病變進展，其中該第二生物標記為纈胺酸，且相較於該第二生物標記的第一時間點檢測含量，該第二生物標記的第二時間點檢測含量的增加表示該患者的腎病變進展，其中該生物樣品為尿液樣品。
  8. 如請求項5之方法，其中該個體為糖尿病患者。
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